WO2023161844A1 - Hpk1抑制剂在治疗干扰素相关疾病中的应用 - Google Patents

Hpk1抑制剂在治疗干扰素相关疾病中的应用 Download PDF

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WO2023161844A1
WO2023161844A1 PCT/IB2023/051675 IB2023051675W WO2023161844A1 WO 2023161844 A1 WO2023161844 A1 WO 2023161844A1 IB 2023051675 W IB2023051675 W IB 2023051675W WO 2023161844 A1 WO2023161844 A1 WO 2023161844A1
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WO
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virus
compound
substituted
hpk1
unsubstituted
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PCT/IB2023/051675
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魏文娟
彭虹
黄韬
胡显镜
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智宠制药（北京）有限公司
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • HPK1 Hematopoietic progenitor kinase 1
  • HPK1 also known as mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase kinase (MAP4K1)
  • MAP4K1 mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase
  • HPK1 is mainly expressed in blood cells.
  • HPK1 is a negative regulator of T cell receptor (TCR) signaling responsible for suppressing immune responses.
  • TCR activation leads to the recruitment of HPK1 to the cell membrane, followed by activation through phosphorylation of Tyr281 ⁇ Serl71 ⁇ Thrl65 sites.
  • Activated HPK1 destabilizes the TCR signaling complex by phosphorylating the Ser276 site of SLP76 protein, thereby inhibiting the activation and proliferation of T cells.
  • HPK1 activation also inhibits the secretion of interferon gamma (IFN-Y).
  • IFN-Y interferon gamma
  • HPK1 knockout/knockdown In a series of tumor immune animal models, HPK1 knockout/knockdown, or the use of HPK1 inhibitors, can effectively prevent HPK1 from suppressing the immune system, improve the body's immunity, and thereby enhance the anti-tumor effect (Hernandez et al., Cell Reports, 2018).
  • LCMV lymphocytic choriomeningitis virus
  • HPK1 small molecule inhibitor may be an effective therapy for curing hepatitis B.
  • HBV hepatitis B vaccine
  • HPK1 small molecule inhibitors as broad-spectrum antiviral drugs alone or in combination (non-vaccine adjuvant) for viral infection. related disease treatment.
  • the purpose of the present invention is to provide a series of novel HPK1 inhibitors, which can be used as therapeutic drugs for interferon-related diseases, especially viral infections.
  • Zi is selected from N or C-RRi;
  • z 2 and Z 3 are selected from N or C-RR2 respectively, wherein Z2 and Z 3 are not the same;
  • RR1 is selected from hydrogen, halogen, alkenyl, hydroxyl, substituted or unsubstituted C1-6 alkyl, substituted or unsubstituted C3-6 cycloalkyl, substituted or unsubstituted C1-6 alkoxy, substituted or unsubstituted Substituted amino or substituted or unsubstituted amido;
  • RR2 is selected from substituted or unsubstituted hydroxyl, substituted or unsubstituted amino, or substituted or unsubstituted group building;
  • RR3 is selected from H, hydroxyl, halogen, alkenyl, substituted or unsubstituted C6 alkyl, substituted or unsubstituted C3-8 cycloalkyl, substituted or unsubstituted C1-6 alkoxy, substituted or unsubstituted A substituted amino group or a substituted or unsubstituted amido group;
  • RR4, RR5 > RR6, RR7 are independently selected from H, hydroxyl, halogen, alkenyl, substituted or unsubstituted C1-6 alkyl, substituted or unsubstituted C3-8 cycloalkyl, substituted or unsubstituted C1 -6 alkoxy, substituted or unsubstituted amino, substituted or unsubstituted amido, substituted or unsubstituted C5-10 heteroaryl or RR8-Z4-;
  • RR8 is selected from substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted heterocyclyl or substituted or unsubstituted hydroxy;
  • Z4 is selected from the group consisting of -0-, -NH-, -S-, -SO-, -SO2-, ethylene, benzoylamino or amino ethylene.
  • the compound shown in formula I is the compound shown in the following formula 1-1:
  • Re is selected from H, hydroxyl, halogen, alkenyl, substituted or unsubstituted Cl-6 alkyl, substituted or unsubstituted C3-8 cycloalkyl, or substituted or unsubstituted C-6 alkoxy;
  • X' is selected from -0-, -NH-, -s-, -SO-, -SO2-, alkyl, benzylamino or amino alkyl;
  • R 1 ' is a substituted or unsubstituted cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted heterocyclic group or R 14 -O-(CH 2 ) m -, wherein m is
  • R14' is a substituted or unsubstituted C1-6 alkyl group or a substituted or unsubstituted C3-8 cycloalkyl group;
  • the A' ring is a substituted or unsubstituted aryl group (preferably a substituted or unsubstituted phenyl group) or a substituted or unsubstituted 5-6 membered heteroaryl group, wherein the heteroaryl group has 1-4 members selected from 0 , S or N heteroatoms;
  • Rb, RC, Rd, Re are each independently selected from H, hydroxyl, halogen, alkenyl, substituted or unsubstituted C1-6 In the formula, R ⁇ R°, Rd, R.
  • X is selected from -0-, -NH-, -S-, -SO-, -S02-, xyl, alkylamino or amino xyl; n is 1, 2, 3 or 4, m is 0, 1, 2, 3, 4 or 5,
  • R 14 ' is a substituted or unsubstituted Ci-6 alkyl group or a substituted or unsubstituted C3-8 cycloalkyl group;
  • the A' ring is a substituted or unsubstituted aryl group (preferably a substituted or unsubstituted phenyl group) or a substituted or unsubstituted 5-6 membered heteroaryl group, wherein the heteroaryl group has 1-4 members selected from 0 , S or N heteroatoms;
  • R2' is selected from the following substituents:
  • R1, R2, R3, & and R5 are each independently selected from: hydrogen, halogen, indenyl, hydroxyl, substituted or unsubstituted C "6 ii.
  • Branched or straight-chain Cl-6 alkyl, C2-6 alkenyl or C2-6 block, the alkyl, alkenyl and block also contain various types of single or multiple substitutions, including hydrogen, hydroxyl , halogen, alkenyl, amino, -CHF2, -CF3, two (C1-6 alkyl) amino, single (C1-6 alkyl) amino, C3-6 cycloalkyl or C1-6 alkoxy; iii.
  • Ri, R2, R and R8 are each as defined above.
  • X is NH.
  • Ri, R2, R8 and ring A are each as defined above.
  • the A ring is selected from: In a preferred embodiment, the A ring and R7 together form an optionally substituted fused ring group, bridged ring group, heterobridged ring group, spirocyclic group or heterospirocyclic group:
  • the Ri is an amino group, a hydroxyl group, an indenyl group, a methoxy group or a halogen substituent.
  • R8 is methyl, ethyl, isopropyl, cyclopropyl, vinyl, ethyl or substituted or unsubstituted aryl (preferably phenyl) or 5-membered heteroaryl.
  • R8 is methyl, ethyl, isopropyl, cyclopropyl, substituted or unsubstituted phenyl.
  • the compound is selected from:
  • the compound is In a specific embodiment, the virus is selected from the group consisting of Hepatitis B virus > Measles Virus > Sindbis Virus > West Nile Virus > Dengue Virus ) > Herpes Simplex Virus > Human Cytomegalovirus HCMV > Ebola Virus > Hepatitis C Virus (HCV), Influenza A Virus, Severe Acute Respiratory Syndrome Virus (SARS) -CoV), Zika Virus, HIV, Feline Infectious Peritonitis Virus, Mouse Hepatitis Virus > Canine Coronavirus, Feline Calicivirus (Feline Calicivirus), Feline Leukemia Virus, Feline Immunodeficiency Virus, Feline Panleukopenia Virus, Avian Infect
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or stereoisomer thereof , tautomers, prodrugs, metabolites or derivatives and one or more other antiviral drugs, and optional pharmaceutically acceptable excipients.
  • the present invention provides the compound of the present invention for use as a drug for treating interferon-related diseases.
  • the present invention provides a method for treating interferon-related diseases, comprising the step of administering a therapeutically effective amount of the compound or pharmaceutical composition of the present invention to a subject in need thereof.
  • Figure 13 shows the synthetic route of compound D D02008H.
  • Figure 14 shows the synthetic route of compound D D02015H.
  • Figure 15 shows the synthetic route of compound D D02021H.
  • Figure 16 shows the synthetic route of compound D D02018H.
  • Figure 17 shows the synthetic route of compound D D02002H.
  • Figure 18 shows the synthetic route of compound DD02019H.
  • alkyl refers to branched and straight chain saturated aliphatic hydrocarbon groups containing, for example, 1 to 12, 1 to 6 or 1 to 4 carbon atoms.
  • alkyl groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, propyl (such as n-propyl and isopropyl), T-groups (such as n-butyl, isobutyl, sec-butyl and tert-butyl), and pentyl (such as n-pentyl, isopentyl, neopentyl), n-hexyl, 2-methylpentyl, 2-ethylbutyl, 3-methylpentyl and 4-methylpentyl.
  • C represents the number of carbon atoms a particular group may contain.
  • C'6 alkyl represents straight and branched chain alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms.
  • alkenyl refers to a straight chain or branched alkenyl group having at least one double bond).
  • the alkenyl group may be optionally substituted with one or more substituents, and includes groups with "cis” and “trans” orientations, or groups with "E” and “Z” orientations. Examples include, but are not limited to, vinyl, allyl, and the like.
  • carboxylate as used herein generally refers to a branched or straight chain hydrocarbon group having at least one triple bond. Carboxyl can be optionally substituted.
  • C2-3 carbinyl generally refers to a branched or straight chain hydrocarbon group having at least one triple bond. Carboxyl can be optionally substituted.
  • C2-3 carbinyl generally refers to a carboxyl group containing at least 2, and at most 3, 4, 5, 6, 7 or 8 carbon atoms, respectively.
  • Non-limiting examples of carboxanyl groups include ethylcanthyl, propanyl, butyryl, pentahanyl, hexanyl, hephanyl, octahanyl, nonanganyl, decanyl, and the like.
  • cycloalkyl refers to a group resulting from the loss of a hydrogen atom from a cyclic cone molecule.
  • Representative examples of cycloalkyl include, but are not limited to, cyclopropyl, cyclopentyl, and cyclohexyl.
  • Examples of monocyclic cycloalkyl groups are cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl or cycloheptyl.
  • heteroatom refers to oxygen (O), sulfur (S, or nitrogen (N).
  • Halo and “halogen” refer to F, Cl, Br, or I.
  • haloalkyl Refer to the alkyl substituted by one or more halogens.
  • indenyl as used herein refers to the group-CN.
  • amino refers to the group-NH2.
  • heterocycloalkyl as used herein or "Heterocyclyl” means a ring containing 1-4 heteroatoms (if monocyclic), 1-6 heteroatoms (if bicyclic), or 1-9 heteroatoms (if tricyclic) Alkyl, the heteroatom is selected from O, S or N. Heterocycloalkyl can be optionally substituted by one or more substituents. In one embodiment, each ring of heterocycloalkyl. 2, 3 or 4 atoms may be substituted by substituents.
  • heterocycloalkyl groups include piperazinyl, piperazinyl, tetrahydropyranyl, morphyl, thiomorphyl, 1,3 - dioxolyl, THF group, tetrahydroshenyl, shenyl, etc.
  • aromatic ring or "aryl” as used herein refers to a monocyclic, bicyclic or tricyclic aromatic ring A group obtained by losing a hydrogen atom in the ring system.
  • Aryl can be optionally substituted by one or more substituents. In one embodiment, 0, 1, 2, 3, 4 of each ring of aryl 1, 5 or 6 atoms can be substituted by substituents.
  • aryl groups include phenyl, naphthyl, core group, drug base, anthracyl, molybdenum, etc.
  • aromatic heterocyclic ring used herein " or “heteroaryl” means an “aromatic ring” or “aryl” having at least one heteroatom (0, S or N) in at least one ring, and the heteroatom-containing ring preferably has 1, 2 or 3 independently selected from 0, S or N heteroatoms.
  • Each ring in a heteroatom-containing heteroaryl group may contain 1 or 2 oxygen or sulfur atoms and/or 1-4 nitrogen atoms, provided that the total number of heteroatoms in each ring is 4 or less And each ring has at least one carbon atom.
  • a heteroaryl group can be attached to any available nitrogen or carbon atom of any ring.
  • a heteroaryl ring system can be unsubstituted or can contain one or more substituents.
  • Non-limiting examples of heteroaryl groups include pyryl, pyryl, phenenyl, pyrrolyl, fenyl, erlicyl, milyl, fenyl, isoamyl, wah ⁇ Linji, pirilyl, iso-n-sewa-based, pyridazinyl, succino-based, piperazinyl, triazinyl, iso-wakoulin-yl, ming-sui-based, etc.
  • alkoxy refers to -O-alkyl.
  • An alkoxy group can be optionally substituted with one or more substituents.
  • residue moieties include, but are not limited to, ketone and aldehyde moieties.
  • alkylamino refers to an amino group substituted with one or two alkyl groups.
  • aminoalkyl refers to an alkyl group substituted with one or more amino groups.
  • hydroxyalkyl refers to an alkyl group substituted with one or more hydroxy groups.
  • the alkyl moiety optionally has one or more substituents.
  • spirocyclyl denotes a polycyclic group in which two carbocyclic rings share one carbon atom.
  • Heterospirocyclic group refers to a polycyclic group in which two monocyclic rings share one carbon atom, and the two rings may contain one or more heteroatoms.
  • bridged ring group refers to any two carbon rings A ring group that shares two carbon atoms that are not directly connected can be divided into bicyclic, tricyclic, tetracyclic, etc. according to the number of rings.
  • Heterobridged ring group refers to a polycyclic heterocyclic group, and the polycyclic There are two rings in the heterocyclic group that share two non-adjacent carbon atoms or heteroatoms.
  • fused ring group used herein means a polycyclic ring formed by two or more carbon rings sharing ring edges Organic compound.
  • Heterofused ring group refers to a polycyclic heterocyclic group, and in the polycyclic heterocyclic group, two rings share two adjacent carbon atoms or heteroatoms.
  • the term “isomer” used herein " or “stereoisomer” refers to compounds that have the same chemical composition but differ in the arrangement of atoms or groups in space.
  • tautomer or "tautomeric form” refers to compounds that have different energies Structural isomers, which are interconvertible via low energy barriers.
  • proton tautomers also called prototropic isomers
  • Valency tautomers include interconversion by recombination of some of the bonding electrons.
  • diastereoisomer refers to those having two or more centers of asymmetry and whose molecules are not mutually Stereoisomers that are mirror images.
  • prevention and/or treatment not only includes prevention and/or treatment of disease, but also generally includes prevention of disease onset, slowing or reversing the progression of disease, preventing or slowing down the disease-related reducing and/or alleviating one or more symptoms associated with the disease, reducing the severity and/or duration of the disease and/or any symptoms associated therewith and/or preventing the disease and /Or further increase in the severity of any symptoms associated with it, prevention, reduction or reversal of any physiological damage caused by the disease, and any pharmacological effects that are generally beneficial to the patient being treated.
  • a therapeutic agent need not achieve a complete cure or eradicate any symptoms or manifestations of the disease.
  • a drug used as a therapeutic agent can reduce the severity of a given disease state, but does not require Elimination of every manifestation of disease is considered a useful therapeutic agent.
  • a treatment administered prophylactically need not be fully effective in preventing the onset of the disorder to constitute a viable prophylactic. Simply reducing the effects of disease in a subject (for example, by reducing the number or severity of its symptoms, or by increasing the effectiveness of another treatment, or by producing another beneficial effect), or reducing disease occurrence or The possibility of deterioration is enough.
  • prevention and/or treatment includes the prevention and/or treatment of diseases achieved by various means, for example, the prevention and/or treatment of diseases is achieved by improving the immunity of the subject.
  • administering or “administering” includes the means by which the compound is introduced into a subject to achieve its intended function. Examples of routes of administration that may be used include injection (subcutaneous, intravenous, parenteral, intraperitoneal, intrathecal), topical, oral, inhalation, rectal and transdermal.
  • effective amount includes an amount effective to achieve the desired result, at dosages and for periods of time necessary.
  • an effective amount of a compound can vary depending on factors such as the disease state, age and weight of the subject and the ability of the compound to elicit a desired response in the subject. Dosage regimens may be adjusted to provide the optimum therapeutic response.
  • “Therapeutically effective amount” refers to the amount of the compound of the present application, which amount (i) treats or prevents a specific disease, condition or disorder, (ii) weakens, improves or eliminates one or more symptoms of a specific disease, condition or disorder, or (iii) preventing or delaying the onset of one or more symptoms of a particular disease, condition or disorder described herein.
  • subject or “patient” as used herein refers to animals, such as mammals, including but not limited to primates (such as humans), cows, sheep, goats, horses, dogs, cats, rabbits, rats , mice, etc. In certain embodiments, the subject is a human.
  • inhibitor as used herein means to reduce the activity of the enzyme of interest as compared to the activity of the enzyme in the absence of the inhibitor.
  • the term "inhibition" means that HPK1 activity is reduced by at least about 5%, at least about 10%, at least about 20%, at least about 25%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, At least about 80%, at least about 90%, or at least about 95%; or about 5% to about 25%, about 25% to about 50%, about 50% to about 75%, or about 75% to 100% reduction in CO activity %; or 15-10 activity is reduced by about 95% to 100%, for example, the activity is reduced by 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%.
  • Compounds of the Invention The present invention provides a series of compounds having HPK1 inhibitory activity.
  • the compound of the present invention can increase or restore the expression or production of interferon in the subject, thereby enhancing the immunity of the subject, and then treating and/or preventing diseases.
  • the HPK1 inhibitory compound of the present invention can enhance the antiviral effect mediated by IFN- ⁇ and/or enhance the activation of T cells mediated by IFN- ⁇ , thereby being able to treat and/or prevent viral infection.
  • the HPK1 inhibitory active compounds of the present invention can also be used to enhance the immunity of a subject.
  • the present invention provides the compound shown in formula I, Each substituent in the formula is as described above.
  • the compound of the present invention may be a compound represented by formula 1-2-1, formula 1-2-2 or formula 1-2-3:
  • the compounds of the present invention may form pharmaceutically acceptable salts, such as organic or inorganic salts formed by the compounds of the present invention.
  • Exemplary salts include, but are not limited to, sulfate, citrate, acetate, oxalate, chloride, bromide, iodide, nitrate, bisulfate, phosphate, acid phosphate, isonicotinate , Lactate, Salicylate, Acid Citrate, Tartrate, Oleate, Tannin, Pantothenate, Bitartrate, Ascorbate, Succinate, Maleate, Gentiana salt, fumarate, gluconate, glucuronate, sugar salt, formate, benzoate, glutamate, methanesulfonate, ethanesulfonate, benzenesulfonate, p-toluenesulfonate, bishydroxyl catalate (i.e.
  • I,r-methylene-bis-(2-hydroxy-3-carboxylate) salt alkali metal (e.g. sodium and potassium) salts, alkaline earth metal (e.g. Magnesium) salt and Hyun salt.
  • a pharmaceutically acceptable salt may involve the inclusion of another molecule such as acetate, succinate or other counterion.
  • the counterion can be any organic or inorganic moiety which stabilizes the charge on the parent compound.
  • pharmaceutically acceptable salts can have more than one charged atom in their structure. In instances where multiple charged atoms are part of a pharmaceutically acceptable salt, the salt can have multiple counterions. Thus, a pharmaceutically acceptable salt may have one or more charged atoms and/or one or more counterions.
  • the compounds of the invention may also form solvates (eg, hydrates).
  • solvate refers to the physical association of a compound with one or more solvent molecules, whether organic or inorganic. This physical association includes hydrogen bonding. In some cases, solvates will be capable of isolating, for example when one or more solvent molecules are incorporated into the crystal lattice of a crystalline solid. Exemplary solvates include hydrates, ethanolates, methanolates, isopropanolates, acetonitrile solvates, and ethyl acetate solvates. Solvation methods are known in the art. The compounds of the present invention are metabolized in vivo.
  • metabolites that is, products produced by metabolizing specific compounds or their salts in vivo should also be included in the protection scope of the present invention.
  • the compound of the present invention can also be made into a “prodrug” or “prodrug”, that is, a compound of a drug precursor, which, when administered to a subject, undergoes a chemical transformation through a metabolic or chemical process to obtain a compound of formula I or a salt thereof .
  • Prodrugs are well known in the art (see, e.g., Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts w , J. Pharm. Sci.
  • esters of the present invention may also form esters and esters are therefore also within the scope of this application within.
  • Representative examples of specific esters include, but are not limited to, formates, acetates, propionates, butyrates, acrylates, and ethyl succinates.
  • the compounds of the present application are intended to include those present in the compounds of the present application All isotopes of the atoms.
  • the isotopes of hydrogen include S (D) and Ni (T).
  • the isotopes of carbon include 13C and 14C.
  • the compound of the application of isotope labeling can usually be passed through conventional techniques known to those skilled in the art or by Similar to the method described in this application, it is prepared by using an appropriate isotope-labeled reagent instead of an unlabeled reagent used in other cases.
  • the term "derivative" refers to an atom or atomic group in the molecule of the parent compound that is replaced by other atoms or atomic groups. Substitute the resulting compound.
  • Interferon-Related Diseases as described herein refer to diseases that can be treated and/or prevented by increasing or restoring interferon expression or production in a subject by administering the compounds of the present invention.
  • the interferon is IFN- ⁇ and/or IFN- ⁇ ; therefore, the compound of the present invention can be used as an enhancer of IFN- ⁇ and/or IFN- ⁇ signaling pathway, while the "Interferon-associated disease" also includes all viral infections to which IFN-p/IFN- ⁇ has a therapeutic and/or preventive effect.
  • the interferon-associated disease is a viral infection including but not limited to hepatitis B Virus
  • Hepatitis B virus Measles Virus > Sindbis Virus > West Nile Virus, Dengue Virus Herpes Simplex Virus Human Cytomegalovirus Cytomegalovirus (HCMV) > Ebola Virus, Hepatitis C Virus (HCV), Influenza A Virus > Severe Acute Respiratory Syndrome Virus (SARS-CoV), Zika Virus > HIV ( HIV), Feline Infectious Peritonitis Virus > Mouse Hepatitis Virus > Canine Coronavirus, Feline Calicivirus, Feline Leukemia Virus, Feline Immunodeficiency Virus, Feline Panleukopenia Virus, Avian Infectious Bronchitis Virus, Transmissible Gastroenteritis Virus, Porcine Epidemic Diarrhea virus (Porcine Epidemic Diarrhea Virus), porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus (Porcine Hemagglutinating Encephalomyelitis Virus), bovine
  • compositions Given that the compounds of the present invention can treat interferon-related diseases, the compounds of the present invention can be formulated into pharmaceutical compositions.
  • the compound of the present invention or its pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, tautomer, prodrug, metabolite or derivative and optionally pharmaceutically acceptable excipients.
  • pharmaceutically acceptable means that the described compound, substance, composition and/or dosage form are suitable for use in contact with human and animal tissues without causing excessive toxicity, irritation, allergy reactions or other problems or complications, commensurate with a reasonable benefit/risk ratio.
  • excipient refers to a carrier, excipient or stabilizer that is nontoxic to cells or mammals at the dosages and concentrations employed.
  • Non-limiting examples include buffers, such as phosphate, citrate, and other organic acids; antioxidants, including ascorbic acid; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; proteins, such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins proteins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates (including glucose , mannose or dextrin); chelating agents such as EDTA; sugar alcohols such as mannitol or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; and/or nonionic surfactants such as TWEEWM, polyethylene glycol (PEG) and PLURONICSTM o
  • the pharmaceuticallycerolidone such as
  • the compounds of the present invention can treat interferon-related diseases, especially viral infections. Therefore, in addition to the compound of the present invention, the pharmaceutical composition of the present invention may also contain one or more other antiviral drugs, so as to enhance the curative effect of the pharmaceutical composition. Advantages of the present invention:
  • the present invention provides a novel highly active and highly selective HPK1 small molecule inhibitor
  • the present invention clarifies for the first time the internal mechanism connection between HPK1 kinase and viral infection
  • HPK1 small-molecule inhibitor of the present invention can be used as a monotherapy to exhibit antiviral effects at the level of cells and animal models, thereby laying a new material foundation for the development of interferon-related diseases, especially drugs for viral infections;
  • HPK1 small molecule inhibitor of the present invention can be used as an adjuvant/combined drug to improve immunity and exhibit antiviral effects at the level of cells and animal models, thus laying a new foundation for the development of interferon-related diseases, especially drugs for viral infections material basis.
  • the technical solutions of the present invention are further described below in conjunction with specific implementation cases, but the following implementation cases do not constitute limitations to the present invention, and all the various application methods adopted according to the principles and technical means of the present invention belong to the scope of the present invention.
  • the experimental methods in the following examples that do not specify specific conditions are generally in accordance with conventional conditions, or in accordance with the conditions suggested by the manufacturer. Percentages and parts are by weight unless otherwise indicated. Examples Example 1. Synthesis of compounds of the present invention
  • the target compound DD02008H was obtained as a yellow solid (71.94 mg, 183 umoh 40.9% yield, 98.6% purity), the structure was confirmed by XH NMR, Confirmed by LCMS and HPLC.
  • the mixture was slowly poured into 40.0 mL H 2 O with stirring, the pH was adjusted to about 8 with saturated NaHCCh, and then extracted with DCM ( 80.0 mL*3 ), and the organic layer was washed with brine ( 50.0 mL*2) , dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure, the obtained crude product was purified by preparative high-performance liquid chromatography, the obtained material was adjusted to about pH 8 with saturated NaHCO 3 , extracted with DCM (40.0 mL*4), and washed with brine ( 40.0 mL*3) The organic layer was washed, dried over anhydrous Na 2 SO 4 , filtered, and concentrated to obtain the target product DD02018H (17.1 mg, 35.13 umol, 5.31% yield, 97.7% purity) as a light yellow solid with the structure Confirmed by XH NMR, LCMS and HPLC.
  • % inhibition 100-(Signal cm pd-SignalAve_PC)/(SignalAve_vc-SignalAve_PC) x 100
  • cmpd refers to the test compound
  • PC refers to the positive control
  • VC refers to the negative control.
  • the positive control used in the HPK1 experiment was Sunitinib.
  • Table 2. has listed the inhibitory ability of the compound described in each embodiment to HPK1 kinase activity
  • LCMS showed that the compound 7_Cis was completely consumed, and the molecular weight of the target product was detected.
  • Staurosporine MCE HY-15141 The initial concentration of all compounds tested was 10 pM, three-fold concentration serial dilution, a total of 10 concentration points, and each concentration was repeated once.
  • % inhibition 100-(Signal cm pd-SignalAve_PC)/(SignalAve_vc-SignalAve_PC) x 100
  • cmpd refers to the test compound
  • PC refers to the positive control
  • VC refers to the negative control.
  • DD02001A_trans is effective against most kinases, such as AKT1, HER2, EGFR, ERK1/2, ZAP70, IGF1R, ATR, MNK1/2, R0S1, CDK4, CDK7, CDK12, p38-alpha, IKK-beta, CKlgammal, etc. at 10 pM No obvious inhibitory effect was shown at the concentration (inhibition rate ⁇ 40%), but highly selective inhibition of immune-related protein kinases shown in Table 6, indicating that compound DD02001A_trans has excellent kinase inhibitory selectivity.
  • DD02001A_trans 2000 > 1500, 1000, 500 mg/kg
  • mice purchased from Guangdong Experimental Animal Center, license number: SCXK (Guangdong) 2018-0002), 10 mice, half male and half male. After the mice weighing 18-22 g o were purchased, the mice were reared for three days to adapt to the environment. Mice were housed in indoor cages at a room temperature of 23 ⁇ 1 °C, relative humidity of 40%-60%, and free access to food and drink.
  • mice were fasted without food and water for 10 hours before the experiment. Give the mice a one-time gavage of the test drug (0.1ml/10g) at each concentration, observe continuously for 14 days, and record in detail the poisoning symptoms of the animals after administration, the time of occurrence and duration of poisoning, and the death of the animals; Carry out autopsy in time and record the pathological changes. If obvious changes are observed with the naked eye, pathological biopsy should be performed. According to the results of acute toxicity experiments, the maximum tolerated dose of DD02001A_trans administered to mice is in the range of 1000-1500 mg/kg. Example 2.
  • Interferon P is a protein encoded by the IFNB1 gene. Natural or recombinant IFN- ⁇ protein has antiviral, antibacterial and anticancer activities.
  • HPK1 and IFN- ⁇ Luciferase Reporter plasmids were overexpressed in HEK293 cells, the cells were stimulated with Sendai virus (SeV) 24 hours after transfection, and harvested 12 hours later Cells were collected for IFN-P Luciferase activity test.
  • Sendai virus Sendai virus
  • ISRE IFN-stimulated response elements
  • IFN-stimulated response elements can be combined with phosphorylated IRF3 to mediate IFN-P transcription, which is another important indicator of the antiviral pathway.
  • Different doses of HPK1 and ISRE Luciferase Reporter plasmids were overexpressed in HEK293 cells, the cells were stimulated with Sendai virus (SeV) 24 hours after transfection, and the cells were collected 12 hours later for ISRE Luciferase activity test.
  • SeV Sendai virus
  • compound C2 exhibited a dose-dependent restoration of HPK1-inhibited IFN-8 expression ( Figure 5) o Example 5.
  • the oral maximum tolerated dose of the compound of the present invention The inventors tested the oral maximum tolerance of representative compounds in mice received dose. The test results showed that the maximum tolerated oral dose of compound C1 in a single administration was 337.5 mg/kg (Table 2), and the maximum tolerated oral dose of compound C3 was 225 mg/kg (Table 3). Table 2. Oral acute toxicity test results of small molecule compound C1 in mice. Table 3. Oral acute toxicity test results of small molecule compound C3 in mice. Example 6.
  • mice of the present invention effectively treat mouse MHV models
  • MHV mouse Hepatitis virus
  • MHV is a mouse coronavirus that easily infects the liver and nervous system. 8-week-old female C57 mice, 3 mice in each group, were orthotopically injected with 4*10 4 pfu virus in the liver. After the virus was inoculated, the mice were administered orally (10 mg/kg, BID ) . Three days after the virus infection, the virus content in the liver tissue was detected by qPCR.
  • Example 7 The compounds of the present invention are effective in the treatment of Feline Infectious Peritonitis (FIP), referred to as Feline Infectious Peritonitis (FIP), which is a fatal abnormal immune response in cats, and is caused by feline coronaviruses carried by cats.
  • FIP Feline Infectious Peritonitis
  • FIP farnesoid fever
  • wet FIP wet FIP
  • dry FIP dry FIP Symptoms in cats with FIP vary, depending on the type of organ affected by the virus. As of 2011, FIP has ranked first among pet cat fatal infectious diseases in developed countries.
  • HPK1 inhibitors can carry out anti-infection treatment from the two dimensions of IFN- ⁇ -mediated antiviral effect and IFN- ⁇ -mediated T cell activation. Therefore, HPK1 inhibitors have therapeutic effects on human or animal diseases caused by all viruses with IFN-B/IFN-v effects, including but not limited to: Hepatitis B virus, Measles Virus > Sindbis Virus > West Nile Virus > Dengue Virus > Herpes Simplex Virus > Human Cytomegalovirus HCMV, Ebola Virus ), Hepatitis C Virus (HC V) > Influenza A Virus. Severe Acute Respiratory Syndrome Virus (SARS-CoV).
  • SARS-CoV Severe Acute Respiratory Syndrome Virus
  • Zika Virus Zika Virus (Zika Virus), HIV (HIV), Feline Infectious Virus (Feline Infectious Peritonitis Virus > Mouse Hepatitis Virus > Canine Coronavirus, Feline Calicivirus, Feline Leukemia Virus, Feline Immunodeficiency Virus, Cat Feline Panleukopenia Virus, Avian Infectious Bronchitis Virus, Transmissible Gastroenteritis Virus, Porcine Epidemic Diarrhea Virus, Porcine Hemagglutinating Encephalomyelitis Virus (Porcine Hemagglutinating Encephalomyelitis Virus), Bovine Coronavirus (Bovine Coronavirus), etc.
  • HPK1 inhibitors are expected to be used as a new type of broad-spectrum antiviral therapy for the treatment of the above-mentioned virus-induced diseases. All documents mentioned in this application are incorporated by reference in this application as if each were individually incorporated by reference. In addition, it should be understood that after reading the above teaching content of the present invention, those skilled in the art may make various changes or modifications to the present invention, and these equivalent forms also fall within the scope defined by the appended claims of the present application.

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Abstract

本发明公开了一类全新的HPK1抑制活性化合物并首次阐明了HPK1激酶与病毒感染的内在机制联系。本发明的化合物可用于治疗干扰素相关疾病，特别是病毒感染。本发明还提供了利用本发明的化合物治疗干扰素相关疾病的方法。

Description

HPK1 抑制剂在治疗干扰素相关疾病中的应用
Figure imgf000002_0001
背景技术 造血祖细胞激酶 1(HPK1)也称为丝裂原激活的蛋白激酶激酶激酶激酶 (MAP4K1), 其是 一种丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶。 它参与各种细胞事件， 包括促分裂原活化蛋白激酶信号传导, 核因子 KB信号传导， 细胞因子信号传导， 细胞增殖和凋亡， T细胞受体 / B细胞受体信号传 导和 T / B /树突状细胞介导的免疫应答。 HPK1主要表达于血液细胞中。在 T细胞里， HPK1 是 T细胞受体 (TCR)信号的负调节因子， 负责抑制免疫响应。 TCR激活导致 HPK1在细胞膜 的招募， 随后通过磷酸化 Tyr281\Serl71\Thrl65位点活化。 活化的 HPK1通过磷酸化 SLP76 蛋白的 Ser276位点，破坏 TCR信号复合物稳定，从而抑制 T细胞的激活与增殖。与此同时, HPK1 活化还会抑制干扰素 Y(IFN-Y)分泌。在一系列肿瘤免疫动物模型中， HPK1敲除/敲低, 或者使用 HPK1抑制剂， 都能够有效地阻止 HPK1对于免疫系统的压制， 提高机体免疫， 从 而增强抗肿瘤效果 (Hernandez等， Cell Reports, 2018)。 另一方面， 在感染淋巴细胞脉络丛脑 膜炎病毒 (lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV)的小鼠中， 感染后 21天后， HPK1敲低 的小鼠血浆中的病毒滴度显著低于野生型小鼠，提示抑制 HPK1活性或可成为一种新的抗病 毒治疗途径。 杨森公司 (Janssen Sciences Ireland Unlimited Company )申请的专利 (W02020255022)表明， 联合使用乙肝疫苗 (HBV)和 HPK1小分子抑制剂或可成为治愈乙型肝 炎的有效疗法。 尽管有上述研究基础， 迄今为止， HPK1激酶与病毒感染的内在机制尚未得到阐明； 同 时尚未有报道探索 HPK1小分子抑制剂作为广谱抗病毒药物单独或联合使用 (非疫苗佐剂) 用于病毒相关疾病治疗。 发明内容 本发明的目的在于提供一系列新型的 HPK1抑制剂， 这些 HPK1抑制剂可以用作干扰 素相关疾病， 特别是病毒感染的治疗药物。
Figure imgf000002_0002
Figure imgf000003_0001
式中， Zi选自 N或 C -RRi； z2和 Z3分别选自 N或 C-RR2， 其中 Z2和 Z3不相同；
RR1选自氢、 卤素、 氤基、 羟基、 取代或未取代的 C1一 6烷基、 取代或未取代的 C3-6环烷 基、 取代或未取代的 C1一 6烷氧基、 取代或未取代的氨基或取代或未取代的酰氨基；
RR2选自取代或未取代的羟基、 取代或未取代的氨基、 或取代或未取代的筑基；
RR3选自 H、 羟基、 卤素、 氤基、 取代或未取代的 C「6烷基、 取代或未取代的 C3-8环烷 基、 取代或未取代的 C1一 6烷氧基、 取代或未经取代的氨基或取代或未取代的酰氨基；
RR4、 RR5> RR6、 RR7分别独立选自 H、羟基、 卤素、氤基、 取代或未取代的 C1一 6烷基、 取代或未取代的 C3-8环烷基、 取代或未取代的 C1一 6烷氧基、 取代或未经取代的氨基、 取代或 未取代的酰氨基、 取代或未取代的 C5-10杂芳基或 RR8-Z4-；
RR8选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基或取代 或未取代的羟基；
Z4选自 -0-、 -NH-、 -S-、 -SO-、 -SO2-、 洗基、 旎基氨基或氨基洗基。 在具体的实施方式中， 式 I所示化合物是下式 1-1所示的化合物： 取代
Figure imgf000003_0002
Re选自 H、 羟基、 卤素、 氤基、 取代或未取代的 Cl一 6烷基、 取代或未取代的 C3-8环烷 基、 或取代或未取代的 C「6烷氧基；
X' 选自 -0-、 -NH-、 -s-、 -SO-、 -SO2-、 撮基、 菽基氨基或氨基撮基；
R1'为取代或未取代的环烷基、 取代或未取代的杂环基或者 R14 -O-(CH2)m-, 其中 m为
0、 1、 2、 3、 4或 5, R14'为取代或未取代的 C1一 6烷基或取代或未取代的 C3-8环烷基；
A' 环为取代或未取代的芳基 (优选取代或未取代的苯基)或取代或未取代的 5-6元杂芳 基， 其中， 所述杂芳基具有 1-4个选自 0、 S或 N的杂原子；
Figure imgf000004_0001
式中， Rb、 RC、 Rd、 Re各自独立地选自 H、 羟基、 卤素、 氤基、 取代或未取代的 C1-6
Figure imgf000005_0001
式中， R\ R°、 Rd、 R。各自独立地选自 H、 羟基、 卤素、 氤基、 取代或未取代的 Ci一 6 烷基、 取代或未取代的 C3-8环烷基或取代或未取代的 C1一 6烷氧基；
X选 自 -0-、 -NH-、 -S-、 -SO-、 -S02-、 勰基、 撮基氨基或氨基勰基； n为 1、 2、 3或 4, m 为 0、 1、 2、 3、 4或 5,
R14'为取代或未取代的 Ci一 6烷基或取代或未取代的 C3-8环烷基；
A' 环为取代或未取代的芳基（优选取代或未取代的苯基）或取代或未取代的 5-6元杂芳 基， 其中， 所述杂芳基具有 1-4个选自 0、 S或 N的杂原子；
R2'选自以下取代基：
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
式中, Rl、 R2、 R3、 &和 R5各自独立地选自： 氢、 卤素、 氤基、 羟基、 取代或未取代的 C「6
Figure imgf000011_0001
ii. 支链的或直链的 Cl一 6烷基、 C2-6烯基或 C2-6块基， 所述烷基、 烯基和块基还包含各 类单或者多取代， 包括氢、 羟基、 卤素、 氤基、 氨基、 - CHF2、 -CF3、 二（Ci一 6烷基）氨基、 单 （C1一 6烷基）氨基、 C3-6环烷基或 C1一 6烷氧基； iii. C3.6环烷基、 C3-6杂环基、 C&io芳基或 C5-10杂芳基， 所述环烷基、 杂环基、 芳基或
Figure imgf000011_0002
式中， Ri、 R2、 说和 R8各自如上文定义。 在优选的实施方式中， X是 NH。
Figure imgf000012_0001
式中， Ri、 R2、 R8和 A环各自如上文定义。 在优选的实施方式中, 所述 A环选自:
Figure imgf000012_0002
在优选的实施方式中，所述 A环与 R7一起形成选自下组的任选取代的稠环基、桥环基、 杂桥环基、 螺环基或杂螺环基：
Figure imgf000012_0003
在优选的实施方式中， 所述 Ri为氨基、 羟基、 氤基、 甲氧基或卤素取代基。 在优选的实施方式中， R8为甲基、 乙基、 异丙基、 环丙基、 乙烯基、 乙块基或取代或 未取代的芳基（优选苯基）或 5元杂芳基。 在优选的实施方式中， R8为甲基、 乙基、 异丙基、 环丙基、 取代或未取代的苯基。 在具体的实施方式中， 所述化合物选自：
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
在具体的实施方式中， 所述化合物是
Figure imgf000016_0001
在具体的实施方式中， 所述病毒选自乙肝病毒 (Hepatitis B virus)＞ 麻疹病毒 (Measles Virus)＞ 辛德毕斯病毒 (Sindbis Virus)＞ 西尼罗河病毒 (West Nile Virus)＞ 登革病毒 (Dengue Virus)＞疱疹病毒 (Herpes Simplex Virus)＞人巨细胞病毒 (Human Cytomegalovirus HCMV)＞ 埃博拉病毒 (Ebola Virus)＞丙肝病毒 (HCV)、 流感病毒 (Influenza A Virus) 严重急性呼吸综 合征病毒 (SARS-CoV)、 寨卡病毒 (Zika Virus)、 艾滋病毒 (HIV) 、 猫传腹病毒 (Feline Infectious Peritonitis Virus) 小鼠肝炎病毒 (Mouse Hepatitis Virus)＞ 犬冠状病毒 ( Canine Coronavirus) 、 猫杯状病毒 (Feline Calicivirus) 、 猫白血病病毒 (Feline Leukemia Virus) 、 猫艾滋病毒 (Feline Immunodeficiency Virus)、猫泛白血球减少症病毒 (Feline Panleukopenia Virus) 、 鸡传染性支气管炎病毒 (Avian Infectious Bronchitis Virus) 、 猪传染性胃肠炎病毒 (Transmissible Gastroenteritis Virus) 、猪流行性腹泻病毒 (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) 、 猪血凝性脑脊髓炎病毒 (Porcine Hemagglutinating Encephalomyelitis Virus) 、 牛冠状病毒 (Bovine Coronavirus)等； 优选猫传腹病毒 (Feline Infectious Peritonitis Virus)、 小鼠肝炎病毒 (Mouse Hepatitis Virus)＞ 疱疹病毒、 严重急性呼吸综合征病毒、 寨卡病毒、 猫传腹病毒、 犬 冠状病毒、 猫杯状病毒、 鸡传染性支气管炎病毒、 猪流行性腹泻病毒. 在第二方面， 本发明提供一种药物组合物， 所述药物组合物包含本发明的化合物或其 药学上可接受的盐、 溶剂化物、 立体异构体、 互变异构体、 前药、 代谢物或衍生物和一种或 多种其它抗病毒药物， 以及任选的药学上可接受的赋形剂。 在第三方面， 本发明提供本发明的化合物， 用作干扰素相关疾病治疗药物。 在第四方面， 本发明提供一种治疗干扰素相关疾病的方法， 包括将治疗有效量的本发 明化合物或药物组合物给予有此需要的受试者的步骤。 应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具体描述 的各技术特征之间都可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅， 在此不再 一一累述。
Figure imgf000017_0001
图 13显示了化合物 D D02008H的合成路线。 图 14显示了化合物 D D02015H的合成路线。 图 15显示了化合物 D D02021H的合成路线。 图 16显示了化合物 D D02018H的合成路线。 图 17显示了化合物 D D02002H的合成路线。 图 18显示了化合物 DD02019H的合成路线。 具体实施方式 发明人经过广泛而深入的研究， 出乎意料地发现一系列高活性、 高选择性的 HPK1小 分子抑制剂。本发明人进一步阐述了 HPK1激酶与病毒感染的内在机制联系， 同时评估了这 些 HPK1小分子抑制剂作为单药疗法在细胞以及动物模型水平上的抗病毒效果。研究结果表 明， HPK1小分子抑制剂作为单药或组合物有望作为一种新型的广谱抗病毒疗法用于病毒相 关疾病治疗。 在此基础上完成了本发明。 术语定义 本文所用的术语与本领域技术人员常规理解的相同或相似。 为清晰起见， 对本文所用 的部分术语定义如下。 本文所用的术语“烷基”是指支链和直链的饱和脂族炷基， 其含有例如 1至 12、 1至 6 或 1至 4个碳原子。 烷基的实例包括但不限于甲基、 乙基、 丙基 （例如正丙基和异丙基）、 T 基 （例如正丁基、 异丁基、 仲丁基和叔丁基）以及戊基（例如正戊基、 异戊基、 新戊基）、 正己 基、 2 -甲基戊基、 2 -乙基丁基、 3 -甲基戊基和 4 -甲基戊基。 以下标形式出现在符号 “C”后的 数字表示特定基团可含有的碳原子数。 例如， “C「6烷基 ”表示具有 1-6个碳原子的直链和 支链烷基。 本文所用的术语 “烯基”是指具有至少一个双键的直链或支链炷基）。 所述烯基可任选 被一个或多个取代基取代， 并包括具有 “顺式 ”和 “反式” 取向的基团， 或者 “E”和 “Z” 取向的基团。 实例包括但不限于乙烯基、 烯丙基等。 本文所用的术语 “焕基”通常是指具有至少一个三键的支链或直链炷基。 焕基可以任 选被取代。在本申请中， 术语 “C2-3焕基”、 “C2-4焕基”、 "C2-5块基”、 “C2-6靛基”、 “C2-7貌基”和 “C2-8供基”通常是指分别含至少 2个， 且最多 3、 4、 5、 6、 7或 8个碳 原子的焕基基团。 焕基基团的非限制性实例包括乙焕基、 丙焕基、 丁：烘基、 戊焕基、 己焕基、 庚焕基、 辛焕基、 壬焕基、 癸焕基等。 本文所用的术语 “环烷基” 是指环状炷分子失去一个氢原子而得到的基团。 环烷基的 代表性实例包括但不限于环丙基、环戊基和环己基。单环的环烷基的实例是环丙基、环丁基、 环戊基、 环己基或环庚基。 本文所用的术语 “杂原子” 是指氧（0）、 硫（S域氮（N）。 “卤代 ”和 “卤素”是指 F、 Cl、 Br或 I。 相应地， 术语 “卤代烷基” 是指被一个或多个卤素取代的烷基。 本文所用的术语 “氤基”是指基团 -CN。 术语 “氨基”是指基团 -NH2。 本文所用的术语 “杂环烷基”或 “杂环基”是指包含 1-4个杂原子（若为单环的）、 1-6 个杂原子（若为双环的）或 1-9个杂原子（若为三环的）的环烷基， 所述杂原子选自 0、 S或 N。 杂环烷基可任选被一个或多个取代基取代。在一个实施方案中， 杂环烷基各环的。个、 1个、 2个、 3个或 4个原子可被取代基取代。 代表性的杂环烷基基团包括哌嚏基、 哌嗪基、 四氢 毗喃基、 吗 基、 硫代吗 基、 1,3 -二氧杂环戊基、 THF基、 四氢嚏吩基、 嚏吩基， 等等。 本文所用的术语 “芳香环” 或 “芳基”是指炷的单环、 双环或三环芳族环体系失去一 个氢原子而得到的基团。 芳基可任选被一个或多个取代基取代。 在一个实施方案中， 芳基各 环的 0个、 1个、 2个、 3个、 4个、 5个或 6个原子可被取代基取代。 芳基基团的实例包括 苯基、 蔡基、 芯基、 药基、 茸基、 莫基， 等等。 本文所用的术语 “芳香杂环 ”或 “杂芳基”是指在至少一个环中具有至少一个杂原子（0、 S或 N）的 “芳香环”或 “芳基” , 所述含有杂原子的环优选具有 1、 2或 3个独立地选自 0、 S或 N的杂原子。 含有杂原子的杂芳基基团中的每个环可以含有 1或 2个氧或硫原子和/或 1-4个氮原子，条件是在每个环中杂原子的总数为 4或更少并且每个环具有至少一个碳原子。 杂芳基基团可以连接于任何环的任何可利用的氮或碳原子上。杂芳基环系统可以是未取代的 或可以含有一个或多个取代基。 杂芳基基团的非限制性实例包括毗嚏基、 味喃基、 嚏吩基、 毗咯基、 嗯哩基、 嗯二哩基、 咪哩基、 嚏哩基、 异嗯哩基、 哇 □林基、 毗哩基、 异 n塞哇基、 哒 嗪基、 嚅嚏基、 毗嗪基、 三嗪基、 异哇口林基、 明 m坐基等。 本文所用的术语 “烷氧基”是指 -0-烷基。 烷氧基可任选被一个或多个取代基取代。 在本文中， “（co）”和 “c（o）”表示臻基部分。适合的残基部分的实例包括但不限于酮和醛 部分。 本文所用的术语 “烷基氨基”是指被一个或两个烷基取代的氨基。 术语 “氨基烷基” 则是指被一个或多个氨基取代的烷基。术语 “羟基烷基 ”是指被一个或多个羟基取代的烷基。 所述烷基部分任选具有一个或多个取代基。 本文所用的术语 “螺环基”表示两个碳环共用一个碳原子的多环基团。 杂螺环基”指 两个单环共用一个碳原子的多环基团， 其中两个环可含有 1个或多个杂原子。 本文所用的术语 “桥环基”指其中任意两个碳环共用两个不直接相连的碳原子的环基, 根据组成环的数目可以分为二环、 三环、 四环等。 “杂桥环基”是指多环的杂环基， 且该多 环的杂环基中有两个环共用两个不相邻的碳原子或杂原子。 本文所用的术语 “稠环基”表示由两个或两个以上碳环以共有环边而形成的多环有机 化合物。 “杂稠环基”指多环的杂环基， 且该多环的杂环基中有两个环共用两个相邻的碳原 子或杂原子。 本文所用的术语 “异构体”或 “立体异构体”是指具有相同化学组成但原子或基团在 空间中的排列不同的化合物。 术语 “互变异构体”或 “互变异构形式”是指具有不同能量的结构异构体， 其可通过 低能垒相互转化。 例如， 质子互变异构体（也称为质子互变的异构体）包括通过质子迁移的相 互转化， 例如酮 -烯醇和亚胺 -烯胺异构化。 化合价互变异构体包括通过重组一些成键电子的 相互转化。 术语 “非对映异构体”是指具有两个或更多个不对称中心并且其分子不为彼此的镜像 的立体异构体。 术语 “对映异构体”是指彼此不可重叠的镜像的化合物的两种立体异构体。 两种对映异构体的等摩尔混合物称为 “外消旋混合物”或 “外消旋体” 。 本文所用的术语 “预防和 /或治疗”不仅包括预防和 /或治疗疾病， 还通常包括预防疾病 的发作， 减缓或逆转疾病的进展， 预防或减缓与疾病相关的一种或多种症状的发作， 减少和 /或减轻与疾病相关的一种或多种症状， 降低疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度和 /或 持续时间和 /或预防疾病和 /或与其相关的任何症状的严重程度的进一步增加， 预防、 减少或 逆转由疾病引起的任何生理损伤， 以及通常对正在治疗的患者有益的任何药理学作用。本申 请的化合物或组合物形成可行的治疗剂不需要实现完全治愈或根除疾病的任何症状或表现。 如在相关领域中所认识到的， 用作治疗剂的药物可降低给定疾病状态的严重程度， 但不需要 消除疾病的每种表现才能被认为是有用治疗剂。类似地， 预防性施用的治疗构成可行的预防 剂不需要完全有效地预防病症的发作。 简单地在受试者中减少疾病的影响（例如， 通过减少 其症状的数量或严重程度， 或通过提高另一种治疗的有效性， 或通过产生另一种有益效果）, 或减少疾病发生或恶化的可能性就足够了。本文所用的术语“预防和 /或治疗 ”包括通过各种 方式实现的疾病的预防和 /或治疗， 例如通过提高受试者的免疫力来实现疾病的预防和 /或治 疗。 本文所用的术语 “给药”或 “施用”包括将所述化合物引入受试者以实现其预期功能 的途径。 可使用的给药途径的实例包括注射（皮下、 静脉内、 肠胃外、 腹膜内、 鞘内）、 局部、 口服、 吸入、 直肠和经皮。 本文所用的术语 “有效量”包括在必要的剂量和时间段内有效实现所需结果的量。 有 效量的化合物可根据例如受试者的疾病状态、年龄和体重等因素以及该化合物在该受试者中 引发所需响应的能力而变化。 可调整剂量方案以提供最佳治疗响应。 “治疗有效量”是指本 申请化合物的量，该量（i）治疗或预防特定疾病、病况或病症，（ii）减弱、改善或消除特定疾病、 病况或病症的一种或多种症状， 或（iii）预防或延迟本申请所述特定疾病、 病况或病症的一种 或多种症状的发作。 本文所用的术语 “受试者”或 “患者”是指动物， 例如哺乳动物， 包括但不限于灵长 类动物（例如人）、 牛、 绵羊、 山羊、 马、 狗、 猫、 兔、 大鼠、 小鼠等。 在某些实施方案中， 所述受试者为人。 本文所用的术语 “抑制 ”意指，与不存在该抑制剂时所述酶的活性相比，降低该目标酶的 活性。 在一些实施方案中， 术语 “抑制 "意指 HPK1活性降低至少约 5 %、 至少约 10%、 至少 约 20 %、 至少约 25 %、 至少约 50%、 至少约 60%、 至少约 70%、 至少约 80%、 至少约 90 % 或至少约 95 %； 或者0!0活性降低约5 %至约 25 %、约 25 %至约 50%、约 50%至约 75 % 或约 75 %至 100%； 或者15?10活性降低约95 %至 100% , 例如活性降低 95 %、 96%、 97 % 、 98 %、 99%或 100%。 本发明的化合物 本发明提供了一系列具有 HPK1抑制活性的化合物。 本发明的化合物能够提高或恢复 受试者体内的干扰素表达或产生，从而增强受试者的免疫力，进而治疗和 /或预防疾病。例如, 本发明的 HPK1抑制活性化合物可以增强 IFN-p介导的抗病毒作用和/或增强 IFN- Y介导的 T 细胞活化， 从而能够治疗和 /或预防病毒感染。在另一方面，本发明的 HPK1抑制活性化合物 还可以用来提高受试者的免疫力。 在具体的实施方式中， 本发明提供式 I所示化合物，
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式中的各取代基分别如上文所述。 在进一步优选的实施方式中， 本发明的化合物可以是式 1-2-1、 式 1-2-2或式 1-2-3所示 的化合物：
Figure imgf000022_0001
1-2-3 式中的各取代基分别如上文所述。 本发明的化合物可以形成药学上可接受的盐， 例如本发明化合物形成的有机盐或无机 盐。 实例性盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、 乙酸盐、草酸盐、 氯化物、 漠化物、 碘化物、 硝酸盐、 硫酸氢盐、 磷酸盐、 酸式磷酸盐、 异烟酸盐、 乳酸盐、 水杨酸盐、 酸式柠檬酸盐、 酒石酸盐、 油酸盐、 丹宁酸盐、 泛酸盐、 酒石酸氢盐、 抗坏血酸盐、 琥珀酸盐、 马来酸盐、 龙胆酸盐、 富马酸盐、葡萄糖酸盐、 葡萄糖醛酸盐、糖酸盐、 甲酸盐、 苯甲酸盐、谷氨酸盐、 甲磺酸盐、 乙磺酸盐、 苯磺酸盐、 对甲苯磺酸盐、 双羟蔡酸盐（即 I, r-亚甲基-双 -（2 -羟基 -3- 荼甲酸）盐）、 碱金属（例如钠和钾）盐、 碱土金属（例如镁）盐和铉盐。 药学上可接受的盐可涉及 包含另一种分子， 该分子例如乙酸根离子、 琥珀酸根离子或其它抗衡离子。 该抗衡离子可为 任何有机或无机部分， 其稳定所述母体化合物上的电荷。 此外， 药学上可接受的盐在其结构 中可具有多于一个带电的原子。在多个带电原子为药学上可接受的盐的一部分的实例中， 该 盐可以具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和 /或一个或 多个抗衡离子。 本发明的化合物也可以形成溶剂化物（例如， 水合物）。 术语 “溶剂化物”是指化合物与 一种或多种溶剂分子（不论有机或无机）的物理性缔合。 此物理性缔合包括氢键合。 在某些情 况下， 溶剂化物将是能够分离的， 例如当一个或多个溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时。 示 例性的溶剂化物包括水合物、 乙醇化物、 甲醇化物、 异丙醇化物、 乙腊溶剂化物和乙酸乙酯 溶剂化物。 溶剂化方法在本领域中是已知的。 本发明的化合物可在体内代谢。 因此， “代谢物” ， 即通过在体内代谢特定化合物或 其盐而产生的产物也应包括在本发明的保护范围内。 本发明的化合物也可以做成 “前药”或 “前体药物”， 即药物前体的化合物， 其在给 予受试者时， 通过代谢或化学过程经历化学转化， 得到式 I化合物或其盐。 关于前药的内容 是本领域所熟知的 (参见， 例如 Berge等 (1977) "Pharmaceutical Salts w , J. Pharm. Sci. 66: l-19)o 本发明的化合物也可以形成酯， 因此酯也在本申请的范围内。 具体酯的代表性的例子 包括但不限于， 甲酸酯、 乙酸酯、 丙酸酯、 丁酸酯、 丙烯酸酯和丁二酸乙酯。 本申请化合物意在包括本申请化合物中出现的原子的所有同位素。 例如， 氢的同位素 包括笊 (D)和氤 (T)。 碳的同位素包括 13C和 14C。 同位素标记的本申请化合物通常可通过本 领域技术人员已知的常规技术或通过类似于本申请所述的方法使用适当的同位素标记的试 剂替代在其它情况下所采用的未经标记的试剂来制备。 术语 “衍生物”指母体化合物分子中的原子或原子团被其他原子或原子团取代所形成 的化合物。 干扰素相关疾病 本文所述的干扰素相关疾病是指可以通过施用本发明的化合物来提高或恢复受试者体 内的干扰素表达或产生来治疗和/或预防的疾病。在具体的实施方式中， 所述干扰素是 IFN-0 和 /或 IFN-丫； 因此， 本发明的化合物可以作为 IFN-p和/或 IFN- Y信号通路的增强剂， 而本 文所述的 “干扰素相关疾病 ”亦包括 IFN-p/IFN-Y对其有治疗和 /或预防作用的所有病毒感染。 在具体的实施方式中， 所述干扰素相关疾病是病毒感染包括但不限于乙肝病毒
(Hepatitis B virus)、 麻疹病毒 (Measles Virus) > 辛德毕斯病毒 (Sindbis Virus) > 西尼罗河病毒 (West Nile Virus)、 登革病毒 (Dengue Virus) 疱疹病毒 (Herpes Simplex Virus) 人巨细胞病 毒 (Human Cytomegalovirus HCMV)> 埃博拉病毒 (Ebola Virus)、 丙肝病毒 (HCV)、 流感病 毒 (Influenza A Virus) > 严重急性呼吸综合征病毒 (SARS-CoV)、 寨卡病毒 (Zika Virus) > 艾 滋病毒 (HIV) 、 猫传腹病毒 (Feline Infectious Peritonitis Virus) > 小鼠肝炎病毒 (Mouse Hepatitis Virus) > 犬冠状病毒 ( Canine Coronavirus ) 、 猫杯状病毒 (Feline Calicivirus) 、 猫 白血病病毒 (Feline Leukemia Virus) 、 猫艾滋病毒 (Feline Immunodeficiency Virus) 、 猫泛 白血球减少症病毒 (Feline Panleukopenia Virus) 、 鸡传染性支气管炎病毒 (Avian Infectious Bronchitis Virus) 、 猪传染性胃肠炎病毒 (Transmissible Gastroenteritis Virus) 、 猪流行性腹泻 病毒 (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) 、 猪血凝性脑脊髓炎病毒 ( Porcine Hemagglutinating Encephalomyelitis Virus) 、 牛冠状病毒 (Bovine Coronavirus)等； 优选猫传腹病毒 (Feline Infectious Peritonitis Virus)、 小鼠肝炎病毒 (Mouse Hepatitis Virus) > 疱疹病毒、 严重急性呼 吸综合征病毒、寨卡病毒、猫传腹病毒、犬冠状病毒、猫杯状病毒、鸡传染性支气管炎病毒、 猪流行性腹泻病毒。 药物组合物 鉴于本发明的化合物能够治疗干扰素相关疾病， 可以将本发明的化合物制成药物组合 物。 在所述药物组合物中， 包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐、 溶剂化物、 立体异 构体、 互变异构体、 前药、 代谢物或衍生物以及任选的药学上可接受的赋形剂。 术语 “药学上可接受的 ”是指所描述的化合物、 物质、 组合物和/或剂型在合理的医药判 断范围内适用于与人和动物的组织接触而不引起过度的毒性、刺激性、 过敏反应或其它问题 或并发症， 从而与合理的益处 /风险比例相称。 术语 “赋形剂”或 “载体”是指在所用剂量和浓度下对细胞或哺乳动物无毒的载体、 赋形剂或稳定剂。 其非限制性实例包括缓冲剂， 例如磷酸盐、 柠檬酸盐和其它有机酸； 抗氧 化剂， 包括抗坏血酸； 低分子量（小于约 10个残基）多肽； 蛋白质， 例如血清白蛋白、 明胶或 免疫球蛋白； 亲水性聚合物， 例如聚乙烯基毗咯烷酮； 氨基酸， 例如甘氨酸、 谷氨酰胺、 天 冬酰胺、 精氨酸或赖氨酸； 单糖、 二糖和其它碳水化合物（包括葡萄糖、 甘露糖或糊精）； 螯 合剂如 EDTA；糖醇如甘露醇或山梨糖醇；成盐的抗衡离子如钠；以及 /或非离子表面活性剂, 例如 TWEEWM 、 聚乙二醇（PEG）和 PLURONICS™o在某些实施方案中， 所述药学上可接受 的载体为非天然存在的药学上可接受的载体。 本发明的化合物可以治疗干扰素相关疾病， 特别是病毒感染。 因此， 除了本发明的化 合物以外， 本发明的药物组合物中还可以包含一种或多种其它抗病毒药物， 从而增强所述药 物组合物的疗效。 本发明的优点：
1. 本发明提供了新型的高活性、 高选择性的 HPK1小分子抑制剂；
2. 本发明首次阐明了 HPK1激酶与病毒感染的内在机制联系；
3. 本发明的 HPK1小分子抑制剂能够作为单药疗法在细胞以及动物模型水平上表现出 抗病毒效果， 从而为干扰素相关疾病， 特别是病毒感染药物的开发奠定了全新的物质基础；
4. 本发明的 HPK1小分子抑制剂能够作为提高免疫力的辅助 /联合用药在细胞以及动物 模型水平上表现出抗病毒效果， 从而为干扰素相关疾病， 特别是病毒感染药物的开发奠定了 全新的物质基础。 以下结合具体实施案例对本发明的技术方案进一步描述， 但以下实施案例不构成对本 发明的限制， 所有依据本发明的原理和技术手段采用的各种施用方法， 均属于本发明范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条 件。 除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。 实施例 实施例 1. 本发明化合物的合成
1. 式 1-1系列化合物的合成及 HPK1抑制活性检测
1.1 化合物 DD02001H： 8-（（（ls,4s）-4 -氨基环己基）氧代）-N-（l-（l-甲基哌嚏 -4 -基）-lH- 毗哩一 4一基）喳哩咻一 2一胺的合成 化合物 DD02001H的合成路线如图 9所示。
1.1.1 化合物 2的合成 在 N2保护、 0°C下， 向化合物 1 (25.0 g, 150 mmoh 1.00 eq) 的 THF (300 mL) 溶液 中逐滴添加 BH3/THF (LOOM, 329 mL, 2.20 eq) 。 滴加完毕后， 将混合物在 0°C 下搅拌 30分钟，然后将混合物加热至 50°C并搅拌 12小时 °TLC(石油酰：乙酸乙酯 =1:1, 原料 R广 0」， 产品 Rf=0.3) 显示有新斑点形成， 原料完全消失， 反应完全， 随后将混合 物冷却 至 0°C, 逐滴添加 MeOH (400 mL ) 至无气泡形成， 然后添加 40.0 mL H2 O并用 乙酸乙酯 (300 mL*2)萃取， 有机层盐水 (100mL*2)洗涤， 无水 Na2SO4干燥并过滤， 然 后减压浓缩获得化合物 2 (45.0 g, 294 mmol, 98.2%产率) ， 该物质为淡黄色油状物
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向化合物 2 (45.0 g, 294 mmol, 1.00当量) 的二氯甲烷 (DCM) (500 mL) 溶液 中添加 MnCh (128 g, 1.47 mob 5.00当量) ， 所得混合物在 25°C下搅拌 12小时。 薄层 色谱 (石油醍： 乙酸乙酯 =1:1, 物料％=0.45, 产品 Rf=0.8) 显示有新斑点形成， 原料点 消 失， 反应结束后混合物经硅藻土过滤， 滤液减压浓缩。 经柱层析法 (SiO2, 石油醍/ 乙酸乙酯 =30/1至 5/1) 分离纯化得化合物 3 (25.0 g, 166 mmol, 56.3%产率) ， 结构经 LH NMR证实。
XH NMR (400 MHz, DMSO-必 ) d 9.85 (s, 1H), 7.18 (dd, J= 8.0, 1.2 Hz, 1H), 7.02 (dd, J= 8.0, 0.8 Hz, 1H), 6.80 (br s, 2H), 6.64 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 3.77-3.87 (m, 3H).
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将化合物 3 (23.0 g, 152 mmol, 1.00 eq) 、 尿素 (101 g, 1.67 mol, 89.7 mL, 11.0 eq) 和 NH4OAC (586 mg, 7.61 mmoL 0.05 eq) 的混合物在 160 °C T搅拌 0.5小时， 混 合物开始从热溶液 中析出沉淀。 添加 NMP ( 100 mL) 以溶解固体沉淀后， 将反应在 160 °C下搅拌 1小时。 LC-MS显示检测到 MS (RT=0.247分钟) 目标产物 4, 原料消失， 反 应结束后将混合物冷却至 25。(2并倒入 100 mL H2 O中， 25°C下搅拌 10分钟， 在减压 下过滤。 粗产物用石油醍 (60.0 mL)在 25°C下振荡分散 5 min, 并在减压下过滤以获得 化合物 4 (20.0 g, 114 mmoh 74.6%产率) ， 为灰色固体。 结构经 XH NMR证实。
LCMS: 产物 RT = 0.247 min, m/z = 177.2 (M+H)+ XH NMRC400 MHz, DMSO)(58.36 (s, 1H), 6.90 (br d, J =4.0 Hz, 1H), 6.87 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 6.79 (dd,J= 8.0, 4.0 Hz, 1H), 5.98 (dd, J= 8.0, 4.0 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H)。
1.1.4化合物 5的合成 将化合物 4 (19.0 g, 108 mmoh 1.00 eq ) 于0°(?下加入 POC13 (248 g, 1.61 moh 150 mL, 15.0 eq) 中， 所得混合物在 25°C搅拌 0.5小时， 然后升温至 140°C搅拌 2小时。 LC-MS 显示检测到目标产物 MS (RT=0.655分钟) 。 反应结束后， 将混合物缓慢倒入 0-10°C的冰水 (200 mL)中并搅拌，然后用乙酸乙酯 (300 mL*4)萃取，盐水 (100 mL*2) 洗涤有机层， 无水 Na2SO4干燥， 过滤并减压浓缩。 在 25°C下用石油醍 (60.0 mL)振荡 分散 5 min,过滤得黄色固体化合物 5 (7.60 g, 39.1 mmol, 36.2%产率)，结构经 XH NMR
Figure imgf000026_0001
在 0°C下向化合物 6-1 (10.0 g, 86.8 mmol, 10.1 mL, 1.00 eq) 、 化合物 6-la (11.7 g, 104 mmol, 1.20 eq) 和三苯基麟烷 (34.2 g, 130 mmoh 1.50 eq) 的 THF ( 300 mL) 溶液中加入 DIAD (26.3 g, 130 mmol, 25.3 mL, 1.50 eq) , 所得混合物在 25 °C. N2 保护下搅拌 12小时。 LCMS显示原料反应完全， 产物形成。 反应结束后， 用 1 MHC1 将反应混合物调节至 pH=4, 并用乙酸乙酯 (300 mL) 萃取， 用 NaHCO3 (饱和) 将水 相调节至 pH=8, 并用乙酸乙酯 (100mL*2) 再次莘取。 用饱和盐水 (100 mL) 洗涤有 机层，有机层使用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到化合物 6-2 (8.00 g, 38.1 mmol, 43.8%产率) ， 该化合物为黄色油状物质， 结构经 XHNMR证实。
LCMS 产物 RT = 0.150 min, m/z = 211.1 (M+H)+ XH NMR (400 MHz, CDCI3) <58.15 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 4.08 - 4.14 (m, 1H), 2.95 - 2.98 (m, 2H), 2.31 (s, 3H), 2.09 - 2.15 (m, 6H)。 化合物 6-2 ( 8.00 g, 38.1 mmol, 1.00当量)、 Pd/C ( 2.00 g, 10%纯度)在甲醇 ( 50.0 mL) 中搅拌， 混合物于 25°C下在 H2 ( 15 psi ) 下搅拌 12小时。 LCMS显示化合物 6-2 被完全消耗，反应结束后将混合物过滤并减压浓缩，得到黄色油状化合物 6 ( 5.00 g, 27.7 mmol, 72.9%产率) ， 结构经 XH NMR证实。
LCMS: 产物 RT = 0.10 min, m/z = 181.1 (M+H)+ XH NMR (400 MHz, CDCI3) <5 7.09 (s, 1H), 7.01 (s, 1H), 3.92 - 3.98 (m, 1H), 2.88 - 2.91 (m, 4H), 2.26 (s, 3H), 1.85 - 2.26 (m, 6H)。
Figure imgf000027_0001
向化合物 5 ( 400 mg, 2.06 mmol, 1.00 eq)和化合物 6 (444 mg, 2.47 mmoL 1.20 eq) 的 IPA ( lO.O mL) 中溶液中添加 TFA ( 23.4 mg, 205 umoh 15.2 uL, 0.10 eq) , 所得混合物在 1 OO°C T搅拌 2小时。 LCMS显示检测到目标产物质量 (RT=0.653 min) 。 用乙酸乙酯 ( 100 mL) 稀释混合物并用饱和 NaHCO3溶液 ( 50.0 mL) 洗涤， 再用盐水
( 50.0 mL) 洗涤有机相， 无水硫酸钠干燥， 过滤并浓缩得到固体物质， 用石油醍 ( 25.0 mL) 振荡分散得到化合物 7 ( 570 mg, 1.68 mmol, 81.9%产率) ， 其为黄色固体， 结构 经 LCMS和 XH NMR确认。
LCMS:产物 RT = 0.673 min, m/z = 339.3 (M+H) +
XH NMR ( 400 MHz, CDCI3 ) <5 9.05 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.31 - 7.35 (m,
2H), 7.21 - 7.25 (m, 1H), 7.10 - 7.12 (m, 1H), 4.12 - 4.14 (m, 1H), 4.05 (s, 3H), 2.98 - 3.01 (m, 2H), 2.34 (s, 3H), 2.14 - 2.23 (m, 6H).
Figure imgf000027_0002
向化合物 7 ( 570 mg, 1.68 mmol, 1.00 eq) 的 DCM ( 15.0 mL) 溶液中逐滴添加 BBr3 ( 1.05 g, 4.21 mmol, 405.7 uL, 2.50 eq) 。在 25°C下将混合物搅拌 12小时。 LCMS (EW20001-101-P1A1 ) 显示检测到目标产物 (RT=0.622 min) 。 反应结束周， 用 DCM ( 100 mL) 稀释混合物， 并用饱和 NaHCO3溶液 ( 50.0 mL) 洗涤， 用盐水 ( 50.0 mL) 洗涤有机相， 无水硫酸钠干燥， 过滤并浓缩得到化合物 8 ( 500 mg, 粗品) 作为黄色固 体， 在下一步中直接使用。
LCMS: 产物 RT= 0.847 min, m/z = 325.2 (M+H)+
Figure imgf000028_0001
向化合物 8 (200 mg, 616 umoL 1.00 eq )和化合物 9 ( 273 mg, 740 umoL 1 .20 eq) 的 DMF ( 3.00 mL) 溶液中添加 C s2CO3 ( 502 mg, 1.54 mmol, 2.50 eq) , 所得混合物 在 80 °C下搅拌 1小时。 LCMS显示检测到目标产物 (RT=0.799 min) 。 反应结束后， 添 加水 ( 50.0 mL) 淬灭混合物并用乙酸乙酯 ( 50.0 mL*2) 萃取， 用盐水 ( 50.0 mL)洗涤 有机相， 无水硫酸钠上干燥， 过滤并浓缩得到化合物 10 ( 320 mg, 613 umol, 99.5%产 率) ， 黄色油状物质， 未经进一步纯化， 下一步直接使用。
LCMS 产物 RT = 0.799 min, m/z = 522.3 (M+H)+ o
Figure imgf000028_0002
在 25 °C下将化合物 10 ( 320 mg, 613 umol , 1.00 eq) 与 HC1/二氧六环 ( 4 M, 10.0 mL, 65.2 eq) 的混合物搅拌 1小时。 LCMS显示检测到目标产物 (RT=0.651 min) 。 将 混合物浓缩得到残留物， 通过制备 HPLC纯化。 用饱和 NaHCO3溶液将混合物调节至 pH=8, 并用 DCM ( 50.0 mL*2 ) 萃取， 用盐水 ( 50.0 mL) 洗涤有机相， 无水硫酸钠干 燥， 过滤并浓缩得到化合物 D D02001H, 化合物结构经 LCMS、 HPLC
(EW20001-106-P1A2) 和 XH-NMR确认， 为黄色固体 ( 27.2 mg, 91.7 umol, 14.9%产 率， 96.7%纯度) 。
LCMS 产物 RT = 0.644 min, m/z = 422.3 (M+H) +
NMR (400 MHz, CDC13) <5 8.94 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.23 - 7.25 (m, 1H), 7.12 - 7.13 (m, 2H), 7.06 (s, 1H), 4.67 - 4.68 (m, 1H), 4.05 - 4.09 (m, 1H), 2.89 - 2.92 (m, 2H), 2.78 - 2.80 (m, 1H), 2.26 (s, 3H), 2.05 - 2.15 (m, 8H), 1.62 - 1.74 (m, 8H).
1.2 化合物 D D02013H： 4-((2-((4-((2-(二甲氨基)乙基 )(甲基)氨基)苯基)氨基 )哇哩哧 -8 -基)氧代)环己烷 -1-醇的合成 化合物 DD02013H的合成路线如图 10所示。
1.2.1 化合物 11的合成
Figure imgf000029_0001
0°C下， 向化合物 5 (500 mg, 2.57 mmoh 1.00 eq) 的 DCM (lO.OmL) 溶液中逐 滴加入 BBr3 (1.42 g, 5.65 mmol, 545 uL, 2.20 eq) 的 DCM (5.00 mL) 溶液。 滴加完 毕，在 25°C下将混合物搅拌 12小时 oLCMS显示检测到目标产品分子量 (RT=0.585 min)。 反应结束后， 混合物加水 (50.0 mL)淬火并用 DCM (50.0 mL)萃取。用盐水 (50.0 mL) 洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩以得到残余物，该残留物通过柱层析法 (SiCh， 石油醍/乙酸乙酯 =20/1到 10/1, TLC (石油醍： 乙酸乙酯 =3:1, Rf=0.3)纯化， 得到黄色 固体化合物 11 (400 mg, 2.21 mmoh 86.2%产率) ， 结构经 LCMS与 XHNMR确认。
LCMS: 产物 RT = 0.575 min, m/z = 181.0 (M+H)+ XH NMR (400 MHz, CDCI3) <59.30 (s, 1H), 7.59-7.64 (m, 1H), 7.49-7.52 (m, 1H), 7.42-7
Figure imgf000029_0003
向化合物 11 (200 mg, 1.11 mmoL 1.00 eq) 和化合物 Ila (639 mg, 1.66 mmol, 1.50 eq) 的 DMF (5.00 mL) 溶液中添加 CS2CO3 (721.6 mg, 2.21 mmol, 2.00 eq) , 所 得混合物在 80°C下搅拌 2小时。 LCMS检测到目标产物分子量 (RT=1.229分钟) 。 反 应结束后，添加水 (50.0 mL)淬灭反应， 用乙酸乙酯 (50.0 mL*2)萃取， 盐水 (50.0 mL) 洗涤有机相， 无水硫酸钠干燥， 过滤并浓缩得到残留物， 通过柱层析法 (SiCh， 石油醍 /乙酸乙酯 =20/1到 10/1, TLC (石油醍 /乙酸乙酯 =5:1, Rf=0.4) ) 纯化得到黄色固体化 合物 12 (100 mg, 254 umol, 22’9%产率) ， 结构经 XH NMR证实。
LCMS: 产物 RT = 1.229 mins, m/z = 393.2 (M+H) +
XH NMR (400 MHz, CDCI3) <59.25 (s, 1H), 7.55-7.60 (m, 1H), 7.49-7.51 (m, 1H), 7.34-7.37 (m, 1H), 4.53-4.57 (m, 1H), 3.90-392 (m, 1H), 215-2.20 (m, 2H), 1.86 -1.89 (m, 4H), 1.60-1.64 (m, 2H), 0.93 (s, 9H), 0.08 (s, 6H)。
Figure imgf000029_0002
向化合物 12-1 (2.00 g, 14.2 mmoh 1.50 mL, 1.00 eq ) 和化合物 12-la ( 1.59 g, 15.6 mmoh 2.03 mL, 1.10 eq) 的二甲基亚飒 ( lO.O mL) 溶液中添加 K2CO3 ( 3.92 g, 28.4 mmoh 2.00 eq) , 所得混合物在 40°C下搅拌 2小时。 TLC (石油醍： 乙酸乙酯 =5: 1 ) 显示化合物 12-1 (Rf=0.6 )保留， 并检测到新产物形成。 反应结束后， 用 H2O ( 100 mL) 稀释反应混合物并用乙酸乙酯 ( 100 mL*2)萃取， 饱和盐水 (200 mL)洗涤合并的有机 层， 无水硫酸钠干燥， 过滤并减压浓缩， 得到化合物 12-2 (3.20 g, 原油) ， 结构经 0 NMR 确认后用于下一步骤， 未进行进一步的纯化。
XH NMR(400 MHz, CDC13)<5 8.09-8.12 (m, 2H), 6.59-6.62 (m, 2H), 3.55 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 3.10 (s, 1H), 2.50 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 2.30 (s, 6H)。 向化合物 12-2 (3.20 g, 14.3 mmol, 1.00当量) 的 MeOH ( 30.0 mL) 溶液中添加 Pd/C ( 1.00 g, 10%纯度， 1.00当量) 。 悬浮液在真空下脱气， 并用氢气吹扫几次， 之后 所得溶液在 25。(2的田 ( 15 psi) 氛围下搅拌 2小时。 TLC (二氯甲烷： 甲醇 =10:1 ) 显 示化合物 12-2 (Rf=0.5) 原料点消失， 并检测到新化合物形成。 反应结束后， 将混合物 过滤并浓缩以得到化合物 12a (2.30 g, 11.9 mmoh 83.0%产率) ， 产物为红棕色油， 结 构经 XH NMR确证， 未经进一步纯化。
XH NMR (400 MHz, DMSO) B 6.47 - 6.54 (m, 4H), 4.34 (br. s, 2H), 3.19 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 2.72 (s, 1H), 2.30 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 2.14 (s, 6H)。
Figure imgf000030_0001
向化合物 12 ( 100 mg, 254 umoh 1.00 eq )和化合物 12a ( 59.0 mg, 305 umol, 1.20 eq) 的 IPA ( 3.00 mL) 溶液中添加 TFA (29.0 mg, 255 umol, 18.8 uL, 1.00 eq) 。 所 得混合物在 100°C下搅拌 1小时。 LCMS显示检测到目标产物分子量 (RT=0.913 min) 。 反应结束后， 用乙酸乙酯 ( 100 mL) 萃取， 先后用饱和 NaHCOs溶液 ( 50.0 mL) 、 盐 水 ( 50.0 mL) 洗涤有机相， 无水硫酸钠干燥， 过滤并浓缩， 得到化合物 13 ( 130 mg,
Figure imgf000030_0002
向化合物 13 ( 130 mg, 236 umol, 1.00当量) 的 D CM ( 5.00 mL)溶泡中添加 TFA ( 0.50 mL) , 所得混合物在 25°C下搅拌 1小时。 LCMS显示检测到目标产物分子量 (RT=0.701 min) 。 反应结束后， 将混合物浓缩得到残留固体， 通过制备高效液相色谱 法纯化， 所得固体用饱和 NaHCO3溶液调节至 pH=8, DCM ( 50.0 mL*2) 莘取， 用盐 水 ( 50.0 mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得黄色固体、 目标化合物 D D02013H
(47.6 mg, 130.7 umol, 55.3%产率， 94.9%纯度) , 结构经 LCMS、 HPLC和 XH-NMR 确认。
LCMS 产物 RT = 0.997 min, m/z = 436.3 (M+H)+
HPLC 产物 RT = 2.951 mins, purity: 95.6%
XH NMR (400 MHz, CDCI3) <5 9.00 (s, 1H), 7.83 - 7.85 (m, 2H), 7.29 - 7.31 (m, 1H), 7.17 - 7.19 (m, 3H), 6.85 - 6.87 (m, 2H), 4.78 - 4.79 (m, 1H), 3.76 - 3.81 (m, 1H), 3.49 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.95 (s, 3H), 2.54 (t, 7.2 Hz, 2H), 2.33 (s, 6H), 2.16 - 2.21 (m, 2H), 2.03 -
2.06 (m, 2H), 1.80 - 1.83 (m, 2H), 1.69 - 1.73 (m, 2H).
1.3 化合物 DD02014H： 4-((2-((l-(l-甲基哌嚏 -4 -基 )-lH』比哩 -4 -基)氨基 )喳哩咻 -8 -基)氧 代)环己烷 -1-醇的合成 化合物 DD02014H的合成路线示于图 11。 向化合物 8 (400 mg, 1.23 mmol, 1.00 eq) 和化合物 I la ( 569.1 mg, 1.48 mmol, 1.20 eq) 的 DMF ( 10.0 mL) 溶液中添加 CS2CO3 ( 1.00 g, 3.08 mmol, 2.50 eq) , 所得 混合物在 80°C T搅拌 1小时。 LCMS显示检测到目标产物分子量 (RT=0.958 min) 。 反 应结束后， 加入乙酸乙酯 ( 100 mL) , 并先后用饱和 NaHCO3溶液 ( 50.0 mL) 、 盐水 ( 50.0 mL) 洗涤有机相， 无水硫酸钠干燥， 过滤并浓缩得到残余物， 所述残留物用石 油醍： 乙酸乙酯 ( 3:1 , 20.0 mL)振荡分散， 过滤并干燥， 得到黄色固体、化合物 14 ( 300 mg, 559 umoL 45.3%产率) ， 结构经 LCMS表征。
LCMS 产物 RT = 0.912 min, m/z = 537.3 (M+H)+ o 在 25°C T将化合物 14 ( 300 mg, 559 umol, 1.00 eq)与 HCl/MeOH (4 M, 10.0 mL, 71.6 eq) 的混合物搅拌 1小时， LCMS (EW20001-117-P1A1 ) 显示检测到产物消失、 目 标产物分子量出现 (RT=0.729 min)。反应结束后，将混合物浓缩，所得固体经制备 HPLC 纯化， 随后用饱和 NaHCO3溶液将混合物调节至 pH=8, DCM ( 50.0 mL*2) 萃取， 盐 ZK ( 50.0 mL)洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩得黄色固体、化合物 D D02014H ( 35.5 mg, 138 umol, 24.6%产率， 96.9%纯度) ， 结构经 LCMS、 HPLC和 XH NMR确 证。
LCMS 产物 RT = 0.730 min, m/z = 423.2 (M+H)+
HPLC 产物 RT = 1.192 mins, purity: 98.0%
XH NMR (400 MHz, CDCI3) <5 9.01 (s, 1H), 8.61 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.28 - 7.30 (m, 1H), 7.17 - 7.22 (m, 3H), 4.66 - 4.68 (m, 1H), 4.23 - 4.30 (m, 1H), 3.85 - 3.89 (m, 1H), 2.99 - 3.03 (m, 2H), 2.33 (s, 3H), 2.25 - 2.29 (m, 4H), 2.15 - 2.17 (m, 4H), 1.95 - 2.06 (m, 2H), 1.84 - 1.88 (m, 4H). 1.4化合物 DD02006H： 4-((2-((4-(4 -甲基哌嗪 -1-基)苯基)氨基 )喳哩咻 -8 -基)氧代)环己烷 -1-醇的合成 化合物 DD02006H的合成路线示于图 12„
1.4.1 化合物 16的合成
25°C下， 向化合物 5 ( 1.00 g, 5.14 mmol, 1.00 eq)和化合物 16a ( 1.08 g, 5.65 mmol, 1.10 eq) 的 IPA (20.0 mL) 溶液中添加 TFA (586 mg, 5.14 mmol, 380 uL, 1.00 eq) ,
Figure imgf000032_0001
LCMS 显示检测到目标产物的分子量 (RT=0.691分钟) 。 反应结束后， 将混合物 倒入 30.0 mL H20中， 然后用乙酸乙酯 (60.0mL*4) 萃取， 盐水 (60.0mL*2) 洗涤有 机层， 无水 Na2SO4干燥， 过滤并减压浓缩， 得到化合物 16 (1.50 g, 粗品) ， 为一黄色 固体。 产品未经纯化， 直接用作下一步。
LCMS: 产物 RT = 0.691 min, m/z = 350.2 (M+H)+
Figure imgf000032_0002
0°C下， 向化合物 16 (1.30 g, 3.72 mmoh 1.00 eq) 的 DCM (20.0 mL) 溶液中逐 滴添加溶解于 D CM (lO.OmL) 中的 BBr3 (2.80 g, 11.2 mmol, 1.08 mL, 3.00 eq) , 滴加完毕之后， 在 0°C搅拌 30 min, 随后将混合物加热至 25°C并搅拌 12 h。 LCMS显示 检测到目标产物的分子量 (RT=0.677 min)。反应结束后， 将混合物倒入冰水 (30.0 mL) 中， 用乙酸乙酯 (60.0 mL*3) 萃取， 将盐水洗涤有机层 (30.0 mL*2) , 无水 Na2SO4 上干燥， 过滤并减压浓缩， 得到化合物 17 (1.20g, 粗品) ， 为一灰色固体。 产品未经 纯化， 直接用作下一步。
LCMS: 产物 RT = 0.677 min, m/z = 336.2 (M+H) +
Figure imgf000032_0003
化合物 17 ( 150 mg, 447 umoL 1.00 eq)、化合物 I la (276 mg, 894 umoL 2.00 eq) 和 CS2CO3 ( 364 mg, 1.12 mmoh 2.50 eq) 溶解于 DMF ( 10.0 mL) 中， 随后将混合物 加热到 80°C反应 12小时。 LCMS显示检测到目标产品分子量 (RT=0.934分钟) 。 反应 结束后， 将混合物倒入 30.0 mL H20中， 然后用乙酸乙酯 (3O0 mL*4)萃取， 将有机层 盐水 ( 30.0 mL*2)洗涤， 无水 Na2SO4干燥， 过滤并减压浓缩， 得到化合物 18 (200 mg, 粗品) ， 为一黄色固体。 产品未经纯化， 直接用作下一步。
LCMS 产物： RT = 0.934 min, m/z = 548.4 (M+H)+
Figure imgf000033_0001
在 25°C下向化合物 18 (200 mg, 365 umol, 1.00 eq) 的 DCM ( 6.00 mL) 溶液中 滴加 HCl/1,4 -二氧六环 (4 M, 2.00 mL, 21.9 eq) , 所得混合物搅拌 2小时。 LCMS显 示检测到目标产物分子量 (RT=0.746 min) 。 薄层色谱 (DCM:MeOH=8:l , 物料 Rf=0.5, 产品 Rf=0.2) 显示有新斑点形成， 无残留物质。 将混合物倒入 30.0 mL H2。中， 用饱和 NaHCCh调节 pH值约 8, 然后用乙酸乙酯 ( 30.0 mL*4) 莘取， 盐水 ( 30.0 mL*2) 洗涤 有机层， 无水 Na2SO4干燥， 过滤并减压浓缩。 粗产物经预高效液相色谱， 减压浓缩， 得到黄色固体目标产物( 68.6 mg, 157 umol, 43.1%产率， 99.4%纯度)，结构经〔H NMR、 LCMS 和 HPLC确认。
LCMS 产物： RT = 0.734 min, m/z = 434.3 (M+H)+；
HPLC 产物 RT = 1.373 mins, 99.4% 纯度；
XH NMR(400 MHz, DMSO) <5 9.57 - 9.71 (m, 1H), 9.12 - 9.27 (m, 1H), 7.90 - 8.06 (m, 2H), 7.40 - 7.47 (m, 1H), 7.28 - 7.34 (m, 1H), 7.18 - 7.26 (m, 1H), 6.86 - 6.99 (m, 2H), 4.75 (br s, 1H), 4.52 - 4.64 (m, 1H), 3.63 (br s, 1H), 3.07 (br d, J= 4.0 Hz, 4H), 2.24 (s, 3H), 1.91 - 2.05 (m, 2H), 1.74 - 1.87 (m, 2H), 1.56 - 1.72 (m, 4H).
1.5 化合物 D D02008H： 8-(2 -甲氧基乙氧基 )-N-(4-(4 -甲基哌嗪 -1-基)苯基 )哇哩咻 -2- 胺的合成 图 13显示了化合物 D D02008H的合成路线。 将化合物 17 ( 150 mg, 447 umol, 1.00 eq) 、 化合物 17a (68.4 mg, 492 umol, 46.2 uL, 1.10 eq) 和 CS2CO3 (437 mg, 1.34 mmol, 3.00 eq) 溶解于 DMF ( 10.0 mL) 中， 然后将混合物加热至 80°C并搅拌反应 12小时， LCMS显示检测到目标产品分子量 (RT=0.703分钟) 。 薄层色谱 (DCM:MeOH=10:l , 物料 Rf=O.b 产品 Rf=0.3 ) 显示有 新斑点形成， 无起始原料。 反应结束后， 将混合物倒入 30.0 mL H2 O中， 然后用乙酸乙 酯 ( 30.0 mL*4) 萃取， 盐水 (30.0 mL*2)洗涤有机层， 无水 Na2SO4干燥， 过滤并减压 浓缩。 通过柱层析法 ( SiCh， DCM/MeOH=20/l至 5/1 )纯化， 获得黄色固体目标化合物 DD02008H ( 71.94 mg, 183 umoh 40.9%产率， 98.6%纯度) , 结构经 XH NMR, LCMS 和 HPLC确证。
LCMS 产物： RT = 0.710 min, m/z = 416.2 (M+H+Na) +
HPLC 产物： RT = 1.267 min, 98.7% purity
XH NMR (400 MHz, CDC13) (5 9.04 (s, 1H), 7.72 (br d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.33 (dd, J = 8.0, 4.0 Hz, 1H), 7.15 - 7.24 (m, 2H), 6.97 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 4.33 - 4.41 (m, 2H), 3.91 - 3.99 (m, 2H), 3.56 (s, 3H), 3.13 - 3.25 (m, 4H), 2.58 - 2.65 (m, 4H), 2.38 (s, 3H).
1.6 化合物 D D02015H： 3-((2-((4-(4 -甲基哌嗪 -1-基)苯基)氨基 )喳哩 □林 -8 -基)氧代)环 戊烷 -1-醇的合成 图 14显示了化合物 D D02015H的合成路线。 将化合物 17 ( 150 mg, 447 umol, 1.00 eq) 、 化合物 18a ( 331 mg, 894 umol, 2.00 eq) 和 CS2CO3 ( 364 mg, 1.12 mmol, 2.50 eq) 溶解于 DMF ( 10.0 mL) 中， 然后将混 合物加热至 80°C并在搅拌反应 12小时。 LCMS显示检测到目标产品分子量 (RT=0.893min) , TLC (DCM:MeOH=10: b 物料 Rf=0.1 , 产品 Rf=0.25 ) 显示有新斑 点形成， 无起始原料。 反应结束后， 所得混合液倒入 30 mL水中， 随后用乙酸乙酯 (30.0 mL * 4)莘取， 盐水洗涤 ( 30.0 mL * 2) , 无水硫酸钠干燥， 过滤， 减压除去溶剂， 所得 残留固体通过柱层析法 ( SiO2, DCM/MeOH=20/l至 5/1 ) 纯化， 得到黄色固体化合物 19 (200 mg, 375 umol, 83.8%产率) 。
LCMS 产物： RT = 0.893 min, m/z = 534.4 (M+H) + 将化合物 19 (200 mg, 375 umol, 1.00 eq) 溶于 DCM ( 6.00 mL) 中， 25°C下滴 加 HCl /1,4 -二氧六环 (4 M, 4.00 mL, 42.7 eq) , 滴加完毕， 搅拌反应 2小时。 LCMS 显示检测到目标产物分子量 (RT=0.721min) , 高效液相色谱显示起始原料反应完毕。 反应结束后将混合物倒入 30.0 mL H2O中，用饱和 NaHCO3调节至 pH值约 8,然后用乙 酸乙酯 ( 30.0 mL*4) 萃取， 有机层盐水 ( 30.0 mL*2)洗涤， 无水 Na2SO4干燥， 过滤并 减压浓缩，所得粗产物经制备高效液相色谱纯化，得黄色固体目标化合物 D D02015HC 110 mg, 262 umoL 70.0%产率， 100%纯度) ， 结构经 XH NMR> LCMS和 HPLC确证。
LCMS 产物： RT = 0.716 min, m/z = 420.3 (M+H) +
HPLC 产物： RT = 1.286 min, 100%纯度.
XH NMRC400 MHz, CDCI3)。 9.04 (s, 1 H), 7.60 (br d, J= 8.0 Hz, 2 H), 7.32 - 7.38 (m, 1 H), 7.21 - 7.24 (m, 2 H), 6.93 - 7.01 (m, 2 H), 5.15
Figure imgf000034_0002
4.0 Hz, 1 H), 4.41 (br t,
Figure imgf000034_0001
4.0
Hz, 1 H), 3.17 - 3.26 (m, 4 H), 2.62 (m, 4 H), 2.38 (s, 3 H), 1.94 - 2.20 (m, 6 H).
1.7 化合物 DD02021H： 4-((2-((5-(4 -甲基哌嗪 -1-基 )毗嚏 -2 -基)氨基 )哇哇 □林 -8 -基)氧 代)环己烷 -1-醇的合成 图 15显示了化合物 D D02021H的合成路线。
1.7.1 化合物 20的合成
Figure imgf000035_0001
化合物 19a (988 mg, 5.14 mmoL 2.00 eq)、 Pd2(dba)3 (353 mg, 386 umoL 0.15 eq)和 BINAP ( 184 mg, 295 umoL 1.15e-l eq)溶解于 1,4 -二氧六环 ( 30.0 mL )中，所得混合物中加入 Cs2CO3 (1.67 g, 5.14 mmol, 2.00 eq) , 然后将反应混合物加热到 100°C并搅拌反应 10小时。 LCMS显示检 测到目标产物分子量 (RT=0.643 min) 。 反应结束后， 将混合物倒入 30.0 mL H2 O中， 然后用 DCM (50.0 mL*3)萃取， 有机层盐水 (30.0 mL*3)洗涤， 无水 Na2SO4 ±干燥， 过滤并减压浓缩， 得到化合物 20 (600 mg, 粗品) ， 为一黄色固体。 产品未经纯化， 直
Figure imgf000035_0002
将化合物 20 (600 mg, 1.71 mmoh 1.00 eq) 溶于 DCM (10.0 mL) 中， 所得溶液 逐滴添加溶解于 DCM (5.00 mL) 中的 BBr3 (429 mg, 1.71 mmol, 165 uL, 1.00 eq) , 滴加完毕,体系在 25°C下搅拌反应 12小时 OLCMS显示检测到目标产物分子量 (RT=0.321 min) o 反应结束后， 将混合物倒入冰水 (40.0 mL) 中， 用饱和 NaHCO3将 pH调整至 约 8, 然后用 DCM (50.0mL*3) 萃取， 有机层经盐水 (30.0mL*3) 洗涤， 无水硫酸钠 干燥， 过滤并减压浓缩， 得到化合物 21 (600 mg, 粗品) ， 为一黄色固体。 产品未经纯 化， 直接用于下一步反应。
LCMS 产物 RT = 0.324 min, m/z = 337.2 (M+H) +
Figure imgf000035_0003
将化合物 21 (600 mg, 1.78 mmol, 1.00 eq) 、 化合物 Ila (1.37 g, 3.57 mmol, 2.00 eq) 和 CS2CO3 (1.45 g, 4.46 mmoh 2.50 eq) 溶解于 DMF (10.0 mL) 中， 所得混 合物加热到 80°C反应 12小时。 LCMS显示检测到目标产物分子量 (RT=0.830 min) , 薄层色谱 (DCM:MeOH=10:l, 物料 Rf=O.L 产品 Rf=0.3) 显示有新斑点形成， 无起始 原料。反应结束后， 将混合物倒入 30.0 mL H2 O中， 然后用乙酸乙酯 (60.0mL*3)萃取, 有机层盐水 (40.0 mL*2) 洗涤， 无水 Na2SO4干燥， 过滤并减压浓缩， 所得物质通过柱 层析法 ( SiO2， DCM/MeOH=40/ 1至 5/1 ) 纯化， 得到化合物 22 ( 700 mg, 1.08 mmoh 60.5%产率， 84.6%纯度) , 为一黄色固体。
LCMS 产物 RT = 0.830 min, m/z = 549.4 (M+H) +
HPLC 产物 RT = 2.563 mins, 84.6%纯度.
Figure imgf000036_0001
将化合物 22 ( 600 mg, 925 umol, 1.00当量) 、 HCl/1,4 -二氧六环 (4 M, 6.00 mL, 25.9当量) 溶解于 DCM ( lO.O mL) 中， 所得混合物在 25°C下搅拌反应 1小时。 LCMS 显示检测到目标产物分子量 (RT=0.680min) ,薄层色谱 (DCM:MeOH=10:l ,物料 Rf=0.3, 产品 Rf=0.15) 显示有新斑点形成， 无起始原料。 反应结束后， 搅拌下将混合物缓慢倒 A 40.0 mL H20中， 然后用乙酸乙酯 ( 80.0 mL*3 ) 萃取， 有机层盐水 ( 50.0 mL*2) 洗
Figure imgf000036_0002
确证。
LCMS 产物 RT = 0.717 min, m/z = 435.3 (M+H) +
HPLC 产物 RT = 1.232 min, 96.7% 纯度
XH NMR C400 MHz, DMSO) d 9.74 (s, 1H), 9.26 (s, 1H), 8.86 (d, 8.0 Hz, 1H), 8.02
(d, J= 4.0 Hz, 1H), 7.43 - 7.57 (m, 2H), 7.24 - 7.40 (m, 2H), 4.78 (br s, 1H), 4.62 - 4.73 (m, 1H), 3.54 - 3.69 (m, 1H), 3.08 - 3.16 (m, 4H), 2.47 (m, 3H), 2.23 (s, 3H), 1.93 - 2.04 (m, 2H), 1.74 - 1.88 (m, 2H), 1.58 - 1.72 (m, 4H).
1.8 化合物 D D02018H： 4-((8-((4 -羟基环己基)氧代 )喳哩口林一2 -基)氨基 )-N-(l-甲基哌 嚏一 4 -基)苯酰胺的合成 图 16显示了化合物 D D02018H的合成路线。
25°C下，将化合物 11 (400 mg, 2.21 mmol, 1.00 eq)、化合物 l la( 1.28 g, 3.32 mmol, 1.50 eq) 和 CS2CO3 ( 1.44 g, 4.43 mmol, 2.00 eq) 溶解于在 DMF ( lO.O mL) 中， 所得 混合物加热至 80°C并搅拌反应 2小时。 LCMS显示检测到目标产物分子量 (RT=1.218min)。反应结束后， 将混合物缓慢倒入 40.0 mL H2 O中， 然后用 D CM ( 80.0 mL*3 ) 莘取， 有机层盐水 ( 50.0 mL*2) 洗涤， 无水 Na2SO4 ±干燥， 过滤并减压浓缩， 得到化合物 15 ( 310 mg, 粗品)， 为一灰色固体。产品未经纯化， 直接用于下一步反应。 将化合物 15 ( 260 mg, 661 umoh 1.00 eq)、 化合物 15a ( 231.53 mg, 992.38 umoh 1.50 eq) 和 TFA ( 75.4 mg, 661 umoh 49.0 uL, 1.00 eq) 溶解于 IPA ( lO.O mL) 中， 然后将所得混合物加热至 80°C并搅拌反应 2小时， 再将混合物加热至 100 °C并搅拌 2小 时 o LCMS显示检测到目标产物分子量 (RT=0.762 min) ,高效液相色谱显示纯度为 59.7% (RT=1.535 min) 。 反应结束后， 在搅拌下将混合物缓慢倒入 40.0 mL H2 O中， 用饱和 NaHCCh调节 pH至 8左右，然后用 DCM ( 80.0 mL*3 )萃取，有机层用盐水 ( 50.0 mL*2) 洗涤， 无水硫酸钠干燥， 过滤并减压浓缩， 所得粗品经制备高效液相色谱纯化， 所得物 质用饱和 NaHCO3调节 pH至 8左右， 用 D CM ( 40.0 mL*4 )莘取， 用盐水 ( 40.0 mL*3 ) 洗涤有机层， 无水 Na2SO4干燥， 过滤， 浓缩， 获得目标产物 DD02018H ( 17.1 mg, 35.13 umol, 5.31%产率， 97.7%纯度) ， 为一浅黄色固体， 结构经 XH NMR^ LCMS和 HPLC 确证。
LCMS 产物 RT = 0.771 min, m/z = 476.2 (M+H) +
HPLC 产物 RT = 1.535 mins, 97.3%纯度
NMR ( 400 MHz, DMSO-t/6) <5 10.15 (br s, 1H), 9.30 (br s, 1H), 8.23 (br d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.13 (br s, 1H), 7.83 (br d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.49 (br s, 1H), 7.27 - 7.42 (m, 2H), 4.73 (br s, 1H), 4.60 (br s, 1H), 3.87 (br s, 1H), 3.07 (br s, 2H), 2.62 - 2.67 (m, 2H), 2.33 (br s, 3H), 1.84 - 2.08 (m, 3H), 1.73 (m, 9H).
1.9 化合物 DD02002H： 4-((8-((3 -羟基环戊基)氧代 )喳哇 □林 -2 -基)氨基)苯磺酰胺的合 成 图 17显示了化合物 D D02002H的合成路线。
1.9.1 化合物 23的合成 氮气保护下， 将化合物 11(200 mg, 1.11 mmol)溶于无水四氢口夫喃 ( 5 mL) 中， 依次 加入三苯基磷 ( 581 mg, 2.22 mmol) , DIAD (449 mg, 2.22 mmol) , 搅拌 15min, 最 后加入 1 , 3 -环戊二醇 (即化合物 22, 340.1 mg, 3.33 mmol), 反应液室温搅拌过夜， TLC
Figure imgf000037_0001
LCMS 产物 RT=2.76 min, m/z = 265.1 (M+H) +
1.9.2 化合物 DD02002H的合成 氮气保护下， 将化合物 23 (200 mg, 0.76 mmol)溶于异丙醇 ( 5 mL) 中， 加入对氨 基苯磺酰胺 (260.2 mg, 1.51 mmol), 反应加热至 90°C反应过夜， 薄层层析分析显示有部 分原料剩余， 有新产物点生成， LCMS显示检测到目标产物分子量。反应结束后， 浓缩, 所得粗品经硅胶柱分离， 得目标分子 D D02002H ( 104 mg) , 收率 34%, 为一白色固体, 结构经 XH NMR和 LCMS确证。
LCMS 产物 RT = 3.46 min, m/z = 401.1 (M+H)+ XH NMR( 400 MHz, MeOD )B 9.21(s, 1H), 8.23-8.25(m, 2H), 7.87-7.89(m, 2H), 7.48(d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.33-7.37(m, 2H), 4.36(m, 1H), 4.20(m,lH), 1.76-2.10(m, 6H)。
1.10化合物 DD02019H： 3 -((8-((4 -羟基环己基)氧代 )喳哩口林一2 -基)氨基)苯磺酰胺的合成 图 18显示了化合物 DD02019H的合成路线。
1.10.1 化合物 26的合成 氮气保护下， 将化合物 11 (200 mg, 1.11 mmol)溶于无水四氢味喃 ( 5 mL) 中， 依 次加入三苯基磷 ( 581 mg, 2.22 mmol) , DI AD ( 449 mg, 2.22 mmol ) , 所得混合物搅 拌 15min, 最后加入 1 , 4 -环己二醇 ( 387 mg, 3.33 mmol), 所得反应液室温搅拌过夜， TLC (PE/EA=3 : 1 ) 分析显示原料消耗完毕， 有新产物点生成， LCMS检测到目标产品 分子量 (RT = 4.03 min ) ,反应液浓缩，所得粗产品经硅胶柱分离得化合物 26 (197 mg), 收率 70.7%, 浅黄色固体。
LCMS 产物 RT = 4.03 min, m/z =279.1 (M+H)+
1.10.2 化合物 DD02019H的合成 氮气保护下， 将化合物 26 (150 mg, 0.54 mmol)溶于异丙醇 ( 5 mL) 中， 加入间氨 基苯磺酰胺 ( 185.4 mg, 1.1 mmol), 反应加热至 90°C反应过夜， TLC分析显示原料有剩 余， 同时有新产物点生成， LC-MS检测到目标产物分子量， 反应液浓缩， 所得粗品经硅 胶柱分离，得目标分子 D D02019H C 27 mg) , 收率 12.1%,为一白色固体，结构经 LC-MS 与 XH NMR确证。
LCMS 产物 RT = 3.54 min, m/z = 415.2 (M+H) +
XH NMR ( 400 MHz, MeOD ) 5 9.19 (s, 1H), 8.5 l(m, 2H), 7.34-7.55(m, 5H), 4 62 (m, 1H), 3.73(m, 1H), 1.57-1.94(m, 8H)。
1.11 式 1-1系列化合物体外抑制 HPK1激酶活性的测试 表 1. 列出了实验所需试剂及其来源情况 材料与试剂名称 供应商 产 品编号
HPK 1 Signalchem M23 -11G-10
MBP Signalchem M42-52N-1MG
ADP-Glo Kinase Assay Promega V9102
DMSO Sigma D8418
Sunitinib Selleck C64749
ATP Promega V915B 所有化合物测试的起始浓度为 lO piM, 三倍浓度梯度稀释， 共 10个浓度点， 每个 浓度重复一次。
1.11.1 化合物体外抑制 HPK1激酶活性测试 实验开始前， 配置好 50 pM DTT以及酶促反应系统缓冲液。 移液枪将化合物稀释液转移到 384孔板中， 加毕， 将 384孔板密封， 转速 1000g T 离心 1 min； 在激酶缓冲液中，配置好 2倍浓度的 HPK1溶液， 随后向 384孔加入 2.5 ycL 配置好的 2倍浓度的 HPK1溶液， 在转速 1000 g下离心 30 s, 室温孵育 10 min； 在激 酶缓冲液中， 制备 2倍浓度的 MBP和 ATP的混合液， 向上述反应体系中加入 2.5 pL配 置好的 2倍浓度的 MBP和 ATP的混合液， 反应开始， 在转速 1000 g T离心 30 s, 随后 室温孵育 1 h； 向反应体系中加入 5应 ADP-Glo试剂， 室温孵育 40 min； 加入 10 piL激 酶检测试剂， 室温孵育 40 min, 随后在 Envision 2104 plate阅读器上读取发光信号， 按 照以下公式计算抑制率：
% inhibition =100-(Signalcmpd-SignalAve_PC)/(SignalAve_vc-SignalAve_PC)x 100 上式中， cmpd指测试化合物， PC指阳性对照， VC指阴性对照。 HPK1实验所采 用的阳性对照为 Sunitinib。 表 2. 列出了各实施例所述的化合物对 HPK1激酶活性的抑制能力
Figure imgf000039_0002
Figure imgf000039_0001
1 2 向化合物 1 ( 345 g, 2.67 moL, 371 mL, 1.00 eq) 的 MeOH (2.00 L) 溶液中加入 MeONa ( 14.4 g, 267 mmol , 0.10 eq) , 用 N?吹扫 3次， 然后在 20°C下搅拌 16小时。 TLC (石油酰 /乙酸乙酯 =5/1 )显示化合物 l (Rf=0.70)消失，检测到一个新斑点 ( Rf=0.45 ) o 用干冰将所得混合物的 pH值调整为 9左右， 然后在真空下浓缩得到黄色混合物。 将混 合物倒入水中 ( 1.00升) ， 然后用乙酸乙酯 ( 1.00 L*2) 莘取。 有机层经无水 Na2SO4 干燥， 过滤， 真空浓缩， 得化合物 2 ( 400g, 2.48 moL, 收率 92.9%) , 为淡黄色油状 物质， 结构经 XH NMR确证。
NMR ( 400 MHz, CDCI3) 5 7.89 (s, 1H), 4.80 (s, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.61 -3.53 (m, 4H),
Figure imgf000040_0003
在 25°C下向化合物 b ( 80.0 g, 171 mmoL, 61.0%纯度， LOO eq )的 MeOH ( 500 mL) 溶液中加入化合物 2 (4L3 g, 256 mmol, 1.50 eq) , 然后在 25°C下搅拌 2小时。 LCMS 显示化合物 b消失， 并检测到所需质量。 反应结束后， 45°C下、 减压下浓缩所得液体混 合物。用乙酸乙酯 ( 1 00 L)溶解残留物， 并用盐水 (200 mL*2)洗涤。有机相用 Na2SO4 干燥， 过滤并浓缩得到残渣。 20°C下用石油醒 /乙酸乙酯 ( 5/1 , 150ml) 研磨残渣， 并过 滤以获得滤饼， 得到化合物 3 ( 53.0g, 121mmoL, 收率 71.0%, 纯度 95.0%) , 为一淡 黄色固体， 结构经 L C-MS以及 XH NMR确证。
LCMS: m/z = 415.0 (M+H) +
M NMR: (400 MHz, DMSO-扁)》 7.76 (dd, J= 6.2, 8.2 Hz, 1H), 7.13 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 6.62 - 6.19 (m, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.23 (s, 2H), 3.66 - 3.42 (m, 4H), 1.15 (t, J= 7.0 Hz, 6H)O
Figure imgf000040_0001
化合物 3 ( 94.0 g, 212 mmol, 93.5%纯度， 1.00当量)于 10°C下添加至 H2SO4 ( 920 g, 9.38 moL, 500 mL, 44.2当量) 中， 然后加热至 60 °C , 反应 16小时。 LCMS显示化 合物 3被消耗完毕， 并检测到目标产物分子量。 反应结束后， 将反应液冷却至 25 °C , 冰 ( 5.00 L)冷却， 用 NaOH固体调整 pH值约 13 , 温度保持在 20°C以下， 出现大量固体， 过滤， 滤饼真空干燥， 在 25°C下用乙酸乙酯 (300 mL)研磨滤饼， 得黄色固体化合物 4 ( 60.0 g, 186 mmol, 87.7%产率) ， 结构经 L C-MS以及 XH NMR确证。
LCMS: m/z = 322.9 (M+H)+ XH NMR (400 MHz, DMSO-^) <5 8.96 (s, 1H), 8.21 (d, J= 5.8 Hz, 1H), 6.62 (s, 1H), 6.31
Figure imgf000040_0002
25°C下， 将化合物 4 (41.0g, 121 mmol, 95.6%纯度， 1.00当量)与化合物 c (30.2 g, 146 mmoL, 1.20 eq) 溶解于二氧六环 (410 mL) 和 H2O (41.0 mL) 中， 所得溶液 加入 K3PO4 (51.6 g, 243 mmoL, 2.00 eq)和 Pd(dppf) Cl2 (8.89 g, 12.1 mmol, 0.10 eq) , 所得悬浮液在真空下进行脱气并用 N2吹扫数次，随后反应在 100°C下搅拌 7小时。 LCMS 显示化合物 4被消耗完全， 并检测到目标产物分子量。 反应结束后， 所得混合物用冰水 (1000 mL)淬灭， 然后用二氯甲烷 (1000 mL*2) 萃取， 有机层使用无水 Na2SO4干燥, 过滤并在真空下浓缩， 所得固体在 25°C下用石油酰 /乙酸乙酯 (2/1, 200 mL) 研磨， 得 到化合物 5 (33.0 g, 103 mmol, 85.3%产率， 86.7%纯度)，为一黄色固体，结构经 LC-MS 与 XHNMR确证。
LCMS: m/z = 276.1 (M+H)+
1JINMR (400 MHz, CDCI3) (59.20 (s, 1H), 7.41 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 6.92 - 6.79 (m,
1H), 6.71 (s, 1H), 6.36 (ddd, J= 0.8, 1.6, 3.6 Hz, 1H), 6.27 (dd, J=2.8, 3.6 Hz, 1H), 4.57 (s,
2H), 3.64 (d, J= 1.6 Hz, 3H)。
Figure imgf000041_0001
0 g, 124 mmoL, 1.20 eq ) 和毗嚏 Py (82.1 g, 1.04 mol, 83.8 mL, 10.0 eq ) 溶解于 DCM (500 mL) 中， 所得的溶液中添加 POC13 (19.3 g, 126 mmol, 11.7 mL, 1.22 eq) , 随 后反应液在 15°C下搅拌反应 1.5小时。 TLC (石油酰 /乙酸乙酯 =1/1)显示， 化合物 5 (Rf
= 0.40) 消耗完毕， 目标产物斑点 (Rf= 0.47, 0.75) 被检出。 反应结束后， 反应混合物 在减压下浓缩得到残渣，残渣经硅胶层析纯化 (石油酰 /乙酸乙酯 =8/l-5/l,Rf=0.47,0.75), 得化合物 6_cis顺式 (7.00g, 19.3mmoL, 18.6%产率， 100%纯度) ， 为一淡黄色固体， 化合物 6_trans反式 (5.00g, 13.7mmoL, 13.2%产率， 99.1%) , 为一淡黄色固体。
LCMS: RT = 0.959 min, m/z = 362.1 (M+H)+
LCMS RT = 0.986 min, m/z = 362.1 (M+H)+ 化合物 6_cis： XH NMR:(400 MHz, CDC13)59.31 (s, 1H), 8.61 (s, 2H), 7.66 (d, J= 6.6 Hz, 1H), 6.94 - 6.80 (m, 1H), 6.43 (td, 1.6, 3.4 Hz, 1H), 6.29 (dd, J = 2.8, 3.6 Hz, 1H), 5.00 - 4.73 (m, 1H), 3.66 (d, J= 1.4 Hz, 3H), 2.08 - 1.87 (m, 2H), 1.34 - 1.24 (m, 1H)。 化合物 6_trans：
Figure imgf000041_0002
(400 MHz, CDCI3) 59.33 (s, 1H), 8.59 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 7.66 (d, J= 6.6 Hz, 1H), 6.93 - 6.80 (m, 1H), 6.42 (td, J= 1.6, 3.4 Hz, 1H), 6.29 (dd, J = 2.8, 3.6 Hz, 1H), 5.10 - 4.81 (m, 1H), 3.66 (d, J= 1.4 Hz, 3H), 2.21 - 2.08 (m, 1H), 1.60 - 1.50 (m, 2H)o
2.1.6 化合物 7_cis的合成
Figure imgf000042_0001
eq)、 BrettPhos Pd G3 ( 2.51 g, 2.76 mmoL 0. 10 eq)和 K3PO4 ( 17.6 g, 82.9 mmoL 3.00 eq)溶解于 2 -甲基 -2 -丁醇 ( 1.00 L) 中， 所得溶液脱气并用 N?吹扫 3次， 然后在 100 °C 下、 N2气氛下搅拌反应 16小时。 LCMS显示化合物 6_Cis被消耗完毕， 并检测到目标 产物分子量。 反应结束后， 过滤， 所得滤液在真空下浓缩， 残渣经硅胶层析纯化 (石油 醍/乙酸乙酯 =10/1-3/1 , R广 0.40) ，得化合物 7_cis ( 3.90g, 8 31mmoL, 收率 30.1%, 纯 度 94.3%) , 为一淡黄色固体， 结构经 L C-MS以及 XH NMR确证。
LCMS: m/z = 443.3 (M+H) +
HPLC: 94.3% purity under 220 nm.
XH NMR: (400 MHz, DMSO-^) 5 10.99 (s, 1H), 9.33 (s, 1H), 9.09 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 7.84 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.52 - 6.29 (m, 1H), 6.23 - 6.13 (m,
1H), 5.15 - 4.81 (m, 1H), 3.63 (s, 3H), 2.30 - 2.15 (m, 1H), 1.77 - 1.60 (m, 1H), 1.47 (s, 9H),
1.25 - 1.02 (m, 1H)O
2.1.7 化合物 7 trans的合成
Figure imgf000042_0002
将化合物 6_trans ( 10.0 g7 27.6 mmoL 1.00 eq)、 BocNH2 ( 62.8 g? 536 mmol, 19.4 eq) 、 BrettPhos Pd G3 ( 2.51 g, 2.76 mmoh 0.10 eq)和 K3PO4 ( 17.6 g, 82.9 mmol , 3.00
Figure imgf000042_0003
LCMS: m/z = 443.3 (M+H) +
HPLC: 87.4% purity under 220 nm0
NMR: (400 MHz, DMSO-必) S 11.11 (s, 1H), 9.33 (s, 1H), 9.09 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 7.82 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 7.04 - 6.93 (m, 1H), 6.45 - 6.31 (m, 1H), 6.17 (dd, J= 2.6, 3.6 Hz, 1H), 5.11 - 4.77 (m, 1H), 3.62 (s, 3H), 2.74 - 2.57 (m, 1H), 1.67 - 1.42 (m, 10H), 1.27 (dt, J = 6.6, 13.0 Hz, 1H)。
Figure imgf000043_0001
在 25 C下搅拌反应 16小时。 LCMS显示化合物 7_Cis被消耗完毕， 并检测到目标产物 分子量。 反应结束后， 所得溶液减压浓缩得到固体， 用饱和 NaHCO3水溶液调节 pH值 约 8, 然后用二氯甲烷 /甲醇 =10/1 ( lOO mL) 萃取残留物， 所得有机层用无水硫酸钠干 燥，过滤，减压蒸馅，得到 DD02001A_Cis ( 3Q7g, 8.17mmol,收率 98.3%,纯度 93.2%) , 为一黄色固体， 结构经 L CMS、 1H NMR以及 F NMR确证。
LCMS: m/z = 343.2 (M+H) +
HPLC: 93.2% purity under 220 nm.
XH NMR: ( 400 MHz, DMSO-O 6 10.80 (s, 1H), 9.36 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 7.06 - 6.88 (m, 2H), 6.31 - 6.10 (m, 4H), 5.08 - 4.78 (m, 1H), 3.60 (s, 3H), 2.30 - 2.17 (m, 1H), 1.74 - 1.60 (m, 1H), 1.18 - 1.09 (m, 1H)
FNMR: ( 400 MHz, DMSO-dQ 5 -141.11, -221. l l o
Figure imgf000043_0002
_ 0 mL) 中， 在 25 °C下将 HC1/乙酸乙酯 ( 4 M, 51.3 mL, 19.0 eq) 加入上述溶液中， 所得 混合物在 25 °C下搅拌反应 16小时。 LCMS显示化合物 7_trans消耗完毕， 并检测到目标 产物分子量。 反应结束后， 反应液减压浓缩得到固体， 用饱和 NaHCO3水溶液调节 pH 值约 8, 然后用二氯甲烷 /甲醇 =10/1 ( 100 mL) 萃取， 所得有机层用无水硫酸钠干燥， 过滤， 减压浓缩， 25 °C下用石油酰 /乙酸乙酯 =2/1 ( 30 mL) 打浆， 过滤， 滤饼在真空下 干燥， 得到黄色固体 D D02001A_trans ( 3.30g, 9.20mmol, 85.0%收率， 95.4%纯度) , 结构经 LCMS、 1H NMR以及 F NMR确证。
LCMS m/z = 343.2 (M+H)+
HPLC: 95.4% purity under 220 nm.
XH NMR: ( 400 MHz, DMSO-dQ8 10.94 (s, 1H), 9.38 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.03 - 6.91 (m, 2H), 6.25 - 6.22 (m, 3H), 6.14 - 6.12 (m, 3H), 5.07 - 4.79 (m, 1H), 3.60 (s, 3H), 2.67 - 2.54 (m, 1H), 1.62 - 1.44 (m, 1H), 1.35 - 1.19 (m, 1H)
FNMR: (400 MHz, DMSO-d6) 8 -140.94, -206.78。
2.2
Figure imgf000044_0001
HPK 1 Signalchem M23 -11G-10
GCK Signalchem M24-10G-10
TNIK Signalchem T27 - 11G-10
MBP Signalchem M42-52N-1MG
ADP-Glo Kinase Assay Promega V9102
DMSO Sigma D8418
Sunitinib Selleck C64749
ATP Promega V915B
PDK1 Invitrogen P3001
Staurosporine MCE HY-15141 所有化合物测试的起始浓度为 10 pM, 三倍浓度梯度稀释， 共 10个浓度点， 每个 浓度重复一次。
2.2.1 化合物体外抑制 HPK1激酶活性测试 实验开始前， 配置好 50 pM DTT以及酶促反应系统缓冲液。 移液枪将化合物稀释液转移到 384孔板中， 加毕， 将 384孔板密封， 转速 1000g T 离心 1 min； 在激酶缓冲液中，配置好 2倍浓度的 HPK1溶液， 随后向 384孔加入 2.5 pL 配置好的 2倍浓度的 HPK1溶液, 在转速 1000 g下离心 30 s, 室温孵育 10 min； 在激 酶缓冲液中， 制备 2倍浓度的 MBP和 ATP的混合液， 向上述反应体系中加入 2.5
Figure imgf000044_0002
配 置好的 2倍浓度的 MBP和 ATP的混合液， 反应开始， 在转速 1000 g T离心 30 s, 随后 室温孵育 1 h； 向反应体系中加入 5应 ADP-Glo试剂， 室温孵育 40 min； 加入 10 piL激 酶检测试剂， 室温孵育 40 min, 随后在 Envision 2104 plate阅读器上读取发光信号， 按 照如下公式计算抑制率：
% inhibition =100-(Signalcmpd-SignalAve_PC)/(SignalAve_vc-SignalAve_PC)x 100 上式中， cmpd指测试化合物， PC指阳性对照， VC指阴性对照。
2.2.2 化合物体外抑制 GCK、 TNIK与 PDK1激酶活性测试 实验过程与抑制 HPK1激酶活性测试实验完全一致， 所不同的是， HPK1实验所采 用的阳性对照为 Sunitinib, GCK、 TNIK以及 PDK1实验所采用的阳性对照为 Staurosporine。 表 4. DD02001A_cis以及 DD02001A_trans对上述 4个激酶活性的抑制能力
Figure imgf000044_0003
Figure imgf000045_0001
如表 4所示， DD02001A_trans对 HPK1激酶活性有高效的抑制作用。
2.2.3 化合物体外抑制其它蛋白激酶活性测试 表 5. 实验所需试剂及其来源
Figure imgf000045_0002
Figure imgf000045_0003
Figure imgf000046_0002
DD02001A_trans对绝大多数的激酶，例如 AKT1、 HER2、 EGFR、 ERK1/2, ZAP70、 IGF1R、 ATR、 MNK1/2、 R0S1、 CDK4、 CDK7、 CDK12、 p38-alpha> IKK-beta、 CKlgammal 等在 10 pM浓度下没有显示出明显的抑制效应 （抑制率 <40%） , 而对表 6所示免疫相 关蛋白激酶具有高度选择性的抑制， 表明化合物 DD02001A_trans具备优异的激酶抑制 选择性。
2.2.4 化合物药代动力学参数的测定 取雄性 SD大鼠各 3只分别静脉注射 （2 mg/kg）和灌胃 （10 mg/kg） 给予待测化合 物， 用液相色谱串联质谱法定量测定血浆中待测化合物的血药浓度， 计算药动学参数， 考察待测化合物在 SD雄性大鼠体内的药代动力学特征。 待测化合物， 口服给药之后， 在 0.25 h、 0.5 h、 1 h、 2 h、 4 h、 6 h、 8 h和 24 h时间点分别取血， 静脉给药之后， 在 0.083 h、 0.25 h、 0.5 h、 1 h、 2 h、 4 h、 6 h、 8 h和 24 h时间点分别取血， 随后， 将 50 血浆样品转移到 96孔板上， 加入 250 [1LACN（内标含 260ng/ml甲苯磺丁酰胺）沉淀蛋 白质， 在 4°C、 4000 rpm下离心 20分钟， 将 150 pL上清转移到新的 96孔板中， 并与 150
Figure imgf000046_0001
随后取 5 piL所得溶液进入 LC-MS/MS进行分析。 表 7. DD02001A_trans的口服绝对生物利用度
Figure imgf000046_0003
2.2.5 DD02001A_trans急性毒性实验 分别一次性灌胃给予小鼠 DD02001A_trans（2000 > 1500、 1000、 500 mg/kg）, 记录小鼠 在给药后的反应和两周内的死亡情况。
2.2.5.1 动物： 昆明种小鼠（购自广东省实验动物中心， 许可证号: SCXK（粤）2018-0002）, 10只， 雌雄各半。 体重 18-22 go 小鼠购进后， 将小鼠饲养三天， 适应环境。 小鼠在室内笼 养， 室温 23土 1 °C , 相对湿度 40%-60%, 自由饮食。
2.5.1.2方法： 小鼠实验前禁食不禁水 10 h。 分别给予小鼠一次性灌胃各浓度受试药物 （0.1ml/10g） , 连续观察 14天， 详细记录动物在给药后的中毒症状、 中毒发生时间和持续 时间以及动物死亡情况； 对死亡动物及时进行尸检， 记录病变情况， 若肉眼观察到明显变化 应作病理切片检查。 根据急性毒性实验结果，小鼠灌胃 DD02001A_trans的最大耐受剂量在 1000-1500 mg/kg 范围。 实施例 2. HPK1抑制 IFN-P信号通路的检测 干扰素 P（IFN-P）是由 IFNB1基因编码的蛋白。 天然或重组 IFN-P蛋白具有抗病毒、 抗 菌、抗癌活性。为探索 HPK1与 IFN-p信号通路的内在联系，在 HEK293细胞中过表达 HPK1 和 IFN-P Luciferase Reporter质粒， 转染 24小时后用仙台病毒（SeV）刺激细胞， 12小时后收 集细胞进行 IFN-P Luciferase活性检查。结果表明，过表达 HPKl(l-274)激酶结构域可以显著 抑制 SeV诱导的 IFN书转录 (图 1)。 更进一步， 表达不同量的 HPK1质粒， 可以呈剂量依赖 地抑制 SeV诱导的 IFN-P转录 (图 2)o
I SRE(IFN- stimulated response elements)可被磷酸化的 IRF3结合， 从而介导 IFN-P转录, 是抗病毒通路的另外一个重要指标。 在 HEK293细胞中过表达不同剂量 HPK1和 ISRE Luciferase Reporter质粒， 转染 24小时后用仙台病毒 (SeV)刺激细胞， 12小时后收集细胞进 行 I SRE Luciferase活性检查。 结果表明， HPK1可以呈剂量依赖地抑制 SeV诱导的 ISRE转 录 (图 3)» 实施例 3. 本发明化合物的体外酶活的检测 本发明人使用 ADP-Glo™方法检测了本发明化合物 (C1-C6)对于 HPK1激酶的抑制活 性
Figure imgf000047_0001
发光与 ADP浓度相关联。本研究评估的 6个小分子抑制剂均对体外重组 HPK1激酶呈现较 好的抑制活性， IC50都在 0.1 以下 (表 1)。 与此同时， 在同源关系较为接近的激酶如
Figure imgf000048_0001
实施例 4. 本发明的化合物恢复 HPK1抑制的 IFN-P表达 鉴于研究发现 HPK1抑制抗病毒 IFN-p信号通路， 因此本发明人探索了 HPK1小分 子抑制剂是否可以恢复 HPK1抑制的 IFN-p表达。 和上述实验过程一样， 在 HEK293细 胞中过表达 HPK1和 IFN-P Luciferase Reporter质粒， 转染 18小时后加入 0.5p.M的化合 物， 24小时后用 SeV刺激细胞， 12小时后收集细胞进行 IFN-p Luciferase活性检查。 结 果表明化合物 C2\C3\C4具有较好的活性， 其次是化合物 C1和 C6（图 4）。 更进一步， 化 合物 C2呈现剂量依赖地恢复 HPK1抑制的 IFN-8表达（图 5）o 实施例 5. 本发明的化合物的口服最大耐受剂量 本发明人测试了代表化合物在小鼠的口服最大耐受剂量。 测试结果表明， 单次给药化 合物 C1的口服最大耐受剂量为 337.5 mg/kg（表 2）, 化合物 C3的口服最大耐受剂量为 225 mg/kg（表 3）。 表 2. 小分子化合物 C1小鼠口服急毒测试结果。
Figure imgf000048_0002
表 3. 小分子化合物 C3小鼠口服急毒测试结果。
Figure imgf000048_0003
实施例 6.本发明的化合物有效治疗小鼠 MHV模型 为了评价 HPK1小分子抑制剂在动物模型上的抗病毒疗效，本发明人使用了小鼠肝 炎病毒 (Mouse Hepatitis Virus, MHV)感染的 C57小鼠模型。 MHV是小鼠冠状病毒，容易 感染肝脏和神经系统。 8周龄的雌性 C57小鼠， 每组 3只， 采用肝原位注射 4* 104 pfu 病毒。 接种病毒后， 对小鼠进行口服给药治疗 (10 mg/kg, BID)O 病毒感染 3天后， 采用 qPCR检测肝脏组织 中的病毒含量。其中化合物 C1表现出较为显著的抗病毒疗效， 可有 效降低小鼠肝脏中的病毒滴度 (图 6)。 在相同病毒感染 C57小鼠模型上， 一天两次口服 不同剂量 Cl(5 mg/kg, 20 mg/kg),对于小鼠肝脏中的病毒滴度 (图 7)以及血清中的谷丙转 氨酶 (图 8)具有呈剂量依赖的抑制效果。 实施例 7. 本发明的化合物有效治疗猫传腹 猫传染性腹膜炎 (Feline Infectious Peritonitis, FIP), 简称猫传腹， 是一种发生于猫的致 命异常免疫反应， 由猫携带的猫冠状病毒发生变异而引起。 FIP目前仍为绝症， 发病后死亡 时间不定， 但极少活过一年时间。 虽然该病名称为 “腹膜炎”， 但 FIP实际上是一种多系统 性炎症， 并非所有的患猫都一定会表现出腹膜炎的症状。 患猫的症状表现通常分为两类： 分 别为湿性 (wet) FIP和干性 (dry) FIP, 其中湿性 FIP占全部病例的 70%左右， 表现为腹腔 胸腔出现积液， 异常鼓胀； 干性 FIP患猫症状不一， 取决于病毒侵害的器官种类。截至 2011 年， FIP已位列发达国家宠物猫致死性传染病的第一名。 之前的研究 (Ishida et al., Journal of Feline Medicine and Surgery, 2004)发现， 重组猫干扰 素 (recombinant feline interferon, rFelFN)对于猫传腹有治疗效果。 结合我们研究发现， HPK1 抑制剂可以激活 IFN-P信号通路。 因此我们假设： HPK1抑制剂或许对于猫传腹具有治疗效 果。 为了验证该假设， 我们进行了动物临床试验。 三只纳入实验的动物均患有猫传腹， 年龄 位于 5-12个月之间， 其中 1只为雌性， 2只雄性 (表 4)0 表 4.HPK1抑制剂抗病毒治疗猫传腹实验入组动物。
Figure imgf000049_0001
经过化合物 C1溶液注射给药 (一天两次， 剂量 1.5 mg/kg) 治疗 20天后， 实验动物生 理指标全面好转 (表 5) : (1)食欲增加从而导致体重增加; (2)精神状态好转， 从萎靡到活泼 好动； ⑶腹水消失; (4)白球比增加； (5)猫血清淀粉样蛋白 A显著下降。 表 5. 小分子化合物 C1治疗猫传腹动物前后生理指标变化。
Figure imgf000049_0002
Figure imgf000050_0001
由此我们获得结论： HPK1小分子抑制剂可以有效治疗冠状病毒引发的猫传腹。 结论 本发明人发现， HPK1可以显著抑制 IFN-B信号通路。 而依据之前研究发现， HPK1亦 可显著抑制 IFN- y信号通路。 使用 HPK1抑制剂可以从 IFN-P介导的抗病毒作用和 IFN- y 介导的 T细胞活化两个维度进行抗感染治疗。 因此， HPK1抑制剂对于所有 IFN-B/IFN-v有 作用效果的病毒导致的人类或动物疾病具有治疗效果，包括但不局限于：乙肝病毒 (Hepatitis B virus)、麻疹病毒 (Measles Virus) >辛德毕斯病毒 (Sindbis Virus) >西尼罗河病毒 (West Nile Virus) >登革病毒 (Dengue Virus) >疱疹病毒 (Herpes Simplex Virus) > A巨细胞病毒 (Human Cytomegalovirus HCMV)、 埃博拉病毒 (Ebola Virus)、 丙肝病毒 (HC V) > 流感病毒 (Influenza A Virus).严重急性呼吸综合征病毒 (SARS-CoV).寨卡病毒 (Zika Virus)、艾滋病毒 (HIV) 、 猫传腹病毒 (Feline Infectious Peritonitis Virus) > 小鼠肝炎病毒 (Mouse Hepatitis Virus) > 犬冠 状病毒 ( Canine Coronavirus)、猫杯状病毒 (Feline Calicivirus)、猫白血病病毒 (Feline Leukemia Virus) 、 猫艾滋病毒 (Feline Immunodeficiency Virus) 、 猫泛白血球减少症病毒 (Feline Panleukopenia Virus)、鸡传染性支气管炎病毒 (Avian Infectious Bronchitis Virus) 、猪传染性 胃肠炎病毒 (Transmissible Gastroenteritis Virus) 、 猪流行性腹泻病毒 (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) 、 猪血凝性脑脊髓炎病毒 ( Porcine Hemagglutinating Encephalomyelitis Virus) 、 牛冠状病毒 (Bovine Coronavirus)等。 HPK1抑制剂有望作为一种 新型的广谱抗病毒疗法， 用于上述病毒引发疾病的治疗。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独引用 作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对 本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

权 利 要 求
1. HPK1抑制剂在制备治疗或预防干扰素相关疾病， 或提高免疫力的药物中的应用。
2. 如权利要求 1所述的应用， 其特征在于， 所述干扰素相关疾病是病毒感染。
3. 如权利要求 1所述的应用，其特征在于， HPK1抑制剂是式 I所示化合物或其药学上
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000051_0002
Figure imgf000052_0001
基、 取代或未取代的 Ci-6烷基或取代或未取代的 C3-8环烷基， R12为取代或未取代的 4-6元 杂环基。
6, 如权利要求 5所述的应用， 其特征在于， 式 1-1所示化合物如式 I-1-1-1或 I-1-1-2所
Figure imgf000053_0001
式中， R\ R。、 Rd、 R。各自独立地选自 H、 羟基、 卤素、 氤基、 取代或未取代的 Cl一 6
Figure imgf000053_0002
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000056_0001
Figure imgf000057_0001
Figure imgf000058_0001
式中,
Ri、 R2> R3、 &和 R5各自独立地选自： 氢、 卤素、 氤基、 羟基、 取代或未取代的 C「6
Figure imgf000058_0002
ii. 支链的或直链的 Cl一 6烷基、 C2-6烯基或 C2-6焕基， 所述烷基、 烯基和快基还包含各 类单或者多取代， 包括氢、 羟基、 卤素、 氤基、 氨基、 - CHF2、 -CF3、 二（Ci-6烷基）氨基、 单 （Cl一 6烷基）氨基、 C3-6环烷基或 Cl一 6烷氧基； iii. C3.6环烷基、 C3-6杂环基、 C6-10芳基或 C5-10杂芳基， 所述环烷基、 杂环基、 芳基或
Figure imgf000058_0003
10. 如权利要求 8所述的应用， 其特征在于， 式 1-2所示化合物如式 1-2-2所示:
Figure imgf000059_0001
Figure imgf000059_0002
Figure imgf000060_0001
60
Figure imgf000061_0001
61
Figure imgf000062_0002
13. 如权利要求 1・12中任一项所述的应用， 其特征在于， 所述化合物是
C1 C2
Figure imgf000062_0001
14. 如权利要求 2・13中任一项所述的应用， 其特征在于， 所述病毒选自乙肝病毒
(Hepatitis B virus) 麻疹病毒 (Measles Virus) > 辛德毕斯病毒 (Sindbis Virus)> 西尼罗河病毒 (West Nile Virus) 登革病毒 (Dengue Virus) > 疱疹病毒 (Herpes Simplex Virus) > 人巨细胞病 毒 (Human Cytomegalovirus HCMV)> 埃博拉病毒 (Ebola Virus)、 丙肝病毒 (HCV)、 流感病 毒 (Influenza A Virus) > 严重急性呼吸综合征病毒 (SARS-CoV)、 寨卡病毒 (Zika Virus) > 艾 滋病毒 (HIV) 、 猫传腹病毒 (Feline Infectious Peritonitis Virus) 小鼠肝炎病毒 (Mouse Hepatitis Virus) > 犬冠状病毒 (Canine Coronavirus) 、 猫杯状病毒 (Feline Calicivirus) 、 猫 白血病病毒 (Feline Leukemia Virus) 、 猫艾滋病毒 (Feline Immunodeficiency Virus) 、 猫泛 白血球减少症病毒 (Feline Panleukopenia Virus) 、 鸡传染性支气管炎病毒 (Avian Infectious 62
Bronchitis Virus) 、 猪传染性胃肠炎病 W(Transmissible Gastroenteritis Virus) 、 猪流行性腹泻 病毒 (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) 、 猪血凝性脑脊髓炎病毒 (Porcine Hemagglutinating Encephalomyelitis Virus) 、 牛冠状病 W (Bovine Coronavirus)等； 优选猫传腹病毒 (Feline Infectious Peritonitis Virus) 小鼠肝炎病毒 (Mouse Hepatitis Virus) > 疱疹病毒、 严重急性呼 吸综合征病毒、 寨卡病毒、 犬冠状病毒、 猫杯状病毒、 鸡传染性支气管炎病毒、 猪流行性腹 泻病毒。
15. 一种药物组合物， 所述药物组合物包含权利要求 1-13中任…项所述的化合物或其 药学上可接受的盐、 溶剂化物、 立体异构体、 互变异构体、 前药、 代谢物或衍生物和一种或 多种其它抗病毒药物， 以及任选的药学上可接受的赋形剂。
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