WO2023163301A1 - Kitenin의 이량체 형성을 저해하는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Kitenin의 이량체 형성을 저해하는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 KITENIN 이량체의 형성을 억제하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, KITENIN 이량체의 형성을 억제하여 암의 종양원성, 침윤성, 및 전이성을 억제하는 효과를 나타낸다.

Description

KITENIN의 이량체 형성을 저해하는 펩타이드 및 이의 용도
본 발명은 KITENIN의 이량체 형성을 저해하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며 KITENIN의 이량체 형성을 저해하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
단백질 올리고머화는 단백질의 단량체 단위를 동종-올리고머 또는 이종-올리고머로 배열하는 것으로 정의할 수 있다. 올리고머화는 유전자 발현 매개 및 효소, 이온 채널 및 수용체의 활성 조절과 같은 세포 기능의 특이성과 다양성을 허용하는 단백질 구성을 생성한다(1). 동종-올리고머 및 이종-올리고머의 모두에서 올리고머화는 리간드, 온도 및 기타 단백질에 의해 조절되며, 알로스테릭 조절을 위한 부위를 제공한다(2). 단백질은 게놈 크기의 증가 없이 올리고머화를 통해 큰 어셈블리(assembly)를 형성하여 단백질 안정성을 향상시킬 수 있다(3-5). 따라서 많은 막연관 단백질(MAP) 및 가용성 단백질은 세포에서 동종 올리고머 복합체를 형성한다(5, 6). 동종 올리고머는 이량체 및 사량체로 가장 흔하게 존재하며, 이는 이종 올리고머보다 약 4배 더 일반적이다(7). 이량체 단백질의 소수성 계면의 노출은 프로테아좀(proteasome) 또는 자가포식(autophagy) 경로를 통해 단백질의 불안정화 및 분해로 이어질 수 있는 구조적 변화를 일으키는 것으로 알려져 있다(8-10). 따라서 올리고머화(oligomerization) 올리고머성 단백질을 포함하는 질병의 치료를 위한 매우 유망한 치료 전략이며(11), 단백질 올리고머화의 분자적 측면에 대한 더 나은 이해가 필요하다(12).
Vangl 단백질은 배아 발달 동안 신경관 형성에 중요한 기능을 가지고 있으며, Vangl1 및 Vangl2 유전자의 돌연변이는 신경관 결손 두개골 분열을 유발한다(13). 종래 연구에서 세포내 긴 C-말단 도메인을 가진 막 관련 비정형 테트라스파닌(본 발명자들은 KITENIN[KAI1 C-terminal interaction tetraspanin]으로 재명명하였음)인 Vangl1이 KAI1의 C-말단에 결합하여 대장암(CRC)에서 전이를 강화하는 단백질로 작용하는 것으로 보고하였다(14). KITENIN을 과발현하는 CT-26 마우스 결장암 세포는 KITENIN 기능 획득(KITENIN gain-of-function; KITENIN-GOF)으로 인한 침윤성 및 종양원성 증가 및 조기 간 전이를 나타내었다. 기능적 KITENIN 복합체는 세포 운동성과 관련하여 실행자(executor) 역할을 하여 CRC 세포 침윤을 제어하고 전이 촉진에 기여한다(15). 또한 KITENIN 수준은 CRC의 진행 단계(15) 및 림프절 전이(16)와 양의 상관관계가 있다. EGF의 독특한 EGFR 독립 신호(unconventional EGFR-independent signal)인 KITENIN/ErbB4-Dvl2-c-Jun 축(axis)의 존재도 CRC 세포 침윤 증가를 매개하고 세투시맙(cetuximab)에 대한 낮은 반응을 나타낸다(17, 18). KITENIN 축은 또한 선종성 결장 폴립증 손실 관련 환경(adenomatous polyposis coli-loss-associated environment) 내에서 결장직장 발암에 중요한 역할을 한다(19). 따라서 이러한 보고는 KITENIN 축이 CRC의 악성 진행을 차단하는 치료제 개발을 위한 분자 표적임을 시사한다. 그러나 KITENIN의 생화학적 특성에 대한 발현 및 번역 후 변형 분석을 제외하고 KITENIN 안정성이 어떻게 조절되고 어떤 분자가 이 조절에 밀접하게 관여하는지에 대한 연구는 수행되지 않았다.
이에 본 발명자들은 KITENIN의 안정성을 조절하는 생화학적 특성을 조사하였다. 그 결과 KITENIN의 구조적 무결성(structural integrity)을 유지하는 생화학적 특징을 식별함으로써 KITENIN을 표적으로 하여 더 높은 KITENIN 수치를 발현하는 암 환자를 위한 새로운 치료제를 개발할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
한편, 본 명세서에서 참조번호로 기재된 문헌은 다음과 같다.
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본 발명의 하나의 목적은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며 KITENIN의 이량체 형성을 저해하는 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 펩타이드를 코팅하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 암의 치료 또는 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 암의 침윤 및 전이를 억제하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 개체에 투여하여 개체의 암을 치료하거나 개체의 암 침윤 및 전이를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며 KITENIN의 이량체 형성을 저해하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명에 있어서, KITENIN(KAI1- C-terminal interaction tetraspin)은 KAI1의 C-말단에 결합하여 암의 침윤성 및 종양원성을 증가시키고, 조기 암 전이를 활성화시키는 단백질이다.
본 발명자들은 상기 KITENIN은 동종이량체(homodimerization)를 형성함으로써 암의 침윤성 및 종양원성이 증가하고 조기 암 전이를 활성화시킴을 발견하였다. 또한, KITENIN은 Myo10에 의하여 안정화되면서 상기한 활성이 증가됨을 발견하였다. 따라서, KITENIN의 상기한 활성을 억제하는 방안이 본 발명에서 제안된다.
본 발명의 펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는데, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열은 KITENIN의 전장을 구성하는 아미노산 서열((서열번호 1)의 466번째 내지 470번째 아미노산 서열로부터 유래한 서열이거나 KITENIN의 C-말단 도메인(C-terminal domain)을 구성하는 아미노산 서열(서열번호 2)의 223번째 내지 227번째 아미노산 서열로부터 유래한 서열이다.
하나의 구체적 예로서, KITENIN 전장을 구성하는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 KITENIN의 C-말단 도메인, N-말단 도메인, 및 C-말단과 N-말단 도메인을 각각 결실시킨 후 형질도입하여 발현하였을 때 KITENIN의 C-말단 도메인이 결실된 경우는 KITENIN의 이량체가 검출되지 않았다. 이에 KITENIN의 이량체화 부위는 KITENIN의 C-말단 도메인으로 확인하였으며, 상기 KITENIN의 C-말단 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되어 있다.
또 하나의 구체적 예로서, KITENIN의 C-말단 도메인을 10-mer 이하로 분할한 여러 펩타이드를 대상으로 실험한 결과 서열번호 1의 아미노산 서열 중 462번째 내지 469번째 아미노산 서열로 구성된 펩타이드, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 463번째 내지 471번째 아미노산 서열로 구성된 펩타이드, 및 서열번호 1의 467번째 내지 474번째 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 KITENIN의 이량체 형성을 억제하고 세포 침윤을 효과적으로 억제함을 확인하였다. 특히, 상기 아미노산 서열 중 서열번호 1의 아미노산 서열 중 463번째 내지 471번째 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 KITENIN의 이량체 형성을 억제하고 세포 침윤을 가장 효과적으로 억제함을 확인하였다.
상기 서열번호 1의 462번째 내지 469번째 아미노산 서열은 서열번호 2의 219번째 내지 226번째 아미노산 서열과 동일하며, 본 명세서에서 서열번호 6으로 표시하였다.
상기 서열번호 1의 463번째 내지 471번째 아미노산 서열은 서열번호 2의 220번째 내지 228번째 아미노산 서열과 동일하며, 본 명세서에서 서열번호 7로 표시하였다.
상기 서열번호 1의 467번째 내지 474번째 아미노산 서열은 서열번호 2의 224번째 내지 231번째 아미노산 서열과 동일하며, 본 명세서에서 서열번호 8로 표시하였다.
또 다른 하나의 구체적 예로서, 서열번호 6 내지 8로 표시되는 아미노산 서열에서 공통되는 아미노산 서열이고, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 실험한 결과 서열번호 1의 아미노산 서열 중 465번째 내지 470번째 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 동등 수준 이상으로 KITENIN의 이량체 형성을 억제하고 세포 침윤을 효과적으로 억제함을 확인하였다. 이러한 결과로부터 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 KITENIN의 이량체 형성을 억제하고 세포 침윤을 효과적임을 알 수 있다. 또한, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로서, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 466번째 내지 471번째 아미노산 서열로 구성된 펩타이드, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 465번째 내지 471번째 아미노산 서열열로 구성된 펩타이드, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 464번째 내지 470번째 아미노산 서열로 구성된 펩타이드, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 464번째 내지 471번째 아미노산 서열로 구성된 펩타이드, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 463번째 내지 470번째 아미노산 서열로 구성된 펩타이드도 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드와 동등한 수준의 KITENIN의 이량체 형성을 억제하고 세포 침윤을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 465번째 내지 470번째 아미노산 서열은 서열번호 2의 222번째 내지 227번째 아미노산 서열과 동일하며, 본 명세서에서 서열번호 16으로 표시하였다.
상기 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 466번째 내지 471번째 아미노산 서열은 서열번호 2의 223번째 내지 228번째 아미노산 서열과 동일하며, 본 명세서에서 서열번호 17로 표시하였다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 465번째 내지 471번째 아미노산 서열은 서열번호 2의 222번째 내지 228번째 아미노산 서열과 동일하며, 본 명세서에서 서열번호 18로 표시하였다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 464번째 내지 470번째 아미노산 서열은 서열번호 2의 221번째 내지 227번째 아미노산 서열과 동일하며, 본 명세서에서 서열번호 19로 표시하였다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 464번째 내지 471번째 아미노산 서열은 서열번호 2의 221번째 내지 228번째 아미노산 서열과 동일하며, 본 명세서에서 서열번호 20으로 표시하였다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 463번째 내지 470번째 아미노산 서열은 서열번호 2의 220번째 내지 227번째 아미노산 서열과 동일하며, 본 명세서에서 서열번호 21로 표시하였다.
따라서, 본 발명의 상기 펩타이드는 KITENIN의 이량체 형성을 저해하여 KITENIN의 안정성을 감소시키고 KITENIN의 활성을 저해하는 효과가 있다.
하나의 구체적 양태로서, 본 발명의 상기 펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
하나의 구체적 예에서, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 KITENIN의 이량체 형성을 억제하고 세포 침윤을 효과적으로 억제하였다.
다른 하나의 구체적 양태로서, 본 발명의 상기 펩타이드는 서열번호 6 내지 8 중의 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
하나의 구체적 예에서, 서열번호 6 내지 8 중의 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 KITENIN의 이량체 형성을 억제하고 세포 침윤을 효과적으로 억제하였으며, 특히 상기 아미노산 서열 중 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 KITENIN의 이량체 형성을 억제하고 세포 침윤을 가장 효과적으로 억제하였다.
또 다른 하나의 구체적 양태로서, 본 발명의 상기 펩타이드는 서열번호 16 내지 21 중의 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
하나의 구체적 예에서, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 KITENIN의 이량체 형성을 억제하고 세포 침윤을 효과적으로 억제하였다.
또 다른 하나의 구체적 예로서, 서열번호 17 내지 21로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드도 서열번호 7 및 16으로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드와 동일하게 KITENIN의 이량체 형성을 억제하고 세포 침윤을 효과적으로 억제한다.
이들 효과가 우수한 아미노산 서열에서 공통되는 아미노산 서열은 SDE이며, 서열번호 7의 아미노산 서열에서 SDE를 포함하는 전방 및 후방 서열의 일부가 포함될 경우 상술한 효과를 가질 것으로 예상할 수 있다. 더욱이 서열번호 16의 아미노산 서열도 SDE를 포함하고 있으며, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 동등 수준 이상의 효과를 나타내었다. 따라서, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열이 KITENIN의 이량체 형성을 억제하고 세포 침윤을 억제할 수 있는 최소 아미노산 서열임을 알 수 있다.
결국, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 전방으로 서열번호 2의 아미노산 서열의 222번째 아미노산부터 1번째 아미노산의 순으로 1 이상의 아미노산을 추가하고/하거나 서열번호 3의 아미노산 서열의 후방으로 서열번호 2의 아미노산 서열의 228번째 아미노산부터 281번째 아미노산의 순으로 1 이상의 아미노산을 추가로 포함하여 구성될 수 있다. 달리 표현하면, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 전방으로 서열번호 1의 아미노산 서열의 465번째 아미노산부터 244번째 아미노산의 순으로 1 이상의 아미노산을 추가하고/하거나 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 후방으로 서열번호 1의 471번째 아미노산부터 524번째 아미노산의 순으로 1 이상의 아미노산을 추가로 포함하여 구성될 수 있다.
하나의 구체적 예로서, 본 발명의 상기 펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열에 추가되는 아미노산 서열로서, 서열번호 3의 아미노산 서열의 전방(5' 방향)으로 서열번호 2의 222번째 아미노산 내지 1번째 아미노산 중 222번째 아미노산부터 하나 이상의 아미노산이 추가로 포함될 수 있다. 상기 222번째 아미노산부터 하나 이상의 아미노산이 추가로 포함되는 예는, 서열번호 2의 아미노산의 222번째 아미노산(이 경우는 서열번호 16과 동일함), 221번째 및 222번째 아미노산(이 경우는 서열번호 20과 동일함), 220번째 내지 222번째 아미노산(이 경우는 서열번호 21과 동일함), 219번째 내지 222번째 아미노산, 218번째 내지 222번째, 217번째 내지 222번째, 216번째 내지 222번재, 또는 215번째 내지 222번째 아미노산 등이거나 1번째 내지 222번째의 아미노산일 수 있다.
또 하나의 구체적 예로서, 본 발명의 상기 펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열에 추가되는 아미노산 서열로서, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 후방(3' 방향)으로 서열번호 2의 아미노산 서열의 228번째 아미노산 내지 281번째 아미노산 중 228번째 아미노산부터 하나의 이상의 아미노산이 추가로 포함될 수 있다. 228번째 아미노산부터 하나 이상의 아미노산이 추가로 포함되는 예는, 서열번호 2의 228번째 아미노산(이 경우는 서열번호 17과 동일함), 228번째 및 229번째 아미노산, 228번째 내지 230번째 아미노산, 228번째 내지 231번째 아미노산, 227번째 내지 232번째 아미노산 등이거나 228번째 내지 281번째의 아미노산일 수 있다.
또 다른 하나의 구체적 예로서, 본 발명의 상기 펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열에 추가되는 아미노산 서열로서, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 전방(5' 방향)으로 서열번호 2의 222번째 아미노산 내지 1번째 아미노산 중 222번째 아미노산부터 하나 이상의 아미노산이 추가로 포함되고, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 후방(3' 방향)으로 서열번호 2의 아미노산 서열의 228번째 아미노산 내지 281번째 아미노산 중 228번째 아미노산부터 하나의 이상의 아미노산이 추가로 포함될 수 있다. 이러한 예로, 서열번호 3의 아미노산 서열의 전방으로 서열번호 2의 아미노산의 222번째 아미노산, 221번째 및 222번째 아미노산, 220번째 내지 222번째 아미노산, 219번째 내지 222번째 아미노산, 218번째 내지 222번째, 217번째 내지 222번째, 216번째 내지 222번재, 또는 215번째 내지 222번째 아미노산 등 또는 1번째 내지 222번째의 아미노산일 수 있고; 서열번호 3의 아미노산 서열의 후방(3' 방향)으로 서열번호 2의 228번째 아미노산, 228번째 및 229번째 아미노산, 228번째 내지 230번째 아미노산, 228번째 내지 231번째 아미노산, 227번째 내지 232번째 아미노산 등, 또는 228번째 내지 281번째의 아미노산 등의 아미노산일 수 있다.
또 다른 하나의 구체적 예로서, 본 발명의 상기 펩타이드는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열, 즉 KITENIN의 C-말단 도메인(KITEIN-CTD)를 구성하는 아미노산 서열일 수도 있다.
또한, 본 발명의 상기 펩타이드는 이의 기능적 변이체를 포함하는 개념이다. “기능적 변이체”란 KITENIN의 동종이량체의 형성을 저해하는 본 발명의 펩타이드의 성질에는 영향을 미치지 않는 아미노산 위치에서 일부 아미노산의 치환이 발생된 모든 유사한 서열을 의미한다.
본 발명의 상기 펩타이드는 KITENIN의 동종이량체의 형성을 저해하여 KITENIN과 RACK1의 결합을 증가시키고 자가포식 의존적 방식에 의하여 KITENIN 단백질을 분해하는 역할을 한다. 따라서, 상기 펩타이드는 시험관 내 및 생체 내에서 발암성 KITENIN을 효과적으로 억제하며, KITENIN 단백질의 안정성을 감소시키는 효과를 가지며, 이에 의하여 암의 종양원성, 침윤성, 및 전이성을 억제하는 효과가 있다.
본 발명의 상기 펩타이드는 또한 세포 투과성 물질과 결합하여 이루어질 수 있다. 이러한 세포 투과성 물질은 세포를 투과하여 본 발명의 펩타이드를 KITENIN에 전달하는 물질이면 모두 포함할 수 있다. 하나의 예로, 상기 세포 투과성 물질은 세포 투과성 펩타이드 및 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 세포 투과성 펩타이드는 폴리아르기닌, Hph-1, Tat, SPACE(skin penetration and cell entering peptide), TD1(transdermal peptide-1), DLP(dermis localizing peptide), LP-12(linear peptide-12 mer), penetratin, EGFR-1 및 EGFR-2와 같은 종양 귀속 펩타이드(tumor homing peptide) 등이 있다.
상기 화합물은 콜산(cholic acid), 올레산(oleic acid) 및 이들의 유도체 등이 있다.
하나의 구체적 예로서, 상기 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드와 세포 투과성 물질이 결합한 펩타이드를 KDIP (KITENIN Dimerization-Interfering Peptide)로 혼용하여 사용하였다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
상기 “폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다.
또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에 있어서, “벡터”는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, “재조합벡터”는 숙주 세포 내에서 삽입된 핵산을 발현할 수 있는 당 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미하는 것으로서, 당업계에 공지된 통상의 발현벡터에 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 재조합벡터는 일반적으로 숙주세포에서 증식할 수 있는 복제원점, 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(예. 프로모터, 인핸서 등), 선별 마커(selective marker) 및 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 형질전환체는 상기 재조합벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다.
바람직하게는 형질전환체는 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 숙주세포에 도입하여 수득할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방, 치료, 또는 개선용 조성물, 또는 암의 침윤 및 전이 억제용 조성물을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 상기 펩타이드는 KITENIN의 동종이량체의 형성을 저해하여 KITENIN과 RACK1의 결합을 증가시키고 자가포식 의존적 방식에 의하여 KITENIN 단백질을 분해한다. 따라서 상기 펩타이드는 시험관 내 및 생체 내에서 발암성 KITENIN을 효과적으로 억제하고, KITENIN 단백질의 안정성을 효과적으로 감소시켜 암의 종양원성, 침윤성, 및 전이성을 억제하므로 암 치료 또는 개선용 조성물, 및 암세포의 침윤 및 전이 억제용 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에서, "치료"는 본 발명의 조성물을 이용하여 암으로 인해 발생한 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서, “예방” 또는 “개선”은 본 발명의 조성물을 이용하여 암으로 인해 발생한 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함될 수 있다.
상기 암은 대장암, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 폐암, 뇌종양, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 췌장암, 두경부암 또는 편평상피세포암 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 암은 대장암, 유방암, 간암, 식도암, 폐암, 뇌종양, 직장암, 위암, 담관암, 당낭암, 췌장암, 두경부암 또는 편평상피세포암이다.
본 발명의 상기 암의 예방, 치료 또는 개선용 조성물 또는 암의 침윤 및 전이 억제용 조성물이 약학적 조성물로서 사용되는 경우, 유효성분인 상기 펩타이드 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사 용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥내, 복강내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토즈, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제가 사용될 수 있다
경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61. 카카오지, 라우 린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 한편, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있으며 활성 성분을 의학적 치료, 구체적으로 암의 전이 및 침윤의 억제나 암의 치료에 유효한 양으로 포함한다.
이때, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학 적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다
예컨대, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 펩타이드의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물의 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 암 전이 및 침윤을 억제하고 암의 치료 효과를 나타내는 것이므로, 본 발명의 약학 조성물을 단독으로 사용할 수 있지만, 치료 효율을 증가시키기 위해 방사선 요법과 같은 다른 항암 치료법과 병용하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
그 일 예로, 본 발명의 약학 조성물은 추가로 다른 항암제와 병용 투여할 수 있다. 상기 항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록 시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노 레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페 메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈(5-Fu), 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루 오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 카페시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토 포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로 마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로 람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴, 보리노스텟, 엔티노스텟 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 암의 예방, 치료 또는 개선용 조성물 또는 암의 침윤 및 전이 억제용 조성물이 식품 조성물로서 사용되는 경우, 유효성분인 상기 펩타이드 이외에 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 펩타이드 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 식품 조성물은 유효성분 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 식품 조성물에 함유된 유효성분의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 KITENIN의 이량체 형성을 저해하는 방법, 또는 암의 전이 및 침윤 억제, 또는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 조성물의 유효성분인 서열번호 3, 또는 서열번호 6 내지 8, 또는 서열번호 16 내지 21 등으로 표시되는 펩타이드의 KITENIN의 이량체 형성 저해 방법, 이에 따른 암의 전이 및 침윤 억제, 및 암의 치료 또는 예방은 상술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "개체"란, 암이 전이 및 침윤 가능성이 있거나, 혹은 전이 및 침윤되거나 암이 발병한 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 조성물을 개체에게 투여함으로써 암의 전이 및 침윤을 억제하거나 암을 효과적으로 치료 또는 개선할 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수 성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로 아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레졸, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 KITENIN의 이량체 형성을 저해하여 저해하여 KITENIN과 RACK1의 결합을 증가시키고 자가포식 의존적 방식에 의하여 KITENIN 단백질을 분해하는 역할을 한다. 따라서, 상기 펩타이드는 시험관 내 및 생체 내에서 발암성 KITENIN을 효과적으로 억제하며, KITENIN 단백질의 안정성을 감소시키는 효과를 가지며, 이에 의하여 종양원성, 침윤성, 및 전이성을 억제하는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 암의 발생, 침윤, 및 전이를 억제하는 항암 치료제로서 매우 유용할 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 KITENIN-Myc 및 KITENIN-V5는 동종이량체를 형성함을 나타낸 그림이다. (A) HEK293T 세포를 KITENIN-myc를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시키고, 정제된 Myc 태그 KITENIN 특이적 용출액을 준비한 다음 SDS-PAGE 및 Coomassie blue 염색을 수행한 결과를 나타낸 그림이며, 겔(gel)의 화살표는 KITENIN-Myc가 내인성 KITENIN과 상호작용하여 동종이량체를 형성함을 보여주는 PMF(peptide mass fingerprinting) 분석에 의해 식별된 단백질을 나타낸다. (B) KITENIN-Myc 또는 KITENIN-V5로 공동 형질감염된 Caco2 세포에서 Western blot 및 co-immunoprecipitation (co-IP) 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 2는 도 1과 더불어 KITENIN-Myc 및 KITENIN-V5는 동종이량체를 형성함을 나타낸 그림이다. Caco2 세포(A) 및 HCT116 세포(B)를 KITENIN-V5 및 KITENIN-myc 플라스미드로 형질감염시킨 다음 48시간의 인큐베이션 후, 항-V5 또는 항-Myc 항체로 면역침전(immunoprecipitation; IP)을 각각 수행하였고, 지시된 항체로 면역블롯팅을 통해 분석한 결과이다. IgG 밴드는 면역침전 분석에서 항체 용량에 대한 대조군으로 사용하였다. WCL(whole cell lysate)을 이용한 면역블롯 분석을 통해 각 단백질 수준을 조사하였다.
도 3은 GST 태그 지정 도메인 삭제 KITENIN 돌연변이의 개략도를 나타낸 그림이다. 전체 길이, DC(1-240), DN(110-524), DNDC(110-240).
도 4는 GST 태그 지정 도메인 삭제 KITENIN 돌연변이에 대한 각각의 돌연변이체를 대장균에서 발현하고, 글루타티온-세파로스 비드에 고정화한 후, GST 융합 단백질의 비교 크기를 나타내는 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과이다(검은 화살촉, 우측 패널). 풀다운(pulldown)에 사용된 용해물의 10%가 입력(input)을 보이기 위해 사용되었다.
도 5는 KITENIN의 동종이량체화(Homodimerization)가 세포막에서 발생하는 결과를 나타내는 그림이다. (A) Caco2 세포를 빈(empty) 벡터(EV), KITENIN-Myc 및 KITENIN-V5로 48시간 동안 형질감염시키고 세포내 분획을 세포질 및 막 분획으로 처리한 후 면역침전(IP)으로 분석한 결과이다. 튜불린 및 Na+/K+-ATPase는 각각 세포질 및 막 마커로 사용되었다. W; 전세포 용해물, C; 세포질, M; 막. (B) KITENIN 동종이량체의 세포내 분포가 In situ 근접 결찰 분석(proximity ligation assay)에 의해 검출된 결과를 나타낸 그림이다. KITENIN-Myc 및 KITENIN-HA로 형질감염된 Caco2 세포를 커버 슬립(cover slip)에서 성장시켰으며, 적색 형광 점(red fluorescent dots)은 KITENIN 동종이량체를 나타낸다.
도 6은 KITENIN의 동종이량체화의 두 가지 가능한 모델을 나타내는 개략도이다.
도 7은 KITENIN의 이량체화가 cis(동일한 세포 표면에서) 또는 trans(다른 세포에 걸쳐) 형성에서 발생했는지 확인하기 위해 co-IP(co-Immunoprecipitation) 실험을 수행한 결과로서 KITENIN 동종이량체는 시스 형태로만 존재하는 것을 나타내는 그림이다. HEK-293T 세포는 다음과 같이 KITENIN-Myc 또는 KITENIN-V5를 인코딩한 플라스미드로 형질감염되었다: 빈 벡터로 형질감염한 세포(레인 1), 플라스미드 KITENIN-Myc 및 KITENIN-V5로 공동형질감염한 세포(레인2), 각 플라스미드 단독으로 형질감염하였지만 공동배양을 위해 혼합한 세포(레인 3), KITENIN-Myc로 형질감염한 세포(레인 4) 또는 KITENIN-V5로 형질감염한 세포(레인 5). 이들 세포를 각각 항-Myc 또는 항-V5 항체로 면역침전시키고 지시된 항체로 분석하였다.
도 8은 KITENIN-CTD의 발현이 KITENIN의 이량체화를 감소시키는 결과를 나타낸 그림이다. (A) KITENIN-V5/Myc를 공동 발현하는 Caco2 세포를 KITENIN-CTD-HA의 증가된 용량으로 형질감염시키고, 48시간의 배양 후 Caco2 세포를 항-Myc 항체로 면역침전시키고 지시된 항체에 의해 검출한 결과이다. (B) KITENIN-V5/Myc를 공동 발현하는 Caco2 세포를 48시간 동안 KITENIN, KITENIN 및 NTD(1-240) 및 KITENIN 및 CTD(110-524)로 형질감염시키고 시험관내 트랜스웰 침윤 분석을 실시한 결과이다. 이들 (A) 및 (B)에 표시된 그림은 세 가지 독립적인 실험을 나타낸다. 히스토그램은 4개의 선택된 영역에서 계산되고 막대 그래프(bar graph)로 표시된 침윤 세포를 나타낸다(평균 ± SEM, n = 3).
도 9는 KITENIN의 정의된 세포내 C-말단 영역에 의한 KITENIN 이량체화 억제 효과를 나타낸 그림이다. (A) KITENIN의 결실 돌연변이 및 KITENIN의 이량체화에 대한 KITENIN의 세포내 C-말단 영역의 효과에 대한 도식적 묘사이다. 세포내 KITENIN C-말단 도메인은 C-말단 마지막(524 aa)에서 약 40개 아미노산 간격으로 연속적으로 결실시켰다. (B) KITENIN-Myc 및 KITENIN-V5를 공동 발현하는 Caco2 세포는 빈 벡터(EV), 또는 야생형 KITENIN(WT), CTD 및 연속적으로 삭제된 KITENIN 돌연변이체(1-339, 1-394, 1-449, 1-487)와 같은 HA-태그된 KITENIN 구조체로 형질감염시킨 후, 각 세포 용해물을 항-V5 항체로 면역침전시킨 다음 항-Myc 항체로 면역블롯팅하여 KITENIN 이량체를 검출한 결과이다.
도 10은 세포 운동성에 대한 KITENIN의 세포내 C-말단 영역의 효과를 나타낸 그림이다. Caco2/KITENIN-V5 세포를 48시간 동안 KITENIN의 HA-태그된 결실 돌연변이체(WT, CTD, 1-339, 1-394, 1-449, 1-487)로 형질감염시킨 후 관찰한 침윤 분석의 사진 및 히스토그램이다(평균 ± SEM, n=3, **P<0.01, ***P<0.001).
도 11은 스테이플된(stapled) KITENIN-표적화 펩타이드의 디자인으로 KITENIN의 C-말단 영역(449-487) 내에 분류된 7개의 펩타이드 서열을 나열한 그림이다.
도 12는 CTD 또는 7개로 분류한 펩타이드 각각에 대한 KITENIN 이량체화 억제 효과를 나타낸 그림이다. KITENIN-Myc 및 KITENIN-V5를 공동 발현하는 Caco2 세포를 빈 벡터(EV), CTD 또는 7개의 분류된 펩타이드 각각으로 형질감염시키고, 항-V5 항체로 면역침전시킨 다음 항-Myc 항체로 면역블롯팅하였다.
도 13은 CTD 또는 7개로 분류한 펩타이드 각각에 대한 세포 운동 억제 효과를 나타낸 그림이다. KITENIN-Myc 및 KITENIN-V5를 공동 발현하는 Caco2 세포를 빈 벡터(EV), CTD 또는 7개의 분류된 펩타이드 각각으로 형질감염시킨 후 관찰한 침윤 분석의 사진 및 히스토그램이다(평균 ± SEM, n=3, **P<0.01, ***P<0.001).
도 14는 다양한 세포 투과성 또는 종양 귀소(homing) 펩타이드를 가지는 변이체 463-471 펩타이드의 설계를 나타내는 그림이다.
도 15는 다양한 세포 투과성 또는 종양 귀소(homing) 펩타이드를 가지는 변이체 463-471 펩타이드에 대한 KITENIN의 이량체화 억제 효과를 비교한 그림이다. KITENIN-Myc 및 KITENIN-V5를 공동 발현하는 Caco2 세포를 다양한 세포 투과성 또는 종양 귀소(homing) 펩타이드를 가지는 변이체 463-471 펩타이드로 24시간 동안 처리하고, 각 세포 용해물을 항-V5 항체로 면역침전시킨 다음 항-Myc 항체로 면역블롯팅하여 KITENIN 이량체를 검출하였다.
도 16은 다양한 세포 투과성 또는 종양 귀소(homing) 펩타이드를 가지는 변이체 463-471 펩타이드 간의 세포 운동성에 대한 억제 효과를 비교한 그림이다. Caco2/KITENIN-V5 세포를 KITENIN-Myc로 형질감염시키고, 24시간 배양 후, 세포를 다양한 세포 투과성 또는 종양 귀소(homing) 펩타이드를 가지는 변이체 463-471 펩타이드로 24시간 동안 처리하고 침윤 분석을 실시한 사진과 히스토그램이다(평균 ± SEM, n=3, **P<0.01, ***P<0.001).
도 17은 KITENIN-WT, KITENIN-CTD 또는 KITENIN-NTD의 강제 발현 후 KITENIN 전사체의 수준을 관찰한 그림이다. Caco2 세포를 빈 벡터, WT KITENIN-HA, KITENIN-NTD-HA(1-240 aa) 또는 KITENIN-CTD-HA(110-524 aa)로 형질감염시키고, 48시간 후 세포를 KITENIN 전사체의 RT-PCR 분석에 적용하였다.
도 18은 KDIP가 KITENIN 단백질의 양을 감소시키지만 KITENIN의 발현은 감소시키지 않음을 나타내는 그림이다. (A) Caco2/KITENIN-V5 세포를 KITENIN-myc로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 표시된 시간 동안 KDIP(1 μM)로 처리하고 세포내 분획을 세포질 및 막 분획으로 처리하였다. 스크램블 펩타이드(scr-pep) 또는 KDIP 처리된 Caco2 세포에서 상대적인 KITENIN 발현은 Q-PCR을 사용하여 2-ΔΔ방법으로 분석되었다. (B) 데이터는 평균± 표준편차(n = 3)을 나타낸다.
도 19는 KDIP가 KITENIN 동종이량체의 형성을 직접적으로 억제하고 과발현된 KITENIN에 의한 상향조절된 세포 침윤을 감소시키고 있음을 나타내는 그림이다. Caco2 세포를 KITENIN-V5/Myc로 공동 형질감염시키고 KDIP 또는 스크램블된 펩타이드(scr)로 처리하거나 처리하지 않고 항-V5 항체로 면역침전시키고 지시된 항체에 의해 검출하였다(A). Caco2 세포를 빈 벡터 또는 KITENIN-V5로 형질감염시키고 스크램블된 펩타이드 또는 KDIP로 처리하고 시험관내 트랜스웰 침윤 분석을 실시하였다(B). 히스토그램은 4개의 선택된 영역에서 계산되고 막대 그래프로 표시된 침윤 세포를 나타낸다(평균±SEM, n=4, **P < 0.01).
도 20은 KDIP 처리에 의해 KITENIN 단량체 및 이량체의 형성이 감소됨을 나타내는 그림이다. KITENIN-GST 및 KITENIN-His는 박테리아에서 발현되고, 시험관 내에서 정제되고, KDIP와 혼합되고, 네이티브 SDS-PAGE 젤(A)에서 수행되었다. 단백질 크기는 화살촉으로 표시하였다. GST 풀다운(pulldown) 후, 스트렙타비딘(streptavidin)에 부착된 KITENIN-GST는 anti-His 항체에 의해 검출되었다(B).
도 21은 KDIP 처리 후 KITENIN의 분해는 KITENIN 내 온전한(intact) KDIP 서열(463-471 펩타이드, RACK1 결합 부위)을 필요로 함을 나타내는 그림이다. Caco2 세포를 KITENIN-V5/Myc 또는 Δ463-471 KIT-V5/Myc로 형질감염시키고 KDIP를 24시간 동안 처리하고, 항-V5 항체로 면역침전시킨 후 면역반응성 V5-태깅(tagging) 및 Myc-태깅(tagging) 단백질을 조사하였다(A). 세포 침윤에 대한 KDIP의 효과에 대한 Δ463-471 KITENIN의 강제 발현의 영향을 나타낸다(B). KDIP 처리 24시간 후, 세포를 침윤 분석에 적용하였다. 침윤 분석의 사진과 히스토그램은 (B)와 같이 얻었다(평균 ± SEM, n=4). 별표(*P<0.05)는 그룹 간의 유의한 차이를 나타낸다. NS는 그룹 간에 유의미한 차이가 없음을 의미한다.
도 22는 RACK1이 KITENIN에 특이적으로 결합함을 나타내는 그림으로서, Caco2/KITENIN-V5 세포를 48시간 동안 RACK1-GFP로 형질감염시키고, 항-GFP 항체로 면역침전시키고, 항-V5 항체로 면역블롯팅하여 RACK1에 결합된 KITENIN을 검출한 결과이다. 전체 세포 용해물(WCL)의 단백질이 표시된 항체로 검출되었다.
도 23은 RACK1이 KITENIN에 특이적으로 결합함을 나타내는 그림으로서, Caco2 세포를 KITENIN-V5 및/또는 RACK-GFP로 형질감염시키고 24시간 후, 세포를 24시간 동안 KDIP(1 uM)로 처리하고 항-GFP 항체로 면역침전시킨 결과이다. 전체 세포 용해물(WCL)의 단백질이 표시된 항체로 검출되었다.
도 24는 RACK1이 KITENIN에 특이적으로 결합함을 나타내는 그림으로서, Caco2 세포를 48시간 동안 KITENIN-V5 또는 Δ3-471-KITENIN-V5 및/또는 RACK1-GFP로 형질감염시키고 항-GFP 항체로 면역침전시켜 Δ463-471 KITENIN과 RACK1 간의 상호작용을 검출한 결과이다. 전체 세포 용해물(WCL)의 단백질이 표시된 항체로 검출되었다.
도 25는 RACK1의 발현 상태에 따른 KITENIN의 분해에 대한 KDIP의 영향 변화를 확인한 그림으로서, Caco2 세포를 KITENIN-V5 및/또는 RACK1-GFP로 형질감염시키고, KDIP(1 μM, 24시간) 처리 후 이들의 발현이 표시된 항체(A) 및 침윤 분석(B)에 의하여 검출된 결과이다. 침윤 분석의 사진과 히스토그램은 도 21와 같이 나타났다.
도 26은 RACK1의 발현 상태에 따른 KITENIN의 분해에 대한 KDIP의 영향 변화를 확인한 그림으로서, Caco2 세포를 KITENIN-V5 및/또는 si-RACK1으로 형질감염시키고, KDIP(1 μM, 24시간) 처리 후 이들의 발현이 표시된 항체(A) 및 침윤 분석(B)에 의하여 검출된 결과이다. 침윤 분석의 사진과 히스토그램은 도 21과 같이 나타났다.
도 27은 Caco2 세포를 48시간 동안 WT KITENIN-V5, KITENIN-CTD-HA 및/또는 RACK1-GFP로 공동 형질감염시키고 표시된 항체(A)로 면역블롯팅을 통해 분석하거나 침윤 분석(B)을 실시한 결과를 나타낸 그림으로, RACK1이 KITENIN 분해 및 세포 운동성 억제에 관한 KITENIN-CTD의 효과에 영향을 미치고 있음을 보여준다. 침윤 분석의 사진과 히스토그램은 도 21과 같이 나타났다(평균 ± SEM, n=3, **P<0.01).
도 28은 Caco2 세포를 48시간 동안 WT KITENIN-V5, KITENIN-CTD-HA 및/또는 RACK1-siRNA로 공동 형질감염시키고 표시된 항체(A)로 면역블롯팅을 통해 분석하거나 침윤 분석(B)을 실시한 결과를 나타낸 그림으로, RACK1이 KITENIN 분해 및 세포 운동성 억제에 관한 KITENIN-CTD의 효과에 영향을 미치고 있음을 보여준다. 침윤 분석의 사진과 히스토그램은 도 21과 같이 나타났다(평균 ± SEM, n=3, **P<0.01).
도 29는 RACK1 발현에 따른 KITENIN 단백질 양의 변화를 나타낸 그림이다. Caco2/KITENIN-V5 세포를 48시간 동안 빈 벡터 또는 RACK1-GFP로 형질감염시키고, 표시된 시점(시간) 동안 사이클로헥시미드(CHX, 20ng/ml)로 처리하고 면역블롯 분석으로 조사하였다.
도 30은 KDIP 처리 후 KITENIN의 분해는 리소좀-자가포식 경로 의존적 패턴을 나타낸다. 48시간 동안 KITENIN-myc로 형질감염된 Caco2 세포를 24시간 동안 KDIP(1 μM)로 처리하였다. 이 실험 기간 동안 세포를 수확하기 전에 세포를 MG132(10 μM) 및 A1(Bafilomycin A1, 1 μM), CQ(클로로퀸, 100 μM) 또는 3-MA(1mM)로 각각 4시간 및 12시간 동안 다시 처리하였다. KITENIN 단백질의 양은 anti-myc 항체로 확인하였다.
도 31은 KITENIN-CTD의 발현 후 리소좀-자가포식 경로 의존적 방식에서의 KITENIN의 분해 결과를 나타낸 그림이다. Caco2 세포를 빈 벡터로 형질감염시키거나 48시간 동안 KITENIN 및/또는 KITENIN-CTD로 공동 형질감염시켰다. 이 실험 기간 동안 세포를 수확하기 전에 세포를 MG132(10 μM) 및 A1(Bafilomycin A1, 1 μM), CQ(클로로퀸, 100 μM) 또는 3-MA(1mM)로 세포를 수확하기 전에 각각 4시간 및 12시간 동안 다시 처리하였다. 항-KITENIN 항체로 KITENIN 단백질의 양을 확인하였다.
도 32는 KDIP가 KITEINN의 자가포식 분해를 자극하고 있음을 나타낸 그림이다. Caco2/KITENIN-V5 세포를 24시간 동안 KDIP로 처리하고 항-KITENIN, 항-p62 또는 항-LC3B 항체(A)를 사용한 면역블롯 분석으로 평가하였다. LC3B와 p62는 자가포식(autophagy)의 마커로 사용하였다. Caco2/KITENIN-V5 세포를 24시간 동안 KDIP 및/또는 3-MA로 처리하고 LC3B의 발현 변화를 면역블롯 분석으로 조사하였다(B). Caco2/KITENIN-V5 세포(C)에서 Rapamycin 또는 KDIP(5M)로 처리한 후 자가포식성(Autophagic) 액포를 Cyto-ID 녹색 염료로 염색하였다.
도 33은 KDIP 처리 후 양적으로 변화된 패턴을 보인 KITENIN 결합 단백질의 동정에 따른 결과를 나타낸 그림이다. Caco2/KITENIN-V5 세포를 scr-peptide 또는 KDIP로 처리한 후 항-V5 항체로 면역침전시킨 후, 용출액을 SDS-PAGE 겔에서 분리하고 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색하여 PMF(peptide mass fingerprint) 분석한 결과이다(A). 화살표는 KDIP 후 KITENIN에 대한 결합이 약해진 단백질을 나타낸다. KITENIN 형질감염 세포에서 확인된 KITENIN 결합 단백질의 변화이다(B). Caco2/KITENIN-V5 세포에서 PMF 분석으로 확인된 eEF2 및 Myo10의 발현 패턴을 조사하였다. KDIP 처리 후 KITENIN 결합 단백질의 감소된 발현 패턴이다(C). Caco2/KITENIN-V5 세포를 KDIP로 처리한 후 항-V5 항체로 면역침전시키고 지시된 항체로 면역블롯팅하였다.
도 34는 동정된 KITENIN 결합 단백질, eEF2 및 Myo10의 녹다운에 의한 KITENIN과 RACK1의 결합 프로파일(binding profile)의 변화를 나타낸 그림이다. Caco2 세포는 siRNA 형질감염을 통해 eEF2(A) 또는 Myo10(B)의 녹다운 하에 KITENIN-V5 및/또는 RACK1-GFP로 형질감염되었고, 24시간 동안 KDIP(1 μM)로 처리되었다. 세포를 항-GFP 항체(RACK1)로 면역침전시키고 항-V5 항체(KITENIN)로 면역블롯팅하였다.
도 35는 Myo10은 KITENIN 수준 및 세포 침윤에 대한 KDIP의 억제 효과를 매개하는 결과를 나타내는 그림이다. Caco2 세포는 siRNA 형질감염을 통해 eEF2의 녹다운 하에 빈 벡터 또는 KITENIN-V5로 형질감염시키고 24시간 동안 KDIP(1 μM)로 처리하였다. 세포를 면역블롯 분석으로 분석하여 KITENIN 수준(A) 또는 침윤 분석(B)을 조사하였다. 침윤 분석의 사진과 히스토그램은 그림 21과 같이 나타났다(mean ± SEM, n=4, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
도 36은 도 35와 더불어 Myo10은 KITENIN 수준 및 세포 침윤에 대한 KDIP의 억제 효과를 매개하는 결과를 나타내는 그림이다. Caco2 세포는 siRNA 형질감염을 통해 Myo10의 녹다운 하에 빈 벡터 또는 KITENIN-V5로 형질감염시키고 24시간 동안 KDIP(1 μM)로 처리하였다. 세포를 면역블롯 분석으로 분석하여 KITENIN 수준(A) 또는 침윤 분석(B)을 조사하였다. 침윤 분석의 사진과 히스토그램은 그림 21과 같이 나타났다(평균 ± SEM, n=4, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
도 37은 Myo10이 KITENIN의 막횡단 부분에 결합하고 있음을 확인한 그림이다. GST 태그된 KITENIN 결실 구성체에서 박테리아로 발현된 단백질을 정제하고 Myo10을 함유하는 세포 용해물과 함께 배양하였고 풀다운(pull down)하였다. 결합된 단백질 복합체를 용출시키고 SDS-PAGE에 이어 면역블롯팅으로 분석하였다. 항-Myo10 항체로 블롯을 검출하여 상호 작용(interaction)을 조사하였다. 양성 밴드(positive band)는 KITENIN 전장 및 ΔC(세포내 C-말단 영역이 없는 KITENIN), ΔN(세포내 N-말단 영역이 없는 KITENIN) 및 ΔNΔC(세포내 N이 없는 KITENIN -말단 및 C-말단 영역, 그러나 막횡단 영역이 있음) 구조체에서 검출되었지만, CTD(막 부분이 없는 세포내 C-말단 영역) 구조체에서 검출되지 않았다. 화살표는 각 단백질의 적정 크기를 가리킨다.
도 38은 Myo10의 C-말단 FERM 도메인이 KITENIN의 막횡단 부분과 상호작용하고 있음을 보여주는 그림이다. Myo10-HA 결실 돌연변이의 도식적 표현이 도시되었다. 열린 상자(open box)는 Myo10의 각 기능 영역을 나타낸다. HA-Myo10의 3개(좌측 패널) 또는 2개(우측 패널) 결실 돌연변이가 Caco2/KITENIN-V5 세포에서 발현되었고, 세포 용해물을 항-V5 항체로 면역침전시키고 항-HA 항체로 면역블롯팅하여 KITENIN과 HA 태깅 Myo10 간의 상호작용을 검출하였다. KITENIN에 결합한 각 Myo10 결실 돌연변이는 화살표로 나타내었다.
도 39는 Myo10이 KITENIN의 발현 조절자 역할을 하고 있음을 나타내는 그림이다. Caco2/KITENIN-V5 세포를 48시간 동안 si-KITENIN(A) 또는 si-Myo10(B)으로 형질감염시키고 표시된(indicated) 항체를 사용한 면역블롯 분석으로 분석하였다. Myo10의 발현은 KITENIN(A)의 녹다운에 의해 영향을 받지 않았지만, KITENIN의 발현은 Myo10(B)의 녹다운 상태에서 거의 없었다.
도 40은 KITENIN 이량체의 형성이 Myo10의 녹다운 하에서 거의 중단되고 있음을 나타내는 그림이다. KITENIN-V5 및/또는 KITENIN-Myc로 공동 형질감염된 Caco2 세포를 si-Myo10으로 48시간 동안 형질감염시키고 항-V5 항체로 면역침전시키고 지시된 항체로 분석하였다.
도 41은 KDIP 처리 후 감소된 Myo10이 MG132 전처리 후 회복되지만 리소좀 억제제 또는 자가포식 억제제의 처리에 의하여 회복되지 않았음을 나타내는 그림이다. KITENIN-V5로 형질감염된 Caco2 세포를 24시간 동안 KDIP(1 μM)로 처리하였다. 이 실험 기간 동안 세포를 수확하기 전에 각각 4시간 및 12시간 동안 MG132(10 μM) 및 클로로퀸(100 μM) 또는 3-MA(1mM)로 세포를 다시 처리하였다. Myo10 및 KITENIN 단백질의 양은 면역블롯 분석으로 확인하였다.
도 42는 KITENIN-CTD의 형질감염 후 Myo10이 감소되었음을 나타내는 그림이다. 빈 벡터 또는 KITENIN-V5를 발현하는 Caco2 세포를 CTD-HA로 형질감염시키고 24시간 동안 KDIP로 처리하였다. 표시된 항체(indicated antibodies)로 세포를 분석하였다.
도 43은 KDIP에 의한 세포 침윤성 억제에 대한 MG132의 효과를 나타낸 그림이다. Caco2 세포를 빈 벡터 또는 KITENIN-V5로 형질감염시키고 KDIP(1 μM, 24시간)로 처리하였다. 이 실험 기간 동안 세포를 수확하고 침윤 분석을 하기 전에 12시간 동안 MG132(10 M)로 다시 처리하였다. 침윤 분석의 사진과 히스토그램은 그림 21과 같이 나타났다.
도 44는 Myo10 및 KITENIN의 수준이 Nrdp1 발현 하에서 KDIP로 처리한 후 더 감소하였음을 보여주는 그림이다. Caco2/KITENIN 세포를 빈 벡터(EV) 또는 Nrdp1로 형질감염시킨 다음, KDIP(1 M)로 처리하였다. Myo10 및 KITENIN의 단백질 수준은 예정된 시간(indicated times)에 cycloheximide(CHX, 20ng/ml)로 처리한 후 확인하였다.
도 45는 E3-리가제(ligase) Nrdp1이 KDIP 처리된 Caco2 세포에서 Myo10의 유비퀴틴화와 연관됨을 보여주는 그림이다. Caco2 세포를 KITENIN 및 Nrdp1 또는 유비퀴틴(ubiquitin)으로 형질감염시키고 스크램블(scrambled) 펩타이드 또는 KDIP(1 μM)로 24시간 동안 처리하였다. 항-Myo10 항체로 면역침전된 세포 생성물을 6% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고 이동한 후, 항-유비퀴틴 항체로 면역블롯팅하였다.
도 46은 E3-리가제(ligase) Nrdp1이 Myo10의 분해 및 감소된 세포 침윤에 대한 KDIP 처리의 효과를 매개하고 있음을 나타내는 그림이다. Caco2 세포를 siRNA 형질감염을 통한 Nrdp1의 녹다운 하에서 빈 벡터(EV) 또는 KITENIN-V5로 형질감염시키고 24시간 동안 KDIP(1 M)로 처리하였다. Myo10 및 KITENIN 수준(A) 또는 침윤 분석(B)을 수행하기 위해 면역블롯 분석으로 세포를 분석하였다. 침윤 분석의 사진과 히스토그램은 그림 21과 같이 나타났다(평균 ± SEM, n=4, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
도 47은 Myo10이 KITENIN 동종이량체를 안정화하는 방법과 KDIP가 KITENIN 이량체의 분해 및 안정성에 미치는 영향을 보여주는 개략도이다. 여기서 Myo10은 KITENIN에 선택적으로 결합하고 이량체화를 안정화시켜 KITENIN의 발암 활성을 조절하는 이펙터(effector) 역할을 한다. Myo10의 하향 조절(downregulation)을 통해 KDIP는 더 높은 수준의 KITENIN, RIM, RACK1 상호작용 모티브를 발현하는 암세포에서 보다 특정한 항종양 활성을 나타낸다.
도 48은 CRC의 생체내 마우스 모델에서 KDIP 처리가 KITENIN 과발현 CT-26 세포의 세포 침윤을 감소시키고 있음을 나타내는 그림이다. 세포 침윤은 KITENIN으로 형질감염되고 scr-peptide 또는 KDIP(1μM)로 처리된 CT-26 세포에서 비교되었다(A). 7×104개의 KITENIN 형질전환된 Caco2 세포(Caco2/KITENIN) 또는 iRFP(CT-26/iRFP/KITENIN)를 발현하는 KITENIN 형질전환된 CT-26 세포를 0.2% BSA를 함유하는 배지에 현탁시킨 후, 세포를 스크램블 펩타이드(1 μM) 또는 KDIP를 표시된 농도(최대 10 μM)에서 24시간 동안 처리하고 침윤 분석(B)을 수행하였다. 도 48은 세 가지 독립적인 실험을 나타낸다. 침윤 분석의 사진과 히스토그램은 도 21과 같이 나타났다. 이러한 결과를 기반으로 세포 침윤에 대한 KDIP의 IC50(half-maximal inhibitory concentration)의 구하였다. 별표는 Caco2/KITENIN-V5 세포(scr-펩타이드 처리 대 KDIP 처리, **P<0.01; ***P<0.001) 또는 CT-26/iRFP/KITENIN 세포(scr-펩타이드 -처리 대 KDIP 처리, #P<0.05, ##P<0.01)를 나타낸다.
도 49는 KDIP가 생체 내 항종양 효과가 있는지 여부를 조사하기 위하여 BALB/c 마우스와 CT-26 쥐 결장 선암종 세포주의 동계 종양 모델의 동물실험 일정을 도식화한 그림이다.
도 50은 KDIP의 정맥 주사가 동계(syngeneic) 마우스 종양 모델에서 종양 크기를 현저히 감소시킴을 나타내는 그림이다. 1×106 CT-26/KITENIN-V5 세포를 BALB/c 마우스에 피하 접종하였다. 종양이 1주일 동안 성장한 후, 펩타이드를 14일 동안 격일로 정맥내 투여하였다. 마우스를 17일째에 희생시켰고, 상이한 처리 그룹에서 종양 및 종양 중량의 이미지를 얻었다(평균 ± SEM) (A). 비이클(vehicle), scr-펩타이드 또는 KDIP(1 및 5 mg/kg, mpk)를 정맥 주사한 후 CT-26/KITENIN-종양 마우스의 종양 성장 및 개별 체중의 라인(line) 그래프는 평균 ± SEM로서 나타내었다(B).
도 51은 KDIP가 생체 내 항전이 효과가 있는지 여부를 조사하기 위한 비장내 간 전이 모델의 동물실험 일정을 도식화한 그림이다.
도 52는 KDIP의 정맥내 주사가 비장내 간 전이 모델에서 결장직장 간 전이를 유의하게 감소시켰음을 보여주는 그림이다. 실험적 간 전이 모델은 CT-26/iRFP/KITENIN-V5 발현 세포를 안정적으로 발현하는 동계 마우스에 비장내 접종한 후 비장 절제술을 통해 준비하였다. 2주 동안 마우스에 KDIP(5mg/kg) 또는 0.1% DMSO에 용해된 스크램블된 펩타이드를 주 3회 정맥 주사하였다. 전이 평가를 위해 iRFP를 발현하는 간 결절에서 방출되는 총 형광을 측정하여 계수하거나(A), 전이성 종양 성장을 간 표면으로 이동한 결절로 계수하고, 크기를 곱하여 전이성 점수를 계산하였다(B). 전이성 점수 또는 총 형광은 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 별표는 표시된 그룹 간의 유의한 차이를 의미한다(*P<0.05). scr-peptide 또는 KDIP(5 mg/kg, mpk)를 정맥 주사한 후 개별 체중의 라인 그래프는 평균 ± SEM(C)으로 표시하였다.
도 53은 Myo10, KITENIN 및 그 하향신호 및 phospho-c-Met의 수준은 감소했지만 KDIP가 처리된 퇴행 종양 조직(regressed tumor tissues)에서 KAI1의 수준은 회복되었음을 나타내는 그림이다. Myo10, eEF2, KITENIN, phospho-ERK, phospho-c-Jun, KAI1 및 phospho-c-Met의 발현 수준은 두 그룹, KDIP(5 mg/kg) 대 스크램블 펩타이드(scr-pep)에서 수집된 전이성 간 결절에서 면역 블롯 분석으로 조사하였다(A). 각 단백질의 정량적 양은 농도계(densitometry)로 측정하였으며 임의의 점수(arbitrary score)로 나타내었다(mean ± SEM, n=6)(B). 별표는 표시된 그룹 간의 유의한 차이를 의미한다(*P<0.05, **P<0.01, NS: 유의하지 않음).
도 54는 KDIP를 구성하는 8개 또는 9개의 아미노산에서 6개의 핵심 아미노산을 선택하는 과정을 보여주는 그림이다. KDIP-8과 KDIP-9의 아미노산 서열은 일부 중복되는 아미노산 서열을 가지고 있으며 KITENIN의 이량체화를 방해하고 KITENIN에 의한 세포 침윤 증가를 억제하는 활성이 거의 유사한 것으로 나타났다. 따라서, KDIP-8과 KDIP-9 사이의 아미노산 범위를 좁혀 6개의 핵심 아미노산 서열을 선택하고 KDIP-6 (465-470 펩타이드(LVSDEA))로 명명하였다.
도 55는 KDIP-6 펩타이드에 대한 KITENIN의 이량체화 억제 효과(A) 및 KITENIN에 의해 증가된 세포 침윤 억제 효과(B)를 KDIP-9 (463-471 펩타이드(WRLVSDEAV))와 비교한 그림이다. Caco2/KITENIN-V5 세포를 스크램블된 펩타이드(scr) 또는 KDIP(KDIP-6 또는 KDIP-9, 1μM)로 24시간 동안 처리하고 면역블롯 분석(A) 및 시험관내 트랜스웰 침입 분석(B, 좌 그림)을 수행하였다. 표시된 그림은 세 가지 독립적인 실험을 나타냅니다(B, 좌 그림). 히스토그램(B, 우 그림)은 4개의 선택된 영역에서 계산되고 막대 그래프로 표시된 침입 세포를 나타낸다(mean±SEM, n=3, **P < 0.01).
도 56은 KDIP-6이 KDIP-9과 동일하게 KITENIN 동종이량체의 형성을 억제하고 있음을 나타내는 그림이다. Caco2/KITENIN-V5 세포를 KITENIN-Myc로 형질감염시키고 스크램블된 펩타이드(scr) 또는 KDIP(KDIP-6 또는 KDIP-9, 1μM)로 처리하였다. 세포를 항-Myc 항체로 면역침전시키고, 지시된 항체로 분석하였다. 130-kDa KITENIN 동종이량체 밴드의 강도를 scr과 KDIP 처리 간에 비교하였다.
도 57은 KDIP-6 및 KDIP-9 처리는 용량 의존적으로 KITENIN 과발현 Caco2 CRC 세포의 세포 침윤을 감소시키고 있음을 나타내는 그림이다. 세포 침윤 분석은 빈 벡터(EV) 단독 또는 KITENIN으로 형질감염된 Caco2 세포에서 수행되었고 KDIP-9(1 μM, 상부 패널) 또는 KDIP-6(1 μM, 하부 패널)으로 처리되었다. 이미지는 세 가지 독립적인 실험을 나타낸다. 침입 분석의 사진과 히스토그램은 도 55와 같이 얻었습니다. 0.2% BSA를 함유하는 배지에 7×104개의 KITENIN 형질감염된 Caco2 세포(Caco2/KITENIN)를 현탁시킨 후, 세포를 지시된 농도에서 24시간 동안 스크램블된 펩타이드(scr) 또는 KDIP(KDIP-6 또는 KDIP-9) (최대 10 μM)로 처리하고 침윤 분석을 하였다. 별표는 Caco2/EV 세포(scr-펩타이드드 처리 대비 KDIP-6 처리, *P<0.05) 또는 Caco2/KITENIN 세포(scr-펩타이드 처리 대비 KDIP-6 처리, #P<0.05; ##P<0.01)에서 유의한 차이를 나타낸다.
도 58은 KDIP-6 처리 후 KITENIN의 분해는 리소좀-자가포식 경로 의존적 패턴임을 보여주는 그림이다. 48시간 동안 KITENIN-myc로 형질감염된 Caco2 세포를 24시간 동안 KDIP-6(1μM)으로 처리하였다. 이 실험 기간 동안 세포를 수확하기 전에 MG132(10μM) 또는 3-MA(1mM)를 각각 4시간 또는 12시간 동안 다시 처리하였다. KITENIN 단백질의 양은 anti-myc 항체로 확인하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
재료 및 방법
1-1. 세포 배양 및 시약
세포주는 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Republic of Korea)에서 구입했으며 정기적으로 마이코플라스마 오염 검사를 받았다. CT-26-WT-iRFP-Neo 세포는 Imanis Life Sciences(Rochester)에서 구입했다. 세포는 RPMI-1640 배지 또는 10% 소태아혈청(GenDEPOT), 100unit/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신(Corning)을 포함하는 DMEM에서 37℃에서 5% CO2를 포함하는 습한 분위기에서 배양되었다. 세포는 컨플루언스에 도달하기 전에 계대되었다. Brefeldin A, chloroquine, MG132, 3-MA, rapamycin 및 cycloheximide(Sigma)를 표시된 농도로 주입되었다.
1-2. 플라스미드 및 siRNA
발현 구조제는 PCR 기반 방법에 의해 제조되었다: V5 태그, Myc 태그, HA 태그 KITENIN, GST 태그 KITENIN 결실 돌연변이, D463-KITENIN 및 His 태그 KITENIN. 모든 구조체는 시퀀싱에 의해 확인되었다. pEGFRP-N1-RACK1은 Anna Huttenlocher(Addgene 플라스미드 #41088)로 제공되었다. 유전자 침묵(gene silencing)에 사용된 모든 siRNA는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입했다. 각각은 여러 서열(sequence)의 혼합물로 구성되어 서열별 다양성(sequence-specific diversity)을 제거했다.
1-3. 아크릴아미드 겔 염색 및 PMF 분석
SDS-PAGE에 의해 분리된 단백질의 시각화를 위해 Coomassie brillant blue G 250 염색을 수행했다. 구체적으로, 겔(gel)은 진탕 플랫폼에서 고정 용액(30% 에탄올, 2% 인산 수용액)에서 30분 동안 고정되었다. 고정된 겔을 세척액(2% 인산 수용액)으로 세척한 후 평형 용액(18% 에탄올, 15% 황산암모늄, 2% 인산 수용액)에서 30분간 평형화시켰다. 염색을 통해 시각화된 단백질 밴드는 겔 내 분해 후 MALDI-TOF 질량 분석을 위해 펀칭(punching)하었다. 모든 분해된 펩타이드는 PMF(Peptide Mass Fingerprinting) 분석(Genomine, Korea)에 의해 검증되었다.
1-4. 항체 및 면역침전반응
다음의 단백질에 대한 항체는 표시된 공급업체로부터 구입하였다: Na+/K+ ATPase, GFP 및 tubulin(Santa Cruz Biotech); c-Jun, p-c-Jun, ERK, p-ERK, c-MET, p-c-MET 및 GST(Cell Signaling Technol); V5, Myc(MBL); HA 및 b-액틴(Sigma); KITENIN(Atlas); His 및 RACK1, LC3, p62, Myo10 및 eEF2(Abcam). 이들은 적절한 2차 항체(Thermo)와 함께 사용되었다. 일시적인(transiene) 형질감염 분석을 위해 293T, Caco2 및 HCT116 세포를 다양한 플라스미드로 형질감염시키고 형질감염 48시간 후 면역블롯 분석을 위해 획득하였다. 안정한 세포주를 사용하는 대부분의 분석에서 혼합된 다클론 세포를 사용하여 클론 변이를 배제했다. 이전에 설명한 대로 세포 단백질을 분리, 전달 및 면역블롯팅했다(14). 293T, Caco2 및 HCT116 세포의 세포 용해물을 이전 논문에서 설명한 대로 면역침전 실험에 사용했다(15).
1-5. 세포내 분획화(Subcellular fractionation)
세포질 및 막 분획은 제조업체의 지침에 따라 세포내 단백질 분획 키트(Thermo Scientific)로 준비했다. 각 분획을 SDS-PAGE로 분석하고 V5 및 Myc에 대한 항체를 태깅하여 KITENIN에 대해 조사했다. 분획 순도는 세포질에 대한 튜불린 및 막 단백질에 대한 Na+-K+ ATPase에 대한 탐침(prob)에 의해 평가되었다.
1-6. 세포 침윤 분석(Cell invasion assay)
세포 침윤은 종전 논문에서 설명한 대로 트랜스웰(transwell) 이동 장치를 사용하여 측정되었다(14). 구체적으로, 배양된 세포를 24웰 침습 챔버 분석 플레이트(Costar)의 상단에 로드(load)하였다. 10㎍/ml의 피브로넥틴(fibronectin; Calbiochem) 및 1% FBS를 함유하는 조건화된(conditioned) DMEM 배지를 화학유인물질(chemoattractant)로서 하부 챔버에 첨가하였다. 16시간 또는 48시간(HCT116) 배양 후 세포를 염색했다. 필터의 상단 표면에 있는 세포는 면봉으로 닦아내고 바닥 표면의 이동된 세포를 각 필터에 대해 0.5 mm×0.5 mm의 임의의 정사각형 4개에 계수하였다. 그 결과는 최소 3개의 독립적인 실험에 대해 필드당 세포 수의 평균 ± SEM으로 나타내었다.
1-7. In situ PLA (In situ Proximity ligation assay)
Control-Caco2/EV 및 Caco2/KITENIN-Myc/HA 세포를 1% 아가로스에 포매하고 10% 중성 완충 포르말린 용액으로 밤새 고정하였다. 고정 후, 세포는 KITENIN의 태깅(tagging)에 대한 1차 항체로 4℃에서 밤새 염색하였다. 그 후 마우스 및 토끼 항체에 대한 이차 항체(Duolink® in situ proximity ligation assay Probes, Sigma-Aldrich)를 추가하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 명시야 탐지 시스템(Duolink® Brightfield in situ detection reagents, Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)이 슬라이드에 적용되었다(Duolink proximity ligation assay reagents Brightfield Protocol. 제공: https://www. sigmaaldrich.com/content/dam/sigmaaldrich/docs/promo_NOT_INDEXED/General_Information/1/duolink-pla-brightfield-protocol-msig.pdf). 사구체 신호의 밀도는 공초점 현미경을 사용하여 분석되었다.
1-8. 풀다운 분석(Pulldown assay)
GST-KITENIN 또는 이의 유도체는 글루타티온-세파로스 비드에 고정되었다. Myc 태그가 붙은 KITENIN은 지시된 대로 글루타티온-세파로스에 고정된 GST 태그 KITENIN 또는 이의 유도체와 함께 배양하였다. 결합된 단백질 복합체를 용리하고 SDS-PAGE에 이어 IB로 분석하였다. 시험관 내 KITENIN 동종이량체화를 검출하기 위해 완충액[50mM Tris.Cl(pH 7.5), 1mM 디티오트레이톨(DTT), 4%(v/v) 글리세롤, 0.1mg/ml의 BSA, 5mM MgCl2, 1mM ATP 및 50mM NaCl]에서 풀다운(pulldown)한 GST-KITENIN과 Ni-NTA 정제된 KITENIN-His 또는 KDIP(5M)와 함께 4℃, 2시간 동안 배양하였다. 배양 후, 비드를 세척 완충액(300mM NaCl을 포함하는 풀다운 완충액)을 사용하여 깨끗이 세척하고, 비드 결합 단백질을 SDS-PAGE에서 분해한 다음 표시된 항체를 사용하여 면역블롯 분석을 수행하였다.
1-9. RT-PCR 및 Q-PCR
RNA 준비 및 역전사를 종전 논문에 기재된 내용대로 수행하였다(14). RT-PCR 지수 단계(exponential phase)는 GeneAmp PCR 시스템(Eppendorf)과 동일한 반응에서 개발된 다양한 cDNA를 정량적으로 비교할 수 있도록 30주기로 설정하였다. Real-time PCR은 Rotor-gene(Qiagen)을 이용하여 수행하였다. 반응은 3개의 독립적인 실험에서 3회 수행하였다. 발현 데이터를 세포유지 유전자(housekeeping gene) GAPDH의 기하 평균으로 정규화하여 발현 수준의 가변성을 제어하고 앞서 설명된 바와 같이 2-DDCT 방법을 사용하여 분석하였다.
1-10. 자가포식소체 염색(Autophagosome staining)
KDIP가 KITENIN-발현 Caco2 세포에서 자가포식을 유도하는지 여부를 확인하기 위해 세포를 24시간 동안 커버슬립(coverslip)에서 성장시켰다. 세포를 PBS로 세척한 다음 세포 배양 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 Cyto-ID 녹색 형광 시약(Enzo Life Sciences, Plymouth Meeting, PA)으로 염색하였다. 세포를 PBS로 세척하고 핵 DAPI를 포함하는 Vectashield 장착 배지(Vectashield mounting medium)(Vector Lab)로 장착하였다. 세포는 공초점 현미경으로 이미지화하였다.
1-11. 생체 내 종양 성장 및 간 전이 모델
모든 동물 실험은 전남대학교 의과대학 연구기관 동물보호위원회의 지침에 따라 수행되었으며 모든 실험 프로토콜은 위원회의 승인을 받았습니다(CNU IACUC-H-2019-3).
CT-26 세포/동계 마우스 모델을 사용하여 KDIP가 결장직장 종양 형성에 미치는 생체 내 효과를 조사하였는데, 상기 동계 마우스 종양 모델은 후보 물질의 항암 효과를 테스트하는 데 유용한 것으로 보고되었기 때문이다(21, 22) 숫컷 Balb/c 마우스(5주령)를 다물사이언스(DaMul Science, 한국)에서 구입하여 동계 CT-26/KITENIN 세포(1×106)를 등쪽에 피하주사하기 전 1주일 동안 적응시켰다. 종양 부피는 다음 방정식을 사용하여 계산되었다: Ｖ= 1/2×a×b2, 여기서 a및 b는 각각 종양의 가장 긴 지름과 가장 짧은 지름(mm 단위)이다. KDIP의 효과를 확인하기 위해 19일 동안 격일로 종양 부피를 측정하였다. 30일 후에 모든 마우스를 희생시켰고, 피하 종양 이식편을 외과적으로 절제하고 무게를 측정하였다.
간 전이 분석을 위해 5-6주령 Balb/c 마우스를 오리엔트바이오사(OrientBio, Inc., 한국 성남)에서 구입하여 물과 음식에 자유롭게 접근할 수 있는 금속 케이지에 수용하였다. 결장직장 간 전이의 동계 마우스 모델은 종양 세포를 비장내 주입을 통해 문맥계로 투여함으로써 확립되었다(23). 구체적으로, CT-26/KITENIN-iRFP 발현 세포(2×105 cell/mouse)를 비장에 투여하였다. CT-26 세포 주입 15분 후 비장절제술을 시행하였다. 마우스를 무작위로 두 그룹으로 나누었다: 스크램블된(scrambled) 펩타이드(0.1% DMSO) 및 KDIP(5mg/ml). 각 펩타이드는 종양 세포 접종 7일 후 2주 동안 6회 정맥 주사하였다. 간에서 직경이 1.0 mm 이상인 전이성 종양 결절을 현미경으로 계수하고 결절 크기에 따라 0(총 전이 없음), 1(종양 크기 >1 mm), 2(종양 크기 >5 mm) 및 3(종양 크기 >10 mm). 전이 점수에 결절의 수와 점수를 곱하였다. iRFP를 발현하는 간 결절의 형광 영상은 FOBI(Fluorescence-labeled Organism Bioimaging Instrument; Cellgentek, Korea)를 사용하여 촬영하였고, 간 결절에서 방출되는 총 형광을 측정하여 군간 비교하였다.
1-12. 통계
실험 결과는 ANOVA를 사용한 후 Tukey HSD 사후 테스트(Tukey HSD post hoc test) 또는 스튜던트 t 테스트(Student's t test)를 사용하여 통계적 유의성을 테스트하였다. 모든 통계적 검정은 양측이었으며 0.05 미만의 P-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 통계 분석은 PASW Statistics 20 소프트웨어(SPSS, IBM Company, Chicago, IL)를 사용하여 수행되었다.
실험 결과
2-1. KITENIN의 세포내 C-말단 영역은 KITENIN 단백질의 동종이량체화 및 안정성에 기여한다.
KITENIN 복합체는 CRC의 진행과 전이에서 중요한 역할을 하지만((15,17,19) 단백질이 구조적 완전성과 안정성을 유지하는 방법에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 분자의 동종올리고머화(homooligomerization)가 단백질이 크고 안정적인 구조를 형성하도록 한다는 점을 감안할 때(1, 3-5), 먼저 KITENIN 단백질이 동종-올리고머 복합체를 형성하는지 여부를 조사하였다.
KITENIN과 상호작용하는 단백질을 확인하기 위해 먼저 Myc-Tag 항체로 KITENIN-myc 과발현 293T 세포의 총 단백질 함량을 면역침전시키고 SDS-PAGE를 사용하여 침전된 단백질을 크기별로 분리하였다. 130kDa 밴드가 분리되어 PMF(peptide mass fingerprint)에 의해 KITENIN으로 식별되었다(도 1(A) 참조). 밴드 크기가 KITENIN 단량체의 약 2배였기 때문에 KITENIN의 동종이량체화된 형태라고 가정하였다. 그 후 두 가지 다른 KITENIN 태그 구조체(KITENIN tagging constructs)로 형질 감염된 세포에서 Western blot 및 co-immunoprecipitation (co-IP) 분석을 수행하였다. 각각 V5 또는 myc 에피토프(epitope)에 대한 항체를 사용한 면역블롯은 형질감염된 세포에서 KITENIN의 단량체의 공동 발현이 확인되었다(도 1(B) 참조). HEK293T 세포(도 1(B) 참조)에서 KITENIN-V5와 KITENIN-myc 사이의 상호 작용을 관찰했지만 Caco2 및 HCT116 세포와 같은 CRC 세포주에서도 관찰하였다(도 2(A) 및 (B) 참조). 이량체 결합에 참여하는 도메인을 확인하기 위해 KITENIN 단백질의 각 도메인을 GST 박테리아 발현 시스템을 사용하여 발현시켰다. KITENIN 단백질은 4개의 잘린 형태로 나뉘었다: 전장, 결실된 C-말단 도메인(DC; CTD), 결실된 N-말단 도메인(DN; NTD), 결실된 N 및 C-말단 도메인(DNDC; TM, 막횡단 도메인)(도 3 참조). 전체 길이의 KITENIN-myc를 발현하는 293T 세포의 용해물과 정제된 GST 융합 절단된 형태를 glutathione-sepharose bead로 풀다운(pull down)한 다음 myc 항체와 반응시켜 KITENIN의 이량체화(dimerization) 부위를 검출하였다. KITENIN C-말단 영역이 결실된 경우, 단백질은 myc 항체에 의해 검출되지 않았으며, 이는 KITENIN의 이량체가 세포내 C-말단 도메인을 통해 발생했음을 의미하였다(KITENIN-CTD, 도 4 참조). 세포에서 KITENIN이 이량체화되는 위치를 결정하기 위해 세포막 분획의 IP를 수행하였다. 세포막에 걸쳐 있는 단백질인 KITENIN이 세포막에서 이량체를 형성함을 관찰하였다(도 5(A) 참조). 이량체화 반점(dimerization spot)은 또한 근접 결찰 분석(proximity ligation assay)을 사용하여 공초점 현미경으로 적색 형광으로 관찰할 수 있었다(도 5(B) 참조). 이러한 KITENIN의 이량체화가 cis(동일한 세포 표면에서) 또는 trans(다른 세포에 걸쳐) 형성에서 발생했는지 확인하기 위해 co-IP 실험을 수행하였다. 2개의 Caco2 세포 집단을 KITENIN-V5 또는 KITENIN-myc로 형질감염시켰다. 공동 배양 조건에서 KITENIN-myc 및 KITENIN-V5 단백질은 서로 상호 작용하지 않았다. 반면에, KITENIN-myc와 KITENIN-V5 사이의 상호간의(reciprocal) 상호작용(interaction)은 공동 발현 조건에서 관찰되었다(도 6 및 7 참조). 따라서 KITENIN 동종이량체는 시스 형태로만 존재함을 확인할 수 있었다.
다음으로 세포내 C-말단 영역을 통해 이량체화가 발생함을 관찰하였기에 KITENIN-CTD의 발현이 KITENIN의 이량체화에 영향을 미치는지 여부를 조사하였다. 흥미롭게도, KITENIN-CTD의 이소성(ectopic) 과발현 후 KITENIN의 이량체화가 감소하였다(도 8(A) 참조). 또한, 야생형 KITENIN(KITENIN-GOF)의 발현으로 인한 증가된 세포 침윤은 KITENIN-CTD의 동시발현 후 빈(empty) 벡터의 발현과 유사한 수준으로 회복되었다. 대조적으로, KITENIN-GOF로 인한 증가된 세포 침윤은 KITENIN의 N-말단 영역(NTD)의 공동 발현에 의해 영향을 받지 않았다(도 8(B) 참조). 이러한 결과는 KITENIN-CTD의 이소성 발현이 단백질 수준에서 KITENIN 동종이량체화를 방해함을 시사하였다. 전반적으로, 이러한 결과는 KITENIN 동종이량체가 KITENIN 단백질의 안정성 및 발암성 기능에 중요하며 KITENIN-CTD에 의한 KITENIN-GOF의 억제가 동종이량체화의 조절장애를 통한 것일 수 있음을 의미한다. 즉, KITENIN-CTD는 다른 전장 KITENIN 분자와의 경쟁적 상호작용에 의해 동종이량체화를 하향조절할 수 있지만 또한 KITENIN 이량체의 안정성을 유지하는 미확인 분자의 조절을 통해 동종이량체를 파괴함으로써 동종이량체화를 하향 조절할 수 있다.
2-2. KITENIN의 이량체화를 방해하는 KITENIN-CTD 내 후보 펩타이드 서열의 확인
KITENIN-CTD의 과발현은 KITENIN의 이량체화를 억제하였기 때문에 본 발명자들은 다음으로 직렬 결실 구조체(serial deletion constructs)를 사용하여 CTD 내의 책임 영역(responsible region)을 동정하고자 하였다. 3개의 결실 구조체(1-339, 1-394, 1-449)의 강제 발현은 야생형 KITENIN에 비해 증가된 세포 침윤을 초래한 반면, 1-487 구조는 KITENIN-CTD와 유사하게 세포 침윤을 감소시켰다. 이러한 결과는 KITENIN의 449-487 영역이 이량체화 및 세포 침윤에 대한 억제 효과를 담당할 수 있음을 의미하였다(도 9(A) 및 도 9(B) 참조). 그 영역을 좁히기 위해 KITENIN의 449-487 영역을 10-mers 이하로 분할하여 여러 펩타이드를 설계하고 인간 전사 인자 Hph-1에서 유래된 세포 투과성 펩타이드 서열(YARVRRRGPRR; CPP)에 융합하였고(표 1 및 도 10 참조) (24, 25), KITENIN 이량체화에 대한 각 펩타이드의 억제 효과를 실험하였다. 도 12 및 도 13에 나타난 바와 같이, 463-471 펩타이드 서열은 KITENIN 과발현으로 인한 이량체화 및 세포 침윤을 억제하는데 가장 효과적이었다. 따라서 이 펩타이드 서열을 KDIP(KITENIN dimerization-interfering peptide)라고 명명하였다. 효율적인 세포 투과성, 이량체 간섭 및 침윤 억제에 대한 KDIP의 효과에 가장 적합한 펩타이드-링커를 찾기 위해 다양한 다른 CPP 또는 종양귀소서열(tumor-homing sequence)을 KDIP에 부착하고(표 2 및 도 14 참조) 실험하였다. 그 결과, KITENIN의 이량체화가 KDIP-CPP 또는 종양귀소펩타이드에 의해 유사한 정도로 억제하였지만, KDIP-CPP가 세포 침윤에 대한 최고의 억제 효과를 나타내었다(p<0.001)(도 15 및 16 참조). 따라서, KITENIN-CTD에서 유래된 KDIP 펩타이드는 KITENIN의 과발현으로 인한 이량체 형성 및 세포 침윤을 효과적으로 억제할 수 있었다.
서열번호 위치 KITENIN-CTD
4 449-456 펩타이드 PTLQYDKD
5 455-462 펩타이드 KDRWLSTQ
6 462-469 펩타이드 QWRLVSDE
7 463-471 펩타이드 WRLVSDEAV
8 467-474 펩타이드 SDEAVTNG
9 473-480 펩타이드 NGLRDGIV
10 480-487 펩타이드 VFVLKCLD
이름 서열 서열번호
CPP
(Cell penetration peptide)		 Hph-1 YARVRRRGPRR-WRLVSDEAV 11
TAT(47-57) YGRKKRRQRRR-GFLG-WRLVSDEAV 12
Penetratin RQIKIWFQNRRMKWKK-GFLG-WRLVSDEAV 13
Tumor Homing peptide EGFR-1 KCCYSL-GFLG-WRLVSDEAV 14
EGFR-2 AEFLR-GFLG-WRLVSDEAV 15
2-3. 6개의 아미노산으로 구성된 펩타이드의 KITENIN 단백질의 이량체 형성 억제 및 세포 침윤 억제 효과 확인
상기한 2-2의 실험으로부터 462-469 펩타이드(QWRLVSDE, 서열번호 6), 463-471 펩타이드(WRLVSDEAV, 서열번호 7), 및 467-474 펩타이드(SDEAVTNG, 서열번호 8)가 KITENIN 이량체의 형성 및 이로 인한 세포 침윤 억제 효과가 있음을 확인하고, 이러한 효과를 나타내는 최소 크기의 펩타이드를 밝히고자 하였다.
구체적으로, 도 54에서 볼 수 있는 바와 같이, 462-469 펩타이드(QWRLVSDE, 서열번호 6), 463-471 펩타이드(WRLVSDEAV, 서열번호 7), 및 467-474 펩타이드(SDEAVTNG, 서열번호 8) 사이의 아미노산 범위를 좁혀 6개의 핵심 아미노산 서열로 이루어진 465-470 펩타이드(LVSDEA, 서열번호 16)를 제조하고 상기 2-2와 동일한 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 55에서 볼 수 있는 바와 같이, 465-470 펩타이드(LVSDEA, 이하 'KDIP-6'이라 함)를 Caco2 세포(CRC)에 처리하였을 때 463-471 펩타이드(WRLVSDEAV, 이하 'KDIP-9'이라 함)를 처리한 경우와 동등한 수준으로 KITENIN 발현량을 감소하였으며(도 54(A) 참조), 과발현된 KITENIN으로 인한 증가된 세포 침윤을 억제하였다(도 54(B) 참조).
또한, KDIP-6의 처리는 KDIP-9을 처리한 경우와 동일하게 KITENIN의 이량체 형성을 억제하였고(도 56 참조), 농도 의존적으로 KITENIN이 과발현된 Caco2 CRC 세포의 세포 침윤을 감소시켰다(도 57 참조).
2-4. KDIP는 KITENIN 단백질의 동종이량체화 및 안정성을 감소시킨다
다음으로 KITENIN-CTD 과발현이 KITENIN 수준과 이량체화 수준에 미치는 영향이 전사 수준인지 단백질 수준인지 확인하였다. 그 결과, KITENIN 전사체의 수준이 KITENIN-WT 또는 KITENIN-NTD의 강제 발현 후와 KITENIN-CTD의 강제 발현 후 거의 동일하다는 것을 발견하였으며(도 17), 이는 KITENIN-CTD에 의한 KITENIN의 이량체화 및 단백질 양의 감소가 단백질 수준에 대한 영향으로 간주될 수 있음을 의미한다. KITENIN-CTD와 마찬가지로, KDIP 처리는 세포막 분획에서 KITENIN을 감소시켰으며, 사용된 KITENIN 전사체와 무관하게 48시간에서 가장 큰 감소를 보였습니다(도 18). 또한, KITENIN-CTD의 경우처럼, KDIP 처리는 KITENIN의 동종이량체화 및 KITENIN 과발현에 의한 세포 침윤을 감소시켰다(도 19). 추가적으로, 비환원/비변성 조건에서 SDS-PAGE에 의한 KITENIN의 이량체화에 대한 KDIP의 효과를 재확인하였다. 그 결과, 130-kDa KITENIN 동종이량체 밴드와 70-kDa KITENIN 단량체 밴드도 KDIP 처리 후 감소되었음을 발견하였다(도 20(A) 참조). 또한, KITENIN 단백질의 이량체화는 다른 태그를 가진 2개의 정제된 KITENIN 단백질이 시험관 내에서 풀다운될 때 KDIP 처리에 의해 직접 감소되었다(도 20(B) 참조). 따라서 본 발명자들은 KDIP 처리 후 KITENIN 이량체의 감소가 단백질 안정성에 중요한 특정 영역의 노출 후 KITENIN의 분해 결과일 수 있다고 가정하였다. KITENIN 단백질의 이량체화는 구조적 장애를 통해 이러한 영역의 노출을 방지할 수 있다.
다음으로 KDIP 처리 후 증가된 KITENIN 분해에 463-471 펩타이드 서열이 필요한지 확인하기 위해 돌연변이 KITENIN 구조체(D463-471-KITENIN, 도 21(A) 왼쪽)를 제조하였다. D463-471-KITENIN은 WT-KITENIN과 같은 동종이량체를 형성했지만 이량체화 및 KITENIN 단백질 감소에 대한 KDIP의 효과는 관찰되지 않았다(도 21(A) 오른쪽). 또한, D463-471-KITENIN의 과발현은 WT-KITENIN의 과발현과 마찬가지로 세포 침윤을 증가시켰지만, D463-471-KITENIN에 의한 증가된 세포 침윤에 대한 KDIP의 억제 효과는 관찰되지 않았다(도 21(B)). 따라서, 463-471 펩타이드 서열은 KDIP 처리 후 KITENIN의 연속적 분해에 필요하고 KDIP 후 KITENIN 이량체의 분해는 과발현된 KITENIN으로 인한 증가된 세포 침윤 억제를 초래하였다.
2-5. KDIP 처리는 RACK1과 KITENIN의 결합 및 KITENIN 분해를 가속화한다.
KITENIN(Vangl1)은 막 단백질이며 막에서의 국소화(localization)는 PCP 경로의 구성요소로서 극성을 유지하는 역할에 필수적이다(26, 27). RACK1은 PCP 신호 전달 및 Vangl2의 막 국소화(membrane localization)를 유지하는 것으로 알려져 있다(28). 그 결과 RACK1이 자가포식 의존적 분해를 통해 Dvl2 및 KITENIN의 수준을 제어할 수 있는 KITENIN 복합체의 다운스트림 신호전달에 관여하는 분자에 대한 어댑터(adaptor) 단백질 역할을 한다는 것을 발견하였다(23). RACK1이 KITENIN과 직접 상호작용하는지 여부를 확인하기 위해 RACK1-GFP 및 KITENIN-V5를 공동 발현하는 Caco2 세포에서 GFP에 대한 항체를 사용한 IP 실험을 하였고, RACK1이 KITENIN과 결합함을 발견하였다(도 22). 흥미롭게도, RACK1-GFP의 과발현 후 KDIP로 처리하면 RACK1에 대한 KITENIN의 결합이 증가하고 KITENIN 단백질이 감소하였다(도 23). KDIP 처리 후 KITENIN 이량체화가 깨져(broken) 이량체화에 의해 마스킹된 영역이 노출되고 KITENIN에 대한 RACK1의 결합이 증가하는 구조적 변화가 발생했음을 유추할 수 있었다. 본 발명자들은 KITENIN의 463-471 아미노산 서열이 KITENIN 이량체 유지에 관여하는 감추어진 영역(masked area)이라고 가정했으며 D463-471-KITENIN-V5 및 GFP-RACK1을 사용하여 co-IP로 테스트하였다. WT-KITENIN과 달리 D463-471-KITENIN은 RACK1과 결합하지 않았다(도 22). 종합적으로, 이러한 결과는 KITENIN 내의 463-471 펩타이드 서열이 RACK1과 KITENIN의 결합에 필요하며, 또한 KITENIN이 이량체화된 형태일 때 이 부위가 구조적으로 감추어져서 RACK1과의 결합이 방해된다는 것을 나타내었다. 따라서 본 발명자들은 CTD의 463-471 aa 서열을 RACK1-상호작용 모티프(RACK1-interacting motif; RIM)라고 명명하였다.
다음으로 KDIP 처리 또는 KITENIN-CTD 형질감염에 의한 KITENIN 분해에 RACK1이 필요한지 여부를 확인하였다. 도시된 바와 같이, KITENIN은 RACK1이 과발현될 때 KDIP(도 25(A) 및 25(B)) 또는 KITENIN-CTD(도 27(A) 및 27(B))에 의해 추가로 감소되었다. RACK1의 형질감염만으로는 KITENIN 함량이 변경되지 않았다. 그러나 RACK1 과발현이 있는 상태에서 세포를 KDIP 또는 KITENIN-CTD로 처리하면 KITENIN 함량이 더 감소하였다. 이러한 결과는 KDIP 처리 또는 KITENIN-CTD의 형질감염이 KITENIN과 RACK1의 결합 증가를 통해 KITENIN 분해를 유도함을 의미한다. RACK1이 RACK1에 특이적인 siRNA를 처리하여 녹다운되었을 때 KDIP(도 27) 또는 KITENIN-CTD(도 29)가 KITENIN 단백질의 양을 감소시키는 효과를 약화시켰다. KITENIN 함량과 대조적으로 KITENIN에 의한 증가된 세포 침윤은 RACK1의 발현에 의해 억제되었다(도 25(A) 및 (B)). RACK1이 동시 과발현되었을 때, KDIP는 KITENIN 단독으로 발현되었을 때보다 세포 침윤에 대한 더 큰 억제 효과를 보인 반면(도 25(A) 및 (B)), si-RACK1 처리하에서는 KDIP가 세포 침윤에 대한 억제 효과를 나타내지 않았다(도 26(A) 및 (B)). 마찬가지로, KITENIN-CTD에 의한 감소된 세포 침윤은 RACK1의 과발현에 의해 더욱 가속화되었지만(도 27(A) 및 (B)), si-RACK1 처리는 세포 침윤에 대한 KITENIN-CTD의 억제 효과를 차단하였다(도 28(A) 및 (B)).
2-6. RACK1은 자가포식 경로를 통해 KDIP 처리 후 KITENIN 분해를 촉진한다.
RACK1은 리보솜에 결합하여 mRNA 번역 및 단백질 합성에 영향을 미치는 것으로 보고되었다(29). RACK1이 KITENIN 단백질 합성에 영향을 미칠 가능성을 배제하기 위해 번역 차단제(translation blocker)인 시클로헥시미드(cycloheximide)로 세포를 전처리하고 KITENIN 함량을 조사했다. 그 결과, KITENIN 단백질의 분해가 EV-형질감염된 대조군 세포와 비교하여 사이클로헥시미드(cycloheximide)로 전처리된 세포에서 과발현된 RACK1에 의해 가속화된다는 것을 발견하였다(도 29). 대부분의 경우 단백질은 단백질분해효소(peoteasome)나 리소좀으로 분해된다. KDIP 또는 KITENIN-CTD에 의한 KITENIN 분해의 원인이 되는 경로를 설명하기 위해 단백질분해효소 억제제(proteasome inhibitor)인 MG132, 리소좀 억제제(lysosome inhibitor)인 바필로마이신(bafilomycin) A1(BFA1) 및 클로로퀴네(cloroquine)(CQ), 또는 자가포식 억제제(autophagy inhibitor) 3-MA로 전처리한 후 세포 내 KITENIN 함량을 조사하였다. KDIP(도 30) 또는 KITENIN-CTD(도 31)에 의한 KITENIN의 분해는 BFA1, CQ 및 3-MA에 의해 약화되었지만 MG132는 약화되지 않았으며, 이는 KDIP 또는 KITENIN-CTD가 리소좀-자가포식 경로를 통해 KITENIN의 분해를 촉진함을 시사하였다. 더욱이, 자가포식의 특징 중 하나인 LC3의 수준은 KDIP 처리 후 증가하였고(도 32(A)), 이 효과는 자가포식 억제제 3-MA 처리에 의해 감소되었다(도 32(B)). 또한 KDIP 처리가 자가포식 유도에 미치는 영향을 분석하기 위해 cytoID 염색을 통해 KDIP 처리 후 자가소화포(autophagosome)의 변화를 관찰하였다. 자가소화포(autophagosome)의 형성은 양성 대조군인 rapamycin의 효과와 유사하게 KDIP에 의해 증가되었다(도 32(C)).
한편, 상기 2-3 실험에서 KDIP-9와 동등한 정도의 KITENIN 이량체 형성 억제 및 세포 침윤 억제 효과를 나타내는 KDIP-6에 대하여도 상기와 동일한 실험을 수행하였다.
그 결과, 상기 실험 결과와 동일하게 KDIP-6에 의한 KITEIN의 분해는 3-MA에 의해 약화되었지만 MG132는 약화되지 않았는데(도 58 참조), 이는 KDIP-6가 KDIP-9와 동일하게 리소점-자가포식 경로를 통해 KITENIN의 분해를 촉진함을 시사하였다.
2-7. Myo10은 RACK1이 RIM에 결합하는 것을 방해하여 안정적인 KITENIN 이량체 상태를 유지하는 역할을 한다.
KDIP 처리 후 RACK1과 KITENIN의 결합 증가가 KITENIN의 분해를 유발함을 관찰함에 따라, KITENIN이 동종이량체로 존재할 때 RACK1 상호작용 도메인이 구조적으로 숨겨져 있거나 마스킹되어 있기 때문에 RACK1과 KITENIN의 상호작용이 방해된다는 가설을 세웠다. KITENIN 이량체의 안정성을 유지하는 또 다른 KITENIN 상호 작용 분자가 KDIP 처리 후 조절된다면, KDIP 처리 후 KITENIN 이량체가 분해될 것이고, 연속하여 RIM도 노출되므로, 이에 의하여 RACK1과 RIM의 상호 작용에 의해 KITENIN이 분해될 수 있을 것이다. 이 가능성을 실험하기 위해 KDIP 처리된 Caco2 세포를 KITENIN 항체로 면역침전시킨 후 SDS-PAGE로 분리하고 KDIP 처리 후 변화하는 밴드를 잘라내어 단백질 시퀀싱을 수행하였다. 이러한 방식으로 본 발명자들은 myosin superfamily(30)의 여러 액틴 기반 모터 분자(actin-based motor molecules) 중 하나인 Myosin-X(Myosin10 또는 Myo10)와 단백질 합성에 필수적인 GTP-binding translation elongation factor family의 구성원(31)인 eEF2(eukaryotic elongation factor 2)를 확인하였다 (도 33(A)). KITENIN으로 형질감염된 Caco2 세포에서 두 단백질의 내인성 수준을 확인했을 때 Myo10의 양은 증가했지만 eEF2의 양은 증가하지 않았다(도 33(B)). 또한 Caco2/KITENIN-V5 세포에서 KDIP 처리 후 eEF2에 대한 KITENIN의 결합은 약간 감소했지만 Myo10에 대한 KITENIN의 결합은 실제로 없어졌다(도 33(C)). 두 단백질이 KITENIN의 안정성에 기여할 수 있는지 확인하기 위해 Myo10 또는 eEF2에 특이적인 siRNA로 처리하여 두 단백질을 녹다운한 후 RACK1과 KITENIN의 결합을 조사하였다. 흥미롭게도, RACK1과 KITENIN의 상호 작용은 eEF2 또는 Myo10의 하향 조절에 의해 실질적으로 영향을 받지 않았다(도 34(A) 및 (B)). 그러나, KITENIN에 대한 RACK1의 결합은 KDIP 처리 후 증가되었고 KDIP의 이러한 효과는 eEF2의 녹다운(도 34(A))과 비교하여 Myo10(도 34(B))의 녹다운 후에 증가되었다. 일관되게, KDIP는 eEF2-녹다운 하에서 KITENIN의 양을 추가로 감소시킨 반면(도 35(A) 및 (B)), Myo10이 녹다운되었을 때 KITENIN 수준에 대한 KDIP의 추가 억제 효과는 관찰되지 않았다(도 35(A) 및 (B)). KITENIN의 안정성에 대한 두 단백질의 기여를 확인하기 위해 siRNA에 의한 Myo10 또는 eEF2의 녹다운이 KITENIN 형질감염된 세포의 세포 침습성에 대한 KDIP의 효과를 변경하는지 여부를 조사하였다. 그 결과, KITENIN의 과발현으로 인한 증가된 세포 침윤이 이 두 단백질의 하향 조절에 의해 크게 감소되었음을 발견하였다(도 35 및 36). 그러나, 과발현된 KITENIN으로 인한 증가된 세포 침윤성에 대한 KDIP의 억제 효과는 eEF2가 녹다운되었을 때 여전히 명백했지만(도 35) Myo10의 녹다운에서는 그렇지 않았다(도 36).
2-8. Myo10은 KITENIN의 막횡단 부분과 상호작용하고 KITENIN 동종이량체를 안정화한다.
Myo10은 뉴클레오티드 결합 부위와 액틴 결합 부위가 있는 모터(motor) 또는 헤드(head) 도메인; 3개의 칼모듈린(calmodulin) 분자를 결합하는 IQ 또는 넥(neck) 도메인; 단일 α-나선 영역과 이량체화에 관련된 것으로 추정되는 코일-코일 영역(coiled-coil region)이 뒤따르는 C-말단 테일(tail) 도메인; 특정 프로테아제(protease)에 대한 감수성을 부여하는 3개의 PEST 서열; 3개의 플렉스트린 상동성(pleckstrin homology; PH) 도메인; 미세소관에 결합하는 미오신 테일(tail) 상동성 4(MyTH4) 도메인; 및 밴드 4.1, Ezrin, Radixin, Merlin(FERM) 도메인(30, 32)을 가지고 있다. Myo10은 세포의 앞쪽 가장자리에서 발견되는 액틴이 풍부한 손가락 모양의 돌출부인 유충(filopodia)의 끝 부분에 위치하며(32), 세포 이동, 상처 치유, 세포외 기질에 대한 접착, 화학 유인 물질에 대한 안내, 신경 성장-원주 경로 파인딩(neuronal growth-cone path finding), 배아 발달 및 종양 형성에 관여하는 것으로 여겨진다(33).
본 발명자들은 Myo10 수준이 KDIP 처리 후 조절되고 이 변화는 KDIP가 KITENIN 분해에 미치는 영향에 필수적이라고 가정하였다. 따라서 본 발명자들은 Myo10의 조절이 KITENIN의 안정성에 영향을 미치는지 여부를 확인하고자 하였다. 먼저 Myo10의 어느 도메인이 KITENIN의 어떤 부분과 상호 작용하는지 실험하였다. 흥미롭게도 Myo10은 C-말단 FERM 도메인(도 38)을 통해 KITENIN의 막횡단 부분에 결합하였다(도 37). Myo10은 N-말단 헤드 도메인을 통해 기본 액틴 세포골격과 결합하기 때문에(30) 이 결과는 Myo10이 KITENIN의 막횡단 부분 내에서 세포내 세포질 루프와 상호 작용함을 나타낸다. KITENIN의 녹다운은 Myo10의 수준에 영향을 미치지 않은 반면, Myo10의 녹다운은 KITENIN 수준을 감소시켰으며(도 39), 이는 Myo10이 KITENIN의 발현 조절제 역할을 함을 나타낸다. 또한, Myo10의 녹다운은 KITENIN 이량체의 형성을 감소시켰지만(도 40) RACK1과 KITENIN의 상호 작용을 향상시켰고 KITENIN의 분해를 증가시켰다(도 34(B)). 따라서 KITENIN 동종이량체의 분해 및 KDIP 처리 후 KITENIN의 후속 분해는 Myo10의 하향 조절에 의해 유발된다.
2-9. Myo10은 KDIP 처리 후 단백질분해효소(proteasome) 분해를 통해 감소된다.
KDIP로 처리한 후 KITENIN의 분해는 MG132로 전처리하였을 때 다소 회복되지만 리소좀-자가포식 경로의 억제제로 전처리하는 경우 완전히 회복되었기 때문에(도 30), 추가로 단백질분해효소(proteasome) 또는 리소좀 분해 경로가 KDIP에 의한 Myo10 감소에 영향이 있는지 확인하고자 하였다. 이 실험을 위해 단백질분해효소(proteasome) 억제제 MG132, 리소좀 억제제 클로로퀸(CQ) 및 자가포식 억제제 3MA로 세포를 전처리하였다. 그 결과, KDIP 처리 후 Myo10의 감소가 MG132를 사용한 전처리에 의해 회복되었지만 CQ 또는 3-MA를 사용한 전처리에 의해 회복되지 않았으며(도 41), KDIP에 의해 촉진된 KITENIN의 분해가 MG132에 의해 다소 약화되었음을 발견하였다. 세포 독성으로 인하여 수확 전 4시간 동안 세포를 MG132로 전처리하였기 때문에 이러한 결과는 KDIP 처리 후 Myo10의 감소가 KDIP에 의한 KITENIN의 분해에 중요한 사건임을 시사한다. 흥미롭게도 Myo10은 KITENIN-CTD의 형질감염 후에도 감소하였다(도 42). KDIP 처리 후 Myo10 감소에 대한 MG132의 효과를 검증하기 위해 세포 침윤 분석을 사용하여 시험관 내 표현형 분석을 수행하였다. 이 실험에서, 단백질분해효소 억제제 MG132의 전처리는 모(parent) Caco2 세포에서 세포 침윤이나 KDIP의 효과에 영향을 미치지 않았지만 KITENIN-과발현된 Caco2 세포에서 증가된 세포 침윤에 대한 KDIP의 억제 효과를 차단하였다(도 43). 이러한 결과는 KITENIN-CTD 또는 KDIP가 Myo10의 하향 조절(downregulation)을 통해 KITENIN 동종이량체의 분해를 유발함을 나타낸다.
E3-리가제 Nrdp1이 기능적 KITENIN/ErbB4 복합체 내에서 KITENIN-CTD와 상호작용하고 KITENIN 결합 Dvl2의 단백질분해효소적(proteasomal) 분해를 매개하여 EGF-KITENIN/ErbB4-c-Jun 축에서 c-Jun을 생성하기 때문에(34) Nrdp1이 또한 KDIP에 의해 유도된 단백질분해효소(proteasome) 분해에 관여하여 KITENIN의 막횡단 부분에도 결합되는 Myo10의 하향조절에 관여하는지 확인하였다(도 37). 먼저 KDIP가 E3-ligase Nrdp1에 의해 조절된 후 Myo10의 안정성을 테스트하기 위해 Nrdp1의 존재 여부에 관계없이 단백질 합성을 억제하는 시약인 사이클로헥시미드(cycloheximide)로 처리한 후 Myo10의 양을 모니터링하였다. 그 결과, KDIP 처리 후 KITENIN과 Myo10의 발현이 모두 감소한 것으로 나타났다. 그러나 이러한 조건에서 Nrdp1이 형질감염되면 KITENIN과 Myo10의 수준이 더 감소하였다(도 44). 다음으로, Myo10의 유비퀴틴화(ubiquitination)에 대한 Nrdp1의 효과를 조사하였고 KDIP에 의해 유도된 Myo10의 유비퀴틴화가 Nrdp1의 강제 발현에 의해 현저히 증가되었음을 발견하였다(도 45). 도 46에 도시된 바와 같이, KDIP 처리 후 관찰된 KITENIN의 강제 발현에 의한 증가된 세포 침윤의 억제 및 Myo10 및 KITENIN의 감소된 발현의 억제와 같은 이러한 효과는 Nrdp1의 녹다운에 의해 회복되었다. 이러한 결과는 E3-리가제 Nrdp1이 KDIP 후 Myo10의 단백질분해효소(proteasome) 분해에도 책임이 있음을 나타낸다. 이러한 데이터를 다음과 같이 해석할 수 있다. KDIP 처리 후, 먼저 Myo10의 E3-리가제 Nrdp1 매개 단백질분해효소(proteasome) 분해가 유도되었고, 두 번째로 하향 조절된 Myo10은 리소좀-자가포식 경로 의존적 방식으로 KITENIN의 분해를 초래하였다.
종합적으로, 상기 실험의 결과를 다음과 같이 요약할 수 있다: KITENIN은 세포막에서 이량체를 형성하여 안정성을 달성하기 때문에 KITENIN의 발암 기능은 세포막에서도 이벤트(event)가 될 것이다. Myo10은 KITENIN의 막횡단 부분의 두 세포내 세포질 루프를 묶어 KITENIN 동종이량체의 cis 형태를 안정화했다. 단백질분해효소(proteasome) 분해를 통한 KDIP 후 Myo10의 하향 조절은 KITENIN 이량체의 느슨해짐과 분해를 초래하여 RIM 부위를 노출시켜 RACK1과 노출된 RIM의 상호작용을 증가시켜 자가포식 의존적 방식으로 KITENIN의 분해를 촉발한다(도 47).
2-10. KDIP 처리는 생체 내에서 CRC의 종양 성장 및 간 전이를 억제한다
먼저 BALB/c 마우스와 CT-26 쥐 결장 선암종 세포주에서 동계 종양 모델을 사용하여 KDIP가 생체 내 항종양 효과가 있는지 여부를 조사하였다. KDIP의 생체 내 효과를 조사하기 전에 CT-26 세포의 시험관 내 침윤성에 대한 KDIP의 효과를 실험하였다. 세포 침윤 분석은 KITENIN-V5를 안정적으로 발현하는 CT-26/KITENIN-V5 세포로 수행되었으며, 스크램블(scrambled) 펩타이드와 비교하여 KDIP의 용량을 증가시키면 유의하게 감소되었다(도 48). 생체 내 실험을 위해 BALB/c 마우스의 오른쪽 등에 CT-26/KITENIN-V5 세포를 주입하여 종양을 형성하고 도 49에 표시된 타임라인에 따라 KDIP를 정맥 주사하였다. CT-26 세포의 세포 침윤에 대한 KDIP의 억제 효과를 고려하여 초기 시험 용량을 1 mg/kg으로 설정하였고, 이는 세포 침윤에 대한 KDIP의 최대 억제 농도(IC50)의 절반에 해당한다. 후속 실험에서 KDIP의 투여량을 5 mg/kg으로 증량하였다. KDIP는 세포주사 후 7일째부터 2주간 정맥 주사를 통해 격일로 투여하였다. 2주 치료 후, 마우스를 희생시키고 종양을 분석하였다. 종양 부피는 KDIP에 의해 상당히 감소되었으며, 이 효과는 사용된 KDIP의 투여량에 따라 달라졌다(도 50).
다음으로 CRC의 간 전이 마우스 모델을 사용하여 KDIP의 항 종양 효과를 추가로 실험하였다. 실험 모델을 만들기 위해 동계 마우스에서 안정적으로 CT-26/KITENIN-iRFP를 발현하는 세포의 비장 내 접종을 수행했으며 마우스는 문맥을 통해 간으로 주입된 CT-26/iRFP/KITENIN- V5 세포의 이동을 위해 후속 비장 절제술 후 2주 동안 회복되도록 하였다. 2주 동안, 마우스에 격일로 KDIP를 정맥 주사하였다. iRFP를 발현하는 종양 결절에서 방출되는 총 형광을 검출하여 간 전이를 평가하였다. 간 결절의 형광은 스크램블 펩타이드 그룹의 형광과 비교하여 KDIP의 투여량 증가에 의해 유의하게 감소되었다(도 51 및 52). 또한 두 그룹에서 수집한 전이성 간 결절에서 KITENIN, Myo10 및 eEF2의 발현 수준을 분석한 결과 KDIP에 의해 eEF2가 아닌 Myo10의 단백질 수준이 유의하게 감소되었음을 발견하였다도 53). 도 53에서 볼 수 있듯이, KITENIN과 phospho-ERK 및 phospho-c-Jun과 같은 다운스트림 신호(15, 17)는 KDIP에 의해 크게 감소하였다. 본 발명자들은 KITENIN 발현이 KAI1 및 다른 전이 억제 유전자의 발현과 역 상관관계가 있다고 보고했기 때문에(14) 두 그룹에서 수집한 전이성 간 결절에서 KITENIN과 KAI1의 발현 수준을 비교하였다. 그 결과, scr-펩타이드 주입 그룹에서 감소된 KAI1 발현이 KITENIN의 분해와 함께 KDIP 주입 그룹에서 유의하게 회복되었음을 발견하였다(도 53). 또한, phospho-c-MET의 발현은 scr-peptide 주입군에 비해 KDIP 주입군에서 유의하게 감소하였다(도 53).
이러한 결과는 KDIP에 의한 KITENIN의 발암 기능 억제를 나타내는 in vitro 결과를 긍정적으로 뒷받침한다. 결과적으로, KDIP는 KITENIN의 이량체화를 특이적으로 억제하여 KITENIN에 의한 발암 활성을 효과적으로 억제한다.
고찰
펩타이드는 낮은 분자량과 좋은 세포 흡수를 가지며 정상 조직에 낮은 독성으로 종양 세포에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서 이들은 표적 암 치료에 이상적인 분자이다(35). 항체와 유사하게 특정 펩타이드는 표적 단백질에 결합할 뿐만 아니라 신호 전달 및 기능을 차단한다(36). 본 실험에서 KDIP, 즉 KITENIN의 이량체화를 특이적으로 억제하여 시험관 내 및 생체 내에서 발암성 KITENIN을 효과적으로 억제하며, KITENIN 단백질의 안정성을 감소시키는 짧은 펩타이드인 KDIP를 도입하였다. 기능적 KITENIN 복합체를 표적으로 하는 siRNA(21), mi-RNA(22) 및 저분자량 화합물(23) 외에도 현재 결과는 펩타이드에 의한 KITENIN의 발암 기능 억제에 대한 첫 번째 보고이다.
RACK1은 이전에 HSP90과의 경쟁 및 Elongin-C/B 유비퀴틴 리가제 복합체의 모집(recruitment)을 통해 HIF-1a 안정성을 조절하는 새로운 저산소증 유발 인자-1a(HIF-1a)-상호작용 단백질로 확인되었다(37). 마찬가지로, 본 실험에서 본 발명자들은 KITENIN의 aa 463-471(RIM)에 대한 RACK1의 결합이 KITENIN의 분해에 필수적임을 발견하였다. 막횡단 부분의 2개의 세포내 세포질 루프의 연결을 통한 안정적인 KITENIN 동종이량체의 형성은 RIM이 RACK1과 결합하는 것을 마스킹하는 구조적 장애를 생성할 수 있습니다. 따라서, KDIP 처리가 Myo10의 하향 조절을 유발하고 KITENIN 이량체의 느슨해짐(loosening) 및 분해를 유도하여 RIM 부위를 노출시키는 것과 마찬가지로, 노출된 RIM과 RACK1의 상호작용을 증가시켰다. 이러한 증가된 상호작용은 자가포식 의존적 방식으로 KITENIN의 분해와 KITENIN 이량체의 감소를 촉발하였다. 따라서 KITENIN에 수용체 기능이 없다는 현재의 결과와 이전 관찰에 기초하여(14, 15, 17) KITENIN 동종이량체가 실제로 KITENIN의 발암성 기능에 대한 구조적 및 기능적 단위임을 제안한다. KITENIN이 CRC 세포에서 침입의 인핸서(enhancer)로 작용할 때 KITENIN 동종이량체가 RACK1과의 결합에 대한 구조적 장애와 같은 이점을 제공하는 기능적 KITENIN 복합체를 형성하는 스캐폴딩 단백질 역할을 하여 단백질이 분해되지 않도록 보호한다.
Myo10(Myosin-X라고도 함)은 세포-세포 부착 관련 신호 전달(cell-cell adhesion-associated signaling) 및 세포골격 재구성(cytoskeleton reorganization)에 관여한다(30, 38). 역평행 코일-코일(anti-parallel coiled-coil)인 Myo10의 단백질 구조는 액틴 번들(actin bundle)의 움직임에 최적화되어 있다(39). 이 특성은 빠른 사상체(filopodia) 수송체로서의 Myo10의 역할과 아마도 사상체(filopodia) 형성을 촉진하는 액틴 조직자로서의 역할을 위해 매우 중요하다(42). Myo10과 Myo1b는 모두 전이 가능성이 높은 전립선암 세포와 전이성 전립선암 조직에서 더 높은 수준으로 발현된다(42). Myo10 녹다운은 사상체(filopodia)을 제거하고 사상체(filopodia) 이동 속도를 감소시킨다. 대조적으로 Myo1b 녹다운은 스트레스 섬유의 수를 증가시키지만 이동 속도에는 영향을 미치지 않는다. 이는 이러한 분자 운동 미오신이 액틴을 따라 걸을 수 있는 트랙으로 사용하지만 액틴 조직 및 세포 형태에도 직접적인 영향을 미치며, 이는 전이 표현형(metasatatic phenotype)에 기여할 수 있음을 나타낸다. Myo10은 또한 사상체(filopodia)에서 혈관 내피(vascular endothelial; VE)-카드헤린(cadherin)과 함께 국소화하고 이와 동시에 움직이는 것으로 보고되었으며, 이는 Myo10이 액틴 세포골격과 VE-카드헤린 사이의 연결을 설정하여 사상체(filopodia) 액틴 케이블(cable)을 따라 VE-카드헤린 수송을 허용함을 나타낸다(43). 따라서 Myo10을 사용하여 사상체(filopodia)를 따라 VE-cadherin을 트래피킹(trafficking)하는 것은 내피 복구 및 혈관신생에서 기능적으로 중요할 수 있는 과정인 세포-세포 접합 형성의 전제 조건이라고 제안되었다. Myo10과 KITENIN의 막횡단 부분의 상호작용을 보여주는 우리의 현재 결과는 Myo10이 액틴 세포골격과 비정형 테트라스파닌(tetraspanin)인 KITENIN 사이의 연결(link)을 설정하여 원형질막에 KITENIN의 고정 및 수송을 허용함을 시사한다. 따라서 Myo10에 의한 KITENIN 동종이량체의 안정화는 발암성 KITENIN 복합체의 형성을 위한 전제 조건이며, 이는 증가된 세포 침윤성 및 전이 확산에 대한 다운스트림 신호 전달 과정을 촉발한다.
KITENIN은 다양한 인간 암의 진행에 있어 공격적인 약제이다. KITENIN의 발현이 정상 점막보다 인간 결장(15, 16), 후두(44), 구강 편평(oral cavity squsamous)(45) 위(46), 간세포(47) 및 신경교종(48) 종양 조직에서 유의하게 더 높다는 것을 보여주었다. 이와 관련하여 KITENIN은 항전이 요법의 유망한 표적이다(23). 도 29 및 30에서 볼 수 있듯이, CxGpPxFxC 펩타이드의 공통 서열을 포함하는 KDIP는 KITENIN 이량체에 특이적인 영향을 미치고 KITENIN 복합체의 다운스트림 신호 전달을 억제하였다. KDIP 처리 후 Myo10은 단백질분해효소적(proteasomal) 분해를 통해 감소되어 KITENIN 이량체의 안정성이 상실되었다. RIM에 대한 RACK1의 결합은 자가포식 의존적 방식으로 KITENIN의 분해를 야기했다. 이러한 결과는 Myo10의 하향 조절이 KITENIN 이량체의 분해 및 그에 따른 KITENIN 단백질의 분해를 통해 더 높은 KITENIN 발현을 갖는 결장직장 종양에 대한 KDIP의 치료 작용에 대한 책임이 있음을 나타낸다. 또한, 이 펩타이드는 동계(syngeneic) 마우스에서 CRC 종양 이종이식편 및 동소성(orthotopic) CRC 종양의 간 전이를 효율적으로 억제하였다. 흥미롭게도 KITENIN의 과발현이 KAI1의 발현을 감소시킨 배양된 CRC 세포에서와 마찬가지로(14) 대조군에서 수집된 전이성 간 결절에서 감소된 KAI1의 발현은 KITENIN의 분해와 함께 KDIP 주입군에서 회복되었다(도 53(A) 및 (B)). 또한, c-Met의 인테그린 및 리간드 매개 활성화의 억제를 나타낸 KAI1 재발현 PC3 전립선암 세포에서와 같이(49) phospho-c-MET의 발현은 KDIP가 주입된 전이성 간 결절에서도 감소하였다(도 53). KDIP 처리 후 KAI1 및 c-MET의 이러한 발현 변화는 KDIP에 의한 대장직장 간 전이 억제에 기여했을 수 있다. 따라서 KDIP는 더 높은 수준의 KITENIN을 발현하는 CRC의 종양 발생을 차단하기 위해 기존의 항암 치료제와 조합하여 사용할 수 있는 새로운 약제이다.
유방 암종에서 Myo10은 주로 암종의 침윤성 가장자리에서 발현되며, 그 발현은 TP53 돌연변이의 존재 및 불량한 예후와 상관관계가 있다. 또한 Myo10에 의한 filopodia tip으로의 β인테그린의 수송은 세포 침윤에 필요하다(50). 이러한 발견은 전립선암 세포 외에 유방암 세포 침범에 Myo10이 필요함을 시사한다. 또한, Myo10은 누드 마우스 모델에서 유방 종양의 침습적 성장과 전이를 촉진하기 위해 invadopodia에 직접적인 영향을 미치는 것으로 나타났지만(51), 폐 선암종 전이에도 관여하였다(52). 본 발명에서 본 발명자들은 Myo10의 발현이 KITENIN 형질감염된 CRC 세포에서 증가되었고 Myo10은 KITENIN 이량체를 더욱 안정화시켰다. 이러한 보고와 우리의 현재 데이터는 KITENIN을 과발현하는 암 조직에서 Myo10의 상향 조절과 과발현된 KITENIN의 안정화가 돌연변이 p53 유도 암에서 공격적인 침윤성과 전이에 기여함을 시사한다. 두 단백질 모두 전문화된 전이 엔진 역할을 할 수 있다. Myo10의 하향 조절은 더 높은 KITENIN 발현을 갖는 결장직장 종양에 대한 KDIP의 치료 작용을 담당하기 때문에, KDIP가 KITENIN 및 Myo10 단백질 모두의 발암성 기능에 대한 이중 차단제로서 사용될 수 있다고 제안한다.
요약하면, KITENIN 동종이량체의 필수 기능은 암전이촉진 KITENIN 단백의 안정성을 유지하여 주요 상호 작용 파트너에 대한 도킹 사이트를 제공하는 것이며, 본 실험 결과는 발암성 KITENIN에 의해 유도되는 암 침윤 및 전이를 특이적으로 차단하는 펩타이드 암 치료제 개발을 위한 새로운 전략을 제안한다.

Claims (11)

  1. 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 하기 (a) 내지 (c) 중의 어느 하나의 아미노산 서열을 추가로 포함하며 KITENIN의 이량체 형성을 저해하는 펩타이드.
    (a) 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 전방으로 서열번호 2의 아미노산 서열의 222번째 아미노산 내지 1번째 아미노산 중 222번째 아미노산부터 하나 이상의 아미노산이 추가로 포함되는 아미노산 서열,
    (b) 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 후방으로 서열번호 2의 아미노산 서열의 228번째 아미노산 내지 281번째 아미노산 중 228번째 아미노산부터 하나 이상의 아미노산이 추가로 포함되는 아미노산 서열,
    (c) 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 전방으로 서열번호 2의 아미노산 서열의 222번째 아미노산 내지 1번째 아미노산 중 222번째 아미노산부터 하나 이상의 아미노산이 추가로 포함되고, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 후방으로 서열번호 2의 아미노산 서열의 228번째 아미노산 내지 281번째 아미노산 중 228번째 아미노산부터 하나 이상의 아미노산이 추가로 포함되는 아미노산 서열.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 3, 서열번호 6 내지 8, 및 서열번호 16 내지 21으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 KITENIN의 이량체 형성을 저해하는 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 세포 투과성 물질이 추가로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  4. 제4항에 있어서, 상기 세포 투과성 물질은 세포 투과성 펩타이드 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 폴리아르기닌, Hph-1, Tat, SPACE(skin penetration and cell entering peptide), TD1(transdermal peptide-1), DLP(dermis localizing peptide), LP-12(linear peptide-12 mer), penetratin, 또는 종양 귀속 펩타이드(tumor homing peptide)인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  6. 제4항에 있어서, 상기 화합물은 콜산, 올레산, 또는 이들의 유도체인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제7항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터.
  9. 제8항의 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체(단, 인간을 제외함).
  10. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용, 또는 암의 침윤 및 전이 억제용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 암은 대장암, 유방암, 간암, 식도암, 폐암, 뇌종양, 직장암, 위암, 담관암, 담낭암, 췌장암, 두경부암 또는 편평상피세포암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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