WO2023140487A1 - 프로바이오틱스 유래 배양여과물을 포함하는 항노화 화장료 조성물 - Google Patents

프로바이오틱스 유래 배양여과물을 포함하는 항노화 화장료 조성물 Download PDF

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WO2023140487A1
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cosmetic composition
strain
culture filtrate
cms
probiotics
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PCT/KR2022/018827
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정명준
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주식회사 쎌바이오텍
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Definitions

  • the present invention relates to an anti-aging cosmetic composition, and more particularly, to an anti-aging cosmetic composition comprising a culture filtrate derived from probiotics.
  • Keratinocytes and melanocytes are the main cells located in the epidermis and play a pivotal role in protecting against environmental factors including ultraviolet (UV) light. It is known that melanin pigment is produced by intercellular interaction between keratinocytes and melanocytes and acts as a filter for natural sunscreen. However, when excessively irradiated with ultraviolet rays, pigment synthesis proceeds abnormally, and it is known to cause various hyperpigmentation-related skin disorders such as melasma, age spots, and freckles.
  • Epidermal melanin synthesis is regulated by several molecular signaling pathways, such as stem cell factor (SCF) and its receptor KIT, and alpha-melanocyte stimulating hormone ( ⁇ -MSH) and its receptor, the melanocyte-specific melanocortin-1 receptor (MC1R) pathway.
  • SCF stem cell factor
  • ⁇ -MSH alpha-melanocyte stimulating hormone
  • M1R melanocyte-specific melanocortin-1 receptor
  • the ⁇ -MSH/MC1R pathway is a well-known mechanism for UV-induced melanin production in melanocytes, and activation of the pathway upregulates a major downstream target, microphthalmia-associated transcription factor (MITF), which is a transcription factor for the production of melanin synthase such as tyrosinase, tyrosinase-related protein 1 (TYPR1) and tyrosinase-related protein 2 (TYPR2).
  • MITF microphthalmia-associated transcription factor
  • TYPR1 tyrosinase-related protein 1
  • TYPR2 tyrosinase-related protein 2
  • the ⁇ -MSH/MC1R pathway is activated and the enzymatic activity of tyrosinase is more upregulated than in normal keratinocytes.
  • effective treatments for pigmentation disorders are based on anti-pigmentation strategies by discovering new compounds that exhibit down-regulation of pathways and tyrosinas
  • dermal fibroblasts are the main cells and play a pivotal role in the construction of the extracellular matrix (ECM) by producing and secreting collagen proteins, primarily collagen type 1 (COL1A1) and type 3 (COL3A1). Collagen synthesis is an important process constituting the ECM, but the balance between collagen production and degradation is an important physiological process that maintains tissue homeostasis.
  • ECM extracellular matrix
  • ECM e.g., matrix metalloproteinase-1 (MMP1) and matrix metalloproteinase-3 (MMP3). That is, the ECM can be altered during the aging process by abnormal regulation of collagen and MMP production.
  • MMP1 matrix metalloproteinase-1
  • MMP3 matrix metalloproteinase-3
  • UV rays are a major cause of external skin aging, and abnormal UV irradiation can lead to ECM degradation through several intracellular events, including reactive oxygen species (ROS) production, downregulation of collagen genes, and upregulation of MMP genes. This leads to certain signs of aging such as wrinkles. Due to the localized nature of the skin, the aging process including hyperpigmentation and wrinkles is easily detectable; Therefore, there is a great demand in the pharmaceutical and cosmetic industries to find a suitable candidate material that exhibits a protective function against skin aging.
  • ROS reactive oxygen species
  • Probiotics are special microorganisms that convert carbohydrates into lactic acid. As the name suggests, the term probiotics refers to the intake of these living microorganisms in adequate amounts.
  • probiotics are related to direct interactions between probiotic bacteria and epithelial cells, but not all aspects of the effects are related to interactions.
  • CM probiotics conditioned media
  • the present inventors studied whether the CMs of the Bifidobacterium sp. strain and the Lactobacillus sp. strain among probiotics had an effect of protecting skin aging-related cell dysfunction, and as a result, it was confirmed that they had an excellent anti-aging effect, thereby completing the present invention.
  • the present inventors have studied whether the probiotics -derived culture filtration can be used as an anti -aging cosmetic composition, and the probiotics -derived culture filtration inhibits the inner cells of the cells by ultraviolet rays, showing antioxidant effects, and inhibiting the expression level of the genes related to the generosity of the cell protection against ultraviolet rays and the improvement of wrinkle improvement. Since the skin whitening effect is inhibited by inhibiting the enzyme activity and gene expression level associated with the production of Nin, the present invention was completed by experimentally confirming the anti -aging function.
  • an object of the present invention is to culture at least one strain from the group consisting of Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bifidobacterium longum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus casei It is to provide an anti-aging cosmetic composition containing a filtrate.
  • At least from the group consisting of Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bifidobacterium longum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus casei It provides an anti-aging cosmetic composition comprising at least one strain culture filtrate.
  • the strain culture filtrate of the present invention is a probiotics-derived culture filtrate, exhibits an antioxidant effect by suppressing intracellular ROS generation by ultraviolet rays, exhibits an anti-wrinkle effect by suppressing cell protection effect against ultraviolet rays and the expression level of genes related to wrinkle generation, and exhibits a skin whitening effect by suppressing the enzyme activity and gene expression level related to melanin production, so it can be used as an anti-aging cosmetic composition.
  • the term "aging" is a change in body function and condition that progresses with the passage of time, and there are symptoms such as uneven skin and spots, wrinkles, and loss of elasticity due to pigmentation such as melasma, freckles, and age spots. It is known that ultraviolet rays and oxidative stress are the main causes.
  • anti-aging refers to mitigating, reducing, preventing, delaying, improving or eliminating the aging symptoms through whitening, wrinkle improvement, antioxidant, protective effects against ultraviolet rays, or skin regeneration effects.
  • strain culture filtrate includes culture filtrate obtained from a strain culture medium, concentrated culture filtrate, dried culture filtrate, fermentation filtrate, concentrated fermentation filtrate, dried product of fermentation filtrate, or cell lysate.
  • the formulation is not limited, and may be, for example, liquid or solid.
  • the culture filtrate refers to a liquid from which the cells present on the top of the precipitate of the culture solution obtained by culturing the microorganisms in a medium are removed, and more specifically, the culture solution in which the microorganisms are cultured is centrifuged or filtered to remove cells, but is not limited thereto.
  • the fermentation filtrate is a filtrate in which cells are removed from a medium fermented with microorganisms, and includes components included in a medium fermented or cultured using microorganisms.
  • the strain culture filtrate of the present invention is prepared from a culture solution in which all cells are removed after culturing a probiotic strain, and when a cosmetic composition including the probiotic culture filtrate from which the cells are removed is applied to the skin, skin irritation can be minimized and can be used as a relatively safe cosmetic composition.
  • a material arbitrarily selected according to the formulation or purpose of use of the cosmetic may be added, but is not limited thereto.
  • purified water, oil, surfactants, moisturizers, higher alcohols, thickeners, chelating agents, pigments, fatty acids, antioxidants, preservatives, waxes, pH adjusters and fragrances may be added, but are not limited thereto.
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, or zinc oxide may be included as carrier components, but is not limited thereto.
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a powder or spray
  • it may include lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder as a carrier component, and in particular, in the case of a spray, it may additionally include a propellant such as chlorofluorohydrocarbon, propane/butane or dimethyl ether, but is not limited thereto.
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention may include a solvent, a solubilizing agent, or an emulsifying agent as a carrier component, and may include, for example, water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycol, or fatty acid esters of sorbitan, but is not limited thereto.
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a suspension
  • a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol
  • a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracanth may be included, but is not limited thereto.
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention is surfactant-containing cleansing, as carrier components, fatty alcohol sulfate, fatty alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyl taurate, sarcosinate, fatty acid amide ether sulfate, alkylamidobetaine, fatty alcohol, fatty acid glyceride, fatty acid diethanolamide, vegetable oil, lanolin derivative, or ethoxylated glycerol fatty acid ester, etc. It can be done, but is not limited thereto.
  • the composition includes a culture filtrate of Bifidobacterium animalis lactis strain, and may further include at least one strain culture filtrate from the group consisting of Bifidobacterium longum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, and Lactobacillus casei.
  • the composition includes a Bifidobacterium longum strain culture filtrate, and may further include at least one strain culture filtrate from the group consisting of Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, and Lactobacillus casei.
  • the strain culture filtrate can be obtained by culturing the strain in a medium containing inulin and polydextrose.
  • the Bifidobacterium animalis lactis strain may be Bifidobacterium animalis lactis (KCTC 11904BP) [hereinafter, BBAL].
  • the Bifidobacterium longum strain may be Bifidobacterium longum (KCTC 12200BP) [hereinafter referred to as BBL].
  • BBL Bifidobacterium longum
  • the Lactobacillus plantarum strain may be Lactobacillus plantarum (KCTC 10782BP) [hereinafter referred to as LBP].
  • KCTC 10782BP Lactobacillus plantarum
  • the Lactobacillus rhamnosus strain may be Lactobacillus rhamnosus (KCTC 12202BP) [hereinafter referred to as LBR].
  • KCTC 12202BP Lactobacillus rhamnosus
  • the Lactobacillus casei strain may be Lactobacillus casei (KCTC 12398BP) [hereinafter referred to as LBC].
  • the present invention relates to an anti-aging cosmetic composition
  • a probiotics-derived culture filtrate comprising a probiotics-derived culture filtrate.
  • the probiotics-derived culture filtrate according to the present invention exhibits an antioxidant effect by suppressing intracellular ROS production by ultraviolet rays, exhibits an anti-wrinkle effect by suppressing cell protective effects against ultraviolet rays and expression levels of genes related to wrinkle generation, and exhibits a skin whitening effect by inhibiting enzyme activity and gene expression levels related to melanin production, and thus can be used in cosmetic compositions that can be used for anti-aging.
  • Figure 1 shows the cytotoxicity assay of probiotics CMs in NHDFs.
  • NHDFs were treated with the indicated doses (1-100 ⁇ g/mL) of probiotic CMs for 24 h and cell viability was determined by WST-1 assay.
  • the cytotoxicity of BBL CM (a), BBAL CM (b), LBP CM (c), LBC CM (d), LU4 CM (e) and LBR CM (f) is graphed.
  • Graphs represent mean ⁇ SD of relative cell viability in each sample of triplicate experiments. Student's t -test was performed to determine statistical significance (*p ⁇ 0.05).
  • pHO pH-adjusted CM
  • pHX pH-unregulated CM.
  • FIG. 2 shows the inhibitory effect of probiotics CMs on ROS generation induced by UV in NHDFs.
  • Cells were seeded in a 96-well plate, washed with PBS, and irradiated with UVB (10 mJ/cm 2 ). After UVB irradiation, cells were treated with the indicated doses of CMs, including CM from BBL and BBAL (a), CM from LBP and LBC (b), and CM from LU4 and LBR (c).
  • Intracellular ROS levels were determined by DCF-DA assay. Graphs represent mean ⁇ SD of relative intracellular ROS levels in each sample of triplicate experiments. Student's t -test was performed to determine statistical significance (*p ⁇ 0.05).
  • pHO pH-adjusted CM
  • pHX pH-unregulated CM.
  • Figure 3 shows the protective effect of probiotics CMs against UV-induced cell viability loss in NHDFs.
  • Cells were seeded in a 96-well plate, washed with PBS, and irradiated with UVB (10 mJ/cm 2 ). After UVB irradiation, cells were treated with the indicated doses of CMs, including BBL and BBAL CM (a), LBP and LBC CM (b), and LU4 and LBR CM (c).
  • CMs including BBL and BBAL CM (a), LBP and LBC CM (b), and LU4 and LBR CM (c).
  • Cell viability was determined by WST-1 assay. Graphs represent mean ⁇ SD of relative cell viability in each sample of triplicate experiments. Student's t -test was performed to determine statistical significance (*p ⁇ 0.05).
  • pHO pH-adjusted CM
  • pHX pH-unregulated CM.
  • Figure 4 shows the regulatory effect of probiotics CMs on the gene expression of collagen and MMP in UV-irradiated NHDFs.
  • Cells were seeded in a 60-pie cell culture plate, washed with PBS, and UVB (10 mJ/cm 2 ) was irradiated. After UVB irradiation, cells were treated with the indicated doses of CMs including BBL, BBAL and LBP CMs. Levels of COL1A1, COL3A1, MMP1 and MMP3 mRNA were determined by RT-qPCR analysis using specific primers. Results were normalized to ⁇ -actin levels. Graphs represent mean ⁇ SD of relative gene expression levels in each sample of triplicate experiments. Student's t -test was performed to determine statistical significance (*p ⁇ 0.05).
  • pHO pH-adjusted CM
  • pHX pH-unregulated CM.
  • FIG. 5 shows the inhibitory effect of probiotics CMs on mushroom tyrosinase activity in vitro.
  • Tyrosinase activity was assessed by measuring the levels of the enzyme-mediated product dopachrome in the absence and presence of CMs including BBL CM (a), BBAL CM (b), LBP CM (c), LU4 CM (d), LBC CM (e) and LBR CM (f).
  • Graphs represent mean ⁇ SD of relative enzyme activity in each sample of triplicate experiments. Student's t -test was performed to determine statistical significance (*p ⁇ 0.05).
  • pHO pH-adjusted CM
  • pHX pH-unregulated CM.
  • Figure 6 shows the inhibitory effect of probiotics CMs on intracellular melanin synthesis in B16F10 cells.
  • Cells were co-treated with ⁇ -MSH (100 nM) and probiotic CMs (BBAL and LBP CMs (a), and LBC and LU4 CMs (b)) for 24 hours.
  • the melanin content was determined by applying NaOH lysis buffer to the cell pellet and measuring the absorbance at 450 nm.
  • Arbutin was used as a positive control.
  • Graphs represent mean ⁇ SD of relative melanin content in each sample of triplicate experiments. Student's t -test was performed to determine statistical significance (*p ⁇ 0.05).
  • pHO pH-adjusted CM
  • pHX pH-unregulated CM.
  • Figure 7 shows the effect of probiotics CMs on the expression of melanin production-related mRNA and protein in B16F10 cells.
  • Figure 8 shows the effect of probiotics CMs on the phosphorylation of CREB, PKA and MAPK kinases (kinase) in B16F10 cells.
  • Expression levels of the indicated proteins after treatment with non-toxic doses of CM at BBAL pH in cells stimulated with ⁇ -MSH were determined by immunoblotting using specific antibodies.
  • the levels of p-CREB and p-PKA were confirmed (a), and the band intensities of p-CREB and p-PKA were analyzed using the Image-J program and normalized to CREB and PKA blots, respectively (b). Student's t -test was performed to determine statistical significance (*p ⁇ 0.05).
  • phosphorylation levels of ERK, p38 and JNK were confirmed (c).
  • pHO pH adjusted CM.
  • FIG. 9 shows the results of analyzing the chemical components of BBAL CM.
  • (a) shows that HPLC chromatogram analysis of BBAL pHO and pHX CM has 6 different peak patterns including lactic acid, formic acid, acetic acid and 3 unknown peaks.
  • (b) shows a comparative analysis of the concentrations of lactic acid, formic acid and acetic acid in BBAL pHO and pHX CM.
  • Bifidobacterium animalis subsp. lactis BBAL (KCTC 11904BP) and Bifidobacterium longum BBL (KCTC 12200BP) were cultured overnight at 37° C. under anaerobic conditions in BL liquid medium (broth, Becton Dickinson), an optimized medium for bifidobacteria.
  • Lactobacillus casei LBC (KCTC 12398BP)
  • Lactobacillus plantarum LBP (KCTC 10782BP)
  • Lactobacillus rhamnosus LBR (KCTC 12202BP)
  • Lactobacillus reuteri LU4 Lactobacillus rhamnosus LBR (KCTC 12202BP)) obacillus reuteri LU4
  • MRS liquid medium broth, Difco, BD Biosciences, USA
  • the pH-adjusted medium refers to a medium adjusted to maintain the pH conditions of the medium at 6.0 to 6.5.
  • a pH-unregulated medium (pHX) refers to a medium in which there is no condition in which pH is maintained.
  • Each strain culture solution was centrifuged at 2700 g for 30 minutes to obtain a supernatant (culture filtrate) of the culture solution from which cells were removed.
  • a 5-fold concentrated powder of the supernatant was prepared by vacuum evaporation and freeze-drying of the supernatant (culture filtrate) of the culture solution. After that, in the experimental analysis, the concentrated powder was dissolved in an appropriate solvent to a certain concentration and used.
  • NHDF Normal human dermal fibroblasts
  • B16F10 mouse melanoma cells were cultured in a humidified 5% CO 2 incubator at 37°C in Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (Biowest, Nuaille, France) supplemented with 10% (v/v) fetal bovine serum (Biowest), 100 U/mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA).
  • Cytotoxicity induced by probiotic CMs was evaluated using the WST-1 assay (EZ-Cytox cell viability assay kit; Itsbio, Seoul, Korea). Briefly, NHDF and B16F10 cells were seeded in 96-well culture plates and cultured overnight. Cells were then treated with the indicated doses of probiotic CMs for 24 hours. Afterwards, WST-1 solution was added to each well and further incubated for 0.5 hour. Cell viability was determined by measuring absorbance at 450 nm with 620 nm (reference filter) using an iMark microplate reader (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
  • UVB-irradiated and CM-treated NHDFs The protective effect of probiotic CMs against UV-induced cell damage, including cell viability loss and ROS generation, was evaluated with UVB-irradiated and CM-treated NHDFs. Briefly, cells (2 x 10 5 ) were seeded in 60 mm cell culture plates and cultured for 24 hours. Before UVB irradiation, cells were washed twice with PBS (phosphate-buffered saline), and UVB was irradiated at 10 mJ/cm2 using a UV illuminator, Super Light VI (BoTeck, Gyeonggi-do, Korea) without covering the plate dish. After UVB irradiation, cells were immediately treated with fresh growth medium containing probiotic CMs for 24 hours.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the protective effect of probiotic CMs against UV-induced intracellular ROS production in NHDFs was evaluated using a 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA; Sigma Aldrich) staining assay. Briefly, cells were exposed to UVB light and treated with probiotic CMs for 24 hours. Cells were then trypsinized and resuspended in 10 ⁇ M DCF-DA solution (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). After incubation for 1 hour, fluorescence intensity was measured at excitation and emission wavelengths of 485 nm and 530 nm, respectively, using a microplate fluorescence reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
  • DCF-DA 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate
  • HPLC was performed using a Shimadzu HPLC system (Shimadzu, Korea). Fermentation supernatant of Bifidobacterium animalis lactis BBAL was prepared under two different conditions. One sample was fermented in a pH-controlled manner by maintaining the pH of the medium.
  • ⁇ -actin was used as an endogenous internal control and was detected using an antibody against it (Sigma-Aldrich).
  • Primary antibodies used for immunoblot analysis were Mitf, Tyrosinase, Tyrp-1, Tyrp-2, p38 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), p-PKA (Thr198), CREB, p-CREB (Ser133), ERK, p-ERK (Thr202/Tyr204), p-p38 (Thr180/Tyr182), JNK, p-J antibodies against NK (Thr183/Tyr185) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) and PKA (Abcam, Cambridge, UK).
  • RNA was prepared using TRIzol reagent (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • cDNA was synthesized using M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).
  • Real-time quantitative PCR was performed using the HOT FIREPol EvaGreen PCR Mix Plus (Solis BioDyne, Estonia) and the StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific).
  • Primer sequences are as follows: human COL1A1 forward 5'-AGGGCCAAGACGAAGACATC-3', reverse 5'-AGATACACGTCATCGCACAACA-3'; human COL3A1 forward 5′-GTTTTGCCCCGTATTATGGA-3′, reverse 5′-GGAAGTTCAGGATTGCCGTA-3′; Human MMP1 forward 5′-TCTGACGTTGATCCCAGAGAGCAG-3′, reverse 5′-CAGGGTGACACCAGTGACTGCAC-3′; human MMP3 forward 5′-AGCAAGGACCTCGTTTTCATT-3′, reverse 5′-GTCAATCCCTGGAAAGTCTTCA-3′; Mitf forward, 5′-AGAAGCTGGAGCATGCGAACC-3′, reverse, 5′-GTTCCTGGCTGCAGTTCTCAAG-3′; Tyrosinase forward 5′-ACACACTGGAAGGATTTGCC-3′, reverse 5′-GAGCGGTATGAAAGGAACCA-3′; Tyrp-1 forward 5′-GA
  • the mRNA expression of each target gene was normalized to ⁇ -actin and relative mRNA quantification was calculated using the 2 - ⁇ Ct method.
  • Intracellular melanin content was determined by NaOH lysis buffer and absorbance at 450 nm. Briefly, cells were treated with various concentrations of probiotic CMs in the presence or absence of 100 nM of alpha-melanocyte stimulating hormone ( ⁇ -MSH) for 24 hours. Cell pellets were lysed in 1N NaOH lysis buffer at 60°C for 1 hour. The melanin content was measured by comparing absorbance at 450 nm measured using an iMark microplate reader (Bio-Rad). Total protein was measured using the Pierce BCA Protein Assay Kit (Rockford, IL, USA). Relative melanin content was calculated from a standard curve using total protein concentration.
  • ⁇ -MSH alpha-melanocyte stimulating hormone
  • CMs were irradiated with 10 mJ/cm 2 UVB, treated with non-toxic doses of CMs, and intracellular ROS were measured using DCF-DA.
  • UV light significantly increased ROS levels in cells.
  • this value decreased in all CM-treated groups.
  • CM of 100 ⁇ g/mL of BBL pHX, BBAL pHX, and LBP pHHO reduced cellular ROS levels by 72%, 54%, and 59%, respectively, compared to those of UV-irradiated NHDFs.
  • Other CMs reduced cellular ROS levels by 10-30%.
  • UV-induced ROS generation can cause ECM degradation through dysregulation of collagen and MMP expression. Therefore, it was further tested whether the above result was related to the protective function against UV-irradiated cell damage.
  • NHDFs were irradiated with 10 mJ/cm 2 UVB and treated with CMs for 24 hours.
  • WST-1 assay was performed. As shown in Figure 3, UV light significantly reduced viability to 54 ⁇ 0.84%.
  • CMs of BBL pHHO (10 ⁇ g/mL) and pHX (100 ⁇ g/mL) significantly restored UVB-mediated loss of cell viability by 13% and 21%, respectively.
  • 100 ⁇ g/mL CMs of BBAL pHHO and LBP pHX restored cell viability loss by 18% and 23%, respectively.
  • Other CMs did not show significant recovery effects.
  • CMs have an inhibitory effect on UV-induced melanogenesis in human epidermal melanocytes.
  • tyrosinase enzyme activity which is a major metabolic enzyme for melanin production. Mushroom tyrosinase and its substrate L-DOPA were incubated with CMs (1-100 ⁇ g/mL), and the amount of dopachrome produced from L-DOPA was measured to analyze the inhibitory effect on tyrosinase activity. As shown in Figure 5, CMs of BBL had no inhibitory effect on tyrosinase activity.
  • CMs from BBAL showed a significant decrease in tyrosinase activity in a dose-dependent manner.
  • CM of BBAL pH increased the inhibition rate of tyrosinase activity by about 40%.
  • the inhibition rate of tyrosinase activity in the group treated with CM of BBAL pHX was up to 30%, indicating that the CM of BBAL pHO had a better inhibition rate of tyrosinase activity than that of CM of BBAL pHX.
  • CM of LBP pHHO but not LBP pHX, showed an inhibitory effect on tyrosinase activity in a dose-dependent manner.
  • a tyrosinase activity inhibitory effect was also observed for the LU4 and LBC CM-treated groups, but no dose-dependent tyrosinase activity inhibitory effect was observed.
  • MITF is known as a major transcription factor for this gene. Therefore, the expression level of the MITF was further analyzed. As a result of the analysis, it was shown that the protein and mRNA levels of MITF were significantly downregulated by CM of BBAL pH. These results suggest that the anti-pigmentation (whitening) effect of CM of BBAL pH is mediated by the downregulation of MITF expression in cells.
  • HPLC analysis showed six different peaks including three unknown peaks, lactic acid, formic acid and acetic acid in both CMs (FIG. 9). Notably, the amount of the unknown first and sixth peaks (peaks a and c) did not change between the CMs of BBAL pHO and pHX.
  • the amount of the unknown second peak (peak b) and three organic acids were significantly increased in the CM of BBAL pHX compared to the amount in the CM of BBAL pHX.
  • the amount of the component of peak b increased by a factor of X in the pHO sample compared to the value of the pHX sample.
  • the amounts of lactic acid, formic acid and acetic acid were found to increase about 8.9-fold, 4.3-fold and 2.9-fold, respectively, in the pHO sample compared to the values in the pHX sample.

Abstract

본 발명은 프로바이오틱스 유래 배양여과물을 포함하는 항노화 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프로바이오틱스 유래 배양여과물은 자외선에 의한 세포 내 ROS 생성을 억제하여 항산화 효과를 나타내고, 자외선에 대한 세포 보호 효과 및 주름 발생과 관련된 유전자의 발현 수준을 억제하여 주름 개선 효과를 나타내며, 멜라닌 생성과 관련된 효소 활성 및 유전자 발현 수준을 억제하여 피부 미백 효과를 나타내는 바, 항노화에 사용될 수 있는 화장료 조성물에 활용될 수 있다.

Description

프로바이오틱스 유래 배양여과물을 포함하는 항노화 화장료 조성물
본 발명은 항노화 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 프로바이오틱스 유래 배양여과물을 포함하는 항노화 화장료 조성물에 관한 것이다.
인간의 피부에는 표피, 진피 및 피하의 세 가지 층이 있으며 각 층에 특화된 세포가 있다. 각질형성세포(keratinocytes)와 멜라닌세포(melanocytes)는 표피에 위치한 주요 세포이며 자외선(UV)을 포함한 환경 요인으로부터 보호하는 중추적인 역할을 한다. 멜라닌 색소는 각질형성세포와 멜라닌세포 사이의 세포간 상호작용에 의해 생성되어 천연 자외선 차단제의 필터 역할을 하는 것으로 알려져 있지만, 자외선을 과도하게 조사될 경우, 색소 합성이 비정상적으로 진행되어 기미, 검버섯 및 주근깨와 같은 여러 가지 과색소침착(hyperpigmentation)과 관련된 피부장애를 유발하는 것으로 알려져 있다.
표피의 멜라닌 합성은 줄기 세포 인자(stem cell factor, SCF)와 그 수용체 KIT 및 알파-멜라닌세포 자극 호르몬(alpha-melanocyte stimulating hormone, α-MSH)과 그 수용체인, 멜라닌세포-특이적 멜라노코르틴-1 수용체(melanocortin-1 receptor, MC1R) 경로와 같은 여러 분자 신호 경로에 의해 조절된다.
그 중 α-MSH/MC1R 경로는 멜라닌세포에서 UV에 의해 유도되는 멜라닌 생성에 대해 잘 알려진 기전이며, 경로의 활성화는 주요 하류 표적인, MITF (microphthalmia-associated transcription factor)를 상향조절하고, 상기 MITF 는 tyrosinase, tyrosinase-related protein 1(TYPR1) 및 tyrosinase-related protein 2(TYPR2)와 같은 멜라닌 합성 효소 생산을 위한 전사 인자이다. UV에 의해 유도되는 노화된 피부에서는 α-MSH/MC1R 경로가 활성화되고 tyrosinase의 효소 활성은 정상 각질형성세포에서보다 더 상향조절된다. 따라서, 색소침착 질환에 대한 효과적인 치료법은 경로 및 tyrosinase 활성의 하향 조절을 나타내는 새로운 화합물을 발견함으로써 항-색소침착 전략을 기반으로 한다.
진피층에서, 진피 섬유아세포는 주요 세포이며 주로 1형 콜라겐(COL1A1) 및 3형(COL3A1)과 같은 콜라겐 단백질을 생성 및 분비함으로써 세포외기질(extracellular matrix, ECM)의 구성에 중추적인 역할을 한다. 콜라겐 합성은 ECM을 구성하는 중요한 과정이지만, 콜라겐 생성과 분해 사이의 균형은 조직 항상성을 유지하는 중요한 생리학적 과정이다.
ECM의 흥미로운 특징 중 하나는 콜라겐 단백질과, 주로 MMP1(matrix metalloproteinase-1)및 MMP3(matrix metalloproteinase-3)와 같은 콜라게나제(collagenases)에 의해 조절되는 동적 구조에 있다. 즉, ECM은 콜라겐과 MMP 생성의 비정상적인 조절에 의해 노화 과정에서 변화될 수 있다.
자외선은 외적인 피부 노화의 주요 원인이며, 비정상적인 UV 조사는 활성산소종(ROS) 생산, 콜라겐 유전자의 하향조절 및 MMP 유전자의 상향조절을 포함한 여러 세포 내 이벤트를 통해 ECM 분해로 이어질 수 있다. 이는 주름과 같은 특정 노화 징후로 이어진다. 피부의 국소화 특징으로 인해, 과색소침착과 주름을 포함한 노화 과정이 쉽게 감지된다; 따라서, 제약 및 화장품 산업에서 피부 노화에 대한 보호 기능을 발휘하는 적합한 후보물질의 발견이 크게 요구되고 있다.
프로바이오틱스(probiotics)는 탄수화물을 젖산으로 전환시키는 특수한 미생물로 유산균에 속하기도 한다. 이름에서 알 수 있듯이, 프로바이오틱스라는 용어는 이러한 살아있는 미생물을 적정량 섭취하는 것을 의미한다.
숙주에 유익한 건강 효과를 발휘하고 수많은 연구에서 항염, 점막장벽 기능 자극 및 장내 미생물의 항상성과 같은 건강 효과를 뒷받침하는 과학적 증거를 지속적으로 제시하였다. 또한, 여러 피부과 및 분자 연구에서 장내 미생물총(gut microbiota)이 잠재적으로 피부와 소통하고 비피도박테리움 속(Bifidobactrium sp.) 및 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)을 포함한 프로바이오틱스의 경구 투여는 경피수분손실(transepidermal water loss, TEWL)의 증가, 건선, 아토피 피부염 및 여드름과 같은 피부 항상성 이상(dyshomeostasis)-관련 장애에 치료 효과가 있는 것으로 나타났다.
프로바이오틱스의 몇 가지 유익한 효과는 프로바이오틱스 세균과 상피 세포 간의 직접적인 상호 작용과 관련이 있으나, 효과의 모든 측면이 상호 작용과 관련이 있는 것은 아니다.
최근 연구에서는 프로바이오틱스 세균을 증식시킨 후 모든 균체를 제거하기 위해 여과된 배양용 액체배지(broth)인, 프로바이오틱스 배양여액(conditioned media, CM)을 적용함으로써 건강에 유익한 효과를 입증했다. 선행 연구에 따르면, 생리활성 성분은 특정 프로바이오틱 세균에 의해 CM으로 분비되며 항염증 및 세포보호 특성이 있는 것으로 보고되었다. 참고로, 비피도박테리움 속(Bifidobactrium sp.) 및 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)의 CM은 각각 아스피린에 의해 유도되는 세포손상과 인터루킨-10 결핍-매개 결장(colon) 염증에 대한 보호 효과를 나타냈다. 이러한 연구 결과들은 CM이 프로바이오틱스의 효과를 가지는 잠재적인 후보물질이 될 수 있음을 나타낸다.
이에 본 발명자는 프로바이오틱스 중 비피도박테리움 속(Bifidobactrium sp.) 균주 및 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 균주의 CM이 피부 노화-관련 세포 기능장애를 보호하는 효과가 있는지에 대하여 연구한 결과, 우수한 항노화 효과를 가지는 것으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 프로바이오틱스 유래 배양여과물을 항노화 화장료 조성물로 사용할 수 있는지 연구하였고, 상기 프로바이오틱스 유래 배양여과물이 자외선에 의한 세포 내 ROS 생성을 억제하여 항산화 효과를 나타내고, 자외선에 대한 세포 보호 효과 및 주름 발생과 관련된 유전자의 발현 수준을 억제하여 주름 개선 효과를 나타내며, 멜라닌 생성과 관련된 효소 활성 및 유전자 발현 수준을 억제하여 피부 미백 효과를 나타내므로, 항노화능을 가짐을 실험적으로 입증 및 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 비피도박테리움 애니말리스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)로 이루어진 군 중에서 적어도 1종 이상의 균주 배양여과물을 포함하는 항노화 화장료 조성물를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 비피도박테리움 애니말리스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)로 이루어진 군 중에서 적어도 1종 이상의 균주 배양여과물을 포함하는 항노화 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 균주 배양여과물은 프로바이오틱스 유래 배양여과물로서, 자외선에 의한 세포 내 ROS 생성을 억제하여 항산화 효과를 나타내고, 자외선에 대한 세포 보호 효과 및 주름 발생과 관련된 유전자의 발현 수준을 억제하여 주름 개선 효과를 나타내며, 멜라닌 생성과 관련된 효소 활성 및 유전자 발현 수준을 억제하여 피부 미백 효과를 나타내므로, 항노화 화장료 조성물로 활용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "노화"는 시간의 흐름과 함께 진행되는 신체의 기능 및 상태 변화로 기미, 주근깨, 검버섯과 같은 색소 침착으로 인한 불균일한 피부 및 반점, 주름, 탄력저하 등의 증상이 있으며, 자외선 및 산화적 스트레스가 주된 원인으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어 "항노화"는 미백, 주름개선, 항산화, 자외선에 대한 보호 효과 또는 피부 재생 효과를 통해 상기 노화 증상을 완화, 감소, 예방, 지연, 개선 또는 제거시키는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "균주 배양여과물"은 균주 배양액으로부터 수득한 배양여액, 농축 배양여액, 배양여액의 건조물, 발효여액, 농축 발효여액, 발효여액의 건조물 또는 균체 용해물을 포함하여 균체를 제거한 배양액의 상등액 또는 발효 상등액 형태로, 그 제형이 한정되지 아니하고, 일 예로 액체 또는 고체일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배양여액은 미생물을 배지에 배양하여 얻어진 배양액의 침전물의 상부에 존재하는 균체가 제거된 액체를 의미하는 것으로, 보다 구체적으로 미생물을 배양한 배양액을 원심분리하거나, 여과하여 균체를 제거한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 발효여액은 미생물로 발효시킨 배지에서 균체를 제거한 여액으로서, 미생물을 이용하여 발효 또는 배양한 배지에 포함된 구성성분들을 포함한다.
본 발명의 균주 배양여과물은 프로바이오틱 균주를 배양한 후 모든 균체를 제거한 배양액으로 제조된 것으로, 상기 균체를 제거한 프로바이오틱 배양여과물을 포함한 화장료 조성물을 피부에 적용할 경우, 피부 자극을 최소화할 수 있고 비교적 안전한 화장료 조성물로 활용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 유효성분인, 상기 균주 배양여과물 이외에 화장료의 제형 또는 사용 목적에 맞게 임의로 선정한 물질을 첨가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 정제수, 유분, 계면활성제, 보습제, 고급 알코올, 증저점제, 킬레이트제, 색소, 지방산, 산화방지제, 방부제, 왁스, pH 조절제 및 향료 등이 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우, 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우, 담체 성분으로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더를 포함할 수 있고, 특히, 스프레이인 경우, 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제를 포함할 수 있고, 예를 들어, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우, 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 비피도박테리움 애니말리스 락티스 균주 배양여과물을 포함하고, 비피도박테리움 롱굼, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노수스 및 락토바실러스 카제이로 이루어진 군 중에서 적어도 1종 이상의 균주 배양여과물을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 조성물은 비피도박테리움 롱굼 균주 배양여과물을 포함하고, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노수스 및 락토바실러스 카제이로 이루어진 군 중에서 적어도 1종 이상의 균주 배양여과물을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 균주 배양여과물은 이눌린(inulin) 및 폴리덱스트로스(polydextrose)를 포함하는 배지에서 균주를 배양하여 얻어질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비피도박테리움 애니말리스 락티스 균주는 비피도박테리움 애니말리스 락티스 (KCTC 11904BP)[이하, BBAL]일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비피도박테리움 롱굼 균주는 비피도박테리움 롱굼 (KCTC 12200BP)[이하, BBL]일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 락토바실러스 플란타룸 균주는 락토바실러스 플란타룸 (KCTC 10782BP)[이하, LBP]일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 락토바실러스 람노수스 균주는 락토바실러스 람노수스 (KCTC 12202BP)[이하, LBR]일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 락토바실러스 카제이 균주는 락토바실러스 카제이 (KCTC 12398BP)[이하, LBC]일 수 있다.
본 발명은 프로바이오틱스 유래 배양여과물을 포함하는 항노화 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프로바이오틱스 유래 배양여과물은 자외선에 의한 세포 내 ROS 생성을 억제하여 항산화 효과를 나타내고, 자외선에 대한 세포 보호 효과 및 주름 발생과 관련된 유전자의 발현 수준을 억제하여 주름 개선 효과를 나타내며, 멜라닌 생성과 관련된 효소 활성 및 유전자 발현 수준을 억제하여 피부 미백 효과를 나타내는 바, 항노화에 사용될 수 있는 화장료 조성물에 활용될 수 있다.
도 1은 NHDFs에서 프로바이오틱스 CMs의 세포독성 분석을 나타낸 것이다. NHDFs는 24시간 동안 프로바이오틱스 CMs의 표시된 용량(1-100 μg/mL)으로 처리되었고 세포 생존능은 WST-1 분석에 의해 결정되었다. BBL CM(a), BBAL CM(b), LBP CM(c), LBC CM(d), LU4 CM(e) 및 LBR CM(f)의 세포독성은 그래프에 표시되었다. 그래프는 삼중 실험의 각 샘플에서 상대적인 세포 생존능의 평균 ± S.D를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트는 통계적 유의성을 결정하기 위해 수행되었다(*p<0.05). pHO: pH 조절 CM, pHX: pH 조절되지 않은 CM.
도 2는 NHDFs에서 UV에 의해 유도되는 ROS 생성에 대한 프로바이오틱스 CMs의 억제 효과를 나타낸 것이다. 세포를 96-웰 플레이트에 씨딩(seeding)하고 PBS로 세척한 후 UVB(10 mJ/cm2)를 조사하였다. UVB 조사 후, 세포는 BBL 및 BBAL의 CM(a), LBP 및 LBC의 CM(b), LU4 및 LBR의 CM(c)을 포함하여 표시된 용량의 CMs으로 처리되었다. 세포 내 ROS 수준은 DCF-DA 분석에 의해 결정되었다. 그래프는 삼중 실험의 각 샘플에서 상대적인 세포 내 ROS 수준의 평균 ± S.D를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트는 통계적 유의성을 결정하기 위해 수행되었다(*p<0.05). pHO: pH 조절 CM, pHX: pH 조절되지 않은 CM.
도 3은 NHDFs에서 UV로 인한 세포 생존능 손실에 대한 프로바이오틱스 CMs의 보호 효과를 나타낸 것이다. 세포를 96-웰 플레이트에 씨딩(seeding)하고 PBS로 세척한 후 UVB(10 mJ/cm2)를 조사하였다. UVB 조사 후, 세포는 BBL 및 BBAL CM(a), LBP 및 LBC CM(b), LU4 및 LBR CM(c)을 포함하여 표시된 용량의 CMs으로 처리되었다. 세포 생존능은 WST-1 분석에 의해 결정되었다. 그래프는 삼중 실험의 각 샘플에서 상대적인 세포 생존능의 평균 ± S.D를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트는 통계적 유의성을 결정하기 위해 수행되었다(*p<0.05). pHO: pH 조절 CM, pHX: pH 조절되지 않은 CM.
도 4는 UV 조사된 NHDFs에서 콜라겐 및 MMP의 유전자 발현에 대한 프로바이오틱스 CMs의 조절 효과를 나타낸 것이다. 세포를 60-파이 세포 배양 플레이트에 씨딩(seeding)하고 PBS로 세척한 후 UVB(10 mJ/cm2)를 조사하였다. UVB 조사 후, 세포는 BBL, BBAL 및 LBP CMs을 포함하여 표시된 용량의 CMs으로 처리되었다. COL1A1, COL3A1, MMP1 및 MMP3 mRNA의 수준은 특정 프라이머를 사용한 RT-qPCR 분석에 의해 결정되었다. 결과는 β-actin 수준에 대해 정규화되었다. 그래프는 삼중 실험의 각 샘플에서 상대적인 유전자 발현 수준의 평균 ± S.D를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트는 통계적 유의성을 결정하기 위해 수행되었다(*p<0.05). pHO: pH 조절 CM, pHX: pH 조절되지 않은 CM.
도 5는 시험관 내 mushroom tyrosinase 활성에 대한 프로바이오틱스 CMs의 억제 효과를 나타낸 것이다. Tyrosinase 활성은 BBL CM(a), BBAL CM(b), LBP CM(c), LU4 CM(d), LBC CM(e) 및 LBR CM(f)를 포함하여 CMs의 부재 및 존재시 효소-매개 산물인 도파크롬(dopachrome)의 수준을 측정하여 평가했다. 그래프는 삼중 실험의 각 샘플에서 상대적인 효소 활성의 평균 ± S.D를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트는 통계적 유의성을 결정하기 위해 수행되었다(*p<0.05). pHO: pH 조절 CM, pHX: pH 조절되지 않은 CM.
도 6은 B16F10 세포에서 세포내 멜라닌 합성에 대한 프로바이오틱스 CMs의 억제 효과를 나타낸 것이다. 세포는 α-MSH (100 nM) 및 프로바이오틱스 CMs(BBAL 및 LBP CMs(a), 및 LBC 및 LU4 CMs(b))을 24시간 동안 공동 처리되었다. 세포 펠렛에 NaOH 용해 완충액을 적용하고 450 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 함량을 결정했다. 알부틴은 양성 대조군으로 사용되었다. 그래프는 삼중 실험의 각 샘플에서 상대적인 멜라닌 함량의 평균 ± S.D를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트는 통계적 유의성을 결정하기 위해 수행되었다(*p<0.05). pHO: pH 조절 CM, pHX: pH 조절되지 않은 CM.
도 7은 B16F10 세포에서 멜라닌 생성 관련 mRNA 및 단백질의 발현에 대한 프로바이오틱스 CMs의 효과를 나타낸 것이다. α-MSH로 자극된 세포에서 무독성 용량의 BBAL pHO의 CM을 처리한 후 tyrosinase, Tyrp-1 및 Tyrp-2의 단백질 수준(a)을 확인하였고, tyrosinase(b), Tyrp-1(c) 및 Tyrp-2(d)의 mRNA 수준을 확인하였으며, MITF의 단백질(e)과 mRNA(f)의 수준을 확인하였다. 그래프는 삼중 실험의 각 샘플에서 상대적인 발현 수준의 평균 ± S.D를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트는 통계적 유의성을 결정하기 위해 수행되었다(*p<0.05). pHO: pH 조절 CM, pHX: pH 조절되지 않은 CM.
도 8은 B16F10 세포에서 CREB, PKA 및 MAPK 키나아제(kinase)의 인산화에 대한 프로바이오틱스 CMs의 효과를 나타낸 것이다. α-MSH로 자극된 세포에서 무독성 용량의 BBAL pHO의 CM을 처리한 후 표시된 단백질의 발현 수준은 특정 항체를 사용한 면역블롯팅에 의해 결정되었다. p-CREB 및 p-PKA 수준을 확인하였고(a), p-CREB 및 p-PKA의 밴드 강도는 Image-J 프로그램을 사용하여 분석하고 각각 CREB 및 PKA 블롯으로 정규화했다(b). 스튜던트 t-테스트는 통계적 유의성을 결정하기 위해 수행되었다(*p<0.05). 또한, ERK, p38 및 JNK의 인산화 수준을 확인하였다(c). pHO: pH 조절 CM.
도 9는 BBAL CM의 화학 성분을 분석한 결과를 나타낸 것이다. (a)는 BBAL pHO 및 pHX CM의 HPLC 크로마토그램 분석에 의해 젖산, 포름산, 아세트산 및 알려지지 않은 3개의 피크를 포함하여 6개의 다른 피크 패턴을 가짐을 보여주는 것이다. (b)는 BBAL pHO 및 pHX CM에서의 젖산, 포름산 및 아세트산의 농도에 대한 비교 분석을 나타낸 것이다.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
실시예
실험 재료 및 방법
1. 프로바이오틱 배양여액(conditioned media, CM)의 제조
비피도박테리움 애니말리스 락티스 BBAL(Bifidobacterium animalis subsp. lactis BBAL(KCTC 11904BP)) 및 비피도박테리움 롱굼 BBL(Bifidobacterium longum BBL(KCTC 12200BP))은 비피도박테리아 최적화 배지인, BL 액체배지(broth, Becton Dickinson)에서 혐기성 조건하에 37℃에서 밤새 배양하였다.
락토바실러스 카제이 LBC(Lactobacillus casei LBC(KCTC 12398BP)), 락토바실러스 플란타룸 LBP(Lactobacillus plantarum LBP(KCTC 10782BP)), 락토바실러스 람노수스 LBR(Lactobacillus rhamnosus LBR(KCTC 12202BP)) 및 락토바실러스 루테리 LU4(Lactobacillus reuteri LU4)를 락토바실러스 최적화 배지인, MRS 액체배지(broth, Difco, BD Biosciences, USA)에서 호기성 조건하에 37℃에서 밤새 배양하였다.
pH 조절 배지(pHO)는 배지의 pH 조건을 6.0~6.5로 유지하도록 조절한 배지를 의미한다. pH 조절되지 않은 배지(pHX)는 pH가 유지되는 조건이 없는 배지를 의미한다. 각각의 균주 배양액을 2700 g에서 30분간 원심분리하여 균체가 제거된 배양액의 상등액(배양여액)을 수득하였다. 상기 배양액의 상등액(배양여액)을 진공 증발 및 동결 건조를 통해 상등액의 5 배 농축 분말을 제조하였다. 이 후 실험 분석에는 상기 농축 분말을 적절한 용매에 일정농도가 되도록 녹여서 사용되었다.
2. 세포 배양
정상 인간 진피 섬유아세포(Normal human dermal fibroblasts, NHDF)를 CELLnTEC(Bern, Switzerland)에서 구입하고 FGM-2 SingleQuot Kit(Lonza)가 보충된 섬유아세포 성장 배지(FBM; Lonza, Basel, Switzerland)에서 37℃, 5% CO2에서 유지했다.
B16F10 마우스 흑색종 세포는 10%(v/v) 태아 소 혈청(Biowest), 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신(Gibco, Grand Island, NY, USA)가 보충된 Roswell Park Memorial Institute 1640 배지(Biowest, Nuaille, France)에서 37℃에서 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 배양되었다.
3. 수용성 테트라졸륨염(WST-1) 분석
프로바이오틱 CMs에 의해 유도되는 세포독성은 WST-1 assay (EZ-Cytox cell viability assay kit; Itsbio, Seoul, Korea)를 이용하여 평가하였다. 간단히 말해서, NHDF 및 B16F10 세포를 96-웰 배양 플레이트에 씨딩(seeding)하고 밤새 배양하였다. 그런 다음 세포를 표시된 용량의 프로바이오틱 CMs으로 24시간 동안 처리했다. 이후 WST-1 용액을 각 웰에 추가했고 0.5시간 동안 더 배양하였다. 세포 생존능은 iMark 마이크로플레이트 판독기(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 620 nm(기준 필터)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 결정했다.
4. UVB 조사 및 시약 처리
세포 생존능 손실 및 ROS 생성을 포함한 UV에 의해 유도되는 세포 손상에 대한 프로바이오틱스 CMs의 보호 효과를 UVB에 조사되고 CM 처리된 NHDFs로 평가했다. 간단히 말해서, 세포(2 x 105)를 60 mm 세포 배양 플레이트에 씨딩(seeding)하고 24시간 동안 배양했다. UVB 조사 전에, 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 두 번 세척한 다음, 플레이트 디쉬를 덮지 않고 UV 조명기인, Super Light VI(BoTeck, 경기도, 한국)를 사용하여 10 mJ/cm²의 UVB를 조사하였다. UVB 조사 후, 세포는 즉시 24시간 동안 프로바이오틱 CMs을 함유하는 신선한 성장 배지로 처리되었다.
5. 세포 내 ROS 수준 분석
NHDFs에서 UV에 의해 유도되는 세포 내 ROS 생성에 대한 프로바이오틱스 CMs의 보호 효과는 2', 7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCF-DA; Sigma Aldrich) 염색 분석을 사용하여 평가되었다. 간단히 말해서, 세포를 UVB 광선에 노출시키고 24시간 동안 프로바이오틱 CMs으로 처리했다. 그런 다음 세포를 트립신 처리하고 10 μM DCF-DA 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 재현탁했다. 1시간 동안 배양한 후, 형광 강도를 마이크로플레이트 형광 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 각각 485 nm 및 530 nm의 여기(excitation) 및 방출(emission) 파장에서 측정하였다.
6. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석
HPLC는 Shimadzu HPLC 시스템(Shimadzu, Korea)을 통해 수행하였다. 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BBAL의 발효 상등액은 두 가지 다른 조건에서 준비되었다. 하나의 샘플은 배지의 pH를 유지하여 pH 조절 방식으로 발효되었다.
다른 샘플은 배지의 pH 조절 없이 발효되었다. 발효 후 배양액을 원심분리하여 균체와 상등액을 분리하여 발효 상등액(발효여액)을 수득하였다. 상기 발효 상등액(발효여액)은 분리 후 동결 건조시켰다. 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BBAL 발효 상등액의 동결 건조 샘플 50 mg을 6 mM 과염소산(perchloric acid)에 녹이고 0.2 μm 필터로 여과하였다. 동일한 용매를 이동상으로 컬럼(Shodex RSpak KC-811, 6 μm, 8.0 x 300 mm)에 펌핑했다. 과염소산의 유속은 1 mL/분이었고 온도는 40℃였다. 두 조건은 분석이 끝날 때까지 유지되었다. 샘플의 주입량은 10 μl였다. 피크는 210 nm에서 UV 검출기로 검출되었다.
7. 면역블롯(Immunoblot) 분석
면역블롯 분석을 사용하여 단백질 수준의 변화를 측정했다. 총 세포 용해물은 프로테아제 억제제 칵테일(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)이 보충된 방사성면역침전(radioimmunoprecipitation) 분석 용해 완충액(Thermo Fisher Scientific)으로 제조되었다. 용해물을 SDS-PAGE를 실시한 후 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 5% skim milk로 블록킹(blocking)하고 4℃에서 표시된 항체와 함께 밤새 배양했다. Horseradish peroxidase-결합 항-마우스 또는 항-토끼 2차 항체(Cell Signaling Technology)를 사용하였고, 그 다음으로 enhanced chemiluminescence (ECL; Pierce, Thermo Fisher Scientific) 및 자가방사선촬영을 통해 단백질을 검출하였다. β-actin은 내인성 내부 대조군으로 사용되었으며 이에 대한 항체(Sigma-Aldrich)를 사용하여 검출되었다. 면역블롯 분석에 사용된 1차 항체는 Mitf, Tyrosinase, Tyrp-1, Tyrp-2, p38 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), p-PKA (Thr198), CREB, p-CREB (Ser133), ERK, p-ERK (Thr202/Tyr204), p-p38(Thr180/Tyr182), JNK, p-JNK(Thr183/Tyr185)(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 및 PKA (Abcam, 케임브리지, 영국)에 대한 항체였다.
8. 실시간 정량 PCR (real-time quantitative PCR, RT-qPCR)
mRNA 수준의 변화는 RT-qPCR을 사용하여 측정되었다. 총 RNA는 제조업체의 지침에 따라, TRIzol 시약(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 준비했다. cDNA는 M-MLV 역전사효소(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 합성되었다. 실시간 정량 PCR은 HOT FIREPol EvaGreen PCR Mix Plus(Solis BioDyne, Estonia) 및 StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수행되었다. 프라이머 서열은 다음과 같다: 인간 COL1A1 정방향 5'-AGGGCCAAGACGAAGACATC-3', 역방향 5'-AGATACACGTCATCGCACAACA-3'; 인간 COL3A1 정방향 5'-GTTTTGCCCCGTATTATGGA-3', 역방향 5'-GGAAGTTCAGGATTGCCGTA-3'; 인간 MMP1 정방향 5'-TCTGACGTTGATCCCAGAGAGCAG-3', 역방향 5'-CAGGGTGACACCAGTGACTGCAC-3'; 인간 MMP3 정방향 5'-AGCAAGGACCTCGTTTTCATT-3', 역방향 5'-GTCAATCCCTGGAAAGTCTTCA-3'; Mitf 정방향 5'- AGAAGCTGGAGCATGCGAACC-3', 역방향, 5'-GTTCCTGGCTGCAGTTCTCAAG-3'; Tyrosinase 정방향 5'-ACACACTGGAAGGATTTGCC-3', 역방향 5'-GAGCGGTATGAAAGGAACCA-3'; Tyrp-1 정방향 5'-GATGTCTGCACTAGTGACTTG-3', 역방향 5'-CCTGATTGGTCCACCCTCAG-3'; Tyrp-2 정방향 5'-CGTGCTGAACAAGGAATGCT-3', 역방향 5'-GCATGTCCGGTTGAAGAAT-3'; β-actin 정방향 5'-GTATGGAATCCTGTGGCATC 3', 역방향 5'-AAGCACTTGCGGTGCACGAT-3'.
각 표적 유전자의 mRNA 발현은 β-actin으로 정규화되었고 상대적인 mRNA 정량화는 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 계산되었다.
9. 멜라닌 함량 측정
세포 내 멜라닌 함량은 NaOH 용해 완충액 및 450 nm에서의 흡광도에 의해 결정되었다. 간단히 말해서, 세포를 24시간 동안 100 nM의 알파-멜라닌세포 자극 호르몬(alpha-melanocyte stimulating hormone, α-MSH)의 존재 또는 부재하에 다양한 농도의 프로바이오틱 CMs으로 처리했다. 세포 펠렛(cell pellets)을 1시간 동안 60℃에서 1N NaOH 용해 완충액에 용해시켰다. 멜라닌 함량은 iMark 마이크로플레이트 리더(iMark microplate reader, Bio-Rad)를 이용하여 측정한 450 nm에서의 흡광도를 비교하여 측정하였다. 총 단백질은 Pierce BCA 단백질 분석 키트(Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정되었다. 상대적인 멜라닌 함량은 총 단백질 농도를 사용하여 표준 곡선에서 계산되었다.
10. Mushroom tyrosinase 활성 측정
시험관 내 tyrosinase 활성을 측정하기 위해 100 U/mL mushroom tyrosinase 및 1 mM L-DOPA 용액을 96-웰 플레이트에 첨가하고 0.1 M 인산나트륨 완충액(pH 6.8)에서 다양한 농도의 프로바이오틱 CMs과 반응시켰다. 37℃에서 5분간 배양한 후 iMark 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad)를 이용하여 L-DOPA로부터 생성되는 도파크롬(dopachrome)의 양을 450 nm에서 흡광도 측정하여 tyrosinase 활성을 분석하였다.
11. 통계 분석
모든 실험 데이터는 평균 ± SD로 표시되며 스튜던트 t-검정을 사용하여 분석되었다. 모든 분석은 삼중으로 수행되었으며, p-값 < 0.05가 유의한 것으로 간주되었다.
실험 결과
1. 비피도박테리움 속(Bi) 및 락토바실러스 속(La) 균주 CM의 세포 내 ROS 소거 효과
ROS는 세포 에너지 생성을 위한 정상적인 대사과정에서 생성되지만 비정상적인 자외선 조사량은 피부 광노화의 주요 원인 중 하나인 ROS 생성 수준을 증가시킨다. 따라서, 먼저 정상 인간 진피 섬유아세포(NHDFs)에서 UV에 의해 유도되는 ROS 생성에 대한 비피도박테리움 속(Bi) 및 락토바실러스 속(La) 균주 CM의 억제 효과를 조사했다. 세포에 대한 CM의 처리 용량을 설정하기 위해, NHDFs에 다양한 용량(1-100 μg/mL)의 CMs을 24시간 동안 처리한 후 WST-1 기반 세포 생존능 분석을 통해 CM의 무독성 용량을 평가했다.
도 1에서 도시된 바와 같이, LBP 균주의 pHO와 pHX CMs의 처리 용량은 세포 생존능에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 다른 균주의 pHO와 pHX CM 사이에서 다른 세포독성이 나타났다. 이러한 결과는 CM의 조성이 성장 조건에서 다른 pH에 의해 잠재적으로 변경되었음을 시사했다. 이러한 결과에서 각 CM의 무독성 용량이 추가 실험을 위해 선택되었다.
다음으로, CMs의 세포 내 ROS 소거 효과를 조사하기 위해, NHDFs에 10 mJ/cm2 UVB를 조사하고 무독성 용량의 CMs을 처리한 후 DCF-DA를 사용하여 세포 내 ROS를 측정하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, UV 광선은 세포의 ROS 수준을 상당히 증가시켰다. 그러나, 이 값은 모든 CM-처리 그룹에서 감소했다. 흥미롭게도, BBL pHX, BBAL pHO 및 LBP pHO의 CM 100 μg/mL은 UV 조사된 NHDFs의 ROS 수준과 비교하여 세포 ROS 수준을 각각 72%, 54% 및 59% 감소시켰다. 다른 CMs은 세포의 ROS 수준을 10~30% 감소시켰다. 이러한 결과는 CMs이 NHDFs에서 UV 광선에 의해 유도되는 세포 ROS 생성에 대한 억제 효과를 나타냄을 시사한다.
2. UV 조사된 NHDFs에 대한 비피도박테리움 속(Bi) 및 락토바실러스 속(La) 균주 CM의 보호 효과
UV에 의해 유도되는 ROS 생성은 콜라겐 및 MMP 발현의 조절장애를 통해 ECM 분해를 유발할 수 있다. 따라서, 상기 결과가 UV 조사된 세포 손상에 대한 보호 기능과 관련이 있는지 여부를 추가로 테스트했다. NHDFs에 10 mJ/cm2 UVB를 조사하고 24시간 동안 CMs으로 처리했다. 세포 생존능의 변화를 조사하기 위해, WST-1 분석을 수행했다. 도 3에 도시된 바와 같이, UV 광선은 생존능을 54 ± 0.84%로 상당히 감소시켰다. 그러나, 상기 결과는 CMs 처리에 의해 회복되었다. 흥미롭게도, BBL pHO (10 μg/mL) 및 pHX (100 μg/mL)의 CMs은 UVB-매개 세포 생존능 손실을 각각 13% 및 21%만큼 현저하게 회복시켰다. 또한, BBAL pHO 및 LBP pHX의 100 μg/mL CMs은 세포 생존능 손실을 각각 18% 및 23% 회복시켰다. 다른 CMs은 회복 효과를 유의하게 나타내지 않았다.
다음으로, 세포 생존능에서의 UV 보호 기능이 UV로 인한 ECM 분해에 대한 보호와 잠재적으로 관련이 있는지 여부를 추가로 테스트했다. UVB 조사된 NHDFs에서 BBL pHO 와 pHX, BBAL pHO 및 LBP pHX의 CMs으로 처리한 후, 총 RNA를 분리하고 콜라겐 유전자(COL1A1 및 COL3A1) 및 MMP 유전자(MMP1 및 MMP3)의 발현 수준을 RT-qPCR 실험을 이용하여 분석했다. 도 4에 도시된 바와 같이, UVB 조사는 대조군에 비해 COL1A1 및 COL3A1 발현을 유의하게 감소시켰다. 그러나, BBL pHO (10 μg/mL) 및 pHX (100 μg/mL)의 CMs으로 처리하면 UVB에 의해 유도되는 COL1A1 및 COL3A1 하향조절이 회복되었다. 또한, CMs은 UVB에 의해 유도되는 MMP1 및 MMP3 상향조절을 유의하게 감소시켰다. 유사한 결과가 BBAL pHO CM 처리된 NHDFs에서 나타났으나, LBP pHX CM 처리된 세포에서는 나타나지 않았다. 이러한 결과는 BBL pHO 와 pHX, 및 BBAL pHO의 CMs이 NHDFs에서 세포 생존능 및 콜라겐과 MMP 유전자의 발현을 조절함으로써 UV 보호 효과를 나타냄을 시사한다.
3. 멜라닌 생성에 대한 비피도박테리움 속(Bi) 및 락토바실러스 속(La) 균주 CM의 억제 효과
피부 과색소침착은 노화 과정 중 하나로 주로 자외선에 의해 유발된다. 따라서, CMs이 인간 표피 멜라닌세포에서 UV에 의해 유도되는 멜라닌 생성에 억제 효과가 있는지 여부를 테스트했다. 먼저, 멜라닌 생성의 주요 대사 효소인 tyrosinase 효소 활성의 억제 효과를 평가하기 위해 수행하였다. Mushroom tyrosinase와 그 기질인 L-DOPA를 CMs (1~100 μg/mL)과 함께 배양하고 L-DOPA로부터 생성되는 도파크롬(dopachrome)의 양을 측정하여 tyrosinase 활성 억제 효과를 분석하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, BBL의 CMs은 tyrosinase 활성에 대한 억제 효과가 없었다. 그러나, BBAL의 CMs은 용량-의존적 방식으로 tyrosinase 활성의 유의한 감소를 보여주었다. 특히, BBAL pHO의 CM은 tyrosinase 활성 억제율을 약 40%까지 증가시켰다. 그러나, BBAL pHX의 CM 처리 그룹의 tyrosinase 활성 억제율은 최대 30%로 나타났으며, 이는 BBAL pHO의 CM이 BBAL pHX의 CM보다 tyrosinase 활성에 대한 억제율이 더 우수함을 나타낸다. 다른 그룹에서는 LBP pHX가 아닌 LBP pHO의 CM이 용량-의존적 방식으로 tyrosinase 활성의 억제 효과를 보였다. LU4 및 LBC의 CM 처리 그룹에 대해서도 tyrosinase 활성 억제 효과가 관찰되었지만, 용량-의존적인 tyrosinase 활성 억제 효과가 나타나지 않았다.
Tyrosinase 활성에 대한 억제 효과를 나타내지 않은 BBL 및 LBR CMs을 제외한 CMs을 처리한 후 멜라닌세포의 멜라닌 양을 평가하여 시험관 내 분석 결과를 추가로 확인했다. 먼저, WST-1 분석을 수행하여 CMs의 처리 용량을 B16F10 흑색종 세포로 설정했다(데이터는 표시되지 않음). 각 CM의 무독성 용량을 사용하여 멜라닌 합성의 주요 자극 인자인 α-MSH로 자극된 세포에서 24시간 처리 후 세포 내 멜라닌 함량을 정량화했다. 도 6에 도시된 바와 같이, BBAL pHO와 pHX의 CM 처리 그룹은 멜라닌 함량의 유의한 감소를 보였다. 그러나, 다른 그룹은 멜라닌 함량의 하향조절에 낮은 영향을 나타내었다. 종합하면, 이러한 결과는 BBAL의 CM이 우수한 멜라닌 생성 억제 효과가 있음을 시사한다.
4. PKA 및 ERK 경로의 하향조절을 통한 BBAL CM의 항-색소침착(미백) 효과
도 5 및 6의 결과는 단지 흑색종 세포에서 시험관 내 tyrosinase 활성 및 멜라닌 함량에 대한 BBAL CM의 억제 효과를 보여주었다. 이러한 결과를 확인하기 위해 억제 기전을 추가로 조사했다. α-MSH로 자극된 세포에서 무독성 용량의 BBAL pHO의 CM을 처리한 후 면역블롯 및 RT-qPCR 분석을 수행했다. 도 7에 도시된 바와 같이, α-MSH 자극은 tyrosinase, TYPR-1 및 TYRP-2 단백질뿐만 아니라 mRNA 수준을 상향조절하였다. 그러나, BBAL pHO의 CM은 용량-의존적 방식으로 α-MSH 자극에 의해 상향조절된 tyrosinase, TYPR-1 및 TYRP-2 단백질뿐만 아니라 mRNA 수준을 모두 감소시켰다.
MITF는 상기 유전자의 주요 전사 인자로 알려져 있다. 따라서, 상기 MITF의 발현 수준을 추가로 분석했다. 분석한 결과, MITF의 단백질과 mRNA 수준이 BBAL pHO의 CM에 의해 유의하게 하향조절되었음을 나타내었다. 이러한 결과는 BBAL pHO의 CM의 항-색소침착(미백) 효과가 세포내에서 MITF 발현의 하향조절에 의해 매개됨을 시사한다.
MITF 발현의 조절은 'cAMP 매개 PKA/CREB 신호 전달'과 같은 특정 경로에 의해 매개되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이러한 가능성을 추가로 테스트했으며, 면역 블롯 분석 결과는 BBAL pHO의 CM 처리에 의해 PKA 및 CREB 단백질의 인산화 수준을 현저하게 하향조절했으나, 총 단백질 수준에서는 용량-의존적 방식으로 하향조절하지 않았다(도 8a 및 8b).
또한, MAPK 키나아제(kinase) 활성의 효과에 대한 다른 가능성을 테스트했다. CREB 단백질의 인산화가 멜라닌 생성에서 PKA-독립적 방식으로 ERK에 의해 유도될 수 있기 때문이다. 도 8c에 도시된 바와 같이, α-MSH 자극은 ERK에서 인산화의 상향조절을 유도했으나, p38과 JNK에서는 그렇지 않았다. 그러나, BBAL pHO의 CM은 용량-의존적 방식으로 ERK의 인산화 수준을 감소시켰다.
종합하면, 이러한 결과는 BBAL pHO의 CM에 의한 항-색소침착(미백) 효과는 멜라닌세포에서 PKA- 및 ERK-매개 CREB 경로의 조절에 의해 나타날 수 있음을 시사한다.
5. BBAL CM의 화학 성분 분석
관련 연구에서 각 성분의 정확한 화학적 조성과 생물학적 효과가 완전히 밝혀지지 않았지만 프로바이오틱스의 CMs에서 알려진 발견 중 하나는 단쇄 지방산과 같은 여러 대사 산물, 분비 단백질, 세포외소포체 및 박테리오신의 생성이다. 따라서, 특히 BBAL pHO의 CM에서 어떤 성분이 분포되어 있는지 추가로 분석했다. 상기 CM이 본 발명의 테스트한 결과에서 가장 우수한 항노화 효과를 보였기 때문이다. 상기 CM의 화학 성분을 더 잘 제시하고자, BBAL pHO와 pHX의 CM 사이의 유기산 조성을 비교했다.
HPLC 분석은 두 CM에서 알려지지 않은 3개의 피크, 젖산(lactic acid), 포름산(formic acid) 및 아세트산(acetic acid)를 포함한 여섯개의 다른 피크를 나타내었다(도 9). 주목할 만한 사실은 알려지지 않은 첫번째 및 여섯번째 피크(피크 a 및 c)의 양은 BBAL pHO와 pHX의 CM 사이에서 변하지 않았다.
그러나, 알려지지 않은 두번째 피크(피크 b)의 양과 3개의 유기산은 BBAL pHX의 CM에 있는 양과 비교하여 BBAL pHO의 CM에서 현저하게 증가했다. 특히, 피크 b의 성분의 양은 pHX 샘플의 값과 비교하여 pHO 샘플에서 X배만큼 증가하였다. 또한, 젖산, 포름산 및 아세트산의 양은 pHX 샘플의 값과 비교하여 pHO 샘플에서 각각 약 8.9배, 4.3배 및 2.9배 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 상기 증가된 성분들이 항노화 효과와 관련이 있을 수 있음을 시사한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 비피도박테리움 애니말리스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)로 이루어진 군 중에서 적어도 1종 이상의 균주 배양여과물을 포함하는 항노화 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 비피도박테리움 애니말리스 락티스 균주 배양여과물을 포함하고, 비피도박테리움 롱굼, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노수스 및 락토바실러스 카제이로 이루어진 군 중에서 적어도 1종 이상의 균주 배양여과물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항노화 화장료 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 비피도박테리움 롱굼 균주 배양여과물을 포함하고, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노수스 및 락토바실러스 카제이로 이루어진 군 중에서 적어도 1종 이상의 균주 배양여과물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항노화 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 균주 배양여과물은 이눌린(inulin) 및 폴리덱스트로스(polydextrose)를 포함하는 배지에서 균주를 배양하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 항노화 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 비피도박테리움 애니말리스 락티스 균주는 비피도박테리움 애니말리스 락티스 (KCTC 11904BP)인 것을 특징으로 하는 항노화 화장료 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 비피도박테리움 롱굼 균주는 비피도박테리움 롱굼 (KCTC 12200BP)인 것을 특징으로 하는 항노화 화장료 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 락토바실러스 플란타룸 균주는 락토바실러스 플란타룸 (KCTC 10782BP)인 것을 특징으로 하는 항노화 화장료 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 락토바실러스 람노수스 균주는 락토바실러스 람노수스 (KCTC 12202BP)인 것을 특징으로 하는 항노화 화장료 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 락토바실러스 카제이 균주는 락토바실러스 카제이 (KCTC 12398BP)인 것을 특징으로 하는 항노화 화장료 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117625498A (zh) * 2024-01-10 2024-03-01 广州集妍化妆品科技有限公司 长双歧杆菌婴儿亚种的滤液的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100302504B1 (ko) * 1998-12-12 2001-09-22 이세복 유산균발효액및이를함유하는화장료조성물
US20100061967A1 (en) * 2006-01-27 2010-03-11 Nina Rautonen Use
KR20130115943A (ko) * 2012-04-13 2013-10-22 주식회사 알엔에이 유산균 파쇄물의 상등액을 포함하는 항 염증, 피부 미백 및 항 노화용 조성물
WO2020260200A1 (en) * 2019-06-24 2020-12-30 L'oreal Cosmetic composition comprising a bifidobacterium species lysate, an extract of yeast of the saccharomyces genus, and a monosaccharide and cosmetic uses thereof
KR102235470B1 (ko) * 2020-09-11 2021-04-05 주식회사 다산씨엔텍 유산균주, 유산균 발효물 및 천연 추출물을 함유하는 항노화 화장료 조성물 및 그 제조방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210060801A (ko) 2019-11-19 2021-05-27 주식회사 사임당화장품 식물 복합 발효물을 유효성분으로 포함하는 항노화 화장료 조성물

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100302504B1 (ko) * 1998-12-12 2001-09-22 이세복 유산균발효액및이를함유하는화장료조성물
US20100061967A1 (en) * 2006-01-27 2010-03-11 Nina Rautonen Use
KR20130115943A (ko) * 2012-04-13 2013-10-22 주식회사 알엔에이 유산균 파쇄물의 상등액을 포함하는 항 염증, 피부 미백 및 항 노화용 조성물
WO2020260200A1 (en) * 2019-06-24 2020-12-30 L'oreal Cosmetic composition comprising a bifidobacterium species lysate, an extract of yeast of the saccharomyces genus, and a monosaccharide and cosmetic uses thereof
KR102235470B1 (ko) * 2020-09-11 2021-04-05 주식회사 다산씨엔텍 유산균주, 유산균 발효물 및 천연 추출물을 함유하는 항노화 화장료 조성물 및 그 제조방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HONG YOO KYUNG, AN SUNGKWAN, LEE YUN HEE, YANG SEUNG AH, YOON YOO KYUNG, LEE JOONIL, LEE GWASOO, CHUNG MYUNG JUN, BAE SEUNGHEE: "Potential anti-ageing effects of probiotic-derived conditioned media on human skin cells", ACTA PHARMACEUTICA, vol. 72, no. 3, 1 September 2022 (2022-09-01), pages 359 - 374, XP093080009, DOI: 10.2478/acph-2022-0027 *

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117625498A (zh) * 2024-01-10 2024-03-01 广州集妍化妆品科技有限公司 长双歧杆菌婴儿亚种的滤液的应用
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