WO2023140350A1 - 臓器の線維化抑制用医薬組成物 - Google Patents

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WO2023140350A1
WO2023140350A1 PCT/JP2023/001676 JP2023001676W WO2023140350A1 WO 2023140350 A1 WO2023140350 A1 WO 2023140350A1 JP 2023001676 W JP2023001676 W JP 2023001676W WO 2023140350 A1 WO2023140350 A1 WO 2023140350A1
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losartan
pharmaceutical composition
less
fibrosis
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PCT/JP2023/001676
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桃生 李
維立 古
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国立大学法人 長崎大学
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for suppressing organ fibrosis.
  • HSCs Hepatic stellate cells
  • hydrostatic pressure within the liver increases due to increased production of inflammatory cytokines and increased vascular permeability.
  • increased hydrostatic pressure in diseased livers may alter the properties of hepatic stellate cells through mechanotransduction and control the development and progression of hepatic fibrosis. Therefore, inhibition of mechanotransduction signaling to hepatic stellate cells is considered as an effective therapeutic strategy for liver fibrosis.
  • Angiotensin II receptor blockers such as losartan are known to prevent cardiac fibrosis by regulating mechanotransduction pathways such as Ras homolog family member A (RhoA) and its downstream effectors Rho associated protein kinase (ROCK) and myosin light chain (MLC) (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • RhoA Ras homolog family member A
  • ROCK Rho associated protein kinase
  • MLC myosin light chain
  • Losartan has been reported to effectively alleviate acute lung injury caused by mechanical stimulation and alleviate liver fibrosis caused by non-alcoholic steatohepatitis in rats (Non-Patent Documents 3 and 4).
  • the effects of angiotensin receptor antagonists on organ fibrosis and the mechanism thereof are still unclear.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition that effectively suppresses organ fibrosis.
  • a pharmaceutical composition for suppressing organ fibrosis which comprises an angiotensin II receptor antagonist as an active ingredient and is administered at a dose of 0.2 times or less the daily dose of the antihypertensive drug.
  • the pharmaceutical composition according to [1] above which is administered at a daily dose of 0.1 times or less as the antihypertensive drug.
  • the pharmaceutical composition according to [2] above which is administered at a daily dose of 0.05 times or less as the antihypertensive drug.
  • angiotensin II receptor antagonist is a compound selected from the group consisting of losartan, candesartan, valsartan, telmisartan, olmesartan, irbesartan and azilsartan, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the angiotensin II receptor antagonist is losartan.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition that effectively suppresses organ fibrosis.
  • FIG. 2 shows the procedure for producing a model mouse with partial inferior vena cava ligation.
  • FIG. 3 shows the results of measuring the body weight and organ weight of mice to which low-dose losartan was orally administered for 8 weeks after partial inferior vena cava ligation surgery, where (A) is the body weight, (B) is the liver/body weight ratio, and (C) is the spleen/body weight ratio.
  • FIG. 1 shows the results of measuring AST and ALT in serum collected from mice orally administered with a low dose of losartan for 8 weeks after partial inferior vena cava ligation surgery, where (A) is AST, (B) is ALT, and (C) is the ALT/AST ratio.
  • FIG. 1 shows the results of measuring AST and ALT in serum collected from mice orally administered with a low dose of losartan for 8 weeks after partial inferior vena cava ligation surgery, where (A) is AST, (B) is ALT, and (C) is the ALT/AST ratio
  • FIG. 1 shows the results of Masson's trichrome staining of liver tissue of mice orally administered with a low dose of losartan for 8 weeks after partial inferior vena cava ligation surgery
  • (A) is a representative stained image of each group (scale bar is 500 ⁇ m)
  • (B) is the result of comparing the ratio of Masson's trichrome-stained positive regions in each group by image analysis.
  • FIG. 1 shows the results of observation of apoptotic cells in the liver tissue of mice to which low-dose losartan was orally administered for 8 weeks after partial inferior vena cava ligation surgery, (A) is a representative TUNEL-stained image of each group, and (B) is the result of comparing the ratio of TUNEL-positive areas by image analysis.
  • FIG. 1 shows the results of ⁇ -SMA immunostaining in liver tissue of mice to which low-dose losartan was orally administered for 8 weeks after partial inferior vena cava ligation surgery.
  • FIG. 1 shows the results of RhoA immunostaining in liver tissue of mice orally administered with a low dose of losartan for 8 weeks after partial inferior vena cava ligation surgery, (A) is a representative RhoA immunostaining image of each group, and (B) is the result of comparing the intensity of RhoA expression signals by image analysis.
  • FIG. 1 shows the results of ROCK1 immunostaining in liver tissue of mice to which low-dose losartan was orally administered for 8 weeks after partial inferior vena cava ligation surgery, (A) is a representative ROCK1 immunostaining image of each group, and (B) is the result of comparing the intensity of ROCK1 expression signals by image analysis.
  • FIG. 1 shows the results of RhoA immunostaining in liver tissue of mice orally administered with a low dose of losartan for 8 weeks after partial inferior vena cava ligation surgery, (A) is a representative ROCK1 immunostaining image of each group, and (B) is the result of
  • FIG. 1 shows the results of ROCK2 immunostaining in liver tissue of mice to which low-dose losartan was orally administered for 8 weeks after partial inferior vena cava ligation surgery
  • (A) is a representative ROCK2 immunostaining image of each group
  • (B) is the result of comparing the intensity of ROCK2 expression signals by image analysis.
  • FIG. 1 shows the results of p-MLC2 immunostaining in the liver tissue of mice orally administered with a low dose of losartan for 8 weeks after partial inferior vena cava ligation surgery
  • (A) is a representative p-MLC2 immunostaining image of each group
  • (B) is the result of comparing the intensity of p-MLC2 expression signals by image analysis.
  • FIG. 3 shows the results of RT-qPCR of AT1R, ACTA2, TGFB1 and COL1A1 in an ex vivo hydrostatic pressure test of human hepatic stellate cells, where (A) is AT1R, (B) is ACTA2, (C) is TGFB1 and (D) is COL1A1.
  • FIG. 2 shows the results of AT1R immunohistochemistry in an ex vivo hydrostatic pressure test of human hepatic stellate cells, showing representative AT1R immunostaining images of each group.
  • (A) is a representative image of ⁇ -SMA immunostaining for each group (scale bar: 30 ⁇ m), and (B) is the result of comparing the intensity of ⁇ -SMA expression signals by image analysis.
  • Immunohistochemistry results for TGF- ⁇ 1 in an ex vivo hydrostatic pressure test of human hepatic stellate cells.
  • (A) is a representative TGF- ⁇ 1 immunostained image of each group (scale bar: 30 ⁇ m)
  • (B) is the result of comparing the intensity of TGF- ⁇ 1 expression signals by image analysis.
  • Immunohistochemistry results for type 1 collagen in an ex vivo hydrostatic pressure test of human hepatic stellate cells.
  • FIG. 2 shows the results of RT-qPCR of RhoA, ROCK1 and ROCK2 in an ex vivo hydrostatic pressure test of human hepatic stellate cells, where (A) is the result of RhoA, (B) is the result of ROCK1, and (C) is the result of ROCK2.
  • RhoA immunohistochemistry results in an ex vivo hydrostatic pressure test of human hepatic stellate cells
  • (A) is a representative RhoA immunostaining image of each group (scale bar is 30 ⁇ m)
  • (B) is the result of comparing the intensity of RhoA expression signals by image analysis.
  • ROCK1 immunohistochemistry results in an ex vivo hydrostatic pressure test of human hepatic stellate cells.
  • A) is a representative ROCK1 immunostained image of each group (scale bar: 30 ⁇ m)
  • (B) is the result of comparing the intensity of ROCK1 expression signals by image analysis.
  • ROCK2 immunohistochemistry results in an ex vivo hydrostatic pressure test of human hepatic stellate cells.
  • FIG. 2 shows a procedure for producing a unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis model mouse.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the body weight of mice before surgery for unilateral ureteral obstruction and 1 week and 2 weeks after surgery.
  • FIG. 2 shows images of the left and right kidneys of mice orally administered with low and high doses of losartan for 2 weeks after surgery for unilateral ureteral obstruction and mice without losartan administration.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of measuring BUN and CRE in serum collected from mice orally administered with low and high doses of losartan for 2 weeks and mice not administered losartan, where (A) is the result of BUN and (B) is the result of CRE.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for suppressing organ fibrosis (hereinafter referred to as "the pharmaceutical composition of the present invention") containing an angiotensin II receptor antagonist as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is characterized in that it is used at a dose lower than that of an angiotensin II receptor antagonist as an antihypertensive drug.
  • the daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is lower than the daily dose of the angiotensin II receptor antagonist as an antihypertensive drug, but may be 0.2 times or less, 0.1 times or less, 0.05 times or less, 0.04 times or less, 0.03 times or less, or 0.02 times or less than the daily dose of the angiotensin II receptor antagonist as an antihypertensive drug.
  • Angiotensin II receptor antagonist is also called “angiotensin receptor antagonist", “angiotensin receptor blocker”, and “ARB”.
  • Angiotensin II receptor antagonists are widely used clinically as antihypertensive drugs (antihypertensive drugs).
  • the antihypertensive effect of angiotensin II receptor antagonists is expressed by blocking the binding between angiotensin II and AT1 receptors by binding angiotensin II receptor antagonists to angiotensin II type 1 receptors (AT1 receptors).
  • the angiotensin II receptor antagonist is not particularly limited as long as it is a compound having the above action, and examples include losartan, candesartan, valsartan, telmisartan, olmesartan, irbesartan, azilsartan, and pharmaceutically acceptable salts thereof. Losartan or a pharmaceutically acceptable salt thereof is preferred.
  • the pharmaceutical composition of the invention may contain two or more angiotensin II receptor antagonists.
  • the "pharmaceutically acceptable salt” is not particularly limited as long as it forms a salt that does not affect the activity of the angiotensin II receptor antagonist.
  • salts with inorganic acids such as sulfuric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid, and nitric acid
  • organic acids such as acetic acid, oxalic acid, lactic acid, tartaric acid, fumaric acid, maleic acid, citric acid, benzenesulfonic acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, benzoic acid, camphorsulfonic acid, ethanesulfonic acid, glucoheptonic acid, gluconic acid, glutamic acid, glycolic acid, malic acid, malonic acid, mandelic acid, galactaric acid, and naphthalene-2-sulfonic acid; salts, salts with one or more metal ions such as lithium ions, sodium ions, potassium ions,
  • Losartan is a compound with the following structure and is well known as an active ingredient of antihypertensive drugs. Its potassium salt, losartan potassium, has been approved as an ethical drug in Japan and listed in drug prices. The Japanese Pharmacopoeia lists losartan potassium and losartan potassium tablets.
  • Candesartan is a compound with the following structure and is well known as an active ingredient of antihypertensive drugs.
  • Candesartan cilexetil candesartan cilexetil ester
  • Candesartan cilexetil and candesartan cilexetil tablet are listed in the Japanese Pharmacopoeia.
  • Valsartan is a compound with the following structure and is well known as an active ingredient of antihypertensive drugs. Valsartan has been approved as an ethical drug in Japan and is listed on the drug price list. Valsartan and valsartan tablets are listed in the Japanese Pharmacopoeia.
  • Telmisartan is a compound with the following structure and is well known as an active ingredient of antihypertensive drugs. Telmisartan has been approved as an ethical drug in Japan and is listed on the drug price list. Telmisartan and telmisartan tablets are listed in the Japanese Pharmacopoeia.
  • Olmesartan is a compound having the following structure and is well known as an active ingredient of antihypertensive drugs.
  • Olmesartan medoxomil (medoxomil ester of olmesartan), a prodrug of olmesartan, has been approved as an ethical drug in Japan and listed in the National Health Insurance drug price list.
  • Olmesartan medoxomil and olmesartan medoxomil tablets are listed in the Japanese Pharmacopoeia.
  • Irbesartan is a compound having the following structure and is well known as an active ingredient of antihypertensive drugs. Irbesartan has been approved as an ethical drug in Japan and is listed on the drug price list. Irbesartan and irbesartan tablets are listed in the Japanese Pharmacopoeia.
  • Azilsartan is a compound having the following structure and is well known as an active ingredient of antihypertensive drugs. Azilsartan has been approved as an ethical drug in Japan and is listed in the NHI drug price list. Azilsartan and azilsartan tablets are listed in the Japanese Pharmacopoeia.
  • the daily dosage is 25 mg to 100 mg (see the package insert of Neurotan (registered trademark) tablets (Organon Co., Ltd.)). Therefore, when losartan or losartan potassium is used as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention for suppressing organ fibrosis, the daily dose may be 20 mg or less, 10 mg or less, 5 mg or less, 2.5 mg or less, 2.0 mg or less, 1.5 mg or less, 1.25 mg or less, 1.0 mg or less, 0.75 mg or less, and 0.5 mg or less. The lower limit is not limited as long as the effect of suppressing organ fibrosis is exhibited.
  • the daily dose is 4 mg to 12 mg (see the package insert of Probreath (registered trademark) tablets (Takeda Pharmaceutical Company Limited)). Therefore, when candesartan or candesartan cilexetil is used as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention for suppressing organ fibrosis, the daily dose may be 2.4 mg or less, 1.2 mg or less, 1.0 mg or less, 0.8 mg or less, 0.6 mg or less, 0.4 mg or less, 0.2 mg or less, 0.1 mg or less, and 0.08 mg or less.
  • the lower limit is not limited as long as the effect of suppressing organ fibrosis is exhibited.
  • the daily dose is 40 mg to 160 mg (see the package insert of Diovan (registered trademark) tablets (Novartis Pharma Co., Ltd.)). Therefore, when valsartan is used as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention for suppressing organ fibrosis, the daily dose may be 32 mg or less, 16 mg or less, 8 mg or less, 5 mg or less, 4 mg or less, 3 mg or less, 2 mg or less, 1 mg or less, and 0.8 mg or less. The lower limit is not limited as long as the effect of suppressing organ fibrosis is exhibited.
  • telmisartan for hypertensive patients is 20 mg to 80 mg (see the package insert of Micardis (registered trademark) tablets (Nippon Boehringer Ingelheim Co., Ltd.)). Therefore, when telmisartan is used as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention for suppressing organ fibrosis, the daily dose may be 16 mg or less, 8 mg or less, 4 mg or less, 2 mg or less, 1.6 mg or less, 1 mg or less, 0.8 mg or less, 0.6 mg or less, and 0.4 mg or less.
  • the lower limit is not limited as long as the effect of suppressing organ fibrosis is exhibited.
  • the daily dose is 5 mg to 40 mg (see the package insert of Olmetec (registered trademark) tablets (Daiichi Sankyo Co., Ltd.)). Therefore, when olmesartan or olmesartan medoxomil is used as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention for suppressing organ fibrosis, the daily dose may be 4 mg or less, 3 mg or less, 2 mg or less, 1 mg or less, 0.8 mg or less, 0.5 mg or less, 0.25 mg or less, 0.2 mg or less, or 0.1 mg or less. The lower limit is not limited as long as the effect of suppressing organ fibrosis is exhibited.
  • the daily dosage is 50 mg to 200 mg (see the package insert of Avapro (registered trademark) tablets (Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.)). Therefore, when irbesartan is used as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention for suppressing organ fibrosis, the daily dose may be 40 mg or less, 20 mg or less, 10 mg or less, 5 mg or less, 4 mg or less, 3 mg or less, 2.5 mg or less, 2 mg or less, 1.5 mg or less, or 1 mg or less. The lower limit is not limited as long as the effect of suppressing organ fibrosis is exhibited.
  • the daily dose is 20 mg to 40 mg (see the package insert of Asilva (registered trademark) tablets (Takeda Pharmaceutical Company Limited)). Therefore, when azilsartan is used as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention for suppressing organ fibrosis, the daily dose may be 8 mg or less, 4 mg or less, 2 mg or less, 1 mg or less, 0.8 mg or less, 0.6 mg or less, 0.5 mg or less, and 0.4 mg or less.
  • the lower limit is not limited as long as the effect of suppressing organ fibrosis is exhibited.
  • the pharmaceutical composition of the present invention exerts an effect of suppressing organ fibrosis.
  • fibrosis includes being in a fibrosis state, transitioning to a fibrosis state, and developing, progressing, or exacerbating fibrosis. Since biomechanics exist in all tissues and organs and exhibit dynamic changes, target organs are not particularly limited, and any organ that can develop fibrosis is a target organ for the pharmaceutical composition of the present invention. Examples include liver, kidney, heart, lung, stomach, intestine, skeletal muscle, and skin. Liver, kidney and heart are preferred, liver and kidney are more preferred, and liver is particularly preferred.
  • Fibrosis of an organ to which the pharmaceutical composition of the present invention is applied may be fibrosis caused by changes in biomechanics such as hydrostatic pressure, osmotic pressure, tensile stress, and compressive stress within the organ.
  • Fibrosis caused by changes in biomechanics in organs is a pathological condition in which, when abnormal changes (increase or decrease) in hydrostatic pressure, osmotic pressure, tensile stress, compressive stress, etc. occur, various cells sense the mechanical changes and, through the activation of various biological signal pathways, produce excessive extracellular matrix from tissue cells and locally accumulate it as fibrotic tissue.
  • Fibrosis caused by changes in biomechanics to which the pharmaceutical composition of the present invention is applied may be fibrosis caused by changes in hydrostatic pressure within an organ.
  • Diseases associated with fibrosis due to changes in hydrostatic pressure within organs include liver failure, heart failure, renal failure, pulmonary fibrosis, myofibrosclerosis, skin scar formation, and the like.
  • Diseases accompanied by fibrosis caused by changes in tensile or compressive stress in organs include scarring of the skin, fibrosis of myocardial tissue, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains an angiotensin II receptor antagonist as an active ingredient, and can be formulated by appropriately blending pharmaceutically acceptable carriers or additives according to known methods for manufacturing pharmaceutical preparations (for example, methods described in the Japanese Pharmacopoeia). Specifically, for example, tablets (including sugar-coated tablets, film-coated tablets, sublingual tablets, orally disintegrating tablets, buccal tablets, etc.), pills, powders, granules, capsules (including soft capsules and microcapsules), lozenges, syrups, liquids, emulsions, suspensions, controlled-release preparations (e.g., rapid-release preparations, sustained-release preparations, sustained-release microcapsules, etc.), aerosols, films (e.g., orally disintegrating films, oral mucosal patch films, etc.), injections (e.g., skin lower injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, etc.), drops, transdermal preparations, ointments
  • the mixing ratio of the carrier or additive can be appropriately set based on the range normally employed in the pharmaceutical field.
  • Carriers or additives that can be incorporated are not particularly limited, but include various carriers such as water, physiological saline, other aqueous solvents, and aqueous or oily bases; excipients, binders, pH adjusters, disintegrants, absorption enhancers, lubricants, coloring agents, flavoring agents, and various additives such as perfumes.
  • Additives that can be mixed with tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, cornstarch, tragacanth, and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, swelling agents such as cornstarch, gelatin, and alginic acid, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose, or saccharin, and flavoring agents, such as peppermint, akamono oil, or cherries.
  • the dosage unit form is a capsule, the above type of material may further contain a liquid carrier such as oil.
  • Sterile compositions for injection can be prepared according to conventional formulation procedures (eg, dissolving or suspending the active ingredient in a solvent such as water for injection, natural vegetable oil, etc.).
  • Aqueous solutions for injection include, for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (e.g., D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.), and the like, and may be used in combination with suitable solubilizing agents, such as alcohols (ethanol, etc.), polyalcohols (propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (polysorbate 80, HCO-50, etc.), and the like.
  • suitable solubilizing agents such as alcohols (ethanol, etc.), polyalcohols (propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (polysorbate 80, HCO-50, etc.), and the like.
  • suitable solubilizing agents such as alcohols (ethanol, etc.), polyalcohols (propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (polysorbate 80, HCO-50, etc.), and the like.
  • phosphate buffers sodium acetate buffers, etc.
  • soothing agents e.g., benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers e.g., human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives e.g., benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants etc.
  • the angiotensin II receptor antagonist which is the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, has already been used clinically for many years, so it can be safely administered to humans and other mammals (for example, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the content of the active ingredient in the formulation varies depending on the dosage form, administration method, carrier, etc., but is usually 0.01 to 100% (w/w) of the total amount of the formulation, and may be 0.1 to 95% (w/w).
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used to administer an angiotensin II receptor antagonist, which is an active ingredient, at a dose lower than the original dose of an antihypertensive drug. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can exhibit the advantageous effect of suppressing organ fibrosis at a dose that does not exhibit an antihypertensive effect or a dose that exhibits a moderate antihypertensive effect. Therefore, it is very advantageous in that it can be used safely even for subjects with blood pressure in the normal range to hypotension. In addition, it is thought that low doses have almost no effect on peripheral blood vessels and blood flow, and it is advantageous for long-term administration because it minimizes tissue and organ damage due to decreased local tissue blood flow that can occur at normal doses and toxic side effects caused by other drugs.
  • Example 1 Evaluation by partial inferior vena cava ligation model mouse
  • Materials and Methods (1) Animals C57BL/6 mice (10 weeks old, CLEA) were used. All animal experiments were approved by the Nagasaki University Animal Care and Use Committee and were performed in accordance with institutional guidelines.
  • Partial inferior vena cava ligation model and losartan treatment Partial inferior vena cava ligation was performed by the method described in Simonetto et al. (Hepatology 61: 648-659, 2015. doi: 10.1002/hep.27387.). The procedure for partial inferior vena cava ligation is shown in FIG. Anesthetized mice were subjected to laparotomy, and the falciform ligament was cut to expose the inferior vena cava (IVC) in the upper part of the liver (Fig. 1(A)). The inferior vena cava was isolated and a thin tube (diameter 0.9 mm) was placed along the anterior surface of the inferior vena cava (Fig. 1(B)).
  • IVC inferior vena cava
  • the tube was tightly ligated together with the inferior vena cava (Fig. 1(C)) and immediately gently pulled out (Fig. 1(D)).
  • the peritoneal muscle/fascia was sutured and the skin was closed. According to Simonetto et al., supra, removal of the 0.9 mm diameter tube ligated together with the inferior vena cava is expected to reduce the cross-sectional area of the inferior vena cava by approximately 80%.
  • the losartan group was given a final concentration of 2.3 mg/L of losartan (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as drinking water so that the estimated daily dose was 0.5 mg/kg.
  • the IVCL group was given non-medicated drinking water. Treatment continued until the end of the experiment.
  • the Sham group underwent surgery other than partial IVC ligation and was given non-medicated drinking water.
  • the present inventors investigated many documents reporting the results of experiments in which losartan was administered to experimental animals, and confirmed that most reports reported a daily dose of 3 to 30 mg/kg in rats and mice.
  • the present inventors set the dose of losartan at 0.5 mg/kg/day in this example so that the dose per day is sufficiently low compared to these conventional techniques.
  • the human equivalent dose (abbreviation: HED) of the test animal dose is estimated to be the dose that produces equivalent effects in humans mainly from the body surface area ratio between the test animal and human. HED can be determined by referring to "Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers" published by the U.S.
  • FDA Food and Drug Administration
  • human-equivalent doses are estimated using 12.3 for conversion between humans and mice unless there is particular comparative data. That is, the dose of 0.5 mg/kg/day of losartan to mice in this example is estimated to be equivalent to the dose of 0.04 mg/kg/day in humans. Therefore, the dose is much lower than the clinically recommended dose for hypertensive patients (recommended minimum dose is 20 mg/day for a 60 kg human).
  • mice were euthanized 8 weeks after surgery. Prior to euthanasia, animals were weighed and exsanguinated from the inferior vena cava and serum was separated to measure serum ALT and serum AST. After blood collection, the inferior vena cava above the liver was cut, and the liver was perfused with PBS via the portal vein to remove circulating blood and fibrinogen. Spleens and livers were harvested and weighed to calculate spleen/body weight and liver/body weight ratios. Liver tissue was fixed with 4% paraformaldehyde and embedded in paraffin blocks. Tissue sections approximately 5 ⁇ m thick were used for histological analysis.
  • Masson's trichrome staining Liver tissue sections were deparaffinized and rehydrated. Masson's Trichrome staining was performed using the Masson Trichrome staining kit (Sigma-Aldrich) according to the manufacturer's instructions and observed with a light microscope (IX71, Olympus).
  • mice body weight, organ weight and serum analysis
  • the body weight and organ weight results are shown in FIG. (A) Body weight 8 weeks after surgery, (B) liver/body weight ratio, and (C) spleen/body weight ratio.
  • the liver/body weight and spleen/body weight ratios were significantly higher in the IVCL group than in the Sham group, suggesting hepatic congestion and injury in mice that underwent partial inferior vena cava ligation.
  • the liver/body weight and spleen/body weight ratios of the losartan group remained similar to those of the Sham group.
  • Results of serum analysis are shown in FIG. (A) is AST, (B) is ALT, and (C) is the ALT/AST ratio. Serum ALT and serum AST were not significantly different between all groups.
  • FIG. 4 shows the results of Masson's trichrome staining of liver tissue.
  • A is a representative stained image of each group, with arrows indicating fibrotic regions.
  • B shows the results of comparing the ratio of Masson's trichrome-positive areas in each group by image analysis.
  • the liver tissue of the Sham group showed normal lobular architecture with little collagen deposition.
  • the fibrosis area was markedly increased, and the lobular structure surrounding the fibrosis area was clearly damaged.
  • the losartan group significantly reduced the fibrotic area compared with the IVCL group, and also effectively alleviated the structural changes in the lobules.
  • FIG. 5 shows the results of observing apoptotic cells in liver tissue.
  • A is a representative TUNEL-stained image of each group
  • B is the result of comparing the percentage of TUNEL-stained positive areas by image analysis. The percentage of apoptotic cells was significantly increased in the IVCL group compared to the Sham group, but there was no significant change in the losartan group.
  • FIG. 6 shows the results of ⁇ -SMA immunostaining of liver tissue.
  • ⁇ -SMA is a marker for activated hepatic stellate cells.
  • A is a representative ⁇ -SMA immunostained image of each group
  • B is the result of comparing the intensity of ⁇ -SMA expression signals by image analysis.
  • Expression of ⁇ -SMA was detected in a wider range of liver tissues in the IVCL group than in the Sham group, and a significant difference in signal intensity was observed between the two groups.
  • the losartan group significantly suppressed the expression of ⁇ -SMA, which increased in the IVCL group.
  • the results of RhoA immunostaining of liver tissue are shown in FIG. 7, the results of ROCK1 immunostaining of liver tissue are shown in FIG. 8, the results of ROCK2 immunostaining of liver tissue are shown in FIG. 9, and the results of p-MLC2 immunostaining of liver tissue are shown in FIG. 10, respectively.
  • (A) is a representative immunostained image of each group
  • (B) is the result of comparing the intensity of expression signals by image analysis.
  • HSC Human hepatic stellate cells
  • ScienCell Research Laboratories A stellate cell medium (ScienCell Research Laboratories) was used as a medium, and cells were grown in a humidified incubator at 37°C in 5% CO 2 , 95% air. Cells passaged 3 times were used for the following experiments.
  • a hydrostatic pressure of 50 mmHg was chosen based on preliminary experiments and previous reports (Yoshino et al., Commun Biol 3: 152, 2020; Chen et al., Int J Biol Sci 15: 2509-2521, 2019).
  • a hydrostatic pressure unloaded group was provided as a control group for each of the losartan-added group and the losartan-free group.
  • RT-qPCR RT-qPCR was performed to assess the expression of RHOA, ROCK1, ROCK2, ACTA2, TGFB1, COL1A1.
  • Total RNA was isolated from hepatic stellate cells using the Quick-RNA MicroPrep Kit, and 1.25 ⁇ g of RNA was reverse transcribed using the SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific). Quantitative PCR was performed using SYBR Green real-time PCR Master Mix (Toyobo). Reaction was performed with CFX96 real-time PCR System (BIO-RAD). The primer sequences are shown below. GAPDH was used for normalization.
  • RHOA Forward CAGAAAAGGGACCCCAGAA (SEQ ID NO: 1)
  • RHOA Reverse: GCAGCTGCTCTCGTAGCCATTTC SEQ ID NO: 2
  • ROCK1 Forward AACATGCTGCTGGATAAATCTGG (sequence number 3)
  • ROCK1 Reverse AGGAAGGCATGGTACGATGTGATACA
  • ROCK2 Reverse CCAGGGGCTATTGGCAAAGG (SEQ ID NO: 6)
  • ACTA2 Reverse: CTTTTCCATGTCGTCCCAGT SEQ ID NO: 8)
  • COL1A1 Forward CCCACCAATCACCTGCGTACAGA (sequence number 9)
  • COL1A1 Reverse TTCTTGGTCGGTGGGTGACTCTGA (SEQ ID NO: 10) SMAD2 Forward
  • FIG. 11 shows the results of RT-qPCR for AT1R, ACTA2, TGFB1 and COL1A1.
  • A AT1R
  • B ACTA2 (gene encoding ⁇ -SMA)
  • C TGFB1 (gene encoding TGF- ⁇ 1)
  • D COL1A1 (gene encoding type 1 collagen).
  • Gene expressions of AT1R, ACTA2, TGFB1 and COL1A1 were significantly elevated in the losartan-free hydrostatic pressure group compared to the hydrostatic pressure non-loading group.
  • FIGS. FIG. 12 shows representative immunostained images of each group
  • FIG. 13(A) shows the result of comparing the intensity of the AT1R expression signal in the cytoplasm by image analysis
  • FIG. 13(B) shows the result of comparing the intensity of the AT1R expression signal in the nucleus by image analysis
  • FIG. 13(C) shows the result of comparing the ratio of cytoplasmic signal intensity/nuclear signal intensity.
  • the expression of AT1R was significantly elevated at the protein level in the cytoplasm and nucleus.
  • FIG. 17 shows the results of RT-qPCR of RhoA, ROCK1 and ROCK2.
  • A is for RhoA
  • B is for ROCK1
  • C is for ROCK2.
  • RhoA and ROCK1 in the losartan-free hydrostatic pressure-loaded group was significantly elevated compared to the hydrostatic pressure-unloaded group.
  • the gene expression of RhoA and ROCK1 in the losartan-added hydrostatic pressure group showed no significant difference compared to the hydrostatic pressure-unloaded group, and significantly decreased compared to the losartan-free hydrostatic pressure group.
  • Gene expression of ROCK2 did not change significantly in the hydrostatic pressure group and the addition of losartan.
  • RhoA, ROCK1, and ROCK2 The results for RhoA, ROCK1, and ROCK2 are shown in FIG. 18, ROCK1, and ROCK2, respectively, in FIG. In both figures, (A) is a representative immunostained image of each group, and (B) is the result of comparing the intensity of expression signals by image analysis. Similar to the results of RT-qPCR, the expression of RhoA and ROCK1 was significantly increased at the protein level in the losartan-free hydrostatic pressure group.
  • FIG. (A) is a representative stained image of each group
  • (B) is the result of comparing the signal intensity of p-MLC2 by image analysis.
  • phalloidin staining of F-actin it was observed that the losartan-free group exhibited thick actin bundles and formed dense parallel networks.
  • the losartan-added hydrostatic pressure group effectively suppressed the formation of actin stress fibers.
  • the expression of p-MLC2 was significantly increased in the losartan-free hydrostatic pressure group.
  • p-MLC2 expression in the losartan-added hydrostatic pressure group was not significantly different from that in the hydrostatic pressure-unloaded group, and was significantly decreased compared to the losartan-free hydrostatic pressure group.
  • Example 3 Evaluation by unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis model mouse.
  • Materials and Methods (1) Unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis model and losartan-treated C57BL/6 mice (8 weeks old, CLEA) were used. A procedure for unilateral ureteral obstruction (UUO) is shown in FIG. Mice under general anesthesia were subjected to laparotomy and the left ureter was ligated. The right ureter was not ligated and the right kidney was used as a control. The peritoneum, muscle layer, and skin were sutured in one layer, and the wound was closed to close the abdomen.
  • UUO unilateral ureteral obstruction
  • the ligated kidney exhibits symptoms of hydronephrosis, and 3 days after UUO, interstitial fibrosis associated with interstitial deposition of type IV collagen and tubular cell apoptosis are observed.
  • the losartan low-dose group was given a final concentration of 4.6 mg/L of losartan (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as drinking water so that the estimated daily dose would be 1 mg/kg.
  • the losartan high-dose group was given a final concentration of 13.8 mg/L losartan in their drinking water for an estimated daily dose of 3 mg/kg. Drinking water to which losartan was not added was given to the losartan non-administered group.
  • Body weights were measured before surgery for unilateral ureteral obstruction and 1 week and 2 weeks after surgery. Mice were euthanized two weeks after surgery. Prior to euthanasia, whole blood was drawn from the inferior vena cava and serum was separated to measure serum BUN and serum CRE. After blood collection, the left and right kidneys were collected and photographed. Kidneys were fixed in 4% paraformaldehyde and embedded in paraffin blocks. Tissue sections approximately 5 ⁇ m thick were used for histological analysis.
  • Masson's trichrome staining and hematoxylin-eosin staining Tissue sections were deparaffinized and rehydrated. Masson's trichrome staining was performed using the Trichrome staining (Masson) kit (Sigma-Aldrich) according to the manufacturer's instructions. Matoxylin-eosin (HE) staining was performed according to a standard method. Tissue specimens were observed with an optical microscope (IX71, Olympus).
  • FIG. 23 shows the results of changes in body weight of mice in each group
  • FIG. 24 shows images of left and right kidneys excised from mice in each group. No significant change in body weight of mice was observed between groups at any time point of measurement.
  • the left kidney of the control group was dilated due to hydronephrosis, but the expansion of the left kidney of the losartan low-dose group and the losartan high-dose group was remarkably suppressed.
  • FIG. (A) is the result of BUN and (B) is the result of CRE. Both the BUN and CRE values in the losartan low-dose group and the losartan high-dose group were significantly decreased compared to the control group.
  • FIG. 25 shows the results of Masson's trichrome staining and HE staining of renal tissue.
  • A is a representative stained image of each group, with Masson's trichrome-stained images in the upper row and HE-stained images in the lower row.
  • the far left (CON) is the right kidney of the control group, the second from the left (UUO) is the left kidney of the control group.
  • B shows the results of comparing the percentage of Masson's trichrome-stained positive regions (arrows in the image of (A)) in each group by image analysis.

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Abstract

本発明は、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬を有効成分とし、１日あたり、降圧薬としての投与量の０．２倍以下で投与するように用いられることを特徴とする臓器の線維化抑制用医薬組成物を提供する。

Description

臓器の線維化抑制用医薬組成物
　本発明は、臓器の線維化抑制用医薬組成物に関するものである。
　一般に、慢性的な損傷や炎症を伴う肝臓で線維化が生じる。肝線維化の主要な細胞メディエーターは肝星細胞（hepatic stellate cell: HSC）であることがよく知られており、この細胞が活性化すると主要なコラーゲン産生細胞として機能する。したがって、肝線維化の予防や治療には、肝星細胞の活性を低下させることが有効なアプローチである。
　体内の細胞は、間質液が発生させる静水圧や細胞外マトリックスの蓄積によって生じる硬直などの周囲の様々な生体力学の動的変化を常に感知している。生体力学的刺激を受けた細胞が物理的な合図を生体反応に変換する分子過程はメカノトランスダクションと総称され、細胞の生物学的特性を変更するために基本的に重要である。
　病的な肝臓では、炎症性サイトカインの産生増加と血管透過性の亢進により、肝臓内の静水圧が上昇する。肝星細胞の生物学的特性は、周囲の微小環境におけるバイオメカニクスに大きく影響されるため、病的な肝臓における静水圧の上昇は、メカノトランスダクションを通して肝星細胞の特性を変更し、肝臓線維化の発生と進行を制御している可能性がある。したがって、肝星細胞へのメカノトランスダクションシグナル伝達の阻害は、肝線維化の有効な治療戦略として考えられる。
　ロサルタンなどのアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（ARB）は、Ras homolog family member A（RhoA）およびその下流のエフェクターであるRho associated protein kinase（ROCK）やmyosin light chain（MLC）などのメカノトランスダクション経路を調節して、心臓の線維化を防ぐことが知られている（非特許文献１、２）。ロサルタンは、ラットにおいて機械的刺激に起因する急性肺傷害を効果的に緩和し、非アルコール性脂肪肝炎に起因する肝線維化を緩和することが報告されている（非特許文献３、４）。しかし、アンジオテンシン受容体拮抗薬の臓器線維化に対する効果やそのメカニズムについては、未だ不明な点が多い。
Ma Z-G, Yuan Y-P, Wu H-M, Zhang X, Tang Q-Z. Cardiac fibrosis: new insights into the pathogenesis. Int J Biol Sci 14: 1645-1657, 2018. doi: 10.7150/ijbs.28103. Yamakawa T, Tanaka S, Numaguchi K, Yamakawa Y, Motley ED, Ichihara S, Inagami T. Involvement of Rho-kinase in angiotensin II-induced hypertrophy of rat vascular smooth muscle cells. Hypertens (Dallas, Tex 1979) 35: 313-318, 2000. doi: 10.1161/01.hyp.35.1.313. Yao S, Feng D, Wu Q, Li K, Wang L. Losartan Attenuates Ventilator-Induced Lung Injury. J Surg Res 145: 25-32, 2008. doi: https://doi.org/10.1016/j.jss.2007.03.075. Sawada Y, Kawaratani H, Kubo T, Fujinaga Y, Furukawa M, Saikawa S, Sato S, Seki K, Takaya H, Okura Y, Kaji K, Shimozato N, Mashitani T, Kitade M, Moriya K, Namisaki T, Akahane T, Mitoro A, Yamao J, Yoshiji H. Combining probiotics and an angiotensin-II type 1 receptor blocker has beneficial effects on hepatic fibrogenesis in a rat model of non-alcoholic steatohepatitis. Hepatol Res 49: 284-295, 2019. doi: https://doi.org/10.1111/hepr.13281.
　本発明は、臓器の線維化を効果的に抑制する医薬組成物を提供することを課題とする。
　本発明は、上記の課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬を有効成分とし、１日あたり、降圧薬としての投与量の０．２倍以下で投与するように用いられることを特徴とする臓器の線維化抑制用医薬組成物。
［２］１日あたり、降圧薬としての投与量の０．１倍以下で投与するように用いられる、前記［１］に記載の医薬組成物。
［３］１日あたり、降圧薬としての投与量の０．０５倍以下で投与するように用いられる、前記［２］に記載の医薬組成物。
［４］前記アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬が、ロサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、テルミサルタン、オルメサルタン、イルベサルタンおよびアジルサルタンからなる群から選択される化合物またはその薬学的に許容される塩である、前記［１］～［３］のいずれか一つに記載の医薬組成物。
［５］前記アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬がロサルタンである、前記［４］に記載の医薬組成物。
［６］前記臓器が、肝臓、腎臓および心臓から選択される少なくとも１つである、前記［１］～［５］のいずれか一つに記載の医薬組成物。
［７］前記臓器が、肝臓および／または腎臓である、前記［６］に記載の医薬組成物。
［８］前記臓器の線維化が臓器内の生物力学の変化に起因する線維化である、前記［１］～［７］のいずれか一つに記載の医薬組成物。
［９］前記臓器内の生物力学の変化が静水圧の変化である、前記［８］に記載の医薬組成物。
　本発明により、臓器の線維化を効果的に抑制する医薬組成物を提供することができる。
部分的下大静脈結紮モデルマウス作製の手順を示す図である。 部分的下大静脈結紮手術後、低用量のロサルタンを8週間経口投与したマウスの体重および臓器重量を測定した結果を示す図であり、（A）は体重、（B）は肝臓／体重比、（C）は脾臓／体重比の結果である。 部分的下大静脈結紮手術後、低用量のロサルタンを8週間経口投与したマウスから採取した血清におけるASTおよびALTを測定した結果を示す図であり、（A）はAST、（B）はALT、（C）はALT/AST比の結果である。 部分的下大静脈結紮手術後、低用量のロサルタンを8週間経口投与したマウスの肝組織をマッソントリクローム染色した結果を示す図であり、（A）は各群の代表的な染色画像（スケールバーは500μm）、（B）は画像解析により各群のマッソントリクローム染色陽性領域の割合を比較した結果である。 部分的下大静脈結紮手術後、低用量のロサルタンを8週間経口投与したマウスの肝組織におけるアポトーシス細胞を観察した結果を示す図であり、（A）は各群の代表的なTUNEL染色画像、（B）は画像解析によりTUNEL染色陽性領域の割合を比較した結果である。 部分的下大静脈結紮手術後、低用量のロサルタンを8週間経口投与したマウスの肝組織におけるα-SMA免疫染色の結果を示す図であり、（A）は各群の代表的なα-SMA免疫染色画像、（B）は画像解析によりα-SMA発現シグナルの強度を比較した結果である。 部分的下大静脈結紮手術後、低用量のロサルタンを8週間経口投与したマウスの肝組織におけるRhoA免疫染色の結果を示す図であり、（A）は各群の代表的なRhoA免疫染色画像、（B）は画像解析によりRhoA発現シグナルの強度を比較した結果である。 部分的下大静脈結紮手術後、低用量のロサルタンを8週間経口投与したマウスの肝組織におけるROCK1免疫染色の結果を示す図であり、（A）は各群の代表的なROCK1免疫染色画像、（B）は画像解析によりROCK1発現シグナルの強度を比較した結果である。 部分的下大静脈結紮手術後、低用量のロサルタンを8週間経口投与したマウスの肝組織におけるROCK2免疫染色の結果を示す図であり、（A）は各群の代表的なROCK2免疫染色画像、（B）は画像解析によりROCK2発現シグナルの強度を比較した結果である。 部分的下大静脈結紮手術後、低用量のロサルタンを8週間経口投与したマウスの肝組織におけるp-MLC2免疫染色の結果を示す図であり、（A）は各群の代表的なp-MLC2免疫染色画像、（B）は画像解析によりp-MLC2発現シグナルの強度を比較した結果である。 ヒト肝星細胞のエクスビボ静水圧負荷試験におけるAT1R、ACTA2、TGFB1およびCOL1A1のRT-qPCRの結果を示す図であり、（A）はAT1R、（B）はACTA2、（C）はTGFB1、（D）はCOL1A1の結果である。 ヒト肝星細胞のエクスビボ静水圧負荷試験におけるAT1Rの免疫組織化学の結果であり、各群の代表的なAT1R免疫染色画像を示す図である。 ヒト肝星細胞のエクスビボ静水圧負荷試験におけるAT1Rの免疫組織化学の結果であり、（A）は画像解析により細胞質におけるAT1Rの発現シグナルの強度を比較した結果、（B）は画像解析により核におけるAT1Rの発現シグナルの強度を比較した結果、（C）は細胞質のシグナル強度/核のシグナル強度の比を比較した結果である。 ヒト肝星細胞のエクスビボ静水圧負荷試験におけるα-SMAの免疫組織化学の結果であり、（A）は各群の代表的なα-SMA免疫染色画像（スケールバーは30μm）、（B）は画像解析によりα-SMA発現シグナルの強度を比較した結果である。 ヒト肝星細胞のエクスビボ静水圧負荷試験におけるTGF-β1の免疫組織化学の結果であり、（A）は各群の代表的なTGF-β1免疫染色画像（スケールバーは30μm）、（B）は画像解析によりTGF-β1発現シグナルの強度を比較した結果である。 ヒト肝星細胞のエクスビボ静水圧負荷試験における1型コラーゲンの免疫組織化学の結果であり、（A）は各群の代表的な1型コラーゲン免疫染色画像（スケールバーは30μm）、（B）は画像解析により1型コラーゲン発現シグナルの強度を比較した結果である。 ヒト肝星細胞のエクスビボ静水圧負荷試験におけるRhoA、ROCK1およびROCK2のRT-qPCRの結果を示す図であり、（A）はRhoA、（B）はROCK1、（C）はROCK2の結果である。 ヒト肝星細胞のエクスビボ静水圧負荷試験におけるRhoAの免疫組織化学の結果であり、（A）は各群の代表的なRhoA免疫染色画像（スケールバーは30μm）、（B）は画像解析によりRhoA発現シグナルの強度を比較した結果である。 ヒト肝星細胞のエクスビボ静水圧負荷試験におけるROCK1の免疫組織化学の結果であり、（A）は各群の代表的なROCK1免疫染色画像（スケールバーは30μm）、（B）は画像解析によりROCK1発現シグナルの強度を比較した結果である。 ヒト肝星細胞のエクスビボ静水圧負荷試験におけるROCK2の免疫組織化学の結果であり、（A）は各群の代表的なROCK2免疫染色画像（スケールバーは30μm）、（B）は画像解析によりROCK2発現シグナルの強度を比較した結果である。 ヒト肝星細胞のエクスビボ静水圧負荷試験におけるF-アクチン繊維のファロイジン染色およびp-MLC2の免疫組織化学の結果であり、（A）は各群の代表的な染色画像（スケールバーは30μm）、（B）は画像解析によりROCK2発現シグナルの強度を比較した結果である。 片側尿管閉塞誘発型腎線維症モデルマウス作製の手順を示す図である。 片側尿管閉塞手術前、術後1週目および2週目において、マウスの体重を測定した結果を示す図である。 片側尿管閉塞手術後、低用量および高用量のロサルタンを2週間経口投与したマウスならびにロサルタン非投与のマウスの左右の腎臓の画像を示す図である。 片側尿管閉塞手術後、低用量および高用量のロサルタンを2週間経口投与したマウスならびにロサルタン非投与のマウスから採取した血清におけるBUNおよびCREを測定した結果を示す図であり、（A）はBUN、（B）はCREの結果である。 片側尿管閉塞手術後、低用量および高用量のロサルタンを2週間経口投与したマウスならびにロサルタン非投与のマウスの腎組織をマッソントリクローム染色およびヘマトキシリン・エオジン染色した結果を示す図であり、（A）は各群の代表的な染色画像、（B）は画像解析により各群のマッソントリクローム染色陽性領域の割合を比較した結果である。
　本発明は、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬を有効成分とする臓器の線維化抑制用医薬組成物（以下「本発明の医薬組成物」という）を提供する。本発明の医薬組成物は、降圧薬としてのアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬の用量より低用量で投与するように用いられることを特徴とする。
　本発明の医薬組成物の１日あたりの投与量は、降圧薬としてのアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬の１日あたりの投与量より低用量であれば特に限定されないが、降圧薬としてのアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬の１日あたりの投与量の０．２倍以下、０．１倍以下、０．０５倍以下、０．０４倍以下、０．０３倍以下、０．０２以下であってもよい。
　「アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬」は、「アンジオテンシン受容体拮抗薬」、「アンジオテンシン受容体遮断薬」、「ＡＲＢ」とも称される。アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬は、高血圧症治療薬（降圧薬）として、広く臨床で使用されている。アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬の降圧作用は、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬がアンジオテンシンＩＩタイプ１受容体（ＡＴ１受容体）に結合することにより、アンジオテンシンＩＩとＡＴ１受容体との結合を遮断することにより発現される。
　アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬は、上記作用を有する化合物であれば特に限定されないが、例えば、ロサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、テルミサルタン、オルメサルタン、イルベサルタン、アジルサルタン、これらの薬学的に許容される塩などが挙げられる。好ましくはロサルタンまたはその薬学的に許容される塩である。本発明の医薬組成物は、２種以上のアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬を含んでいてもよい。
　「薬学的に許容される塩」は、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬の活性に影響を与えない塩を形成するものであれば特に限定されない。例えば、硫酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸などの無機酸との塩、酢酸、シュウ酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、エタンスルホン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、ガラクタル酸、ナフタレン－２－スルホン酸などの有機酸との塩、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、アルミニウムイオンなどの１種または複数の金属イオンとの塩、アンモニア、アルギニン、リシン、ピペラジン、コリン、ジエチルアミン、４－フェニルシクロヘキシルアミン、２－アミノエタノール、ベンザチンなどのアミンとの塩等が挙げられる。本明細書において「薬学的に許容される塩」には、水和物および溶媒和物が含まれる。それらを形成する溶媒としては、水、生理学的に許容される有機溶媒、例えばエタノール、アセトンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　ロサルタンは以下の構造を有する化合物であり、高血圧症治療薬の有効成分として周知である。そのカリウム塩であるロサルタンカリウムは日本で医療用医薬品として承認され、薬価収載されている。日本薬局方にはロサルタンカリウムおよびロサルタンカリウム錠が収載されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　カンデサルタンは以下の構造を有する化合物であり、高血圧症治療薬の有効成分として周知である。カンデサルタンのプロドラッグであるカンデサルタン シレキセチル（カンデサルタンのシレキセチルエステル）は日本で医療用医薬品として承認され、薬価収載されている。日本薬局方にはカンデサルタン シレキセチルおよびカンデサルタン シレキセチル錠が収載されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　バルサルタンは以下の構造を有する化合物であり、高血圧症治療薬の有効成分として周知である。バルサルタンは日本で医療用医薬品として承認され、薬価収載されている。日本薬局方にはバルサルタンおよびバルサルタン錠が収載されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　テルミサルタンは以下の構造を有する化合物であり、高血圧症治療薬の有効成分として周知である。テルミサルタンは日本で医療用医薬品として承認され、薬価収載されている。日本薬局方にはテルミサルタンおよびテルミサルタン錠が収載されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　オルメサルタンは以下の構造を有する化合物であり、高血圧症治療薬の有効成分として周知である。オルメサルタンのプロドラッグであるオルメサルタン メドキソミル（オルメサルタンのメドキソミルエステル）は日本で医療用医薬品として承認され、薬価収載されている。日本薬局方にはオルメサルタン メドキソミルおよびオルメサルタン メドキソミル錠が収載されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　イルベサルタンは以下の構造を有する化合物であり、高血圧症治療薬の有効成分として周知である。イルベサルタンは日本で医療用医薬品として承認され、薬価収載されている。日本薬局方にはイルベサルタンおよびイルベサルタン錠が収載されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　アジルサルタンは以下の構造を有する化合物であり、高血圧症治療薬の有効成分として周知である。アジルサルタンは日本で医療用医薬品として承認され、薬価収載されている。日本薬局方にはアジルサルタンおよびアジルサルタン錠が収載されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　ロサルタンカリウムを高血圧症患者に用いる場合の１日あたりの投与量は２５ｍｇ～１００ｍｇである（ニューロタン（登録商標）錠（オルガノン株式会社）の添付文書参照）。したがって、本発明の医薬組成物の有効成分としてロサルタンまたはロサルタンカリウムを臓器の線維化抑制に用いる場合の１日あたりの投与量は、２０ｍｇ以下、１０ｍｇ以下、５ｍｇ以下、２．５ｍｇ以下、２．０ｍｇ以下、１．５ｍｇ以下、１．２５ｍｇ以下、１．０ｍｇ以下、０．７５ｍｇ以下、０．５ｍｇ以下であってもよい。臓器の線維化抑制効果を奏する限り下限は限定されないが、例えば、０．１ｍｇ以上、０．２ｍｇ以上、０．３ｍｇ以上、０．４ｍｇ以上であってもよい。
　カンデサルタン シレキセチルを高血圧症患者に用いる場合の１日あたりの投与量は４ｍｇ～１２ｍｇである（プロブレス（登録商標）錠（武田薬品工業株式会社）の添付文書参照）。したがって、本発明の医薬組成物の有効成分としてカンデサルタンまたはカンデサルタン シレキセチルを臓器の線維化抑制に用いる場合の１日あたりの投与量は、２．４ｍｇ以下、１．２ｍｇ以下、１．０ｍｇ以下、０．８ｍｇ以下、０．６ｍｇ以下、０．４ｍｇ以下、０．２ｍｇ以下、０．１ｍｇ以下、０．０８ｍｇ以下であってもよい。臓器の線維化抑制効果を奏する限り下限は限定されないが、例えば、０．０２ｍｇ以上、０．０４ｍｇ以上、０．０６ｍｇ以上、０．０７ｍｇ以上であってもよい。
　バルサルタンを高血圧症患者に用いる場合の１日あたりの投与量は４０ｍｇ～１６０ｍｇである（ディオバン（登録商標）錠（ノバルティスファーマ株式会社）の添付文書参照）。したがって、本発明の医薬組成物の有効成分としてバルサルタンを臓器の線維化抑制に用いる場合の１日あたりの投与量は、３２ｍｇ以下、１６ｍｇ以下、８ｍｇ以下、５ｍｇ以下、４ｍｇ以下、３ｍｇ以下、２ｍｇ以下、１ｍｇ以下、０．８ｍｇ以下であってもよい。臓器の線維化抑制効果を奏する限り下限は限定されないが、例えば、０．２ｍｇ以上、０．４ｍｇ以上、０．６ｍｇ以上、０．７ｍｇ以上であってもよい。
　テルミサルタンを高血圧症患者に用いる場合の１日あたりの投与量は２０ｍｇ～８０ｍｇである（ミカルディス（登録商標）錠（日本ベーリンガーインゲルハイム株式会社）の添付文書参照）。したがって、本発明の医薬組成物の有効成分としてテルミサルタンを臓器の線維化抑制に用いる場合の１日あたりの投与量は、１６ｍｇ以下、８ｍｇ以下、４ｍｇ以下、２ｍｇ以下、１．６ｍｇ以下、１ｍｇ以下、０．８ｍｇ以下、０．６ｍｇ以下、０．４ｍｇ以下であってもよい。臓器の線維化抑制効果を奏する限り下限は限定されないが、例えば、０．０５ｍｇ以上、０．１ｍｇ以上、０．２ｍｇ以上、０．３ｍｇ以上であってもよい。
　オルメサルタン メドキソミルを高血圧症患者に用いる場合の１日あたりの投与量は５ｍｇ～４０ｍｇである（オルメテック（登録商標）錠（第一三共株式会社）の添付文書参照）。したがって、本発明の医薬組成物の有効成分としてオルメサルタンまたはオルメサルタン メドキソミルを臓器の線維化抑制に用いる場合の１日あたりの投与量は、４ｍｇ以下、３ｍｇ以下、２ｍｇ以下、１ｍｇ以下、０．８ｍｇ以下、０．５ｍｇ以下、０．２５ｍｇ以下、０．２ｍｇ以下、０．１ｍｇ以下であってもよい。臓器の線維化抑制効果を奏する限り下限は限定されないが、例えば、０．０４ｍｇ以上、０．０６ｍｇ以上、０．０８ｍｇ以上、０．０９ｍｇ以上であってもよい。
　イルベサルタンを高血圧症患者に用いる場合の１日あたりの投与量は５０ｍｇ～２００ｍｇである（アバプロ（登録商標）錠（大日本住友製薬株式会社）の添付文書参照）。したがって、本発明の医薬組成物の有効成分としてイルベサルタンを臓器の線維化抑制に用いる場合の１日あたりの投与量は、４０ｍｇ以下、２０ｍｇ以下、１０ｍｇ以下、５ｍｇ以下、４ｍｇ以下、３ｍｇ以下、２．５ｍｇ以下、２ｍｇ以下、１．５ｍｇ以下、１ｍｇ以下であってもよい。臓器の線維化抑制効果を奏する限り下限は限定されないが、例えば、０．４ｍｇ以上、０．６ｍｇ以上、０．８ｍｇ以上、０．９ｍｇ以上であってもよい。
　アジルサルタンを高血圧症患者に用いる場合の１日あたりの投与量２０ｍｇ～４０ｍｇである（アジルバ（登録商標）錠（武田薬品工業株式会社）の添付文書参照）。したがって、本発明の医薬組成物の有効成分としてアジルサルタンを臓器の線維化抑制に用いる場合の１日あたりの投与量は、８ｍｇ以下、４ｍｇ以下、２ｍｇ以下、１ｍｇ以下、０．８ｍｇ以下、０．６ｍｇ以下、０．５ｍｇ以下、０．４ｍｇ以下であってもよい。臓器の線維化抑制効果を奏する限り下限は限定されないが、例えば、０．０５ｍｇ以上、０．１ｍｇ以上、０．２ｍｇ以上、０．３ｍｇ以上、０．９ｍｇ以上であってもよい。
　本発明の医薬組成物は、臓器の線維化を抑制する効果を奏する。本明細書において、「線維化」には、線維症の状態であること、線維症の状態に移行すること、線維症が発症、進展または悪化することが含まれる。生体力学はあらゆる組織臓器に存在し、ダイナミック的変化を呈するため、対象臓器は特に限定されず、線維症を発症し得る臓器はいずれも本発明の医薬組成物の対象臓器となる。例えば、肝臓、腎臓、心臓、肺、胃、腸、骨格筋、皮膚などが挙げられる。好ましくは肝臓、腎臓および心臓であり、より好ましくは肝臓および腎臓であり、特に好ましくは肝臓である。
　本発明の医薬組成物を適用する臓器の線維化は、臓器内の静水圧、浸透圧、引張応力、圧縮応力など生物力学の変化に起因する線維化であってもよい。臓器内の生物力学の変化に起因する線維化とは、静水圧、浸透圧、引張応力、圧縮応力などの異常変化（上昇または低下）が生じた場合に、様々な細胞がその力学的変化を感知し、様々の生物学的シグナル経路の活性化を通して、組織細胞から過剰な細胞外基質を産生し、線維化組織として局所に蓄積すること病態である。本発明の医薬組成物を適用する生物力学の変化に起因する線維化は、臓器内の静水圧の変化に起因する線維化であってもよい。臓器内の静水圧の変化に起因する線維化を伴う疾患としては、肝不全、心不全、腎不全、肺線維症、筋線維化硬化症、皮膚瘢痕形成などが挙げられる。臓器内の引張応力や圧縮応力の変化に起因する線維化を伴う疾患としては、皮膚の瘢痕形成、心筋組織の線維化などが挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬を有効成分とし、医薬製剤の製造法として公知の方法（例えば、日本薬局方に記載の方法等）に従って、薬学的に許容される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には、例えば錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠、舌下錠、口腔内崩壊錠、バッカル錠等を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、マイクロカプセル剤を含む）、トローチ剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、放出制御製剤（例えば速放性製剤、徐放性製剤、徐放性マイクロカプセル剤等）、エアゾール剤、フィルム剤（例えば口腔内崩壊フィルム、口腔粘膜貼付フィルム等）、注射剤（例えば皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤等）、点滴剤、経皮吸収型製剤、軟膏剤、ローション剤、貼付剤、坐剤（例えば肛門坐剤、膣坐剤等）、ペレット、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）、点眼剤等の経口剤または非経口剤が挙げられる。担体または添加剤の配合割合については、医薬分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定することができる。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
　錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は通常の製剤化手順（例えば有効成分を注射用水、天然植物油等の溶媒に溶解または懸濁させる等）に従って調製することができる。注射用の水性液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えばD-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80、HCO-50等）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（例えば塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えばヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えばベンジルアルコール、フェノール等）、酸化防止剤などと配合してもよい。
　本発明の医薬組成物の有効成分であるアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬は、既に長年にわたり臨床で使用されているので、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して、安全に投与することができる。製剤中の有効成分の含有量は、剤型、投与方法、担体等により異なるが、製剤全量に対して通常０．０１～１００％（ｗ／ｗ）の割合であり、０．１～９５％（ｗ／ｗ）の割合であってもよい。
　本発明の医薬組成物は、有効成分であるアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬を、本来の降圧薬として投与量より低用量で投与するように用いられる。したがって、本発明の医薬組成物は、血圧降下作用を呈しない投与量、または血圧降下作用が緩やかな投与量で臓器の線維化を抑制できるという有利な効果を奏することができる。そのため、血圧が正常範囲～低血圧症の対象に対しても安全に使用できる点で非常に有利である。また、低用量による末梢血管や血流への影響がほとんどないと考えられ、通常用量で起こりうる局所組織血流低下による組織臓器傷害やそのほかの薬による毒副作用の最小化にもつながり長期的な投与に有利である。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：部分的下大静脈結紮モデルマウスによる評価〕
１．材料および方法
（１）動物
　C57BL/6マウス（10週齢、CLEA）を使用した。すべての動物実験は長崎大学動物実験委員会の承認を受け、施設のガイドラインに従って実施した。
（２）部分的下大静脈結紮モデルおよびロサルタン治療
　部分的下大静脈結紮は、Simonettoら（Hepatology 61: 648－659, 2015. doi: 10.1002/hep.27387.）に記載の方法で行った。部分的下大静脈結紮の手順を図１に示す。麻酔下のマウスを開腹し、鎌状靭帯を切断して肝上部の下大静脈（inferior vena cava: IVC）を露出させた（図1(A)）。下大静脈を分離し、下大静脈の前面に沿って細いチューブ（直径0.9mm）を設置した（図1(B)）。チューブを下大静脈と一緒にしっかりと結紮し（図1(C)）、直ちに優しく抜いた（図1(D)）。腹膜の筋肉/筋膜を縫合し、皮膚を閉じた。上記Simonettoらによれば、下大静脈と一緒に結紮した直径0.9mmのチューブを抜くことにより、下大静脈の断面積が約80％減少することが予想される。
　すべての処置の後、マウスをロサルタン群（n=6）、IVCL群（n=6）、Sham群（n=6）に分けた。ロサルタン群には、推定1日量が0.5 mg/kgになるように、最終濃度2.3 mg/Lのロサルタン（富士フイルム和光純薬）を飲料水として与えた。IVCL群には薬剤を添加していない飲料水を与えた。治療は実験終了時まで続けられた。Sham群には、部分的IVC結紮以外の手術を行い、薬剤を添加していない飲料水を与えた。
　ここで、本発明者らは、実験動物にロサルタンを投与した実験結果が報告されている多くの文献を調査し、ラットやマウスでは1日あたりの投与量が3～30mg/kg程度の報告が最も多いことを確認した。本発明者らは、これらの従来技術と比較して、1日あたりの投与量が十分低い用量となるように、本実施例においてロサルタンの投与量を0.5 mg/kg/dayに設定した。なお、試験動物の投与量のヒトに相当する投与量の換算（ヒト等価用量 Human equivalent dose, 略語: HED）は、主に試験動物とヒトの体表面積比からヒトで同等の作用が発現する用量が推測される。HEDは、アメリカ食品医薬品局（FDA）が刊行する「Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers」等を参考に決めることができ、ヒトとマウスの換算は特に比較データが無い限りは12.3を使用してヒト相当の用量が推測される。すなわち本実施例のロサルタンのマウスへの投与量0.5 mg/kg/dayは、ヒト投与量で0.04mg/kg/dayと同等と推定される。したがって、高血圧症患者の臨床推奨用量（ヒト60kgに対し推奨される最小投与量は20mg/day）より遥かに低用量となっている。
（３）組織採取および血清分析
　術後8週目にマウスを安楽死させた。安楽死させる前に、体重を測定し下大静脈から全採血し血清を分離して血清ALTおよび血清ASTを測定した。採血後、肝上部の下大静脈を切断し、PBSで門脈から肝臓を灌流し、循環血液とフィブリノーゲンを除去した。脾臓と肝臓を採取して重量を測定し、脾臓／体重比および肝臓／体重比を算出した。肝組織は4％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンブロックに包埋した。約5μmの厚さの組織切片を組織学的分析に使用した。
（４）マッソントリクローム染色
　肝組織切片を脱パラフィン処理し、再水和した。マッソントリクローム染色は、トリクローム染色（Masson）キット（Sigma-Aldrich）を用いて、メーカーの説明書に従って行い、光学顕微鏡（IX71、オリンパス）で観察した。
（５）免疫組織化学
　肝組織の免疫組織化学的解析を行い、関連するメカニズムの解明を行った。肝組織切片を10%ウシ血清アルブミンでブロッキングし、一次抗体（表1）で4℃一晩インキュベートし、その後二次抗体（表2）で室温・暗所で1時間インキュベートした。その後、DAPIを含む封入剤で切片を封入した。アポトーシス細胞は、TUNELアッセイキット（Abcam, #ab66108）を用いて、メーカーの説明書に従って検出した。DNA標識液とともに37℃で60分間インキュベートした後、PI/RNase A溶液を30分間添加した。染色された肝組織の免疫蛍光は蛍光顕微鏡（FV10i、オリンパス）を用いて検出した。各染色について、無作為に選んだ視野から60倍の倍率で少なくとも10枚の画像を撮影し、平均蛍光強度をImageJソフトウェアで測定した。
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（６）統計解析
　結果はすべて平均値±SDで示した。統計的有意性は、一元配置分散分析（ANOVA）後、チューキー検定（Turkey's test）により決定した。P値＜0.05を有意差ありとした。統計解析ソフトにはGraphPad Prism 8を使用した。
２．結果
（１）体重、臓器重量および血清分析
　体重および臓器重量の結果を図２に示した。（A）は術後8週目の体重、（B）は肝臓／体重比、（C）は脾臓／体重比の結果である。IVCL群ではSham群に比べ肝臓/体重比および脾臓/体重比が有意に高く、部分的下大静脈結紮を受けたマウスの肝臓の鬱血や損傷が示唆された。ロサルタン群の肝臓/体重比および脾臓/体重比はSham群と同程度に保たれた。
　血清分析の結果を図３に示した。（A）はAST、（B）はALT、（C）はALT/AST比の結果である。血清ALTおよび血清ASTは、全ての群間で有意差がなかった。
（２）線維化（マッソントリクローム染色）
　肝組織のマッソントリクローム染色の結果を図４に示した。（A）は各群の代表的な染色画像であり、矢印が線維化領域を示す。（B）は画像解析により各群のマッソントリクローム染色陽性領域の割合を比較した結果である。Sham群の肝組織はコラーゲンの沈着がほとんどなく、正常な小葉構造を示した。IVCL群では、線維化領域が顕著に増加し、線維化領域を囲む小葉の構造が明らかに障害を受けていた。ロサルタン群は、IVCL群と比較して線維化領域が有意に減少し、小葉の構造変化も効果的に緩和した。
（３）アポトーシス
　肝組織のアポトーシス細胞を観察した結果を図５に示した。（A）は各群の代表的なTUNEL染色画像であり、（B）は画像解析によりTUNEL染色陽性領域の割合を比較した結果である。アポトーシス細胞の割合は、Sham群に比べIVCL群で有意に増加したが、ロサルタン群では有意な変化はなかった。
（４）α-SMA発現
　肝組織のα-SMA免疫染色の結果を図６に示した。α-SMAは活性化肝星細胞のマーカーである。（A）は各群の代表的なα-SMA免疫染色画像であり、（B）は画像解析によりα-SMA発現シグナルの強度を比較した結果である。α-SMAの発現はIVCL群の肝組織でSham群よりも広範に検出され、両群間のシグナル強度に有意差が認められた。一方、ロサルタン群はIVCL群で上昇したα-SMAの発現を有意に抑制した。
（５）RhoA、ROCK1、ROCK2およびp-MLC2発現
　RhoA/ROCKシグナル伝達経路がメカノトランスダクションに中心的な役割を果たすことから、RhoA/ROCKシグナル伝達経路に関与するいくつかの分子の発現を調べた。肝組織のRhoA免疫染色の結果を図７に、肝組織のROCK1免疫染色の結果を図８に、肝組織のROCK2免疫染色の結果を図９に、肝組織のp-MLC2免疫染色の結果を図１０に、それぞれ示した。いずれの図においても、（A）は各群の代表的な免疫染色画像であり、（B）は画像解析により発現シグナルの強度を比較した結果である。肝組織のROCK2の発現は、全群でほとんど変化しなかった（図９）。IVCL群の門脈周囲の肝細胞ではRhoAおよびROCK1の発現がSham群と比較して有意に上昇したが、ロサルタン群はIVCL群で上昇したRhoAおよびROCK1の発現を有意に抑制した（図７、８）。ROCKの下流分子であるp-MLC2の発現についても、IVCL群はSham群と比較して有意に上昇したが、ロサルタン群はIVCL群で上昇したp-MLC2の発現を有意に抑制した（図１０）。
（６）まとめ
　これらのインビボ実験の結果は、低用量ロサルタンはRhoA/ROCKシグナル伝達経路を阻害することにより、肝線維化を軽減できることを示唆している。
〔実施例２：ヒト肝星細胞による評価〕
１．材料および方法
（１）ヒト肝星細胞（hepatic stellate cell: HSC）
　初代ヒト肝星細胞は、ScienCell Research Laboratories社より購入した。培地にはstellate cell medium（ScienCell Research Laboratories社）を用い、5％CO2、95％空気、37℃の加湿インキュベーター内で増殖させた。3回継代した細胞を以下の実験に使用した。
（２）ヒト肝星細胞のエクスビボ静水圧負荷試験
　空気圧式加圧システム（ストレックス社製）を用いて静水圧を発生させた。肝星細胞を直径60mmの培養皿（5×104細胞/dish）および4ウェル培養チャンバースライド（2×104細胞/well）に播種した。細胞を3日間培養して約70％コンフルエントにした後、培養皿とスライドの半分を無作為に選び、培地中に10nMのロサルタンを添加してまたは添加せずに、50mmHgの静水圧で24時間負荷をかけた。50mmHgの静水圧は、予備実験および過去の報告（Yoshino et al., Commun Biol 3: 152, 2020、Chen et al., Int J Biol Sci 15: 2509－2521, 2019）に基づいて選択した。ロサルタン添加群、ロサルタン無添加群のそれぞれに対照群として静水圧非負荷群を設けた。
（３）RT-qPCR
　RHOA、ROCK1、ROCK2、ACTA2、TGFB1、COL1A1の発現を評価するためにRT-qPCRを実施した。Quick-RNA MicoroPrep Kit を用いて肝星細胞からトータルRNAを分離し、SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて、1.25μgのRNAを逆転写した。定量PCRは、SYBR Green real-time PCR Master Mix（東洋紡）を用いて行った。反応はCFX96 real-time PCR System（BIO-RAD）で行った。プライマー配列を以下に示す。標準化にはGAPDHを用いた。
RHOA Forward: CAGAAAAGGGACCCCAGAA（配列番号１）
RHOA Reverse: GCAGCTGCTCTCGTAGCCATTTC（配列番号２）
ROCK1 Forward: AACATGCTGCTGGATAAATCTGG（配列番号３）
ROCK1 Reverse: AGGAAGGCATGGTACGATGTGATACA（配列番号４）
ROCK2 Forward: TCAGAGGTCTACAGATGAAGGC（配列番号５）
ROCK2 Reverse: CCAGGGGCTATTGGCAAAGG（配列番号６）
ACTA2 Forward: GTGACGAAGCACAGAGCAAA（配列番号７）
ACTA2 Reverse: CTTTTCCATGTCGTCCCAGT（配列番号８）
COL1A1 Forward: CCCACCAATCACCTGCGTACAGA（配列番号９）
COL1A1 Reverse: TTCTTGGTCGGTGGGTGACTCTGA（配列番号１０）
SMAD2 Forward: TCTTGATGGTCGTCTCCAGGTA（配列番号１１）
SMAD2 Reverse: GAGGCGGAAGTTCTGTTAGGAT（配列番号１２）
GAPDH Forward: GACTCATGACCACAGTCCATGC（配列番号１３）
GAPDH Reverse: AGAGGCAGGGATGATGTTCTG（配列番号１４）
AT1R Forward: TCAACAAAAATGAGCACGCTTT（配列番号１５）
AT1R Reverse: AAACATGGTGCAGGCTTCTTG（配列番号１６）
（４）免疫組織化学
　肝星細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定した後、10％ウシ血清アルブミンでブロッキングした。一次抗体および二次抗体は、表１および表２に記載の抗体を使用した。一次抗体で一晩インキュベートした後、二次抗体で室温1時間インキュベートし、DAPIを含む封入剤で切片を封入した。F-アクチン繊維は、封入剤中のTRITC標識ファロイジンで染色した。染色された細胞の免疫蛍光は蛍光顕微鏡（FV10i、オリンパス）を用いて検出した。各染色について、無作為に選んだ視野から60倍の倍率で10枚の画像を撮影し、平均蛍光強度をImageJソフトウェアで測定した。
（５）統計解析
　実施例１と同じ方法で統計解析を行った。
２．結果
（１）AT1R、ACTA2、TGFB1およびCOL1A1のRT-qPCR
　AT1R、ACTA2、TGFB1およびCOL1A1のRT-qPCRの結果を図１１に示した。（A）はAT1R、（B）はACTA2（α-SMAをコードする遺伝子）、（C）はTGFB1（TGF-β1をコードする遺伝子）、（D）はCOL1A1（1型コラーゲンをコードする遺伝子）の結果である。ロサルタン無添加静水圧負荷群は静水圧非負荷群と比較して、AT1R、ACTA2、TGFB1およびCOL1A1の遺伝子発現が有意に上昇した。一方ロサルタン添加静水圧負荷群のAT1R、ACTA2、TGFB1およびCOL1A1の遺伝子発現は、静水圧非負荷群と比較して有意差がなく、ロサルタン無添加静水圧負荷群と比較して有意に減少した。
（２）AT1Rの免疫組織化学
　AT1Rの免疫組織化学の結果を図１２および図１３に示した。図１２は各群の代表的な免疫染色画像であり、図１３（A）は画像解析により細胞質におけるAT1Rの発現シグナルの強度を比較した結果であり、図１３（B）は画像解析により核におけるAT1Rの発現シグナルの強度を比較した結果であり、図１３（C）は細胞質のシグナル強度/核のシグナル強度の比を比較した結果である。ロサルタン無添加静水圧負荷群では、細胞質および核においてタンパク質レベルでAT1Rの発現が有意に上昇した。一方、ロサルタン添加静水圧負荷群では、細胞質および核ともに静水圧非負荷群と比較して有意差がなく、ロサルタン無添加静水圧負荷群と比較して有意に減少した。
（３）α-SMA、TGF-β1および1型コラーゲンの免疫組織化学
　α-SMAの結果を図１４に、TGF-β1の結果を図１５に、1型コラーゲンの結果を図１６にそれぞれ示した。いずれの図においても、（A）は各群の代表的な免疫染色画像であり、（B）は画像解析により発現シグナルの強度を比較した結果である。RT-qPCRの結果と同様に、ロサルタン無添加静水圧負荷群はタンパク質レベルでα-SMA、TGF-β1および1型コラーゲンの発現が有意に上昇した。一方、ロサルタン添加静水圧負荷群のα-SMA、TGF-β1および1型コラーゲンの発現は静水圧非負荷群と比較して有意差がなく、ロサルタン無添加静水圧負荷群と比較して有意に減少した。
（４）RhoA、ROCK1およびROCK2のRT-qPCR
　RhoA、ROCK1およびROCK2のRT-qPCRの結果を図１７に示した。（A）はRhoA、（B）はROCK1、（C）はROCK2の結果である。ロサルタン無添加静水圧負荷群のRhoAおよびROCK1の遺伝子発現は、静水圧非負荷群と比較して有意に上昇した。一方ロサルタン添加静水圧負荷群のRhoAおよびROCK1の遺伝子発現は、静水圧非負荷群と比較して有意差がなく、ロサルタン無添加静水圧負荷群と比較して有意に減少した。ROCK2の遺伝子発現は、静水圧負荷群およびロサルタン添加により、有意に変化しなかった。
（５）RhoA、ROCK1およびROCK2の免疫組織化学
　RhoAの結果を図１８に、ROCK1の結果を図１９に、ROCK2の結果を図２０にそれぞれ示した。いずれの図においても、（A）は各群の代表的な免疫染色画像であり、（B）は画像解析により発現シグナルの強度を比較した結果である。RT-qPCRの結果と同様に、ロサルタン無添加静水圧負荷群はタンパク質レベルでRhoAおよびROCK1の発現が有意に上昇した。一方ロサルタン添加静水圧負荷群のRhoAおよびROCK1の発現は静水圧非負荷群と比較して有意差がなく、ロサルタン無添加静水圧負荷群と比較して有意に減少した。ROCK2の遺伝子発現は、静水圧負荷群およびロサルタン添加により、有意に変化しなかった。
（６）F-アクチン繊維のファロイジン染色およびp-MLC2の免疫組織化学
　結果を図２１に示した。（A）は各群の代表的な染色画像であり、（B）は画像解析によりp-MLC2のシグナル強度を比較した結果である。F-アクチンのファロイジン染色により、ロサルタン無添加静水圧負荷群は太いアクチン束を示し、緻密な平行ネットワークを形成していることが観察された。一方ロサルタン添加静水圧負荷群は、アクチンストレスファイバーの形成を効果的に抑制した。また、ロサルタン無添加静水圧負荷群はp-MLC2の発現が有意に上昇した。一方ロサルタン添加静水圧負荷群のp-MLC2の発現は静水圧非負荷群と比較して有意差がなく、ロサルタン無添加静水圧負荷群と比較して有意に減少した。
（７）まとめ
　これらのエクスビボ実験データを総合すると、ロサルタンは、静水圧による肝星細胞のメカノトランスダクション特性の変化を効果的に軽減できることを示している。
〔実施例３：片側尿管閉塞誘発型腎線維症モデルマウスによる評価〕
１．材料および方法
（１）片側尿管閉塞誘発型腎線維症モデルおよびロサルタン治療
　C57BL/6マウス（8週齢、CLEA）を使用した。片側尿管閉塞（UUO: Unilateral ureteral obstruction）の手順を図２２に示す。全身麻酔下のマウスを開腹し、左尿管を結紮した。右尿管は結紮せず右腎臓をコントロールとした。腹膜、筋層、皮膚を一層で縫合し、創を閉じ閉腹した。片側尿管閉塞誘発型腎線維症モデルでは、結紮側腎臓は水腎症の症状を呈し、UUO術後3日目にIV型コラーゲンの間質性沈着に伴う間質性線維化と尿細管細胞のアポトーシスが認められることが知られている。UUO術後のマウスを、ロサルタン低用量群（1mg/kg、n=3）、ロサルタン高用量群（3mg/kg、n=3）、ロサルタン非投与群（n=3）の3群に分けた。ロサルタン低用量群には、推定1日量が1 mg/kgになるように、最終濃度4.6 mg/Lのロサルタン（富士フイルム和光純薬）を飲料水として与えた。ロサルタン高用量群には、推定1日量が3 mg/kgになるように、最終濃度13.8 mg/Lのロサルタンを飲料水として与えた。ロサルタン非投与群にはロサルタンを添加していない飲料水を与えた。
（２）体重測定、組織採取および血清分析
　体重は、片側尿管閉塞手術前、術後1週目および2週目に測定した。術後2週目にマウスを安楽死させた。安楽死させる前に、下大静脈から全採血し血清を分離して血清BUNおよび血清CREを測定した。採血後、左右の腎臓を採取して写真撮影した。腎臓は4％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンブロックに包埋した。約5μmの厚さの組織切片を組織学的分析に使用した。
（３）マッソントリクローム染色およびヘマトキシリン・エオジン染色
　組織切片を脱パラフィン処理し、再水和した。マッソントリクローム染色は、トリクローム染色（Masson）キット（Sigma-Aldrich）を用いて、メーカーの説明書に従って行った。マトキシリン・エオジン（HE）染色は定法に従って行った。組織標本は光学顕微鏡（IX71、オリンパス）で観察した。
（４）統計解析
　実施例１と同じ方法で統計解析を行った。
２．結果
（１）体重および腎臓
　各群のマウスの体重変化の結果を図２３に、各群のマウスから摘出した左右の腎臓画像を図２４に示した。マウスの体重は、いずれの測定時点においても各群間に有意な変化が認められなかった。腎臓については、コントロール群の左側腎臓は水腎症により拡張していたが、ロサルタン低用量群およびロサルタン高用量群の左側腎臓の拡張は顕著に抑制されていた。
（２）血清分析
　血清分析の結果を図２４に示した。（A）はBUN、（B）はCREの結果である。ロサルタン低用量群およびロサルタン高用量群のBUN値およびCRE値は、いずれもコントロール群と比較して有意に減少していた。
（３）線維化（マッソントリクローム染色およびHE染色）
　腎組織のマッソントリクローム染色およびHE染色の結果を図２５に示した。（A）は、各群の代表的な染色画像であり、上段がマッソントリクローム染色、下段がHE染色の画像である。左端（CON）はコントロール群の右側腎臓、左から2番目（UUO）はコントロール群の左側腎臓である。（B）は画像解析により各群のマッソントリクローム染色陽性領域（（A）の画像中の矢印）の割合を比較した結果である。コントロール群の右側腎臓（CON）にはマッソントリクローム染色陽性領域はほとんどなかった。コントロール群の左側腎臓（UUO）では、線維化領域が顕著に増加していたが、ロサルタン低用量群およびロサルタン高用量群では線維化領域が有意に減少していた。
（４）まとめ
　これらのインビボ実験の結果は、低用量ロサルタンは腎線維化を軽減できることを示唆している。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (9)

  1. 　アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬を有効成分とし、１日あたり、降圧薬としての投与量の０．２倍以下で投与するように用いられることを特徴とする臓器の線維化抑制用医薬組成物。
  2. 　１日あたり、降圧薬としての投与量の０．１倍以下で投与するように用いられる、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　１日あたり、降圧薬としての投与量の０．０５倍以下で投与するように用いられる、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 　前記アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬が、ロサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、テルミサルタン、オルメサルタン、イルベサルタンおよびアジルサルタンからなる群から選択される化合物またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の医薬組成物。
  5. 　前記アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬がロサルタンである、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 　前記臓器が、肝臓、腎臓および心臓から選択される少なくとも１つである、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 　前記臓器が、肝臓および／または腎臓である、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 　前記臓器の線維化が臓器内の生物力学の変化に起因する線維化である、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  9. 　前記臓器内の生物力学の変化が静水圧の変化である、請求項８に記載の医薬組成物。
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