WO2023190534A1 - 粒子分析装置、粒子分析装置用プログラム、及び粒子分析方法 - Google Patents

粒子分析装置、粒子分析装置用プログラム、及び粒子分析方法 Download PDF

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WO2023190534A1
WO2023190534A1 PCT/JP2023/012555 JP2023012555W WO2023190534A1 WO 2023190534 A1 WO2023190534 A1 WO 2023190534A1 JP 2023012555 W JP2023012555 W JP 2023012555W WO 2023190534 A1 WO2023190534 A1 WO 2023190534A1
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WO
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particles
fluorescence
observation mode
particle
scattered light
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PCT/JP2023/012555
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央昌 菅澤
康弘 立脇
達夫 伊串
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株式会社堀場製作所
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence

Definitions

  • the present invention relates to a particle analyzer and the like that analyze particles using a particle trajectory analysis method (PTA method).
  • PTA method particle trajectory analysis method
  • this type of particle analyzer adds a fluorescent marker to particles to be measured, irradiates the fluorescent marker with a laser beam of an excitation wavelength corresponding to the fluorescent marker, and observes the resulting fluorescence.
  • this particle analyzer is equipped with a filter that cuts laser light scattered by particles while transmitting fluorescence emitted by fluorescent markers.By observing the fluorescence that has passed through this filter with an imaging unit, It is configured so that particles to which a marker has been added can be separated from other particles and analyzed.
  • the particle diameter is calculated from the average distance traveled by the particles within a certain period of time, so it is necessary to observe the particles for a certain amount of time, but if the above-mentioned fading occurs, sufficient observation time cannot be secured. There are cases.
  • the present invention solves the above-mentioned problems, and aims to ensure sufficient observation time in the PTA method without being affected by fading of fluorescent markers or particles with autofluorescence properties. This is something to be addressed.
  • the particle analyzer according to the present invention has a fluorescence observation mode in which a fluorescence marker added to the particles or fluorescence emitted by the particles themselves is imaged by irradiating the particles with excitation light, and a fluorescence observation mode in which the particles are irradiated with light.
  • a particle identification unit identifies the particles in the particle identification unit, and from the image data of the scattered light obtained in the scattered light observation mode, which has a larger number of frames than the fluorescence observation mode, the particle identification unit identifies the particles identified by the Brownian motion.
  • the present invention is characterized by comprising an analysis section that determines the diffusion rate and analyzes the physical properties of the particles.
  • the particle analyzer configured in this way, particles to which a fluorescent marker has been added or particles emitting fluorescence are identified in the fluorescence observation mode, and the identified particles are observed and analyzed in the scattered light observation mode. Therefore, the time required in the fluorescence observation mode can be completed in a short time, and in the subsequent scattered light observation mode, sufficient observation time can be secured in the PTA method without being affected by fading of the fluorescent marker or the particles themselves. It becomes possible to do so.
  • a filter that transmits fluorescence emitted by the fluorescent marker or the particles themselves while cutting off scattered light caused by irradiation of the particles with the excitation light; and an imaging unit that images the fluorescence transmitted through the filter. It is preferable to further provide. With this, it is possible to image fluorescence without being affected by scattered light caused by irradiating particles with excitation light, and more accurately identify particles to which fluorescent markers have been added or particles that are emitting fluorescence. can be specified.
  • the filter is placed in front of the imaging section in the fluorescence observation mode, and that the filter is removed from in front of the imaging section in the scattered light imaging mode.
  • a common imaging unit can be used in the fluorescence observation mode and the scattered light observation mode, reducing the number of parts and manufacturing costs, and improving the equipment. It can be made more compact.
  • the mode switching mechanism removes the filter from the front of the imaging section, making it possible to switch modes and, in turn, to automate the analysis.
  • Another embodiment for being able to take a fluorescence observation mode and a scattered light observation mode further includes a beam splitter that splits the luminous flux made up of the fluorescence and the scattered light into a first optical path and a second optical path,
  • the imaging unit and the filter are arranged, and in the second optical path, a second imaging unit different from the imaging unit that observes the scattered light is arranged.
  • the filter can be placed in the first optical path, eliminating the need for a mechanism or operation to remove the filter from in front of the imaging section, and furthermore, allowing fluorescence and scattered light to be observed simultaneously. .
  • the particle identifying unit may identify particles to which the fluorescent marker is added or particles emitting fluorescence from at least a first frame of image data of the fluorescent image data obtained in the fluorescent observation mode. preferable. With this, the time required for the fluorescence observation mode can be shortened as much as possible.
  • At least one of the intensity of the excitation light, the gain or exposure time of the imaging section, or the position of the filter differs between the fluorescence observation mode and the scattered light observation mode. With this, it is possible to set appropriate imaging conditions in each of the fluorescence observation mode and the scattered light observation mode.
  • a program for a particle analyzer includes a fluorescence observation mode in which a fluorescent marker added to the particles or fluorescence emitted by the particles themselves is imaged by irradiating the particles with excitation light, and a fluorescence observation mode in which the particles are irradiated with light.
  • This is a program used in a particle analyzer that can take a scattered light observation mode that images scattered light generated by or a particle specifying unit that specifies particles emitting fluorescence, and image data of the scattered light obtained in the scattered light observation mode in which the number of frames is larger than that in the fluorescence observation mode, and the particles specified by the particle specifying unit.
  • This system is characterized by having a computer function as an analysis unit that determines the diffusion rate of particles due to Brownian motion and analyzes the physical properties of the particles.
  • the particle analysis method includes a fluorescence observation mode in which fluorescent markers added to the particles or fluorescence emitted by the particles themselves are imaged by irradiating the particles with excitation light, and a fluorescence observation mode in which the particles are irradiated with light.
  • This is a particle analysis method using a particle analyzer that can operate in a scattered light observation mode that images scattered light generated by the fluorescence observation mode, and from the fluorescence image data obtained in the fluorescence observation mode, particles to which the fluorescent marker is added or A particle identification step of identifying particles emitting fluorescence, and the particles identified by the particle identification unit from image data of the scattered light obtained in the scattered light observation mode in which the number of frames is larger than that in the fluorescence observation mode.
  • This method is characterized by comprising an analysis step of determining the diffusion rate due to Brownian motion of the particles and analyzing the physical properties of the particles.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a fluorescence observation mode of a particle analyzer according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a scattered light observation mode of the particle analyzer of the same embodiment.
  • FIG. 3 is a functional block diagram showing the functions of the information processing device according to the embodiment. 3 is a flowchart showing the operation of the particle analyzer according to the embodiment.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing an image obtained by the imaging unit of the embodiment.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing a fluorescence observation mode of a particle analyzer in another embodiment.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing a scattered light observation mode of a particle analyzer in another embodiment.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing a particle analysis device in another embodiment.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing a particle analysis device in another embodiment.
  • the particle analyzer 100 of this embodiment analyzes the physical properties of particles contained in a sample in a cell 1, and for example, exosomes contained in a body fluid sample such as blood or urine. Or, it analyzes virus-like particles, liposomes, or proteins related to vaccines.
  • This particle analyzer 100 is used in conjunction with a multiple staining method, and specifically, it irradiates light onto a sample made by adding multiple types of fluorescent markers to particles, and detects the fluorescence emitted by those fluorescent markers. This is used to analyze the physical properties of particles.
  • the particles themselves emit fluorescence for example, particles contained in a sample have autofluorescence, it is not necessarily necessary to use a fluorescent marker; The fluorescence emitted by itself may be detected.
  • Such particles can include, for example, inorganic materials such as fluorescent beads.
  • three types of fluorescent markers are used, and thereby particles to be measured can be classified into eight types.
  • the eight types include one type in which all three types of fluorescent markers are not added, three types in which only one type is added, three types in which only two types are added, and three types in which all three types are added.
  • the particle analyzer 100 does not necessarily need to be used with a multiple staining method, and may be used with a single type of fluorescent marker.
  • the particle analyzer 100 of this embodiment has a fluorescence observation mode shown in FIG. 1 in which fluorescence generated by irradiating excitation light to a fluorescent marker added to particles is imaged, and a fluorescence observation mode in which light other than excitation light is applied to particles.
  • the scattered light observation mode shown in FIG. 2, in which scattered light generated by irradiation is imaged, can be used.
  • this particle analyzer 100 includes a light irradiation unit 2 that irradiates light onto a sample containing particles to be analyzed, and an imaging unit that captures an image of light generated by the irradiation of the light. 3, and an information processing device 4 that analyzes the physical properties of particles using the imaging data obtained by the imaging section 3.
  • the light irradiation unit 2 includes excitation light sources 21, 22, and 23 that irradiate excitation light onto a fluorescent marker to excite fluorescence, and a scattering source that irradiates particles with light other than the excitation light and scatters the other light. It has a light source 20 for use.
  • the excitation light sources 21, 22, and 23 emit light with lower light intensity than the scattering light source 20, which will be described later, and are, for example, LEDs. Since this embodiment uses three types of fluorescent markers, it has three excitation light sources 21, 22, and 23. Note that one excitation light source 21 may emit light including three excitation wavelengths. Further, the number of excitation light sources 21, 22, and 23 may be changed as appropriate depending on the number of types of fluorescent markers used.
  • the first excitation light source 21 irradiates the first fluorescent marker with excitation light having an excitation wavelength ⁇ 1
  • the second excitation light source 22 irradiates the first fluorescent marker with excitation light having an excitation wavelength ⁇ 2.
  • the third excitation light source 23 irradiates the third fluorescent marker with excitation light having an excitation wavelength ⁇ 3.
  • the excitation wavelengths ⁇ 1, ⁇ 2, and ⁇ 3 are different from the fluorescence wavelengths ⁇ 1', ⁇ 2', and ⁇ 3' of the fluorescence emitted by the three types of fluorescent markers, respectively.
  • the light emitted from each of these excitation light sources 21, 22, and 23 is guided to the cell 1 via the irradiation optical system 24, which includes reflective mirrors 241, 242, half mirrors 243, 244, and a condensing lens 245. Ru.
  • the scattering light source 20 irradiates particles with light having a wavelength different from the above-mentioned excitation wavelengths ⁇ 1, ⁇ 2, and ⁇ 3, and in this embodiment is a laser light source that emits laser light. Although a single scattering light source 20 is provided here, a plurality of scattering light sources 20 may be provided.
  • the optical path L1 of the excitation light emitted to the particles from the excitation light sources 21, 22, and 23 (see FIG. 1), and the optical path L2 of the laser light emitted to the particles from the scattering light source 20 (see FIG. 2). ) have some things in common with In other words, a part of the optical system constituting the optical paths L1 and L2 is used in both the fluorescence observation mode and the scattered light observation mode, and here, the half mirror 244 and the reflection mirror 242 are used for the excitation light optical path L1 and L2. It is also used as the optical path L2 of the laser beam.
  • the imaging unit 3 images the particles to which the fluorescent marker is added by imaging the fluorescence emitted by the fluorescent marker in the fluorescence observation mode, and the particles to which the fluorescent marker is added by imaging the scattered light in the scattered light observation mode. It images various particles contained in a sample regardless of whether or not they are captured, and outputs, for example, image data as the image data.
  • This imaging unit 3 has color discrimination ability, and in this embodiment is an imaging camera having a color CCD.
  • the light irradiation direction of the light irradiation section 2 and the imaging direction of the imaging section 3 are provided to be orthogonal to each other, but the invention is not limited to this.
  • the excitation light when excitation light is irradiated onto particles in the cell 1, the excitation light will be scattered by the particles, and the scattered light will be detected by the imaging unit 3, which may impede fluorescence observation. be.
  • the particle analyzer 100 of the present embodiment is designed to prevent the above-mentioned scattered light from being detected by the imaging unit 3, as shown in FIG.
  • One or more filters 5 are provided that cut off scattered light while transmitting fluorescent light of a plurality of colors emitted by the plurality of types of fluorescent markers described above. Note that when the particles themselves emit fluorescence, the filter 5 transmits the fluorescence emitted by the particles while cutting off scattered light.
  • a filter group 5 (hereinafter simply referred to as filter 5) made up of a plurality of filters stacked one on top of the other is provided between the cell 1 and the imaging unit 3.
  • filter 5 it is not always necessary to use a plurality of filters; for example, if only one type of fluorescent marker is used, only one filter may be used.
  • the filter 5 here is a stack of at least a plurality of notch filters, and includes a first filter that transmits wavelengths longer than the shortest excitation wavelength ⁇ 1, and a second filter that cuts the next shortest excitation wavelength ⁇ 2. It is formed by overlapping a filter and a third filter that cuts off the longest excitation wavelength ⁇ 3.
  • the filter 5 transmits fluorescence of various wavelengths (various colors) while cutting at least excitation wavelengths ⁇ 1, ⁇ 2, and ⁇ 3.
  • the particle analyzer 100 of this embodiment operates in the fluorescence observation mode, as shown in FIGS. 1 and 2.
  • a filter 5 is disposed in front of the imaging section 3, and is configured to be removed from in front of the imaging section 3 in the scattered light observation mode.
  • the particle analyzer 100 of the present embodiment switches the filter 5, which is placed in front of the imaging section 3 at the start of the fluorescence observation mode, to the imaging section after a predetermined period of time has elapsed from the start of the fluorescence observation mode.
  • a mode switching mechanism 6 that is removed from the front of 3 is provided.
  • An example of the mode switching mechanism 6 is one that is configured using a motor, for example, and moves the filter 5 back and forth between the imaging section 3 and the cell 1.
  • the user can manually place the filter 5 between the cell 1 and the imaging section 3; It may be possible to manually remove it from between 3 and 3.
  • the fluorescence observation mode it is possible to observe the fluorescence generated using the excitation light sources 21, 22, and 23, and in the scattered light observation mode, the scattered light generated using the scattering light source 20 can be observed. can be observed.
  • the information processing device 4 is a computer equipped with a CPU, memory, display, various input/output devices, etc., and is connected to the imaging unit 3 by wire or wirelessly.
  • the information processing device 4 By executing the particle analysis program stored in the memory, the information processing device 4 has functions as a particle identification section 41, an analysis section 42, and a display section 43, as shown in FIG. ing.
  • the particles to be measured contained in the sample are multi-stained (S1). Note that, as described above, it is not always necessary to carry out multiple staining, and a single type of fluorescent marker may be added to the sample. Furthermore, a step of stirring the sample may be provided before adding the fluorescent marker.
  • the particle analyzer 100 is placed in the fluorescence observation mode shown in FIG. 1 (S2).
  • the excitation light sources 21, 22, and 23 irradiate the sample in the cell 1 with excitation light having excitation wavelengths ⁇ 1, ⁇ 2, and ⁇ 3 corresponding to the plurality of types of fluorescent markers, respectively, and the resulting fluorescence is transmitted to the imaging unit. 3 (S3).
  • excitation light having excitation wavelengths ⁇ 1, ⁇ 2, and ⁇ 3 is sequentially irradiated.
  • the first frame of the image data obtained by the imaging unit 3 in the fluorescence observation mode is set to the first excitation wavelength ⁇ 1.
  • the excitation light switching timing and the frame length of the imaging unit 3 are not limited to the above-mentioned embodiments.
  • the first group of image data consisting of multiple frames is A second group of image data consisting of a plurality of subsequent frames is obtained by irradiating excitation light with a second excitation wavelength ⁇ 2, and a third group of image data consisting of a subsequent plurality of frames.
  • the image data may be obtained by irradiating excitation light with the third excitation wavelength ⁇ 3.
  • the particle identification unit 41 identifies particles to which a fluorescent marker has been added from the fluorescence image data obtained by the imaging unit 3 ( S4). Note that when the particles themselves emit fluorescence, the particle identification unit 41 identifies the particles emitting fluorescence.
  • the particle specifying unit 41 of this embodiment specifies the position, size, or range of particles captured in this fluorescence image data.
  • the particle identifying unit 41 identifies particles to which a fluorescent marker is added from at least one of the image data from the first frame to the tenth frame, for example, among the fluorescent image data obtained in the fluorescence observation mode. is preferred, and a more preferred embodiment is an embodiment in which particles to which a fluorescent marker is added are identified from at least the first frame of image data.
  • the particle identifying unit 41 performs image processing on image data to distinguish between particles to which a fluorescent marker that emits fluorescence is added and other regions, and identifies the position of the particles.
  • the center of gravity position of each particle to which a fluorescent marker is added is calculated.
  • the particle identification unit 41 identifies the positions of particles shown in the respective image data from the image data of the second and third frames ( Here, the center of gravity position) is calculated.
  • the particle identifying unit 41 of this embodiment is configured to identify not only the position of the particle but also the type of the particle based on each image data.
  • the particles shown in the first frame are particles of the first type
  • the particles shown in the second frame are particles of the second type
  • the particles shown in the third frame are particles of the second type. is called the third type of particle.
  • the particle analyzer 100 is changed from the fluorescence observation mode shown in FIG. 1 to the scattered light observation mode shown in FIG. Switch (S5).
  • the particles in the cell 1 are irradiated with laser light from the scattering light source 20, and the scattered light scattered by the particles is imaged by the imaging unit 3 (S6).
  • This scattered light observation mode is a mode in which the number of frames is larger than that in the fluorescence observation mode.
  • the number of frames (that is, the number of image data) obtained by the imaging unit 3 in this scattered light observation mode is The number of frames is larger than the number of frames (that is, the number of image data) obtained by the imaging unit 3 in the mode.
  • the scattered light observation time in the scattered light observation mode is longer than the fluorescence observation time in the fluorescence observation mode.
  • the analysis unit 42 acquires image data of the scattered light captured by the imaging unit 3 in the scattered light observation mode, and analyzes the physical properties of the particles based on this image data.
  • the analysis section 42 may analyze the physical properties of particles using image data obtained in the fluorescence observation mode in addition to the image data obtained in the scattered light observation mode.
  • this analysis section 42 calculates the particle size distribution using the PTA method, and calculates the particle size distribution of the particles identified by the particle identification section 41 by determining the diffusion rate due to Brownian motion. Note that the analysis unit 42 does not necessarily need to calculate the particle size distribution, and may instead calculate the particle size of the particles as a physical property, for example.
  • the time from the start of the fluorescence observation mode described above to the switch to the scattered light observation mode is about the time required to acquire, for example, three frames of image data, which is a very short time. There should be almost no movement of particles.
  • the analysis unit 42 of this embodiment estimates the particles identified by the above-mentioned particle identification unit 41 among the particles captured in the image data of scattered light (S7), and uses the estimated particles as The particles are regarded as particles identified by the particle identification unit 41 and analyzed (S8).
  • the analysis unit 42 acquires the centroid position of each particle calculated by the particle identification unit 41 described above based on the fluorescence image data, and also acquires the obtained centroid position of the particles captured in the scattered light image data.
  • the particle photographed at the position closest to the position is estimated as the particle specified by the particle specifying unit 41.
  • the analysis unit 42 of this embodiment identifies each of the first type of particles, second type of particles, and third type of particles identified by the particle identification unit 41 as the particles shown in the scattered light image data. It is configured to estimate from within.
  • the analysis unit 42 of the present embodiment is configured to analyze the physical properties of particles contained in the sample by dividing them into types of particles. , the particle size distribution of each of the second type of particles and the third type of particles is calculated.
  • the display section 43 displays the analysis results of the analysis section 42 on a display D or the like, and specifically displays the particle size distribution or particle diameter of the particles in a distinguishable manner, for example, for each type of particle. .
  • ⁇ Effects of this embodiment> According to the particle analyzer 100 of this embodiment configured in this way, particles to which a fluorescent marker is added are identified in the fluorescence observation mode, and the identified particles are observed and analyzed in the scattered light observation mode. , the time required for fluorescence observation mode can be completed in a short time, and in the subsequent scattered light observation mode, it is possible to secure sufficient observation time using the PTA method without being affected by fading of the fluorescent marker. Become.
  • the filter 5 is placed in front of the imaging unit 3 in the fluorescence observation mode, and the filter 5 is removed from the front of the imaging unit 3 in the scattered light imaging mode, the imaging unit is common in the fluorescence observation mode and the scattered light observation mode. 3 can be used, and the number of parts and manufacturing costs can be reduced, and the device can be made more compact.
  • the apparatus is switched to the fluorescence observation mode or the scattered light observation mode, so mode switching becomes possible, and analysis can be automated.
  • the particle identification unit 41 identifies particles to which a fluorescent marker is added from at least the first frame of fluorescence image data obtained in the fluorescence observation mode, the time required for the fluorescence observation mode can be saved as much as possible. Can be shortened.
  • the excitation light sources 21, 22, and 23 and the scattering light source 20 are of different types, and a laser light source is used as the scattering light source used in the scattered light observation mode, thereby ensuring analysis by the PTA method.
  • a laser light source is used as the scattering light source used in the scattered light observation mode, thereby ensuring analysis by the PTA method.
  • the particle analyzer 100 can be configured to be inexpensive and contribute to the multiple staining method.
  • the excitation light sources 21, 22, and 23 used in the fluorescence observation mode LEDs were used in the embodiment, but for example, a lamp that emits white light or the like that emits light with a broader wavelength than the LEDs. It may be.
  • the excitation wavelength of the fluorescent marker is transmitted on the optical path from the light source to cell 1. It is preferable to provide a filter that allows
  • the same light source may be used both as the excitation light source 21 and the scattering light source 20. More specifically, the light source that is used both as the excitation light source 21 and the scattering light source 20 emits light at an excitation wavelength for the fluorescent marker, and is, for example, a laser light source.
  • the particle analyzer 100 here includes a filter 5 that cuts each of the excitation lights emitted from the laser light sources 20 and 21 while transmitting the fluorescence emitted by the fluorescent marker.
  • the filter 5 is placed between the cell 1 and the imaging section 3, as shown in FIG. From the data, identify particles to which fluorescent markers have been added.
  • the analysis conditions different between the fluorescence observation mode and the scattered light observation mode.
  • the intensity of excitation light, the imaging Preferably, at least one of the gain or exposure time of the section 3 or the position of the filter is different.
  • the intensity of the excitation light is lowered, the gain of the imaging unit 3 is increased, or the imaging unit 3 is Examples include lengthening the exposure time, or arranging a neutral density filter between the cell 1 and the excitation light sources 21, 22, and 23 in the fluorescence observation mode, and combining multiple of these aspects. is more desirable. Note that it is desirable that the neutral density filter be removed from between the cell 1 and the excitation light sources 21, 22, and 23 in the scattered light observation mode.
  • the filter 5 when switching from the fluorescence observation mode to the scattered light observation mode, the filter 5 is removed from the front of the imaging unit 3, which increases the amount of light observed in the scattered light observation mode, which may cause overexposure.
  • a neutral density filter may be placed between the cell 1 and the imaging section 3.
  • the particle analyzer 100 is It may be configured so that it can take a fluorescence observation mode and a scattered light observation mode.
  • such a particle analyzer 100 further includes a beam splitter that splits a light beam consisting of fluorescence and scattered light that has passed through the cell 1 into a first optical path La and a second optical path Lb.
  • a beam splitter that splits a light beam consisting of fluorescence and scattered light that has passed through the cell 1 into a first optical path La and a second optical path Lb.
  • an imaging unit 3 and a filter 5 for observing fluorescence are arranged as in the embodiment described above, and in the second optical path Lb, a second imaging unit 31 for observing scattered light is arranged separately from the imaging unit 3.
  • a second imaging unit 31 for observing scattered light is arranged separately from the imaging unit 3.
  • the first optical path La is an optical path for fluorescence observation to observe fluorescence
  • the second optical path Lb is an optical path for scattered light observation to observe scattered light
  • the particle identification unit 41 identifies particles to which a fluorescent marker has been added from the image data obtained by the imaging unit 3, and then performs fluorescence observation of the device during the main use of the analysis.
  • the analysis section 42 analyzes the physical properties of the particles specified by the particle identification section 41 from the image data obtained by the second imaging section 31.
  • the time required for the fluorescence observation mode can be shortened, and by placing the filter 5 in the first optical path La, there is a mechanism for removing the filter 5 from the front of the imaging section 3. In addition, it is possible to observe fluorescence and scattered light at the same time.
  • the analyzer 100 does not necessarily need to be equipped with a filter 5 that transmits fluorescence, and the imaging section 3 observes the fluorescence and the second imaging section 31 observes the scattered light. be able to.
  • the imaging unit 3 only needs to have the ability to discriminate colors, and for example, it may be configured to include a plurality of combinations of a filter 5 that transmits fluorescence of a certain color and a CCD camera. Further, as the imaging unit 3, for example, a monochrome CCD camera that does not have color discrimination ability may be used.
  • the excitation light from the three excitation light sources 21, 22, and 23 was sequentially irradiated, but if the imaging section 3 has a color discrimination function as described above, the excitation light from the three excitation light sources 21, 22, and For example, excitation light from an excitation light source may be irradiated simultaneously in the first frame.
  • the particle identification unit 41 can identify each of multiple types of particles using common image data such as the first frame, and the fluorescence observation mode can be used for a shorter time. can.
  • the particle analyzer 100 can automatically or manually stir the particles in the cell 1 after identifying the particles in the fluorescence observation mode and analyzing the physical properties in the scattered light observation mode.
  • analysis section 42 is not limited to measuring the particle size distribution or particle size, but also measures various characteristics of particles, such as particle number concentration and gel properties such as the average lattice spacing of the gel from the autocorrelation function. I don't mind it as something to analyze.
  • sufficient observation time in the PTA method can be ensured without being affected by fading of fluorescent markers or particles with autofluorescence properties.

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Abstract

蛍光マーカ又は自家蛍光の性質を持つ粒子の褪色に影響されることなく、ＰＴＡ法における十分な観察時間を確保できるようにするべく、粒子に励起光を照射することにより前記粒子に添加されている蛍光マーカ又は前記粒子自身が発する蛍光を撮像する蛍光観察モードと、粒子に光を照射することにより生じる散乱光を撮像する散乱光観察モードとを取り得る粒子分析装置１００であり、蛍光観察モードにおいて得られる蛍光の画像データから、蛍光マーカが添加されている粒子又は蛍光を発している粒子を特定する粒子特定部４１と、蛍光観察モードよりもフレーム数が多い散乱光観察モードにおいて得られる散乱光の画像データから、粒子特定部４１により特定された粒子のブラウン運動による拡散速度を求めて当該粒子の物性を分析する分析部４２とを備えるようにした。

Description

粒子分析装置、粒子分析装置用プログラム、及び粒子分析方法
　本発明は、粒子軌跡解析法（ＰＴＡ法）により粒子を分析する粒子分析装置等に関するものである。
　この種の粒子分析装置としては、特許文献１に示すように、測定対象たる粒子に蛍光マーカを添加して、その蛍光マーカに対応した励起波長のレーザ光を照射し、これにより生じる蛍光を観察することで、前記粒子の物性を分析するものがある。
　具体的にこの粒子分析装置は、粒子で散乱したレーザ光をカットしつつ、蛍光マーカが発する蛍光を透過させるフィルタを備えており、このフィルタを透過した蛍光を撮像部で観察することにより、蛍光マーカが添加された粒子をその他の粒子と切り分けて分析できるように構成されている。
　ところで、蛍光マーカにレーザ光などの強度の強い光を照射すると、蛍光色素が光化学的に破壊されて蛍光が発生しなくなる所謂褪色という現象が起こる。
　上述したＰＴＡ法は、ある時間内の粒子の平均移動距離からその粒子径を算出するので、粒子をある程度の時間観察する必要があるところ、上述した褪色が起こると十分な観察時間が確保できなくなる場合がある。
　褪色対策としては、蛍光マーカに照射する励起光の強度を落とす、露光時間を長くしてフレームレートを落とす、褪色に強い蛍光色素を使うなど、ある程度の改善が見込まれるものはあるものの、こうした改善代にも限界がある。
　なお、上述した問題は、粒子に蛍光マーカを添加して分析する場合に限らず、自家蛍光の性質を持つ粒子を分析する場合においても共通して生じ得るものである。
特開２０２０―２０４６０４号公報
　そこで、本発明は、上述した問題を解決するものであり、蛍光マーカ又は自家蛍光の性質を持つ粒子の褪色に影響されることなく、ＰＴＡ法における十分な観察時間を確保できるようにすることを課題するものである。
　すなわち本発明に係る粒子分析装置は、粒子に励起光を照射することにより前記粒子に添加されている蛍光マーカ又は前記粒子自身が発する蛍光を撮像する蛍光観察モードと、前記粒子に光を照射することにより生じる散乱光を撮像する散乱光観察モードとを取り得る粒子分析装置であり、前記蛍光観察モードにおいて得られる前記蛍光の画像データから、前記蛍光マーカが添加されている粒子又は蛍光を発している粒子を特定する粒子特定部と、前記蛍光観察モードよりもフレーム数が多い前記散乱光観察モードにおいて得られる前記散乱光の画像データから、前記粒子特定部により特定された前記粒子のブラウン運動による拡散速度を求めて当該粒子の物性を分析する分析部とを備えることを特徴とするものである。
　このように構成された粒子分析装置によれば、蛍光マーカが添加されている粒子又は蛍光を発している粒子を蛍光観察モードで特定し、その特定した粒子を散乱光観察モードで観察して分析するので、蛍光観察モードとして必要な時間を僅かで済ませることができ、その後の散乱光観察モードにおいては、蛍光マーカ又は粒子自身の褪色に影響されることなく、ＰＴＡ法における十分な観察時間を確保することが可能となる。
　前記蛍光マーカ又は前記粒子自身が発する蛍光を透過させつつ、前記励起光が前記粒子に照射されることにより生じる散乱光をカットするフィルタと、前記フィルタを透過した前記蛍光を撮像する撮像部とをさらに備えることが好ましい。
　これならば、励起光が粒子に照射されることにより生じる散乱光の影響を受けずに蛍光を撮像することができ、蛍光マーカが添加されている粒子又は蛍光を発している粒子をより確実に特定することができる。
　前記蛍光観察モードにおいて前記撮像部の手前に前記フィルタが配置され、前記散乱光撮像モードにおいて前記撮像部の手前から前記フィルタが取り除かれることが好ましい。
　このように、散乱光撮像モードにおいて撮像部の手前からフィルタを取り除くことで、蛍光観察モードと散乱光観察モードとにおいて共通の撮像部を用いることができ、部品点数及び製造コストを削減や装置のコンパクト化などを図れる。
　前記蛍光観察モードの開始時点に前記撮像部の手前に配置されている前記フィルタを、その開始時点から所定時間の経過後に前記撮像部の手前から取り除くモード切替機構をさらに備えることが好ましい。
　これならば、モード切替機構がフィルタを撮像部の手前から取り除くので、モード切替が可能となり、ひいては分析の自動化を図れる。
　蛍光観察モードと散乱光観察モードとを取り得るための別の実施態様としては、前記蛍光と前記散乱光とからなる光束を第１光路及び第２光路に分割するビームスプリッタをさらに備え、前記第１光路には、前記撮像部及び前記フィルタが配置されており、前記第２光路には、前記散乱光を観察する前記撮像部とは別の第２の撮像部が配置されている態様を挙げることができる。
　これならば、フィルタを第１光路に据え置くことができ、フィルタを撮像部の手前から取り除くための機構や操作を不要にすることができ、さらには蛍光と散乱光とを同時に観察することができる。
　前記粒子特定部が、前記蛍光観察モードにおいて得られる前記蛍光の画像データのうち少なくとも１フレーム目の画像データから、前記蛍光マーカが添加されている粒子又は蛍光を発している粒子を特定することが好ましい。
　これならば、蛍光観察モードとして必要な時間を可及的に短くすることができる。
　前記蛍光観察モードと前記散乱光観察モードとで、前記励起光の強度、前記撮像部のゲイン或いは露光時間、又は、前記フィルタの位置の少なくとも１つが異なることが好ましい。
　これならば、蛍光観察モードと散乱光観察モードとにおいて、それぞれ適切な撮像条件に設定することができる。
　本発明に係る粒子分析装置用プログラムは、粒子に励起光を照射することにより前記粒子に添加されている蛍光マーカ又は前記粒子自身が発する蛍光を撮像する蛍光観察モードと、前記粒子に光を照射することにより生じる散乱光を撮像する散乱光観察モードとを取り得る粒子分析装置に用いられるプログラムであり、前記蛍光観察モードにおいて得られる前記蛍光の画像データから、前記蛍光マーカが添加されている粒子又は蛍光を発している粒子を特定する粒子特定部と、前記蛍光観察モードよりもフレーム数が多い前記散乱光観察モードにおいて得られる前記散乱光の画像データから、前記粒子特定部により特定された前記粒子のブラウン運動による拡散速度を求めて当該粒子の物性を分析する分析部としての機能をコンピュータに発揮させることを特徴とするものである。
　本発明に係る粒子分析方法は、粒子に励起光を照射することにより前記粒子に添加されている蛍光マーカ又は前記粒子自身が発する蛍光を撮像する蛍光観察モードと、前記粒子に光を照射することにより生じる散乱光を撮像する散乱光観察モードとを取り得る粒子分析装置を用いる粒子分析方法であり、前記蛍光観察モードにおいて得られる前記蛍光の画像データから、前記蛍光マーカが添加されている粒子又は蛍光を発している粒子を特定する粒子特定ステップと、前記蛍光観察モードよりもフレーム数が多い前記散乱光観察モードにおいて得られる前記散乱光の画像データから、前記粒子特定部により特定された前記粒子のブラウン運動による拡散速度を求めて当該粒子の物性を分析する分析ステップとを備えることを特徴とする方法である。
　このような粒子分析装置用プログラム及び粒子分析方法によれば、上述した粒子分析装置と同様の作用効果を奏し得る。
　以上に述べた本発明によれば、蛍光マーカの褪色に影響されることなく、ＰＴＡ法における十分な観察時間を確保することができる。
本発明の一実施形態に係る粒子分析装置の蛍光観察モードを示す模式図。 同実施形態の粒子分析装置の散乱光観察モードを示す模式図。 同実施形態に用いられる蛍光マーカの一例を示す表。 同実施形態の情報処理装置の機能を示す機能ブロック図。 同実施形態の粒子分析装置の動作を示すフローチャート。 同実施形態の撮像部により得られる画像を示す模式図。 その他の実施形態における粒子分析装置の蛍光観察モードを示す模式図。 その他の実施形態における粒子分析装置の散乱光観察モードを示す模式図。 その他の実施形態における粒子分析装置を示す模式図。 その他の実施形態における粒子分析装置を示す模式図。
　以下、本発明に係る粒子分析装置の一実施形態について、図面を参照しながら説明する。
＜装置構成＞
　本実施形態の粒子分析装置１００は、図１及び図２に示すように、セル１内のサンプルに含まれる粒子の物性を分析するものであり、例えば血液や尿等の体液試料に含まれるエクソソーム、又は、ワクチンに関するウイルス様粒子、リポソーム、或いはタンパク質などを分析するものである。
　この粒子分析装置１００は、多重染色法とともに用いられるものであり、具体的には、粒子に複数種類の蛍光マーカを添加してなるサンプルに光を照射し、それらの蛍光マーカが発する蛍光を検出して、粒子の物性を分析するものである。
　ただし、本粒子分析装置１００を用いた分析において、例えばサンプルに含まれる粒子が自家蛍光を性質に持つものなど、粒子自身が蛍光発光する場合であれば、必ずしも蛍光マーカを用いる必要はなく、粒子自身が発する蛍光を検出しても良い。かかる粒子としては、例えば蛍光ビーズなどの無機材料を挙げることができる。
　本実施形態では、図３に示すように、３種類の蛍光マーカを用いており、これにより、測定対象たる粒子を８種類に種別し得る。なお、８種類の種別とは、３種類全ての蛍光マーカが添加されない１つの種別、１種類のみ添加される３つ種別、２種類のみ添加される３つの種別、及び、３種類全てが添加される１つの種別である。
　ただし、粒子分析装置１００としては、必ずしも多重染色法とともに用いられる必要はなく、単一種類の蛍光マーカとともに用いられるものであっても良い。
　本実施形態の粒子分析装置１００は、粒子に添加されている蛍光マーカに励起光を照射することにより生じる蛍光を撮像する図１記載の蛍光観察モードと、粒子に励起光とは別の光を照射することにより生じる散乱光を撮像する図２記載の散乱光観察モードとを取り得るものである。
　具体的にこの粒子分析装置１００は、図１及び図２に示すように、分析対象たる粒子を含むサンプルに光を照射する光照射部２と、その光の照射により生じる光を撮像する撮像部３と、撮像部３により得られた撮像データを用いて粒子の物性を分析する情報処理装置４とを備える。
　光照射部２は、蛍光マーカに励起光を照射して蛍光を励起させる励起用光源２１、２２、２３と、粒子に励起光とは別の光を照射してその別の光を散乱させる散乱用光源２０とを有している。
　励起用光源２１、２２、２３は、後述する散乱用光源２０よりも光強度の低い光を射出するものであり、例えばＬＥＤである。本実施形態は、３種類の蛍光マーカを用いていることから、３つの励起用光源２１、２２、２３を有している。なお、１つの励起用光源２１において、３つの励起波長を含む光を照射するものであっても良い。また、励起用光源２１、２２、２３の数は、使用している蛍光マーカの種類の数に応じて適宜変更して構わない。
　第１の励起用光源２１は、第１の蛍光マーカの励起波長λ１の励起光を照射するものであり、第２の励起用光源２２は、第２の蛍光マーカの励起波長λ２の励起光を照射するものであり、第３の励起用光源２３は、第３の蛍光マーカの励起波長λ３の励起光を照射するものである。ここで、励起波長λ１、λ２、λ３は、３種類の蛍光マーカがそれぞれ発する蛍光の蛍光波長λ１’、λ２’、λ３’とは異なる。また、これら各励起用光源２１、２２、２３から射出された光は、反射ミラ２４１、２４２、ハーフミラ２４３、２４４、集光レンズ２４５等の照射光学系２４を介して、セル１に導光される。
　散乱用光源２０は、上述した励起波長λ１、λ２、λ３とは異なる波長の光を粒子に照射するものであり、この実施形態ではレーザ光を射出するレーザ光源である。
　なお、ここでは単一の散乱用光源２０を設けてあるが、複数の散乱用光源２０を設けても構わない。
　本実施形態では、励起用光源２１、２２、２３から粒子に射出される励起光の光路Ｌ１（図１参照）と、散乱用光源２０から粒子に射出されるレーザ光の光路Ｌ２（図２参照）との一部が共通している。言い換えれば、蛍光観察モードと散乱光観察モードとのそれぞれにおいて、光路Ｌ１、Ｌ２を構成する光学系の一部が兼用されており、ここではハーフミラ２４４及び反射ミラ２４２が、励起光の光路Ｌ１及びレーザ光の光路Ｌ２に兼用されている。
　撮像部３は、蛍光観察モードにおいて蛍光マーカが発する蛍光を撮像することで、その蛍光マーカが添加されている粒子を撮像し、散乱光観察モードにおいて散乱光を撮像することで、蛍光マーカが添加されているか否かによらず、サンプルに含まれる種々の粒子を撮像するものであり、撮像データとして例えば画像データを出力する。
　この撮像部３は、色の識別能力を有するものであり、この実施形態ではカラーＣＣＤを有する撮像カメラである。なお、図１では、光照射部２の光照射方向と撮像部３の撮像方向とが互いに直交して設けられているが、これに限られない。
　ここで、蛍光観察モードにおいて、セル１内の粒子に励起光を照射すると、その励起光が粒子により散乱して、その散乱光が撮像部３により検出されてしまい、蛍光観察を阻害する恐れがある。
　そこで、蛍光観察モードにおいて上述した散乱光が撮像部３で検出されないようにするべく、本実施形態の粒子分析装置１００は、図１に示すように、励起光が粒子に照射されることにより生じる散乱光をカットしつつ、上述した複数種類の蛍光マーカが発する複数の色の蛍光を透過させる１又は複数枚のフィルタ５を備えている。なお、粒子自身が蛍光を発する場合、フィルタ５は、散乱光をカットしつつ、粒子が発する蛍光を透過させるものとなる。
　本実施形態では、複数枚のフィルタが重ねられてなるフィルタ群５（以下、単にフィルタ５という）が、セル１と撮像部３との間に設けられている。ただし、必ずしも複数枚のフィルタを用いる必要はなく、例えば使用する蛍光マーカが一種類であれば、フィルタも１枚で使用すれば良い。
　ここでのフィルタ５は、少なくとも複数枚のノッチフィルタを重ね合わせたものであり、最も短い励起波長λ１よりも長波長領域を透過させる第１フィルタと、次に短い励起波長λ２をカットする第２フィルタと、最も長い励起波長λ３をカットする第３フィルタとを重ねてなるものである。
　これにより、蛍光観察モードにおいて、フィルタ５は、少なくとも励起波長λ１、λ２、λ３をカットしつつ、種々の波長（種々の色）の蛍光を透過させるものとなる。
　一方、散乱光観察モードにおいては、粒子で散乱した散乱光を撮像部３に導く必要があることから、本実施形態の粒子分析装置１００は、図１及び図２に示すように、蛍光観察モードにおいて撮像部３の手前にフィルタ５が配置され、散乱光観察モードにおいて撮像部３の手前からフィルタ５が取り除かれるように構成されている。
　本実施形態の粒子分析装置１００は、モードの切り替えを自動化するべく、蛍光観察モードの開始時点に撮像部３の手前に配置されているフィルタ５を、その開始時点から所定時間の経過後に撮像部３の手前から取り除くモード切替機構６を備えている。
　モード切替機構６の一例としては、例えばモータなどを利用して構成されたものであり、撮像部３とセル１との間に対してフィルタ５を進退移動させる態様を挙げることができる。
　なお、例えば所望のタイミングでモードを切り替えられるようにするべく、ユーザが手作業でフィルタ５をセル１と撮像部３の間に配置することができ、そのフィルタ５をユーザがセル１と撮像部３と間から手作業で取り除けるようにしても良い。
　上述した構成により、蛍光観察モードにおいて、励起用光源２１、２２、２３を用いて生じさせた蛍光を観察することができ、散乱光観察モードにおいて、散乱用光源２０を用いて生じさせた散乱光を観察することができる。
　情報処理装置４は、ＣＰＵ、メモリ、ディスプレイ、各種入出力機器等を備えたコンピュータであり、撮像部３と有線又は無線でつながれている。
　この情報処理装置４は、前記メモリに格納されている粒子分析用プログラムが実行されることにより、図４に示すように、粒子特定部４１、分析部４２、及び表示部４３としての機能を備えている。
　以下、本実施形態の粒子分析装置１００の動作の説明を兼ねて、図５のフローチャートを参照しながら、情報処理装置４の各部の機能を説明する。
　まず、セル１内のサンプルに複数種類の蛍光マーカを添加することにより、サンプルに含まれる測定対象たる粒子を多重染色する（Ｓ１）。なお、上述した通り、必ずしも多重染色する必要はなく、サンプルに単一種類の蛍光マーカを添加しても良い。また、蛍光マーカを添加する前にサンプルを撹拌する工程を設けても良い。
　次に、モード切替機構６を例えば制御又は操作して、フィルタ５を撮像部３の手前に配置することにより、粒子分析装置１００を図１に示す蛍光観察モードにする（Ｓ２）。
　続いて、励起用光源２１、２２、２３からセル１内のサンプルに、複数種類の蛍光マーカそれぞれに対応する励起波長λ１、λ２、λ３の励起光を照射するとともに、これにより生じる蛍光を撮像部３により撮像する（Ｓ３）。
　本実施形態では、上述したように、励起波長λ１、λ２、λ３の励起光を順番に照射する。そして、この励起光の切替タイミングと撮像部３のフレーム長さとを適宜設定することにより、蛍光観察モードにおける撮像部３により得られた画像データのうち、１フレーム目を第１の励起波長λ１の励起光を照射して得られるもの、２フレーム目を第２の励起波長λ２の励起光を照射して得られるもの、３フレーム目を第３の励起波長λ３の励起光を照射して得られるものとなるようにしてある。
　ただし、励起光の切替タイミングや撮像部３のフレームの長さは上述した態様に限定されるものではなく、例えば複数フレームからなる第１群の画像データが、第１の励起波長λ１の励起光を照射して得られるもの、それに続く複数フレームからなる第２群の画像データが、第２の励起波長λ２の励起光を照射して得られるもの、それにさらに続く複数フレームからなる第３群の画像データが、第３の励起波長λ３の励起光を照射して得られるものとなるようにしても良い。
　サンプルに励起波長λ１、λ２、λ３の励起光が順番に照射されると、粒子特定部４１が、撮像部３により得られる蛍光の画像データから、蛍光マーカが添加されている粒子を特定する（Ｓ４）。なお、粒子自身が蛍光を発する場合、粒子特定部４１は、蛍光を発している粒子を特定する。
　ここで、図６（ａ）において斜線で示されているものは、第１の励起波長λ１の励起光を照射して得られる画像（すなわち、１フレーム目の画像）に写されている粒子である。すなわち、この画像には、第１の励起波長λ１の励起光により発光する発光マーカが添加されている粒子が４つ写されており、それ以外の粒子は写されていない。
　本実施形態の粒子特定部４１は、この蛍光の画像データに写されている粒子の位置、大きさ、又は範囲を特定するものである。
　この粒子特定部４１は、蛍光観察モードにおいて得られる蛍光の画像データのうち、例えば１フレーム目から１０フレーム目までの画像データの少なくとも１つから、蛍光マーカが添加されている粒子を特定することが好ましく、より好ましい態様として、少なくとも１フレーム目の画像データから、蛍光マーカが添加されている粒子を特定する態様を挙げることができる。
　具体的に粒子特定部４１は、画像データを画像処理することにより、蛍光を発している蛍光マーカが添加されている粒子と、それ以外の領域とを区別して、粒子の位置等を特定するものであり、ここでは蛍光マーカが添加されている粒子それぞれの重心位置を算出する。
　そして、粒子特定部４１は、１フレーム目の画像データから粒子を特定したのと同様に、２フレーム目及び３フレーム目の画像データから、それぞれの画像データに写されている粒子の位置等（ここでは、重心位置）を算出する。
　本実施形態の粒子特定部４１は、それぞれの画像データに基づいて、粒子の位置等のみならず、粒子の種類をも特定するように構成されている。
　以下では、理解の容易のため、１フレーム目に写されている粒子を第１種の粒子、２フレーム目に写されている粒子を第２種の粒子、３フレーム目に写されている粒子を第３種の粒子と呼ぶ。
　続いて、モード切替機構６を例えば制御又は操作して、フィルタ５を撮像部３の手前から取り除くことにより、粒子分析装置１００を図１に示す蛍光観察モードから図２に示す散乱光観察モードに切り替える（Ｓ５）。
　次いで、散乱用光源２０からレーザ光をセル１内の粒子に照射するとともに、これにより粒子で散乱する散乱光を撮像部３により撮像する（Ｓ６）。
　この散乱光観察モードは、蛍光観察モードよりもフレーム数が多いモードであり、言い換えれば、この散乱光観察モードにおいて撮像部３により得られるフレーム数（すなわち、画像データのデータ数）は、蛍光観察モードにおいて撮像部３により得られるフレーム数（すなわち、画像データのデータ数）よりも多い。また、この実施形態において、散乱光観察モードにおける散乱光の観察時間は、蛍光観察モードにおける蛍光の観察時間よりも長い。
　そして、分析部４２が、散乱光観察モードにおいて撮像部３により撮像された散乱光の画像データを取得するとともに、この画像データに基づいて粒子の物性を分析する。なお、分析部４２としては、散乱光観察モードにおいて得られた画像データに加えて、蛍光観察モードにおいて得られた画像データをも用いて粒子の物性を分析するものであっても良い。
　具体的にこの分析部４２は、ＰＴＡ法により粒子径分布を算出するものであり、粒子特定部４１により特定された粒子のブラウン運動による拡散速度を求めて当該粒子の粒子径分布を算出する。なお、分析部４２としては、必ずしも粒子径分布を算出する必要はなく、例えば粒子の粒子径を物性として算出するものであっても良い。
　ところで、上述した蛍光観察モードが開始されてから散乱光観察モードに切り替わるまでの時間は、例えば３フレームの画像データを取得する程度であり、ごく僅かな時間であることから、蛍光観察モード中における粒子の動きは殆どないはずである。
　このことから、蛍光観察モードから散乱光観察モードに切り替わった時点では、図６（ｂ）に示すように、観察される粒子数は増えるものの、蛍光観察モードにおいて粒子特定部４１により特定された粒子の位置と、その粒子が散乱光観察モードにおいて観察される位置とは殆ど変わらないはずである。
　そこで、本実施形態の分析部４２は、散乱光の画像データに写されている粒子のうち、上述した粒子特定部４１により特定された粒子を推定して（Ｓ７）、その推定した粒子を、粒子特定部４１により特定された粒子とみなして分析する（Ｓ８）。
　具体的に分析部４２は、上述した粒子特定部４１が蛍光の画像データに基づき算出した粒子それぞれの重心位置を取得するとともに、散乱光の画像データに写されている粒子のうち、取得した重心位置から最も近い位置に写されている粒子を、粒子特定部４１により特定された粒子として推定する。
　本実施形態の分析部４２は、粒子特定部４１により特定された第１種の粒子、第２種の粒子、及び第３種の粒子それぞれを、散乱光の画像データに写されている粒子の中から推定するように構成されている。
　かかる構成において、本実施形態の分析部４２は、サンプルに含まれる粒子の物性を、粒子の種類ごとに切り分けて物性を分析するように構成されており、具体的には、第１種の粒子、第２種の粒子、及び、第３種の粒子それぞれの粒子径分布を算出する。
　その後、表示部４３は、分析部４２の分析結果をディスプレイＤ等に表示するものであり、具体的には粒子の粒子径分布又は粒子径などを、例えば粒子の種類ごとに識別可能に表示する。
＜本実施形態の効果＞
　このように構成された本実施形態の粒子分析装置１００によれば、蛍光マーカが添加されている粒子を蛍光観察モードで特定し、その特定した粒子を散乱光観察モードで観察して分析するので、蛍光観察モードとして必要な時間を僅かで済ませることができ、その後の散乱光観察モードにおいては、蛍光マーカの褪色に影響されることなく、ＰＴＡ法による十分な観察時間を確保することが可能となる。
　また、蛍光観察モードにおいて撮像部３の手前にフィルタ５が配置され、散乱光撮像モードにおいて撮像部３の手前からフィルタ５が取り除かれるので、蛍光観察モードと散乱光観察モードとにおいて共通の撮像部３を用いることができ、部品点数及び製造コストの削減や装置のコンパクト化などを図れる。
　さらに、モード切替部によりフィルタ５を移動させることにより、装置が蛍光観察モード又は散乱光観察モードに切り替わるので、モード切替が可能となり、ひいては分析の自動化を図れる。
　そのうえ、粒子特定部４１が、蛍光観察モードにおいて得られる蛍光の少なくとも１フレーム目の画像データから、蛍光マーカが添加されている粒子を特定するので、蛍光観察モードとして必要な時間を可及的に短くすることができる。
　加えて、励起用光源２１、２２、２３と散乱用光源２０とを別タイプのものとしおり、散乱光観察モードで用いられる散乱用光源としてレーザ光源を用いることでＰＴＡ法による分析を担保しつつ、蛍光観察モードで用いられる励起用光源として比較的安価なＬＥＤを用いることで、安価な装置構成で種々の蛍光マーカそれぞれに適した励起波長の励起光を照射することが可能となる。
　さらに加えて、互いに異なる励起波長の励起光を射出する複数の励起用光源２１、２２、２３を有するので、種々の蛍光マーカそれぞれに適した励起波長の励起光を照射できる。これにより、粒子分析装置１００を、安価な構成で多重染色法に資するものとすることができる。
＜その他の実施形態＞
　なお、本発明は前記実施形態に限られるものではない。
　例えば、蛍光観察モードにおいて用いられる励起用光源２１、２２、２３として、前記実施形態ではＬＥＤを用いていたが、例えば白色光等を照射するランプなどＬＥＤよりもブロードな波長の光を射出するものであっても良い。
　かかる構成において複数種類の蛍光マーカを用いる場合、光源から射出されるブロードな光のうち、蛍光マーカそれぞれの励起波長を取り出すべく、この光源からセル１までの光路上に蛍光マーカの励起波長を透過させるフィルタを設けておくことが好ましい。
　また、図７及び図８に示すように、同じ光源を励起用光源２１及び散乱用光源２０として兼用しても良い。より具体的に説明すると、励起用光源２１及び散乱用光源２０として兼用される光源は、蛍光マーカに対する励起波長の光を射出するものであり、例えばレーザ光源である。
　ここでの粒子分析装置１００は、前記実施形態と同様に、レーザ光源２０、２１から射出される励起光それぞれをカットしつつ、蛍光マーカが発する蛍光を透過させるフィルタ５を備えている。
　かかる構成において、蛍光観察モードの開始時には、図７に示すように、フィルタ５をセル１と撮像部３との間に配置しており、粒子特定部４１が、撮像部３により得られた画像データから、蛍光マーカが添加されている粒子を特定する。
　そして、例えば蛍光観察モードの開始時から所定時間の経過後には、図８に示すように、フィルタ５をセル１と撮像部３との間から取り除いて散乱光観察モードとし、分析部４２が、粒子特定部４１により特定された粒子の物性を分析する。
　このような構成であっても、蛍光マーカが添加されている粒子を蛍光観察モードで特定し、その特定した粒子を散乱光観察モードで観察して分析するので、蛍光観察モードとして必要な時間を僅かで済ませることができる。これにより、蛍光マーカの褪色に影響されることなく、ＰＴＡ法による十分な観察時間を確保することが可能となる。
　また、上述した種々の実施形態において、褪色が起こるまでの時間を少しでも長くするべく、蛍光観察モードと散乱光観察モードとで分析条件を互いに異ならせることが好ましく、例えば励起光の強度、撮像部３のゲイン或いは露光時間、又は、フィルタの位置の少なくとも１つが異なることが好ましい。
　より具体的な実施態様としては、蛍光観察モードの方が散乱光観察モードに比べて、例えば励起光の強度（レーザ光源の出力）を低くする、撮像部３のゲインを大きくする、撮像部３の露光時間を長くする、或いは、蛍光観察モードにおいてセル１と励起用光源２１、２２、２３の間に減光フィルタを配置するなどの態様を挙げることができ、これらの複数の態様を組み合わせることがより望ましい。なお、減光フィルタは、散乱光観察モードにおいては、セル１と励起用光源２１、２２、２３の間から取り除かれることが望ましい。
　さらに、蛍光観察モードから散乱光観察モードに切り替える場合、撮像部３の手前からフィルタ５が取り除かれることで、散乱光観察モードにおいて観察される光量が増大して、白飛びなどが生じる恐れがあるところ、散乱光観察モードにおいては、セル１と撮像部３との間に減光フィルタを配置しても良い。
　ところで、これまではフィルタ５を移動させることにより蛍光観察モードと散乱光観察モードとを切り替える態様を説明したが、図９及び図１０に示すように、フィルタ５を据え置きながら、粒子分析装置１００が蛍光観察モードと散乱光観察モードとを取り得るように構成されていても良い。
　かかる粒子分析装置１００としては、図９に示すように、セル１を通過した蛍光と散乱光とからなる光束を第１光路Ｌａ及び第２光路Ｌｂに分割するビームスプリッタをさらに備え、第１光路Ｌａには、前記実施形態と同様に蛍光を観察する撮像部３及びフィルタ５が配置されており、第２光路Ｌｂには、撮像部３とは別に散乱光を観察する第２の撮像部３１が配置されている構成を挙げることができる。
　すなわち、第１光路Ｌａは、蛍光を観察する蛍光観察用光路であり、第２光路Ｌｂは、散乱光を観察する散乱光観察用光路であり、これらの光路を互いに独立して形成することにより、蛍光と散乱光とを同時に観察することができるようにしてある。
　そして、分析初期時の蛍光観察モードにおいて、粒子特定部４１が、撮像部３により得られた画像データから、蛍光マーカが添加されている粒子を特定し、その後の分析主用時に装置を蛍光観察モードから散乱光観察モードに切り替えることで、分析部４２が、第２の撮像部３１により得られた画像データから、粒子特定部４１により特定された粒子の物性を分析する。
　このような構成であっても、蛍光観察モードとして必要な時間を僅かで済ませることができるうえ、フィルタ５を第１光路Ｌａに据え置くことで、フィルタ５を撮像部３の手前から取り除くための機構や操作を不要にすることができ、さらには蛍光と散乱光とを同時に観察することが可能となる。
　さらに、例えば蛍光マーカの励起光の励起波長と、蛍光の波長とが離れており、撮像部３及び第２の撮像部３１が色の識別機能を有する例えばカラーＣＣＤを有するものであれば、粒子分析装置１００としては、図１０に示すように、必ずしも蛍光を透過させるフィルタ５を備えている必要はなく、撮像部３により蛍光を観察するとともに、第２の撮像部３１により散乱光を観察することができる。
　撮像部３としては、色の識別能力を有していれば良く、例えば、ある色の蛍光を透過させるフィルタ５とＣＣＤカメラとの組み合わせを複数組備える構成であっても良い。
　また、撮像部３としては、色の識別能力を有していない例えばモノクロのＣＣＤカメラを利用したものであっても構わない。
　さらに、前記実施形態では３つの励起用光源２１、２２、２３からの励起光を順番に照射していたが、上述したように撮像部３が色の識別機能を有している場合、複数の励起用光源からの励起光を例えば１フレーム目に同時に照射しても良い。
　このような構成であれば、粒子特定部４１は、例えば１フレーム目など共通の画像データを用いて、複数種類の粒子それぞれを特定することができ、蛍光観察モードをより短時間にすることができる。
　そのうえ、本発明に係る粒子分析装置１００としては、蛍光観察モードにおける粒子の特定、及び、散乱光観察モードにおける物性の分析をした後、セル１内の粒子を自動又は手動で撹拌して、再び、蛍光観察モードにおける粒子の特定、及び、散乱光観察モードにおける物性の分析を行うように構成されていても良い。
　また、分析部４２としては、粒子径分布又は粒子径を測定するものに限らず、例えば粒子の個数濃度や、自己相関関数からゲルの平均格子間隔などのゲル特性など、粒子の種々の特性を分析するものとして構わない。
　その他、本発明は前記実施形態に限られず、その趣旨を逸脱しない範囲で種々の変形が可能であるのは言うまでもない。
　本発明によれば、蛍光マーカ又は自家蛍光の性質を持つ粒子の褪色に影響されることなく、ＰＴＡ法における十分な観察時間を確保することができる。
１００・・・粒子分析装置
１　　・・・セル
２　　・・・光照射部
３　　・・・撮像部
４　　・・・情報処理装置
４１　・・・粒子特定部
４２　・・・分析部
４３　・・・表示部
５　　・・・フィルタ
６　　・・・モード切替機構

 

Claims (9)

  1. 　粒子に励起光を照射することにより前記粒子に添加されている蛍光マーカ又は前記粒子自身が発する蛍光を撮像する蛍光観察モードと、前記粒子に光を照射することにより生じる散乱光を撮像する散乱光観察モードとを取り得る粒子分析装置であり、
    　前記蛍光観察モードにおいて得られる前記蛍光の画像データから、前記蛍光マーカが添加されている粒子又は蛍光を発している粒子を特定する粒子特定部と、
    　前記蛍光観察モードよりもフレーム数が多い前記散乱光観察モードにおいて得られる前記散乱光の画像データから、前記粒子特定部により特定された前記粒子のブラウン運動による拡散速度を求めて当該粒子の物性を分析する分析部とを備える、粒子分析装置。
  2. 　前記蛍光マーカ又は前記粒子自身が発する蛍光を透過させつつ、前記励起光が前記粒子に照射されることにより生じる散乱光をカットするフィルタと、
    　前記フィルタを透過した前記蛍光を撮像する撮像部とを備える、請求項１記載の粒子分析装置。
  3. 　前記蛍光観察モードにおいて前記撮像部の手前に前記フィルタが配置され、前記散乱光撮像モードにおいて前記撮像部の手前から前記フィルタが取り除かれる、請求項２記載の粒子分析装置。
  4. 　前記蛍光観察モードの開始時点に前記撮像部の手前に配置されている前記フィルタを、その開始時点から所定時間の経過後に前記撮像部の手前から取り除くモード切替機構をさらに備える、請求項３記載の粒子分析装置。
  5. 　前記蛍光と前記散乱光とからなる光束を第１光路及び第２光路に分割するビームスプリッタをさらに備え、
    　前記第１光路には、前記撮像部及び前記フィルタが配置されており、
    　前記第２光路には、前記散乱光を観察する前記撮像部とは別の第２の撮像部が配置されている、請求項２記載の粒子分析装置。
  6. 　前記粒子特定部が、前記蛍光観察モードにおいて得られる前記蛍光の画像データのうち少なくとも１フレーム目の画像データから、前記蛍光マーカが添加されている粒子又は蛍光を発している粒子を特定する、請求項１乃至５のうち何れか一項に記載の粒子分析装置。
  7. 　前記蛍光観察モードと前記散乱光観察モードとで、前記励起光の強度、前記撮像部のゲイン或いは露光時間、又は、前記フィルタの位置の少なくとも１つが異なる、請求項１乃至６のうち何れか一項に記載の粒子分析装置。
  8. 　粒子に励起光を照射することにより前記粒子に添加されている蛍光マーカ又は前記粒子自身が発する蛍光を撮像する蛍光観察モードと、前記粒子に光を照射することにより生じる散乱光を撮像する散乱光観察モードとを取り得る粒子分析装置に用いられるプログラムであり、
    　前記蛍光観察モードにおいて得られる前記蛍光の画像データから、前記蛍光マーカが添加されている粒子又は蛍光を発している粒子を特定する粒子特定部と、
    　前記蛍光観察モードよりもフレーム数が多い前記散乱光観察モードにおいて得られる前記散乱光の画像データから、前記粒子特定部により特定された前記粒子のブラウン運動による拡散速度を求めて当該粒子の物性を分析する分析部としての機能をコンピュータに発揮させる、粒子分析装置用プログラム。
  9. 　粒子に励起光を照射することにより前記粒子に添加されている蛍光マーカ又は前記粒子自身が発する蛍光を撮像する蛍光観察モードと、前記粒子に光を照射することにより生じる散乱光を撮像する散乱光観察モードとを取り得る粒子分析装置を用いる粒子分析方法であり、
    　前記蛍光観察モードにおいて得られる前記蛍光の画像データから、前記蛍光マーカが添加されている粒子又は蛍光を発している粒子を特定する粒子特定ステップと、
    　前記蛍光観察モードよりもフレーム数が多い前記散乱光観察モードにおいて得られる前記散乱光の画像データから、前記粒子特定部により特定された前記粒子のブラウン運動による拡散速度を求めて当該粒子の物性を分析する分析ステップとを備える、粒子分析装方法。

     
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