WO2023195215A1 - 透明度評価方法 - Google Patents

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WO2023195215A1
WO2023195215A1 PCT/JP2023/003087 JP2023003087W WO2023195215A1 WO 2023195215 A1 WO2023195215 A1 WO 2023195215A1 JP 2023003087 W JP2023003087 W JP 2023003087W WO 2023195215 A1 WO2023195215 A1 WO 2023195215A1
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target color
color
transparency
center
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PCT/JP2023/003087
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諒太 川畑
花穂 加納
麻耶 尾崎
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住友化学株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/46—Measurement of colour; Colour measuring devices, e.g. colorimeters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/27—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands using photo-electric detection ; circuits for computing concentration
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a transparency evaluation method.
  • a test substance is added to a test substance and, for example, changes in transparency are observed to determine whether the sample is toxic to the test substance.
  • a plurality of wells as disclosed in Patent Document 1, Patent Document 2, Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2, and Non-Patent Document 3 has been developed. In some cases, a method using a plate having .
  • Patent Document 1 As disclosed in Patent Document 1, Patent Document 2, etc., methods for evaluating test specimens or specimens based on color changes using a plate having a plurality of wells are more objective and have improved accuracy. There is a need for a method for evaluating color changes that can be measured. Transparency change in the Ames test is a type of such color change, and is used to evaluate the influence of the specimen on the specimen. Therefore, there is a need for a transparency evaluation method that is more objective and can improve accuracy.
  • an object of the present invention is to provide a transparency evaluation method that can be evaluated objectively and that can improve accuracy.
  • the transparency evaluation method according to the present invention includes the following aspects [1] to [8]. [1] Obtain N frequency distributions for target colors in N predetermined areas (N is an integer of 1 or more) in the plate image, the N frequency distributions having at least two color feature quantities as variables.
  • the evaluation target includes a test specimen,
  • the plurality of wells have at least one sample well holding the evaluation target further including a sample,
  • At least one of the N predetermined regions includes at least one image corresponding to the at least one sample well,
  • the first reference target color is the target color in a first transparent state,
  • evaluating the transparency based on a centroid vector directed from a first centroid position of the first reference target color area in the first reference power distribution to a second centroid position of the target color area in each of the N frequency distributions. evaluating the transparency; Transparency evaluation method.
  • the transparency of N predetermined regions can be evaluated based on N frequency distributions obtained from the plate image. Therefore, objectivity can be ensured compared to, for example, when transparency is evaluated visually.
  • the above-mentioned N points are calculated from the first centroid position of the first reference target color region in the first reference frequency distribution corresponding to the first reference target color, which is the color corresponding to the first transparent state of the target color.
  • the transparency is evaluated based on the centroid vector toward the second centroid position of the target color region in each frequency distribution. Therefore, it is possible to improve the accuracy of transparency evaluation.
  • the plurality of wells further includes at least one first reference object color well for the first reference object color; one of the N predetermined regions includes an image corresponding to the at least one first reference target color well; In the step of obtaining the first reference frequency distribution, at least two color feature quantities in a predetermined region including an image corresponding to the at least one first reference target color well among the N predetermined regions are used as variables. obtaining a frequency distribution as the first reference frequency distribution; Transparency evaluation method described in [1].
  • the first standard power distribution which is the standard for transparency evaluation
  • the first standard power distribution can be obtained based on the power distribution obtained from the plate image to be evaluated. Therefore, since transparency can be evaluated according to the plate image to be evaluated, the accuracy of transparency evaluation can be easily improved.
  • the transparency is evaluated based on the angle of the center of gravity vector with respect to the transparency change reference vector and the length of the center of gravity vector
  • the transparency change reference vector is a second reference frequency distribution from the first center of gravity position to a second reference target color, and a second reference target color region in the second reference frequency distribution that uses at least two color feature quantities as variables.
  • the second reference target color is the target color in a second transparent state different from the first transparent state
  • the length of the center of gravity vector is a length normalized by the image size when a frequency distribution including the second center of gravity position that defines the center of gravity vector is displayed as an image.
  • the transparency can be evaluated based on the change in transparency from the first reference target color to the second reference target color.
  • a frequency distribution whose variables are the at least two color feature quantities for the second reference target color in one predetermined region among the N predetermined regions is acquired by the second reference frequency distribution. Obtained as a standard frequency distribution, Transparency evaluation method described in [3].
  • the second reference power distribution used to define the transparency change vector can be obtained based on the power distribution obtained from the plate image to be evaluated. Therefore, since transparency can be evaluated according to the plate image to be evaluated, the accuracy of transparency evaluation can be easily improved.
  • the frequency distributions for the first reference target color and the second reference target color are acquired in each of the N predetermined regions, and the frequency distribution for the first reference target color is obtained. obtaining a frequency distribution of the target color based on the distribution and a frequency distribution for the second reference target color;
  • the second reference target color is the target color in a second transparent state different from the first transparent state,
  • the transparency change reference vector extends from the first centroid position to the third centroid position of the second reference target color region in the second reference power distribution, which has at least two color features as variables.
  • the first reference frequency distribution is a frequency distribution of the first reference target color acquired in one predetermined area of the N predetermined areas
  • the second reference frequency distribution is a frequency distribution of the second reference target color acquired in one predetermined area of the N predetermined areas
  • the length of the center of gravity vector is a length normalized by the image size when a frequency distribution including the second center of gravity position that defines the center of gravity vector is displayed as an image. Transparency evaluation method described in [1].
  • the transparency can be evaluated based on the change in transparency from the first reference target color to the second reference target color.
  • the first reference power distribution and the second reference power distribution which serve as standards for transparency evaluation, can be obtained based on the power distribution obtained from the plate image to be evaluated. Therefore, since transparency can be evaluated according to the plate image to be evaluated, the accuracy of transparency evaluation can be easily improved.
  • the step of acquiring the N frequency distributions includes: obtaining an initial frequency distribution using the at least two color feature quantities as variables for a plurality of regions in each of the N predetermined regions; a degree of similarity between the initial frequency distribution for the plurality of regions and a first frequency distribution model for the first reference target color; and a degree of similarity between the initial frequency distribution for the plurality of regions and a second frequency distribution for the second reference target color. determining the color of the plurality of regions based on the degree of similarity to the model; Obtaining frequency distributions for the first reference target color and the second reference target color using initial frequency distributions of regions determined for the first reference target color and the second reference target color among the plurality of regions.
  • the process of has, Transparency evaluation method described in [5].
  • the step of acquiring the N frequency distributions frequency distributions for the first reference target color, the second reference target color, and the comparative color are acquired in each of the N predetermined regions, and the frequency distributions for the first reference target color obtaining a frequency distribution of the target color based on a frequency distribution for the target color and a frequency distribution for the second reference target color;
  • the second reference target color is the target color in a second transparent state different from the first transparent state,
  • the comparison and contrast color is a color different from the target color,
  • the transparency is evaluated based on the angle of the center of gravity vector with respect to the transparency change reference vector, the angle of the center of gravity vector with respect to the color change reference vector, and the length of the center of gravity vector,
  • the transparency change reference vector is a vector directed from the first barycenter position to a third barycenter position of the second reference
  • the transparency when there is a comparison color different from the target color on the evaluation plate to be evaluated for transparency, the transparency can be evaluated based on the relationship between the transparency change reference vector and the color change reference vector.
  • the at least two color features include hue and saturation.
  • the transparency evaluation method according to any one of [1] to [7].
  • FIG. 1 is a plan view of an evaluation plate used in a method for evaluating an evaluation target according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a cross section of a well.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of an evaluation system for an evaluation target according to an embodiment.
  • FIG. 4 is a drawing showing an example of an image of an evaluation plate (plate image).
  • FIG. 5 is a drawing showing a flowchart of an example of a transparency evaluation method.
  • FIG. 6 is a drawing showing an example of an HSV image.
  • FIG. 7 is a drawing showing a histogram of an example of a frequency distribution created for a well.
  • FIG. 8 is a drawing showing an example of an image corresponding to the frequency distribution for the first reference target color.
  • FIG. 1 is a plan view of an evaluation plate used in a method for evaluating an evaluation target according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a cross section of a well.
  • FIG. 3 is a schematic diagram
  • FIG. 9 is a drawing showing an example of an image corresponding to the frequency distribution for the second reference target color.
  • FIG. 10 is a drawing showing an example of an image corresponding to the frequency distribution for yellow (comparison and contrast color).
  • FIG. 11 is a drawing for explaining the process of shifting image data when the frequency distribution is displayed as an image.
  • FIG. 12 is a drawing showing the image shown in FIG. 8 shifted by the step of shifting the image data when the frequency distribution is displayed as an image.
  • FIG. 13 is a schematic diagram for explaining the process of evaluating transparency.
  • FIG. 14 is a schematic diagram showing the results of an experimental example.
  • the Ames test is known as a test for evaluating the safety of a specimen.
  • test cells that have been genetically modified to be unable to synthesize amino acids by performing genetic manipulation on amino acid synthesis genes are used as test specimens.
  • a sample is added to the cells. Thereafter, the cells are cultured under certain conditions. If the sample causes a mutation in the cell's amino acid synthesis genes, the cell is able to synthesize amino acids again. Therefore, genotoxicity is evaluated by checking whether mutations have occurred and whether cells have proliferated.
  • toxicity evaluation may also be performed to confirm whether the specimen is toxic to cells.
  • the transparency evaluation method of this embodiment is suitably used for evaluating whether such a specimen is toxic to cells.
  • the transparency evaluation method according to the present embodiment is applied to the Ames test.
  • the test specimen is a cell.
  • FIG. 1 is a plan view of an evaluation plate 10 used in a transparency evaluation method according to an embodiment.
  • the evaluation plate 10 has a plate 11.
  • Plate 11 has a plurality of wells 13.
  • the plate 11 has 384 wells 13 arranged in two dimensions (16 ⁇ 24).
  • N sections are virtually set on the plate 11.
  • N is an integer of 1 or more.
  • the eight sections are referred to as sections Se1 to Se8.
  • Sections Se1 to Se8 are regions including 4 ⁇ 12 (48) wells 13 (well group).
  • the section Se1 is the solvent control section (the area where the reference target color appears)
  • the section Se8 is the positive control section (the area where the comparison color appears).
  • the solvent control compartment serves as the negative control compartment.
  • the well 13 is a recess formed in the plate 11.
  • the well 13 holds the evaluation target 14.
  • evaluation objects 14a to 14h When the evaluation objects 14 held in the wells 13 belonging to each of the sections Se1 to Se8 are separately explained, they are referred to as evaluation objects 14a to 14h.
  • the evaluation objects 14a to 14h have a culture solution in which cells are dispersed (or suspended). All 384 wells 13 hold the same amount of culture solution. The amount of cells in the culture medium held in the wells 13 is also the same between the wells 13. Examples of cells include microorganisms having amino acid auxotrophic mutations, cells derived from organisms, and the like.
  • Microorganisms having amino acid auxotrophic mutations include histidine-auxotrophic Salmonella typhimurium (e.g., TA1535, TA1537, TA97, TA97a, TA98, TA100, TA92, TA94, TA102, TA104, TA1538, TA7001, TA7002, TA7003, TA7004, TA70 05, TA7006, various YG strains, etc.), tryptophan-requiring Escherichia coli (for example, WP2, WP2uvrA, WP2/pKM101, WP2uvrA/pKM101, etc.), and other microorganisms.
  • histidine-auxotrophic Salmonella typhimurium e.g., TA1535, TA1537, TA97, TA97a, TA98, TA100, TA92, TA94, TA102, TA104, TA1538, TA7001,
  • Cells derived from living organisms include, for example, cultured cells derived from mammals, cells derived from other vertebrates, cells derived from insects, and the like.
  • the cells included in the evaluation objects 14a to 14h may be a mixture of a plurality of types of cells.
  • An example of a culture medium is a phosphate buffer containing a small amount of amino acids.
  • the evaluation objects 14a to 14h further include an indicator.
  • the amount of indicator is the same for the evaluation targets 14a to 14h (ie, the same for all wells 13).
  • the indicator is a pH indicator.
  • An example of a pH indicator is bromocresol purple.
  • the color of the pH indicator in this embodiment is purple (target color) in the case of a negative result (if no mutation has occurred in the cell), and purple (target color) in the case of a positive result (in the case that a mutation has occurred in the cell). It is yellow (comparison color).
  • the evaluation objects 14b to 14g further include a liquid (sample liquid) in which a specimen is dissolved or uniformly dispersed in a solvent, in addition to the culture medium in which the cells are dispersed and the indicator. Therefore, the wells 13 in the sections Se2 to Se7 that hold the evaluation objects 14b to 14g are wells that hold specimens (sample wells).
  • the specimen is a substance (for example, a chemical substance) whose safety (for example, cytotoxicity, genotoxicity, etc.) should be evaluated.
  • the solvent include water, dimethyl sulfoxide (DMSO), and the like.
  • the evaluation targets 14b to 14g are the same except for the difference in concentration, which is one of the test conditions for the specimen.
  • the amount of sample liquid in the evaluation target 14b of all wells 13 belonging to section Se2 is the same. The same applies to the sections Se3 to Se7.
  • the evaluation target 14a includes, in addition to the culture solution containing the cells and the indicator, a solvent control solution that does not substantially affect the color of the indicator and the cells. Therefore, the well 13 of the section Se1 holding the evaluation target 14a is a solvent control well (first reference target color well).
  • the solvent control solution is the solvent used for the sample solution. However, the solvent control solution may be any liquid that does not affect the cells. Examples of solvent control solutions include water and DMSO.
  • the amount of the solvent control solution in the evaluation target 14a is the same in all the wells 13 belonging to the section Se1.
  • the evaluation target 14h includes, in addition to the culture solution containing the cells and the indicator, a positive control solution that changes the color of the indicator to yellow. Therefore, the well 13 of the section Se8 holding the evaluation target 14h is a positive control well (comparative control color well).
  • the positive control solution is a solution containing a positive control compound and a solvent.
  • the positive control compound may be any compound known to be positive for cells. Examples of positive control compounds include 9AA (9-Aminoacridine), 4-NQO (4-Nitroquinoline-N-oxide), 2-AA (2-Aminoanthracene) and 2-NF (2-Nitrofluorene).
  • the solvent does not have to be the same as the solvent used for the sample solution. Examples of the solvent include water, DMSO, and the like. The amount of positive control solution held in all wells 13 belonging to compartment Se8, which is a positive compartment, is the same.
  • the evaluation targets 14a to 14h further include S9mix.
  • S9mix is a liquid made by adding coenzymes to animal liver extract.
  • S9mix may be a liquid prepared by adding cofactors involved in the electron transport system, such as NADPH, to the 9,000 ⁇ g supernatant of liver homogenate (S9).
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a cross section of a well.
  • the evaluation target 14 is schematically illustrated.
  • the shape of the well 13 in plan view (the shape seen from the depth direction of the well 13) is a square.
  • An example of the length of one side of the opening of the well 13 is 3.0 mm to 4.0 mm.
  • An example of the depth of the well 13 is 9.0 mm to 15.0 mm.
  • a plate 11 having wells of this size is known as a microplate.
  • the well 13 tapers toward the bottom 13a. Therefore, the area of the bottom portion 13a is smaller than the area of the opening 13b of the well 13.
  • the shape of the well 13 in plan view may be circular. When the shape of the well 13 in plan view has corners like the above-mentioned square, the corners may be rounded.
  • the well 13 may have a columnar shape that does not taper toward the bottom 13a.
  • the evaluation plate 10 is a plate in which the safety evaluation of the evaluation object 14 is possible after the evaluation object 14 corresponding to each well 13 of the plate 11 is injected and subjected to a certain culture treatment.
  • the preparation procedure for the evaluation plate 10 will be explained based on an example of the Ames test.
  • the evaluation plate 10 can be prepared, for example, by the following procedure.
  • test specimen to be used bacteria with amino acid auxotrophic mutations, such as Salmonella typhimurium: TA100 strain, TA98 strain, TA1535 strain, TA1537 strain, Escherichia coli: WP2uvrA strain, etc.
  • Salmonella typhimurium TA100 strain, TA98 strain, TA1535 strain, TA1537 strain, Escherichia coli: WP2uvrA strain, etc.
  • step 2A The sample prepared in step 2A is dissolved or suspended in an appropriate medium, and this is serially diluted using the medium to prepare a concentration series of the sample liquid.
  • six specimen solutions with different concentrations are prepared.
  • indicator medium minimum medium containing a pH indicator and carbon source and deficient in amino acids
  • Step 11A A 384-well plate (plate 11) is incubated at 37°C for 48 hours. As a result, an evaluation plate 10 is obtained.
  • step 6A When detecting a toxic specimen after being metabolized by various enzymes in the body, in step 6A, as mentioned above, an animal liver extract with coenzyme added (S9 mixture) is used. Prepare and mix 0.175 to 0.7 mL of the culture solution of the test specimen, 5.78 to 5.25 mL of the medium, and 1.05 mL of the S9 mixture. The mixture is called a bacterial solution prepared in the presence of metabolic activation. Thereafter, the steps after Step 7A are performed using a bacterial solution prepared under conditions in the presence of metabolic activation instead of the bacterial suspension prepared in the absence of metabolic activation.
  • S9 mixture animal liver extract with coenzyme added
  • FIG. 3 is a schematic diagram of the evaluation system 20 according to one embodiment.
  • the evaluation system 20 includes an observation device 30 and an image processing device 40.
  • the observation device 30 includes a stage (plate holding section) 31, an illumination device 32, and an imaging section 33.
  • Stage 31 supports evaluation plate 10.
  • the evaluation plate 10 is placed on the stage 31 such that the bottom of the evaluation plate 10 (the bottom 13a side of the well 13) is located on the stage 31 side.
  • the stage 31 is configured to pass light 34 output from the illumination device 32 toward the imaging section 33 .
  • the material of the stage 31 may have optical transparency, or an opening or a window portion that transmits the light 34 may be formed in a region of the evaluation plate 10 that corresponds to the region where the 384 wells 13 are formed. You can leave it there.
  • the stage 31 is configured to be transportable in the direction of the white arrow in FIG. 3 .
  • the illumination device 32 is arranged on the evaluation plate 10 (on the opposite side from the stage 31 when viewed from the evaluation plate 10).
  • the illumination device 32 irradiates the evaluation plate 10 with light 34 .
  • An example of the lighting device 32 is LED lighting, and an example of the light 34 is light with a wavelength of 400 nm to 780 nm.
  • the imaging unit 33 receives the light 34 that has passed through the evaluation plate 10 and images the evaluation plate 10.
  • the imaging unit 33 acquires a color image (RGB image) that is substantially the same as when the evaluation plate 10 is visually observed.
  • the imaging section 33 includes an imager 33a and a light condensing section 33b.
  • Examples of the imager 33a include a two-dimensional sensor (or camera) and a line sensor.
  • Examples of two-dimensional sensors are CCD cameras and CMOS cameras.
  • the condensing section 33b condenses the light 34 and makes it incident on the imager 33a.
  • the light condensing section 33b includes at least one lens.
  • the image capturing section 33 does not need to have the condensing section 33b.
  • the imaging area of the imaging unit 33 is smaller than the size of the evaluation plate 10.
  • the imaging unit 33 images the evaluation plate 10 in multiple times.
  • the imaging unit 33 may include a plurality of imaging units 33, and the imaging area of the imaging unit 33 may be large enough to image the entire evaluation plate 10 at once.
  • the imaging unit 33 is connected to the image processing device 40 by wired communication or wireless communication, and outputs the acquired image (specifically, image data) to the image processing device 40. Images may be input from the imaging unit 33 to the image processing device 40 via, for example, a storage medium such as a DVD.
  • the positions of the illumination device 32 and the imaging section 33 with respect to the evaluation plate 10 may be reversed. That is, in FIG. 3, the evaluation plate 10 may be imaged with the imaging unit 33 disposed above the evaluation plate 10 and the illumination device 32 disposed below the stage 31.
  • a method of imaging the evaluation plate 10 using the observation device 30 will be described.
  • the evaluation plate 10 is placed on the stage 31. While moving the stage 31 in one direction, the evaluation plate 10 is irradiated with light 34 from the illumination device 32 (irradiation step). With the evaluation plate 10 irradiated with the light 34 in this manner, the evaluation plate 10 is imaged using the imaging section 33 (imaging step).
  • the imaging area of the imaging unit 33 is smaller than the size of the evaluation plate 10, a partial image of the evaluation plate 10 is obtained in one imaging operation. Therefore, in the imaging step, the evaluation plate 10 is imaged multiple times using the imaging unit 33 so that the partial images are combined to form an entire image of the evaluation plate 10.
  • the imaging unit 33 inputs the acquired image to the image processing device 40.
  • the image processing device 40 includes an input section 41, a calculation section 42 (execution section), and an output section 43.
  • Image processing device 40 is a computer.
  • the image processing device 40 may further include a storage unit (memory) that is normally included in a computer.
  • the image processing device 40 may be a personal computer that functions as the image processing device 40 by executing various programs, or may be a dedicated device for evaluation.
  • the image processing device 40 functions as an evaluation device or an evaluation support device that evaluates the evaluation plate 10.
  • the input unit 41 is an input means into which (or accepted) data of the image acquired by the imaging unit 33 is input.
  • the calculation unit 42 creates a plate image P1 (see FIG. 4) based on the image input to the input unit 41.
  • FIG. 4 is a drawing showing an example of the plate image P1.
  • Plate image P1 is an image corresponding to evaluation plate 10.
  • portions corresponding to the well 13 and the sections Se1 to Se8 are a well image 13p and section images Se1p to Se8p, respectively.
  • the calculation unit 42 performs various processes for implementing each step of the transparency evaluation method of this embodiment, which will be described later.
  • the calculation unit 42 executes each step, for example, by executing a program that causes a computer to execute each step of the transparency evaluation method.
  • Such a program may be stored in the storage unit (memory), for example.
  • the calculation unit 42 may access the storage unit and acquire the data to be processed.
  • the calculation unit 42 will be described later.
  • the output unit 43 displays and outputs the results of the calculation unit 42 for the evaluator to refer to.
  • the output section 43 may output the results of the calculation section 42 to an external display device, or the output section 43 itself may have a display function.
  • the output unit 43 may output and display the data being processed to the calculation unit 42 .
  • this embodiment uses a pH indicator that changes from purple to yellow when the sample has genotoxicity to cells. Therefore, since the color of the well 13 is purple when the sample does not have genotoxicity to cells, a method for evaluating the transparency of the purple color in the sections Se1 to Se8 will be explained.
  • the above-mentioned “color of the well 13” is the color of the evaluation target 14 held in the well 13.
  • the image processing device 40 converts the input plate image (color image, RGB image) into “Hue”, “Saturation” and It is converted into an HSV image expressed by three combinations of "brightness (value)" (image conversion step S11). Conversion from an RGB image to an HSV image may be performed based on a known conversion formula (or a known program based on the formula).
  • FIG. 6 is a drawing showing an example of the HSV image P2.
  • the HSV image P2 shown in FIG. 6 is an image obtained by converting the plate image P1 shown in FIG. 4 into HSV. Since the HSV image P2 is an image obtained by HSV conversion of the plate image P1, in FIG. 6, the partial images corresponding to the well 13 and the sections Se1 to Se8 in the HSV image P2 are also shown as the well image 13p and the section images Se1p to Se8p. It shows.
  • a frequency distribution (initial frequency distribution ) is created (frequency distribution creation step S12).
  • hue and saturation are employed as the at least two color feature amounts. That is, the frequency distribution in the following explanation is a frequency distribution in which hue and saturation are variables.
  • the image processing device 40 specifies the area of each well image 13p in the HSV image P2. For example, as indicated by the broken line in FIG. 6, a ROI (Region of Interest) may be set in the well image 13p.
  • a state in which an ROI is set in one well image 13p is shown for illustrative purposes.
  • the ROI may be set as a region specified by the evaluator.
  • the image processing device may automatically perform the image processing based on data (shape, size, etc.) of the plate 11 input in advance, an image of the plate 11 with nothing in the well 13, brightness information of the HSV image, etc.
  • An ROI may also be set.
  • the image processing device 40 creates the frequency distribution using image information (hue, saturation, etc.) possessed by a plurality of pixels included in the identified well image 13p.
  • a frequency distribution is created by dividing the hue and saturation into 0 to 55, respectively, and extracting feature amounts (combinations of hue and saturation).
  • FIG. 7 is a diagram showing a histogram that is an example of the created frequency distribution.
  • the horizontal axis in FIG. 7 indicates hue and saturation, and the vertical axis indicates the number of pixels.
  • FIG. 7 is a histogram for one well image 13p.
  • the colors of the wells 13 included in each of the sections Se1 and Se8 are determined (first color determination step S13).
  • the colors of the well 13 are assumed to be purple and yellow, which are the colors before and after the pH indicator changes color. Furthermore, since the color appears to be different depending on the transparent state, purple is divided into purple in the first transparent state and purple in the second transparent state. Therefore, in the first color determination step S13, it is determined which of the three colors, purple in the first transparent state, purple in the second transparent state, and yellow, is the color of the well 13.
  • the purple color of the first transparent state is the purple color of the transparent state when the specimen is not toxic to cells, and in this embodiment, it is the color when the transparency is low (there is turbidity).
  • the purple color of the second transparent state is the purple color of the transparent state when the specimen is toxic to cells, and in this embodiment, it is the color when the specimen is highly transparent (no turbidity).
  • the purple color in the first transparent state may be referred to as the first reference target color
  • the purple color in the second transparent state may be referred to as the second reference target color
  • the plurality of frequency distributions created in the frequency distribution creation step S12, the frequency distribution model of the first reference target color (first frequency distribution model), and the frequency distribution of the second reference target color is calculated.
  • the degree of similarity between the target color area and the yellow area is calculated.
  • the first reference target color area, the second reference target color area, and the yellow area are areas of each color specified by a combination of hue and saturation.
  • the evaluator may set the first reference target color area, the second reference target color area, and the yellow area in advance.
  • the similarity may be calculated using, for example, Euclidean distance or a correlation coefficient.
  • the degree of similarity may be calculated using pattern matching, for example. Deep learning may be used to calculate the similarity.
  • the well 13 corresponding to the frequency distribution having a predetermined degree of similarity (for example, the maximum degree of similarity) with respect to the frequency distribution model of the first reference target color calculated as described above is It is determined that the well 13 has the reference target color.
  • a well 13 corresponding to a frequency distribution having a predetermined degree of similarity (for example, maximum similarity) to the frequency distribution model of the second reference target color is determined to be a well 13 of the second reference target color.
  • a well 13 corresponding to a frequency distribution having a predetermined degree of similarity (for example, the maximum degree of similarity) to the yellow frequency distribution model is determined to be a yellow well 13.
  • the frequency distribution models for each of the first reference target color, the second reference target color, and yellow are frequency distributions with hue and saturation as variables, and are frequency distributions that serve as standards for color determination and the like.
  • the frequency distribution model is, for example, (a) It may be a frequency distribution created based on images of a plurality of wells showing the first reference target color, the second reference target color, and yellow by conducting a preliminary experiment in advance; (b) Specify the first reference target color, second reference target color, and yellow from the color palette list, and the frequency distribution obtained for each color may be used, or (c) The frequency distribution may be obtained by specifying areas in the plate image P1 that are clearly the first reference target color, the second reference target color, and yellow.
  • the frequency distribution models of the first reference target color, the second reference target color, and yellow are updated using the above-mentioned reference target color (model update step S14).
  • the frequency distribution for the first reference target color is calculated by averaging the frequency distribution of all the wells 13 determined to be the first reference target color and the frequency distribution model for the first reference target color. Update the model. Similarly, by averaging the frequency distribution of all the wells 13 determined to be the second reference target color and the frequency distribution model for the second reference target color, the frequency distribution model for the second reference target color is calculated. Update. Similarly, the frequency distribution model for yellow is updated by averaging the frequency distribution of all the wells 13 determined to be yellow and the frequency distribution model for yellow.
  • the frequency distribution model used in the steps after the model update step S14 is an updated frequency distribution model, unless otherwise specified.
  • the colors of all the wells 13 of the evaluation plate 10 are determined using the first reference target color, the second reference target color, and the yellow frequency distribution model (second color determination step S15).
  • the determination method is the same as in the first color determination step S13, except that the frequency distribution corresponding to all the wells 13 of the evaluation plate 10 is used.
  • a well 13 corresponding to a frequency distribution having a predetermined degree of similarity (for example, maximum similarity) to the frequency distribution model of the first reference target color is determined to be a well 13 of the first reference target color.
  • a well 13 corresponding to a frequency distribution having a predetermined degree of similarity (for example, maximum similarity) to the frequency distribution model of the second reference target color is determined to be a well 13 of the second reference target color.
  • a well 13 corresponding to a frequency distribution having a predetermined degree of similarity (for example, the maximum degree of similarity) to the yellow frequency distribution model is determined to be a yellow well.
  • each average frequency distribution is used as an evaluation image (evaluation image data).
  • the evaluation image is an image (image data) obtained by expressing the frequency in the average frequency distribution as a brightness value and performing binarization processing.
  • the evaluation image in this embodiment has the same size for all average frequency distributions.
  • FIGS. 8 to 10 are drawings for explaining evaluation images for each color, they are not evaluation images for each color in the same section.
  • FIG. 8 is a drawing showing an example of the evaluation image 51 corresponding to the first reference target color.
  • FIG. 9 is a drawing showing an example of the evaluation image 52 corresponding to the second reference target color.
  • FIG. 10 is a drawing showing an example of the evaluation image 53 corresponding to yellow (comparison and contrast color).
  • the horizontal axis horizontal direction
  • the vertical axis vertical direction
  • the white areas in each figure are areas with high frequencies (number of pixels) in the corresponding average frequency distribution.
  • FIG. 8 is an image corresponding to the first reference target color
  • the white area is the first reference target color expressed by a combination of hue and saturation in the average frequency distribution of the section corresponding to the evaluation image 51. This is area A1.
  • the white area is expressed by a combination of hue and saturation in the average frequency distribution of the section corresponding to the evaluation image 52. This is the reference target color area A2.
  • the white area is a yellow color expressed by a combination of hue and saturation in the average frequency distribution of the section corresponding to the evaluation image 53. This is area (comparison and contrast color area) A3.
  • the first reference target color area, the second reference target color area, and the comparative color area are shown by broken lines so as to surround the plurality of white areas.
  • the first reference target color area A1, the second reference target color area A2, and the yellow area A3 in the evaluation images 51, 52, and 53 are It is shifted in a predetermined direction (shift step S17).
  • the shift step S17 will be explained using FIG. 11 using the evaluation image 51 as an example.
  • the evaluation image 51 (specifically, its image data) is shifted by a certain amount in the direction of the outlined arrow (predetermined direction) shown in FIG.
  • the example shown in FIG. 11 shows an example in which image data is shifted in the hue direction.
  • the image data of the evaluation image 51 that is moved outside the image display area due to the shift is moved to the opposite side of the shift direction (in other words, it is moved forward).
  • FIG. 11 when the image data is shifted downward in the display area of the evaluation image 51, the data that has fallen out of the display area is moved to the opposite side of the display area, as shown by the dashed arrow. Move (move) to the (top) side (upper side).
  • FIG. 12 is a drawing showing the evaluation image 51 after the shift.
  • the cross mark (specifically, its center position) in FIG. 12 indicates the gravity center position G1 of the shifted first reference target color area A1.
  • image data is similarly shifted for the evaluation images 51 created in each of the sections Se1 to Se8.
  • Image data is similarly shifted for the evaluation images 52 and 53 created in each of the sections Se1 to Se8.
  • FIG. 13 is a schematic diagram for explaining the evaluation step S18.
  • the gravity center vector V1 is a vector directed from the reference gravity center position (comparison source gravity center position) for transparency evaluation to the gravity center position of the transparency evaluation area.
  • the section Se1 is a solvent target section (negative control section) composed of solvent control wells for the first reference target color (first reference target color wells)
  • the purple transparency of the section Se1 is Evaluate the transparency of other sections based on . Therefore, in the present embodiment, the center of gravity position (first center of gravity position) G1 of the first reference target color area A1 in the average frequency distribution (first reference frequency distribution) for the first reference target color of the partition Se1 is set to the reference center of gravity position.
  • the transparency evaluation area is the purple area (target color area).
  • the first reference target color area A1 of the average frequency distribution for the first reference target color (purple in the first transparent state) and the second reference target color (purple in the second transparent state) The area including the second reference target color area A2 of the average frequency distribution is adopted as the transparency evaluation area.
  • Such a transparency evaluation area can be obtained by, for example, the following first method or second method.
  • An average frequency distribution of purple (target color) is created in each of the sections Se1 to Se8 (step of obtaining N frequency distributions).
  • a shift step S17 is performed on image data for displaying this average frequency distribution as an image.
  • a transparency evaluation area is set based on the image corresponding to the average frequency distribution of purple obtained through the shift step S17.
  • Images corresponding to the average frequency distribution for the first reference target color (purple in the first transparent state) and the average frequency distribution for the second reference target color (purple in the second transparent state) after passing through the shift step S17 are superimposed.
  • a transparency evaluation area may be set in the image obtained by Superimposing images corresponding to the average frequency distribution for the first reference target color (purple in the first transparent state) and the average frequency distribution for the second reference target color (purple in the second transparent state) Adding and averaging the average frequency distribution for the color (purple in the first transparent state) and the average frequency distribution for the second reference target color (purple in the second transparent state) to create an average frequency distribution for purple (target color). (Step of acquiring N frequency distributions).
  • the center of gravity position of the transparency evaluation area is referred to as the center of gravity position (second center of gravity position) G2.
  • the transparency evaluation area is a purple area, and as described above, includes an area of the first reference target color (target color in the first transparent state) and an area of the second reference target color (target color in the second transparent state). This is an area that includes Such a transparency evaluation area is obtained in each of the sections Se1 to Se8 as described above, and the center of gravity of the obtained transparency evaluation area is defined as the center of gravity G2.
  • centroid vector V1 is calculated from the centroid position G1 to the centroid of each of the sections Se1 to Se8, as shown in FIG. This is a vector toward position G2.
  • the first reference vector V2 is a centroid vector directed from the centroid position G1 of the first reference target color area A1 to the centroid position (third centroid position) G3 of the second reference target color area A2, and is of the same color (purple in this embodiment).
  • ) is a transparency change reference vector indicating the direction of change in transparency.
  • the second reference vector V3 is a center of gravity vector directed from the center of gravity G1 of the first reference target color area A1 to the center of gravity G4 of the yellow area A3 (fourth center of gravity), and indicates the direction of color change from purple to yellow. This is a color change reference vector.
  • centroid position G1 of the first reference target color area A1 of the partition Se1 is used as the base point of the centroid vector V1 as described above, the first The center of gravity G1 of the first reference target color area A1 of the section Se1 is also used as the center of gravity G1 of the reference target color area A1.
  • the centroid position G3 of the second reference target color area A2 the centroid position G3 of the second reference target color area A2 included in the average frequency distribution for the second reference target color in any of the sections Se1 to Se8 can be adopted.
  • the centroid position of the second reference target color area A2 in the average frequency distribution (second reference frequency distribution) for the second reference target color in the section Se7 can be adopted. This is because, if the sample has toxicity to cells, the color of the well 13 included in the section Se7 is likely to become the second reference target color.
  • the center of gravity position of the second reference target color area A2 that has undergone the shift step S17 is employed as the center of gravity position G3.
  • the center of gravity position G4 of the yellow area A3 included in the average frequency distribution for the yellow area in any of the sections Se1 to Se8 can be adopted.
  • the gravity center position G4 of the yellow region A3 of the average frequency distribution in the section Se8 can be adopted. Since the section Se8 is a positive control section and is expected to change to yellow, by using the yellow region A3 of the average frequency distribution for yellow (comparison control frequency distribution) in the section Se8, the yellow region A3 is A more accurate center of gravity position G4 can be obtained as the center of gravity position.
  • the center of gravity position of the yellow area A3 that has undergone the shift step S17 is adopted as the center of gravity position G4.
  • the angle ⁇ 1 between the center of gravity vector V1 and the first reference vector V2 is compared with the angle ⁇ 2 between the center of gravity vector V1 and the second reference vector V3.
  • the transparency index T is calculated based on equation (1).
  • the angle ⁇ 2 is larger than the angle ⁇ 1, the transparency index T is calculated based on equation (2).
  • T 1-Ln (when ⁇ 1 ⁇ 2)...(1)
  • T 1+Ln (when ⁇ 1> ⁇ 2)...(2)
  • Ln in equations (1) and (2) is the length of the center of gravity vector V1 divided by the image size (length L of one side) of the evaluation image, and is the standardization of the center of gravity vector V1. length (or normalized length).
  • the transparency index T being smaller than 1 means that the transparency is high (in this embodiment, the cells are dead). That is, the smaller the transparency index T is less than 1, the more toxic the specimen is to cells. This point will be specifically explained.
  • the case where the transparency index T becomes smaller than 1 is the case of formula (1), that is, the case where the angle ⁇ 1 is less than or equal to the angle ⁇ 2.
  • the center of gravity vector V1 is located on the first reference vector V2 side.
  • the larger the length Ln of the standardized gravity center vector V1 the smaller T becomes.
  • a large length Ln of the standardized gravity center vector V1 means that the gravity center position G2 is far from the gravity center position G1. Therefore, when the transparency index T is smaller than 1, it indicates that the center of gravity G2 is located on the side of the center of gravity G3 from the center of gravity G1, which means that the transparency is high. Therefore, by using the transparency index T, it is possible to evaluate transparency objectively and quantitatively. For example, a certain threshold value is predetermined for the transparency index T, and if the transparency index T is smaller than the threshold value, it can be evaluated that the specimen is toxic to cells.
  • a transparency index T is calculated for each of the sections Se1 to Se8. Therefore, the transparency, that is, the toxicity can be evaluated for each of the sections Se1 to Se8. Alternatively, for example, if the same specimen is used in sections Se1 to Se8 except for different concentrations, and the transparency index T in any of the sections Se1 to Se8 is smaller than the above threshold value, from a safety perspective, The specimen may be determined to be toxic to cells.
  • the transparency of the sections Se1 to Se8 on the evaluation plate 10 can be substantially automatically evaluated by analyzing the plate image P1. Therefore, for example, the objectivity and accuracy of transparency evaluation can be improved compared to when an evaluator visually evaluates. Furthermore, since the transparency of the sections Se1 to Se8 on the evaluation plate 10 can be substantially automatically evaluated by analyzing the plate image P1, the reproducibility of the evaluation is also improved.
  • centroid position G1 of the first reference target color area A1 corresponding to purple in the first transparent state is adopted as the evaluation standard, for example, the purple area including the first transparent state and the second transparent state is used as the standard. Changes in transparency can be evaluated with higher accuracy than when
  • the toxicity of the specimen to cells can also be evaluated more accurately based on the evaluation results of the transparency of each section Se1 to Se8.
  • the model update step S14 As one embodiment, a case has been described in which the model update step S14 is included.
  • the model updating step S14 by updating the frequency distribution model of each color based on the evaluation plate 10 to be evaluated, it is possible to obtain a frequency distribution model of each color according to the evaluation plate 10. As a result, the transparency of the sections Se1 to Se8 in the evaluation plate 10 can be evaluated more appropriately, and as a result, the accuracy of the toxicity evaluation for the cells of the specimen is improved.
  • the center of gravity positions G1, G2, G3, and G4 that define the center of gravity vector V1, the first reference vector V2, and the second reference vector V3 are also obtained based on the image of the evaluation plate 10. Therefore, for example, compared to the case where the center of gravity positions G1, G2, G3, and G4 obtained for the initial frequency distribution model of each color are used, the center of gravity vector V1, the first reference vector V2, and the A two-reference vector V3 can be defined. As a result, the transparency of the sections Se1 to Se8 in the evaluation plate 10 can be evaluated more appropriately, and as a result, the accuracy of the toxicity evaluation for the cells of the specimen is improved.
  • the evaluation method includes the shift step S17
  • the shift step S18 is a step performed to appropriately separate the center of gravity G1 of the first reference target color area A1 and the center of gravity G4 of the yellow area A3, the shift amount, shift direction, etc. may be set so that the center of gravity G1 of the first reference target color area A1 and the center of gravity G4 of the yellow area A3 can be separated.
  • the average frequency distributions of the first reference target color, the second reference target color, and yellow are created for each of the sections Se1 to Se8.
  • the average frequency distribution of purple (target color) can be obtained using the average frequency distribution of the first reference target color and the second reference target color.
  • a frequency distribution model of purple (target color) can also be created based on the frequency distribution models of the first reference target color and the second reference target color.
  • the evaluation plate 10 since an image of the evaluation plate 10 is acquired, it is possible to determine the presence or absence of a colony in the well 13 or the presence or absence of a foreign substance through image processing.
  • the presence or absence of genotoxicity can also be evaluated by the presence or absence of colonies.
  • the above-mentioned foreign matter is generated, for example, when cells die due to the influence of the specimen. Therefore, it is also possible to determine whether a sample is toxic to cells based on the presence or absence of foreign substances.
  • determination of the presence or absence of colonies, determination of foreign substances, etc. may be performed together with evaluation of genotoxicity by color determination. Therefore, the evaluation method according to the present embodiment, which allows such evaluations to be performed in parallel, is easily applied to the Ames test.
  • View-Plate-384 manufactured by Perkinelmer was used as the plate 11.
  • View-Plate-384 had 384 wells 13, as shown in FIG.
  • sections Se1 to Se8 were virtually set.
  • an Ames test kit (“Ames MPF TM Penta I Microplate Format Mutagenicity Assay") manufactured by Xenometrix, which includes an indicator, a culture solution, and the like, was used.
  • the preparation procedure for the evaluation plate 10 in the Ames test was performed according to the steps from the 1A process to the 11A process described above.
  • test specimens (cells), specimens, specimen solutions, positive control compounds, and positive control compounds used in the experimental examples were as follows.
  • Section Se1 was used as a negative control section
  • section Se8 was used as a positive control section.
  • the concentrations of the samples in Sections Se2 to Se7 in Step 8A were as follows. Compartment Se2: 1.95 ⁇ g/mL Section Se3: 7.81 ⁇ g/mL Section Se4: 31.3 ⁇ g/mL Section Se5: 125 ⁇ g/mL Section Se6: 500 ⁇ g/mL Section Se7: 2000 ⁇ g/mL
  • the concentration of the positive control compound in step 8A in section Se8 was 15 ⁇ g/mL.
  • an experiment was conducted without metabolic activation.
  • an evaluation plate 10 was prepared according to the steps from the 1A step to the 11A step described above, and a plate image P1 was obtained using the observation device 30 schematically shown in FIG.
  • a color camera with a resolution of 20 ⁇ m/pixel was used as the imaging unit 33 included in the observation device 30.
  • the color camera was placed below the evaluation plate 10 as shown in FIG. LED lighting was used for illumination, and light was irradiated from above the evaluation plate 10.
  • the evaluation plate 10 was imaged while being transported. The conveyance speed was 4.28 mm/s.
  • the transparency evaluation method described using FIG. 5 was performed on the plate image P1 of the evaluation plate 10 obtained by imaging as described above.
  • the transparency of each section Se1 to Se7 was evaluated. Since section Se8 is a positive control section, the transparency index T was not calculated. That is, the transparency of section Se8 was not evaluated.
  • the frequency distribution was a frequency distribution with hue and saturation as variables. Hue and saturation were evaluated on a scale of 0 to 55.
  • For the frequency distribution model in the first color determination step S13 areas in the plate image P1 that are clearly the first reference target color, the second reference target color, and yellow are specified, and the frequency distribution for these areas is used. The maximum similarity was adopted as the predetermined similarity in the first color determination step S13 and the second color determination step S15.
  • the transparency evaluation area (purple area) was set based on the first method described above.
  • FIG. 14 is a plot of the transparency index T obtained by equations (1) and (2) for each of the sections Se1 to Se7.
  • "1", "2", . . . , "7" on the horizontal axis of FIG. 14 indicate the sections Se1, Se2, . . . , Se7, respectively.
  • the vertical axis is the transparency index T.
  • Each plot point is the average value of the evaluation results for the three evaluation plates 10 described above.
  • the broken line in the figure indicates the standard deviation of the evaluation results for the three evaluation plates 10 described above.
  • the transparency index T decreases in the sections Se6 and Se7, where the concentration of the specimen is higher.
  • the specimen used is toxic to the test specimen.
  • toxicity may be evaluated based on the presence or absence of a section where the transparency index T is located below the threshold value.
  • the safety evaluation method to which this transparency evaluation method is applied is not limited to the Ames test, and includes, for example, a test using a pH indicator, a test using a dye (for example, MTT assay, protein quantification), and a test using luminescence or fluorescence. It can also be applied to tests such as ATP assays.
  • the present transparency evaluation method since the present transparency evaluation method is applied to the Ames test, the embodiment has been described using as an example a case where the color of the indicator changes from purple to yellow. However, the present transparency evaluation method may be implemented by focusing only on changes in the transparency of purple (target color).
  • the acquisition of the frequency distribution for yellow in the above embodiment can be omitted. Since the frequency distribution for yellow is not used, the use of the second reference vector can also be omitted.
  • transparency may be evaluated based on the angle ⁇ 1 and length between the first reference vector and the center of gravity vector. For example, a threshold value may be set in advance for angle ⁇ 1, and transparency may be evaluated by applying equations (1) and (2) according to the relationship between the threshold value and angle ⁇ 1 instead of angle ⁇ 2. .
  • the shift step S17 in the above embodiment is a measure to further distance the center of gravity G1 of the first reference target color area A1 from the center of gravity G4 of the yellow area A3. Therefore, when the frequency distribution for yellow is not used, In this case, the shift step S17 may not be performed.
  • the evaluation was performed using the angle ⁇ 1 and the length of the center of gravity vector with respect to the first reference vector.
  • a vector has a direction and a size, transparency can be evaluated if the center of gravity vector is obtained.
  • transparency was evaluated based on the relationship between the center of gravity vector, the first reference vector, and the second reference vector.
  • the first reference vector and the second reference vector may not be used.
  • a threshold value may be set as described above for the angle of the center of gravity vector with respect to the direction of change in saturation.
  • the average frequency distribution obtained for the sections Se1 to Se8 was used to identify the first reference target color region, the second reference target color region, and the yellow region.
  • the first reference object color region, the second reference object color region and the yellow region in the frequency distribution model itself for the first reference object color, the second reference object color and yellow may be used.
  • This transparency evaluation method does not need to include the model updating step S14 described in the above embodiment.
  • processing such as color judgment using the updated frequency distribution model if the initial frequency distribution model (unupdated frequency distribution model) for the first reference target color, second reference target color, and yellow is used. good.
  • the centroid position G3 of the second reference target color area A2 includes the second reference target color area obtained by performing the shift step S17 on the second reference target color area in the frequency distribution model for the second reference target color.
  • the center of gravity position may also be used. Note that in an embodiment in which the shift step S17 is not performed, the center of gravity position of the second reference target color region in the frequency distribution model for the second reference target color may be used. In these embodiments, it is not necessary to perform the color determination for the second reference target color in the first color determination step S13, and accordingly, the model update step S14 is performed for the frequency distribution model for the second reference target color. You don't have to. Such a configuration is particularly effective, for example, when determining the color of the well 13 when purple is not divided into the first reference target color and the second reference target color, but is determined as purple including the first reference target color and the second reference target color.
  • the first color determination step S13 and model update step S14 may not be performed.
  • the color of each well 13 may be determined based on the frequency distribution corresponding to each well 13 created in the frequency distribution creation step S12.
  • the color may be determined based on the frequencies in the first reference target color area, the second reference target color area, and the yellow area in the frequency distribution corresponding to each well 13.
  • the color of the well 13 corresponding to a frequency distribution in which a frequency equal to or higher than a certain threshold exists in the first reference target color region may be determined to be the first reference target color.
  • Color determination for the second reference target color and color determination for yellow may be performed in the same manner. In this case, it is not necessary to use frequency distribution models for each of the first reference target color, the second reference target color, and yellow.
  • the target color is purple and the comparative color is yellow.
  • these colors correspond to colors that serve as indicators in evaluation tests, and are not limited to purple, yellow, etc.
  • a frequency distribution that uses hue and saturation instead of a frequency distribution that uses hue and saturation as variables, it is also possible to use a frequency distribution that uses hue and lightness or lightness and saturation as variables.
  • the number of variables defining the frequency distribution may be three or more.
  • the number (N) of predetermined areas in the plate image is not limited to eight.
  • the N predetermined regions in the plate image are regions corresponding to eight sections Se1 to Se8 including section Se1 (negative control section) and section Se8 (positive control section).
  • the N predetermined regions may be seven sections Se1 to Se7 that do not include section Se8, which is a positive control section.
  • the plate image may include an area corresponding to the positive control section (an area where a comparison color appears) as well as the N predetermined areas.
  • the N predetermined areas may be the negative control area Se1 and areas Se2 to Se7 that do not include the area Se8.
  • the N predetermined regions include at least one of a region corresponding to the positive control section (a region where the comparison color appears) and a region corresponding to the negative control section (the region where the first reference target color appears). Good too.

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Abstract

一実施形態に係る透明度評価方法は、プレート画像におけるＮ個の所定領域の対象色に対するＮ個の度数分布であり、少なくとも２つの色特徴量を変量とするＮ個の度数分布を取得する工程と、第１透明状態の対象色である第１基準対象色に対する第１基準度数分布とＮ個の度数分布とに基づいて透明度を評価する工程とを備え、プレート画像は、試験体を含む評価対象が複数のウェルに保持された評価プレートに対応する画像であり、複数のウェルは検体を含む評価対象を保持した少なくとも１つの検体用ウェルを有し、Ｎ個の所定領域の少なくとも１つは検体用ウェルに対応する画像を含み、透明度を評価する工程では、第１基準度数分布内の第１基準対象色領域の重心位置からＮ個の度数分布内の対象色領域の重心位置に向かう重心ベクトルに基づいて透明度を評価する。

Description

透明度評価方法
　本発明は、透明度評価方法に関する。
　生物学的な安全性評価の一例として、試験体（tester）に検体（test substance）を加えて、たとえば、透明度の変化などを観察し、検体が試験体に対して毒性を有するか否かなどを評価する方法がある。近年、試験体及び検体の量などの低減などのために、例えば、特許文献１、特許文献２、非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３に開示されているような複数のウェルを有するプレートを用いる方法が採用される場合がある。
特開２０１７－６７６０５号公報 特開２０１７－８５９６６号公報
Fluckiger-Isler　S.,　Kamber M., "Direct comparison of the Ames microplate format(MPF) test in liquid medium with the standard Ames pre-incubation assay on agar plates by use of equivocal to weakly positive test compounds.", Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 747, p36-45, 2012. Sui H., Kawakami K., Sakurai N., Hara T., Nohmi T., "Improvement and evaluation of high throughput fluctuation Ames test using 384-well plate with Salmonella typhimurium TA100 and TA98.", Genes and Environment 31(2), p47-55, 2009. Kamber M., Fluckiger-Isler S., Engelhardt G., Jaeckh R., Zeiger E., "Comparison of the Ames II and traditional Ames test responses with respect to mutagenicity, strain specificities, need for metabolism and correlation with rodent carcinogenicity", Mutagenesis 24(4),p359-366, 2009.
　特許文献１、特許文献２等に開示されているように、複数のウェルを有するプレートを用いて試験体あるいは検体を色の変化に基づいて評価する方法において、より客観的で、精度の向上が図れる色の変化の評価方法が求められている。Ａｍｅｓ試験における透明度変化はこのような色の変化の一種であり、試験体に対する検体の影響を評価するために用いられている。そして、より客観的で、精度の向上が図れる透明度評価方法が求められている。
　そこで、本発明は、客観的に評価可能であって、精度向上が図れる透明度評価方法を提供することを目的とする。
　本発明に係る透明度評価方法は、以下の［１］～［８］の態様を含む。
［１］プレート画像におけるＮ個（Ｎは１以上の整数）の所定領域の対象色に対するＮ個の度数分布であって、少なくとも２つの色特徴量を変量とする前記Ｎ個の度数分布を取得する工程と、
　前記少なくとも２つの色特徴量を変量としており第１基準対象色に対する第１基準度数分布と前記Ｎ個の度数分布とに基づいて、前記Ｎ個の所定領域の透明度を評価する工程と、
を備え、
　前記プレート画像は、プレートが備える複数のウェルに評価対象が保持された評価プレートに対応する画像であり、
　前記評価対象は試験体を含み、
　前記複数のウェルは、検体を更に含む前記評価対象を保持した少なくとも１つの検体用ウェルを有し、
　前記Ｎ個の所定領域の少なくとも１つは、前記少なくとも１つの検体用ウェルに対応する少なくとも１つの画像を含み、
　前記第１基準対象色は、第１透明状態である前記対象色であり、
　前記透明度を評価する工程では、前記第１基準度数分布における第１基準対象色領域の第１重心位置から前記Ｎ個の度数分布それぞれにおける対象色領域の第２重心位置に向かう重心ベクトルに基づいて前記透明度を評価する、
透明度評価方法。
　上記方法では、プレート画像から得られるＮ個の度数分布に基づいて、Ｎ個の所定領域の透明度を評価できる。そのため、たとえば、目視で透明度を評価する場合に比べて客観性を確保可能である。透明度を評価する工程では、対象色の第１透明状態に対応する色である第１基準対象色に対応する第１基準度数分布における第１基準対象色領域の第１重心位置から上記Ｎ個の度数分布それぞれにおける対象色領域の第２重心位置に向かう重心ベクトルに基づいて上記透明度を評価する。そのため、透明度評価の精度の向上を図ることができる。
［２］前記第１基準度数分布を取得する工程を更に備え、
　前記複数のウェルは、前記第１基準対象色用の少なくとも１つの第１基準対象色ウェルを更に含み、
　前記Ｎ個の所定領域の１つは、前記少なくとも１つの第１基準対象色ウェルに対応する画像を含み、
　前記第１基準度数分布を取得する工程では、前記Ｎ個の所定領域のうち、前記少なくとも１つの第１基準対象色ウェルに対応する画像を含む所定領域における少なくとも２つの色特徴量を変量とする度数分布を、前記第１基準度数分布として取得する、
　［１］に記載の透明度評価方法。
　この場合、透明度評価の基準となる第１基準度数分布を、評価すべきプレート画像から得られた度数分布に基づいて取得できる。そのため、評価すべきプレート画像に応じて透明度を評価できるので、透明度評価の精度が向上し易い。
［３］前記透明度を評価する工程では、透明度変化基準ベクトルに対する前記重心ベクトルの角度および前記重心ベクトルの長さに基づいて、前記透明度を評価し、
　前記透明度変化基準ベクトルは、前記第１重心位置から第２基準対象色に対する第２基準度数分布であって少なくとも２つの色特徴量を変量とする前記第２基準度数分布における第２基準対象色領域の第３重心位置に向かうベクトルであり、
　前記第２基準対象色は、前記第１透明状態とは異なる第２透明状態である前記対象色であり、
　前記重心ベクトルの長さは、前記重心ベクトルを規定する前記第２重心位置を含む度数分布を画像表示した場合の画像サイズで規格化された長さである、
　［１］または［２］に記載の透明度評価方法。
　この場合、第１基準対象色から第２基準対象色に対する透明度変化を基準にして透明度を評価可能である。
［４］前記第２基準度数分布を取得する工程を更に備え、
　前記第２基準度数分布を取得する工程では、前記Ｎ個の所定領域のうちの１つの所定領域における第２基準対象色に対する前記少なくとも２つの色特徴量を変量とする度数分布を、前記第２基準度数分布として取得する、
　［３］に記載の透明度評価方法。
　この場合、透明度変化ベクトルを規定するために使用する第２基準度数分布を、評価すべきプレート画像から得られた度数分布に基づいて取得できる。そのため、評価すべきプレート画像に応じて透明度を評価できるので、透明度評価の精度が向上し易い。
［５］前記Ｎ個の度数分布を取得する工程では、前記Ｎ個の所定領域それぞれにおいて、第１基準対象色および第２基準対象色に対する度数分布を取得し、前記第１基準対象色に対する度数分布と前記第２基準対象色に対する度数分布とに基づいて前記対象色の度数分布を取得し、
　前記第２基準対象色は、第１透明状態と異なる第２透明状態である前記対象色であり、
　前記透明度を評価する工程では、透明度変化基準ベクトルに対する前記重心ベクトルの角度および前記重心ベクトルの長さに基づいて、前記透明度を評価し、
　前記透明度変化基準ベクトルは、前記第１重心位置から第２基準度数分布であって少なくとも２つの色特徴量を変量とする前記第２基準度数分布における第２基準対象色領域の第３重心位置に向かうベクトルであり、
　前記第１基準度数分布は、前記Ｎ個の所定領域のうちの１つの所定領域で取得された前記第１基準対象色の度数分布であり、
　前記第２基準度数分布は、前記Ｎ個の所定領域のうちの１つの所定領域で取得された前記第２基準対象色の度数分布であり、
　前記重心ベクトルの長さは、前記重心ベクトルを規定する前記第２重心位置を含む度数分布を画像表示した場合の画像サイズで規格化された長さである、
　［１］に記載の透明度評価方法。
　この場合、第１基準対象色から第２基準対象色に対する透明度変化を基準にして透明度を評価可能である。上記方法では、透明度評価の基準となる第１基準度数分布および第２基準度数分布を、評価すべきプレート画像から得られた度数分布に基づいて取得できる。そのため、評価すべきプレート画像に応じて透明度を評価できるので、透明度評価の精度が向上し易い。
［６］前記Ｎ個の度数分布を取得する工程は、
　前記Ｎ個の所定領域それぞれにおける複数の領域に対して前記少なくとも２つの色特徴量を変量とする初期度数分布を取得する工程と、
　前記複数の領域に対する前記初期度数分布と前記第１基準対象色に対する第１度数分布モデルとの類似度、および、前記複数の領域に対する前記初期度数分布と前記第２基準対象色に対する第２度数分布モデルとの類似度に基づいて前記複数の領域の色を判定する工程と、
　前記複数の領域のうち前記第１基準対象色および前記第２基準対象色それぞれに判定された領域の初期度数分布を用いて前記第１基準対象色および前記第２基準対象色に対する度数分布を取得する工程と、
を有する、
　［５］に記載の透明度評価方法。
　この場合、Ｎ個の所定領域それぞれにおいて、各所定領域の状態に応じた上記第１基準対象色および上記第２基準対象色に対する度数分布を取得できる。
［７］前記少なくとも２つの色特徴量を変量とする度数分布に対応する画像データを、前記少なくとも２つの色特徴量のうちの１つの方向にシフトさせる工程を更に備え、
　前記Ｎ個の度数分布を取得する工程では、前記Ｎ個の所定領域それぞれにおいて、第１基準対象色、第２基準対象色および比較対照色に対する度数分布を取得するとともに、前記第１基準対象色に対する度数分布と前記第２基準対象色に対する度数分布とに基づいて前記対象色の度数分布を取得し、
　前記第２基準対象色は、前記第１透明状態とは異なる第２透明状態である前記対象色であり、
　前記比較対照色は、前記対象色とは異なる色であり、
　前記透明度を評価する工程では、透明度変化基準ベクトルに対する前記重心ベクトルの角度、色変化基準ベクトルに対する前記重心ベクトルの角度および前記重心ベクトルの長さに基づいて、前記透明度を評価し、
　前記透明度変化基準ベクトルは、前記第１重心位置から第２基準度数分布における第２基準対象色領域の第３重心位置に向かうベクトルであり、
　前記色変化基準ベクトルは、前記第１重心位置から比較対照度数分布における比較対照色領域の第４重心位置に向かうベクトルであり、
　前記第１基準度数分布は、前記Ｎ個の所定領域のうちの１つの所定領域で取得された前記第１基準対象色の度数分布であり、
　前記第２基準度数分布は、前記Ｎ個の所定領域のうちの１つの所定領域で取得された前記第２基準対象色の度数分布であり、
　前記比較対照度数分布は、前記Ｎ個の所定領域のうちの１つの所定領域で取得された前記比較対照色の度数分布であり、
　前記シフトさせる工程では、前記Ｎ個の度数分布、前記第１基準度数分布、前記第２基準度数分布および前記比較対照度数分布を画像表示した場合における表示領域に対して前記Ｎ個の度数分布、前記第１基準度数分布、前記第２基準度数分布および前記比較対照度数分布に対応する画像データを前記少なくとも２つの色特徴量のうちの１つの方向にシフトし、
　前記第１重心位置、前記第２重心位置、前記第３重心位置および前記第４重心位置それぞれは、前記Ｎ個の度数分布、前記第１基準度数分布、前記第２基準度数分布および前記比較対照度数分布それぞれに対応する画像データであって前記シフトされた画像データに基づく重心位置である、
　［１］に記載の透明度評価方法。
　上記方法では、透明度評価すべき評価プレートにおいて対象色とは異なる比較対照色が存在する場合において、透明度変化基準ベクトルと、色変化基準ベクトルとの関係に基づいて、透明度を評価できる。
［８］前記少なくとも２つの色特徴量は、色相及び彩度を含む、
　［１］～［７］の何れか１つに記載の透明度評価方法。
　本発明によれば、客観的に評価可能であって、精度向上が図れる透明度評価方法を提供できる。
図１は、一実施形態に係る評価対象の評価方法で使用する評価プレートの平面図である。 図２は、ウェルの断面の模式図である。 図３は、一実施形態に係る評価対象の評価システムの模式図である。 図４は、評価プレートの画像（プレート画像）の一例を示す図面である。 図５は、透明度評価方法の一例のフローチャートを示す図面である。 図６は、ＨＳＶ画像の一例を示す図面である。 図７は、ウェルに対して作成された度数分布の一例のヒストグラムを示す図面である。 図８は、第１基準対象色に対する度数分布に対応する画像の一例を示す図面である。 図９は、第２基準対象色に対する度数分布に対応する画像の一例を示す図面である。 図１０は、黄色（比較対照色）に対する度数分布に対応する画像の一例を示す図面である。 図１１は、度数分布を画像表示した場合の画像データをシフトさせる工程を説明するための図面である。 図１２は、度数分布を画像表示した場合の画像データをシフトさせる工程によってシフトされた図８に示した画像を示す図面である。 図１３は、透明度を評価する工程を説明するための模式図である。 図１４は、実験例の結果を示す模式図である。
　以下、図面を参照しながら本発明の実施形態を説明する。同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。
　本実施形態では、検体の安全性を評価する実施形態を説明する。検体の安全性を評価する試験としてＡｍｅｓ試験が知られている。
　Ａｍｅｓ試験では、アミノ酸合成遺伝子に対して遺伝子操作が実施され、アミノ酸の合成ができないように改良された細胞を試験体として用いる。Ａｍｅｓ試験では上記細胞に検体を加える。その後、細胞を一定の条件で培養する。検体によって細胞のアミノ酸合成遺伝子に突然変異が生じると、細胞がアミノ酸を再び合成できるようになる。そのため、突然変異が生じたか否かを、細胞の増殖の有無を確認することによって、遺伝毒性を評価する。
 上記Ａｍｅｓ試験では、検体が細胞に対して毒性を有するか否かを確認する毒性評価も行われる場合がある。本実施形態の透明度評価方法は、このような検体が細胞に対して毒性を有するか否かの評価に好適に用いられる。
　以下では、一例としてＡｍｅｓ試験に対して本実施形態に係る透明度評価方法を適用した場合を説明する。以下のＡｍｅｓ試験に基づいた実施形態の説明では、断らない限り、試験体は細胞である。
　図１は、一実施形態に係る透明度評価方法で使用する評価プレート１０の平面図である。評価プレート１０は、プレート(plate)１１を有する。プレート１１は、複数のウェル１３を有する。本実施形態では、プレート１１は、２次元（１６×２４）に配列された３８４個のウェル１３を有する。
　プレート１１には、Ｎ個の区画（所定領域）が仮想的に設定されている。Ｎは、１以上の整数である。本実施形態では、図１に示したように、８個の区画が仮想的に設定されている場合（すなわち、Ｎが８の場合）を説明する。８個の区画を、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８と称す。区画Ｓｅ１～Ｓｅ８は、４×１２個（４８個）のウェル１３（ウェル群）を含む領域である。本実施形態において、区画Ｓｅ１が溶媒対照区画（基準対象色が現れる領域）であり、区画Ｓｅ８が陽性対照区画（比較対照色が現れる領域）である。溶媒対照区画は、陰性対照区画として機能する。
　ウェル(well)１３は、プレート１１に形成された凹部（窪み）である。ウェル１３は、評価対象１４を保持する。区画Ｓｅ１～Ｓｅ８のそれぞれに属するウェル１３に保持される評価対象１４を区別して説明する場合、評価対象１４ａ～１４ｈと称す。
　評価対象１４ａ～１４ｈは、細胞が分散された（或いは懸濁された）培養液を有する。３８４個の全てのウェル１３には、同じ量の培養液が保持されている。ウェル１３で保持される培養液内の細胞の量もウェル１３間で同じである。細胞の例は、アミノ酸要求性変異を有する微生物、生物由来の細胞等である。アミノ酸要求性変異を有する微生物は、ヒスチジン要求性のネズミチフス菌（たとえば、ＴＡ１５３５、ＴＡ１５３７、ＴＡ９７、ＴＡ９７ａ、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ９２、ＴＡ９４、ＴＡ１０２、ＴＡ１０４、ＴＡ１５３８、ＴＡ７００１、ＴＡ７００２、ＴＡ７００３、ＴＡ７００４、ＴＡ７００５，ＴＡ７００６、各種ＹＧ株など）、トリプトファン要求性の大腸菌（たとえば、ＷＰ２、　ＷＰ２ｕｖｒＡ、ＷＰ２／ｐＫＭ１０１、ＷＰ２ｕｖｒＡ／ｐＫＭ１０１など）、その他の微生物などである。生物由来の細胞は、たとえば、哺乳動物由来の培養細胞、その他脊椎動物由来の細胞、昆虫由来の細胞などである。評価対象１４ａ～１４ｈに含まれる細胞は、複数の種類の細胞が混合された細胞でもよい。培養液の例は、アミノ酸をわずかに含むリン酸緩衝液である。
　評価対象１４ａ～１４ｈは、指示薬を更に含む。指示薬の量は、評価対象１４ａ～１４ｈで同じ（すなわち全てのウェル１３で同じ）である。本実施形態において、指示薬は、ｐＨ指示薬である。ｐＨ指示薬の例は、ブロモクレゾールパープルである。本実施形態におけるｐＨ指示薬の色は、陰性結果の場合（細胞に突然変異が生じなかった場合）、紫色（対象色）であり、陽性結果の場合（細胞に突然変異が生じた場合）は、黄色（比較対照色）である。
　評価対象１４ｂ～１４ｇは、上記細胞が分散された培養液と指示薬の他、検体が溶媒に溶解または均一に分散された液（検体液）を更に含む。よって、評価対象１４ｂ～１４ｇを保持する区画Ｓｅ２～Ｓｅ７のウェル１３は検体を保持するウェル（検体用ウェル）である。検体は、安全性（たとえば、細胞毒性、遺伝毒性等）が評価されるべき物質（例えば化学物質）である。溶媒としては、水、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）等が挙げられる。評価対象１４ｂ～１４ｇは、検体の試験条件の一つである濃度が異なる点以外は、同じである。区画Ｓｅ２に属する全てのウェル１３の評価対象１４ｂ内の検体液の量は同じである。区画Ｓｅ３～区画Ｓｅ７においても同様である。
　評価対象１４ａは、上記細胞を含む培養液及び指示薬の他、指示薬の色および細胞に実質的に影響を与えない溶媒対照液を含む。よって、評価対象１４ａを保持する区画Ｓｅ１のウェル１３は溶媒対照ウェル（第１基準対象色ウェル）である。溶媒対照液は、検体液に使用した溶媒である。ただし、溶媒対照液は、細胞に影響を与えない液体であればよい。溶媒対照液としては、例えば、水、ＤＭＳＯである。区画Ｓｅ１に属する全てのウェル１３において評価対象１４ａ内の溶媒対照液の量は同じである。
　評価対象１４ｈは、上記細胞を含む培養液及び指示薬の他、指示薬の色を黄色に変化させる陽性対照液を含む。よって、評価対象１４ｈを保持する区画Ｓｅ８のウェル１３は陽性対照ウェル（比較対照色ウェル）である。陽性対照液は、陽性対照化合物と溶媒とを含む溶液である。陽性対照化合物は、細胞に対して陽性として知られる化合物であればよい。陽性対照化合物の例は、９ＡＡ（９－Aminoacridine）、４-ＮＱＯ（４－Nitroquinoline-N-oxide）、２-ＡＡ(２－Aminoanthracene)及び２－ＮＦ（２－Nitrofluorene）を含む。溶媒は、検体液に使用した溶媒と同じでなくてもよい。溶媒としては、水、ＤＭＳＯ等が挙げられる。陽性区画である区画Ｓｅ８に属する全てのウェル１３で保持される陽性対照液の量は同じである。
　たとえば、Ａｍｅｓ試験において、検体の代謝活性化の有無による影響を調べる場合、評価対象１４ａ～１４ｈは、更に、Ｓ９ｍｉｘを含む。Ｓ９ｍｉｘは、動物の肝臓の抽出物に補酵素を加えた液体である。Ｓ９ｍｉｘは、肝臓ホモジネートの９，０００×ｇ上清（Ｓ９）に、ＮＡＤＰＨなどの電子伝達系に関わる補助因子が加えられ調整された液体とし得る。
　図１及び図２を参照して、ウェル１３の構成を更に説明する。図２は、ウェルの断面の模式図である。図２では、評価対象１４を模式的に図示している。本実施形態において、ウェル１３の平面視形状（ウェル１３の深さ方向からみた形状）は、正方形である。ウェル１３の開口部の一辺の長さの例は、３．０ｍｍ～４．０ｍｍである。ウェル１３の深さの例は、９．０ｍｍ～１５．０ｍｍである。このようなサイズのウェルを有するプレート１１は、マイクロプレートとして知られている。図２に示したように、ウェル１３は、底部１３ａに向けて先細りしている。よって、底部１３ａの面積は、ウェル１３の開口１３ｂの面積より小さい。ウェル１３の平面視形状は、円形でもよい。ウェル１３の平面視形状が上記正方形のように角を有する場合、角は丸まっていてもよい。ウェル１３は、底部１３ａに向けて先細りしていない柱状であってもよい。
　評価プレート１０は、プレート１１の各ウェル１３に対応する評価対象１４が注入され、一定の培養処理が施された後において、評価対象１４の安全性評価が可能な状態となったプレートである。
　評価プレート１０の準備手順を、Ａｍｅｓ試験の一例に基づいて説明する。評価プレート１０は、たとえば、次の手順で準備され得る。
（第１Ａ工程）
　使用する試験体（アミノ酸要求性変異を有する細菌、例えば、ネズミチフス菌：ＴＡ１００株、ＴＡ９８株、ＴＡ１５３５株、ＴＡ１５３７株、大腸菌：ＷＰ２ｕｖｒＡ株など）を、６０ｍＬのニュートリエントブロス培地に植菌し３７℃で９～１０時間振とう培養して増殖させる。
（第２Ａ工程）
　検体（例えば毒性を評価したい化合物）を必要量はかりとる。
（第３Ａ工程）
　第２Ａ工程で準備した検体を適当な媒体に溶解または懸濁し、これを、媒体を用いて段階希釈し、検体液の濃度系列を調製する。同一検体を異なる６濃度で評価する場合、濃度の異なる６つの検体液を調製する。
　（第４Ａ工程）
　所定の毒性を示すことがわかっている陽性対照化合物の溶液を調製する。
　（第５Ａ工程）
　検体液の調製に使用した媒体、検体液の濃度系列、陽性対照化合物の溶液（以上をまとめて検体液等と呼ぶ）を１０μＬずつ、２４ウェルプレート（２４個のウェルを有するプレート）の別々のウェルに入れる。
　（第６Ａ工程）
　０．１７５～０．７ｍＬの試験体の培養液（通常１×１０９細胞／ｍＬを超える濃度）と、６．８３～６．３ｍＬの培地（炭素源が添加され且つアミノ酸が不足した最小培地）を混合する。混合したものを代謝活性化非存在下条件の調製菌液と呼ぶ。
　（第７Ａ工程）
　検体液等１０μＬを入れた２４ウェルプレートに、第６Ａ工程で準備した代謝活性化非存在下条件の調製菌液２４０μＬを添加する。
　（第８Ａ工程）
　第７Ａ工程の混合液の入った２４ウェルプレートを、３７℃、２５０ｒｐｍで９０分間振とうする（プレインキュベーション）。
　（第９Ａ工程）
　プレインキュベーション終了後の２４ウェルプレートの各ウェル（２５０μＬ）に指示培地（ｐＨ指示薬と炭素源を含み、アミノ酸が不足した最小培地）を２．６ｍＬ添加する。
　（第１０Ａ工程）
　第９Ａ工程の混合液を５０μＬずつ３８４ウェルプレートであるプレート１１の８個の区画Ｓｅ１～Ｓｅ８それぞれが有する４８ウェル（１区画分）に区画Ｓｅ１～Ｓｅ８に対応するように移す。同様にして計３枚以上の３８４ウェルプレート（プレート１１）に播種する。
　（第１１Ａ工程）
　３８４ウェルプレート（プレート１１）を３７℃で４８時間培養する。これによって、評価プレート１０が得られる。
　生体内の種々の酵素によって代謝を受けた後に毒性を示す検体を検出する場合は、第６Ａ工程において、前述したように、動物の肝臓の抽出物に補酵素を加えたもの（Ｓ９混液）を調製し、０．１７５～０．７ｍＬの試験体の培養液と、５．７８～５．２５ｍＬの培地と、１．０５ｍＬのＳ９混液を混合する。混合したものを代謝活性化存在下条件の調製菌液と呼ぶ。その後、第７Ａ工程以降の工程を、代謝活性化非存在下条件の調製菌液の代わりに、代謝活性化存在下条件の調製菌液を用いて実施する。
　次に、評価プレート１０に保持されている検体の安全性の評価方法に使用する評価システム２０を説明する。図３は、一実施形態に係る評価システム２０の模式図である。評価システム２０は、観察装置３０と、画像処理装置４０とを備える。
　［観察装置］
　観察装置３０は、ステージ（プレート保持部）３１と、照明装置３２と、撮像部３３とを有する。ステージ３１は、評価プレート１０を支持する。評価プレート１０は、評価プレート１０の底部（ウェル１３の底部１３ａ側）がステージ３１側に位置するようにステージ３１に配置される。ステージ３１は、照明装置３２から出力される光３４を撮像部３３に向けて通すように構成されている。例えば、ステージ３１の材料が光透過性を有してもよいし、評価プレート１０における３８４個のウェル１３が形成されている領域と対応する領域に開口又は光３４を透過する窓部が形成されていてもよい。本実施形態では、ステージ３１は、図３の白抜き矢印の方向に搬送可能に構成されている。
　照明装置３２は、評価プレート１０上（評価プレート１０からみてステージ３１と反対側）に配置されている。照明装置３２は、光３４を評価プレート１０に照射する。照明装置３２の例はＬＥＤ照明であり、光３４の例は、波長４００ｎｍ～７８０ｎｍの光である。
　撮像部３３は、評価プレート１０を透過した光３４を受けて、評価プレート１０を撮像する。撮像部３３は、評価プレート１０を目視した場合と実質的に同様のカラー画像（ＲＧＢ画像）を取得する。撮像部３３は、撮像器３３ａと、集光部３３ｂとを有する。
　撮像器３３ａの例は、２次元センサ（又はカメラ）及びラインセンサを含む。２次元センサの例は、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラである。
　集光部３３ｂは、光３４を、集光して撮像器３３ａに入射する。集光部３３ｂは、少なくとも１つのレンズを含む。撮像器３３ａ自体が、集光光学機能を有する場合は、撮像部３３は、集光部３３ｂを有しなくてもよい。
　本実施形態では、撮像部３３の撮像領域は、評価プレート１０の大きさより小さい。この場合、撮像部３３は、複数回に分けて評価プレート１０を撮像する。ただし、撮像部３３は、複数の撮像部３３を備えてもよいし、撮像部３３の撮像領域は、評価プレート１０全体を一度に撮像可能な大きさでもよい。
　撮像部３３は、画像処理装置４０に有線通信又は無線通信で接続されており、取得した画像（具体的には画像データ）を画像処理装置４０に出力する。撮像部３３から画像処理装置４０への画像の入力は、例えば、ＤＶＤ等の記憶媒体などを介して行われてもよい。
　観察装置３０において、評価プレート１０に対する照明装置３２及び撮像部３３の位置は、反転していてもよい。すなわち、図３において、撮像部３３を評価プレート１０上に配置し、照明装置３２をステージ３１の下側に配置した状態で、評価プレート１０を撮像してもよい。
　上記観察装置３０を利用して評価プレート１０を撮像する方法を説明する。評価プレート１０を撮像する場合、ステージ３１に評価プレート１０を配置する。ステージ３１を一方向に移動させながら、評価プレート１０に照明装置３２から光３４を照射する（照射工程）。このように光３４を評価プレート１０に照射した状態において、撮像部３３を用いて評価プレート１０を撮像する（撮像工程）。
　本実施形態では、撮像部３３の撮像領域が評価プレート１０の大きさより小さいため、１度の撮像では、評価プレート１０の部分画像が得られる。よって、撮像工程では、撮像部３３を用いて、上記部分画像を合成して評価プレート１０の全体の画像が形成されるように、評価プレート１０を複数回撮像する。
　撮像部３３は、取得した画像を画像処理装置４０に入力する。
　［画像処理装置］
　画像処理装置４０は、入力部４１と、演算部４２（実行部）と、出力部４３とを有する。画像処理装置４０は、コンピュータである。画像処理装置４０は、通常、コンピュータが有する記憶部（メモリ）などを更に有し得る。画像処理装置４０は、各種プログラムを実施することで、画像処理装置４０として機能するパーソナルコンピュータでもよいし、評価のための専用装置でもよい。画像処理装置４０は、評価プレート１０を評価する評価装置または評価支援装置として機能する。
　入力部４１は、撮像部３３で取得した画像のデータが入力される（又は受け付ける）入力手段である。
　演算部４２は、入力部４１に入力された画像に基づくプレート画像Ｐ１（図４参照）を作成する。図４はプレート画像Ｐ１の一例を示す図面である。プレート画像Ｐ１は、評価プレート１０に対応する画像である。プレート画像Ｐ１において、ウェル１３、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８に対応する部分は、それぞれウェル画像１３ｐ、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐである。演算部４２は、後述する本実施形態の透明度評価方法が有する各工程を実施するための各種処理を実施する。演算部４２は、たとえば、上記透明度評価方法が有する各工程をコンピュータに実施させるプログラムを実施することによって、各工程を実施する。このようなプログラムは、たとえば、上記記憶部（メモリ）に格納され得る。
　入力部４１が、例えばプレート画像Ｐ１を記憶部に出力する場合には、演算部４２は、記憶部にアクセスして処理すべきデータを取得すればよい。演算部４２については後述する。
　出力部４３は、演算部４２の結果を評価者が参照するために表示出力を行う。出力部４３は、例えば、外部の表示装置に演算部４２の結果を出力してもよいし、出力部４３自体が表示機能を有してもよい。出力部４３は、演算部４２に処理過程中のデータの出力表示を行ってもよい。
　次に、本実施形態に係る透明度評価方法の一例を説明する。ここでは、検体が細胞（試験体）に毒性を有するか否かを評価する。Ａｍｅｓ試験を実施した場合において、検体が細胞（試験体）に対して毒性を有する場合、細胞が死滅したこと等によりウェル１３の透明度（具体的には、評価対象１４の透明度）が変化する。本実施形態では、上記透明度の変化を評価する場合を主に説明する。
　前述したように、本実施形態では、検体が細胞に対して遺伝毒性を有する場合、紫色から黄色に変化するｐＨ指示薬を用いている。そのため、検体が細胞に対して遺伝毒性を有しない場合は、ウェル１３の色は紫色であることから、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８の紫色の透明度を評価する形態を説明する。上記「ウェル１３の色」とは、ウェル１３内に保持された評価対象１４の色である。
　以下では、図３に示した撮像部３３を用いて評価プレート１０の画像データを取得し、画像処理装置４０に画像データが入力された後の工程を、図５を利用して説明する。
　上記画像データが画像処理装置４０に入力されると、画像処理装置４０は、入力されたプレートの画像（カラー画像、ＲＧＢ画像）を、「色相(Hue)」、「彩度(Saturation)」および「明度(Value)」の３つの組み合わせで表現されたＨＳＶ画像に変換する（画像変換工程Ｓ１１）。ＲＧＢ画像からＨＳＶ画像への変換は、公知の変換式（又はそれに基づいた公知のプログラム）に基づいて行えばよい。
　図６は、ＨＳＶ画像Ｐ２の一例を示す図面である。図６に示したＨＳＶ画像Ｐ２は、図４に示したプレート画像Ｐ１をＨＳＶ変換した画像である。ＨＳＶ画像Ｐ２はプレート画像Ｐ１をＨＳＶ変換した画像であることから、図６では、ＨＳＶ画像Ｐ２におけるウェル１３、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８に対応する部分画像も、ウェル画像１３ｐ、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐとして図示している。
　次に、図５に示したように、作成されたＨＳＶ画像Ｐ２を用いて、複数のウェル画像１３ｐ（複数の領域）毎に、少なくとも２つの色特徴量を変量とする度数分布（初期度数分布）を作成する（度数分布作成工程Ｓ１２）。以下の本実施形態の説明では、断らない限り、上記少なくとも２の色特徴量として色相および彩度を採用する。すなわち、以下の説明における度数分布は、色相および彩度を変量とする度数分布である。
　度数分布の作成方法の一例を説明する。画像処理装置４０は、ＨＳＶ画像Ｐ２における各ウェル画像１３ｐの領域を特定する。例えば、図６の破線で示したように、ウェル画像１３ｐにＲＯＩ（Region of interest）を設定すればよい。図６では、例示のために一つのウェル画像１３ｐにＲＯＩを設定した状態を示している。ＲＯＩは、評価者によって指定された領域として設定されてよい。或いは、例えば、予め入力されているプレート１１のデータ（形状、サイズ等）、ウェル１３に何も入っていない状態のプレート１１の画像、ＨＳＶ画像の輝度情報等に基づいて画像処理装置が自動でＲＯＩを設定してもよい。
　画像処理装置４０は、特定したウェル画像１３ｐに含まれる複数の画素が有する画像情報（色相、彩度等）を用いて、上記度数分布を作成する。本実施形態では、色相及び彩度をそれぞれ０～５５に分けて特徴量（色相および彩度の組合わせ）を抽出することによって、度数分布を作成する。
　図７は、作成した度数分布の一例であるヒストグラムを示す図面である。図７の横軸は、色相及び彩度を示しており、縦軸は、画素数を示している。図７は、一つのウェル画像１３ｐに対するヒストグラムである。
　上記度数分布工程Ｓ１２の後、図５に示したように、区画Ｓe１および区画Ｓe８それぞれに含まれるウェル１３の色を判定する（第１色判定工程Ｓ１３）。ウェル１３の色としては、ｐＨ指示薬の色変化の前後の色である紫色と黄色が想定される。更に、透明状態の違いによって色が異なるように見えることから、紫色を第１透明状態の紫色と、第２透明状態の紫色とに分ける。よって、第１色判定工程Ｓ１３では、ウェル１３の色が、第１透明状態の紫色、第２透明状態の紫色および黄色の３色の何れであるかを判定する。第１透明状態の紫色は、検体が細胞に対して毒性を有しない場合における透明状態の紫色であり、本実施形態では、透明度が低い（濁度がある）場合の色である。第２透明状態の紫色は、検体が細胞に対して毒性を有する場合の透明状態の紫色であり、本実施形態では、透明度が高い（濁度がない）場合の色である。
　以下、第１透明状態の紫色を第１基準対象色と称し、第２透明状態の紫色を第２基準対象色と称す場合もある。
　第１色判定工程Ｓ１３の一例を具体的に説明する。
　第１色判定工程Ｓ１３では、まず、度数分布作成工程Ｓ１２で作成された複数の度数分布と、第１基準対象色の度数分布モデル（第１度数分布モデル）、第２基準対象色の度数分布モデル（第２度数分布モデル）および黄色の度数分布モデル（比較対照色度数分布モデル）それぞれとの類似度を算出する。
　具体的には、度数分布作成工程Ｓ１２で作成された複数の度数分布、並びに、第１基準対象色、第２基準対象色および黄色それぞれの度数分布モデルにおける第１基準対象色領域、第２基準対象色領域および黄色領域（比較対照色領域）の類似度を算出する。第１基準対象色領域、第２基準対象色領域および黄色領域は、色相および彩度の組み合わせで指定される各色の領域である。たとえば、評価者が、第１基準対象色領域、第２基準対象色領域および黄色領域を予め設定すればよい。
　類似度は、例えば、ユークリッド距離を用いて算出されてもよいし、或いは、相関係数を用いて算出されてもよい。類似度は、たとえば、パターンマッチングを利用して算出されてもよい。類似度の算出には、深層学習を利用してもよい。
　第１色判定工程Ｓ１３では、上記のように算出した第１基準対象色の度数分布モデルに対して所定の類似度（たとえば最大の類似度）を有する度数分布に対応するウェル１３を、第１基準対象色のウェル１３と判定する。
　同様に、第２基準対象色の度数分布モデルに対して所定の類似度（たとえば最大の類似度）を有する度数分布に対応するウェル１３を、第２基準対象色のウェル１３と判定する。
　同様に、黄色の度数分布モデルに対して所定の類似度（たとえば最大の類似度）を有する度数分布に対応するウェル１３を、黄色のウェル１３と判定する。
　上記第１基準対象色、第２基準対象色および黄色それぞれの度数分布モデルは、色相および彩度を変量とする度数分布であって、色判定などの基準となる度数分布である。度数分布モデルは、たとえば、
　（ａ）予め予備実験を実施し、第１基準対象色、第２基準対象色および黄色を示す複数のウェルの画像に基づいて作成した度数分布でもよいし、
　（ｂ）色パレット一覧から第１基準対象色、第２基準対象色および黄色を指定し、各色に対して得られた度数分布でもよいし、または、
　（ｃ）プレート画像Ｐ１中において明らかに第１基準対象色、第２基準対象色および黄色である領域を指定してその領域に対する度数分布であってもよい。
　上記第１色判定工程Ｓ１３の後、図５に示したように、第１色判定工程Ｓ１３において、第１基準対象色、第２基準対象色および黄色それぞれに判定されたウェル１３の度数分布を用いて上記第１基準対象色、第２基準対象色および黄色その度数分布モデルを更新する（モデル更新工程Ｓ１４）。
　具体的には、第１基準対象色と判定された全てのウェル１３の度数分布と、第１基準対象色用の度数分布モデルとを加算平均することによって、第１基準対象色用の度数分布モデルを更新する。
　同様に、第２基準対象色と判定された全てのウェル１３の度数分布と、第２基準対象色用の度数分布モデルとを加算平均することによって、第２基準対象色用の度数分布モデルを更新する。
　同様に、黄色と判定された全てのウェル１３の度数分布と、黄色用の度数分布モデルとを加算平均することによって、黄色用の度数分布モデルを更新する。
　モデル更新工程Ｓ１４以降の工程で使用する度数分布モデルは、断らない限り、更新された度数分布モデルである。
　次に、上記第１基準対象色、第２基準対象色および黄色の度数分布モデルを用いて、評価プレート１０が有する全てのウェル１３の色を判定する（第２色判定工程Ｓ１５）。判定方法は、評価プレート１０が有する全てのウェル１３に対応する度数分布を用いる点以外は、第１色判定工程Ｓ１３の場合と同様である。
　すなわち、度数分布作成工程Ｓ１２で作成された全ての度数分布と、第１基準対象色、第２基準対象色および黄色それぞれの度数分布モデルとの類似度を算出する。第１基準対象色の度数分布モデルに対して所定の類似度（たとえば、最大の類似度）を有する度数分布に対応するウェル１３を、第１基準対象色のウェル１３と判定する。
　同様に、第２基準対象色の度数分布モデルに対して所定の類似度（たとえば、最大の類似度）を有する度数分布に対応するウェル１３を、第２基準対象色のウェル１３と判定する。
　同様に、黄色の度数分布モデルに対して所定の類似度（たとえば、最大の類似度）を有する度数分布に対応するウェル１３を、黄色のウェルと判定する。
　第２色判定工程Ｓ１５の後、図５に示したように、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８それぞれにおいて、第１基準対象色、第２基準対象色および黄色の平均度数分布を作成する（平均度数分布作成工程Ｓ１６）。
　具体的には、各区画Ｓｅ１～Ｓｅ８において、第１基準対象色と判定されたウェル１３の度数分布を加算平均することによって、各区画Ｓｅ１～Ｓｅ８の第１基準対象色に対する平均度数分布を作成する。
　同様に、各区画Ｓｅ１～Ｓｅ８において、第２基準対象色と判定されたウェル１３の度数分布を加算平均することによって、各区画Ｓｅ１～Ｓｅ８の第２基準対象色に対する平均度数分布を作成する。
　同様に、各区画Ｓｅ１～Ｓｅ８において、黄色（比較対照色）と判定されたウェル１３の度数分布を加算平均することによって、各区画Ｓｅ１～Ｓｅ８の黄色（比較対照色）に対する平均度数分布を作成する。
　このように各区画Ｓｅ１～Ｓｅ８において、各色に対する平均度数分布を作成するため、区画毎に３つの平均度数分布が得られる。
　本実施形態では、上記のように区画Ｓｅ１～Ｓｅ８毎に作成された各色に対する平均度数分布に基づいて、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８の紫色（対象色）の透明度を評価する。本実施形態では、各平均度数分布を、評価用画像（評価用画像データ）として使用する。具体的には、評価用画像は、平均度数分布における度数を輝度値で表し、２値化処理して得られた画像（画像データ）である。本実施形態における評価用画像は、全ての平均度数分布に対して同じ大きさ（サイズ）を有する。図８～図１０を利用して評価用画像を説明する。図８～図１０は、各色に対する評価用画像を説明する図面であるが、同じ区画における各色の評価用画像ではない。
　図８は、第１基準対象色に対応する評価用画像５１の一例を示す図面である。図９は、第２基準対象色に対応する評価用画像５２の一例を示す図面である。図１０は、黄色（比較対照色）に対応する評価用画像５３の一例を示す図面である。各図中の横軸（横方向）が彩度を示しており、縦軸（縦方向）が色相を示している。各図中の白色領域が、対応する平均度数分布において度数（画素数）が高い領域である。
　図８は、第１基準対象色に対応する画像であるため、白色領域が、評価用画像５１に対応する区画の平均度数分布において、色相および彩度の組み合わせで表現される第１基準対象色領域Ａ１である。
　同様に、図９は、第２基準対象色に対応する画像であるため、白色領域が、評価用画像５２に対応する区画の平均度数分布において、色相および彩度の組み合わせで表現される第２基準対象色領域Ａ２である。
　同様に、図１０は、黄色（比較対照色）に対応する画像であるため、白色領域が、評価用画像５３に対応する区画の平均度数分布において、色相および彩度の組み合わせで表現される黄色領域（比較対照色領域）Ａ３である。図８～図１０では、図示の便宜上、複数の白色領域を囲うように第１基準対象色領域、第２基準対象色領域および比較対照色領域を破線で示している。
　本評価方法では　図５に示したように、平均度数分布作成工程Ｓ１６の後に、評価用画像５１，５２，５３における第１基準対象色領域Ａ１、第２基準対象色領域Ａ２および黄色領域Ａ３を所定方向にシフトさせる（シフト工程Ｓ１７）。シフト工程Ｓ１７を、図１１を用いて評価用画像５１の場合を例にして説明する。
　シフト工程Ｓ１７では、評価用画像５１（具体的には、その画像データ）を、図１１に示した白抜き矢印の方向（所定方向）に一定量、シフトさせる。図１１に示した例では、色相方向に画像データをシフトさせた例を示している。シフトに伴い画像の表示領域外に移動する評価用画像５１の画像データは、シフト方向の反対側に移動させる（換言すれば、繰り上げる）。たとえば、図１１に示したように、評価用画像５１の表示領域の下方向に画像データをシフトさせた場合、破線の矢印で示したように、表示領域から抜けたデータは表示領域の反対側（上側）の辺（上辺）側に移動させる（繰り上げる）。図１２は、シフト後の評価用画像５１を示す図面である。図１２中の、十字マーク（具体的にはその中心位置）は、シフトされた第１基準対象色領域Ａ１の重心位置Ｇ１を示している。
　シフト工程Ｓ１７では、各区画Ｓｅ１～Ｓｅ８それぞれで作成された評価用画像５１に対して同様に画像データをシフトさせる。各区画Ｓｅ１～Ｓｅ８それぞれで作成された評価用画像５２および評価用画像５３に対して同様に画像データをシフトさせる。
　次に、シフト工程Ｓ１７Ｓの後、図５に示したように、透明度を評価（判定）する（評価工程Ｓ１８或いは判定工程）。図１３を用いて評価工程Ｓ１８を説明する。図１３は、評価工程Ｓ１８を説明するための模式図である。
　評価工程Ｓ１８では、図１３に示したように、重心ベクトルＶ１、第１基準ベクトルＶ２および第２基準ベクトルＶ３を利用して透明度を評価する。
　重心ベクトルＶ１は、透明度の評価のための基準重心位置（比較元重心位置）から透明度評価領域の重心位置に向かうベクトルである。
　本実施形態では、区画Ｓｅ１が、第１基準対象色用の溶媒対照ウェル（第１基準対象色ウェル）で構成される溶媒対象区画（陰性対照区画）であることから、区画Ｓｅ１の紫色の透明度を基準にして他の区画の透明度を評価する。したがって、本実施形態では、区画Ｓｅ１の第１基準対象色に対する平均度数分布（第１基準度数分布）における第１基準対象色領域Ａ１の重心位置（第１重心位置）Ｇ１を上記基準重心位置に設定する。
　区画Ｓｅ１～Ｓｅ８における紫色（対象色）の透明度を評価することから、透明度評価領域は、紫色領域（対象色領域）である。本実施形態では、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８において、第１基準対象色（第１透明状態の紫色）に対する平均度数分布の第１基準対象色領域Ａ１および第２基準対象色（第２透明状態の紫色）に対する平均度数分布の第２基準対象色領域Ａ２を合わせた領域を透明度評価領域として採用する。
　このような透明度評価領域（対象色領域）は、たとえば、次の第１手法または第２手法によって取得できる。
　［第１手法］
　まず、平均度数分布作成工程Ｓ１６において作成された第１基準対象色（第１透明状態の紫色）に対する平均度数分布と第２基準対象色（第２透明状態の紫色）に対する平均度数分布とを加算平均することによって、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８それぞれにおいて紫色（対象色）の平均度数分布を作成する（Ｎ個の度数分布を取得する工程）。この平均度数分布を画像表示する場合の画像データに対してシフト工程Ｓ１７を実施する。シフト工程Ｓ１７を経て得られた紫色の平均度数分布に対応する画像に基づいて透明度評価領域を設定する。
　［第２手法］
　シフト工程Ｓ１７を経た後の第１基準対象色（第１透明状態の紫色）に対する平均度数分布と第２基準対象色（第２透明状態の紫色）に対する平均度数分布それぞれに対応する画像を重畳して得られた画像において、透明度評価領域を設定してもよい。第１基準対象色（第１透明状態の紫色）に対する平均度数分布と第２基準対象色（第２透明状態の紫色）に対する平均度数分布それぞれに対応する画像を重畳することは、第１基準対象色（第１透明状態の紫色）に対する平均度数分布と第２基準対象色（第２透明状態の紫色）に対する平均度数分布を加算平均して、紫色（対象色）の平均度数分布を作成すること（Ｎ個の度数分布を取得する工程）に相当する。
　透明度評価領域の重心位置を重心位置（第２重心位置）Ｇ２と称す。上記区画Ｓｅ１～Ｓｅ８それぞれにおける透明度評価領域の重心位置Ｇ２の一例を説明する。透明度評価領域は、紫色領域であり、前述したように、第１基準対象色（第１透明状態の対象色）の領域と、第２基準対象色（第２透明状態の対象色）の領域とを含む領域である。このような透明度評価領域を、各区画Ｓｅ１～Ｓｅ８それぞれにおいて前述したように取得し、得られた透明度評価領域の重心位置を重心位置Ｇ２とする。
　上記のように、重心位置Ｇ１（基準重心位置）から透明度評価領域の重心位置Ｇ２を規定した場合、重心ベクトルＶ１は、図１３に示したように、重心位置Ｇ１から区画Ｓｅ１～Ｓｅ８それぞれの重心位置Ｇ２に向かうベクトルである。
　第１基準ベクトルＶ２は、第１基準対象色領域Ａ１の重心位置Ｇ１から第２基準対象色領域Ａ２の重心位置（第３重心位置）Ｇ３に向かう重心ベクトルであり、同色（本実施形態では紫色）における透明度の変化方向を示す透明度変化基準ベクトルである。
　第２基準ベクトルＶ３は、第１基準対象色領域Ａ１の重心位置Ｇ１から黄色領域Ａ３の重心位置（第４重心位置）Ｇ４に向かう重心ベクトルであり、紫色から黄色への色変化の方向を示す色変化基準ベクトルである。
　ここでは、前述したように重心ベクトルＶ１の基点に区画Ｓｅ１の第１基準対象色領域Ａ１の重心位置Ｇ１を使用していることから、第１基準ベクトルおよび第２基準ベクトルの基点である第１基準対象色領域Ａ１の重心位置Ｇ１にも区画Ｓｅ１の第１基準対象色領域Ａ１の重心位置Ｇ１を採用する。
　第２基準対象色領域Ａ２の重心位置Ｇ３は、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８の何れかにおける第２基準対象色に対する平均度数分布に含まれる第２基準対象色領域Ａ２の重心位置Ｇ３を採用できる。たとえば、区画Ｓｅ７における第２基準対象色に対する平均度数分布（第２基準度数分布）における第２基準対象色領域Ａ２の重心位置を採用できる。検体が細胞に対して毒性を仮に有する場合、区画Ｓｅ７に含まれるウェル１３の色が第２基準対象色になりやすいからである。本実施形態では、図１２を用いて第１基準対象色領域Ａ１について説明したように、重心位置Ｇ３としてシフト工程Ｓ１７を経た第２基準対象色領域Ａ２の重心位置を採用する。
　黄色領域Ａ３の重心位置Ｇ４についても、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８の何れかにおける黄色領域に対する平均度数分布に含まれる黄色領域Ａ３の重心位置Ｇ４を採用できる。たとえば、区画Ｓｅ８における平均度数分布の黄色領域Ａ３の重心位置Ｇ４を採用できる。区画Ｓｅ８は陽性対照区画であり、黄色に変化することが想定されていることから、区画Ｓｅ８における黄色に対する平均度数分布（比較対照度数分布）の黄色領域Ａ３を使用することで、黄色領域Ａ３の重心位置としてより精度の高い重心位置Ｇ４を得ることができる。本実施形態では、図１２を用いて第１基準対象色領域Ａ１について説明したように、重心位置Ｇ４としてシフト工程Ｓ１７を経た黄色領域Ａ３の重心位置を採用する。
　評価工程Ｓ１８では、重心ベクトルＶ１、第１基準ベクトルＶ２および第２基準ベクトルＶ３を用いて透明度を評価する。
　具体的には、まず、重心ベクトルＶ１と第１基準ベクトルＶ２との間の角度θ１と、重心ベクトルＶ１と第２基準ベクトルＶ３との間の角度θ２とを比較する。角度θ１が角度θ２以下である場合、式（１）に基づいて、透明度指標Ｔを算出する。角度θ２が角度θ１より大きい場合、式（２）に基づいて、透明度指標Ｔを算出する。
Ｔ＝１－Ｌｎ　（θ１≦θ２の場合）・・・（１）
Ｔ＝１＋Ｌｎ　（θ１＞θ２の場合）・・・（２）
　式（１）および式（２）中の「Ｌｎ」は、重心ベクトルＶ１の長さを評価用画像の画像サイズ（一辺の長さＬ）で除した長さであり、重心ベクトルＶ１の規格化された長さ（或いは正規化された長さ）である。
　上記評価工程Ｓ１８の評価方法に基づけば、透明度指標Ｔが１より小さいことは、透明度が高いこと（本実施形態では、細胞が死滅していること）を意味する。すなわち、透明度指標Ｔが１より小さいほど検体が細胞に対して毒性を有することを示す。この点を、具体的に説明する。
　透明度指標Ｔが１より小さくなる場合は、式（１）の場合、すなわち、角度θ１が角度θ２以下の場合である。この場合、重心ベクトルＶ１が第１基準ベクトルＶ２側に位置する。更に、式（１）では規格化された重心ベクトルＶ１の長さＬｎが大きいほどＴは小さくなる。規格化された重心ベクトルＶ１の長さＬｎが大きいことは、重心位置Ｇ１から重心位置Ｇ２が離れていることを意味する。従って、透明度指標Ｔが１より小さい場合は、重心位置Ｇ１から重心位置Ｇ３側に重心位置Ｇ２が位置していることを示しており、結果として、透明度が高いことを意味する。したがって、透明度指標Ｔを用いることで、客観的且つ定量的に透明度を評価することが可能である。たとえば、透明度指標Ｔに対して一定の閾値を予め定めておき、透明度指標Ｔが上記閾値より小さい場合、検体が細胞に対して毒性を有すると評価し得る。
　区画Ｓｅ１～Ｓｅ８毎に透明度指標Ｔが算出される。そのため、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８毎に透明度、すなわち、毒性を評価できる。或いは、たとえば、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８において濃度の異なる点以外は同じ検体を使用している場合であって何れかの区画Ｓｅ１～Ｓｅ８における透明度指標Ｔが上記閾値より小さい場合、安全性の観点では、検体は細胞に対して毒性を有すると判定してもよい。
　本透明度評価方法では、プレート画像Ｐ１を解析することによって実質的に自動的に評価プレート１０における区画Ｓｅ１～Ｓｅ８の透明度を評価できる。そのため、たとえば、評価員が目視で評価する場合より、透明度評価の客観性および精度の向上を図れる。更に、プレート画像Ｐ１を解析することによって実質的に自動的に評価プレート１０における区画Ｓｅ１～Ｓｅ８の透明度を評価できることから、評価の再現性も向上する。
　評価の基準として第１透明状態の紫色に対応する第１基準対象色領域Ａ１の重心位置Ｇ１を採用しているため、たとえば、第１透明状態および第２透明状態を含む紫色の領域を基準とする場合より、透明度変化を高い精度で評価できる。
　上記のように、透明度を、客観的に且つより高い精度で評価可能であることから、各区画Ｓｅ１～Ｓｅ８の透明度の評価結果に基づいて検体の細胞に対する毒性もより正確に評価可能である。
　一実施形態として、モデル更新工程Ｓ１４を有する場合を説明した。モデル更新工程Ｓ１４で、各色の度数分布モデルを、評価すべき評価プレート１０に基づいて更新することで、評価プレート１０に応じた各色の度数分布モデルを得ることが可能である。その結果、評価プレート１０における区画Ｓｅ１～Ｓｅ８の透明度をより適切に評価でき、結果として、検体の細胞に対する毒性評価の精度が向上する。
　重心ベクトルＶ１、第１基準ベクトルＶ２および第２基準ベクトルＶ３を規定する重心位置Ｇ１、Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４も評価プレート１０を撮像した画像に基づいて取得している。そのため、たとえば、初期の各色の度数分布モデルに対して得られる重心位置Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４を使用する場合に比べて、評価プレート１０に応じた重心ベクトルＶ１、第１基準ベクトルＶ２および第２基準ベクトルＶ３を規定できる。その結果、評価プレート１０における区画Ｓｅ１～Ｓｅ８の透明度をより適切に評価でき、結果として、検体の細胞に対する毒性評価の精度が向上する。
　評価方法が、シフト工程Ｓ１７を備える場合、第２基準ベクトルＶ３を設定し易い。シフト工程Ｓ１７を備えない場合、第１基準対象色領域Ａ１の重心位置Ｇ１と、黄色領域Ａ３の重心位置Ｇ４との間に充分な距離を確保できない場合が生じ得るからである。このような場合でもシフト工程Ｓ１７を実施することによって、第１基準対象色領域Ａ１の重心位置Ｇ１と、黄色領域Ａ３の重心位置Ｇ４とを適切に分離できる。このようにシフト工程Ｓ１８は、第１基準対象色領域Ａ１の重心位置Ｇ１と、黄色領域Ａ３の重心位置Ｇ４とを適切に分離するために実施する工程であることから、シフト量およびシフト方向などは、第１基準対象色領域Ａ１の重心位置Ｇ１と、黄色領域Ａ３の重心位置Ｇ４とを分離可能に設定されればよい。
　本実施形態では、Ａｍｅｓ試験に本実施形態に係る評価方法の一例を適用した場合を説明した。上記実施形態では、平均度数分布作成工程Ｓ１６において、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８それぞれに第１基準対象色、第２基準対象色および黄色の平均度数分布を作成している。第１基準対象色および第２基準対象色の平均度数分布を用いて紫色（対象色）の平均度数分布を得ることができる。第１基準対象色および第２基準対象色の度数分布モデルに基づいて、紫色（対象色）の度数分布モデルも作成できる。そのため、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８の紫色および黄色それぞれの平均度数分布と、紫色および黄色の度数分布モデルとの類似度を算出することによって、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８の色が紫色か、黄色かを判定可能である。その結果、色判定の結果に基づいて遺伝毒性も評価できる。
　本実施形態では、評価プレート１０の画像を取得しているため、画像処理によって、ウェル１３内のコロニーの有無を判定したり、異物の有無を判定したりできる。コロニーの有無でも遺伝毒性の有無が評価できる。上記異物はたとえば、検体の影響で細胞が死滅することで生じるものである。そのため、異物の有無で検体が細胞に対して毒性を有するか否かも判定できる。このようなコロニーの有無の判定、異物の判定などは、Ａｍｅｓ試験においてより正確な評価結果を得るため、色判定による遺伝毒性の評価と一緒に実施される場合がある。したがって、このような評価も並行して実施可能な本実施形態に係る評価方法は、Ａｍｅｓ試験に適用しやすい。
　次に、本実施形態で説明した評価システム２０及び評価方法をＡｍｅｓ試験に適用した実験例を説明する。以下、断らない限り、これまで説明した要素と同様の要素には、同じ符号を付し、重複する説明は省略する。
　実験例では、プレート１１として、Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ社製のＶｉｅｗ－Ｐｌａｔｅ－３８４を用いた。Ｖｉｅｗ－Ｐｌａｔｅ－３８４は、図１に示したように、３８４個のウェル１３を有していた。実験例でも、図１と同様に、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８を仮想的に設定した。
　実験例では、指示薬、培養液などを含むＸｅｎｏｍｅｔｒｉｘ社製のＡｍｅｓ試験キット（「Ａｍｅｓ　ＭＰＦＴＭ　Ｐｅｎｔａ　Ｉ　　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｆｏｒｍａｔ　Ｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ　Ａｓｓａｙ」）を用いた。Ａｍｅｓ試験における評価プレート１０の準備手順は、前述した第１Ａ工程から第１１Ａ工程の手順に従って行った。
　実験例において使用した試験体（細胞）、検体、検体液および陽性対照化合物並びに陽性対照化合物は以下のとおりであった。
　試験体（細胞）：ＴＡ１５３７
　検体：4-chlorobenzyl chloride
　検体液および陽性対照液の溶媒：ＤＭＳＯ　
　陽性対照化合物：９ＡＡ
　実験例では、区画Ｓｅ１を陰性対照区画とし、区画Ｓｅ８を陽性対照区画とした。区画Ｓｅ２～区画Ｓｅ７における検体の第８Ａ工程における濃度は次のとおりであった。
　区画Ｓｅ２：１．９５μｇ／ｍＬ
　区画Ｓｅ３：７．８１μｇ／ｍＬ
　区画Ｓｅ４：３１．３μｇ／ｍＬ
　区画Ｓｅ５：１２５μｇ／ｍＬ
　区画Ｓｅ６：５００μｇ／ｍＬ
　区画Ｓｅ７：２０００μｇ／ｍＬ
　区画Ｓｅ８（陽性対照区画）における陽性対照化合物の第８Ａ工程における濃度は１５μｇ／ｍＬであった。本実験例では、代謝活性化を有しない場合の実験を実施した。
　上記条件において、前述した第１Ａ工程から第１１Ａ工程の手順に従って評価プレート１０を準備し、図３に模式的に示した観察装置３０でプレート画像Ｐ１を得た。観察装置３０が有する撮像部３３には、分解能が２０μｍ／ｐｉｘｅｌであるカラーカメラを用いた。カラーカメラは、図３に示したように評価プレート１０の下側に配置した。照明にはＬＥＤ照明を用いて、評価プレート１０の上側から光を照射した。評価プレート１０の撮像では、評価プレート１０を搬送しながら評価プレート１０を撮像した。搬送速度は４．２８ｍｍ／ｓであった。
　上記のように撮像して得られた評価プレート１０のプレート画像Ｐ１に対して、図５を用いて説明した透明度評価方法を実施した。本実験例では、各区画Ｓｅ１～Ｓｅ７の透明度を評価した。区画Ｓｅ８は陽性対照区画であることから、透明度指標Ｔの算出は行わなかった。すなわち、区画Ｓｅ８については、透明度を評価しなかった。実験例において、度数分布は、色相および彩度を変量とした度数分布であった。色相および彩度は、０～５５に分けて評価した。第１色判定工程Ｓ１３の度数分布モデルには、プレート画像Ｐ１中において明らかに第１基準対象色、第２基準対象色および黄色である領域を指定してその領域に対する度数分布を使用した。第１色判定工程Ｓ１３および第２色判定工程Ｓ１５における所定の類似度には最大の類似度を採用した。実験例において、透明度評価領域（紫色領域）は、上記第１手法に基づいて設定した。
　本実験例では、同じ条件の評価プレート１０を３枚準備し、３枚の評価プレート１０に対して透明度を評価した。
　図１４は、区画Ｓｅ１～Ｓｅ７それぞれに対して式（１）および式（２）で得られた透明度指標Ｔをプロットしたものである。図１４の横軸の「１」、「２」、・・・、「７」はそれぞれ区画Ｓｅ１，Ｓｅ２、・・・、Ｓｅ７を示している。縦軸は、透明度指標Ｔである。各プロット点は、上記３枚の評価プレート１０に対する評価結果の平均値である。図中の破線は、上記３枚の評価プレート１０に対する評価結果に対する標準偏差を示している。
　図１４に示したように、検体の濃度のより高い区画Ｓｅ６および区画Ｓｅ７において、透明度指標Ｔが低下している。この場合、使用した検体が試験体に対して毒性を有するものであることが明らかに理解され得る。たとえば、予め閾値を１から少し下側に設定しておくことで、閾値より下側に透明度指標Ｔが位置する区画の有無で毒性を評価してもよい。
　以上、本発明の実施形態および実験例を説明した。しかしながら、本発明は、上記実施形態および実験例に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示される範囲が含まれることが意図されるとともに、特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
　上記実施形態では、本発明に係る透明度評価方法を、Ａｍｅｓ試験に適用した場合を説明した。しかしながら、本透明度評価方法が適用される安全性の評価方法は、Ａｍｅｓ試験に限定されず、たとえば、ｐＨ指示薬を用いる試験、色素を用いる試験（例えばＭＴＴアッセイ、タンパク質定量）、発光あるいは蛍光を用いる試験（例えばＡＴＰアッセイ）などにも適用され得る。
　上記実施形態では、Ａｍｅｓ試験に本透明度評価方法を適用した形態を説明したことから、指示薬の色が紫色から黄色への色変化が存在する場合を例にして実施形態を説明した。しかしながら、紫色（対象色）の透明度の変化にのみに着目して本透明度評価方法を実施してもよい。
　この場合、上記実施形態における黄色に対する度数分布の取得などを省略できる。黄色に対する度数分布を使用しないことから、第２基準ベクトルの使用も省略できる。この場合、第１基準ベクトルと重心ベクトルの角度θ１および長さに基づいて透明度を評価すればよい。たとえば、角度θ１に対して予め閾値を設定しておき、角度θ２の代わりに閾値と角度θ１との関係に応じて式（１）及び式（２）を適用することで透明度を評価すればよい。上記実施形態におけるシフト工程Ｓ１７は、第１基準対象色領域Ａ１の重心位置Ｇ１と、黄色領域Ａ３の重心位置Ｇ４とをより離すための処置であることから、黄色に対する度数分布を使用しない場合には、シフト工程Ｓ１７は実施しなくてもよい。
　上記実施形態では、重心ベクトルの第１基準ベクトルに対する角度θ１および長さを用いて評価した。しかしながら、ベクトルは、向きおよび大きさを有することから、重心ベクトルが得られていれば、透明度を評価可能である。
　上記実施形態では、重心ベクトルと第１基準ベクトル及び第２基準ベクトルとの関係に基づいて透明度を評価した。しかしながら、第１基準ベクトル及び第２基準ベクトルを用いなくてもよい。たとえば、彩度および色相を変量とした度数分布では、彩度の変化方向（例えば図８の横方向）に対する重心ベクトルの角度等に基づいて透明度を評価することも可能である。この場合も彩度の変化方向に対する重心ベクトルの角度に対して前述したように閾値を設定してもよい。
　第１基準対象色領域、第２基準対象色領域および黄色領域の特定に、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８に対して取得した平均度数分布を使用した。しかしながら、たとえば、第１基準対象色、第２基準対象色および黄色に対する度数分布モデル自体における第１基準対象色領域、第２基準対象色領域および黄色領域を使用してもよい。
　本透明度評価方法は、上記実施形態で説明したモデル更新工程Ｓ１４を有さなくてもよい。この場合、更新された度数分布モデルを用いた色判定などの処理において、第１基準対象色、第２基準対象色および黄色に対する初期の度数分布モデル（更新されていない度数分布モデル）を用いればよい。
　第２基準対象色領域Ａ２の重心位置Ｇ３には、第２基準対象色に対する度数分布モデルにおける第２基準対象色領域に対してシフト工程Ｓ１７を実施することで得られる第２基準対象色領域の重心位置を用いてもよい。なお、シフト工程Ｓ１７を実施しない形態では、第２基準対象色に対する度数分布モデルにおける第２基準対象色領域の重心位置を用いてもよい。これらの形態では、第１色判定工程Ｓ１３において第２基準対象色に対する色判定を実施しなくてもよく、それに伴い、第２基準対象色に対する度数分布モデルに対してモデル更新工程Ｓ１４を実施しなくてもよい。このような形態は、たとえば、ウェル１３の色判定として、紫色を、第１基準対象色および第２基準対象色に分けず、それらを含む紫色として判定する場合に特に有効である。
　第１色判定工程Ｓ１３およびモデル更新工程Ｓ１４は実施されなくてもよい。この形態では、第２色判定工程Ｓ１５に対応する色判定工程として、度数分布作成工程Ｓ１２で作成した各ウェル１３に対応する度数分布に基づいて各ウェル１３の色を判定すればよい。このような場合の一形態では、各ウェル１３に対応する度数分布において第１基準対象色領域、第２基準対象色領域および黄色領域における度数に基づいて色を判定すればよい。たとえば、第１基準対象色領域に一定の閾値以上の度数が存在する度数分布に対応するウェル１３の色を第１基準対象色と判定すればよい。第２基準対象色の色判定および黄色の色判定も同様に実施され得る。この場合、第１基準対象色、第２基準対象色および黄色それぞれに対する度数分布モデルを用いなくてもよい。
　対象色が紫色であり、比較対照色が黄色である場合を説明した。しかしながら、これらの色は、評価試験において指標となる色に応じたものであり、紫色、黄色などに限定されない。
　色相および彩度を変量とする度数分布の代わりに、色相と明度或いは明度と彩度を変量とする度数分布を用いることも可能である。度数分布を規定する変量の数は、３以上でもよい。
　プレート画像における所定領域の個数（Ｎ）は、８に限定されない。上記実施形態では、プレート画像におけるＮ個の所定領域として、区画Ｓｅ１（陰性対照区画）および区画Ｓｅ８（陽性対照区画）を含む８個の区画Ｓｅ１～Ｓｅ８に対応する領域である場合を説明した。しかしながら、Ｎ個の所定領域は、陽性対照区画である区画Ｓｅ８を含まない７個の区画Ｓｅ１～Ｓｅ７でもよい。この場合、プレート画像は、Ｎ個の所定領域とともに、陽性対照区画に対応する領域（比較対照色が現れる領域）を有してもよい。Ｎ個の所定領域は、陰性対照区画である区画Ｓｅ１および上記区画Ｓｅ８を含まない区画Ｓｅ２～Ｓｅ７でもよい。この場合、Ｎ個の所定領域とともに、陽性対照区画に対応する領域（比較対照色が現れる領域）および陰性対照区画に対応する領域（第１基準対象色が現れる領域）の少なくとも一方を有してもよい。
　例示した実施形態及び変形例などは、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜組み合わされてもよい。
１０…評価プレート、１３…ウェル、１４，１４ａ～１４ｈ…評価対象、Ｐ１…プレート画像、１３ｐ…ウェル画像、Ｇ１…重心位置（第１重心位置）、Ｇ２…重心位置（第２重心位置）、Ｇ３…重心位置（第３重心位置）、Ｇ４…重心位置（第４重心位置）、Ｓｅ１～Ｓｅ８…区画（Ｎ個の所定領域）。

Claims (8)

  1. 　プレート画像におけるＮ個（Ｎは１以上の整数）の所定領域の対象色に対するＮ個の度数分布であって、少なくとも２つの色特徴量を変量とする前記Ｎ個の度数分布を取得する工程と、
    　前記少なくとも２つの色特徴量を変量としており第１基準対象色に対する第１基準度数分布と前記Ｎ個の度数分布とに基づいて、前記Ｎ個の所定領域の透明度を評価する工程と、
    を備え、
    　前記プレート画像は、プレートが備える複数のウェルに評価対象が保持された評価プレートに対応する画像であり、
    　前記評価対象は試験体を含み、
    　前記複数のウェルは、検体を更に含む前記評価対象を保持した少なくとも１つの検体用ウェルを有し、
    　前記Ｎ個の所定領域の少なくとも１つは、前記少なくとも１つの検体用ウェルに対応する少なくとも１つの画像を含み、
    　前記第１基準対象色は、第１透明状態である前記対象色であり、
    　前記透明度を評価する工程では、前記第１基準度数分布における第１基準対象色領域の第１重心位置から前記Ｎ個の度数分布それぞれにおける対象色領域の第２重心位置に向かう重心ベクトルに基づいて前記透明度を評価する、
    透明度評価方法。
  2. 　前記第１基準度数分布を取得する工程を更に備え、
    　前記複数のウェルは、前記第１基準対象色用の少なくとも１つの第１基準対象色ウェルを更に含み、
    　前記Ｎ個の所定領域の１つは、前記少なくとも１つの第１基準対象色ウェルに対応する画像を含み、
    　前記第１基準度数分布を取得する工程では、前記Ｎ個の所定領域のうち、前記少なくとも１つの第１基準対象色ウェルに対応する画像を含む所定領域における少なくとも２つの色特徴量を変量とする度数分布を、前記第１基準度数分布として取得する、
    　請求項１に記載の透明度評価方法。
  3. 　前記透明度を評価する工程では、透明度変化基準ベクトルに対する前記重心ベクトルの角度および前記重心ベクトルの長さに基づいて、前記透明度を評価し、
    　前記透明度変化基準ベクトルは、前記第１重心位置から第２基準対象色に対する第２基準度数分布であって少なくとも２つの色特徴量を変量とする前記第２基準度数分布における第２基準対象色領域の第３重心位置に向かうベクトルであり、
    　前記第２基準対象色は、前記第１透明状態とは異なる第２透明状態である前記対象色であり、
    　前記重心ベクトルの長さは、前記重心ベクトルを規定する前記第２重心位置を含む度数分布を画像表示した場合の画像サイズで規格化された長さである、
    請求項１または２に記載の透明度評価方法。
  4. 　前記第２基準度数分布を取得する工程を更に備え、
    　前記第２基準度数分布を取得する工程では、前記Ｎ個の所定領域のうちの１つの所定領域における第２基準対象色に対する前記少なくとも２つの色特徴量を変量とする度数分布を、前記第２基準度数分布として取得する、
    請求項３に記載の透明度評価方法。
  5. 　前記Ｎ個の度数分布を取得する工程では、前記Ｎ個の所定領域それぞれにおいて、第１基準対象色および第２基準対象色に対する度数分布を取得し、前記第１基準対象色に対する度数分布と前記第２基準対象色に対する度数分布とに基づいて前記対象色の度数分布を取得し、
    　前記第２基準対象色は、第１透明状態と異なる第２透明状態である前記対象色であり、
    　前記透明度を評価する工程では、透明度変化基準ベクトルに対する前記重心ベクトルの角度および前記重心ベクトルの長さに基づいて、前記透明度を評価し、
    　前記透明度変化基準ベクトルは、前記第１重心位置から第２基準度数分布であって少なくとも２つの色特徴量を変量とする前記第２基準度数分布における第２基準対象色領域の第３重心位置に向かうベクトルであり、
    　前記第１基準度数分布は、前記Ｎ個の所定領域のうちの１つの所定領域で取得された前記第１基準対象色の度数分布であり、
    　前記第２基準度数分布は、前記Ｎ個の所定領域のうちの１つの所定領域で取得された前記第２基準対象色の度数分布であり、
    　前記重心ベクトルの長さは、前記重心ベクトルを規定する前記第２重心位置を含む度数分布を画像表示した場合の画像サイズで規格化された長さである、
    請求項１に記載の透明度評価方法。
  6. 　前記Ｎ個の度数分布を取得する工程は、
    　前記Ｎ個の所定領域それぞれにおける複数の領域に対して前記少なくとも２つの色特徴量を変量とする初期度数分布を取得する工程と、
    　前記複数の領域に対する前記初期度数分布と前記第１基準対象色に対する第１度数分布モデルとの類似度、および、前記複数の領域に対する前記初期度数分布と前記第２基準対象色に対する第２度数分布モデルとの類似度に基づいて前記複数の領域の色を判定する工程と、
    　前記複数の領域のうち前記第１基準対象色および前記第２基準対象色それぞれに判定された領域の初期度数分布を用いて前記第１基準対象色および前記第２基準対象色に対する度数分布を取得する工程と、
    を有する、請求項５に記載の透明度評価方法。
  7. 　前記少なくとも２つの色特徴量を変量とする度数分布に対応する画像データを、前記少なくとも２つの色特徴量のうちの１つの方向にシフトさせる工程を更に備え、
    　前記Ｎ個の度数分布を取得する工程では、前記Ｎ個の所定領域それぞれにおいて、第１基準対象色、第２基準対象色および比較対照色に対する度数分布を取得するとともに、前記第１基準対象色に対する度数分布と前記第２基準対象色に対する度数分布とに基づいて前記対象色の度数分布を取得し、
    　前記第２基準対象色は、前記第１透明状態とは異なる第２透明状態である前記対象色であり、
    　前記比較対照色は、前記対象色とは異なる色であり、
    　前記透明度を評価する工程では、透明度変化基準ベクトルに対する前記重心ベクトルの角度、色変化基準ベクトルに対する前記重心ベクトルの角度および前記重心ベクトルの長さに基づいて、前記透明度を評価し、
    　前記透明度変化基準ベクトルは、前記第１重心位置から第２基準度数分布における第２基準対象色領域の第３重心位置に向かうベクトルであり、
    　前記色変化基準ベクトルは、前記第１重心位置から比較対照度数分布における比較対照色領域の第４重心位置に向かうベクトルであり、
    　前記第１基準度数分布は、前記Ｎ個の所定領域のうちの１つの所定領域で取得された前記第１基準対象色の度数分布であり、
    　前記第２基準度数分布は、前記Ｎ個の所定領域のうちの１つの所定領域で取得された前記第２基準対象色の度数分布であり、
    　前記比較対照度数分布は、前記Ｎ個の所定領域のうちの１つの所定領域で取得された前記比較対照色の度数分布であり、
    　前記シフトさせる工程では、前記Ｎ個の度数分布、前記第１基準度数分布、前記第２基準度数分布および前記比較対照度数分布を画像表示した場合における表示領域に対して前記Ｎ個の度数分布、前記第１基準度数分布、前記第２基準度数分布および前記比較対照度数分布に対応する画像データを前記少なくとも２つの色特徴量のうちの１つの方向にシフトし、
    　前記第１重心位置、前記第２重心位置、前記第３重心位置および前記第４重心位置それぞれは、前記Ｎ個の度数分布、前記第１基準度数分布、前記第２基準度数分布および前記比較対照度数分布それぞれに対応する画像データであって前記シフトされた画像データに基づく重心位置である、
    請求項１に記載の透明度評価方法。
  8. 　前記少なくとも２つの色特徴量は、色相及び彩度を含む、
    請求項１に記載の透明度評価方法。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010223933A (ja) * 2009-02-25 2010-10-07 Fuji Electric Systems Co Ltd 色空間判別条件生成装置及びこれを使用した画像検査装置
WO2013145873A1 (ja) * 2012-03-27 2013-10-03 株式会社サタケ 光学式粒状物選別機
US20190011252A1 (en) * 2016-01-07 2019-01-10 Arkema Inc. Optical method to measure the thickness of coatings deposited on substrates
CN111368643A (zh) * 2020-02-12 2020-07-03 杭州电子科技大学 一种大肠杆菌动态生长监测方法
WO2021095381A1 (ja) * 2019-11-12 2021-05-20 住友化学株式会社 評価対象の評価方法、画像処理装置及び評価対象の評価システム

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010223933A (ja) * 2009-02-25 2010-10-07 Fuji Electric Systems Co Ltd 色空間判別条件生成装置及びこれを使用した画像検査装置
WO2013145873A1 (ja) * 2012-03-27 2013-10-03 株式会社サタケ 光学式粒状物選別機
US20190011252A1 (en) * 2016-01-07 2019-01-10 Arkema Inc. Optical method to measure the thickness of coatings deposited on substrates
WO2021095381A1 (ja) * 2019-11-12 2021-05-20 住友化学株式会社 評価対象の評価方法、画像処理装置及び評価対象の評価システム
CN111368643A (zh) * 2020-02-12 2020-07-03 杭州电子科技大学 一种大肠杆菌动态生长监测方法

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