CN105358549A - 新喹唑啉衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了由下式(I)表示的喹唑啉衍生物：其中R1和R2表示氢原子，卤素原子，或任选具有取代基的低级烷基；Z表示具有取代基的环烷基或具有取代基的环烯基；并且Q表示任选具有取代基的双环杂芳基，或其药学上可接受的盐。由于该化合物具有对Wnt基因/β-连环蛋白信号传导途径的抑制效果，并显示出抗肿瘤效果，该化合物作为药物是有用的。

Description

新喹唑啉衍生物
技术领域
本发明涉及一种药物，尤其涉及一种新的喹唑啉衍生物，或其药学上可接受的盐，喹唑啉衍生物具有对Wnt/β-连环蛋白信号传导途径的抑制效果，并表现出抗肿瘤效果。
背景技术
Wnt信号控制体轴形成和器官形成在早期发展中，细胞增殖和细胞分化在出生后等。人们已经知道，激活Wnt信号传导通过许多细胞内信号传导途径(非专利文献1)诱导各种细胞应答。Wnt信号传导途径中最为人所知的是β连环蛋白途径。β连环蛋白，其在正常情况下被存储在细胞质中，通过Wnt刺激被转移到细胞核中，并结合到T细胞因子/淋巴细胞增强因子(TCF/LEF)，其是转录因子，所述转录因子诱导基因的表达，如AXIN和c-MYC。人们已经知道，当在Wnt信号传导途径中有异常时，各种疾病被引起。特别是，在人类癌症病例中已经报道了，β连环蛋白，APC(腺瘤结肠息肉)，AXIN等的基因突变是与癌症的发病密切相关的，以及是Wnt信号传导途径的构成蛋白质(非专利文献2)。在这些癌细胞中，观察到促进细胞生长的β-连环蛋白和各种基因的表达异常累积。
已阐明的是，Wnt基因/β-连环蛋白信号传导途径除了早期发育和器官形成也参与干细胞的维护和未分化潜能的分化(非专利文献3，4)。已经报道，在癌细胞中，存在与那些干细胞具有类似的特性的那些细胞(癌干细胞)。据认为，癌症干细胞是由分化产生大量外围癌细胞的来源，同时由自主复制保持自体细胞在癌组织中。不仅在正常细胞中，而且在癌细胞中，Wnt信号/β-连环蛋白信号传导途径参与维护他们的干性。据认为，由于癌症干细胞对抗采用一般抗癌药的治疗具有抗性，有极少数的肿瘤干细胞在抗癌药物治疗后存活引起癌症复发和肿瘤转移(非专利文献5，6)。由于癌症干细胞被认为是致癌，癌症转移，和癌症复发的原因，它们也被称为肿瘤起始细胞，癌症干细胞样细胞，干状癌细胞，高度致瘤性细胞或超级恶性细胞。
因此，抑制Wnt/β-连环蛋白信号传导途径的化合物适用于治疗疾病，其中Wnt信号被参与，特别是癌症，并且也通过靶向癌症干细胞可用于预防肿瘤的转移和复发。
各种喹唑啉衍生物迄今是已公知的。除了申请人的专利文献1，专利文献2，专利文献3等也被报道。然而，没有针对本发明的喹唑啉衍生物的记载，也没有报告指出，本发明的喹唑啉衍生物抑制Wnt/β-连环蛋白信号传导途径。
现有技术文献
专利文献
[专利文献1]WO2009/84695号公报
[专利文献2]WO2012/044090号公报
[专利文献3]KR20130084474号公报
非专利文献
[非专利文献1]洛根，C.Y.和Nusse，R.，Annu。启细胞。开发。生物学，2004，20，781-810(Logan,C.Y.andNusse,R.,Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.,2004,20,781–810)
[非专利文献2]Clevers，H.和Nusse，R.，细胞，2012年，149，1192至1205(Clevers,H.andNusse,R.,Cell,2012,149,1192–1205)
[非专利文献3]芝，T。，和Clevers，H.，自然，2005，434，843-850(Raya,T.,andClevers,H.,Nature,2005,434,843–850)
[非专利文献4]荷兰，法学博士，克劳斯，A，Garratt，AN，Birchmeier，W.，币种。奥平。细胞。生物学杂志，2013，25，254-264(Holland,J.D.,Klaus,A.,Garratt,A.N.,Birchmeier,W.,Curr.Opin.Cell.Biol.,2013,25,254–264)
[非专利文献5]院长，M.，Fojo，T.，贝茨，S.纳特。牧师癌症，2005，5，275-284(Dean,M.,Fojo,T.,Bates,S.Nat.Rev.Cancer,2005,5,275–284)
[非专利文献6]李，F，Tiede，B。，Massague，J.，康，Y。，细胞研究。，2007，17，3-14(Li,F.,Tiede,B.,Massague,J.,Kang,Y.,CellRes.,2007,17,3–14)
发明内容
问题解决的课题
本发明的一个目的在于提供药物，尤其是新的喹唑啉衍生物，或其药学上可接受的盐，其具有针对Wnt/β-连环蛋白信号传导途径的抑制效果，并表现出抗肿瘤效果。
用于解决课题的技术方案
本发明通过下列喹唑啉衍生物或其药学上可接受的盐来实现。
(1)由下式(I)表示的喹唑啉衍生物：
其中R1和R2表示氢原子，卤素原子，或任选具有取代基的低级烷基；Z表示具有取代基的环烷基或具有取代基的环烯基；Q表示任选具有取代基的双环杂芳基，或其药学上可接受的盐。
(2)上述(1)的喹唑啉衍生物或其药学上可接受的盐，其中Z是具有取代基的环烷基。
(3)上述(1)或(2)的喹唑啉衍生物或其药学上可接受的盐，其中Z是羟基环己基。
(4)由下式(Ia)表示的喹唑啉衍生物：
其中R1a和R2a表示氢原子，卤素原子，或低级烷基；Za表示具有取代基的环烷基或具有取代基的环烯基；和Qa表示任选具有取代基的双环杂芳基，或其药学上可接受的盐。
(5)上述(4)的喹唑啉衍生物或其药学上可接受的盐，其中Za是羟基环己基。
发明效果
本发明者进行深入细致的研究，以解决上述课题，并发现，以上述(1)-(3)为代表的新的喹唑啉衍生物和它们的药学上可接受的盐对所述的Wnt/β-连环蛋白信号传导途径具有极好的抑制效果，并表现出抗肿瘤效果，从而完成了本发明。由本发明提供的化合物可特别用于治疗已知与经由Wnt信号/β-连环蛋白信号传导途径介导的异常细胞反应有关的疾病，特别是癌症，并且也可用于通过靶向癌症干细胞而预防肿瘤的转移和复发。此外，它们可用作为Wnt/β-连环蛋白信号传导途径抑制剂以用于实验室和研究试剂。
附图的简单说明
图1示出了实施例1的化合物以浓度依赖的方式(试验例2)抑制在HCT116结肠直肠癌细胞中的AXIN蛋白2基因的表达。
图2示出了实施例1的化合物以浓度依赖的方式抑制(试验例2)在HCT116结肠直肠癌细胞中的c-MYC基因的表达。
图3示出了实施例1的化合物以浓度依赖的方式抑制(试验例3)在HCT116结肠直肠癌细胞中AXIN2和c-MYC蛋白的表达。
图4示出实施例1的化合物以剂量依赖的方式抑制皮下移植人源癌细胞系的小鼠模型的肿瘤生长(试验例4)。
具体实施方式
本发明将在下文中详细说明。
本发明的新的喹唑啉衍生物是由下式(I)表示的化合物：
其中R1和R2表示氢原子，卤素原子，或任选具有取代基的低级烷基；Z表示具有取代基的环烷基或具有取代基的环烯基；Q表示任选具有取代基的双环杂芳基，或其药学上可接受的盐。
在上述式(Ⅰ)中，卤素原子的实例包括氟，氯，溴等。
任选具有取代基的低级烷基中的低级烷基部分可以是具有1至4个碳原子的任何直链或支链烷基。其实例包括甲基，异丙基，叔丁基，等。
具有取代基的环烷基中的环烷基部分可以是具有3至7个碳原子的任何环状烷基。其实例包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基，等。
具有取代基的环烯基中的环烯基部分可以是具有5-7个碳原子的任何环状烯基。其实例包括环戊烯基，环己烯基，等。
任选具有取代基的双环杂芳基中的双环杂芳基部分可以是，例如，含有至少一个选自氮原子，硫原子和氧原子的杂原子的任何的4至6元稠合双环芳族杂环基。其实例包括四氢异喹啉基，苯并噻吩基，苯并咪唑基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，吲哚基，苯并三唑基，喹啉基，异喹啉基，喹唑啉基，吲唑基，等。
除非另有说明，任选具有取代基的低级烷基，具有取代基的环烷基，具有取代基的环烯基，和任选具有取代基的双环杂芳基的取代基可以在任何化学上可能的位置具有一个或两个或更多个任意的取代基。当取代基的数量是两个或两个以上时，各取代基可以相同或不同。其实例包括卤素原子，取代或未取代的烷基，环烷基，取代或未取代的烷氧基，取代或未取代的氨基，硝基，氰基，羟基，取代或未取代的烷基氨基，取代或未取代的氨基甲酰基，羧基，吗啉基，甲酰基，乙酰基，甲磺酰基，苯甲酰基，取代或未取代的酰氨基，等。
更具体地，“任选具有取代基的低级烷基”的取代基的实例包括卤素原子，C1-C4(碳数1至4的)烷氧基，氨基，C1-C4(碳数1至4的)烷基氨基，羟基，氨基甲酰基，羧基，甲酰基，乙酰基，甲磺酰基，苯甲酰基，酰氨基，等。
“具有取代基的环烷基”或“具有取代基的环烯基”的取代基的实例包括卤素原子，C1-C4(碳数1至4的)烷基，C1-C4(碳数1至4的)烷氧基，氨基，任选被磺酰基取代的C1-C4(碳数1至4的)烷基氨基，羟基，氨基甲酰基，羧基，甲酰基，乙酰基，甲磺酰基，苯甲酰基，酰氨基，等。特别是，羟基基团和氨基基团是优选的。
“任选具有取代基的双环杂芳基”的取代基的实例包括卤素原子，被(羟基，甲氧基或吡咯烷基)任选取代的C1-C4(碳数1至4的)的烷基，C3-C5(碳数3至5的)环烷基，C1-C4(碳数1至4的)的烷氧基，氨基，C1-C4(碳数1至4的)烷基氨基，二(C1-C4(碳数1至4的)烷基)氨基，羟基，氨基甲酰基，羧基，吗啉基，吡咯烷基，甲酰基，乙酰基，甲磺酰基，苯甲酰基，酰氨基，等。
本发明还提供了一种新的喹唑啉衍生物(Ⅰa)：
其中R1a和R2a表示氢原子，卤素原子，或低级烷基；Za表示具有取代基的环烷基或具有取代基的环烯基；和Qa表示任选具有取代基的双环杂芳基，或其药学上可接受的盐。
另外，在上述式(Ia)中，卤素原子，低级烷基，环烷基，和环烯基是与上述式(I)的那些相同的。
Qa的双环杂芳基可以是任何4至6元稠合双环芳族杂环，其任选含有选自，除了一个氮原子，硫原子和氧原子的至少一个杂原子。其实例包括苯并咪唑基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，喹啉基，异喹啉基，喹唑啉基，吲唑基，等。
Qa中的“任选具有取代基的双环杂芳基”的取代基的实例包括卤素原子，任选地被(卤素原子，羟基，甲氧基，二甲氨基或吡咯烷基)取代的C1-C4(碳数1至4的)烷基，C3-C5(碳数3至5的)环烷基，C1-C4(碳数1至4的)烷氧基，氨基，C1-C4(碳数1至4的)烷基氨基，羟基，吗啉基，等。
Qa优选是吲唑基或苯并咪唑基，其任选被低级烷基取代，和所述低级烷基可以进一步任选用羟基取代。
“具有取代基的环烷基”和“具有取代基的环烯基”的取代基选自羟基和氨基的基团。
关于本发明的化合物(Ⅰ)下面的描述也适用于本发明的化合物(Ia)的。
在某些情况下，根据本发明的化合物(I)可存在异构体，这取决于例如取代基的类型。另外，在本说明书中，根据本发明的化合物可以描述为仅仅一种形式的异构体，但本发明包括了所有的异构体(几何异构体，光学异构体，互变异构体等)，所述异构体可以在结构上经衍生而得到，并且也包括单一异构体，或它们的混合物。
本发明的化合物(I)的药学上可接受的盐的实例包括由盐酸，硫酸，碳酸，磷酸等衍生的无机盐；和由富马酸，马来酸，甲磺酸，对甲苯磺酸或类似物衍生的有机酸盐。此外，从钠，钾或类似物衍生的碱金属盐；由镁，钙或类似物衍生的碱土金属盐；由低级烷基胺，低级醇胺等衍生的有机胺盐；由赖氨酸，精氨酸，鸟氨酸等等衍生的碱性氨基酸盐包括在本发明中，而且，除了上述以外，铵盐也包括在本发明中。
在本发明的化合物和其药学上可接受的盐中包括它们的分子内的盐和它们的溶剂合物如水合物。
本发明的化合物和其药学上可接受的盐(Ⅰ)可通过，例如，通过以下的方法制备。在以下所示的制备方法中，当定义的基团在被执行的方法的条件下发生变化，或基团是不适合实施该方法时，预期的化合物或其药学上可接受的盐可以容易地通过有机合成化学常规使用的方法获得，例如，通过使用手段，如官能团的保护和脱保护[T.W.格林保护基在有机合成，第3版，约翰·威利父子公司，1999]([T.W.Greene,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,3rdEdition,JohnWiley&Sons,Inc.,1999])，和类似手段。如果需要，引入取代基的反应步骤顺序也可以改变。
在以下描述中使用的缩写和符号的含义是如下：
DCM：二氯甲烷
THF：四氢呋喃
DMF：二甲基甲酰胺
DMSO：二甲亚砜
CDCl3：重氯仿
[制备本发明的化合物(I)的方法]
由式(I)表示的本发明的化合物可以例如，通过方案1制备。
[方案1]
其中R1，R2，Q和Z的定义与上述定义相同。
化合物(Ⅰ)可通过化合物(II)的羟基与Z基团导入剂(ZX)的亲核取代反应来制备。
当X是适当的离去基团，例如，甲磺酰化或甲苯磺酰化的羟基，氯原子，溴原子，碘原子等时，化合物(Ⅰ)可以通过在加热下在溶剂中在1至5摩尔当量，优选为1至3.5摩尔当量的碱如碳酸铯的存在下使化合物(II)与1至5摩尔当量，优选1到1.5摩尔当量的Z基团导入剂反应而获得。对溶剂没有特别限制，只要它是对反应是惰性的即可。DMSO或DMF可以优选被使用。该反应可以通过在80-180℃加热1-24小时，优选在100-150℃加热1-4小时而进行。
化合物(I)也可以通过使用光延反应(Mitsunobureaction)使化合物(Ⅱ)的羟基与具有羟基的Z基团导入剂(X＝OH)反应而制备。即，化合物(I)可以通过在加热下在溶剂中，在1至10摩尔当量，优选1至5摩尔当量的光延试剂(Mitsunobureagent)，例如，氰基亚甲基三丁基正膦的存在下使化合物(II)与1～5摩尔当量，优选1～2摩尔当量的具有醇基团的Z基团导入剂反应而得到。
对溶剂没有特别限制，只要它是对反应惰性的即可。优选地，1,4-二噁烷或THF可以使用。该反应可以通过在50-150℃加热1-24小时，例如，在100℃加热3-16小时而进行。
Z基团引入剂可以作为市售品得到，或者通过公知的方法或基于其的方法得到。
当上述偶联反应进行时，如必要，化合物(Ⅰ)也可通过组合使用在有机合成化学中常规使用的方法通过存在于Q和Z基团导入剂的官能团的保护和脱保护而获得。例如，官能团如羟基和氨基的保护和脱保护[在有机合成中的T.W.格林保护基，第3版，约翰·威利父子公司，1999]([T.W.Greene,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,3rdEdition,JohnWiley&SonsInc.,1999])可以使用。
用作方案1的原料的化合物(II)可以通过在例如，方案2所示的方法来制备。
[方案2]
其中R1，R2和Q如上所定义。
在加热下在溶剂中根据需要在酸催化剂例如盐酸的存在下，化合物(II)可通过使化合物(Ⅲ)与1至5摩尔当量，优选1～1.5摩尔当量的胺(Q-NH2)反应而获得。对溶剂没有特别限制，只要它是对反应惰性的即可。例如，低级醇，优选乙醇，2-丙醇或1-丁醇可以使用。该反应可以通过在80-150℃加热3-24小时，例如，在100-110℃加热6-16小时来进行。
胺(Q-NH2)，方案1的原料之一，可以作为市售品(例如，Sigma–Aldrich公司(Co.LLC)的产品)得到，或通过公知的方法或基于此的方法得到。
方案2中用作原料的化合物(Ⅲ)，其中R1和R2为氢原子的化合物(Ⅲ-a)，和其中R1是氢原子，和R2是溴原子的化合物(Ⅲ-b)可以例如，通过在方案3所示的方法被制备。
[方案3]
化合物(III-a)可从作为起始原料的2-氨基-3-甲氧基苯甲酸(Ⅳ)来制备。也就是说，通过使2-氨基-3-甲氧基苯甲酸(Ⅳ)与脲反应得到的化合物(V)在加热下在N，N-二甲基苯胺的存在下用磷酰氯处理，从而得到化合物(VI)。所得化合物(Ⅵ)在氢气氛下和在碱性条件下与钯-碳进行反应，以选择性地除去4位氯原子。所得到的化合物(Ⅶ)用三溴化硼处理，得到化合物(Ⅲ-a)。
所述化合物(III-b)可通过在二异丙基胺的存在下在溶剂中使化合物(Ⅲ-a)与N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)反应得到。
方案2中用作原料的化合物(III)中，其中R1是溴原子，R2是氢原子的化合物(Ⅲ-c)可以例如，通过方案4中所示的方法被制备。
[方案4]
化合物(III-c)可以通过以下方式得到：2-氨基-3-甲氧基苯甲酸(IV)用溴而被溴化。如此得到的化合物(Ⅷ)的羧酸用硼烷还原，并转换成醇。然后，再次通过将醇氧化成醛而得到的化合物(X)是在加热下与脲反应，得到化合物(Ⅺ)。然后，采用磷酰氯处理化合物(Ⅺ)，并将其转换成化合物(Ⅻ)。此后，化合物(Ⅻ)用三溴化硼处理。
方案2中用作原料的化合物(III)中，其中R1是氟原子，和R2是氢原子的化合物(Ⅲ-d)可以例如，通过方案5中所示的方法被制备。
[方案5]
化合物(III-d)可以如下制备：通过硝化3-氟-5-甲氧基苯甲酸(XIII)，采用钯-碳还原所得化合物，得到化合物(ⅩⅩ)，并且以与方案3相同的方式处理该化合物(ⅩⅩ)。
方案2中用作原料的化合物(III)中，其中R1是氢原子，R2是甲基的化合物(Ⅲ-e)可以例如，由方案6所示的方法产生。
[方案6]
化合物(III-e)可以以下面的方式制造：通过乙酰化和硝化3-氨基-4-甲基苯甲酸(ⅩⅩ)而获得的化合物(XX)用氢氧化钾处理，得到酚化合物。所得酚化合物被甲基化，用钯-碳进一步还原，合成化合物(XXII)，化合物(XXII)被以与方案3相同的方式进行处理。
此外，在期望的位置具有期望的官能团的本发明的化合物(I)可以如下获得：通过将上述方法组合使用，并进行在合成有机化学中通常所用的方法(例如，氨基的烷基化反应；氧化烷硫基以形成亚砜基或砜基的反应；将烷氧基转化成羟基或反之亦然的反应)。
[本发明的化合物(I)的用途]
本发明的化合物(Ⅰ)或其可药学上可接受的盐可制备成适于口服给药，肠胃外给药或局部给药的常规的药物制剂(药物组合物)形式。
用于口服给药的制剂包括固体制剂如片剂，粒剂，粉剂，胶囊；和液体制剂如糖浆。这些制剂可以通过常规方法来制备。所述固体制剂可以通过使用常规的药物载体制备，常规的药物载体如乳糖，淀粉如玉米淀粉，结晶纤维素，如微晶纤维素，羟丙基纤维素，羧甲基纤维素钙，滑石和硬脂酸镁。胶囊可通过封装如此制备的颗粒或粉末而制备。所述糖浆可以通过在含有蔗糖，羧甲基纤维素等的水溶液中溶解或悬浮本发明化合物(Ⅰ)或其可药学上可接受的盐来制备。
用于肠胃外给药的制剂包括注射材料(制剂)如静脉内注射制剂。注射制剂也可以通过常规方法制备。等渗剂(例如，甘露醇，氯化钠，葡萄糖，山梨醇，甘油，木糖醇，果糖，麦芽糖，甘露糖)，稳定剂(例如，亚硫酸钠，清蛋白)，和防腐剂(例如，苄醇，对羟基苯甲酸甲基酯)可被适当组合掺入到注射制剂。
本发明的化合物(Ⅰ)或其可药学上可接受的盐的剂量可根据疾病的严重程度，患者的年龄和体重，剂型等而改变。通常，在成人中日剂量是1mg-1000mg的范围，其可以通过口服或肠胃外给药施用一次或分开施用两次或三次。
本发明的化合物(Ⅰ)或其可药学上可接受的盐还可以用于实验室和研究试剂而作为Wnt/β-连环蛋白信号传导途径抑制剂。
此外，将本发明的化合物(I)放射性标记的化合物也可以用作PET用分子探针。
实施例
本发明将通过列举实施例，试验例等具体在下面进一步进行描述。然而，本发明不应该被理解为受到这些实施例的限制。
化合物的鉴定是通过氢核磁共振(1H-NMR)谱和质谱(MS)进行的。除非另有特别指明，1H-NMR的测定在400兆赫。可交换氢有时不能清楚地被观察到，这依赖于化合物或测量条件。术语“br”表示宽的信号。
以梯度模式进行制备性HPLC柱色谱法，用市售ODS柱和水/甲醇(含有甲酸)作为洗脱剂。
参考例1
制造2-氯喹唑啉-8-醇
向2-氯-8-甲氧基喹唑啉(8.85克，45.0毫摩尔)的DCM溶液(91毫升)，在冰冷却下滴加三溴化硼(1M/DCM，100毫升)，然后将混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物冷却至-5℃，和过滤析出的固体。析出的固体用饱和碳酸氢钠洗涤，得到5.84克2-氯喹唑啉-8-醇的粗产物。
1H–NMR(DMSO-d6)δ(ppm)：10.58(s,1H),9.53(s,1H),7.6-7.65(m,2H),7.36-7.42(m,1H)；
LC–MS(m/z)181.0[M+H]+。
参考例2
制造反式-4-叔丁基二甲基甲硅烷基氧基环己基甲磺酸酯
(第一步)
向反式-环己烷-1,4-二醇(5.00克，43.0毫摩尔)和4-二甲氨基吡啶(0.27克，2.21毫摩尔)的DMF溶液(45毫升)，在冰冷却下加入三乙胺(6毫升，43.0毫摩尔)和叔丁基二甲基甲硅烷基氯(6.49克，43.0毫摩尔)，并将该混合物在室温下搅拌25分钟。将反应溶液用乙酸乙酯稀释后，通过用水洗涤两次所得溶液而获得的有机层经硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂后得到的残余物用柱色谱法(硅胶，己烷/乙酸乙酯)纯化，得到反式-4-叔丁基二甲基甲硅烷基氧基环己醇(5.32克)。
1H–NMR(DMSO-d6)δ(ppm)：4.45(d,J＝4.2Hz,1H),3.54-3.66(m,1H),3.36-3.46(m,1H),1.7-1.8(m,4H),1.12-1.3(m,4H),0.84(s,9H),0.02(s,6H)。
(第二步)
向反式-4-叔丁基二甲基甲硅烷基氧基环己醇(5.32克，23.1毫摩尔)和三乙胺(3.85毫升，27.7毫摩尔)的DCM溶液(77毫升)，在冰冷却下滴加甲磺酰氯(1.97毫升，25.4毫摩尔)，并将混合物在室温下搅拌16小时。加入饱和碳酸氢钠于此以停止反应后，将反应混合物用氯仿萃取两次。将得到的有机层合并，依次用饱和碳酸氢钠水溶液，水洗涤，并用硫酸钠干燥。此后，溶剂在减压下蒸馏掉。将残余物用柱色谱法(硅胶，己烷/乙酸乙酯)纯化，得到标题化合物(6.71克)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):4.6-4.7(m,1H),3.7-3.8(m,1H),3.16(s,3H),1.92-2.0(m,2H),1.7-1.8(m,2H),1.5-1.65(m,2H),1.32-1.45(m,2H),0.86(s,9H),0.04(s,6H)。
实施例1
制造顺式-4–({2-[(1H-苯并[d]咪唑-6-基)氨基]喹唑啉-8-基}氧基)环己醇
(第一步)
参考例1的化合物(0.97克，5.26毫摩尔)的2-丙醇溶液(15毫升)和1H-苯并咪唑-6-胺(0.70克，5.26毫摩尔)的混合物在100-110℃搅拌16小时。将溶液冷却至室温之后，析出的固体被过滤。用2-丙醇洗涤之后，将析出的固体干燥，得到2-[(1H-苯并[d]咪唑-6-基)氨基]喹唑啉-8-醇(1.07克)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):10.31(s,1H),9.6-9.75(br,1H),9.50(s,1H),9.31(s,1H),8.98(d,J＝1.1Hz,1H),7.96(dd,J＝9.0,1.7Hz,1H),7.76(d,J＝7.9Hz,1H),7.42(dd,J＝7.5,1.1Hz,1H),7.2-7.35(m,2H)；
LC-MS(m/z)278.2[M+H]+。
(第二步)
向2-[(1H-苯并[d]咪唑-6-基)氨基]喹唑啉-8-醇(1.50克，5.41毫摩尔)和参考例2的化合物(2.50克，8.12毫摩尔)的DMSO悬浮液(40mL)中，加入碳酸铯(5.45克，16.78毫摩尔)溶液。此后，将混合物在130℃搅拌一小时。将反应混合物用乙酸乙酯(50毫升)和THF(50毫升)稀释，和然后将冰水(25毫升)加入其中。有机层分离后，将得到的有机层用硫酸钠干燥，将溶剂减压蒸馏掉。残余物用柱色谱法(硅胶，己烷/乙酸乙酯)纯化，得到N-(1H-苯并[d]咪唑-6-基)-8-({顺式-4-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)环己基]氧基}喹唑啉-2-胺(1.16克)。
1H–NMR(DMSO-d6)δ(ppm)：11.99-12.32(m,1H),9.72-9.90(m,1H),9.16-9.31(m,1H),8.28-8.37(m,1H),7.99-8.18(m,2H),7.38-7.63(m,2H),7.30-7.38(m,1H),7.16-7.30(m,1H),4.76(br,1H),3.84(br,1H),1.92-2.07(m,2H),1.67-1.91(m,4H),1.56-1.67(m,2H),0.87(s,9H),0.06(s,6H)；
LC–MS(m/z)490.2[M+H]+。
(第三步)
在0℃向N-(1H-苯并[d]咪唑-6-基)-8--({顺式-4-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)环己基]氧基}喹唑啉-2-胺(4.0克，8.18毫摩尔)的1,4-二噁烷溶液(20毫升)中，加入4N-HCl/1,4-二噁烷(20毫升)，然后将混合物在室温下搅拌一小时。向通过在减压下蒸馏除去溶剂而得到的残渣，加入碳酸氢钠饱和水溶液(25毫升)。将析出的固体过滤。用乙酸乙酯洗涤(20mL)后，将析出的固体干燥，得到标题化合物(2.0克)。
1H–NMR(DMSO-d6)δ(ppm)：12.29-12.54(m,1H),9.73-10.0(m,1H),9.15-9.3(m,1H),8.65-9.11(m,1H),7.98-8.27(m,1H),7.52-7.69(m,2H),7.4-7.52(m,1H),7.36(dd,J＝7.9,1.2Hz,1H),7.26(t,J＝7.9Hz,1H),5.51-5.9(m,1H),4.88(s,1H),3.45-3.85(m,1H),1.82-2.13(m,4H),1.49-1.85(m,4H)；
LC–MS(m/z)376.2[M+H]+。
实施例2-46
在以下实施例[表1]中的化合物如下制备：使用各自对应的原料(可商购产品，或通过公知的方法或基于其的方法由市售化合物衍生的化合物)，根据在上述实施例中描述的方法，和，任选根据需要将其与通常在合成有机化学中使用的方法组合。
此外，各化合物的物理化学数据示于[表2]。
[表1]
[表2]
实施例47
制造顺式-4-({2-[(1H-苯并[d]咪唑-6-基)氨基]喹唑啉-8-基}氧基)环己醇盐酸盐
向实施例1的化合物(19.3克，51.4毫摩尔)，加入0.2M盐酸-乙醇(273毫升，51.4毫摩尔)，并将该混合物在35-50℃搅拌24小时。将混合物冷却到室温之后，沉淀的产物被过滤，用少量的乙醇洗涤，干燥，得到标题化合物(18.0克)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):10.34(s,1H),9.48(s,1H),9.33(s,1H),8.91(d,J＝1.9Hz,1H),8.13(dd,J＝9.1,1.9Hz,1H),7.82(d,J＝9.0Hz,1H),7.50(dd,J＝8.0,1.2Hz,1H),7.42(dd,J＝8.0,0.9Hz,1H),7.34(t,J＝7.8Hz,1H),4.78-4.95(m,1H),3.69-3.85(m,1H),1.96-2.11(m,2H),1.81-1.96(m,2H),1.60-1.83(m,4H)；LC-MS(m/z)376.0[M+H]+；熔点:241.6℃(起始温度)。
试验例1针对Wnt/β-连环蛋白信号传导途径的抑制活性的评价
本发明的化合物针对Wnt/β-连环蛋白信号传导途径的抑制活性是如下进行评价的：用市售的TCF荧光素酶报道基因测定系统，通过评价本发明的化合物对由Wnt-3a配体活化的Wnt/β-连环蛋白信号传导途径的抑制活性。
(所用细胞的培养)
在T75烧瓶中，HEK293细胞(ATCC编号CRL-1573)被加入到DMEM培养基(由NACALAITESQUE，INC制造，编号08459-35)，其补充有10％FBS(AusGeneX公司(PTYLTD))和1％青霉素/链霉素(NACALAI公司(TESQUE，INC))。将细胞在5％CO2培养箱中在烧瓶中进行培养。
(报道基因的转染和将被测试的化合物的加入)
培养的HEK293细胞用补充有仅10％FBS的DMEM培养基进行稀释，以具有2×105个细胞/毫升的细胞浓度，和100μL各稀释孔被接种到96孔板的各孔中(PerkinElmer公司，ViewPlate编号6005181)，然后在5％CO2培养箱中培养过夜。向OptiMEM培养基(Invitrogen(R)编号11058)，加入pGL4.49[luc2p/TCF-LEF-RE/Hygro(湿度计)]质粒DNA(Promega公司)和Fugene(R)HD(Promega编号E2691)，以便分别具有浓度1微克/毫升和3微克/毫升，以制备转染溶液，如与试剂相关的方案中所描述的。向含有过夜培养的HEK293细胞各孔中，轻轻加入每个转染溶液100μL，随后在5％CO2培养箱中培养过夜，以进行转染。
向DMEM培养基，加入0.5％炭/葡聚糖处理的胎牛血清(ThermoScientific编号SH30068.02)和LiCl(Sigma-Aldrich编号L9650)，以制备含LiCl的培养基(氯化锂的终浓度：10mM)。在HEK293细胞的各孔中培养基被培养过夜，并采用报道基因转染，通过倾析将其除去。含LiCl的培养基(90μL)被轻轻加入每个孔，随后在5％CO2培养箱中培养过夜。
要测试的化合物的DMSO储备溶液被采用含LiCl的培养基稀释100倍，以制备将被进行测试的所述化合物的溶液，其是试验浓度的10倍。此外，重组小鼠Wnt-3a(R&DSystems公司#1324-WN)溶解于0.1％BSA-PBS溶液，以便具有40微克/mL的浓度，将得到的溶液用含氯化锂的培养基稀释，以具有为100ng/mL的浓度，以制备Wnt-3a的溶液。向在含有LiCl的培养基中培养过夜的HEK293细胞的各孔中，加入10μL每个待测试的化合物的溶液，接着在5％CO2培养箱培养2小时(所述化合物待测试最终浓度：3-0.03μM)。此后，将各所述的Wnt-3a的溶液的10μL加入到各自的孔中，接着进一步培养5小时。
(荧光素酶活性的测定)
使用ONE-GloTM萤光素酶检测系统(Promega公司，编号E6110)，将细胞在孔中的荧光素酶活性通过酶标仪(SunergyH1，BioTek仪器有限公司)测量。IC50值从每一化合物浓度的发光强度来计算，假设不添加该化合物的并用Wnt-3a刺激的一组发光强度为100％，而没有添加化合物和无Wnt-3a刺激的一组的发光强度为0％。
(评估结果)
本发明的化合物在TCF-荧光素酶报告基因测定中显示有效的抑制活性。在TCF萤光素酶报告基因检测中本发明的代表性化合物的抑制活性示于表3。关于在TCF-荧光素酶报告基因测定的抑制活性，具有小于0.3μm的IC50值的那些化合物被采用***表示，那些具有0.3μm以上且小于1μm的IC50值的化合物采用**表示，和那些具有1μm以上且小于3μm的IC50值的化合物被*表示。
[表3]
结果表明，本发明的化合物(Ⅰ)具有对Wnt信号/β-连环蛋白信号传导途径有效的抑制活性。
试验例2Wnt/β-连环蛋白信号的下游基因的表达水平的变化的研究
使用实时PCR法以及用在Wnt基因/β-连环蛋白信号传导途径的靶基因的表达水平的变化作为指标，对本发明的化合物对Wnt/β-连环蛋白信号传导活性的效果进行了研究。
(所用细胞的培养)
向RPMI-1640培养基(NACALAITESQUE，INC。)中加入10％FBS(AusGeneXPTYLTD)和1％青霉素/链霉素(NACALAITESQUE，INC。)以制备细胞培养基(下文中称为培养基1)。在T75烧瓶中，HCT116细胞(ATCC编号：CCL-247)被加入到培养基1。在烧瓶中细胞在5％CO2培养箱中培养。
(待测试的化合物的加入)
培养HCT116细胞用培养基1进行稀释，以便具有1.1X105细胞/mL的细胞浓度。向T75烧瓶，接种入13.5毫升的稀释的细胞，随后在5％CO2培养箱中培养过夜。第二天，向细胞溶液中，加入每个待测试化合物的溶液的1.5毫升，待测试化合物的溶液如下制备：通过采用培养基1稀释10和3mM的待测试化合物的DMSO储备溶液100倍(待测试化合物的终浓度：10和3μM)，然后在5％CO2培养箱培养24小时。
(总RNA提取和逆转录反应溶液的制备)
培养上清液被离心，和回收悬浮细胞作为团粒。附着在T75烧瓶内的团粒和细胞被混合，并使用RNeasy加Mini试剂盒(Qiagen公司编号74134)和QIA粉碎机(Qiagen编号79654)回收所述总RNA，如在试剂盒附带的方案所述。总RNA浓度通过显微分光光度计(赛默飞世尔科技公司，纳米掉落ND-1000(ThermoFisherScientificInc.,NanoDropND–1000))进行测定。使用ReverTraAce(R)qPCRRT主混合物(MasterMix)进行1微克总RNA的逆转录反应(TOYOBOCO.LTD编号FSQ-201)，如在与试剂相关的方案中所描述，以制备逆转录反应溶液。
(通过定量RT-PCR法而定量Wnt信号传导的下游基因)
向1μL逆转录反应溶液，加入10μLTaqMan(R)通用PCR主混合物(MasterMix)(AppliedBiosystems，编号4304437)，用于每个基因的1μLTaqMan(R)基因表达测定(AppliedBiosystems)(参照下述表4)，和灭菌水(8μL)，以具有20μL的体积，然后使用实时热循环仪(AppliedBiosystems，PRISM7300序列检测系统)来进行实时PCR。以下面的方式进行PCR反应：用96孔平板，在50℃孵育2分钟后，并在95℃孵育10分钟，在95℃15秒和在60℃1分钟的升温作为一个循环，重复进行40个循环。通过使用DMSO组作为参照的比较Ct方法，结果被计算为靶基因与内源对照基因(β肌动蛋白)的表达比。
[表4]
基因名称 基因表达分析
AXIN2 Hs00610344_m1
MYC(c–MYC) Hs00153408_m1
ACBT(β-肌动蛋白) Hs99999903_m1
如图1和2所示，实施例1的化合物以浓度依赖性的方式抑制AXIN2和c-MYC的表达，AXIN2和c-MYC是Wnt/β-连环蛋白信号靶基因。从以上可见，由本发明的化合物抑制Wnt信号/β连环蛋白信号传导途径的活性能在靶基因的表达水平得到证实。
试验例3Wnt/β-连环蛋白信号传导途径的靶蛋白的表达水平的变化的研究
通过Western印迹法进行分析，以及使用Wnt信号/β-连环蛋白信号传导途径的靶蛋白的表达量的变化作为指标针对本发明的化合物对Wnt基因/β-连环蛋白信号传导活性的影响进行了研究。
(待测试化的合物的加入)
以与试验例2相同的方式培养的HCT116细胞通采用培养基1稀释，以具有5×105细胞/mL的细胞浓度，和5ml的稀释的细胞被接种到T25烧瓶，随后在5％CO2培养箱中培养过夜。第二天，通过采用培养基1将10和3mM的待测试的化合物的DMSO储备溶液稀释100倍而获得待测试的化合物的溶液，将其加入到各烧瓶中，使得烧瓶中的溶液的量为最终溶液的量的十分之一(待测试的化合物的终浓度：10和3μM)。此后，在5％CO2培养箱中将细胞在烧瓶中培养24小时。
(蛋白质的提取)
培养上清液被离心，和回收悬浮细胞作为团粒。附着在烧瓶的细胞用在冰冷的PBS中的橡胶刮棒小心刮下，接着离心，以回收细胞团粒。这些团粒被合并，用冰冷的PBS洗涤两次，和将50μL裂解缓冲液[如下制备：将5％磷酸酶抑制剂((Activemotif,Inc.,UniversalMagneticCo-IPKit#54002)，1％脱乙酰酶抑制剂(同上)和1mM苯甲磺酰氟(PMSF)加入至全细胞裂解缓冲液(同上)]加入其中。将混合物轻轻搅拌，然后静置在冰上30分钟。通过离心操作(15000转，10分钟)回收上清液和对蛋白质的量进行了测定。对应于50微克蛋白质的量从上清液被称重，并用SDS样品缓冲液混合。将所得混合物在95℃反应5分钟。接着是蛋白质的变性，以得到样品溶液。将样品溶液加到4-20％梯度丙烯酰胺凝胶各孔(COSMOBIO公司有限公司，编号414879)，然后进行电泳。此后，使用iBlot凝胶转移系统(生命技术有限公司)，将凝胶中的蛋白质转录到PVDF膜上。
(检测AXIN2，C-MYC和β肌动蛋白)
用2％的ECLPrime封闭试剂(GEHealthcare公司)对被转录的PVDF膜进行封闭处理。然后，使蛋白在4℃反应过夜，用作为一抗(第一抗体)的抗AXIN2兔抗体(CellSignaling公司编号2151)，抗c-MYC兔抗体(CellSignaling公司编号5605)或抗β-肌动蛋白的小鼠抗体(Abcamplc公司编号ab6276)。未反应的一抗(第一抗体)用TBST洗涤缓冲液(10mM的Tris-HCl(pH值7.5)，150mM的NaCl和0.1％吐温20)洗涤。此后，将蛋白质在室温下在补充有2％的ECLPrime封闭试剂的TBST缓冲液中反应一小时，使用作为二次抗体的HRP标记的抗兔IgG山羊抗体(圣克鲁斯生物技术公司，编号sc2004)或HRP标记抗小鼠IgG山羊抗体(ZymedLaboratories公司，编号62-6520)。未反应的二抗(第二抗体)用TBST缓冲液洗涤后，用Chemi-LumiOneSuper(NACALAITESQUE，INC)使蛋白反应，如附方案所说明的。然后，使用CCD照相机(GE医疗集团有限公司ImageQuantLAS500)，各条带通过化学发光进行检测。所检测的条带，通过光密度仪(GE医疗保健公司，ImageQuantTLv8.1.0.0)定量(数值化)，从各组的条带的强度计算抑制率，其中DMSO添加组的带的发光为100％。根据对应于β-肌动蛋白的条带的强度对各个条带进行校正。
本发明中使用的一抗(第一抗体)和二抗(第二抗体)的组合和它们的浓度如在表5中所示。
[表5]
一抗(第一抗体)(稀释浓度) 二抗(第二抗体)(稀释浓度)
1 抗AXIN2兔抗体(1/1000) 抗兔IgG山羊抗体(1/5000)
2 抗c-MYC兔抗体(1/1000) 抗兔IgG山羊抗体(1/5000)
3 抗β肌动蛋白小鼠抗体(1/10000) 的抗小鼠IgG山羊抗体(1/5000)
如图3和表6中，实施例1的化合物在HCT116细胞中以浓度依赖的方式抑制AXIN2和c-MYC的表达，AXIN2和c-MYC是Wnt/β-连环蛋白信号传导靶蛋白。由上所述可见，由本发明的化合物抑制Wnt信号/β连环蛋白信号传导途径的活性是能够在目标蛋白质的表达水平得到证实。
[表6]
试验例4在皮下移植人源癌细胞系的小鼠模型中抗肿瘤作用
使用皮下移植人源结肠直肠癌细胞系HCT116的裸鼠对本发明的化合物的抗肿瘤作用进行了研究，其中Wnt信号传导途径被持续激活。
(荷癌模型的制备)
以与试验例2相同的方式培养的HCT116细胞用D-PBS(NACALAITESQUE，INC)进行了调整，以便具有7.5X107/mL的细胞浓度，并且将细胞悬浮液用冰冷却在15毫升的管。向细胞悬浮液，加入细胞悬浮液的四分之一的量的Matrigel(BDBiosciences公司公司)，以制备用于细胞移植的制剂。向BALB/cSlc-nu/nu小鼠(雌性，8周龄，日本SLC株式会社)的背部，皮下注射0.1毫升的用于细胞移植的制剂。在癌细胞移植后第7天，将小鼠分组，使得患癌小鼠的肿瘤体积的平均值近似(参考下面的计算公式)。
(用于给药待测试物质的样品溶液的制备)
用于给药待测试物质的两个样品溶液(8毫克/毫升和4毫克/毫升)按照各自施用的剂量制备。待测试物质(512毫克)溶解于DMSO(6.4毫升，NACALAITESQUE，INC)，和将聚乙二醇#400(28.8毫升，NACALAITESQUE，INC)加入其中以制备待测试物质的保存液。保存液储存在避光状态，直至使用当天。在使用的当天，5.5毫升的保存液转移到管中，和将4.5毫升的30％(2-羟丙基)-β环糊精(HP-β-CD)的水溶液(Sigma-Aldrich公司LLC)加入其中以制备用于给药的8毫克/毫升的样品溶液。将该溶液用DMSO，聚乙二醇#400和30％HP-β-CD的水溶液(1：4.5：4.5)的混合溶液稀释两倍，以制备用于给药的4毫克/毫升的样品溶液。
(待测试物质的抗肿瘤作用的测试)
向移植了癌细胞(每组9只)的相应的小鼠，每天两次强制口服给药从它们体重计算的剂量的待测试物质(以6小时或以上的间隔)，总共14天。使用下面的公式计算出各小鼠的肿瘤体积，并使用相对肿瘤体积比作为指标对抗肿瘤效果进行了评价。
肿瘤体积＝长轴×短轴×短轴/2
肿瘤体积变化量＝每个测量日的肿瘤体积-开始给药日的
肿瘤体积
如图4所示，是本发明的化合物的实施例1化合物显示出以剂量依赖的方式显著抑制肿瘤生长。在最后给药日的肿瘤生长抑制率(TGI)(％)分别为在40毫克/公斤的42％，和在80毫克/公斤的70％。由此证实，本发明的化合物抑制Wnt信号传导途径的活性，并且在治疗其中所述Wnt信号传导被不断地激活的癌症中是有用的。
工业实用性
由本发明提供的化合物可用于治疗已知与经由Wnt/β-连环蛋白信号传导途径介导的异常细胞应答相关的疾病，特别是癌症，本发明的化合物也可通过靶向癌症干细胞用于预防肿瘤的转移和复发。此外，本发明的化合物可作为Wnt/β-连环蛋白信号传导途径抑制剂用于实验室用和研究用试剂。

Claims (5)

1.由下式(I)表示的喹唑啉衍生物，或其药学上可接受的盐：
其中R1和R2表示氢原子，卤素原子，或任选具有取代基的低级烷基；Z表示具有取代基的环烷基或具有取代基的环烯基；Q表示任选具有取代基的双环杂芳基。
2.根据权利要求1的喹唑啉衍生物，或其药学上可接受的盐，其中Z是具有取代基的环烷基。
3.根据权利要求1或2的喹唑啉衍生物，或其药学上可接受的盐，其中Z是羟基环己基。
4.由下式(Ia)表示的喹唑啉衍生物，或其药学上可接受的盐：
其中R1a和R2a表示氢原子，卤素原子，或低级烷基；Za表示具有取代基的环烷基或具有取代基的环烯基；和Qa表示任选具有取代基的双环杂芳基。
5.根据权利要求4的喹唑啉衍生物，其中Za是羟基环己基，或其药学上可接受的盐。
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