WO2023156837A1 - Composiciones y métodos para detectar sars-cov-2 en muestras clínicas humanas - Google Patents

Composiciones y métodos para detectar sars-cov-2 en muestras clínicas humanas Download PDF

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WO2023156837A1
WO2023156837A1 PCT/IB2022/058734 IB2022058734W WO2023156837A1 WO 2023156837 A1 WO2023156837 A1 WO 2023156837A1 IB 2022058734 W IB2022058734 W IB 2022058734W WO 2023156837 A1 WO2023156837 A1 WO 2023156837A1
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Jhann Andrés Arturo
Lilia Jadith Bernal Cepeda
Sonia del Pilar Bohórquez Ávila
María Angélica Calderón Peláez
Eliana Patricia Calvo Tapiero
Sigrid Johanna Camacho Ortega
Jaime Eduardo Castellanos Parra
Camilo Andrés Castellar Mendoza
Carolina Coronel Ruiz
Felix Giovanni DELGADO TIRIA
Héctor Hernando Gutiérrez Barbosa
Lady Stephanie López Ibarra
Myriam Lucía Velandia Romero
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Universidad El Bosque
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Definitions

  • the present invention is directed to the field of molecular tests for the detection of viral infections.
  • the present invention is directed to in vitro methods for the detection of SARS-CoV2 in human samples using molecular methodologies, and provides compositions and kits to carry out said methods.
  • the protocol of the University of Charotti or the Berlin Protocol is based on the detection of the viral envelope (E) gene and the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) gene (Coman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DKW, Bleicker, T., Brünick, S., Schneider, J., Schmidt, ML, Mulders, DGJC, Haagmans, BL, Van der Veer, B., Van den Brink, S., Wijsman, L., Goderski, G., Romette, JL, Ellis, J., Zambón, M., Peiris, M., Goossens, H., Reusken, C., Koopmans, MPG, & Drosten, C.
  • E viral envelope
  • RdRp RNA-dependent RNA polymerase
  • 2019 novel coronavirus 2019-nCoV
  • CDC Center for Disease Control and Prevention
  • the protocol published by the World Health Organization in association with the Pasteur Institute is based on the detection of two targets of the RdRp gene (named IP2 and IP4), which can be combined with the detection of the E gene of the Sarbecovirus subgenus, which includes to SARS-CoV-2 (Institut Pasteur, Paris. Protocol: Real-Time RT-PCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2. Available at: https://www.who.int/docs/default-source/ coronaviruse/real-time-rt-pcr-assays-for-the-detection-of-sars-cov-2 -institut-pasteur-paris.pdf).
  • Wagoner et al. (2020), describe an RT-qPCR assay that combines the detection of the N2 region of the N gene (specific to SARSCoV-2); the E gene (also detected in other SARS-related coronaviruses); and human RNase P as a control.
  • This triple assay maintains the clinical performance of the independent assays and allows detection of both viral targets from 45 copies/pL (Waggoner, J.J., Stittleburg, V., Pond, R., Saklawi, Y., Sahoo, M.K., Babiker, A., Hussaini, L., Kraft, C.
  • Nsp2 non-structural protein 2
  • WO2021168478A1 discloses an assay for the simultaneous detection of multiple respiratory tract pathogens, such as SARS-CoV-2, influenza A or B virus and/or respiratory syncytial virus.
  • human (RSV) A and/or B by PCR.
  • the document provides primers and probes directed, on the one hand, to regions of said viruses, such as the open reading frame 1 a/b (ORFla/b), the spike protein (S), and the nucleocapsid protein (N); and on the other hand to controls that can be exogenous, such as the MS2 phage gene or sequence, or endogenous, such as the RNase P gene.
  • document WO2021178534 provides a method for detecting the new coronavirus (SARS-CoV- 2 or C0VID19) based on the detection of the nucleocapsid gene (N), the envelope gene (E) and the RNase P gene as a control.
  • kits or kits are also available that target the detection of one or more SARS-CoV-2 genes, such as the open reading frame 1 a/b (ORFla/b), ORFlb and the protein no. structural 14 (ORFlb-nspl4), RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), the envelope (E), spike (S) or nucleocapsid (N) genes.
  • ORFla/b open reading frame 1 a/b
  • ORFlb-nspl4 RNA-dependent RNA polymerase
  • E envelope
  • spike S
  • N nucleocapsid
  • the present invention refers to methods based on reverse transcription coupled to polymerase chain reaction for the detection of the severe acute respiratory syndrome virus type 2 (SARS-CoV-2) that causes coronavirus disease 2019 (COVID-19). ) in humans, as well as the compositions and kits used for said methods.
  • the methods, compositions and kits according to the invention are useful for detecting persons infected with SARS-CoV-2, including, but not limited to, B lineages; Bl; Bll; B.1.1. eleven; B.1.4.20; B.1.6.21 Mu; B.
  • the methods, compositions and kits according to the invention are useful for detecting persons infected with SARS-CoV-2 from biological samples derived from the patient, such as sputum, bronchoalveolar lavage, tracheal aspirate, endotracheal aspirate, nasopharyngeal aspirate, nasopharyngeal, oropharyngeal, or rectal swabs, biopsy or autopsy tissue (including lung), and cerebrospinal fluid.
  • the methods, compositions, and kits allow the response to treatment for COVID-19 to be followed up and monitored.
  • the invention provides a method for detecting the presence of SARS-CoV-2 in a human clinical sample, based on the simultaneous detection of the S and N genes, and a control gene. In other embodiments, the invention provides a method for detecting the presence of SARS-COV-2 in a human clinical sample, based on the simultaneous detection of the S and E genes, and a control gene. In a preferred embodiment, the control gene is human RNase P.
  • kits for detecting the presence of SARS-CoV-2 in a human clinical sample comprising primers and probes directed to specific SARS-CoV-2 genes and at least one human control; at least one buffer solution; one or more enzymes (thermostable polymerase, reverse transcriptase); and other reagents necessary to carry out the analysis by RT-qPCR, such as dNTPs (deoxynucleoside triphosphate) and co-enzymatic factors (magnesium).
  • the kit comprises primers and probes directed to the Spk, N, E, and RNase P genes.
  • the kit further includes instructions for use.
  • the invention provides compositions comprising oligonucleotides useful for detecting the presence of SARS-CoV-2 in a human clinical sample by means of molecular tests, such as PCR and RT-qPCR.
  • the invention provides compositions comprising primers and probes specifically directed to SARS-COV-2 genes.
  • the invention provides compositions comprising pairs of forward and reverse primers, and probes directed to the human Spk, E, N, and RNase P genes, wherein said primers may be found alone or in combination.
  • oligonucleotides refers to polymers formed by chains of equal to or less than 50 nucleotides, which are formed in turn by a sugar molecule (ribose or deoxyribose), attached to a phosphate group. and to a nitrogenous base (including, but not limited to, adenine (A), cytosine (C), guanine (G), thymine (T), uracil (U)).
  • the oligonucleotides used in the present invention are between 10 to 30 nucleotides in length. In even more preferred embodiments, the oligonucleotides of the present invention are between 14 to 25 nucleotides in length.
  • oligonucleotides of the present invention are identified in this application by means of the number they occupy in the sequence listing attached to the application (SEQ ID NO: X). It should be understood that the scope of the present invention covers both the disclosed sequences and their reverse complements.
  • RT-PCR refers to the molecular technique that combines reverse transcription (reverse transcription or retrotranscription or RT) and polymerase chain reaction (PCR).
  • the main objective of this technique is to amplify and quantify the amount of a specific RNA included in a sample, and includes the stages of obtaining complementary DNA from an RNA extract (RT), and the amplification of specific segments or regions of said complementary DNA by means of cycles of denaturation, hybridization and extension or polymerization of the DNA.
  • qPCR or "real-time PCR” refers to polymerase chain reaction in which fluorophores are used to achieve detection of the amplified fragment.
  • the term “primers”, “initiators” or “primers” refers to oligonucleotides used from which a DNA replication process is initiated.
  • the primers of the present invention are used in the RT-PCR process.
  • the primers used in the present invention are complementary to a particular region of some specific SARS-COV-2 genes or to specific regions of human genes used as control.
  • the primers of the present invention are directed to the SARS-COV-2 nucleocapsid (N), envelope (E) and spike (Spk) genes and the human RNase P gene.
  • forward primer refers to a primer that is complementary to, and hybridizes to, the 3'-» 5' strand sequence of the gene interest.
  • reverse primer refers to a primer that is complementary to, and hybridizes with, the sequence of the 5'->3' strand of the gene of interest.
  • the term "probes” refers to oligonucleotides that hybridize with an internal sequence of the amplicon, which may comprise a label that facilitates their detection.
  • the probes used comprise a fluorophore as a label.
  • said probes may also include a fluorescence quencher molecule.
  • the method of the present invention provides a specific probe for each gene of interest.
  • the blocker is BHQ1 or BHQ2.
  • the fluorophores included in the probes employed in the methods, compositions, and kits of the invention are selected from a group including, but not limited to, 6-FAM, JOE, TET, HEX, VIC, TxRd (also called TexasRed or sulforhodamine 101-X), ROX, Cyanine 3, Cyanine 5, Cyanine 5.5, Quasar 670, Quasar 705, Alexa Fluor 568, CAL Fluor Red 610, BODIPY, ATTO 590 a , CAL Fluor Red 635.
  • Blockers included in the probes used in the methods, compositions, and kits of the invention are selected from the group including, but not limited to, Dabcyl, Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), Black Hole Quencers (BHQ1 or BHQ2), BlackBerry Quencher 650, Eclipse® Dark Quencher, Deep Dark Quencher II.
  • TAMRA Carboxytetramethylrhodamine
  • BHQ1 or BHQ2 Black Hole Quencers
  • BlackBerry Quencher 650 Black Hole Quencers
  • Eclipse® Dark Quencher Deep Dark Quencher II.
  • the selection of the labels in the probes of the method of the invention will be carried out in such a way as to allow the simultaneous detection of different targets, so that each probe will have its own characteristics, for example, each probe used will comprise a different fluorophore.
  • the invention is not limited to the exemplified fluorophore/quencher pairs, but rather covers all possible combinations of the disclosed sequences
  • reaction mixture refers to the mixture comprising the reagents necessary to carry out the detection according to the method of the invention.
  • the reaction mixture includes a buffer solution, which includes reagents, such as dNTPs (deoxynucleoside triphosphates); enzyme cofactors, such as magnesium; enzymes, such as reverse transcriptase and polymerase;
  • reagents such as dNTPs (deoxynucleoside triphosphates)
  • enzyme cofactors such as magnesium
  • enzymes such as reverse transcriptase and polymerase
  • the reaction mix includes the forward and reverse primers, the probes, and the sample to be tested.
  • hybridization refers to the step of PCR in which binding occurs between the primer or probe and the complementary DNA region of interest.
  • threshold cycle refers to the number of cycles required for the fluorescence signal to cross baseline or rise above background noise. This value is related to the initial amount of RNA in the initial sample.
  • the term "biological sample” or “clinical sample” refers to the samples used to perform the RNA extraction process.
  • the biological samples are selected from the group consisting of samples derived from sputum, bronchoalveolar lavage, tracheal aspirate, endotracheal aspirate, nasopharyngeal aspirate, nasopharyngeal, oropharyngeal or rectal swabs, biopsy or autopsy tissues (including from lung), and cerebrospinal fluid.
  • the biological sample is derived from respiratory tract samples.
  • the biological sample is derived from a nasopharyngeal swab.
  • the sample is a human biological sample.
  • analytical sensitivity refers to the number of copies of a gene that can be detected with 95% confidence.
  • the term "clinical specificity” refers to the ability to define the absence of virus in an uninfected individual. It is the probability that an uninfected subject will obtain a negative test result. In other words, the specificity accounts for the ability of the test to distinguish individuals who are not infected.
  • the FIG. 1 shows the analytical sensitivity of the duplex RT-qPCR reaction for the Spk gene and RNase P, using the primers and probe directed to the Spk gene of the invention.
  • the FIG. 1A shows the amplification curves obtained using 20, 10 or 5 genomic copies of SARS-CoV 2 as template RNA
  • FIG. IB shows the amplification curves obtained with 5 and 2.5 copies/reaction. It is evident that, for this gene, the detection limit is 5 copies/reaction.
  • the FIG. 2 shows the analytical sensitivity of the duplex RT-qPCR reaction for the N gene and RNase P, using the primers and the probe that recognize the N2 fragment according to the invention.
  • the FIG. 1A shows the amplification curves obtained using 20, 10 or 5 genomic copies of SARS-CoV 2 as template RNA
  • FIG. IB shows the amplification curves obtained with 5 and 2.5 copies/reaction. It is evident that, for this gene, the detection limit is 5 copies/reaction.
  • the FIG. 2 shows the analytical sensitivity
  • FIG. 2A shows the amplification curves obtained using 100, 50, 20, 10 or 5 genomic copies of SARS-CoV 2 as template RNA while in FIG. 2B shows the amplification curves corresponding to the minimum amount of template used (5 copies/reaction). It is evident that for this gene, the detection limit is 5 copies/reaction.
  • FIG. 3 shows the analytical sensitivity of the duplex RT-qPCR reaction for gene E and RNase P, using the primers and probe according to the invention.
  • FIG.3A shows the amplification curves obtained using 100, 50, 20, 10 or 5 genomic copies of SARS-CoV 2 as template RNA
  • FIG.3B shows the amplification curves corresponding to the minimum amount of template used. (5 copies/reaction). It is evident that, for this gene, the detection limit is 10 copies/reaction.
  • FIG. 4 shows the analytical sensitivity of the multiplex RT-qPCR reaction for the Spk/N2/RNaseP genes using the set of primers and probes according to the invention.
  • the FIG. 4A shows the amplification curves for the S gene obtained using 25, 10, 5 or 2.5 viral copies as template RNA
  • FIG. 4B shows the amplification curves for the N gene (N2 fragment) obtained with 25, 10, 5 and 2.5 copies/reaction. It is evident that, for this system, the detection limit is 5 copies/reaction.
  • FIG. 5 shows the analytical sensitivity of the multiplex RT-qPCR reaction for the Spk/E/RNase P genes using the set of primers and probes according to the invention.
  • the FIG. 5A shows the amplification curves for the S gene obtained using 20, 5 or 2.5 viral copies as template RNA
  • FIG. 5B shows the amplification curves for the E gene obtained with 20, 5 and 2.5 copies/reaction. It is evident that, for this system, the detection limit is 5 copies/reaction.
  • the FIG. 6 corresponds to the sequence alignment of 20 SARS-COV-2 genomes reported in Latin America, each sequence is representative of each of the lineages that have circulated in the region since 2020 (lineages B; Bl; Bll; B. 1.1. 11; B.1.4.20; B.
  • each oligonucleotide (section highlighted in black) is found at the top of each alignment and each point indicates identity in the analyzed sequences; in cases where there is no identity, the corresponding nucleotide is identified.
  • FIG. 7 shows the result of the evaluation of the amplification of the fragments used in the method of detecting SARS CoV 2 according to the invention by agarose gel electrophoresis.
  • FIG. 8 shows the results of the evaluation of the specificity of the method of the invention in nasopharyngeal swabs collected between 2013-2015 (Pre-covid).
  • the FIG. 8A shows the results of the amplification curves obtained by the SARS-CoV2 detection method according to the invention, while FIG. 8B shows the amplification curves for the detection of V SR.
  • FIG. 9 shows the analytical sensitivity of a multiplex RT-qPCR reaction for the E/N/RNase P genes using the set of primers and probes according to the invention.
  • the FIG. 9A shows the amplification curves obtained using 50 viral copies as template RNA
  • FIG. 9B shows the amplification curves obtained with 25 copies/reaction
  • FIG. 9C shows the amplification curves obtained with 10 copies/reaction
  • FIG. 9D shows the amplification curves obtained with 5 copies/reaction. It is evident that, for this system, the detection limit is 5 copies/reaction.
  • the method of the invention refers to a method for detecting the presence of the virus associated severe acute respiratory syndrome virus (SARS-CoV-2) in a biological sample by reverse transcription coupled to the polymerase chain reaction (RT-PCR) in real time, from sets of primers and probes that allow the simultaneous amplification of two viral genes and a control human gene in the same reaction.
  • the method allows for an in vitro diagnosis of C0VID19 from human biological samples, preferably samples from the human respiratory tract such as nasopharyngeal swabs.
  • the method according to the present invention involves the multiplex detection of the human Spk, N and RNase P genes.
  • the detection of the N gene is directed to the N2 region thereof.
  • the method according to the present invention involves the multiplex detection of the human Spk, E and RNase P genes.
  • the method according to the invention comprises the steps of: a) RNA purification from fresh or frozen samples; b) Preparation of a reaction mixture (15 pL) with a buffer solution (contains dNTPs, magnesium and the enzymes: reverse transcriptase and polymerase) and the primers and probes that specifically recognize the N and Spk genes of SARS- CoV-2 and human RNase P. c) Addition of the template RNA obtained from the biological sample to be analyzed (5 pL) for a final reaction volume of 20 pL.
  • Retro transcription-amplification with the following thermal cycle: di.- heating at 55°C for 15 min d2.- heating at 95°C for 3 min d3.- between 40-42 amplification cycles, which include the increase in temperature to 95°C for 15 seconds and subsequently a decrease to 58°C for 45 seconds, e) Verification of the run, as follows:
  • step di of the retrotranscription and amplification step (d.) thermal cycle is performed at 50°C. In another embodiment, the step di is brought to 55°C. In particular embodiments, step d3 comprises 40 amplification cycles. In other embodiments, step d3 comprises 42 amplification cycles.
  • the invention comprises sets of primers and probes targeting the nucleocapsid gene (N) and the spike gene (Spk) of SARS-Cov-2, and the envelope gene (E). ). Also, the invention provides a set of primers and probes for detecting human Ribonuclease P (RNase P).
  • RNase P human Ribonuclease P
  • the method of the invention is based on a set of primers and probes of our own design, aimed at detecting the Spk gene, which allow the detection of circulating lineages in Latin America.
  • the method of the invention uses the primers Sp F (SEQ ID No. 7) and/or Sp F3 (SEQ ID No. 8) and Sp-R (SEQ ID No. 9) for the detection of variants of SARS Cov 2 that present a 69-70 deletion in the S gene.
  • the method of the present invention simultaneously detects the S, N, and RNase P genes.
  • the method of the present invention detects simultaneously the genes S, E and RNase P.
  • kits in a second aspect, refers to a kit for detecting the presence of the virus associated with severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV-2) in a biological sample by reverse transcription and quantitative polymerase chain reaction in time (RT-qPCR), from sets of primers and probes that allow the simultaneous amplification of two viral genes and a control human gene in the same reaction.
  • SARS-CoV-2 virus associated with severe acute respiratory syndrome
  • RT-qPCR reverse transcription and quantitative polymerase chain reaction in time
  • the invention provides kits that allow an in vitro diagnosis of C0VID19 to be carried out from human biological samples, preferably samples of the human respiratory tract obtained from nasopharyngeal swabs.
  • the kit according to the invention comprises compositions that include the primers and probes identified in the sequences in Table 2, either alone or in combination, and, optionally, other compositions that include those necessary to carry out the detection by RT-qPCR medium.
  • RNA extraction with the Inviso rb Spin Virus RNA Mini Kit (Stratec) extraction kit.
  • the detection of SARS-CoV-2 was carried out with each of the systems to be evaluated, following the protocol recommended by each manufacturer. Once the amplification reaction was finished, each run was validated according to the instructions specified in each reference, the result of each sample was analyzed and the data were tabulated as: positive, negative or indeterminate (those samples where there was no detection of RNase P, nor of viral genes).
  • VP True positives
  • FP False positives
  • FN False negatives
  • VN True negatives
  • analytical sensitivity was determined for each of the detection targets for SARS-CoV-2 reported in the in-house protocols and for the Spk fragment, which recognizes a region of the spike gene, in duplex reactions.
  • analytical sensitivity is defined as the minimum number of copies of a gene that can be detected with 95% confidence.
  • an amplification reaction was carried out with serial dilutions of the commercial standard EDX SARS-CoV-2 (Exact Diagnostics Catalog Number: COV019) and the set of primers and specific probes for each detection target and for the RNase control. P of human origin. Known concentrations of 5, 10, and 20 genomic copies per reaction (cg/rx) were used and at least 2 independent set-ups were performed, each with 6 replicates. The average value obtained for 12 replicates is shown in Table 4. For the E gene and the N 1 fragment, no positive result was obtained in all the 12 replicates when using 5 cg/rx as a template, while for the other viral targets it was. , which confirmed the need to introduce another viral detection target to increase detection sensitivity.
  • the Spk and N2 fragments have better sensitivity, that is, they allow the detection of fewer copies of SARS-CoV-2 in an amplification reaction, since they were detected repeatedly in reactions containing 5 viral copies, with an average CT value of 35.9 and 37.9 respectively.
  • LoD6 Detection limit 6
  • LoD6 Detection limit 6
  • LoD6 corresponds to the last dilution where 18 replicates show positive and specific amplification (Shehata, H.R., Ragupathy, S., Shanmughanandhan, D., Kesanakurti, P., Ehlinger, TM., Newmaster, S.G. Guidelines for Validation of Qualitative Real-Time PCR Methods for Molecular Diagnostic Identification of Probiotics. Journal of AOAC, Volume 102, Number 6, Pages 1774-1778, November 2019).
  • the L0D6 in this reaction was 5 cg/rx for the Spk fragment and 10 cg/rx for the E gene.
  • the LoD6 in this reaction was 5 cg/rx for the Spk fragment and 10 cg/rx for the N2 fragment.
  • the results of the amplification in multiplex format made it possible to establish that introducing the detection of the Spk fragment according to the invention leads to a gain in sensitivity, since, by means of the detection of the E or N2 fragment, it is not possible to detect the virus in samples with a viral load less than 10 copies only.
  • the results also allowed us to conclude that with the triplex system it is possible to detect the two SARS-CoV-2 genes and the RNaseP of human origin simultaneously, without losing the sensitivity obtained in the duplex assay.
  • the analytical sensitivity of the reaction was 5 copies/reaction for the N gene and 10 copies/reaction for the E gene.
  • results of the amplification in multiplex format allowed us to establish that there is a "gain" in sensitivity when introducing the N gene, since only with the detection of the E gene the detection of samples with a viral load of less than 10 copies is not achieved. These results allowed us to conclude that with the E/N/RNase P system it is possible to detect the E and N genes of SARS-CoV-2 and the RNase P of human origin simultaneously, without losing the sensitivity obtained in the duplex assay.
  • Example 1 Evaluation of the clinical sensitivity and specificity of the N2/Spk/RNase P multiplex system in comparison with the commercial ViroQ kit
  • the performance of the multiplex system according to the invention (which preferably uses the combination of primers and probes according to the sequences SEQ ID NO: 1 to 6 and 8 to 10), was evaluated with 120 clinical samples, previously they had been analyzed with the ViroQ SARS-CoV2 system (BAG Diagnostics).
  • This system uses RNA as starting material, the virus-specific RNA is transcribed into copy DNA in a reverse transcription reaction at 48°C and then amplified in a real-time PCR reaction.
  • the system has as detection targets the RdRp gene (FAM) and the E gene (HEX), also allows the amplification of RNaseP as a control (ROX).
  • RNAs from nasopharyngeal swabs were evaluated, the panel included 20 negative and 100 positive samples collected from January to May 2021 in the city of Pasto by Laboratorios del Valle.
  • 2x2 tables were constructed, as described above, taking the result obtained with the commercial ViroQ SARS-CoV2 kit (BAG Diagnostics) as the reference result; the results are presented in Table 8.
  • results obtained show that the implemented system presents a performance similar to that of a commercial kit, since it has the ability to discriminate true positive cases and true negative cases.
  • the present invention it is possible to establish the presence of the virus in an infected individual and the absence of the virus in an uninfected individual with the same probability of success as the commercial ViroQ kit.
  • Example 2 Evaluation of the clinical sensitivity and specificity of the N2/Spk/ RNAsaP multiplex system in comparison with the Capital® commercial kit The performance of the Spk/N/RNAsaP multiplex system was evaluated with 150 clinical samples, which had previously been analyzed with Biotechrabbit's Capital system in the Quantstudio equipment (Applied Biosystem). Virus-specific RNA is transcribed into copy DNA in a reverse transcription reaction at 50°C and then amplified in a real-time PCR reaction. The system has as detection targets the RdRp gene; the E gene and RNaseP as control.
  • RNAs from nasopharyngeal swabs were evaluated, the panel included 45 negative and 105 positive samples collected from April to May 2021 in the city of Neiva by the Secretary of Health.
  • 2x2 tables were constructed, as described above, taking the result obtained with the CAPITAL kit (Biotechrabbit) as the reference result; the results are presented in Table 9.
  • the U-TOPTM COVID-19 Detection Kit uses probes directed against an ORFlab region and a region in the N gene of the SARS-CoV-2 genome. detection probes for two amplicons they are marked with FAM and HEX, respectively. In addition, a includes a Texas Red-labeled internal amplification control, which indicates whether the amplification reaction was performed properly. A sample is determined to be positive for SARS-CoV-2 if the ct value of one or both fluorescence channels is ⁇ 38.
  • Dynamiker's detection kit uses detection probes for one FAM-tagged Orflab region and one for HEX-tagged N, plus a CY5-tagged human actin gene probe that indicates whether sample processing , including collection, extraction and amplification was carried out adequately.
  • a sample is determined to be positive for SARS-CoV-2 if the ct value of one or both fluorescence channels is ⁇ 37.
  • the N2/Spk/RNaseP multiplex detection method of the invention presented a better performance compared to the commercial kits, being able to detect up to 5 viral copies of SARS-CoV-2 per reaction, while the two commercial kits detect 10 viral copies per reaction.
  • RNA extraction a set of 155 samples of nasopharyngeal swabs collected between November 16 and 30, 2021 were subjected to RNA extraction with the Nexttractor® NX-48S (Genolution) automated system. From this genetic material, the detection of SARS CoV 2 was carried out with the commercial GeneFinder COVID-19 Plus Real Amp RT-PCR kit, following the protocol recommended by the manufacturer, and with the E/N/RNAsaP multiplex system. Once the amplification reaction was finished, each run was validated, the result of each sample was analyzed and the data were tabulated as: positive, negative or indeterminate (those samples where there was no detection of RNase P or viral genes).
  • results obtained show that the implemented system has a capacity to discriminate true positives and true negatives, similar to that of a commercial kit. That is, they allow establishing the presence of the virus in an infected individual and the absence of the virus in an uninfected individual.
  • Example 7 Stability analysis at storage temperature (- 0°C) 4 lots or sets of primers and probes (P&P) were prepared, each of which was separated into aliquots in amber tubes and stored at -20°C for 7, 15, 21, 28, 35 and 60 days. On each measurement day, the RT-qPCR reaction (10 replicates per batch) was carried out with 250 copies of SARS-CoV-2 per reaction.
  • the standard deviation and relative error values obtained by evaluating each batch independently allow us to establish that the set of primers and probes is stable, does not decompose or decreases its activity due to storage at -20°C.
  • the in-house protocols on which the present invention is based detect a single viral target per reaction (single reaction or monoplex format), while in the method developed, 2 targets are detected in the same reaction.
  • viruses in different genes N gene and S gene, or S gene and E gene
  • RNase P human target
  • the value per test of a commercial kit ranges from 10 to 14 USD, while the cost per test of the method of the invention would be around 4 USD. This difference is significant if one takes into account that a diagnostic laboratory runs between 200 to 300 tests per day.
  • the method of the invention is advantageously aimed at detecting the Spk gene by means of a set of primers and probes that demonstrated improved analytical sensitivity compared to the commercial kits available in Colombia.
  • the method has a specificity equal to the protocol implemented by the National Institute of Health of Colombia (Berlin Protocol) and a higher sensitivity, since two detection targets are used and not one.
  • the method of the present invention is specifically oriented to the detection of people infected with SARS-CoV-2 from lineages of regional circulation in Latin America, specifically lineages B; B.l; B.l.l; B.1.1.11; B.1.4.20; B. 1.6.21 Mu; B.l.4.27; B.l. 1.28; B.l. 1.95; B.l. 1.10; B.l. 1.74; B.l.4.29; B.l.5.26; B.l.5.25; B.l.1.29; B.l.4.39; B.l.l. 186; P.l; Q.2; C.37.

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Abstract

La presente invención se refiere a métodos basados en la transcripción inversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa para la detección del virus del síndrome respiratorio agudo severo tipo 2 (SARS-CoV-2) causante de enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) en humanos, así como también a las composiciones y kits empleados para dichos métodos.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA DETECTAR SARS-CoV-2 EN MUESTRAS CLÍNICAS HUMANAS
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se encuentra dirigida al campo de las pruebas moleculares para la detección de infecciones virales. En particular la presente invención se encuentra dirigida a métodos in vitro para la detección de SARS-CoV2 en muestras humanas haciendo uso de metodologías moleculares, y proporciona composiciones y kits para llevar a cabo dichos métodos.
DESCRIPCIÓN DEL ESTADO DE LA TÉCNICA
La enfermedad por coronavirus de 2019 (COVID-19) emergió a finales de 2019 en Wuhan, China, se propagó rápidamente alrededor del mundo, y desencadenó una crisis sanitaria y económica de proporciones globales. El control de esta pandemia requiere de la implementation de métodos de diagnóstico confiables que permitan detectar, aislar y tratar adecuadamente a los infectados.
Con este fin, a partir de 2020, investigadores alrededor del mundo han concentrado sus esfuerzos en desarrollar protocolos “in house” para la detección molecular del coronavirus de tipo 2 causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2), los cuales han sido difundidos o socializados por la Organización Mundial de la Salud (OMS). Gran parte de estos protocolos se basan en la amplificación de una o varias secuencias genéticas específicas del virus acompañada de la detección de un gen humano (control) a través de la técnica de transcripción reversa acoplada a la reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR), para lo cual es necesario diseñar y sintetizar cebadores y sondas dirigidos a dichas secuencias.
El protocolo de la Universidad de Charité o Protocolo Berlín se basa en la detección del gen de la envoltura viral (E) y del gen de la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp, por sus siglas en inglés) (Coman, V.M, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, D.K.W., Bleicker, T., Brünick, S., Schneider, J., Schmidt, M.L., Mulders, D.G.J.C., Haagmans, B.L., Van der Veer, B., Van den Brink, S., Wijsman, L., Goderski, G., Romette, J.L., Ellis, J., Zambón, M., Peiris, M., Goossens, H., Reusken, C., Koopmans, M.P.G., & Drosten, C. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Europe's Journal of Infectious Disease Surveillance, Epidemiology, Prevention and Control, Volumen 25, número 3, páginas 1-8, Enero 2020). Por su parte, el protocolo desarrollado por el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de Atlanta, EE.UU. se basa en la detección de dos blancos del gen de la nucleocápside (N) (denominados NI y N2) y la detección del gen de ARNasa P humana como control (Centers for Disease Control and Prevention. A CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel. Disponible en: https://www.fda.gov/media/134922/download). El protocolo publicado por la Organización Mundial de la Salud en asociación con el Instituto Pasteur se basa en la detección de dos blancos del gen RdRp (denominados IP2 e IP4), que puede ser combinada con la detección del gen E del subgénero Sarbecovirus, que incluye al SARS- CoV-2 (Institut Pasteur, Paris. Protocol: Real-Time RT-PCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2. Disponible en: https://www.who.int/docs/default- source/coronaviruse/real-time-rt-pcr-assays-for-the-detection-of-sars-cov -2 -institut- pasteur-paris .pdf) .
La mayoría de estos protocolos in house se publicaron en los primeros meses de 2020 cuando solo se disponía de 230 secuencias del virus que circulaba exclusivamente en Asia y Europa, y con unos pocos provenientes de Estados Unidos y Canadá, por lo que su eficiencia y sensibilidad para detectar los virus que circulan otras regiones del mundo, como América Latina, podrían verse afectadas por la variabilidad genética acumulada y las particularidades de secuencia de virus que circulan en regiones específicas. En Colombia, por ejemplo, para algunas de las regiones detectadas por los conjuntos de cebadores y sondas empleados en otros protocolos in house, se reportaron algunas diferencias; sin embargo, no se ha evaluado si tienen un efecto real en la detección, y, por tanto, en la sensibilidad de la prueba. Cabe mencionar que no se encontraron discordancias para los conjuntos de cebadores y sondas dirigidos a las secuencias E (Berlín), IP2 (Instituto Pasteur) y NI, N2, N3 (CDC USA) (Álvarez-Díaz, D.A., Franco- Muñoz, C., Laiton-Donato, K., Usme-Ciro, J.A., Franco-Sierra, N.D., Flórez-Sánchez, A.C., Gómez-Rangel, S., Rodríguez-Calderon, L.D., Barbosa-Ramirez, J., Ospitia-Baez, E., Walteros, D.M., Ospina-Martinez, M.L., & Mercado-Reyes, M. Molecular analysis of several in-house rRT-PCR protocols for SARS-CoV-2 detection in the context of genetic variability of the virus in Colombia. Infection, Genetics and Evolution, Volumen 84, 104390, Octubre 2020).
Los protocolos in house descritos en la literatura, fueron evaluados en reacciones única o ensayos monoplex -en los cuales se amplifica una única secuencia a la vez-, por lo que tiene limitaciones, ya que es necesario realizar entre 2 a 3 reacciones de amplificación por muestra, lo cual implica mayor manipulación y aumenta los tiempos y costos del análisis. Por otra parte, la implementación de protocolos in house requiere la adquisición de reactivos con diferentes casas comerciales (enzimas para RT-PCR, cebadores y sondas) y la posterior estandarización y validación de la prueba, lo cual puede retrasar considerablemente la ejecución de las pruebas en laboratorios que no hacen pruebas moleculares de rutina o que tienen escasa experiencia.
A partir de los cebadores y las sondas empleadas en los protocolos in house se han desarrollado métodos que combinan la detección de 1 o 2 blancos virales y un control humano en un mismo tubo de reacción, denominados comúnmente multiplex. Entre ellos podemos encontrar el del protocolo propuesto por Stahl y colaboradores (2020), quienes desarrollaron un ensayo basado en RT-qPCR que permite la detección simultánea del gen N (región NI) y el gen E de SARS-CoV-2, junto con el gen de la RNasa P humana como control, amplificados en un mismo tubo de reacción, obteniendo concordancia en muestras de hisopados orofaríngeos (Stahl, E.C., Tsuchida, C.A., Hamilton, J.R., Lin- Shiao, E., McDevitt, S.L., Moehle, E.A., Witkowsky, L.B., Tsui, C.K., Pestal, K., Gildea, H.K., McElroy, M., Keller, A., Sylvain, I., Williams, C., Hirsh, A., Ciling, A., Ehrenberg, A.J., Umov, F.D., Ringeisen, B.R., Giannikopoulos, P., & Doudna, J. A. IGI-LuNER: single-well multiplexed RT-qPCR test for SARS-CoV-2. medRxiv: the preprint server for health sciences, Diciembre 2020). En dicho ensayo se descarta la detección de la región N2 debido al reporte de Vogel y colaboradores (2020), que indica menor sensibilidad en comparación con NI (Vogels, C.B.F., Brito, A.F., Wyllie, A.L., Fauver, J.R., Ot, I.M., Kalinich , C.C., Petrone, M.E., Casanovas-Massana, A., Muenker, C.M., Moore, A.J., Klein, J., Lu, P., Lu-Culligan, A., Jiang, X., Kim, D.J., Kudo, E., Mao, T., Moriyama, M., Oh, J.E., Park, A., Silva, J., Song, E., Takahashi, T., Taura, M., Tokuyama, M., Venkataraman, A., Weizman, O.E., Wong, P., Yang, Y., Cheemarla, N.R., White, E.B., Lapidus, S., Earnest, R., Geng, B., Vijayakumar, P., Odio, C., Fournier, J., Bermejo, S., Farhadian, S., Déla Cruz, C.S., Iwasaki, A., Ko, A.I., Landry, M.L., Foxman, E.F., & Grubaugh, N.D. Analytical sensitivity and efficiency comparisons of SARS-CoV-2 RT-qPCR primer-probe sets. Nature Microbiolgy, Volumen 5, Número 10, Páginas 1299-1305, Octubre 2020).
De otro lado, Waggoner y colaboradores (2020), describen un ensayo por RT-qPCR que combina la detección de la región N2 del gen N (específica del SARSCoV-2); el gen E (también detectado en otros coronavirus relacionados con el SARS); y RNasa P humana como control. Este ensayo triple mantiene el desempeño clínico de los ensayos independientes y permite detectar ambos blancos virales a partir de 45 copias/pL (Waggoner, J.J., Stittleburg, V., Pond, R., Saklawi, Y., Sahoo, M.K., Babiker, A., Hussaini, L., Kraft, C. S., Pinsky, B.A., Anderson, E.J., & Rouphael, N. Triplex Real- Time RT-PCR for Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerging infectious diseases, Volumen 26, Número 7, Páginas 1633-1635, Julio 2020). Por su parte, Mostafa y colaboradores (2020) reportan una prueba en formato triplex denominada “NeuMoDx™ SARSCoV-2 assay", la cual amplifica y detecta el gen de la proteína no estructural 2 (Nsp2) y el gen N, ambos específicos del genoma del SARS- CoV-2 y un control de procesamiento de la muestra (Mostafa, H.H., Lamson, D.M., Uhteg, K., Geahr, M., Gluck, L., de Cárdenas, J., Morehead, E., Forman, M., Carroll,
K.C., Hayden, R.T., & George, K.S. Multicenter evaluation of the NeuMoDx™ SARS- CoV-2 Test. Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology, Volumen 130, 104583, Septiembre 2020).
Otros métodos de detección se han descrito en documentos de patente como WO2021168478A1, que divulga un ensayo para la detección simultánea de múltiples patógenos de las vías respiratorias, tales como SARS-CoV-2, virus de gripe A o B y /o virus sincitial respiratorio humano (VSR) A y/o B, mediante PCR. Para ello, el documento proporciona cebadores y sondas dirigidas, por una parte, a regiones de dichos virus, tales como el marco de lectura abierto 1 a/b (ORFla/b), la proteína espiga (S), y la proteína de nucleocápside (N); y por otra parte a controles que pueden ser exógenos, como el gen o secuencia de fago MS2, o endógenos, como el gen de la ARNasa P. Así mismo, el documento WO2021178534 proporciona un método para detectar el nuevo coronavirus (SARS-CoV-2 o C0VID19) basándose en la detección del gen de la nucleocápside (N), el gen de envoltura (E) y el gen ARNasa P como control.
Ahora bien, también se encuentran disponibles estuches o kits comerciales que se dirigen a la detección de uno o más genes de SARS-CoV-2, como el marco de lectura abierto 1 a/b (ORFla/b), ORFlb y la proteína no estructural 14 (ORFlb-nspl4), ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp), los genes de envoltura (E), espiga (S) o nucleocápside (N). Al igual que con los demás protocolos in house, la sensibilidad y especificidad clínica de los estuches comerciales en la población colombiana no es en todos los casos la reportada en otras poblaciones debido a la variabilidad genética en las secuencias del SARS-CoV- 2 que circulan en una región particular, por lo que persiste la necesidad de realizar una validación secundaria antes del uso masivo de un estuche comercial.
Adicionalmente, los kits comerciales no son fabricados nacionalmente, por lo que su disponibilidad puede verse reducida por la alta demanda global o demorada por los procesos de importación y, lo que a la vez puede aumentar considerablemente los costos y tiempos de procesamiento.
Por lo tanto, persiste la necesidad de desarrollar métodos y composiciones para la detección de SARS-CoV-2 que tengan una alta especificidad y sensibilidad para detectar las variantes del virus que circulan actualmente en Latinoamérica. Asimismo, persiste la necesidad de proporcionar métodos que permitan la detección del virus en pocos o un único paso, por ejemplo, en un solo tubo de reacción, de modo que puedan adaptarse de manera rápida y sencilla a las condiciones de todo tipo de laboratorios y permitan disminuir costos, tiempo de procesamiento y errores por manipulación de la muestra.
BREVE DESCRIPCIÓN La presente invención se refiere a métodos basados en la transcripción inversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa para la detección del virus del síndrome respiratorio agudo severo tipo 2 (SARS-CoV-2) causante de enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) en humanos, así como también a las composiciones y kits empleados para dichos métodos. En particular, los métodos, composiciones y kits de acuerdo con la invención son útiles para detectar personas infectadas con SARS-CoV-2, incluyendo, pero sin limitarse a, los linajes B; B.l; B.l.l; B. 1.1. 11; B. 1.4.20; B.1.6.21 Mu; B. 1.4.27; B.l.1.28; B.l.1.95; B.l.1.10; B. l.1.74; B. l.4.29; B.l.5.26; B.l.5.25; B.l. 1.29; B. l.4.39; B. l.1.186; P.1; P.2; C.37.
En modalidades particulares, los métodos, composiciones y kits de acuerdo con la invención son útiles para detectar personas infectadas por SARS-CoV-2 a partir de muestras biológicas derivadas del paciente, tales como esputo, lavado bronco alveolar, aspirado traqueal, aspirado endotraqueal, aspirado nasofaríngeo, hisopados nasofaríngeos, orofaríngeos o rectales, tejido de biopsia o autopsia (incluso de pulmón), y líquido cefalorraquídeo. En otras modalidades preferidas de la invención, los métodos, composiciones y kits permiten hacer seguimiento y monitorear la respuesta al tratamiento por COVID-19.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para detectar la presencia de SARS-CoV-2 en una muestra clínica humana, basado en la detección simultánea de los genes S y N, y un gen control. En otras modalidades, la invención proporciona un método para detectar la presencia de SARS-COV-2 en una muestra clínica humana, basado en la detección simultánea de los genes S y E, y un gen control. En una modalidad preferida, el gen control es ARNasa P humana.
En ciertas modalidades la invención proporciona kits para detectar la presencia de SARS- CoV-2 en una muestra clínica humana, que comprenden cebadores y sondas dirigidos a genes específicos de SARS-COV-2 y al menos un control humano; al menos una solución amortiguadora; una o más enzimas (polimerasa termoestable, transcriptasa reversa); y otros reactivos necesarios para llevar a cabo el análisis por RT-qPCR, tales como dNTPs (deoxinucleosidos trifosfato) y co factores enzimáticos (magnesio). En modalidades particulares, el kit comprende cebadores y sondas dirigidas a los genes Spk, N, E y ARNasa P. En modalidades preferidas, el kit incluye, además, instrucciones para su uso.
En ciertas modalidades la invención proporciona composiciones que comprenden oligonucleótidos útiles para detectar la presencia de SARS-CoV-2 en una muestra clínica humana por medio de pruebas moleculares, tales como PCR y RT-qPCR. Particularmente, la invención proporciona composiciones que comprenden cebadores y sondas dirigidas específicamente a genes de SARS-COV-2. Específicamente, la invención proporciona composiciones que comprenden parejas de cebadores directos y reversos, y sondas dirigidas a los genes Spk, E, N y ARNasa P humana, en donde dichos cebadores pueden encontrarse solos o en combinación.
DEFINICIONES
Como se usa en la presente solicitud, el término “oligonucleótidos” se refiere a polímeros formados por cadenas de igual o menos de 50 nucleótidos, que están formados a su vez por una molécula de azúcar (ribosa o desoxirribosa), unido a un grupo fosfato y a una base nitrogenada (que incluyen, pero no se limitan a, adenina (A), citosina (C), guanina (G) timina (T), uracilo (U)). En modalidades preferidas, los oligonucleótidos usados en la presente invención presentan una longitud de entre 10 a 30 nucleótidos. En modalidades aún más preferidas, los oligonucleótidos de la presente invención tienen una longitud de entre 14 a 25 nucleótidos. Los oligonucleótidos de la presente invención se identifican en la presente solicitud por medio del número que ocupan en el listado de secuencias adjunto a la solicitud (SEC ID NO: X). Deberá entenderse que el alcance de la presente invención cobija tanto las secuencias divulgadas como sus complementos reversos.
Como se usa en la presente solicitud, el término “RT-PCR” se refiere a la técnica molecular que combina la transcripción reversa (transcripción inversa o retrotranscripción o RT) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta técnica tiene como principal objetivo amplificar y cuantificar la cantidad de un ARN específico comprendido en una muestra, y comprende las etapas de obtención de ADN complementario a partir de un extracto de ARN (RT), y la amplificación de segmentos o regiones específicas de dicho ADN complementario por medio de ciclos de desnaturalización, hibridación y extensión o polimerización del ADN.
Tal como se usa en la presente invención, el término “qPCR” o “PCR en tiempo real” se refiere a la reacción en cadena de la polimerasa en la que se emplean fluoróforos para lograr la detección del fragmento amplificado.
Como se usa en la presente solicitud, el término “cebadores”, “iniciadores” o “primers” se refiere a oligonucleotides empleados a partir del cual se inicia un proceso de replicación de ADN. Particularmente, los cebadores de la presente invención son empleados en el proceso de RT-PCR. De manera preferida, los cebadores empleados en la presente invención son complementarios a una región particular de algunos genes específicos de SARS-COV-2 o a regiones específicas de genes humanos usados como control. De manera aún más preferida, los cebadores de la presente invención están dirigidos a los genes de nucleocápside (N), envoltura (E) y espiga (Spk) de SARS-COV- 2 y al gen de ARNasa P humana.
Como se usa en la presente solicitud, el término “cebador directo” o “forward primer” se refiere a un cebador que es complementario a, y se híbrida con, la secuencia de la hebra en dirección 3’—» 5’ del gen de interés. Por su parte, el término “cebador reverso” o “reverse primer” se refiere a un cebador que es complementario a, y se híbrida con, la secuencia de la hebra 5’— >3’ del gen de interés. Estos cebadores limitan el fragmento amplificado empleado para la detección, también conocido como “amplicón”.
Como se usa en la presente solicitud, el término “sondas” se refiere a oligonucleotides que se hibridan con una secuencia intema del amplicón, los cuales pueden comprender una etiqueta que facilite su detección. De manera preferida, las sondas empleadas comprenden un fluoróforo como etiqueta. En modalidades particulares, dichas sondas pueden también incluir una molécula bloqueadora o apagadora de fluorescencia (quencher). De manera preferida, el método de la presente invención proporciona una sonda específica para cada gen de interés. En modalidades aún más preferidas el bloqueador es BHQ1 o BHQ2. En modalidades preferidas, los fluoróforos incluidos en las sondas empleadas en los métodos, composiciones y kits de la invención se seleccionan de un grupo que incluye, pero no se limita a, 6-FAM, JOE, TET, HEX, VIC, TxRd (también llamado TexasRed o sulforodamina 101-X), ROX, Cianina 3, Cianina 5, Cianina 5.5, Quasar 670, Quasar 705, Alexa Fluor 568, CAL Fluor Red 610, BODIPY, ATTO 590a, CAL Fluor Red 635. En modalidades preferidas, los bloqueadores incluidos en las sondas empleadas en los métodos, composiciones y kits de la invención se seleccionan del grupo que incluye, pero no se limita a, Dabcyl, Carboxitetrametillrodamina (TAMRA), Black Hole Quencers (BHQ1 o BHQ2), BlackBerry Quencher 650, Eclipse® Dark Quencher, Deep Dark Quencher II. En particular, la selección de las etiquetas en las sondas del método de la invención se realizará de manera que permita la detección simultánea de distintos blancos, de modo que cada sonda tendrá sus propias características, por ejemplo, cada sonda empleada comprenderá un fluoróforo diferente. Deberá entenderse que la invención no se limita a las parejas fluoróforo/apagador ejemplificadas, sino que cubre todas las posibles combinaciones de las secuencias divulgadas que permitan una detección simultánea de los genes de interés.
Como se usa en la presente solicitud, el término “mezcla de reacción” o “composición de reacción” se refiere a la mezcla que comprende los reactivos necesarios para llevar a cabo la detección de acuerdo con el método de la invención. Así, de manera preferida, la mezcla de reacción incluye una solución amortiguadora (buffer), que incluye reactivos, como dNTPs (deoxinucleosidos trifosfato); cofactores enzimáticos, como magnesio; enzimas, como la transcriptasa reversa y la polimerasa; además, la mezcla de reacción incluye los cebadores directos y reversos, las sondas y la muestra a analizar.
Como se usa en la presente solicitud, el término “hibridación”, “anillado” o “apareamiento”, se refiere a la etapa de la PCR en la que se da la unión entre el cebador o la sonda y la región de ADN complementario de interés. Como se usa en la presente solicitud, el término “ciclo umbral” o “Ct” se refiere al número de ciclos requeridos para que la señal de fluorescencia cruce la línea base o aumente por encima del ruido de fondo o “background”. Este valor se relaciona con la cantidad inicial del ARN en la muestra inicial.
Como se usa en la presente solicitud, el término “muestra biológica” o “muestra clínica” se refiere a las muestras usadas para realizar el proceso de extracción de ARN. En modalidades preferidas de la invención, las muestras biológicas se seleccionan del grupo que consiste en muestras derivadas de esputo, lavado bronco alveolar, aspirado traqueal, aspirado endotraqueal, aspirado nasofaríngeo, hisopados nasofaríngeos, orofaríngeos o rectales, tejidos de biopsia o autopsia (incluso de pulmón), y líquido cefalorraquídeo. En modalidades particulares, la muestra biológica se deriva de muestras del tracto respiratorio. En modalidades aún más preferidas, la muestra biológica se deriva de un hisopado nasofaríngeo. En modalidades particulares de la invención, la muestra es una muestra biológica humana.
Como se usa en la presente solicitud, el término “sensibilidad analítica” se refiere al número de copias de un gen que es posible detectar con una confiabilidad del 95%.
Como se usa en la presente solicitud, el término “especificidad clínica” se refiere a la capacidad de definir la ausencia del virus en un individuo no infectado. Es la probabilidad de que para un sujeto no infectado se obtenga un resultado negativo de la prueba. En otras palabras, la especificidad da cuenta de la capacidad de la prueba para distinguir a los individuos que no están infectados.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La FIG. 1 muestra la sensibilidad analítica de la reacción RT-qPCR dúplex para el gen Spk y ARNasa P, empleando los cebadores y sonda dirigidas al gen Spk de la invención. La FIG. 1A muestra las curvas de amplificación obtenidas empleando 20, 10 o 5 copias genómicas de SARS-CoV 2 como ARN plantilla, mientras que la FIG. IB enseña las curvas de amplificación obtenidas con 5 y 2.5 copias/reacción. Se evidencia que, para este gen el límite de detección es de 5 copias/ reacción. La FIG. 2 muestra la sensibilidad analítica de la reacción RT-qPCR dúplex para el gen N y ARNasa P, empleando los cebadores y la sonda que reconocen el fragmento N2 de acuerdo con la invención. La FIG. 2A muestra las curvas de amplificación obtenidas empleando 100, 50, 20, 10 o 5 copias genómicas de SARS-CoV 2 como ARN plantilla mientras que en la FIG. 2B enseña las curvas de amplificación correspondientes a la mínima cantidad de plantilla utilizada (5 copias/reacción). Se evidencia que para este gen, el límite de detección es de 5 copias/reacción.
La FIG. 3 muestra la sensibilidad analítica de la reacción RT-qPCR dúplex para el gen E y ARNasa P, empleando los cebadores y la sonda de acuerdo con la invención. La FIG.3A muestra las curvas de amplificación obtenidas empleando 100, 50, 20, 10 o 5 copias genómicas de SARS-CoV 2 como ARN plantilla, mientras que la FIG.3B enseña las curvas de amplificación correspondiente a la mínima cantidad de plantilla utilizada (5 copias/reacción). Se evidencia que, para este gen, el límite de detección es de 10 copias/reacción.
La FIG. 4 muestra la sensibilidad analítica de la reacción RT-qPCR múltiplex para los genes Spk/N2/ARNasaP empelando el conjunto de cebadores y sondas de acuerdo con la invención. La FIG. 4A muestra las curvas de amplificación para el gen S obtenidas empleando 25, 10, 5 o 2,5 copias virales como ARN plantilla, mientras que la FIG. 4B enseña las curvas de amplificación para el gen N (fragmento N2) obtenidas con 25, 10, 5 y 2.5 copias/reacción. Se evidencia que, para este sistema, el límite de detección es de 5 copias/reacción.
La FIG. 5 muestra la sensibilidad analítica de la reacción RT-qPCR múltiplex para los genes Spk/E/ARNasa P empleando el conjunto de cebadores y sondas de acuerdo con la invención. La FIG. 5A muestra las curvas de amplificación para el gen S obtenidas empleando 20, 5 o 2,5 copias virales como ARN plantilla, mientras que la FIG. 5B enseña las curvas de amplificación para el gen E obtenidas con 20, 5 y 2.5 copias/reacción. Se evidencia que, para este sistema, el límite de detección es de 5 copias/reacción. La FIG. 6 corresponde al Alineamiento de secuencia de 20 genomas de SARS-COV-2 reportados en Latinoamérica, cada secuencia es representativa de cada uno de los linajes que ha circulado en la región desde el 2020 (linajes B; B.l; B.l.l; B. 1.1.11; B.1.4.20; B. 1.6.21 Mu; B. 1.4.27; B.1.1.28; B. 1.1.95; B.l. l.10; B.1.1.74; B.l.4.29; B. 1.5.26; B. 1.5.25; B. 1.1.29; B.1.4.39; B. l. l.186; P. l; P.2; C.37). La secuencia de cada oligonucleótido (sección resaltada en negro) se encuentra en la parte superior de cada alineamiento y cada punto indica identidad en las secuencias analizadas, en los casos en los que no existe identidad se identifica el nucleótido correspondiente.
La FIG. 7 muestra el resultado de la evaluación de la amplificación de los fragmentos empleados en el método de detección de SARS CoV 2 de acuerdo con la invención por electroforesis en gel de agarosa.
La FIG. 8 muestra los resultados de la evaluación de la especificidad del método de la invención en hisopados nasofaríngeos colectados entre 2013-2015 (Pre-covid). La FIG. 8A muestra los resultados las curvas de amplificación obtenidas mediante el método de detección de SARS-CoV2 de acuerdo con la invención, mientras que la FIG. 8B enseña las curvas de amplificación para la detección de V SR.
La FIG. 9 muestra la sensibilidad analítica de una reacción RT-qPCR múltiplex para los genes E/N/ARNasa P empleando el conjunto de cebadores y sondas de acuerdo con la invención. La FIG. 9A muestra las curvas de amplificación obtenidas empleando 50 copias virales como ARN plantilla, la FIG. 9B enseña las curvas de amplificación obtenidas con 25 copias/reacción, la FIG. 9C muestra las curvas de amplificación obtenidas con 10 copias/reacción y, finalmente, la FIG. 9D muestra las curvas de amplificación obtenidas con 5 copias/reacción. Se evidencia que, para este sistema, el límite de detección es de 5 copias/reacción.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
El método de la invención La presente invención hace referencia a un método para detectar la presencia del virus del síndrome respiratorio agudo severo asociado virus (SARS-CoV-2) en una muestra biológica por transcripción reversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) en tiempo real, a partir de conjuntos de cebadores y sondas que permiten la amplificación simultánea de dos genes virales y un gen humano de control en una misma reacción. El método permite realizar un diagnóstico in vitro de C0VID19 a partir de muestras biológicas humanas, preferiblemente muestras del tracto respiratorio humano como hisopados nasofaríngeos.
En una modalidad preferida, el método de acuerdo con la presente invención involucra la detección multiplex de los genes Spk, N y ARNasa P humana. En una modalidad aún más preferida la detección del gen N se dirige a la región N2 del mismo.
En otra modalidad preferida, el método de acuerdo con la presente invención involucra la detección multiplex de los genes Spk, E y ARNasa P humana.
El método de acuerdo con la invención comprende las etapas de: a) Purificación de ARN a partir de muestras frescas o congeladas; b) Preparación de una mezcla de reacción (15 pL) con una solución amortiguadora o buffer (contiene dNTPs, magnesio y las enzimas: transcriptasa reversa y polimerasa) y los cebadores y sondas que reconocen de manera específica los genes N y Spk de SARS-CoV-2 y la ARNasa P humana. c) Adición del ARN plantilla obtenida de la muestra biológica a analizar (5 pL) para un volumen final de reacción de 20 pL. d) Retro transcripción-Amplificación (RT-qPCR) con el siguiente ciclo térmico: di.- calentamiento a 55°C por 15 min d2.- calentamiento a 95°C por 3 min d3.- entre 40-42 Ciclos de amplificación, que incluyen el aumento de la temperatura a 95°C x 15 seg y posteriormente una disminución a 58°C por 45 seg, e) Verificación de la corrida, así:
Controles Negativos o sin plantilla: No tienen valor de Ct = N/A; Control Positivo Viral: Ct < 35;
Control Positivo ARNasa P humana: Ct <35; f) Interpretación de los resultados de cada una de las muestras como se muestra a continuación:
Tabla 1. Interpretación de resultados del método de acuerdo con la invención
Figure imgf000015_0001
En una modalidad preferida, el paso di del ciclo térmico de la etapa (d.) de retro transcripción y amplificación se realiza a 50°C. En otra modalidad, el paso di se lleva a 55°C. En realizaciones particulares, el paso d3 comprende 40 ciclos de amplificación. En otras realizaciones, el paso d3 comprende 42 ciclos de amplificación.
Cebadores y sondas
Tal como puede observarse en la Tabla 2, La invención comprende conjuntos de cebadores y sondas dirigidos al gen de la nucleocápside (N) y al gen de la espiga (Spk) de SARS-Cov-2, y al gen de la envoltura (E). Asimismo, la invención proporciona un conjunto de cebadores y sondas para detectar Ribonucleasa P humana (ARNasa P). Los blancos de detección, las secuencias de los cebadores y sondas y el protocolo in house del cual se derivan, se especifican en la Tabla 2.
Tabla 2. Características de los cebadores y sondas empleados en los métodos de la invención
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for Disease Control and Prevention. A CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-
Time RT-PCR Diagnostic Panel. Disponible en: https://www.fda.gov/media/ 134922/download
Ventajosamente, el método de la invención se basa en un conjunto de cebadores y sondas de diseño propio, dirigidos a la detección del gen Spk, los cuales permiten detectar los linajes circulantes en Latinoamérica. En particular, el método de la invención emplea los cebadores Sp F (SEQ ID No. 7) y/o Sp F3 (SEQ ID No. 8) y Sp-R (SEQ ID No. 9) para la detección de las variantes de SARS Cov 2 que presentan una deletion 69-70 en el gen S. En una primera modalidad preferida el método de la presente invención detecta de manera simultánea los genes S, N y ARNasa P. En una modalidad alternativa el método de la presente invención detecta de manera simultánea los genes S, E y ARNasa P.
Kits En un segundo aspecto, la presente invención hace referencia a un kit para detectar la presencia del virus del síndrome respiratorio agudo severo asociado virus (SARS-CoV- 2) en una muestra biológica por transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR), a partir de conjuntos de cebadores y sondas que permiten la amplificación simultánea de dos genes virales y un gen humano de control en una misma reacción. De esta forma, la invención proporciona kits que permiten realizar un diagnóstico in vitro de C0VID19 a partir de muestras biológicas humanas, preferiblemente muestras del tracto respiratorio humano obtenidas a partir de hisopados nasofaríngeos.
Particularmente, el kit de acuerdo con la invención comprende composiciones que incluyen los cebadores y sondas identificadas en las secuencias de la Tabla 2, ya sea solos o en combinación, y, opcionalmente, otras composiciones que comprendan los necesarios para llevar a cabo la detección por medio de RT-qPCR.
EJEMPLOS
Debe entenderse que los ejemplos y realizaciones descritos en este documento son solo para propósitos ilustrativos, y que diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán sugestivos para los expertos en la técnica y deben incluirse dentro del espíritu y alcance de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones adjuntas a la misma. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas se incorporan aquí como referencia en su totalidad para todos los propósitos. Salvo que se indique lo contrario, ha de entenderse que las técnicas de biología molecular empleadas en los ejemplos aquí descritos se llevan a cabo según los protocolos estándar.
Todos los métodos o procedimientos descritos a continuación se dan a modo de ejemplo y corresponden a una elección, hecha entre los diversos métodos disponibles, para lograr el mismo resultado. Esta elección no tiene ningún efecto sobre la calidad del resultado y, en consecuencia, los expertos en la técnica pueden utilizar cualquier método apropiado para lograr el mismo resultado.
A. Selección de cebadores y sondas
Con el fin de desarrollar un método que permita la detección de las variantes SARS-CoV- 2 que circulan localmente, se analizó la sensibilidad y la especificidad clínica de 3 estuches comerciales disponibles en el mercado colombiano, que permiten la detección simultánea de múltiples genes virales: Allplex™ 2019-nCoV Assay del fabricante Seegene Inc. (Seúl, República de Corea), MolecuTech Real -Time COVID-19® Test del fabricante YD Diagnostics (República de Corea) y Novel Coronavirus (2019-nCoV) RT- PCR Kit del fabricante Dynamiker Biotechnology (Tianjin, China). Para ello se emplearon cerca de 230 muestras de hisopados nasofaríngeos colectados entre mayo a agosto de 2020. De estas 10 procedían de Cali, 165 de diferentes municipios de Cundinamarca; 35 de Bogotá y 20 de Villavicencio.
Igualmente, se analizó el desempeño de los protocolos in house inicialmente desarrollados, es decir, el propuesto por el Instituto Pasteur-OMS y el del CDC de los EE. UU, tomando al protocolo Berlín (dirigido a la detección del gen E) como el Gold estándar, debido a que este fue el protocolo adoptado por el Instituto Nacional de Salud de Colombia. El fragmento correspondiente al gen RdRp descrito por Coman et al. (Coman, V.M, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, D.K.W., Bleicker, T., Brünick, S., Schneider, J., Schmidt, M.L., Mulders, D.G.J.C., Haagmans, B.L., Van der Veer, B., Van den Brink, S., Wijsman, L., Goderski, G., Romette, J.L., Ellis, J., Zambón, M., Peiris, M., Goossens, H., Reusken, C., Koopmans, M.P.G., & Drosten, C. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Europe's Journal of Infectious Disease Surveillance, Epidemiology, Prevention and Control, Volumen 25, número 3, páginas 1-8, Enero 2020), no se evaluó en este estudio, ya que se ha reportado su baja sensibilidad en muestras colombianas, es decir, una baja capacidad de detectar muestras positivas para SARS CoV2, por varios laboratorios, incluido el de los inventores.
De esta manera, el conjunto de 230 muestras de hisopados nasofaríngeos colectadas en un periodo aproximado de 4 meses se sometieron a extracción de ARN con el estuche de extracción Inviso rb Spin Virus RNA Mini Kit (Stratec). A partir de este material genético se llevó a cabo la detección de SARS-CoV-2 con cada uno de los sistemas a evaluar, siguiendo el protocolo recomendado por cada fabricante. Una vez teminada la reacción de amplificación, se validó cada corrida de acuerdo con las instrucciones especificadas en cada referencia, se analizó el resultado de cada muestra y se tabularon los datos como: positivo, negativo o indeteminado (aquellas muestras donde no hubo detección de ARNasa P, ni de genes virales).
Para calcular la sensibilidad y especificidad clínica se construyeron tablas 2x2 de la siguiente manera:
Figure imgf000019_0001
En donde: VP=Verdaderos positivos, FP=Falsos positivos, FN= Falsos negativos, y VN= Verdaderos negativos.
Posteriormente, los datos fueron procesados de acuerdo con las siguientes fórmulas:
Figure imgf000020_0001
Los blancos de detección de los protocolos in house y de los estuches comerciales, así como sus correspondientes resultados de sensibilidad y especificidad se muestran a continuación.
Tabla 3. Desempeño de las pruebas comerciales y los protocolos in house
Figure imgf000020_0002
protocolo de Berlín; la detección de los fragmentos IP2/IP4 es la particularidad del protocolo WHO-IP, razón por la cual sólo se llevó a cabo la reacción con estos dos fragmentos.
**Con este sistema no se logró definir el resultado como negativo (muestras indeterminadas) en un número considerable de muestras.
Los resultados mostraron un buen desempeño para la detección de SARS-CoV2 (sensibilidad y especificidad mayor al 85%) con los protocolos CDC-EE.UU. y OMS-IP, los cuales detectan los genes RdRp y N, así como con el sistema comercial Dynamiker Biotech, el cual detecta N y ORFlab. Por su parte, los sistemas MolecuTech y Allplex™ mostraron resultados poco favorables, una especificidad por debajo del 80%, y una baja capacidad de distinguir las muestras negativas. Además, también se observó que la detección de los fragmentos N1/N2 e IP2/IP4, podría identificar más casos de infección con SARS-CoV-2 que el protocolo tomado como Gold Estándar que detecta sólo el gen E.
B. Pruebas de sensibilidad analítica para cada uno de los blancos de detección descritos en los protocolos in house
Se determinó la sensibilidad analítica para cada uno de los blancos de detección para SARS-CoV-2 reportados en los protocolos in house y del fragmento Spk, que reconoce una región del gen de espiga, en reacciones dúplex. En un ensayo de PCR, la sensibilidad analítica se define como el mínimo número de copias de un gen que es posible detectar con una confiabilidad del 95%. Los resultados de estos experimentos permitieron definir los blancos de detección que presentan un mejor comportamiento y que podrían ser incluidos en un ensayo de detección multiplex.
Para el análisis se llevó a cabo una reacción de amplificación con diluciones seriadas del estándar comercial EDX SARS-CoV-2 (Exact Diagnostics Catalog Number: COV019) y el conjunto de cebadores y sondas específicas para cada blanco de detección y para el control de ARNasa P de origen humano. Se utilizaron concentraciones conocidas de 5, 10 y 20 copias genómicas por reacción (cg/rx) y se realizaron al menos 2 montajes independientes, cada uno con 6 réplicas. El valor promedio obtenido para 12 réplicas se muestra en la Tabla 4. Para el gen E y el fragmento N 1 no se obtuvo resultado positivo en todas las 12 réplicas al utilizar como plantilla 5 cg/rx, mientras que para los demás blancos virales sí, lo cual confirmó la necesidad de introducir otro blanco de detección viral para aumentar la sensibilidad de la detección.
Tabla 4. Sensibilidad analítica de cada blanco de detección de las pruebas in house
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En el formato dúplex, es decir, en donde se da la detección de un gen viral y ARNasa P simultáneamente, la sensibilidad analítica para el gen E fue de 10 copias/reacción (c/rx); aunque en la publicación de Corman y colaboradores se reportó 3,8 copias/reacción 1 (Coman et al., 2020). Para el fragmento N2 la sensibilidad analítica fue de 5 c/rx, para el fragmento IP4 fue de 10c/rx y para el gen Spk fue de 5 c/rx.
A partir de estos ensayos, se pudo establecer que los fragmentos Spk y N2 presentan una mejor sensibilidad, es decir, permiten detectar menos copias de SARS-CoV-2 en una reacción de amplificación, ya que fueron detectados de forma reiterada en reacciones que contienen 5 copias virales, con valor CT promedio de 35,9 y 37,9 respectivamente.
C. Evaluación in silico de los cebadores y sondas seleccionados para reconocer las variantes de SARS-COV-2 circulantes en la región
Se descargaron las 20 secuencias de genomas colombianos reportados en la base de datos de GISAID (https://www.gisaid.org/), cada secuencia representa uno de los linajes circulantes en el país desde el año 2020 hasta junio de 2021. Se realizó un alineamiento múltiple de secuencias utilizando el programa MEGA 6 y se compararon con cada set de sondas y cebadores utilizados para la detección de los fragmentos E, N2 y Spk. Los resultados mostraron que los todos los cebadores y sondas presentan una alta identidad con los linajes reportados en Colombia y otros países de Latinoamérica, y por tanto es posible utilizarlos en un sistema de detección por RT-qPCR para SARS-CoV-2. Sólo se encontraron pequeñas discrepancias o “mismatch” con 4 de los linajes analizados, no obstante, estos cambios no afectarían la unión del primer a su secuencia blanco (FIG. 6).
D. Evaluación de los productos de amplificación por electroforesis horizontal.
Para verificar que la señal de amplificación obtenida en la reacción de RT-qPCR correspondiera con los productos esperados para cada blanco de amplificación, los productos obtenidos en una reacción monoplex (E, Spk o N2); dúplex (E+Spk o N2+Spk) y triplex (los dos blancos virales junto con ARNasa P) se evaluaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2.5%. En la figura 7 se puede observar las bandas correspondientes a los fragmentos: E con un tamaño de 115 pb, Spk de 107 pb; N2 de 70 pb y el fragmento correspondiente a la ARNasaP de 64pb. Por la cercanía entre los amplicones de E y SpK no se observan las tres bandas en la reacción E+Spk+RP y por la cercanía entre los amplicones de N2 y RP no se observan las tres bandas en la reacción N2+Spk+RP.
E. Pruebas de sensibilidad analítica en formato multiplex
Una vez se seleccionaron los blancos virales que se podían incluir en el formato múltiplex, se procedió a evaluar el desempeño de cada sistema (combinación de 2 genes virales y ARNasaP). El LoD6 (Límite de detección 6) se determinó realizando la reacción de amplificación con diluciones seriadas del estándar comercial EDX SARS-CoV-2 (Exact Diagnostics). Se utilizaron 2,5; 5 y 10 copias genómicas por reacción de amplificación y se realizaron al menos 3 montajes independientes cada uno con 6 réplicas, bajo condiciones reproducibles; con lo cual se obtuvo un total de 18 resultados por cada dilución. El LoD6 corresponde a la última dilución donde 18 réplicas muestran amplificación positiva y específica (Shehata, H.R., Ragupathy, S., Shanmughanandhan, D., Kesanakurti, P., Ehlinger, T.M., Newmaster, S.G. Guidelines for Validation of Qualitative Real-Time PCR Methods for Molecular Diagnostic Identification of Probiotics. Journal of AOAC, Volumen 102, Número 6, Páginas 1774-1778, Noviembre 2019).
E.l Límite de detección de la reacción Multiplex: E/Spk/ARNasa P
Teniendo en cuenta que el fragmento Spk fúe el que demostró mayor sensibilidad en el ensayo dúplex (Tabla 4), y que el fragmento E, al ser el blanco de detección implementado por el INS, fúe el sistema adoptado por la mayoría de los laboratorios habilitados para el diagnóstico de SARS CoV2 en Colombia, se seleccionó la combinación E-Spk. Los resultados del ensayo multiplex se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. Límite de detección de la reacción Multiplex: E/Spk/ARNasa P
Figure imgf000024_0001
El L0D6 en esta reacción fue de 5 cg/rx para el fragmento Spk y 10 cg/rx para el gen E.
Los resultados de la amplificación en formato multiplex permitieron establecer que hay una “ganancia” en sensibilidad al introducir el gen S, dado que sólo con la detección del gen E no se logra la detección de muestras que tengan una carga viral menor a 10 copias. Estos resultados permitieron concluir que, con el sistema Spk/E/ARNasa P, es posible detectar los genes S y E del SARS-CoV-2 y la RNAsa P de origen humano simultáneamente, sin perder la sensibilidad obtenida en el ensayo dúplex.
E.2 Límite de detección de la reacción Multiplex: N2/Spk/ARNasa P
Dado que los fragmentos N2-Spk demostraron tener mejor sensibilidad en el ensayo dúplex (Tabla 4). Los resultados del ensayo multiplex se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6. Límite de detección de la reacción Multiplex: N2/Spk/ARNasa P
Figure imgf000024_0002
El LoD6 en esta reacción fúe de 5 cg/rx para el fragmento Spk y 10 cg/rx para el fragmento N2. Los resultados de la amplificación en formato multiplex permitieron establecer que el introducir la detección del fragmento Spk de acuerdo con la invención, conlleva a una ganancia de sensibilidad, dado que, por medio de la detección del fragmento E o N2, no es posible detectar el virus en las muestras que tengan una carga viral menor a 10 copias únicamente. Los resultados también permitieron concluir que con el sistema triplex es posible detectar los dos genes del SARS-CoV-2 y la ARNasaP de origen humano simultáneamente, sin perder la sensibilidad obtenida en el ensayo dúplex.
E.3 Límite de detección de la reacción Multiplex: E/N2/ARNasa P
De otro lado, se evaluó el desempeño del sistema múltiplex en el que se incluye el gen E y el fragmento N2 junto a la ARNasa P humana. A continuación, se reportan los datos obtenidos con el sistema Multiplex E/N/ARNasa P (FIG. 9 y Tabla 7).
Tabla 7. Límite de detección de la reacción Multiplex: E/N2/ARNasa P
Figure imgf000025_0001
En el formato multiplex E/N/RNasaP, la sensibilidad analítica de la reacción fue de 5 copias/reacción para el gen N y 10 copias/reacción para el gen E.
Los resultados de la amplificación en formato multiplex permitieron establecer que hay una “ganancia” en sensibilidad al introducir el gen N, dado que sólo con la detección del gen E no se logra la detección de muestras que tengan una carga viral menor a 10 copias. Estos resultados permitieron concluir que con el sistema E/N/ARNasa P es posible detectar los genes E y N del SARS-CoV-2 y la ARNAsa P de origen humano simultáneamente, sin perder la sensibilidad obtenida en el ensayo dúplex.
Ejemplo 1. Evaluación de la sensibilidad y especificidad clínica del sistema multiplex N2/Spk/ ARNasa P en comparación con estuche comercial ViroQ
El desempeño del sistema multiplex de acuerdo con la invención (que emplea preferiblemente la combinación de cebadores y sondas de acuerdo con las secuencias SEQ ID NO: 1 a 6 y 8 a 10), fúe evaluado con 120 muestras clínicas, que previamente habían sido analizadas con el sistema ViroQ SARS-CoV2 (BAG Diagnostics). Este sistema utiliza ARN como material de partida, el ARN específico del virus es transcrito a ADN copia en una reacción de retrotranscripción a 48°C y luego amplificado en una reacción de PCR en tiempo real. El sistema tiene como blancos de detección el gen RdRp (FAM) y el gen E (HEX), además permite la amplificación de la ARNasaP como control (ROX).
Se evaluaron 120 RNAs provenientes de hisopados nasofaríngeos, el panel incluyó 20 muestras negativas y 100 positivas colectadas de enero a mayo de 2021 en la ciudad de Pasto por Laboratorios del Valle. Para calcular la sensibilidad y especificidad clínica se construyeron tablas 2x2, como se describió anteriormente, tomando como resultado de referencia el obtenido con estuche comercial ViroQ SARS-CoV2 (BAG Diagnostics); los resultados se presentan en la Tabla 8.
Tabla 8. Sensibilidad y especificidad clínica del sistema triplex Spk/N2/ARNasa P, tomando el sistema ViroQ como método de referencia.
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Los resultados obtenidos demuestran que el sistema implementado presenta un desempeño similar a la de un kit comercial pues cuenta con la capacidad de discriminar los casos verdaderos positivos y los casos verdaderos negativos. Es decir, mediante la presente invención es posible establecer la presencia del virus en un individuo infectado y la ausencia del virus en un individuo no infectado con la misma probabilidad de acierto que el estuche comercial ViroQ.
Ejemplo 2. Evaluación de la sensibilidad y especificidad clínica del sistema multiplex N2/Spk/ ARNasaP en comparación con estuche comercial Capital® El desempeño del sistema multiplex Spk/N/ARNasaP, fue evaluado con 150 muestras clínicas, que previamente habían sido analizadas con el sistema Capital de Biotechrabbit en el equipo Quantstudio (Applied Biosystem). El ARN específico del virus es transcrito a ADN copia en una reacción de retro transcripción a 50°C y luego amplificado en una reacción de PCR en tiempo real. El sistema tiene como blancos de detección el gen RdRp; el gen E y la ARNasaP como control.
Se evaluaron 150 RNAs provenientes de hisopados nasofaríngeos, el panel incluyó 45 muestras negativas y 105 positivas colectadas de abril a mayo de 2021 en la ciudad de Neiva por la Secretaria de Salud. Para calcular la sensibilidad y especificidad clínica se construyeron tablas 2x2, como se describió anteriormente, tomando como resultado de referencia el obtenido con estuche CAPITAL (Biotechrabbit); los resultados se presentan en la Tabla 9.
Tabla 9. Sensibilidad y especificidad clínica del sistema triplex Spk/N2/ARNasaP, tomando el sistema CAPITAL (Biotechrabbit) como referencia
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Los resultados obtenidos demuestran que el sistema implementado presenta una sensibilidad y especificidad del 100%, es decir, permite establecer la presencia del virus en un individuo infectado y la ausencia del virus en un individuo no infectado con la misma probabilidad de acierto que el estuche comercial Capital.
Ejemplo 3. Evaluación de la especificidad clínica del sistema multiplex N2/Spk/ ARNasa P
Para la evaluación de la especificidad clínica del sistema se utilizaron 25 muestras de hisopados nasofaríngeos colectados durante 2013-2015, algunas de las cuales presentaron Virus Sincitial Respiratorio (VSR) confirmado por PCR convencional. Para este ensayo, las muestras se corrieron simultáneamente utilizando dos diferentes mezclas de reacción; una para la detección SARS-CoV-2 con el sistema triplex N2/Spk/ARNasa P de la invención, y otra para evaluar VSR. Tal como puede observarse en la Tabla 10, en ninguna de las muestras analizadas hubo detección de los fragmentos N2 o Spk, mientras que todas tuvieron señal de amplificación para ARNasaP; lo cual indica que el sistema presenta una buena especificidad, o capacidad de distinguir los verdaderos negativos (FIG. 8).
Tabla 10. Detección de VSR en hisopados nasofaríngeos colectados entre 2013-2015.
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Ejemplo 4. Comparación del sistema N2/Spk/ARNasa P con dos estuches comerciales disponibles en Colombia
Se evaluó la sensibilidad analítica del sistema triplex y de los estuches comerciales U- TOP (Seasun) y Dynamiker (Biosciences); las mezclas de reacción se prepararon de acuerdo a las especificaciones de cada fabricante y la reacción de amplificación se llevó a cabo con 25, 10, 5 y 2,5 copias virales del estándar comercial EDX SARS-CoV-2.
El kit de detección de COVID-19 U-TOP™ utiliza sondas dirigidas contra una región ORFlab y una región en el gen N del genoma del SARS-CoV-2. Las sondas de detección para dos amplicones están marcadas con FAM y HEX, respectivamente. Además, un incluye un control interno de amplificación marcado con Texas Red, que indica si la reacción de amplificación se llevó a cabo de forma adecuada. Se determina que una muestra es positiva para el SARS-CoV-2 si el valor ct de uno o ambos canales de fluorescencia es < 38.
El kit de detección de Dynamiker utiliza sondas de detección para una región de Orflab etiquetadas con FAM y otra para N etiquetada con HEX, además de una sonda contra el gen de actina de origen humano marcada con CY 5 que indica si el procesamiento de la muestra, incluida toma, extracción y amplificación se llevó a cabo de forma adecuada. Se determina que una muestra es positiva para el SARS-CoV-2 si el valor ct de uno o ambos canales de fluorescencia es < 37.
Tabla 11. Sensibilidad Analítica de dos estuches comerciales y el sistema N2/Spk/ARNasa P
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Tabla 11. (continúa)Sensibilidad Analítica de dos estuches comerciales y el sistema N2/Spk/ARNasa P
Figure imgf000032_0001
El método de detección multiplex de N2/Spk/ARNasaP de la invención presentó un mejor desempeño en comparación con los kits comerciales, al ser capaz de detectar hasta 5 copias virales de SARS-CoV-2 por reacción, mientras que los dos estuches comerciales detectan 10 copias virales por reacción.
Ejemplo 5. Evaluación de la sensibilidad y especificidad clínica del sistema multiplex E/N2/ARNasa P
Para evaluar el desempeño de este sistema, un conjunto de 155 muestras de hisopados nasofaríngeos colectadas entre el 16 y el 30 de noviembre de 2021 se sometieron a extracción de ARN con el sistema automatizado Nextractor® NX-48S (Genolution). A partir de este material genético se llevó a cabo la detección de SARS CoV 2 con el estuche comercial GeneFinder COVID-19 Plus Real Amp RT-PCR, siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante, y con el sistema multiplex E/N/ARNasaP. Una vez terminada la reacción de amplificación, se validó cada corrida, se analizó el resultado de cada muestra y se tabularon los datos como: positivo, negativo o indeterminado (aquellas muestras donde no hubo detección de ARNasa P, ni de genes virales).
Para calcular la sensibilidad y especificidad clínica se construyeron tablas 2x2, como se describió anteriormente, tomando como resultado de referencia el obtenido con el sistema Gene Finder. El panel incluyó 79 muestras negativas y 76 positivas; los resultados se presentan en la Tabla 12.
Tabla 12. Sensibilidad y especificidad clínica del sistema triplex E/N/ ARNasa P usando al kit comercial GenFinder como método de referencia
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Los resultados obtenidos demuestran que el sistema implementado presenta una capacidad de discriminar los verdaderos positivos y los verdaderos negativos, similar a la de un kit comercial. Es decir, permiten establecer la presencia del virus en un individuo infectado y la ausencia del virus en un individuo no infectado.
Ejemplo 6. Evaluación de la repetibilidad y reproducibilidad del sistema multiplex N2/Spk/ARNasaP
Entendiendo la repetibilidad del sistema de detección como la coincidencia de los resultados obtenidos (Cq) por un mismo analista con el mismo equipo (CFX96 BioRad), con un mismo lote de reactivos; y la reproducibilidad como la coincidencia de los resultados obtenidos utilizando diferentes lotes de reactivos, se prepararon 4 sets (conjuntos) de primers y sondas que se denominaron P&P. Cada set contiene 6 primers y 3 sondas para la detección de Spike Spk (FAM); Nucleocápside N (texas Red) y ARNasa P RP (Hex) en concentración 4X. Cada set se probó en la reacción de RT-qPCR con 10 réplicas, utilizando como plantilla un estándar comercial SARS-CoV-2 de 50 copias virales/pL (250 copias/reacción). Para la amplificación se siguió el programa de temperaturas y tiempos previamente establecido. Los valores de Cq obtenidos para los tres blancos de amplificación para cada una de las réplicas, así como los valores de desviación estándar calculados para determinar la variabilidad intra-lote (repetibilidad) e ínter-lotes (reproducibilidad) se presentan en la Tabla 13.
La evaluación de cada lote de forma independiente mostró que el sistema de detección permite obtener resultados repetibles o repetitivos al ser utilizado por un analista calificado. No se encontraron diferencias significativas entre las 10 réplicas realizadas.
La evaluación de cada lote de forma independiente mostró que el sistema de detección permite obtener resultados repetibles o repetitivos al ser utilizado por un analista calificado; no se encontraron diferencias significativas entre los valores de Cq obtenidas con los diferentes lotes analizados.
Tabla 13. Análisis de la repetibilidad y reproducibilidad del sistema de detección
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Ejemplo 7. Análisis de estabilidad a la temperatura de almacenamiento (- 0°C) Se prepararon 4 lotes o sets de primers y sondas (P&P), cada una de las cuales se separó en alícuotas en tubos ámbar y se almacenó a -20°C durante 7, 15,21,28,35 y 60 días. Cada día de medición, se llevó a cabo la reacción de RT-qPCR (10 réplicas por lote) con 250 copias de SARS-CoV-2 por reacción.
Los valores promedio de Cq obtenidos para los tres blancos de detección: Nucleocápside (N), Spike (Spk) y ARNasa P (RP), se consignaron en la Tabla 14.
Los valores de desviación estándar y error relativo obtenidos al evaluar cada lote de manera independiente permiten establecer que el conjunto de primers y sondas es estable, no se descompone o disminuye su actividad por el almacenamiento a -20°C.
Tabla 14 Análisis de la Estabilidad a -20°C
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VENTAJAS Y BENEFICIOS DE LA PRESENTE INVENCIÓN
En primer lugar, es importante señalar que los protocolos in house en los que se basó la presente invención, detectan un único blanco viral por reacción (single reaction o formato monoplex), mientras que en el método desarrollado se detectan en una misma reacción 2 blancos virales en genes diferentes (gen N y gen S, o gen S y gen E) en conjunto con un blanco humano (ARNasa P), lo cual disminuye los tiempos y costos de procesamiento de las muestras. Por ejemplo, el valor por prueba de un estuche comercial oscila entre los 10 a 14 USD, mientras que el costo por prueba del método de la invención estaría alrededor de 4 USD. Esta diferencia es significativa si se tiene en cuenta que un laboratorio de diagnóstico corre entre 200 a 300 pruebas por día.
Por otra parte, el método de la invención se dirige ventajosamente a detectar el gen Spk mediante un conjunto de cebadores y sondas que demostraron una sensibilidad analítica mejorada en comparación con los estuches comerciales disponibles en Colombia.
De manera similar, el método tiene una especificidad igual que el protocolo implementado por el Instituto Nacional de Salud de Colombia (Protocolo Berlín) y una sensibilidad superior, dado que se utilizan dos blancos de detección y no uno.
Asimismo, el método de la presente invención está específicamente orientado a la detección de las personas infectadas con SARS-CoV-2 de linajes de circulación regional en América Latina, específicamente los linajes B; B.l; B.l.l; B.1.1.11; B.1.4.20; B. 1.6.21 Mu; B.l.4.27; B.l. 1.28; B.l. 1.95; B. l. 1.10; B.l. 1.74; B. l.4.29; B.l.5.26; B.l.5.25; B. l.1.29; B.l.4.39; B. l.l. 186; P.l; P.2; C.37.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro para detectar la presencia de SARS-CoV-2 en una muestra clínica humana, caracterizado porque dicho método comprende:
(a) purificar ARN a partir de la muestra clínica,
(b) incubar dicho ARN purificado con una mezcla de reacción que comprende una transcriptasa inversa, una ADN polimerasa, y
(i) un par de cebadores que hibridan en el gen de la nucleocápside (N) de SARS-CoV-2; en donde uno de los cebadores comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1; otro de los cebadores comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, o las secuencias complementarias de los mismos, o un par de cebadores que hibridan en el gen de la envoltura (£) de SARS-CoV-2; en donde uno de los cebadores comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 11; otro de los cebadores comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 12, o las secuencias complementarias de los mismos;
(ii) un par de cebadores que hibridan en el gen espiga (.S') de SARS- CoV-2; en donde uno de los cebadores comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 7 y/o SEQ ID NO: 8, otro de los cebadores comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 9; o la secuencia complementaria de los mismos
(iii) un par de cebadores que hibridan en el gen de la ARNasa P humana; en donde uno de los cebadores comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 4; otro de los cebadores comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO: 5; o la secuencia complementaria de los mismos en donde la incubación se lleva a cabo bajo condiciones de tiempo y temperatura que permiten obtener un amplicón para cada pareja de cebadores;
(c) detectar la amplificación de cada fragmento de interés;
(d) determinar la presencia de SARS-CoV-2 en dicha muestra clínica humana a partir de los productos de amplificación.
2. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque la mezcla de reacción además comprende al menos un oligonucleótido marcado con un fluoróforo (sonda) que híbrida en el producto de amplificación de los cebadores SEQ ID NO: 1 y 2, o SEQ ID NO: 11 y 12, SEQ ID NO: 4 y 5, y /o SEQ ID NO: 7 u 8 y 9, y en donde la amplificación se detecta mediante la señal de fluorescencia emitida a medida que avanza la reacción.
3. El método de acuerdo con la Reivindicación 3, caracterizado porque la fluorescencia de cada sonda se detecta de manera simultánea.
4. El método de acuerdo con cualquier de las Reivindicaciones 2 o 3, caracterizado porque la sonda marcada con fluorescencia que híbrida en el producto de amplificación de la pareja de cebadores SEQ ID NO: 1 y 2 comprende la SEQ ID NO: 3.
5. El método de acuerdo con cualquier de las Reivindicaciones 2 o 3, caracterizado porque la sonda marcada con fluorescencia que híbrida en el producto de amplificación de la pareja de cebadores de la SEQ ID NO: 7 u 8 y 9 comprende la SEQ ID NO: 10.
6. El método de acuerdo con cualquier de las Reivindicaciones 2 o 3, caracterizado porque la sonda marcada con fluorescencia que híbrida en el producto de amplificación de la pareja de cebadores de la SEQ ID NO: 4 y 5 comprende la SEQ ID NO: 6.
7. El método de acuerdo con cualquier de las Reivindicaciones 2 o 3, caracterizado porque la sonda marcada con fluorescencia que híbrida en el producto de amplificación de la pareja de cebadores de la SEQ ID NO: 11 y 12 comprende la SEQ ID NO: 13.
8. El método de acuerdo con las Reivindicaciones 2 a 7, caracterizado porque la sonda comprende además un bloqueador de la fluorescencia.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la amplificación se lleva a cabo por PCR o qPCR.
10. Un conjunto de oligonucleótidos para detectar la presencia de SARS-CoV-2 en una muestra clínica humana, caracterizado porque comprende:
(i) un par de cebadores que hibridan en el gen la nucleocápside (N) de SARS- CoV-2 que comprenden una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 y una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, o la secuencia complementaria de los mismos o un par de cebadores que hibridan en el gen la envoltura (E) de SARS-CoV-2 que comprenden una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 11 y una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 12, o la secuencia complementaria de los mismos y
(ii) un par de cebadores que hibridan en el gen de la espiga (.S') de SARS-CoV- 2 que comprenden una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 7 y /o SEQ ID NO: 8 y una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9, o la secuencia complementaria de los mismos.
(iii) un par de oligonucleótidos cebadores que hibridan en el gen de la ARNasa P humana que comprenden una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 4 y una secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO: 5 para el cebador reverso, o la secuencia complementaria de los mismos.
11. El conjunto de oligonucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 10, caracterizado porque además comprende al menos una sonda marcada con un fluoróforo que híbrida en el producto de amplificación de las parejas de cebadores de las SEQ ID NO: 1 y 2, SEQ ID NO: 7 u 8 y 9, SEQ ID NO: 4 y 5 o SEQ ID NO: 11 y 12.
12. El conjunto de oligonucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 11, caracterizado porque la sonda marcada con fluorescencia que híbrida en el producto de amplificación de la pareja de cebadores de la SEQ ID NO: 1 y 2 comprende la SEQ ID NO: 3, o el complemento reverso del mismo.
13. El conjunto de oligonucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 11, caracterizado porque la sonda marcada con fluorescencia que híbrida en el producto de amplificación de la pareja de cebadores de la SEQ ID NO: 7 u 8 y 9 comprende la SEQ ID NO: 10, o el complemento reverso del mismo.
14. El conjunto de oligonucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 11, caracterizado porque la sonda marcada con fluorescencia que híbrida en el producto de amplificación de la pareja de cebadores de la SEQ ID NO: 4 y 5 comprende la SEQ ID NO: 6, o el complemento reverso del mismo.
15. Un kit para detectar la presencia de SARS-CoV-2 en una muestra clínica humana, caracterizado porque comprende el conjunto de oligonucleótidos de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 10 a 14.
16. Una composición que comprende un conjunto de oligonucleótidos de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 10 a 14.
17. Un kit para detectar la presencia del virus del síndrome respiratorio agudo severo asociado virus (SARS-CoV-2) en una muestra biológica por transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) cuantitativa en tiempo real, que comprende una composición de acuerdo con la Reivindicación 16.
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