WO2023136668A1 - 돌외잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용 조성물 - Google Patents

돌외잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2023136668A1
WO2023136668A1 PCT/KR2023/000682 KR2023000682W WO2023136668A1 WO 2023136668 A1 WO2023136668 A1 WO 2023136668A1 KR 2023000682 W KR2023000682 W KR 2023000682W WO 2023136668 A1 WO2023136668 A1 WO 2023136668A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
extract
leaves
weight
exercise
zipenoside
Prior art date
Application number
PCT/KR2023/000682
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김태영
문주명
김윤희
Original Assignee
주식회사 비티씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 비티씨 filed Critical 주식회사 비티씨
Publication of WO2023136668A1 publication Critical patent/WO2023136668A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/42—Cucurbitaceae (Cucumber family)
    • A61K36/424—Gynostemma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system

Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving exercise performance comprising an extract of Ginseng elegans as an active ingredient.
  • the inventors of the present invention completed the present invention by preparing an extract of Ginseng elegans leaf extract with significantly increased exercise performance improvement effect in the process of researching the effect of improving athletic performance and the improvement or treatment of muscle diseases.
  • An object of the present invention is to provide a food composition for improving exercise performance containing an extract of Ginseng leaf as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for improving exercise performance, comprising an extract of genus genus elegans as an active ingredient.
  • the present invention is for improving exercise performance using Gypenoside L and Gyphenoside LI in a weight ratio of 100: 20 to 80, which contains Ginseng leaf tea, Ginseng leaf tea extract, or Ginseng leaf extract as an active ingredient.
  • a food composition is provided.
  • the eucalyptus leaf tea, the eucalyptus leaf tea extract, or the eucalyptus leaf extract may contain zipenoside L and zipenoside LI at a concentration of 20 to 140 mg/g.
  • the periwinkle leaf tea, the peritoneum leaf tea extract, or the peritoneum leaf extract may contain 10 to 80 mg/g of the zipenoside L and 10 to 60 mg/g of the zipenoside LI.
  • the periwinkle leaf tea, the edema leaf tea extract, or the edema leaf extract may further contain 5 to 10 parts by weight of Rg3 based on a total of 100 parts by weight of the zipenoside L and zipenoside LI. there is.
  • the ginguli leaf tea, doluli leaf tea extract, or gilphenoside leaf extract contains 50 to 90 damulin A and damulin B with respect to a total of 100 parts by weight of the diphenoside L and diphenoside LI. It may further include parts by weight.
  • the ginsenoside leaf tea, the periwinkle leaf tea extract, or the ginsenoside leaf extract contain 1 to 14 mg/g of ginsenoside Rg3, 10 to 80 mg/g of zipenoside L, and 1 to 80 mg/g of zipenoside LI. 10 to 60 mg/g, 10 to 20 mg/g of damulin A and 10 to 20 mg/g of damulin B, and 10 ppb or less of benzopyrene.
  • the oedo leaf tea, oedo leaf tea extract, or oedo leaf extract comprises the steps of swelling the dried oedo leaf; and heating and then drying the swollen leaves. And it may be prepared by a method including; extracting the dried ginseng leaves. In addition, the step of directly heat-treating the raw leaves outside the stone and then drying; And it may be prepared by a method including; extracting the dried rhododendron leaves.
  • the locust leaf tea, the locust leaf tea extract, or the locust leaf extract may be prepared according to the following methods (1) to (5):
  • the dried periwinkle leaves in the step (1) may be dried after roasting or steaming fresh periwinkle leaves.
  • the roasting or steaming may be performed at 90 to 300 ° C for 5 minutes to 120 hours.
  • the dried ginkgo biloba leaf in step (1) may have a moisture content of 0.01 to 70% by weight.
  • the water content of the outer leaf after step (2) and before step (3) may be 60 to 95% by weight.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for improving exercise performance, containing as an active ingredient gyphenoside L and gyphenoside LI in a weight ratio of 100: 20 to 80, egodolite leaf tea, gyphenoside tea extract, or gyphenoside leaf extract. .
  • composition of the present invention is expected to be very usefully used in the field of medicine or functional food, etc., because it shows excellent effects in improving exercise performance and enhancing physical strength by including the extract of genus periwinkle as an active ingredient.
  • the present invention is a composition derived from a natural product, it can be safely used without side effects and can be usefully used as a medicine or food.
  • FIG. 1 is a process chart showing a method for preparing an extract of genus elegans according to an embodiment of the present invention.
  • Gynostemma pentaphyllum is a perennial vine belonging to the Cucurbitaceae family. It grows naturally in the forests of mountains or fields, and the rhizome extends to the side, has white hairs at the nodes, and grows tangled, but climbs up with tendrils. As a habitat, it grows naturally in the mountains of the southern region, Jeju Island, and Ulleung Island in Korea, and is widely distributed in regions such as China, Japan, and Southeast Asia. Most of them grow in places with high humidity, such as coastal and riversides.
  • the doloe saponin is known to exhibit effects such as lipid metabolism improving action, cardiovascular disease protection action, blood sugar lowering action, central nervous system action, anticancer action, platelet aggregation inhibitory action, and tonic action.
  • doloes contain primeveoside, sophoroside, bisdesmoside, gentiobioside, rutinoside, etc. It contains glycosides, steroids, sugars and pigments.
  • jiphenoside means a triterpenoid saponin.
  • exercise performance ability or “exercise ability” refers to the ability to quickly, strongly, and accurately classify physical motions seen in daily life or sports into running, jumping, throwing, swimming, etc. , It indicates the degree to which it can be done skillfully for a long time, and the motor performance ability is defined by factors such as muscle strength, sense of balance, motor coordination, agility, and endurance.
  • the term 'enhancement of exercise performance' refers to improving or improving exercise performance, and specifically, means improving or enhancing endurance, sense of balance, or muscle strength.
  • the present invention relates to sedum leaf tea, sedum leaf tea extract, or sedum leaf extract (hereinafter, collectively referred to as 'sulphate leaf extract') containing diphenoside L and diphenoside LI in a weight ratio of 100: 20 to 80 as an active ingredient. , Provides a food composition for improving exercise performance.
  • the zifenoside L is a compound represented by Formula 1 below.
  • diastereomer of the diphenoside L is a compound represented by Formula 2 below.
  • the zipenoside L and zipenoside LI may be in a weight ratio of 100:20 to 80, preferably 100:30 to 70, and more preferably 100:50 to 70.
  • the extract of Ginseng leaf of the present invention contains 20 to 140 mg/g, preferably 25 to 140 mg/g, more preferably 30 to 120 mg/g, more preferably 30 to 120 mg/g, more preferably It may be included in a concentration of 30 to 100 mg/g, preferably 30 to 60 mg/g.
  • contents of gypenoside L and gypenoside LI contained in the locust leaf extract are within the above range, the effect of improving the exercise performance of the locust leaf extract is maximized.
  • the effect of improving the exercise performance of the quinoa leaf extract is insignificant, and if it exceeds the upper limit, exercise performance of the quinoa leaf extract The effect of improving ability may rather decrease.
  • the gypsum leaf extract contains 10 to 80 mg/g, preferably 15 to 80 mg/g, more preferably 20 to 60 mg/g of the zipenoside L, and 10 to 60 mg/g of the zipenoside LI. mg/g, preferably 12 to 48 mg/g.
  • the contents of Gypenoside L and Gypenoside LI in the Ginseng leaf extract are within the above ranges, the effect of improving the exercise performance of the Ginseng leaf extract can be maximized.
  • the genus periwinkle leaf extract may further include 5 to 10 parts by weight of Rg3 based on a total of 100 parts by weight of the zipenoside L and zipenoside LI.
  • the effect of improving the exercise performance of the quinoa leaf extract is further enhanced.
  • the weight ratio of Rg3 to the zipenoside L and zipenoside LI is less than the lower limit, the effect of improving the exercise performance of the gyphenoside leaf extract may be reduced.
  • the genoside leaf extract may further include 50 to 90 parts by weight, preferably 60 to 80 parts by weight of damulin A and damulin B, based on a total of 100 parts by weight of the zipenoside L and zipenoside LI. there is.
  • the ginseng leaf extract of the present invention contains 1 to 14 mg/g of ginsenoside Rg3, 10 to 80 mg/g of zipenoside L, 10 to 60 mg/g of zipenoside LI, and 10 mg/g of damulin A. ⁇ 20 mg/g and 10 ⁇ 20 mg/g of damulin B, and may contain less than 10 ppb of benzopyrene.
  • the step of swelling the dried ginguli leaf extract of the present invention can be prepared by a method including; and extracting the dried rhizome leaves.
  • the present inventors sufficiently swelled the dry ginseng leaf by supplying water, and sufficiently converted the high glycoside saponin into a low glycoside by heat-treating at a high temperature for a certain period of time in a wet state.
  • the amount of conversion of proteins, carbohydrates, and lipid components contained in ginseng leaves to benzopyrene is reduced, and Rg3, zipenoside L, zipenoside LI, and It was confirmed that the content of low molecular weight effective saponins such as Mullin A and Damulin B increased.
  • the weight ratio of zipenoside L and zipenoside LI is 100: 20 to 80, and the weight ratio of zipenoside L and zipenoside LI is 20 to 140 mg/g, preferably 25 to 80 mg/g. It is possible to prepare an extract of genus spp. containing 140 mg/g. In addition, since the benzopyrene formed in the process of roasting, steaming, or swelling the leaves of Ginkgo biloba and then subjecting them to high-temperature heat treatment is evaporated together with water vapor by releasing the pressure (seal) of the reaction vessel, an extract of Ginkgo biloba with reduced benzopyrene content can be prepared. .
  • the effective low molecular weight saponin is also referred to as 'low glycoside saponin' and 'low molecular weight saponin'.
  • the extract of genus elegans of the present invention may be prepared according to the methods (1) to (5) below.
  • the present inventors have repeatedly studied a method for producing an extract of periwinkle leaf extract having an effect of improving exercise performance. supplying parts by weight of water; (2) raising the temperature of the reaction container to 112 to 150 ° C. at a rate of 0.2 to 10 ° C./min to swell the leaves; (3) heating the reaction vessel at 112 to 150° C. for 10 minutes to 24 hours; (4) releasing the pressure of the reaction container to dry the periwinkle leaves; And (5) hot water extraction or ethanol extraction of the dried ginseng leaf at 40 to 100 ° C.; By confirming the increase, the present invention was completed.
  • step (1) dry rhizome leaves are put in a reaction container, and 0.5 to 13 parts by weight of water is supplied with respect to 1 part by weight of the dried rhododendron leaves.
  • the reaction vessel may be a pressurized airtight vessel.
  • the present invention is carried out by supplying dried rhododendron leaves and water to the reaction vessel and then sealing it.
  • the dried eugene leaves mean dried eufolia leaves, and include naturally dried eufolia leaves, semi-dried eufolium leaves, and dried eufolia leaves after roasting or steaming.
  • the dried periwinkle leaves may be dried after roasting or steaming fresh periwinkle leaves at 90 to 300 ° C. for 5 minutes to 120 hours.
  • roasting is a heat treatment of raw leaves at a certain temperature or higher in an open container to sterilize harmful bacteria to prevent deterioration, and to stop decomposition enzyme activity remaining in raw leaves to increase shelf life, aroma and flavor.
  • a process generally performed am.
  • benzopyrene produced due to high temperature or the rate at which active ingredient precursors are converted into active ingredients is not constant due to uneven temperature, not only excessive benzopyrene is produced, but also proceeds in a short time and the conversion rate to low-molecular effective saponin is reduced due to loss of moisture. it gets lower
  • the roasting or steaming is performed at 90 to 300 ° C, preferably 90 to 200 ° C, more preferably 90 to 150 ° C for 20 minutes to 120 hours, preferably 30 minutes to 30 hours, more preferably may be performed for 1 to 10 hours.
  • the roasting or steaming treatment is performed in the above temperature range, it is advantageous in that the generation of benzopyrene can be reduced while preventing the loss of active ingredients contained in the leaves.
  • the heat treatment such as roasting or steaming is more preferably a roasting treatment in terms of reducing the benzopyrene content and increasing the active substance content
  • the roasting is not particularly limited, but roasting by wood fire, roasting by gas fire, electricity There may be burnt by the heater.
  • the roasting by the wood fire is in a pot heated by a wood fire
  • the roasting by a gas fire is in a pot heated by a medium gas fire
  • the roasting by an electric heater is a rotary electric heater. It could be Among the above methods, roasting by an electric heater is more preferable in order to increase the content of active substances while reducing the content of benzopyrene.
  • the present inventors have found that in order to maximize the content of low-molecular-weight effective saponin in the leaves of Ginkgo biloba, heat treatment such as roasting should be performed in the raw leaf state.
  • heat treatment such as roasting should be performed in the raw leaf state.
  • saponin precursors and low-molecular-weight effective saponin components
  • saponin can It was assumed that the total amount of saponin could be maintained by removing the activity of the degrading enzyme, and that it would be converted into effective low-molecular-weight saponin when subjected to high-temperature heat treatment.
  • the moisture content of the dried perilla leaf may be 0.01 to 70% by weight, preferably 0.02 to 50% by weight, more preferably 0.03 to 15% by weight.
  • 0.5 to 13 parts by weight of water preferably 1 to 10 parts by weight, more preferably 2 to 8 parts by weight, and more preferably 3 to 5 parts by weight, can be supplied based on 1 part by weight of the dried rhododendron leaves.
  • the amount of water added may be reduced if the non-dried exoskeleton leaves are in a less dry state after being roasted.
  • the reason for supplying water to the dried perilla leaves is to sufficiently swell the persimmon leaves by increasing the water content of the persimmon leaves. That is, in the present invention, supplying water to the leaves is only for "swelling" the leaves, and the effectiveness of the leaves is "immersed” or sufficient supply of solvent so that the leaves are completely immersed in the solvent. It is completely different from “extraction”, which allows the powder to elute into a solvent. When the outer leaf is sufficiently swollen, the conversion rate of the high glycoside saponin to the effective low molecular weight saponin is remarkably increased in the subsequent heat treatment step.
  • the amount of water supplied to the outer leaf is very important.
  • the amount of water to be supplied should be an amount sufficient for the leaves to absorb moisture and sufficiently "swell", and if supplied in excess of this amount, the active ingredient contained in the leaves may be eluted, so it is preferable to absorb it again into the leaves.
  • the ginseng leaf may not be sufficiently swollen, and the conversion to low molecular weight effective saponin may not be sufficient in the subsequent heat treatment process.
  • the content of low-molecular-weight effective saponin contained in the leaves may rather decrease.
  • step (2) the reaction vessel is set at 0.2 to 10 °C/min, preferably 0.2 to 5 °C/min, more preferably 0.2 to 2.5 °C/min, and more preferably 0.5 to 2.5 °C/min.
  • the temperature is raised to 112 to 150 ° C, preferably 115 to 130 ° C, more preferably 120 to 130 ° C at 0.5 to 1.5 ° C / min.
  • This step is a step for sufficiently swelling the dried perilla leaves.
  • the temperature increase rate is less than the lower limit, the time for raising the temperature to the target temperature becomes too long, and if it exceeds the upper limit, the outer leaf may not be sufficiently swollen. In addition, when the temperature is not raised under the above conditions, the dried perilla leaves may not be sufficiently swollen.
  • the outer leaves are sufficiently swollen, and the water content in the outer leaves reaches 60 to 95%, preferably 70 to 90%, and more preferably 75% to 85%. Accordingly, the conversion of the high glycoside saponin into the effective low molecular weight saponin is better achieved in the subsequent heating step.
  • the swelling of the leaves is not sufficient, so that the conversion of the high glycoside saponin to the low molecular weight effective saponin is not performed better in the subsequent heating step, and if it exceeds the upper limit, It is not economical because the effort to increase the water content in the outer leaf or the cost effect is insignificant.
  • step (3) the reaction vessel is heated at 112 to 150 ° C. for 10 minutes to 24 hours.
  • step (2) the low-molecular-weight effective saponin precursors in the leaves swollen by absorbing moisture are deglycosylated and hydrolyzed to be converted into effective low-molecular-weight saponins.
  • benzopyrene contained in the outer leaf of the stone is evaporated.
  • the heating temperature may be 112 to 150 °C, preferably 115 to 135 °C, more preferably 120 to 135 °C, and more preferably 120 to 130 °C.
  • the heating temperature is less than the above lower limit, the conversion rate of the low molecular weight effective saponin precursors into low molecular weight effective saponin decreases and the conversion time becomes longer.
  • the heating temperature exceeds the upper limit, energy efficiency and safety problems may arise, and decomposition, may cause an increase in benzopyrene.
  • the heating time is 10 minutes to 24 hours, preferably 10 minutes to 10 hours, more preferably 20 minutes to 8 hours, more preferably 30 minutes to 8 hours, still more preferably 1 to 4 hours can
  • the heating time is less than the above lower limit, the conversion rate of the low molecular weight effective saponin precursors into low molecular weight effective saponin is lowered and benzopyrene evaporation is less likely to occur. , the benzopyrene content will increase.
  • the heating time when the heating temperature is 120 °C, the heating time may be 1 to 12 hours, preferably 4 to 8 hours, preferably 2 to 4 hours, the heating temperature When the temperature is 130 ° C, the heating time may be 30 minutes to 4 hours, preferably 1 to 3 hours, and when the heating temperature is 140 ° C, the heating time is 20 minutes to 3 hours, preferably 30 minutes to 2 hours. It may be, and when the heating temperature is 150 °C, the heating time is 10 minutes to 4 hours, preferably 10 minutes to 1 hour, more preferably 20 minutes to 1 hour, more preferably 30 minutes to 1 hour can
  • step (4) the pressure of the reaction container is released to dry the periwinkle leaves. Since the reaction vessel is in a state where the temperature and pressure in the reaction vessel are increased due to the heating in step (3), when the pressure in the reaction vessel is released, the water vapor in the reaction vessel rapidly evaporates and the leaves are dried under reduced pressure. Occurs. At the same time, benzopyrene is also evaporated and discharged.
  • the outer leaves of Ginseng are in a semi-dry state with a moisture content of less than 80% by weight, preferably 30 to 75% by weight, more preferably 30 to 50% by weight.
  • the manufacturing method of the present invention can be carried out by adding (4-1) additionally drying the dried ginseng leaves after the step (4).
  • the drying is not limited in any way, such as hot air drying, freeze drying, vacuum drying, reduced pressure drying, or natural drying.
  • the drying may be carried out until the moisture content of the leaves is less than 30% by weight, preferably 0.1 to 15% by weight.
  • the dried ginkgo biloba leaves in step (4) are 40 to 100 ° C, preferably 50 to 100 ° C, more preferably 70 to 100 ° C, more preferably 80 to 100 ° C under normal pressure. Hot water extraction or ethanol extraction. If the extraction temperature is less than the lower limit, the extraction efficiency of the low molecular weight effective saponin component may decrease, and if it exceeds the upper limit, the extraction efficiency is low compared to the effort and / or cost for increasing the temperature, so it is not economical.
  • the extraction of step (5) is repeated twice, but the first extraction is performed by hot water extraction at 40 to 100 ° C., and the second extraction is performed by 40 to 80% (v / v) ethanol extraction. It is possible to increase the yield and increase the content of the saponin component in the extract of the leaf extract.
  • an ethanol aqueous solution may be used as an extraction solvent for both the primary extraction and the secondary extraction, and the number of extractions may exceed two times, but is not preferable in terms of recovery rate and cost.
  • the Gyphenoside leaf extract of the present invention prepared as described above contains zipenoside L and zipenoside LI at a weight ratio of 100: 20 to 80, preferably 100: 30 to 70, more preferably 100: 50 to 70. 20 to 140 mg/g, preferably 25 to 140 mg/g, more preferably 30 to 120 mg/g, and still more preferably 30 to 100 mg of zipenoside L and zipenoside LI. / g, preferably 30 to 60 mg / g, so the exercise performance improvement effect is very excellent.
  • the of the present invention has a high content of effective low-molecular saponins such as ginsenoside Rg3, zipenoside L, zipenoside LI, damulin A and damulin B without high pressure treatment or high temperature treatment, and the extraction
  • effective low-molecular saponins such as ginsenoside Rg3, zipenoside L, zipenoside LI, damulin A and damulin B without high pressure treatment or high temperature treatment, and the extraction
  • the yield is high and the content of benzopyrene is low, so it is very useful.
  • the ginseng leaf extract contains 1 to 14 mg/g of ginsenoside Rg3, 15 to 80 mg/g of zipenoside L, 10 to 60 mg/g of zipenoside LI, and 10 to 20 mg of damulin A. /g and damulin B at 10 to 20 mg/g, and benzopyrene at 10 ppb or less (eg, within the range of 0.01 to 10 ppb).
  • the ginseng leaf extract contains ginsenoside Rg3 at 1 to 14 mg/g, preferably at 2.0 to 7.0 mg/g, more preferably at 2.0 to 5.0 mg/g, and even more preferably at 2.0 to 4.0 mg. / g, more preferably 2.5 to 3.5 mg / g.
  • 15 to 80 mg/g of zipenoside L preferably 20 to 40 mg/g, more preferably 20 to 30 mg/g, and even more preferably 20 to 25 mg/g may be included.
  • 10 to 60 mg/g of zipenoside LI preferably 10 to 30 mg/g, more preferably 10 to 20 mg/g, and more preferably 10 to 15 mg/g may be included.
  • damulin A may be included in an amount of 10 to 20 mg/g, preferably 10 to 15 mg/g.
  • damulin B may be included in an amount of 10 to 20 mg/g, preferably 10 to 15 mg/g.
  • the extract of the rhododendron periwinkle may be prepared in the form of a concentrate or dry powder. Specifically, the filtrate extract of Ginseng leaf can be used after being concentrated to 60 to 70 brix. Alternatively, the extract of the genus periwinkle may be prepared in a powder state that has undergone an additional process such as vacuum drying, freeze drying or spray drying.
  • the food composition of the present invention includes all forms such as functional food, health functional food, nutritional supplement, health food and food additives.
  • Food compositions of this type can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
  • the food composition may be a health functional food composition.
  • the term “health functional food” refers to food manufactured and processed using raw materials or ingredients having functionality useful for the human body according to Health Functional Food Act No. 6727, and is referred to as 'functional'. It refers to intake for the purpose of obtaining useful effects for health purposes such as regulating nutrients for the structure and function of the human body or physiological functions.
  • the content of the periwinkle leaf extract may be contained in an amount of 0.001 to 100% by weight, preferably 0.05 to 50% by weight, based on the total weight of the composition. In the case where the content of the periwinkle leaf extract is less than the above range, there is a problem in that it is difficult to expect the effect of the periwinkle leaf extract.
  • the health functional food composition may be formulated into one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, powders, capsules and liquid formulations, including one or more of carriers, diluents, excipients, and additives.
  • the extract of the present invention can be prepared and consumed in the form of tea, juice or drink.
  • it can be prepared in the form of a composition by mixing the extract of genus japonica of the present invention with a known substance or active ingredient known to have an effect of improving exercise performance, increasing muscle mass or inhibiting muscle loss.
  • the food composition of the present invention may further contain trace amounts of minerals, vitamins, saccharides, and known components having an effect of improving exercise performance, increasing muscle mass, or inhibiting muscle loss, in addition to the extract of the genus periwinkle.
  • the extract of Ginseng leaf of the present invention may be added to food as it is or used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to conventional methods.
  • the mixing amount of the active ingredient can be suitably determined depending on the purpose of its use (for prevention or improvement).
  • the amount of the food composition in the food may be 0.001 to 100% by weight, preferably 0.01 to 50% by weight, more preferably 0.1 to 30% by weight of the total food weight.
  • the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient can be used in an amount above the above range.
  • the present invention is a gypsum leaf containing gypenoside L and gypenoside LI in a weight ratio of 100: 20 to 80, preferably 100: 30 to 70, more preferably 100: 50 to 70. It provides a pharmaceutical composition for improving exercise performance using the extract as an active ingredient.
  • the gypsum leaf extract of the present invention contains 20 to 140 mg/g, preferably 25 to 140 mg/g, more preferably 30 to 120 mg/g, more preferably 30 to 120 mg/g of the zipenoside L and zipenoside LI. It may be included in a concentration of 30 to 100 mg/g, preferably 30 to 60 mg/g.
  • the pharmaceutical composition for improving motor performance of the present invention can be used for preventing or treating diseases caused by deterioration of motor performance.
  • diseases related to this include degenerative diseases, abnormal mitochondrial diseases, hypostamina, hypoacuity, lethargy, muscle wasting, and depression.
  • the composition of the present invention has an effect of improving exercise performance and does not limit the type and type of exercise.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is one commonly used in formulation and includes, but is not limited to, saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome, etc. It is not, and if necessary, other conventional additives such as antioxidants and buffers may be further included. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, lubricants, etc. may be additionally added to suitably form aqueous solutions, suspensions, fluids, and formulations according to each component.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in formulation, but may be formulated as an injection, oral administration, external skin preparation, and the like.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically applied) depending on the desired method, and the dosage is the condition and weight of the patient, the severity of the disease, the drug It varies depending on the form, administration route and time, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the dosage level selected from the composition will also depend on the activity of the compound, the route of administration, the severity of the condition being treated and the condition and previous medical history of the patient being treated. However, it is within the knowledge of the art to start with a dose of the compound at a level lower than that required to achieve the desired therapeutic effect and gradually increase the dosage until the desired effect is achieved, and the preferred dosage is age, sex and age. , body type, and weight can be determined.
  • the composition may be further processed, preferably milled or ground into smaller particles, prior to formulation into pharmaceutically acceptable pharmaceutical preparations.
  • the composition will also vary depending on the condition and the patient being treated, but this can be determined non-exclusively.
  • the effective dose of the extract of genus japonica of the present invention is 0.001 to 400 mg/kg, preferably 0.01 to 100 mg/kg, and may be administered 1 to 3 times a day.
  • the dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulation using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by those skilled in the art. or it may be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the formulation can be used in any form suitable for pharmaceutical preparations, including oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups and aerosols, external preparations such as ointments and creams, suppositories and sterile injection solutions, etc. , a dispersing agent or a stabilizing agent may be additionally included.
  • the present invention is a gypsum leaf containing gypenoside L and gypenoside LI in a weight ratio of 100: 20 to 80, preferably 100: 30 to 70, more preferably 100: 50 to 70. It provides a food composition for preventing or improving muscle diseases using the extract as an active ingredient.
  • the gypsum leaf extract of the present invention contains 20 to 140 mg/g, preferably 25 to 140 mg/g, more preferably 30 to 120 mg/g, more preferably 30 to 120 mg/g of the zipenoside L and zipenoside LI. It may be included in a concentration of 30 to 100 mg/g, preferably 30 to 60 mg/g.
  • the extract of genus japonica of the present invention contains a giphenoside compound as an active ingredient, thereby reducing ROS production and having excellent effects in activating PGC-1 ⁇ and AMPK involved in mitochondrial function in muscle.
  • it protects mitochondria from oxidative stress and activates Nrf2, which regulates the expression of antioxidant genes that can inhibit muscle damage, and increases the expression of TFAM, CPT-1 ⁇ , and mtDNA involved in mitochondrial replication in muscle.
  • Nrf2 which regulates the expression of antioxidant genes that can inhibit muscle damage
  • TFAM, CPT-1 ⁇ , and mtDNA involved in mitochondrial replication in muscle It can improve the expression of GSY, SIRT1, and PPAR ⁇ , which are involved in changes in energy and energy generation, so it can be usefully used to improve exercise performance.
  • it is possible to improve exercise performance by improving muscle fatigue, increasing exercise time and amount of exercise until exhaustion, and increasing glycogen content in muscle.
  • Dried leaves were prepared by spreading the raw leaves in the shade and naturally drying them to a moisture content of 8%.
  • the dried ginseng leaf extract was extracted twice with 80 ° C. alcohol (50% v/v) corresponding to 15 times the volume to prepare an extract of ginseng leaf, concentrated under reduced pressure and lyophilized to powder, and then used as a sample for analysis in the experiment. used
  • the dried ginseng leaf extract was extracted twice with 80 ° C. alcohol (50% v/v) corresponding to 15 times the volume to prepare an extract of ginseng leaf, concentrated under reduced pressure and lyophilized to powder, and then used as a sample for analysis in the experiment. used The average yield of alcohol extraction over the second round was 20.4%.
  • a 15-fold volume of water was added to the dried leaves, and then hot water extraction was performed at 120 ° C. for 2 hours to prepare a hot water extract. Thereafter, the residue remaining after the hot water extraction was extracted with 80 ° C. alcohol (50% v/v) corresponding to a volume of 15 times to prepare an ethanol extract of periwinkle leaf. The extraction yield was 36.8%. After mixing the hot water extract and the ethanol extract of the rhododendron periwinkle leaf, the mixture was concentrated under reduced pressure and lyophilized to powder, and then used as an analysis sample in the experiment.
  • An extract of genus elegans was prepared according to Example 1 of Patent Registration No. 10-2064387.
  • step (3) The hot water extract of step (1) and the alcohol extract of step (2) were mixed in a volume ratio of 1:1, filtered, concentrated under reduced pressure so that the solid content was 20 to 25% by weight, and freeze-dried. A single leaf extract was prepared.
  • Damulin A 99.1% purity
  • Damulin B 95.96% purity
  • Gypenoside L 99.42% purity
  • Gypenoside LI Purity 99.33%) was purchased from Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
  • Gynsenoside Rg3 purity 98.24%) was purchased from Ambo (Korea).
  • Test Example 1 Analysis of Active Ingredient Content of Ginseng Leaf according to Manufacturing Method
  • the low-molecular-weight effective saponin content contained in each sample was measured in the same manner as in Test Example 1 using the analysis samples according to the above Examples and Comparative Examples, and compared with them in Table 6 below.
  • the weight ratio of gypenoside L (Gyp L) and gypenoside LI (Gyp LI) is 100: 60.39, and gypenoside L (Gyp L ) and gypenoside LI (Gyp LI) at a total of 36.97 mg/g.
  • Comparative Example 1 showed that the content of the zipenoside compound was below the detection limit or the content was very low.
  • Comparative Example 2 and Comparative Example 3 showed that the total content of zipenoside L and zipenoside LI was less than 30 mg/g.
  • Creatine monohydrate (Cr) was used as a positive control material, and all test materials were provided by BTC Co., Ltd.
  • C2C12 cells which are myoblasts derived from skeletal muscle of mice, were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC) and used. C2C12 cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 100 units/mL penicillin, and 100 ⁇ g/mL streptomycin in a 37°C humidified CO 2 incubator (5% CO 2 / 95% air). When the cells were about 80% full of the culture dish, the cell monolayer was washed with phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4), and trypsin-2.65 mM EDTA was added to detach the cells and subculture, and the medium was changed every 2 days. .
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • streptomycin 100 fetal bovine serum
  • PBS phosphate buffer saline
  • the cells were cultured by replacing them with myocyte differentiation culture medium in which 2% horse serum (Gibco-Thermo Fisher Scientific) was added to DMEM medium to induce differentiation into myocytes. exchanged every 2 days.
  • myocyte differentiation culture medium in which 2% horse serum (Gibco-Thermo Fisher Scientific) was added to DMEM medium to induce differentiation into myocytes. exchanged every 2 days.
  • C2C12 cells were dispensed in a 6-well plate at 2 ⁇ 10 5 cells/well and stabilized for 24 hours.
  • cells were treated by adding each test substance to the myocyte differentiation culture medium. As shown in Table 3 below, the cell culture medium was replaced with the myocyte differentiation culture medium treated with the test substance, and the cells were cultured for 4 days (mRNA analysis) or 7 days (protein analysis).
  • test group test substance G1 - - G2 Example 20 ⁇ g/mL G3 Comparative Example 1 20 ⁇ g/mL G4 Comparative Example 2 20 ⁇ g/mL G5 Comparative Example 3 20 ⁇ g/mL G6 Comparative Example 4 20 ⁇ g/mL G7 Cr 5 ⁇ g/mL Cr
  • ROS Reactive oxygen species
  • C2C12 cells were dispensed in a 96-well plate to be 1 ⁇ 10 4 cells/well, and the cells were cultured for 24 hours. Thereafter, the cells were cultured for 1 hour by replacing with myocyte differentiation culture medium containing each test substance. After 1 hour, the cells were washed with PBS and further cultured for 3 hours in a medium containing 50 ⁇ M tert-butyl hydrogen peroxide (TBHP). My ROS levels were measured.
  • TBHP tert-butyl hydrogen peroxide
  • C2C12 cells were dispensed in a 6-well plate at 2 ⁇ 10 5 cells/well and stabilized for 24 hours.
  • the cell culture medium was exchanged with the myocyte differentiation culture medium containing the test substance and cultured for 7 days.
  • lysis buffer (20 mmol/L HEPES, pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA, 100 mmol/L NaF, 10 mmol/L sodium pyrophosphate, 1 mmol/L Na3VO4, 20 ⁇ g/mL aprotinin, 10 ⁇ g/mL antipain, 10 ⁇ g/mL leupeptin, 80 ⁇ g/mL benzamidine HCl, 0.2 mmol/L PMSF) was added and homogenized.
  • HRP horseradish peroxidase
  • HRP horseradish peroxidase
  • C2C12 cells were dispensed in a 6-well plate at 2 ⁇ 10 5 cells/well and stabilized for 24 hours.
  • the cell culture medium was exchanged with the myocyte differentiation culture medium containing the test substance and cultured for 2 or 4 days.
  • total RNA was isolated using RNeasy Plus Mini kit (QIAGEN), quantified using a micro-volume spectrophotometer (BioSpec-nano, SHIMADZU), and RNA with an OD260/280 value of 1.8 or higher was used in the experiment. .
  • Test Example 2 Effect on intracellular ROS production of C2C12 cells
  • ROS are mitochondrial by-products generated during normal cellular respiration, and oxidative stress results from an imbalance between ROS production and antioxidant defense capabilities. Abnormally increased ROS causes dysfunction of muscle cells and acts as a causative factor causing cell death by causing damage to intracellular macromolecules such as proteins, lipids and nucleic acids in muscle cells.
  • DCF-DA 2',7'-dichlorofluorescin diacetate
  • #, ##, and ### mean that there is a significant difference at p ⁇ 0.05, p ⁇ 0.01, and p ⁇ 0.001, respectively, compared to the G1 group (G2 to G7).
  • Mitochondria are muscle powerhouses that produce ATP by oxidizing energy sources, and their number and quantity increase so that more energy can be oxidized when exercise load is continuously given.
  • PGC-1 ⁇ plays a role in regulating transcription of mitochondrial function, biosynthesis and cellular energy metabolism. It has been reported that PGC-1 ⁇ activation is induced by AMP-activated protein kinase (AMPK) and Silent mating-type information regulation 2 homolog 1 (Sirt1), and that activation is increased by endurance exercise.
  • AMPK is an enzyme that senses the intracellular energy state. It is activated in situations where intracellular energy is insufficient, that is, when AMP is increased compared to ATP, and regulates various metabolic pathways to restore normal energy balance.
  • Sirt1 is recognized as an important regulator for exercise-induced mitochondrial biogenesis in skeletal muscle because its activity increases due to changes in NAD+ following muscle contraction and regulates the activity of PGC-1 ⁇ .
  • p38 mitogen-activated protein kinase MAPK
  • p38 MAPK is an enzyme known to be activated by various extracellular stimuli and involved in cell growth and differentiation, cell cycle regulation, etc. Exercise or skeletal muscle contraction increase the activity of p38 MAPK. has been reported to activate PGC-1 ⁇ .
  • Table 7 shows a comparison of protein expression levels related to PGC-1 ⁇ activation in each test group by relative band density (% control group).
  • the expression of p-AMPK was increased by the treatment (G2) of the composition of Example compared to the control group (G1).
  • the expression of p-Sirt1 was significantly increased by treatment (G2) of the composition of Example compared to the control group (G1).
  • Expression of p-p38 MAPK was significantly increased by treatment with the composition of Example (G2) compared to the control group (G1).
  • the ratio of p-p38/p38 was significantly increased by the treatment of the genus elegans extract.
  • Activated PGC-1 ⁇ induces the activity of various other transcription factors, among which the activation of nuclear factor erythroid-2 related factor 2 (Nrf2), a leucine zipper transcription factor, is induced to regulate the expression of antioxidant genes.
  • Nrf2 nuclear factor erythroid-2 related factor 2
  • oxidative stress is induced, Nrf2 moves from the cytoplasm to the nucleus, binds to the promoters of antioxidant genes, and induces the expression of various antioxidant genes.
  • the expression of p-Nrf2 was significantly increased by the treatment of Example, and the p-Nrf2/Nrf2 ratio was also increased by the treatment of Example.
  • Test Example 4 Effect on mRNA expression related to mitochondrial replication in C2C12 cells
  • Mitochondria are essential organelles for life because they are central organs for various cellular processes such as ATP generation, apoptosis, fatty acid beta oxidation, and iron-sulfur compound synthesis. Mitochondria uniquely has its own genome in the form of mitochondrial DNA (mtDNA), separate from chromosomal DNA present in the nucleus.
  • mtDNA mitochondrial DNA
  • Mitochondrial transcription factor A modulates mtDNA stability and mtDNA transcription by protecting DNA from ROS attack by transforming mitochondrial nuclear structure.
  • Carnitine palmitoyl transferase-1 CPT-1 is one of the hereditary traits related to ADP phosphorylation in mitochondria, which is related to fat oxidation. It is an enzyme that is involved in incorporation into the substrate.
  • test group TFam CPT1- ⁇ mtDNA G1 - 1.00 ⁇ 0.00 1.00 ⁇ 0.00 1.00 ⁇ 0.00 G2
  • Comparative Example 1 0.98 ⁇ 0.23 1.03 ⁇ 0.26 1.01 ⁇ 0.14
  • Comparative Example 2 0.92 ⁇ 0.12 1.01 ⁇ 0.17 1.00 ⁇ 0.13
  • Comparative Example 3 0.92 ⁇ 0.06 1.16 ⁇ 0.23 1.02 ⁇ 0.36
  • Comparative Example 4 0.97 ⁇ 0.05 1.20 ⁇ 0.11 1.05 ⁇ 0.25 G7 Cr 0.48 ⁇ 0.07 ** 0.93 ⁇ 0.20 0.72 ⁇ 0.12 *
  • Test Example 5 Effect on mRNA expression related to muscle strength type change in C2C12 cells
  • Myosin is the most abundant protein in skeletal muscle and is involved in muscle contraction. Myosin is composed of a myosin heavy chain (MHC) and a myosin light chain (MLC), and MHC is an important factor in determining muscle contraction properties.
  • MHC myosin heavy chain
  • MHC2B subtypes are known to be mainly involved in fast muscle contraction rates
  • MHC1 and MHC7 subtypes are known to be involved in slow muscle contraction rates.
  • MHC1 mRNA expression was significantly increased in the Example treatment group (G2) compared to the control group (G1). MHC7 mRNA expression was significantly increased in the Example treatment group (G2).
  • MHC2A mRNA expression showed a tendency to increase in the Example treatment group (G2), but there was no significant difference, and MHC2B mRNA expression was significantly decreased in the Example treatment group (G2) compared to the control group (G1). That is, it is determined that the treatment of the composition of the example induces differentiation into the slow muscle type involved in slow muscle contraction by increasing the expression of MHC1 and MHC7 mRNA.
  • PGC-1 ⁇ is known as a transcriptional coactivator that plays a key role in regulating genes for skeletal muscle adaptation to exercise, such as mitochondrial biosynthesis in skeletal muscle and specialization of muscle fiber types (fast-to-slow fiber type switching).
  • Expression of PGC-1 ⁇ mRNA was significantly increased in the Example treatment group (G2) compared to the control group (G1).
  • Protein kinase B (PKB) also known as Akt, plays an important role in glucose metabolism and several cellular metabolic processes.
  • PKB an upstream signaling factor of GLUT4, transmits signals to GLUT4 to enable intramuscular glucose transport.
  • PKB mRNA expression was significantly increased in the Example treatment group (G2) compared to the control group (G1).
  • PGC-1 ⁇ activated in skeletal muscle in response to exercise not only participates in the oxidative stress regulation mechanism together with fibronectin type III domain-containing protein 5 (FNDC5), a skeletal muscle membrane protein, but also activates the insulin signaling pathway to improve insulin sensitivity.
  • FNDC5 mRNA expression was significantly increased in the Example treatment group (G2) compared to the control group (G1), and all other groups showed no significant difference.
  • Test Example 6 Effect on expression of energy-related mRNA in C2C12 cells
  • Table 12 shows the effects of the compositions according to the examples on the expression of GSY, SIRT1 and PPAR ⁇ mRNA involved in energy metabolism of muscle cells.
  • Glycogen Synthase is a key enzyme of glycogenesis and is a metabolic enzyme involved in the synthesis and storage of glycogen by insulin. Glycogen in skeletal muscle is the main energy source during exercise, and the higher the exercise intensity, the higher the energy dependence on glycogen. GSY mRNA expression was significantly increased in the Example treated group (G2) compared to the control group (G1), and also significantly increased in the positive control Cr treated group (G9). As ATP stored in skeletal muscle decreases during exercise, energy demand rapidly increases. The increase in intracellular NAD+ activates Sirt1. express transcription factors. Sirt1 mRNA expression showed a tendency to increase in the Example treated group (G2) compared to the control group (G1), but there was no significant difference.
  • Peroxisome proliferator-activated receptor gamma is a transcription factor belonging to the nuclear receptor. It is activated by ligand and regulates genes related to lipid and glucose metabolism and energy homeostasis, and plays a role in regulating cell proliferation and differentiation.
  • PPAR- ⁇ regulates fatty acid oxidation ability in skeletal muscle through interaction with PGC-1 ⁇ .
  • PPAR- ⁇ mRNA expression showed a tendency to increase in the Example treated group (G2) compared to the control group (G1), but did not show a significant difference.
  • the Ginseng leaf extract according to the Example inhibited oxidative stress and increased the expression of various genes related to mitochondrial biosynthesis in muscle cells. It is determined that the composition according to the embodiment has the potential to be used as a functional material for suppressing fatigue due to exercise and improving exercise performance.
  • Creatine monohydrate (Cr) was used as a positive control.
  • mice 5-week-old, male ICR mice free from specific pathogens were purchased from Dooyeol Biotech Co., Ltd. and used. After a week of quarantine and adaptation, healthy animals without weight loss were selected and used in the experiment. Experimental animals were reared in a breeding environment set at a temperature of 23 ⁇ 3 °C, relative humidity of 50 ⁇ 10%, ventilation frequency of 10 to 15 times/hour, lighting time of 12 hours (08:00 to 20:00), and illumination of 150 to 300 Lux. did During the entire test period, the experimental animals were allowed to freely consume solid feed for experimental animals (Cargill Agripurina Co., Ltd.) and drinking water.
  • mice After a one-week adaptation period, healthy animals were selected and prepared according to the egg mass method by dividing the mice into 6 groups of 10 mice in each group.
  • the general control group was orally administered with 5% tween 80-saline, and the positive control group was orally administered with 75 mg/kg body weight (BW) of Creatine monohydrate (Cr).
  • BW body weight
  • Cr Creatine monohydrate
  • Each composition according to Comparative Example was dissolved in drinking water at 300 mg/kg body weight (BW) and orally administered at a constant time every day for 17 days.
  • the experimental animals were supplied with a solid feed for experimental animals (Cargill Agripurina Co., Ltd.), and were allowed to freely consume the diet and drinking water.
  • the body weight of the experimental animals was measured at a regular time every week.
  • the weight-loaded forced swimming test of the experimental animals was performed as follows. That is, a plastic water tank (90 x 45 x 45 cm) was filled with water to a depth of 35 cm, and the temperature of the water was maintained at 25 ⁇ 1 °C. After hanging a weight corresponding to 5% of the body weight of the test animal at the tail (tail), swimming was performed in the water tank, and exhaustion was determined when the test animal did not float to the surface for 7 seconds in the water.
  • swimming adaptation exercise was performed twice for 15 minutes each, and 2 days after the last swimming adaptation exercise (14th day of test substance administration), a forced swimming test was conducted after fasting for 16 hours, and swimming until exhaustion was performed. time was measured.
  • the blood lactate content of the test animals was measured by taking blood from the tail of the test animals before the start of the forced swimming test, immediately after swimming, 10 minutes and 30 minutes after swimming, and using a lactate meter (Lactate Pro2, Arkray).
  • the animals After swimming for a certain period of time (60 minutes) without weight bearing on the 17th day of test substance administration, the animals were anesthetized with an anesthetic made by diluting tribromoethanol with tertiary amyl alcohol, and blood was collected from the orbit. The blood was placed in a serum separate tube (Becton Dickinson), left at room temperature for 30 minutes, centrifuged at 3,000 rpm for 20 minutes to separate the serum, and stored at -70°C until analysis.
  • an anesthetic made by diluting tribromoethanol with tertiary amyl alcohol
  • Serum blood urea nitrogen (BUN) and creatinine (CREA) content and alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), creatine kinase (CK), and lactate dehydrogenase (LDH) activities were measured using a blood biochemical analyzer (KoneLab 20 XT, Thermo Fisher Scientific) was measured.
  • the lactate content in serum was measured using a lactic acid measurement kit (abcam) according to the method suggested by the manufacturer.
  • mice 5-week-old, male ICR mice free from specific pathogens were purchased from Dooyeol Biotech Co., Ltd. and used. After a week of quarantine and adaptation, healthy animals without weight loss were selected and used in the experiment. Experimental animals were reared in a breeding environment set at a temperature of 23 ⁇ 3 °C, relative humidity of 50 ⁇ 10%, ventilation frequency of 10 to 15 times/hour, lighting time of 12 hours (08:00 to 20:00), and illumination of 150 to 300 Lux. did During the entire test period, the experimental animals were allowed to freely consume solid feed for experimental animals (Cargill Agripurina Co., Ltd.) and drinking water.
  • healthy animals were selected and classified into 9 groups according to the egg mass method. Each test group used 10 experimental animals.
  • test substance was dissolved in drinking water and orally administered at a constant time (2 hours before exercise) every day for 6 weeks.
  • the experimental animals were supplied with a solid feed for experimental animals (Cargill Agripurina Co., Ltd.), and were allowed to freely consume the diet and drinking water.
  • test group number of animals treadmill workout Test substance (mg/kg BW) A1 - 10 - - A2 Example 10 - 300 A3 - 10 + - A4 Example 10 + 300 A5 Comparative Example 1 10 + 300 A6 Comparative Example 2 10 + 300 A7 Comparative Example 3 10 + 300 A8 Comparative Example 4 10 + 300 A9 Cr 10 + 75
  • the body weight of the experimental animals was measured at a regular time every week.
  • the total food intake and daily food intake were calculated by measuring the amount consumed during the test period.
  • Endurance exercise training of experimental animals was performed for 6 weeks using a small animal treadmill (Exer3/6-treadmill, Columbus Instruments). Endurance exercise training is 15 minutes in the 1st week, 20 minutes in the 2nd week, 25 minutes in the 3rd week, 30 minutes in the 4th week, 35 minutes in the 5th week, 40 minutes in the 6th week, with an incline of 10 degrees and a speed of 10 m/min. exercise was performed.
  • liver and skeletal muscles [quadriceps femoris muscle (QF, quadriceps muscle), gastrocnemius muscle (GA, calf muscle), soleus muscle (SOL, soleus muscle), extensor digitorum longus muscle (EDL, extensor longus muscle)] were extracted. After rinsing with cold physiological saline, excess water was removed with a filter paper, and the weight was measured. A portion of the soleus muscle (SOL) was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA), embedded in paraffin, and tissue immunostaining was performed, and a portion was subjected to real-time RT-PCR after total RNA was isolated. A part of the calf muscle (GA) was subjected to Western blot after protein isolation. The rest of the tissue was stored at -70°C until analysis.
  • QF quadriceps muscle
  • GA gastrocnemius muscle
  • SOL soleus muscle
  • EDL extensor digitorum longus muscle
  • CK creatine kinase
  • LDH lactate dehydrogenase
  • ALT alanine aminotransferase
  • AST aspartate aminotransferase
  • ALP alkaline phosphatase
  • Liver tissue fluid was prepared to measure the content of glycogen in liver tissue. 1 mL PBS was added to 100 mg liver tissue and homogenized with a homogenizer. The homogenized solution was centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was used as liver tissue fluid.
  • Muscle tissue fluid was prepared for measurement of glycogen content and enzyme activity in muscle tissue.
  • the isolated skeletal muscles of the quadriceps femoris (QF), calf muscles (GA), soleus muscles (SOL), and extensor digitorum (EDL) were homogenized with a homogenizer by adding 1 mL of PBS.
  • the homogenized solution was centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was used as a muscle tissue solution.
  • the amount of protein in muscle tissue fluid was measured using BCA protein assay kit (Thermo Scientific).
  • Glycogen content in liver and skeletal muscle was measured using a glycogen measurement kit according to the method suggested by the manufacturer (abcam).
  • the soleus muscles fixed with 4% PFA were embedded in paraffin, and 5 ⁇ m tissue sections were prepared from the embedded tissues. After deparaffinization, tissues were hydrated by sequentially lowering the percentage of alcohol, starting with 100% alcohol to 0% alcohol (H 2 O). For histomorphological observation of the soleus muscle (SOL), the tissue was stained using Accustain® Hematoxylin and Eosin Stains (Sigma-Aldrich Co.) according to the method suggested by the manufacturer. Then, histological changes were observed using an optical microscope (Carl Zeiss).
  • lysis buffer (20 mmol/L Hepes, pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA, 100 mmol/L NaF, 10 mmol/L sodium pyrophosphate, 1 mmol/L Na3VO4, 20 ⁇ g/mL aprotinin, 10 ⁇ g/mL antipain, 10 ⁇ g/mL leupeptin, 80 ⁇ g/mL benzamidine HCl, 0.2 mmol/L PMSF) was added and homogenized with a homogenizer.
  • the homogenized solution was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was taken to obtain muscle tissue lysates.
  • the amount of protein in the muscle tissue lysate was measured using the BCA protein assay kit (Thermo Scientific).
  • Protein 50 ⁇ g was separated by 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (Milipore). After blocking the membrane in 5% skim milk-TBST (20 mmol/L Tris HCl, pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 0.1% Tween 20) for 1 hour, each antibody to be measured was added and at 4 ° C. Stir for 16 hours or at room temperature for 1 hour. Antibody information used in the experiment is shown in Table 17 below.
  • HRP horseradish peroxidase
  • HRP horseradish peroxidase
  • HRP-linked or anti-mouse IgG was added and stirred for 1 hour, and each protein band was visualized by enhanced chemiluminscence method using LuminataTM Forte Western HRP Substrate (Millipore) did Protein expression levels were quantified using ImageQuantTM LAS 500 imaging systems (GE Healthcare Bio-Sciences AB).
  • Test Example 7 Effect on body weight of experimental animals
  • Test Example 8 Effect on exercise (forced swimming) time
  • Test Example 9 Effect on lactate concentration before and after exercise (forced swimming)
  • Table 19 shows the effect of administration of the test substance on blood lactate concentration before and after exercise (forced swimming).
  • blood lactate concentrations of all test groups showed the maximum value immediately after exercise (at the time of exhaustion) compared to before exercise, and blood lactate concentrations decreased as time passed.
  • the composition according to the example significantly reduced blood lactate concentration before and after exercise.
  • Table 20 shows the contents of lactate, BUN, and CREA, and CK, LDH, ALT, and AST activities in serum collected after swimming for a certain period of time (60 minutes) without weight bearing.
  • Lactate is a substance produced by the reduction of pyruvate in tissue anaerobic glycolysis, which acidifies the environment within muscle cells and inhibits the activity of phosphorylase and myosin ATPase to reduce exercise performance, so many studies have been conducted. is used as an indicator of exercise-induced fatigue.
  • Lactate dehydrogense (LDH) is an enzyme that catalyzes the formation of lactate from pyruvate. Excessive pyruvate is produced during high-intensity exercise, and LDH activity, which catalyzes the conversion of pyruvate to lactic acid, increases. Therefore, an increase in serum LDH activity is an indicator of muscle damage as the burden of skeletal muscle increases.
  • the concentration of lactate in serum was significantly decreased in the Example-administered group (G2) compared to the control group (G1), and the LDH activity in serum was compared to the control group (G1) in the Example-administered group (G2). showed a decreasing trend, but did not show a significant difference.
  • Test Example 11 Body weight of experimental animals
  • the experimental animals of all groups showed a normal body weight change with a continuous increase in body weight during the test period.
  • the weight of the Example administration group (A2) decreased significantly from the 4th week to the end of the test
  • the weight of the exercise control group (A3) was compared to the non-exercise control group (A1).
  • Test Example 12 Effect on exercise time and amount of exercise until exhaustion
  • +, ++, and +++ mean that there is a significant difference at p ⁇ 0.05, p ⁇ 0.01, and p ⁇ 0.001, respectively, compared to the A3 group (A4 to A9).
  • the exercise time until exhaustion was 1,119 ⁇ 58 seconds in the non-exercise control group (A1), which was the shortest exercise time compared to the other test groups, and the non-exercise test group in the Example administration group (A2) and The exercise time to exhaustion was significantly increased in the exercise control group (A3) compared to the non-exercise control group (A1).
  • the exercise time to exhaustion was significantly increased in the Example-administered group (A4) and the Cr-administered group (A9) compared to the exercise control group (A3).
  • Test Example 13 Liver and muscle weight
  • the relative weights of the calf muscles (GA), soleus muscles (SOL), and extensor digitorum (EDL) were significantly increased in the exercise control group (A3) compared to the non-exercise control group (A1).
  • the relative weights of the soleus muscle (SOL) and extensor longus (EDL) significantly increased in the Example administration group (A2) compared to the non-exercising control group (A1).
  • the relative weights of the quadriceps femoris (QF) and gastrocnemius (GA) significantly increased in the Example administration group (A4) compared to the exercise control group (A3).
  • composition of the embodiment according to the present invention exhibits a muscle increasing effect.
  • composition administration group (A4) according to the embodiment of the present invention showed a significant decrease in CK and LDH activities and serum lactate concentration compared to the exercise control group (A3).
  • the administration of the composition according to the embodiment of the present invention helps to improve muscle fatigue.
  • Test Example 15 Glycogen content in liver and muscle (calf muscle, GA)
  • Carbohydrates one of the most important energy sources during exercise, supply energy for muscle contraction through the glycogen breakdown process.
  • glycogen stored in the liver or muscle is immediately used as an energy source. it means.
  • glycogen content in muscle (GA) collected at the end of the test was measured and shown in Table 26 below.
  • the glycogen content in the muscle (GA) tissue was significantly increased in the exercise test group in the Example-administered group (A4) compared to the exercise control group (A3).
  • the Ginseng leaf extract according to an embodiment of the present invention increases the glycogen content of muscle (GA) tissue, thereby serving as an energy source that helps reduce muscle fatigue and improve muscle endurance.
  • Test Example 16 Changes in protein expression in muscle (calf muscle, GA)
  • composition of Example together with regular exercise training significantly increases the activation of AMPK and p38 MAPK, which are proteins related to PGC-1 ⁇ activation, thereby regulating the expression of genes involved in mitochondrial biosynthesis and sugar metabolism Thus, it can be inferred that it improves exercise performance.
  • Test Example 17 Changes in mRNA expression of muscles (soleus muscle, SOL)
  • Muscles can be classified into slow and fast muscles according to their physiological contraction speed, and among them, slow muscles have a high number of mitochondria and are highly active, so they have high resistance to fatigue, allowing them to exercise for a long time. Therefore, in this study, endurance exercise training and administration of test substances were found to be effective in antioxidation-related genes (SOD2, GPx1, UCP2, UCP3), LDH-related genes (ERR ⁇ , LDH B, MCT1), and mitochondrial synthesis-related genes in the sole muscle (SOL) belonging to the slow muscle.
  • SOD2, GPx1, UCP2, UCP3 LDH-related genes
  • ERR ⁇ LDH-related genes
  • MCT1 mitochondrial synthesis-related genes
  • Comparative Example 1 1.13 ⁇ 0.22 1.17 ⁇ 0.29 1.54 ⁇ 1.50 0.63 ⁇ 0.11 A6
  • Comparative Example 2 1.15 ⁇ 0.11 1.15 ⁇ 0.16 1.54 ⁇ 1.06 0.60 ⁇ 0.13
  • Comparative Example 3 1.10 ⁇ 0.15 1.19 ⁇ 0.28 1.55 ⁇ 1.13 0.62 ⁇ 0.12
  • Comparative Example 4 1.23 ⁇ 0.15 1.21 ⁇ 0.11 1.64 ⁇ 0.48 0.60 ⁇ 0.16
  • the example administration group (A4) has higher activities of SOD2 and UCP2 compared to the exercise control group (A3). A significant increase can be observed.
  • composition of Example together with regular exercise training can inhibit muscle cell damage by protecting mitochondria from oxidative stress by increasing SOD2 and UCP2 mRNA expression.
  • Example administration group A4 compared to the exercise control group (A3) mtDNA, CPT It can be confirmed that the expression of 1 ⁇ and NRF1 mRNA was significantly increased.
  • composition of Example in parallel with regular exercise training can improve exercise performance by increasing mitochondrial biosynthesis as mtDNA, CPT-1 ⁇ and NRF1 mRNA expression are increased. there is.
  • composition of Example in parallel with regular exercise training can improve exercise performance by increasing energy metabolism according to increasing PPAR ⁇ and PPAR ⁇ mRNA expression.
  • the administration of the composition of Example together with endurance exercise training shows a muscle increasing effect, reduces the increased lactic acid concentration during exercise to help improve muscle fatigue, and controls the expression of genes involved in mitochondrial biosynthesis and sugar metabolism to exercise It is believed to improve performance.
  • Ginseng leaf extract powder 10 mg of Ginseng leaf extract powder, 9 mg of vitamin E, 9 mg of vitamin C, 200 mg of galacto-oligosaccharide, 60 mg of lactose, and 140 mg of maltose were mixed and granulated using a fluidized bed dryer, followed by 6 mg of sugar ester.
  • Add Tablets are prepared by compressing 500 mg of these compositions in a conventional manner.
  • a powder passing through 200 mesh was obtained by pulverizing the extract of Ginseng japonica of Example. After appropriately kneading honey, dextrin, starch, microcrystalline cellulose, CMC calcium, etc., with 5 mg of the peduncle leaf powder, a pill was prepared.
  • a granule was prepared by mixing 5 mg of the Ginseng leaf extract, 9 mg of vitamin E, 9 mg of vitamin C, 250 mg of anhydrous crystalline glucose, and 550 mg of starch, molding into granules using a fluid bed granulator, and then filling into bags.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

본 발명은 돌외잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용, 또는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 돌외잎 추출물을 유효성분으로 포함하여 운동수행능력을 향상시키고 체력을 증진시키는데 우수한 효과를 나타내므로, 의약 분야 또는 기능성 식품 분야 등에서 매우 유용하게 활용될 것으로 기대된다.

Description

돌외잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용 조성물
본 발명은 돌외잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용 조성물에 관한 것이다.
복잡한 현대사회에서 환경오염에 의한 생활환경 악화, 정신적 스트레스 가중, 활동량 부족 등에 노출되어 있는 현대인들은 건강증진에 대한 관심이 나날이 증가하고 있다. 성인병 또는 노화의 예방책으로 운동이 가장 효과적이고 경제적이지만, 바쁜 일상생활과 피로 등으로 건강관리를 못하는 현대인들은 운동의 대안으로 다양한 기능성 식품 복용에 관심을 가지고 있다. 또한, 운동선수는 운동 종목에 따른 과학적인 훈련과 식이요법 이외에 운동능력 향상 보조제(ergogenic aids)를 사용하여 운동수행능력의 효율을 높인다. 운동능력 향상 보조제는 운동수행능력의 향상뿐만 아니라, 신체활동 시 체내에 축적되어 피로를 발생시키는 피로요소의 제거에도 효과가 있기 때문에 운동선수들뿐만 아니라 일반인들도 흔히 사용하고 있다.
운동능력 향상을 위한 기능성 보조제와 관련된 연구는 동서양을 막론하고 활발하게 수행되고 있다. 스테로이드, 카페인, 탄산수소나트륨, 또는 구연산나트륨 등과 같은 화합물을 포함하는 보조제는 운동 수행능력을 증가시키고 일상생활에도 활기를 주지만, 이는 일시적인 현상에 불과하고 건강에 치명적인 부작용을 수반할 위험이 있다.
이에 따라, 최근에는 식물 추출물과 같이 안전성이 보장된 천연물을 이용한 기능성 보조제 개발에 대한 필요성이 대두되고 있다.
이에, 본 발명자들은 돌외잎 추출물의 운동수행능력 향상 효과 및 근육 질환 개선 또는 치료 효과에 대하여 연구하는 과정에서, 운동수행능력 향상 효과가 현저히 증가된 돌외잎 추출물을 제조하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 돌외잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 돌외잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI을 100 : 20 내지 80의 중량비로 포함하는 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물을 유효성분으로 하는 운동수행능력 향상용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물은 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI을 20 내지 140 mg/g 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물은 상기 지페노사이드 L을 10 내지 80 mg/g, 및 상기 지페노사이드 LI을 10 내지 60 mg/g으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물은, 상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI의 총 100 중량부에 대하여 5 내지 10 중량부의 Rg3를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물은, 상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI의 총 100 중량부에 대하여 다물린 A 및 다물린 B를 50 내지 90 중량부로 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물은, 진세노사이드 Rg3를 1 ~ 14 mg/g, 지페노사이드 L를 10 ~ 80 mg/g, 지페노사이드 LI를 10 ~ 60 mg/g, 다물린 A를 10 ~ 20 mg/g 및 다물린 B를 10 ~ 20 mg/g으로 포함하고, 벤조피렌을 10 ppb 이하로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물은, 건조 돌외잎을 팽윤시키는 단계; 및 상기 팽윤시킨 돌외잎을 가열한 후 건조하는 단계; 및 상기 건조한 돌외잎을 추출하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조된 것일 수 있다. 또한 돌외 생잎을 곧바로 열처리한 후 건조하는 단계; 및 건조한 돌외잎을 추출하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조된 것일 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물은, 하기 (1) 내지 (5)의 방법에 따라 제조된 것일 수 있다:
(1) 반응용기에 건조 돌외잎을 넣고, 상기 건조 돌외잎 1 중량부에 대하여 0.5 내지 13 중량부의 물을 공급하는 단계;
(2) 상기 반응용기를 0.2 내지 10 ℃/min로 112 내지 150 ℃까지 승온시키면서 돌외잎을 팽윤시키는 단계;
(3) 상기 반응용기를 112 내지 150 ℃에서 10분 내지 24 시간 동안 가열하는 단계;
(4) 상기 반응용기의 압력을 해제하여 돌외잎을 건조시키는 단계; 및
(5) 상기 건조한 돌외잎을 40 내지 100 ℃에서 열수 추출 또는 에탄올 추출하는 단계.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (1) 단계의 건조 돌외잎은 돌외 생잎을 덖음 또는 증숙한 후 건조한 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 덖음 또는 증숙은 90 내지 300 ℃에서 5분 내지 120시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (1) 단계의 건조 돌외잎은 수분함량이 0.01 내지 70 중량%일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (2) 단계 후 (3) 단계 이전의 돌외잎의 수분 함량은 60 내지 95 중량%일 수 있다.
또한, 본 발명은 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI을 100 : 20 내지 80의 중량비로 포함하는 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물을 유효성분으로 하는 운동수행능력 향상용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 돌외잎 추출물을 유효성분으로 포함하여 운동수행능력을 향상시키고 체력을 증진시키는데 우수한 효과를 나타내므로, 의약 분야 또는 기능성 식품 분야 등에서 매우 유용하게 활용될 것으로 기대된다.
본 발명은 천연물 유래의 조성물이므로 부작용이 없이 안전하게 사용될 수 있어, 의약품 또는 식품 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 돌외잎 추출물의 제조방법을 보여주는 공정도이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
돌외(Gynostemma pentaphyllum)는 박과(Cucurbitaceae)에 속하는 여러해살이 덩굴식물이다. 산이나 들의 숲 속에서 자생하며 뿌리줄기는 옆으로 뻗고 마디에 흰털이 있고 엉키면서 자라지만 덩굴손으로 기어 올라가기도 한다. 서식지로는 국내에서는 남부지역, 제주도, 울릉도 지역의 산지에 자생하며, 국외에서는 중국, 일본, 동남아시아 등의 지역에 폭넓게 분포되어 있다. 대부분 주로 해안가, 강가 등 습도가 높은 곳에서 자란다.
돌외에는 자생하는 국가와 지역에 따라 여러 종이 있으며, 이 중에서 지노스테마(Gynostemma) 종은 30 여종이 알려져 있고, 산지에 따라서 그 함유성분과 함량의 차이가 많은 것으로 알려져 있다. 이 중에서 펜타필룸(pentapyllum) 종이 널리 분포되어 있으며, 종, 성분 및 효능에 대한 연구가 폭넓게 진행되어 왔다. 돌외에는 다양한 사포닌이 함유되어 있으며, 이들은 지노사포닌(gynosaponin) 또는 지페노사이드(gypenoside)라고 명명된다. 상기 지페노사이드는 화학구조로 볼 때 OH기가 어느 부분에 결합되어 있는가의 차이를 나타낼 뿐 그 구조는 인삼의 진세노사이드계와 유사한 구조를 갖고 있다. 돌외의 높은 사포닌 함량으로 인해 예로부터 돌외잎은 인삼 대용으로 자양강장제로 널리 음용되어 왔다.
상기 돌외 사포닌은 지질대사 개선작용, 심혈관계 질환 방어작용, 혈당강하 작용, 중추신경계 작용, 항암작용, 혈소판 응집 저해작용, 강장작용 등의 효능을 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한, 돌외는 사포닌인 지페노사이드(gypenoside) 이외에 프리메베로사이드(primeveroside), 소포로사이드 (sophoroside), 비스데스모사이드(bisdesmoside), 젠티오바이오사이드 (gentiobioside), 루티노사이드(rutinoside) 등의 배당체와 스테로이드, 당류 및 색소 등을 함유하고 있다.
본 명세서에서, “지페노사이드”는 트리테르페노이드 사포닌(triterpenoid saponin)을 의미한다.
본 명세서에서, “운동수행능력” 또는 “운동능력”은 일상생활이나 스포츠에서 볼 수 있는 신체동작을 외형적으로 달리기, 뛰기, 던지기, 헤엄치기 등으로 구분할 때, 상기 동작을 빠르게, 강하게, 정확하게, 오래, 능숙하게 할 수 있는 정도를 나타내는 것으로, 운동수행능력은 근력, 균형감각, 운동 협응, 민첩성 및 지구력 등의 인자로 규정된다. 용어 '운동수행능력 향상'은 운동수행능력을 개선하거나 향상시키는 것을 말하고, 구체적으로는, 지구력, 균형감각, 또는 근력을 개선하거나 향상시키는 것을 의미한다.
본 발명은 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI을 100 : 20 내지 80의 중량비로 포함하는 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물 (이하, ‘돌외잎 추출물’이라 통칭함)을 유효성분으로 하는, 운동수행능력 향상용 식품 조성물을 제공한다.
상기 지페노사이드 L은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2023000682-appb-img-000001
또한, 상기 지페노사이드 LI은 상기 지페노사이드 L의 부분입체 이성질체로서, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물이다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2023000682-appb-img-000002
상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI은 100 : 20 내지 80의 중량비, 바람직하게는 100 : 30 내지 70의 중량비, 더욱 바람직하게는 100 : 50 내지 70의 중량비일 수 있다.
상기 지페노사이드 L에 대한 지페노사이드 LI의 중량비가 상기 범위일 때 돌외잎 추출물의 운동수행능력 향상 효과가 극대화된다. 상기 지페노사이드 L에 대한 지페노사이드 LI의 중량비가 상기 하한치 미만인 경우에는 돌외잎 추출물의 운동수행능력 향상 효과가 미미해지고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 돌외잎 추출물의 운동수행능력 향상 효과가 오히려 감소하게 된다.
본 발명의 돌외잎 추출물은 상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI을 20 내지 140 mg/g, 바람직하게는 25 내지 140 mg/g, 더욱 바람직하게는 30 내지 120 mg/g, 더욱 바람직하게는 30 내지 100 mg/g, 바람직하게는 30 내지 60 mg/g 농도로 포함할 수 있다. 상기 돌외잎 추출물에 포함된 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI의 함량이 상기 범위일 때 돌외잎 추출물의 운동수행능력 향상 효과가 극대화된다. 상기 돌외잎 추출물에 포함된 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 돌외잎 추출물의 운동수행능력 향상 효과가 미미하고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 돌외잎 추출물의 운동수행능력 향상 효과가 오히려 감소할 수 있다.
상기 돌외잎 추출물은 상기 지페노사이드 L을 10 내지 80 mg/g, 바람직하게는 15 내지 80 mg/g, 더욱 바람직하게는 20 내지 60 mg/g 포함하고, 상기 지페노사이드 LI을 10 내지 60 mg/g, 바람직하게는 12 내지 48 mg/g 포함하는 것일 수 있다. 돌외잎 추출물 내 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI의 함량이 상기 범위일 때 돌외잎 추출물의 운동수행능력 향상 효과가 극대화될 수 있다.
상기 돌외잎 추출물은 상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI의 총 100 중량부에 대하여 5 내지 10 중량부의 Rg3를 더 포함할 수 있다.
돌외잎 추출물 내 상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI에 대한 Rg3의 중량비가 상기 범위 내인 경우에는 돌외잎 추출물의 운동수행능력 향상 효과가 더욱 높아진다. 상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI에 대한 Rg3의 중량비가 상기 하한치 미만인 경우에는 돌외잎 추출물의 운동수행능력 향상 효과가 감소할 수 있다.
또한, 상기 돌외잎 추출물은 상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI의 총 100 중량부에 대하여 다물린 A 및 다물린 B를 50 내지 90 중량부, 바람직하게는 60 내지 80 중량부 더 포함할 수 있다.
돌외잎 추출물 내 상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI에 대한 다물린 A 및 다물린 B의 총 중량비가 상기 범위 내인 경우에는 돌외잎 추출물의 운동수행능력 향상 효과가 더욱 높아진다.
본 발명의 상기 돌외잎 추출물은, 진세노사이드 Rg3를 1 ~ 14 mg/g, 지페노사이드 L를 10 ~ 80 mg/g, 지페노사이드 LI를 10 ~ 60 mg/g, 다물린 A를 10 ~ 20 mg/g 및 다물린 B를 10 ~ 20 mg/g으로 포함하고, 벤조피렌을 10 ppb 이하로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 돌외잎 추출물은, 건조 돌외잎을 팽윤시키는 단계; 및 상기 팽윤시킨 돌외잎을 가열한 후 건조하는 단계; 및 상기 건조한 돌외잎을 추출하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명자들은 건조 돌외잎에 물을 공급하여 충분히 팽윤시키고, 습윤 상태에서 일정 시간 동안 고온 열처리함으로써 고배당체 사포닌을 저배당체로 충분히 전환시켰다. 또한 상기 팽윤시킨 돌외잎을 본 발명의 방법으로 열처리하는 경우 돌외잎에 포함되어 있는 단백질, 탄수화물, 지질 성분들이 벤조피렌으로 전환되는 양이 적어지고, Rg3, 지페노사이드 L, 지페노사이드 LⅠ, 다물린 A 및 다물린 B 등의 저분자 유효 사포닌의 함량이 증가함을 확인하였다. 특히, 본 발명에 따르면 상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI의 중량비가 100 : 20 내지 80의 중량비이고, 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI을 20 내지 140 mg/g, 바람직하게는 25 내지 140 mg/g로 포함하는 돌외잎 추출물을 제조할 수 있다. 또한, 돌외잎을 덖음 또는 증숙하거나, 팽윤시킨 후 고온 열처리하는 과정에서 형성된 벤조피렌이 반응용기의 압력(밀폐) 해제에 의해 수증기와 함께 증발되므로, 벤조피렌 함량이 저감된 돌외잎 추출물을 제조할 수 있다.
본 명세서에서, 상기 저분자 유효 사포닌은 ‘저배당체 사포닌’ 및 ‘저분자 사포닌’이라고도 지칭한다.
더욱 구체적으로, 본 발명의 돌외잎 추출물은, 하기 (1) 내지 (5)의 방법에 따라 제조되는 것일 수 있다.
본 발명자들은 운동수행능력 향상 효과가 있는 돌외잎 추출물의 제조방법에 대하여 연구를 거듭하였으며, 그 과정에서 (1) 반응용기에 건조 돌외잎을 넣고, 상기 건조 돌외잎 1 중량부에 대하여 0.5 내지 13 중량부의 물을 공급하는 단계; (2) 상기 반응용기를 0.2 내지 10 ℃/min로 112 내지 150 ℃까지 승온시키면서 돌외잎을 팽윤시키는 단계; (3) 상기 반응용기를 112 내지 150 ℃에서 10분 내지 24 시간 동안 가열하는 단계; (4) 상기 반응용기의 압력을 해제하여 돌외잎을 건조시키는 단계; 및 (5) 상기 건조한 돌외잎을 40 내지 100 ℃에서 열수 추출 또는 에탄올 추출하는 단계;를 포함하는 방법에 따라 제조된 돌외잎 추출물의 운동수행능력 향상 효과, 근육 질환 예방, 개선 또는 치료 효과가 현저히 증가함을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
먼저 (1) 단계에서는 반응용기에 건조 돌외잎을 넣고, 상기 건조 돌외잎 1 중량부에 대하여 0.5 내지 13 중량부의 물을 공급한다. 상기 반응용기는 가압 밀폐용기일 수 있다. 본 발명은 반응용기에 건조 돌외잎 및 물을 공급한 후 밀폐하여 수행된다.
상기 건조 돌외잎은 돌외잎을 건조한 것을 의미하고, 자연건조 돌외잎, 반건조 돌외잎, 및 덖음 또는 증숙한 후 건조한 돌외잎 등을 포함한다.
구체적으로, 상기 건조 돌외잎은 돌외 생잎을 90 내지 300 ℃에서 5분 내지 120 시간 동안 덖음 또는 증숙한 후 건조한 것일 수 있다.
돌외잎은 유효물질들의 전구체가 대부분 배당체이므로 원칙적으로 고온을 가하게 되면 돌외잎에 함유되어 있는 당 또는 지질 성분들과의 결합이 끊어져 유효성분의 함량을 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 덖음처리 같이 고온을 가함으로써 돌외잎에 함유된 분해효소를 불활성화하여 경시적인 성분 변화를 최대한 억제할 수 있게 된다.
일반적으로, 덖음은 생잎을 개방된 용기에서 일정 온도 이상으로 열처리하는 것으로 유해균을 살균하여 변패를 막고, 생잎에 남아있는 분해효소 활성을 정지시켜 저장성, 향 및 풍미를 증가시키기 위해 일반적으로 수행되는 공정이다. 덖음은 고온으로 인해 생성되는 벤조피렌이나 불균일한 온도로 인해 유효성분 전구체가 유효성분으로 전환되는 비율이 일정하지 않아 과도한 벤조피렌이 생성될 뿐만 아니라 짧은시간 진행되고 수분소실로 인해 저분자 유효 사포닌으로의 전환율이 낮아지게 된다.
따라서, 본 발명에서 상기 덖음 또는 증숙은 90 내지 300 ℃, 바람직하게는 90 내지 200 ℃, 더욱 바람직하게는 90 내지 150 ℃에서 20분 내지 120 시간, 바람직하게는 30분 내지 30 시간, 더욱 바람직하게는 1 내지 10 시간 동안 수행되는 것일 수 있다. 상기 온도범위에서 덖음 또는 증숙 처리를 할 때 돌외잎에 함유된 유효성분의 소실은 막으면서도 벤조피렌 생성은 저감시킬 수 있어 유리하다.
또한, 상기 덖음 또는 증숙과 같은 가열처리는 벤조피렌 함량 저감 및 유효물질 함량 증대 면에서 덖음 처리인 것이 더욱 바람직하며, 상기 덖음은 특별히 제한되지는 않으나 나무불에 의한 덖음, 가스불에 의한 덖음, 전기히터에 의한 덖음 등이 있을 수 있다. 상기 나무불에 의한 덖음은 나무불에 의해 가열된 솥에, 가스불에 의한 덖음은 중간 정도의 가스불로 가열된 솥에, 전기히터에 의한 덖음은 회전형의 전기히터 원통에 돌외잎을 넣고 덖는 것일 수 있다. 상기 방법 중 벤조피렌 함량을 저감시키면서도 유효물질의 함량을 증대시키기 위해서는 전기히터에 의한 덖음이 더욱 바람직하다.
반면 돌외잎을 덖음처리하지 않고 자연건조만 할 경우 고배당체 사포닌들의 저분자 유효 사포닌으로의 전환이 거의 이루어지지 않을 수 있다.
본 발명자들은 돌외잎의 저분자 유효 사포닌의 함량을 최대한 높이기 위해 생잎 상태에서 덖음 등의 열처리가 이루어져야 한다는 사실을 발견하였다. 또한, 사포닌 전구체와 저분자 유효 사포닌 성분들 간의 관계(Chen 등, J. Chromatogr. B Analyt Technol Biomed life Sci, 969 : pp. 42-52)에 근거하여, 돌외의 생잎에 덖음처리를 하게 되면 사포닌을 분해하는 효소의 활성을 제거함으로써 총사포닌 총량을 유지할 수 있고, 여기에 고온 열처리를 하게 되면 저분자 유효 사포닌으로 전환되는 것이라 추정하였다.
상기 건조 돌외잎은 수분함량이 0.01 내지 70 중량%, 바람직하게는 0.02 내지 50 중량%, 더욱 바람직하게는 0.03 내지 15 중량%일 수 있다.
본 발명은 상기 건조 돌외잎 1 중량부에 대하여 물 0.5 내지 13 중량부, 바람직하게는 1 내지 10 중량부, 더욱 바람직하게는 2 내지 8 중량부, 더욱 바람직하게는 3 내지 5 중량부를 공급할 수 있다. 한편, 상기 건조 돌외잎이 아닌 돌외생잎을 덖은 후 덜 건조한 상태라면 추가하는 물의 양이 줄어들 수 있다.
상기와 같이 건조 돌외잎에 물을 공급하는 이유는 돌외잎의 수분 함량을 증가시킴으로써 돌외잎을 충분히 팽윤시키기 위함이다. 즉, 본 발명에서 돌외잎에 물을 공급하는 것은 오직 돌외잎이 “팽윤(swelling)”되도록 하기 위한 것으로, 돌외잎이 용매에 완전히 잠기도록 하는“침지” 또는 용매를 충분히 공급하여 돌외잎의 유효성분이 용매로 용출되도록 하는“추출”과는 완전히 다르다. 돌외잎이 충분히 팽윤되면, 이후의 가열처리 단계에서 고배당체 사포닌의 저분자 유효 사포닌으로의 전환율이 현저히 증가하게 된다.
따라서, 본 발명에서, 상기 돌외잎에 공급되는 물의 양이 매우 중요하다. 상기 공급되는 물의 양은 돌외잎이 수분을 흡수하여 충분히 “팽윤”될 정도의 양이면 되고, 그를 초과하여 공급하는 경우에는 돌외잎에 함유된 유효성분이 용출될 수 있어 이를 다시 돌외잎으로 흡수시켜야 하므로 바람직하지 않다.
상기 물의 양이 상기 하한치 미만인 경우에는 돌외잎이 충분히 팽윤되지 않아 이후 열처리 과정에서 저분자 유효 사포닌으로의 전환이 충분하지 않을 수 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 돌외잎에 함유된 유효 사포닌이 용출되어 돌외잎에 함유된 저분자 유효 사포닌의 함량이 오히려 감소할 수 있다.
다음으로, (2) 단계에서는 상기 반응용기를 0.2 내지 10 ℃/min, 바람직하게는 0.2 내지 5 ℃/min, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 2.5 ℃/min, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 2.5 ℃/min, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 1.5 ℃/min로 112 내지 150 ℃, 바람직하게는 115 내지 130 ℃, 더욱 바람직하게는 120 내지 130 ℃까지 승온시킨다. 이 단계는 상기 건조 돌외잎을 충분히 팽윤시키기 위한 단계이다.
상기 승온 속도가 상기 하한치 미만인 경우에는 목표 온도까지 승온시키기 위한 시간이 너무 길어지게 되고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 돌외잎이 충분히 팽윤되지 않을 수 있다. 또한, 상기 조건으로 승온시키지 않는 경우에는 건조 돌외잎이 충분히 팽윤되지 않을 수 있다.
상기의 승온으로 인해, 돌외잎이 충분이 팽윤되어 돌외잎 내 수분함량이 60 내지 95%, 바람직하게는 70 내지 90%, 더욱 바람직하게는 75% 내지 85%에 이르게 된다. 이에 따라, 이후의 가열 단계에서 고배당체 사포닌의 저분자 유효 사포닌으로의 전환이 더욱 잘 이루어지게 된다.
상기 돌외잎 내 수분함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 돌외잎의 팽윤이 충분하지 않아 이후의 가열 단계에서 고배당체 사포닌의 저분자 유효 사포닌으로의 전환이 더욱 잘 이루어지지 않게 되고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 상기 돌외잎 내의 수분함량을 증가시키기 위한 노력 또는 비용 대비 효과가 미미하여 경제적이지 않다.
다음으로, (3) 단계에서는 상기 반응용기를 112 내지 150 ℃에서 10분 내지 24 시간 동안 가열한다. 상기 가열 처리에 의해 (2) 단계에서 수분을 흡수하여 팽윤된 돌외잎 내의 저분자 유효 사포닌 전구체들이 탈당 가수분해되어 저분자 유효 사포닌으로 전환될 수 있다. 또한 돌외잎에 포함된 벤조피렌이 증발하게 된다.
상기 가열 온도는 112 내지 150 ℃, 바람직하게는 115 내지 135 ℃, 더욱 바람직하게는 120 내지 135 ℃, 더욱 바람직하게는 120 내지 130 ℃일 수 있다. 가열 온도가 상기 하한치 미만인 경우에는 저분자 유효 사포닌 전구체들의 저분자 유효 사포닌으로의 전환율이 낮아지고 전환시간이 길어지게 되며, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 에너지 효율과 안전성의 문제가 대두될 수 있고, 사포닌의 분해, 벤조피렌 증가를 유발할 수 있다.
또한, 상기 가열 시간은 10분 내지 24 시간, 바람직하게는 10분 내지 10 시간, 더욱 바람직하게는 20분 내지 8시간, 더욱 바람직하게는 30분 내지 8 시간, 더욱 바람직하게는 1 내지 4 시간일 수 있다.
가열 시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 저분자 유효 사포닌 전구체들의 저분자 유효 사포닌으로의 전환율이 낮아질 뿐만 아니라 벤조피렌 증발이 덜 일어날 우려가 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 저분자 유효 사포닌이 분해되어 함량이 오히려 감소하고, 벤조피렌 함량이 증가하게 된다.
상기 가열처리에 대한 구체적인 예시는, 상기 가열 온도가 120 ℃인 경우에는, 가열 시간이 1 내지 12 시간, 바람직하게는 4 내지 8 시간, 바람직하게는 2 내지 4 시간일 수 있고, 상기 가열 온도가 130 ℃인 경우에는 가열 시간이 30분 내지 4 시간, 바람직하게는 1 내지 3 시간일 수 있으며, 가열 온도가 140 ℃인 경우에는 가열 시간이 20분 내지 3 시간, 바람직하게는 30분 내지 2 시간일 수 있고, 가열온도가 150 ℃인 경우에는 가열 시간이 10분 내지 4시간, 바람직하게는 10분 내지 1시간, 더욱 바람직하게는 20분 내지 1시간, 더욱 바람직하게는 30분 내지 1시간일 수 있다.
그 다음으로, (4) 단계에서는 상기 반응용기의 압력을 해제하여 돌외잎을 건조시킨다. 상기 반응용기는 상기 (3) 단계에서의 가열로 인해 반응용기 내의 온도와 압력이 증가한 상태이므로, 상기 반응용기의 압력을 해제하면 반응용기 내의 수증기가 빠르게 증발하면서 상기 돌외잎이 감압건조되는 효과가 발생한다. 동시에 벤조피렌도 같이 증발되어 배출된다.
상기 돌외잎은 수분함량 80 중량% 미만, 바람직하게는 30 내지 75 중량%, 더욱 바람직하게는 30 내지 50 중량%로 반건조 상태가 된다.
본 발명의 돌외잎 제조방법은 상기 (4) 단계 이후에, (4-1) 상기 건조한 돌외잎을 추가로 건조하는 단계;를 추가하여 수행할 수 있다.
상기 건조는 열풍건조, 동결건조, 진공건조, 감압건조, 자연건조 등 어떤 방식으로든 제한받지 않는다.
상기 건조는 돌외잎의 수분함량이 30 중량% 미만, 바람직하게는 0.1 내지 15 중량%가 될 때까지 수행될 수 있다.
다음으로, (5) 단계에서는 상기 (4) 단계에서 건조한 돌외잎을 40 내지 100 ℃, 바람직하게는 50 내지 100 ℃, 더욱 바람직하게는 70 내지 100 ℃, 더욱 바람직하게는 80 내지 100 ℃에서 상압 열수 추출, 또는 에탄올 추출한다. 상기 추출온도가 상기 하한치 미만인 경우에는 저분자 유효 사포닌 성분의 추출 효율이 감소할 수 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 온도를 증가시키기 위한 노력 및/또는 비용 대비 추출 효율이 낮으므로 경제적이지 않다.
바람직하게는, 상기 (5) 단계의 추출은 2회 반복 수행하되, 1차 추출은 40 내지 100 ℃에서의 열수 추출, 및 2차 추출은 40 내지 80%(v/v) 에탄올 추출을 함으로써 추출 수율을 높이고, 돌외잎 추출물 내 사포닌 성분의 함량을 증가시킬 수 있다. 상기 돌외잎 추출물의 사포닌 함량을 높이기 위해서 1차 추출, 및 2차 추출 모두 에탄올 수용액을 추출용매로 사용할 수도 있으며, 추출횟수 또한 2회를 초과할 수도 있으나 회수율 대비 비용 측면에서 바람직하지는 않다.
상기와 같이 제조된 본 발명의 돌외잎 추출물은 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI를 100 : 20 내지 80, 바람직하게는 100 : 30 내지 70의 중량비, 더욱 바람직하게는 100 : 50 내지 70의 중량비로 포함하고, 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI을 20 내지 140 mg/g, 바람직하게는 25 내지 140 mg/g, 더욱 바람직하게는 30 내지 120 mg/g, 더욱 바람직하게는 30 내지 100 mg/g, 바람직하게는 30 내지 60 mg/g 포함하므로, 운동수행능력 향상 효과가 매우 우수하다. 또한, 본 발명의 돌외잎 추출물은 고압처리나 고온처리를 하지 않고도 진세노사이드 Rg3, 지페노사이드 L, 지페노사이드 LI, 다물린 A 및 다물린 B 등의 저분자 유효 사포닌의 함량은 높고, 추출수율이 높으며, 벤조피렌은 함량은 낮으므로 매우 유용하다.
또한 상기 돌외잎 추출물은 진세노사이드 Rg3를 1 ~ 14 mg/g, 지페노사이드 L를 15 ~ 80 mg/g, 지페노사이드 LI를 10 ~ 60 mg/g, 다물린 A를 10 ~ 20 mg/g 및 다물린 B를 10 ~ 20 mg/g으로 포함하고, 벤조피렌을 10 ppb 이하(예를 들어, 0.01 ~ 10 ppb 범위 내)로 포함한다.
더욱 구체적으로, 상기 돌외잎 추출물은 진세노사이드 Rg3을 1 ~ 14 mg/g, 바람직하게는 2.0 ~ 7.0 mg/g, 더욱 바람직하게는 2.0 ~ 5.0 mg/g, 더욱 바람직하게는 2.0 ~ 4.0 mg/g, 더욱 바람직하게는 2.5 ~ 3.5 mg/g로 포함할 수 있다. 또한, 지페노사이드 L을 15 ~ 80 mg/g, 바람직하게는 20 ~ 40 mg/g, 더욱 바람직하게는 20 ~ 30 mg/g, 더욱 바람직하게는 20 ~ 25 mg/g로 포함할 수 있다. 또한, 지페노사이드 LI를 10 ~ 60 mg/g, 바람직하게는 10 ~ 30 mg/g, 더욱 바람직하게는 10 ~ 20 mg/g, 더욱 바람직하게는 10 ~ 15 mg/g로 포함할 수 있다. 또한, 다물린 A를 10 ~ 20 mg/g, 바람직하게는 10 ~ 15 mg/g로 포함할 수 있다. 또한, 다물린 B를 10 ~ 20 mg/g, 바람직하게는 10 ~ 15 mg/g로 포함할 수 있다.
상기 돌외잎 추출물은 농축액 또는 건조 분말 상태로 제조될 수도 있다. 구체적으로는 상기 여과된 돌외잎 추출물은 60 내지 70 brix로 농축하여 이용할 수 있다. 또는, 상기의 돌외잎 추출물은 진공건조, 동결건조 또는 분무건조 등과 같은 추가적인 과정을 거친 분말 상태로 제조될 수도 있다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 건강기능성 식품(health functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물 일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, “건강기능식품”은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물에서 상기 돌외잎 추출물의 함량은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 100 중량%로 함유될 수 있고, 바람직하게는 0.05 내지 50 중량%로 함유될 수 있다. 상기 돌외잎 추출물의 함량이 상기 범위 미만인 경우에는 돌외잎 추출물에 의한 효과를 기대하기 어려운 문제가 있다.
상기 건강기능성 식품 조성물은 담체, 희석제, 부형제, 및 첨가제 중 하나 이상을 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액체 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형화될 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물의 구체적인 예로서 본 발명의 돌외잎 추출물을 차, 쥬스 또는 드링크 등의 형태로 제조하여 음용하도록 할 수 있다. 또한, 본 발명의 돌외잎 추출물을 운동수행능력 향상 효과, 근육량 증대 효과 또는 근손실 억제 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 식품 조성물은 돌외잎 추출물 이외에 미량의 미네랄, 비타민, 당류 및 공지의 운동수행능력 향상 효과, 근육량 증대 효과 또는 근손실 억제 효과를 가진 성분 등을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 돌외잎 추출물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 중의 상기 식품 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001 내지 100 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 50 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 30 중량%로 가할 수 있다. 그러나 운동수행능력 향상을 목적으로 하거나, 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에, 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI을 100 : 20 내지 80의 중량비, 바람직하게는 100 : 30 내지 70의 중량비, 더욱 바람직하게는 100 : 50 내지 70의 중량비로 포함하는 돌외잎 추출물을 유효성분으로 하는 운동수행능력 향상용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 돌외잎 추출물은 상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI을 20 내지 140 mg/g, 바람직하게는 25 내지 140 mg/g, 더욱 바람직하게는 30 내지 120 mg/g, 더욱 바람직하게는 30 내지 100 mg/g, 바람직하게는 30 내지 60 mg/g 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 운동수행능력 향상용 약학 조성물은 운동능력의 퇴화로 인한 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 이와 관련된 질환의 예로는 퇴행성 질환, 미토콘드리아 이상 질환, 지구력 저하증, 순발력 저하증, 무기력증, 근육 폐기 및 우울증 등을 들 수 있다. 본 발명의 조성물은 운동수행능력 향상 효과가 있으며, 운동의 형태 및 종류를 제한하지 않는다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토텍스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유체 및 제제화에 관해서는 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 경구투여, 피부외용제 등으로 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용) 할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
또한 상기 조성물로부터 선택되는 투여 수준은 화합물의 활성, 투여 경로, 치료되는 병태의 중증도 및 치료되는 환자의 병태 및 이전 병력에 따를 것이다. 그러나 원하는 치료 효과의 달성을 위해 요구되는 것보다 낮은 수준의 화합물의 용량에서 시작하여, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 서서히 증가시키는 것은 당업계의 지식 내에 있으며, 바람직한 투여량은 나이, 성별, 체형, 체중에 따라 결정될 수 있다. 상기 조성물은 약제학상 허용 가능한 제약 제제로 제제화 되기 전에 추가로 가공될 수 있으며, 바람직하게는 더 작은 입자들로 분쇄 또는 연마될 수 있다. 또한 상기 조성물은 병태 및 치료되는 환자에 따라 달라질 것이지만, 이는 비-독창적으로 결정할 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 돌외잎 추출물의 유효 용량은 0.001 ~ 400 mg/kg이고, 바람직하게는 0.01 ~ 100 mg/kg이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI을 100 : 20 내지 80의 중량비, 바람직하게는 100 : 30 내지 70의 중량비, 더욱 바람직하게는 100 : 50 내지 70의 중량비로 포함하는 돌외잎 추출물을 유효성분으로 하는 근육 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 돌외잎 추출물은 상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI을 20 내지 140 mg/g, 바람직하게는 25 내지 140 mg/g, 더욱 바람직하게는 30 내지 120 mg/g, 더욱 바람직하게는 30 내지 100 mg/g, 바람직하게는 30 내지 60 mg/g 농도로 포함할 수 있다.
하기 실시예에서, 본 발명의 돌외잎 추출물이 지페노사이드 화합물을 유효성분으로 포함함으로써, ROS 생성을 감소시키고, 근육 내 미토콘드리아 기능에 관여하는 PGC-1α와 AMPK를 활성화하는데 우수한 효과가 있다. 또한, 산화적 스트레스로부터 미토콘드리아를 보호하고 근육 손상을 억제시킬 수 있는 항산화 유전자의 발현을 조절하는 Nrf2를 활성화하고 근육 내 미토콘드리아의 복제에 관여하는 TFAM, CPT-1β, mtDNA의 발현을 증가시키며 근육 타입의 변화와 에너지 생성에 관여하는 GSY, SIRT1, PPARγ의 발현을 향상시킬 수 있으므로 운동 수행능력 향상시키는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한 근피로 개선 효과와 탈진 시까지의 운동시간과 운동량 증가 및 근육 내 글리코겐 함량 증대를 통해 운동수행능력을 향상시킬 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 돌외잎 추출물에 대해 실시예를 들어 상세히 설명하기로 한다.
<실시예>
실시예: 돌외잎 추출물의 제조 - 덖음처리 후 건조, 수분 공급(팽윤), 고온열처리
(1) 돌외 생잎 10 kg을 전기히터를 이용하여 300 ℃에서 1 시간 동안 덖음처리한 후 수분함량 8%가 되도록 건조시켜, 건조 돌외잎 728 g을 수득하였다.
이후, 가압 밀폐용기에 상기 건조 돌외잎 100 g 및 물 400 g을 공급하고 밀폐하였다.
(2) 상기 가압 밀폐용기에 열을 가하여 1분에 1.0 ℃씩, 120 ℃까지 승온시켜, 상기 밀폐용기 내의 돌외잎을 팽윤되도록 하였다(돌외잎의 수분함량: 80 중량%).
(3) 이후, 상기 가압 밀폐용기를 120 ℃에서 4 시간 동안 가열하였다.
(4) 상기 가압 밀폐용기에 열을 가하는 것을 중단하고, 밀폐용기 내의 압력을 해제하여 개방하였다. 이후, 상기 압력 해제로 인해 반건조된 돌외잎을 회수하였다(돌외잎의 수분함량: 65 중량%).
(5) 상기 회수한 돌외잎을 65 ℃로 열풍건조하여, 수분함량 8%의 돌외잎 98.5 g을 수득하였다.
(6) 상기 돌외잎 100 g에 50% v/v 주정 1,500 ml을 가하고, 80 ℃에서 2시간 동안 2회 추출, 감압농축 및 동결건조한 후 분말화하여 돌외잎 추출물 31.5g(추출수율 31.5%)을 회수하였다.
비교예 1: 자연건조 - 일반추출
돌외 생잎을 그늘에 잘 펴서 수분함량 8%가 되도록 자연 건조하여 건조 돌외잎을 제조하였다.
상기 건조 돌외잎을 15배 부피에 해당하는 80 ℃ 주정(50% v/v)으로 2회 추출하여 돌외잎 추출물을 제조한 후 감압농축 및 동결건조하여 분말화하고, 이후 실험에서의 분석시료로 이용하였다.
비교예 2: 덖음처리 후 건조 - 일반추출
돌외 생잎을 전기히터를 이용하여 150 ℃에서 덖음처리한 후 수분함량 8%가 되도록 건조하여 건조 돌외잎을 제조하였다.
상기 건조 돌외잎을 15배 부피에 해당하는 80 ℃ 주정(50% v/v)으로 2회 추출하여 돌외잎 추출물을 제조한 후 감압농축 및 동결건조하여 분말화하고, 이후 실험에서의 분석시료로 이용하였다. 덖은 돌외잎의 2차에 걸친 주정추출 수율은 평균 20.4%였다.
비교예 3: 덖음처리 후 건조 - 고온추출
돌외 생잎을 전기히터를 이용하여 150 ℃에서 덖음처리한 후 수분함량 8%가 되도록 건조하여 건조 돌외잎을 제조하였다.
상기 건조 돌외잎에 15배 부피에 해당하는 물을 가한 후 120 ℃에서 2 시간 동안 열수추출하여 돌외잎 열수추출물을 제조하였다. 이후, 상기 열수추출하고 남은 잔사를 15배 부피에 해당하는 80 ℃ 주정(50% v/v)으로 추출하여 돌외잎 에탄올 추출물을 제조하였다. 추출 수율은 36.8%였다. 상기 돌외잎 열수추출물 및 에탄올 추출물을 혼합한 후, 상기 혼합물을 감압농축 및 동결건조하여 분말화하고, 이후 실험에서의 분석시료로 이용하였다.
비교예 4: 덖음처리 후 건조 - 스팀처리 - 고온추출
등록특허공보 제10-2064387호의 실시예 1에 따라 돌외잎 추출물을 제조하였다.
구체적으로, (1) 전기히터를 이용하여 135℃에서 2 시간 동안 덖음처리한 후 건조시킨 돌외잎을 121℃에서 60분 동안 스팀처리하였다. 상기 스팀처리한 돌외 잎 100g에 1L의 물을 가하고 1 시간 동안 침지시킨 다음, 121 ℃, 1.2 기압에서 4 시간 동안 추출한 후 상층액을 회수하여 열수 추출물을 제조하였다.
(2) 상기 돌외잎을 열수 추출하고 남은 잔사(잔여물) 100 g에 50 부피% 에탄올 수용액 1L를 가하고 80 ℃에서 3 시간 동안 추출한 후 상층액을 회수하여 알코올 추출물을 제조하였다.
(3) 상기 (1) 단계의 열수 추출물, (2) 단계의 알코올 추출물을 1 : 1의 부피비로 혼합한 후 여과하였으며, 고형분 함량이 20~25중량%가 되도록 감압농축하고, 동결건조하여 돌외잎 추출물을 제조하였다.
<시험방법>
저분자 유효사포닌 분석 방법
상기 실시예 및 비교예 1 내지 4의 돌외잎 추출물의 유효성분 함량을 측정하기 위하여, 하기 표 1의 조건 및 방법으로 HPLC 분석을 하였다. 분석을 위하여, 상기 실시예 및 비교예 1 내지 4의 돌외잎 추출물 시료를 각각 200 ㎎씩 취하여 50% MeOH 5 ㎖에 녹인 후 HPLC 분석을 위해 사용하였다.
표준품으로서, 다물린 A(순도 99.1%) 및 다물린 B(순도 95.96%)는 Chengdu Biopurify Phytochemicals (중국)로부터, Gypenoside L(순도 99.42%)은 Shanghai yuanye Bio-Technology(중국)로부터, Gypenoside LI(순도 99.33%)는 한국 생명공학 연구원으로부터, Gynsenoside Rg3(순도 98.24%)는 Ambo(한국)로부터 구입하여 사용하였다.
Detector DAD or PDA (204 nm)
Column ZORBAX Eclipse Plus C18
Flow rate 1.0 mL/min
Injection volume 10 μL
Mobile phase Solvent A : DW, Solvent B : Acetonitrile
Time (min) Solvent A (%) Solvent B (%)
0 60 40
20 60 40
35 50 50
40 50 50
40.1 0 100
50 0 100
50.1 60 40
60 60 40
<시험예>
시험예 1. 제조 방법에 따른 돌외잎의 유효 성분 함량 분석
상기 실시예 및 비교예에 따른 분석시료를 이용하여 시험예 1과 동일한 방법으로 각각의 시료에 함유된 저분자 유효 사포닌 함량을 측정하여 하기 표 6에 비교하여 나타내었다.
구분(mg/g) Gyp L Gyp LI Gyp L:Gyp LI Rg3 다물린 A 다물린 B 벤조피렌
(ppb)
실시예 23.05 13.92 100 : 60.39 2.65 13.28 11.27 6.8
비교예 1 0.00 0.00 - 0.00 0.00 0.00 1.21
비교예 2 0.17 0.05 100 : 29.41 0.03 0.00 0.00 25.66
비교예 3 14.02 11.28 100 : 80.46 1.21 9.82 7.62 12.56
비교예 4 28.97 28.26 100 : 97.56 3.26 12.07 10.59 2.83
상기 표 2를 살펴보면, 본 발명의 실시예에 따른 돌외잎 추출물은 상기 지페노사이드 L(Gyp L) 및 지페노사이드 LI(Gyp LI)의 중량비가 100 : 60.39이고, 지페노사이드 L(Gyp L) 및 지페노사이드 LI(Gyp LI)를 총 36.97 mg/g 포함하는 것을 확인할 수 있다.
또한, 비교예 1은 지페노사이드 화합물의 함량이 검출한계 이하이거나, 그 함량이 매우 낮은 것으로 나타났다.
한편, 비교예 3 및 비교예 4는 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI의 중량비가 100 : 20 내지 80의 범위를 벗어나는 것으로 나타났고,
비교예 2 및 비교예 3은 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI의 총 함량이 30 mg/g 미만인 것으로 나타났다.
< 인비트로 시험 >
<재료 및 방법>
1. 시험물질
양성대조물질로는 Creatine monohydrate (Cr)를 사용하였고, 모든 시험물질은 ㈜비티씨에서 제공하였다.
2. 세포배양 및 분화 유도
생쥐의 골격근육에서 유래한 근원세포 (myoblast)인 C2C12 세포는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입하여 사용하였다. C2C12 세포는 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 세포배양액을 사용하여 37℃ 습윤한 CO2 배양기 (5% CO2/95% air)에서 배양하였다. 세포가 배양접시의 80% 정도 찼을 때, phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4)으로 세포 단층을 씻어낸 후 trypsin-2.65 mM EDTA를 첨가하여 세포를 떼어내어 계대 배양하였고, 배지는 2일마다 교환하였다.
C2C12 세포가 배양접시의 90% 정도 찼을 때 근세포로 분화를 유도하기 위해 DMEM 배지에 2% horse serum (Gibco-Thermo Fisher Scientific)를 첨가한 근세포 분화배양액으로 교환하여 세포를 배양하였고, 근세포분화배양액은 2일마다 교환하였다.
3. 근세포 분화 유도 및 시험물질 처리
C2C12 세포를 2 × 105 cells/well로 6-well plate에 분주하고, 24시간 동안 안정화시켰다. 각각의 시험물질이 근세포 분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 근세포 분화배양액에 각 시험물질을 첨가하여 세포에 처리하였다. 하기 표 3과 같이 시험물질을 처리한 근세포분화배양액으로 세포배양액을 교환하여 4일 (mRNA 분석) 또는 7일간 (단백질 분석) 세포를 배양하였다.
시험군 시험물질
G1 - -
G2 실시예 20 ㎍/mL
G3 비교예 1 20 ㎍/mL
G4 비교예 2 20 ㎍/mL
G5 비교예 3 20 ㎍/mL
G6 비교예 4 20 ㎍/mL
G7 Cr 5 ㎍/mL Cr
4. Reactive oxygen species (ROS) 측정
C2C12 세포를 1 × 104 cells/well이 되도록 96-well plate에 분주하고 24시간 세포를 배양하였다. 이후 각각의 시험물질을 함유한 근세포분화배양액으로 교환하여 세포를 1시간 배양하였다. 1시간 후 세포를 PBS로 씻어주고 50 μM tert-butyl hydrogen peroxide (TBHP)를 함유한 배양액으로 3시간 동안 추가배양한 후 DCF-DA Assay Kit (Abcam)을 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 세포 내 ROS 수준을 측정하였다.
5. Total cell lysate 준비 및 단백질 발현 조사 (Western blot analysis)
C2C12 세포를 2 × 105 cells/well로 6-well plate에 분주하고, 24시간 동안 안정화시켰다. 시험물질을 함유한 근세포분화배양액으로 세포배양액을 교환하여 7일간 배양하였다. 7일간 분화 유도된 세포에 lysis buffer (20 mmol/L HEPES, pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA, 100 mmol/L NaF, 10 mmol/L sodium pyrophosphate, 1 mmol/L Na3VO4, 20 μg/mL aprotinin, 10 μg/mL antipain, 10 μg/mL leupeptin, 80 μg/mL benzamidine HCl, 0.2 mmol/L PMSF)를 첨가한 후 균질화하고, 원심 분리하여 total cell lysate를 얻었다. Total cell lysate의 단백질 양은 BCA protein assay Kit (Thermo Scientific)을 사용하여 측정하였다. Total cell lysate (50 μg)를 10 % sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리한 후, polyvinylidene difluoride membrane (Milipore)에 이동시켰다. Membrane을 5% skim milk-TBST (20 mmol/L Tris·HCl, pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 0.1% Tween 20)에서 1시간 동안 blocking한 후, 측정하고자 하는 항체를 각각 첨가하여 4℃에서 16시간 동안 또는 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 사용한 항체 정보는 하기 표 4에 나타내었다. 그 후 horseradish peroxidase (HRP)-linked anti-rabbit IgG 또는 HRP-linked anti-mouse IgG를 첨가하여 1시간 교반하였으며, 검출된 단백질 밴드는 LuminataTM Forte Western HRP Substrate (Millipore)를 사용하여 enhanced chemiluminscence 방법으로 가시화하였다. 단백질 발현 수준은 ImageQuantTM LAS 500 imaging ystems (GE Healthcare Bio-Sciences AB)을 사용하여 정량하였다.
항체명 세부정보 제조회사
p-AMPK Phospho-AMPKα (Thr172) Cat No. #2535 Cell Signaling Technology
AMPK AMPKα Cat No. #2532 Cell Signaling Technology
p-p38 Phospho-p38 MAPK
(Thr180/Tyr182)		 Cat No. #9211 Cell Signaling Technology
p38 p38 MAPK Cat No. #9212 Cell Signaling Technology
p-Sirt1 Phospho-Sirt1 (Ser47) Cat No. #2314 Cell Signaling Technology
Sirt1 Sirt1 Cat No. #9475 Cell Signaling Technology
p-NRF2 Phospho-NRF2 (Ser40) Cat No. ab76026 Abcam
NRF2 NRF2 Cat No. ab31163 Abcam
β-actin Beta-actin Cat No. #3700 Cell Signaling Technology
6. mRNA 발현 조사 (Real-time RT-PCR)
C2C12 세포를 2 × 105 cells/well로 6-well plate에 분주하고, 24시간 동안 안정화시켰다. 시험물질을 함유한 근세포분화배양액으로 세포배양액을 교환하여 2일 또는 4일간 배양하였다. 세포를 수거 후 RNeasy Plus Mini kit (QIAGEN)을 사용하여 total RNA를 분리하였고, micro-volume spectrophotometer (BioSpec-nano, SHIMADZU)을 사용하여 정량하였고, OD260/280 값이 1.8 이상인 RNA를 실험에 사용하였다.
Total RNA (2 μg)로부터 HyperScriptTM RT master mix kit (GeneAll Biotechnology)을 이용하여 cDNA를 얻은 후, Rotor-Gene 300 PCR (Corbett Research)와 Rotor-GeneTM SYBR Green kit (QIAGEN)를 사용하여 real-time PCR을 수행하였다. 실험에 사용한 primer 정보는 하기 표 5에 나타내었다. 유전자의 발현의 정량 분석은 Rotor-Gene 6000 Series System Software program (Corbett Research)을 이용하여 수행하였다.
mRNA Primer sequences Genebank No.
SOD2 Forward 5’-ATCAGGACCCATTGCAAGGA-3’ NM_013671.3
Reverse 5’-AGGTTTCACTTCTTGCAAGCT-3’
GPx1 Forward 5′-CAGGTCGGACGTACTTGAG-3′ NM_001329528.1
Reverse 5′-CAGGTCGGACGTACTTGAG-3′
UCP2 Forward 5’-CTCGTCTTGCCGATTGAAGGT-3’ NM_011671.5
Reverse 5'-TCTGCAATGCAGGCAGCTGTC-3'
UCP3 Forward 5'-GCCTACAGAACCATCGCCAG-3' NM_009464.3
Reverse 5'-GCCACCATCTTCAGCATACA-3'
ERRα Forward 5’-TTCGGCGACTGCAAGCTC-3’ NM_007953.2
Reverse 5’-CACAGCCTCAGCATCTTCAATG-3’
LDH B Forward 5′-CCTCAGATCGTCAAGTACAGCC-3′ NM_001316322.1
Reverse 5′-ATCCGCTTCCAATCACACGGTG-3′
MCT1 Forward 5’-GCTGGGCAGTGGTAATTGGA-3’ XM_021196222.2
Reverse 5'-CAGTAATTGATTTGGGAAATGCAT-3'
TFam Forward 5’-ATAGGCACCGTATTGCGTGA-3’ NM_009360.4
Reverse 5’-CTGATAGACGAGGGGATGCG-3’
CPT-1β Forward 5′-CCTGGAAGAAACGCCTGATT-3′ NM_009948.2
Reverse 5′-CAGGGTTTGGCGAAAGAAGA-3′
mtDNA Forward 5’-CACGATCAACTGAAGCAGCAA-3’ NM_001362199.2
Reverse 5’-ACGATGGCCAGGAGGATAATT-3’
MHC7 Forward 5’-GCTGGAAGATGAGTGCTCAGAG-3’ XM_017315841.2
Reverse 5’-TCCAAACCAGCCATCTCCTCTG-3’
MHC1 Forward 5′-CGCTCCACGCACCCTCACTT-3′ XM_017315841.2
Reverse 5′-GTCCATCACCCCTGGAGAC-3′
MHC2A Forward 5’-CCATTCAGAGCAAAGATGCAGGG-3’ XM_021176019.2
Reverse 5'-GCATAACGCTCTTTGAGGTTG-3'
MHC2B Forward 5'-GCTAGGGTGAGGGAGCTTGAA-3' XM_021175597.1
Reverse 5'-AGACCCTTGACGGCTTCGA-3'
PGC-1α Forward 5’-GTCCTTCCTCCATGCCTGAC-3’ XM_006503779.4
Reverse 5’-GACTGCGGTTGTGTATGGGA-3’
PKB Forward 5’-GGACTACTTGCACTCCGAGAAG-3’ XM_021201913.2
Reverse 5’-CATAGTGGCACCGTCCTTGATC-3’
FNDC5 Forward 5'-ATGAGGTGACCATGAAGGAGATGGC-3' XM_006503212.4
Reverse 5’-CTGGTTTCTGATGCGCTCTTGGTT-3’
GSY Forward 5’-CACAGAACGGTTGTCGGACTTG-3’ NM_030678.3
Reverse 5’-AGGTGAAGTGGTCTGGAAAGGC-3’
SIRT1 Forward 5’-GCAACAGCATCTTGCCTGAT-3’ XM_021204930.2
Reverse 5’-GTGCTACTGGTCTCACTT -3’
PPARy Forward 5’-CAAAACACCAGTGTGAATTA-3’ XM_021164279.2
Reverse 5’-ACCATGGTAATTTCTTGTGA-3’
GAPDH Forward 5’-TGGGTGTGAACCATGAGAAG-3’ XM_029478683.1
Reverse 5’-GCTAAGCAGTTGGTGGTGC-3’
7. 통계처리
모든 분석 수치는 mean ± SEM으로 나타내었다. 수집된 결과는 GraphPad Prism 5.0 (GraphPad software) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 시험물질 처리군과 대조군의 차이를 비교하기 위하여 Student’s t-test 및 one-way analysis variance (ANOVA)를 이용하였다. P < 0.05 이상일 때만 통계적으로 유의성 있는 것으로 판단하였다.
시험예 2: C2C12 세포의 세포 내 ROS 생성에 미치는 영향
ROS는 정상 세포의 호흡 과정에서 발생하는 미토콘드리아의 부산물로서, 산화적 스트레스는 ROS의 생성과 항산화적 방어능력 사이의 불균형에서 비롯된다. 비정상적으로 증가된 ROS는 근육세포의 기능 장애를 유발하며, 근세포의 단백질, 지질 및 핵산 등과 같은 세포 내 거대분자들의 손상을 일으킴으로써 세포 죽음을 야기하는 원인 인자로 작용한다.
실시예에 따른 돌외잎 추출물이 C2C12 세포에서 세포 내 ROS 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA)을 사용하여 ROS 생성을 측정하여 표 6에 나타내었다. DCF-DA는 세포에서 ROS에 의해 산화되어 형광을 나타내는 DCF로 전환되는 원리를 이용하여 측정한다.
시험군 산화 스트레스 유도
(50 μM TBHP)		 시험물질 ROS 생성
(Fluorescence Intensity)
G0 - - 16.32 ± 0.66
G1 + - 37.97 ± 2.19***
G2 + 실시예 21.59 ± 1.12###
G3 + 비교예 1 33.03 ± 0.39#
G4 + 비교예 2 32.81 ± 1.15#
G5 + 비교예 3 31.54 ± 2.09#
G6 + 비교예 4 30.26 ± 2.08#
G7 + Cr 21.13 ± 2.74##
*, ** 및 ***는 G0군과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다(G1).
#, ## 및 ###는 G1군과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다(G2 ~ G7).
상기 표 6을 살펴보면, C2C12 세포에 TBHP를 처리하여 산화적 스트레스를 유도하였을 때 (G1) ROS 생성은 37.97 ± 2.19로 정상 대조군 (G0)의 16.32 ± 0.66와 비교하여 현저히 증가하였다. 산화적 스트레스로 증가된 ROS 생성은 실시예에 따른 돌외잎 추출물의 처리에 의해 현저히 감소하였다. 양성대조물질인 Cr을 처리한 경우 ROS 생성은 21.13 ± 2.74로 산화적 스트레스 유도 대조군 (G1)에 비해 현저히 감소하였다. 이는 C2C12 세포에서 실시예의 돌외잎 추출물이 TBHP에 의해 유도된 산화적 스트레스에 의한 ROS 생성을 효과적으로 억제함을 나타낸다.
시험예 3: C2C12 세포의 peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1 alpha (PGC-1α) 관련 단백질 변화에 미치는 영향
미토콘드리아는 에너지원을 산화시켜 ATP를 생산하는 근육의 발전소로서 운동부하가 지속적으로 주어질 때 더 많은 에너지를 산화할 수 있도록 그 수와 양이 증가하게 된다. PGC-1α는 미토콘드리아의 기능, 생합성 및 세포 에너지 대사의 전사를 조절하는 역할을 한다. PGC-1α 활성화는 AMP-activated protein kinase (AMPK) 및 Silent mating-type information regulation 2 homolog 1 (Sirt1)에 의해 유도되며 지구력 운동에 의해 활성화가 증가됨이 보고되었다. AMPK는 세포 내 에너지 상태를 감지하는 효소로써 세포 내 에너지가 부족한 상황, 즉 ATP에 비해 AMP가 증가하는 상황에서 활성화되어 정상 에너지 균형을 회복시키기 위해 다양한 대사경로를 조절한다. Sirt1은 근 수축에 따른 NAD+의 변화에 의해 활성이 증가하고, PGC-1α의 활성을 조절하기 때문에 운동으로 인한 골격근 내 미토콘드리아 생합성을 위한 중요한 조절자로 인식된다. p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)는 다양한 세포 외 자극에 의해 활성화되어 세포의 성장 및 분화, 세포주기 조절 등에 관여하는 것으로 알려진 효소로 운동이나 골격근 수축은 p38 MAPK의 활성을 증가시키며, 최근 p38 MAPK가 PGC-1α를 활성화한다고 보고되었다.
본 연구에서는 시험물질이 PGC-1α 활성화에 관련된 단백질 변화에 미치는 영향을 조사하기 위해 시험물질을 처리하여 제조한 total cell lysate을 사용하여 Western blot을 실시한 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 하기 표 7은 각 시험군의 PGC-1α 활성화에 관련된 단백질 발현량을 상대적 밴드 밀도(%대조군)로 비교하여 나타낸 것이다.
시험군 시험물질 단백질 발현량(%대조군)
p-AMPK p-Sirt1 p-p38 p-Nrf2
G1 - 100±0.0 100±0.0 100±0.0 100±0.0
G2 실시예 133.8±6.2* 135.4±4.4* 138.8±11.6*** 144.5±3.4**
G3 비교예 1 102.8±5.4 107.4±6.3 100.8±10.1 106.5±2.8
G4 비교예 2 104.6±3.4 102.1±2.8 105.2±6.4 104.7±2.5
G5 비교예 3 107.4±5.9 101.9±5.7 104.1±5.2 103.6±3.6
G6 비교예 4 110.3±2.4 112.1±4.7 109.4±2.1 115.6±3.9
G7 Cr 104.6±14.4 114.0±11.1 151.5±41.0 116.2±11.4
상기 Western blot 분석 결과를 토대로 각 단백질에 대한 활성화 단백질의 비율을 통해 각 단백질의 활성을 평가하여 하기 표 8에 나타내었다.
시험군 p-AMPK/AMPK ratio p-Sirt1/Sirt1 ratio p-p38/p38
ratio		 p-Nrf2/Nrf2 ratio
G1 - 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
G2 실시예 1.50±0.14* 1.30±0.03** 1.36±0.10* 1.59±0.10*
G3 비교예 1 1.02±0.13 1.04±0.13 1.00±0.06 1.03±0.05
G4 비교예 2 1.03±0.29 1.01±0.07 1.03±0.10 1.02±0.12
G5 비교예 3 1.04±0.07 1.06±0.11 1.02±0.16 1.02±0.09
G6 비교예 4 1.08±0.09 1.09±0.12 1.08±0.07 1.12±0.04
G7 Cr 1.09±0.13 1.11±0.10 1.15±0.29 1.20±0.26
*, ** 및 ***는 G1군과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다(G2~G7).
상기 표 7 및 표 8을 살펴보면, p-AMPK의 발현은 대조군(G1)과 비교하여 실시예의 조성물의 처리(G2)에 의해 증가하였다. p-Sirt1의 발현은 대조군(G1)과 비교하여 실시예의 조성물의 처리(G2)에 의해 유의적으로 증가하였다. p-p38 MAPK의 발현은 대조군(G1)과 비교하여 실시예의 조성물의 처리(G2)에 의해 유의적으로 증가하였다. p-p38/p38의 비율은 돌외잎 추출물 처리에 의해 유의적으로 증가하였다.
활성화된 PGC-1α는 다양한 다른 전사인자들의 활성을 유도하는데 그 중 leucine zipper transcription factor인 nuclear factor erythroid-2 related factor 2 (Nrf2)의 활성화를 유도하여 항산화 유전자들의 발현을 조절한다. Nrf2는 산화적 스트레스 유도 시, 세포질에서 핵으로 이동하여 항산화 유전자의 promoter 부분에 결합하여 다양한 항산화 유전자의 발현을 유도한다. 실시예의 처리에 의해 p-Nrf2의 발현이 유의적으로 증가하였고, p-Nrf2/Nrf2 비율도 실시예의 처리에 의해 증가하였다.
상기의 결과로부터, 실시예에 따른 돌외잎 추출물의 처리가 C2C12세포에서 PGC-1α 관련 단백질인 Sirt1, p38 MAPK, Nrf2의 활성화를 유의적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있다.
시험예 4: C2C12 세포의 미토콘드리아 복제 관련 mRNA 발현에 미치는 영향
미토콘드리아는 ATP 생성, 세포사멸, 지방산 베타 산화, 철-황 결합체 합성 등 여러 가지 세포적 과정들을 위한 중심 기관이기 때문에 생명에 있어서 필수적인 세포소기관이다. 미토콘드리아는 독특하게도 핵에 존재하는 염색체 DNA와는 별도로 자신의 고유한 genome을 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 형태로 보유하고 있다.
Mitochondrial transcription factor A (Tfam)은 미토콘드리아의 핵구조를 변환시켜 ROS의 공격으로부터 DNA를 보호하여 mtDNA의 안정성 (stability) 및 mtDNA의 전사를 조절한다. Carnitine palmitoyl transferase-1 (CPT-1)은 미토콘드리아 내의 ADP 인산화에 관련하는 유전형질 중 지방 산화와 관련된 것으로 미토콘드리아의 외막을 통과한 지방산 (long-chain fatty acyl-CoA)이 세포 내막을 통과하여 미토콘드리아의 기질 내로 유입되도록 관여하는 효소이다.
C2C12 세포에 시험물질의 처리가 미토콘드리아 복제와 관련한 mtDNA, Tfam, CPT-1β의 mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하여 하기 표 9에 나타내었다.
시험군 TFam CPT1-β mtDNA
G1 - 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
G2 실시예 1.03±0.10 2.55±0.61* 1.05±0.29
G3 비교예 1 0.98±0.23 1.03±0.26 1.01±0.14
G4 비교예 2 0.92±0.12 1.01±0.17 1.00±0.13
G5 비교예 3 0.92±0.06 1.16±0.23 1.02±0.36
G6 비교예 4 0.97±0.05 1.20±0.11 1.05±0.25
G7 Cr 0.48±0.07** 0.93±0.20 0.72±0.12*
*, ** 및 ***는 G1군과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다(G2~G7).
상기 표 9에 나타난 바와 같이, CPT1-β mRNA 발현이 실시예 처리군 (G2)에서 유의적으로 증가하였다.
시험예 5: C2C12 세포의 근력 타입 변화 관련 mRNA 발현에 미치는 영향
실시예에 따른 조성물이 근력 타입을 대표하는 MHC1, MHC7, MHC2A, MHC2B mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하여 하기 표 10에 나타내었다.
시험군 MHC1 MHC7 MHC2A MHC2B
G1 - 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
G2 실시예 8.53±0.95** 4.66±1.27* 1.37±0.24 0.82±0.05*
G3 비교예 1 1.13±1.47 1.03±0.27 1.03±0.27 1.01±0.12
G4 비교예 2 1.15±1.64 1.02±0.32 1.04±0.24 1.02±0.16
G5 비교예 3 1.35±0.95 1.04±0.23 1.04±0.18 0.99±0.21
G6 비교예 4 1.61±0.32 1.10±0.24 1.03±0.09 0.97±0.15
G7 Cr 4.50±1.43 7.87±2.66* 1.74±0.22* 1.10±0.10
*, ** 및 ***는 G1군과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다(G2~G7).
미오신 (myosin)은 골격근에서 가장 많이 존재하는 단백으로 근육의 수축에 관여한다. 미오신은 미오신 중쇄 (myosin heavy chain, MHC)와 미오신 경쇄 (myosin light chain, MLC)로 구성되어있으며, MHC는 근육 수축 성상을 결정하는 중요한 요인이다. 골격근에서 잘 알려진 아형 중 MHC2A, MHC2B 아형은 주로 빠른 근수축 속도에 관여하는 것으로 알려져 있으며, MHC1과 MHC7 아형은 느린 근수축 속도에 관여하는 것으로 알려져 있다. MHC1 mRNA 발현은 대조군(G1)과 비교하여 실시예 처리군 (G2)에서 각각 유의적으로 증가하였다. MHC7 mRNA 발현은 실시예 처리군 (G2)에서 유의적으로 증가하였다. MHC2A mRNA 발현은 실시예 처리군 (G2)에서 증가하는 경향을 나타내었으나 유의적인 차이는 없었고, MHC2B mRNA 발현은 대조군(G1)과 비교하여 실시예 처리군 (G2)에서 유의적으로 감소하였다. 즉, 실시예의 조성물의 처리는 MHC1과 MHC7 mRNA 발현을 증가시켜 느린 근수축 속도에 관여하는 지근 타입으로의 분화를 유도하는 것으로 판단된다.
실시예에 따른 각각의 조성물이 근력 타입을 대표하는 PGC-1α, PKB, FNDC5 mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하여 하기 표 11에 나타내었다.
시험군 PGC-1α PKB FNDC5
G1 - 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
G2 실시예 8.18±2.55* 2.58±0.20*** 3.69±0.58**
G3 비교예 1 1.13±2.64 1.13±0.28 1.31±0.38
G4 비교예 2 1.14±2.13 1.11±0.45 1.34±0.24
G5 비교예 3 1.26±1.61 1.21±0.60 1.49±0.33
G6 비교예 4 1.68±1.41 1.30±0.54 1.84±0.27
G7 Cr 1.54±1.10 2.18±0.51 1.83±0.47
*, ** 및 ***는 G1군과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다(G2~G7).
PGC-1α는 골격근 내 미토콘드리아 생합성, 근섬유 형태의 특수화 (fast-to-slow fiber type switching) 등과 같이 운동에 따른 골격근 적응을 위한 유전자 조절에 핵심적인 역할을 하는 전사 보조 활성 인자로 알려져 있다. PGC-1α mRNA발현은 실시예 처리군 (G2)에서 대조군 (G1)과 비교하여 유의적으로 증가하였다. Protein kinase B (PKB)는 Akt로도 알려져 있으며, glucose metabolism 및 여러 세포 대사과정에서 중요한 역할을 한다. GLUT4의 상위 신호전달 인자인 PKB는 GLUT4에 신호를 전달하여 근육 내 포도당 이동을 가능하게 한다. PKB mRNA 발현은 실시예 처리군 (G2)에서 대조군 (G1)과 비교하여 유의적으로 증가하였다. 운동에 반응하여 골격근에서 활성화된 PGC-1α은 골격근 막 단백질인 FNDC5 (fibronectin type III domain-containing protein 5)와 함께 산화 스트레스 조절 기전에 관여할 뿐만 아니라 인슐린 신호전달 경로를 활성화시켜 인슐린 민감성을 향상 시킨다. FNDC5 mRNA 발현은 대조군 (G1)과 비교하여 실시예 처리군 (G2)에서 유의적으로 증가하였고, 이외의 모든 군은 유의적인 차이를 나타내지 않았다 .
시험예 6: C2C12 세포의 에너지 관련 mRNA 발현에 미치는 영향
실시예에 따른 조성물이 근육세포의 에너지 대사에 관여하는 GSY, SIRT1 및 PPARγ mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하여 표 12에 나타내었다.
시험군 GSY Sirt1 PPARγ
G1 - 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
G2 실시예 2.27±0.25** 2.24±0.54 1.95±0.75
G3 비교예 1 1.06±0.29 1.04±0.17 1.09±0.34
G4 비교예 2 1.14±0.31 1.06±0.09 1.10±0.11
G5 비교예 3 1.20±0.18 1.18±0.18 1.13±0.20
G6 비교예 4 1.31±0.20 1.21±0.06 1.17±0.23
G7 Cr 2.30±0.39* 1.13±0.18 2.93±1.32
*, ** 및 ***는 G1군과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다(G2~G7).
Glycogen Synthase (GSY)은 glycogenesis의 핵심효소로 인슐린에 의한 glycogen의 합성 및 저장 작용에 관여하는 대사 관련 효소이다. 골격근 내의 glycogen은 운동 시에 주요 에너지원이며, 운동 강도가 높을수록 glycogen에 대한 에너지 의존도가 높다. GSY mRNA 발현은 대조군 (G1)과 비교하여 실시예 처리군 (G2)에서 유의적으로 증가하였고, 양성대조물질인 Cr 처리군 (G9)에서도 유의적으로 증가하였다. 운동 시 골격근 내에 저장되어 있던 ATP가 감소하면서 에너지 요구량이 급격히 증가하게 되는데, 이와 관련된 세포내 NAD+ 증가는 Sirt1을 활성화 시키고, 활성화된 Sirt1은 운동에 필요한 에너지 생성을 위해 에너지생성과 관련된 세포질 및 핵 내 전사인자들을 발현시킨다. Sirt1 mRNA 발현은 대조군 (G1)과 비교하여 실시예 처리군 (G2)에서 증가하는 경향을 나타내었지만, 유의적인 차이는 없었다. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR-γ)는 핵 수용체에 속하는 전사인자로 리간드에 의하여 활성화되어 지질과 글루코스 대사 및 에너지 항상성과 관련된 유전자를 조절하며, 세포의 증식과 분화를 조절하는 역할을 한다. 또한 PPAR-γ는 PGC-1α와의 상호작용을 통해서 골격근에서의 지방산 산화 능력을 조절한다. PPAR-γ mRNA 발현은 대조군 (G1)과 비교하여 실시예 처리군 (G2)에서 증가하는 경향을 나타냈으나 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
이상의 결과를 통해 실시예에 따른 돌외잎 추출물은 산화적 스트레스를 억제하고, 근육세포 안의 미토콘드리아 생합성에 관련된 다양한 유전자들의 발현을 증가시킴을 관찰하였다. 이는 실시예에 따른 조성물이 운동으로 인한 피로 억제 및 운동수행능력 향상을 위한 기능성 소재로서의 활용 가능성이 있는 것으로 판단된다.
<인비보 시험>
<재료 및 방법>
1. 시험물질
양성대조물질로는 Creatine monohydrate (Cr)를 사용하였다.
2. 동물실험 승인
본 연구에서의 모든 동물실험은 한림대학교 동물실험윤리위원회의 승인 아래 동물실험 규정에 따라 수행하였다 (Hallym 2019-28).
3. In vivo 체계에서 돌외잎 추출물의 근피로 개선 효능 평가 - 운동 없이 시료 섭취
(1) 실험동물
특정병원체 (specific pathogen free)가 없는 5주령, 수컷 ICR 생쥐를 (주)두열바이오텍에서 구입하여 사용하였다. 1주일 간의 검역 및 적응과정을 거친 뒤 체중 감소 없는 건강한 동물을 선별하여 실험에 사용하였다. 실험동물은 온도 23 ± 3℃, 상대습도 50 ± 10%, 환기회수 10~15회/시간, 조명시간 12시간 (08:00~20:00), 조도 150~300 Lux로 설정된 사육환경에서 사육하였다. 시험 전 기간 실험동물은 실험동물용 고형사료 ((주) 카길애그리퓨리나)와 음수를 자유 섭취하도록 하였다.
시험군 동물수 시험물질 (mg/kg BW)
G1 - 10 -
G2 실시예 10 300
G3 비교예 1 10 300
G4 비교예 2 10 300
G5 비교예 3 10 300
G6 비교예 4 10 300
(2) 시험군, 시험물질 투여
1주일간의 적응 기간을 거친 후 건강한 동물을 선별하여 난괴법에 의거하여 마우스를 각 군당 10마리씩 6그룹으로 나누어 준비하였다. 일반대조군은 5% tween 80-saline을 경구투여하였고, 양성대조군은 Creatine monohydrate (Cr) 75 mg/kg body weight (BW)을 경구투여하였으며, 시험군들(시험군 2 내지 6)은 실시예 및 비교예에 따른 조성물을 각각 300 mg/kg body weight (BW)씩 음수에 녹여 17일 동안 매일 일정한 시간에 경구 투여하였다. 시험 전 기간 실험동물에게 실험동물용 고형사료 ((주) 카길애그리퓨리나) 식이를 공급하였고, 식이와 음수는 자유로이 섭취하도록 하였다.
(3) 체중 측정
시험 기간 동안 매주 일정한 시간에 실험동물의 체중을 측정하였다.
(4) 강제수영 시험 및 혈중 젖산 (lactate) 함량 측정
실험동물의 강제수영 (weight-loaded forced swimming test)은 다음과 같이 실시하였다. 즉, 플라스틱 수조 (90 x 45 x 45 cm)에 물의 깊이를 35cm가 되도록 채우고, 물의 온도를 25 ± 1℃로 유지하였다. 실험동물의 체중의 5%에 해당하는 추를 미근부 (꼬리)에 매달은 후 수조에서 수영을 실시하였고, 탈진의 판단은 실험동물이 물속에서 7초간 표면상으로 떠오르지 않는 상태로 판정하였다.
시험물질 투여 10일차와 12일차에 15분씩 총 2회 수영 적응 운동을 시행하였고, 마지막 수영 적응 운동 2일 후(시험물질 투여 14일차) 16시간 절식한 후 강제수영 시험을 시행하여 탈진까지의 수영시간을 측정하였다.
실험동물의 혈중 젖산 함량은 강제수영시험 시작 전, 수영 직후, 수영 후 10분, 30분에 실험동물의 꼬리에서 혈액을 취해 젖산측정기 (Lactate Pro2, Arkray)를 사용하여 혈중 젖산 함량을 측정하였다.
(5) 채혈
시험물질 투여 17일 차에 체중 부하 없이 일정 시간 (60분) 수영을 시행한 후 실험동물을 tribromoethanol을 tertiary amyl alcohol로 희석하여 만든 마취제를 사용하여 마취한 후 안와에서 채혈하였다. 혈액은 serum separate tube (Becton Dickinson)에 담아 30분간 실온에서 방치하고 3,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였고, 분석 전까지 -70℃에 보관하였다.
(6) 혈청 분석
혈청 내 blood urea nitrogen (BUN)과 creatinine (CREA) 함량 및 alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH)의 활성은 혈액생화학분석기 (KoneLab 20 XT, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 측정하였다. 혈청 내 젖산 함량은 젖산 측정 kit (abcam)을 사용하여 제조회사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다.
4. In vivo 체계에서 돌외잎 추출물의 운동수행능력 증진 효능 평가 - 운동과 병행하여 시료 섭취
(1) 실험동물
특정병원체 (specific pathogen free)가 없는 5주령, 수컷 ICR 생쥐를 (주)두열바이오텍에서 구입하여 사용하였다. 1주일간의 검역 및 적응과정을 거친 뒤 체중 감소 없는 건강한 동물을 선별하여 실험에 사용하였다. 실험동물은 온도 23 ± 3℃, 상대습도 50 ± 10%, 환기회수 10~15회/시간, 조명시간 12시간 (08:00~20:00), 조도 150~300 Lux로 설정된 사육환경에서 사육하였다. 시험 전 기간 실험동물은 실험동물용 고형사료 ((주) 카길애그리퓨리나)와 음수를 자유 섭취하도록 하였다.
(2) 시험군 및 시험물질 투여
1주간의 적응 기간을 거친 후 건강한 동물을 선별하여 난괴법에 의거하여 9개의 군으로 분류하였다. 각 시험군은 각 10마리의 실험동물을 사용하였다.
시험물질은 음수에 녹여 6주 동안 매일 일정한 시간 (운동 2시간 전)에 경구투여하였다. 시험 전 기간 실험동물에게 실험동물용 고형사료 ((주) 카길애그리퓨리나) 식이를 공급하였고, 식이와 음수는 자유로이 섭취하도록 하였다.
시험군 동물수 트레드밀 운동 시험물질 (mg/kg BW)
A1 - 10 - -
A2 실시예 10 - 300
A3 - 10 + -
A4 실시예 10 + 300
A5 비교예 1 10 + 300
A6 비교예 2 10 + 300
A7 비교예 3 10 + 300
A8 비교예 4 10 + 300
A9 Cr 10 + 75
(3) 체중 및 식이 섭취량 측정
시험 기간 동안 매주 일정한 시간에 실험동물의 체중을 측정하였다. 실험동물의 식이 섭취량은 시험 기간 섭취한 양을 측정하여 총 식이 섭취량과 일일 식이 섭취량을 산출하였다.
(4) 트레드밀 시험 및 지구력 운동
실험동물의 지구력 운동훈련은 소동물용 트레드밀 (Exer3/6-treadmill, Columbus Instruments)을 이용하여 6주간 실시하였다. 지구력 운동 훈련은 경사도 10도, 속도 10 m/min으로 하여 1주차에는 15분, 2주차에는 20분, 3주차에는 25분, 4주차에는 30분, 5주차에는 35분, 6주차에는 40분간 운동을 시행하였다.
6주간의 운동 훈련 후 지구력 운동 수행능력을 평가하기 위하여 경사도 10도, 속도 10 m/min으로 5분간 운동을 시작한 후, 매 1분마다 1 m/min의 속도를 높여 운동 강도를 증가시켜 최대 25 m/min의 속도에서 탈진까지의 운동 지속시간을 측정하였다. 탈진상태는 실험동물이 주행 중에 트레드밀의 후미 부분으로 쳐진 상태에서 10초 이상 달릴 수 없는 시점으로 판정하였다. 실험동물의 운동량은 아래의 식으로 산출하였다.
운동량(Exercise capacity)
= body weight (kg) × speed (m/s) × time (s) × grade × 9.8 m/s2
(5) 제지방 (lean body)률 및 체지방 (fat)률 측정
시험 종료 1일 전에 실험동물을 마취 후 dual-energy X-ray absorptiometry (DEXA, PIXImusTM, GE Lunar)를 사용하여 체구성 성분을 측정하여 제지방률 및 체지방률을 평가하였다.
(6) 채혈 및 조직 적출
실험동물을 희생 전 tribromoethanol을 tertiary amyl alcohol로 희석하여 만든 마취제를 사용하여 마취한 후 안와채혈을 하였다. 혈액은 serum separate tube (Becton Dickinson)에 담아 30분간 실온에서 방치하고 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였고, 분석 전까지 -70℃에 보관하였다. 채혈 후 실험동물을 희생하여 간과 골격근 [quadriceps femoris muscle (QF, 대퇴사두근), gastrocnemius muscle (GA, 장딴지근), soleus muscle (SOL, 가자미근), extensor digitorum longus muscle (EDL, 장지신근)]을 적출한 후 차가운 생리식염수로 헹구어 여과지로 여분의 물기를 제거한 후 무게를 측정하였다. 가자미근 (SOL)의 일부는 4% paraformaldehyde (PFA)에 고정한 후 파라핀에 포매를 하여 조직면역염색을 수행하였고, 일부는 total RNA를 분리한 후 real-time RT-PCR을 수행하였다. 장딴지근 (GA)의 일부는 단백질을 분리한 후 Western blot을 수행하였다. 나머지 조직은 분석 전까지 -70℃에 보관하였다.
(7) 혈액 생화학 분석
혈청 내 포도당 (Glucose), 중성지방 (TG), 총콜레스테롤 (CHOL), LDL-콜레스테롤 (LDL-CHOL), HDL-콜레스테롤 (HDL-CHOL)의 함량 및 blood urea nitrogen (BUN), creatinine (CREA)의 함량과 creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP) 활성은 혈액생화학분석기 (KoneLab 20 XT, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 측정하였다. 혈청 내 젖산 (lactate) 함량은 젖산 측정 kit (abcam)을 사용하여 제조회사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다.
(8) 간 조직액 제조
간 조직 내 글리코겐 (glycogen) 함량을 측정하기 위해 간 조직액을 제조하였다. 100 mg 간 조직에 1 mL PBS를 넣어 homogenizer로 균질화하였다. 균질화한 용액 을 5,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취해 간 조직액으로 사용하였다.
(9) 근육 조직액 제조
근육 조직 내 글리코겐 함량 및 효소 활성 측정을 위해 근육 조직액을 제조하였다. 적출한 골격근 대퇴사두근 (QF), 장딴지근 (GA), 가자미근 (SOL), 장지신근 (EDL)에 1 mL PBS를 넣어 homogenizer로 균질화하였다. 균질화한 용액을 5,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취해 근육 조직액으로 사용하였다. 근육 조직액의 단백질 양은 BCA protein assay kit (Thermo Scientific)을 사용하여 측정하였다.
(10) 간 및 골격근 내 글리코겐 함량 측정
간 및 골격근 (GA) 내 글리코겐 함량은 글리코겐 측정 kit을 사용하여 제조회사 (abcam)에서 제시한 방법에 따라 측정하였다.
(11) 골격근 내 효소 활성 측정
골격근 (QF, SOL, EDL) 내 citrate synthase (BioVision), beta-hydroxyacyl CoA-dehydrogenase (MyBioSource), lactate dehydrogenase (abcam)의 활성은 각각의 측정 kit을 사용하여 제조회사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다
(12) 골격근의 조직형태학적 관찰 (hematocylin & eosin 염색)
4% PFA로 고정된 가자미근을 파라핀에 포매하고, 포매된 조직들로부터 5 μm의 조직 절편을 제작하였다. 파라핀 제거 후, 100% 알코올에서 시작하여 0% 알코올 (H2O)까지 순차적으로 알코올의 %를 낮춤으로 조직을 수화하였다. 가자미근 (SOL)의 조직형태학적 관찰을 위해 Accustain® Hematoxylin and Eosin Stains (Sigma-Aldrich Co.)을 사용하여 제조회사가 제시한 방법에 따라 조직을 염색하였다. 이후 광학현미경 (Carl Zeiss)을 사용하여 조직학적 변화를 관찰하였다.
(13) 근육조직 내의 단백질 발현 조사 (Western blot analysis)
근육조직 (장딴지근, GA) 내 단백질 발현을 조사하기 위해 lysis buffer (20 mmol/L Hepes, pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA, 100 mmol/L NaF, 10 mmol/L sodium pyrophosphate, 1 mmol/L Na3VO4, 20 μg/mL aprotinin, 10 μg/mL antipain, 10 μg/mL leupeptin, 80 μg/mL benzamidine HCl, 0.2 mmol/L PMSF)를 첨가한 후 homogenizer로 균질화하였다. 균질화한 용액을 12,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취해 근육조직 lysates 얻었다. 근육 조직 lysate의 단백질 양은 BCA protein assay kit (Thermo Scientific)을 사용하여 측정하였다.
단백질 (50 μg)을 10 % sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리한 후, polyvinylidene difluoride membrane (Milipore)에 이동시켰다. Membrane을 5% skim milk-TBST (20 mmol/L Tris·HCl, pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 0.1% Tween 20)에서 1시간 동안 blocking 한 후, 측정하고자 하는 antibody를 각각 첨가하여 4℃에서 16시간 동안 또는 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 실험에 사용한 항체 정보는 하기 표 17에 나타내었다. 그 후 horseradish peroxidase (HRP)-linked anti-rabbit IgG, HRP-linked 또는 anti-mouse IgG 를 첨가하여 1시간 교반하였으며, 각 단백질 밴드는 LuminataTM Forte Western HRP Substrate (Millipore)를 사용하여 enhanced chemiluminscence 방법으로 가시화하였다. 단백질 발현 수준은 ImageQuantTM LAS 500 imaging systems (GE Healthcare Bio-Sciences AB)을 사용하여 정량하였다.
항체명 세부정보 제조회사
p-AMPK Phospho-AMPKα (Thr172) Cat No. #2535 Cell Signaling Technology
AMPK AMPKα Cat No. #2532 Cell Signaling Technology
p-p38 Phospho-p38 MAPK
(Thr180/Tyr182)		 Cat No. #9211 Cell Signaling Technology
p38 p38 MAPK Cat No. #9212 Cell Signaling Technology
p-PGC1α Phospho-PGC1α (Ser571) Cat No. AF6650 R&D system
PGC1α PGC1α Cat No. #4259 Cell Signaling Technology
p-NRF2 Phospho-NRF2 (Ser40) Cat No. ab76026 Abcam
NRF2 NRF2 Cat No. ab31163 Abcam
β-actin Beta-actin Cat No. #3700 Cell Signaling Technology
(14) 근육조직의 mRNA 발현 조사 (real-time RT-PCR)
시험 종료 시 수집한 근육조직 (SOL)에서 TRIzol Reagent (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 total RNA를 분리하였고, micro-volume spectrophotometer (BioSpec-nano, SHIMADZU)을 사용하여 정량하였고, OD260/280 값이 1.8 이상인 RNA를 실험에 사용하였다. Total RNA (2 μg)로부터 HyperScriptTM RT master mix kit (GeneAll Biotechnology)을 이용하여 cDNA를 얻은 후, Rotor-Gene 300 PCR (Corbett Research)와 Rotor-GeneTM SYBR Green kit (QIAGEN)를 사용하여 real-time PCR을 수행하였다. 실험에 사용한 primer 정보는 하기 표 16에 나타내었다. 유전자의 발현의 정량 분석은 Rotor-Gene 6000 Series System Software program (Corbett Research)을 이용하여 수행하였다.
mRNA Primer sequences Genebank No.
SOD2 Forward 5’-ATCAGGACCCATTGCAAGGA-3’ NM_013671.3
Reverse 5’-AGGTTTCACTTCTTGCAAGCT-3’
GPx1 Forward 5′-CAGGTCGGACGTACTTGAG-3′ NM_001329528.1
Reverse 5′-CAGGTCGGACGTACTTGAG-3′
UCP2 Forward 5’-CTCGTCTTGCCGATTGAAGGT-3’ NM_011671.5
Reverse 5'-TCTGCAATGCAGGCAGCTGTC-3'
UCP3 Forward 5'-GCCTACAGAACCATCGCCAG-3' NM_009464.3
Reverse 5'-GCCACCATCTTCAGCATACA-3'
PGC1α Forward 5’-GTCCTTCCTCCATGCCTGAC-3’ XM_006503779.4
Reverse 5’-GACTGCGGTTGTGTATGGGA-3’
PPARδ Forward 5’-GGACCAGAACACACGCTTCCTT-3’ NM_011145.3
Reverse 5’-CCGACATTCCATGTTGAGGCTG-3’
MCT1 Forward 5’-GCTGGGCAGTGGTAATTGGA-3’ XM_021196222.2
Reverse 5'-CAGTAATTGATTTGGGAAATGCAT-3'
CPT1β Forward 5′-CCTGGAAGAAACGCCTGATT-3′ NM_009948.2
Reverse 5′-CAGGGTTTGGCGAAAGAAGA-3′
ERRα Forward 5’-TTCGGCGACTGCAAGCTC-3’ NM_007953.2
Reverse 5’-CACAGCCTCAGCATCTTCAATG-3’
LDH B Forward 5′-CCTCAGATCGTCAAGTACAGCC-3′ NM_001316322.1
Reverse 5′-ATCCGCTTCCAATCACACGGTG-3′
mtDNA Forward 5’-CACGATCAACTGAAGCAGCAA-3’ NM_001362199.2
Reverse 5’-ACGATGGCCAGGAGGATAATT-3’
NRF-1 Forward 5’-GGCAACAGTAGCCACATTGGCT-3’ XM_030255219.1
Reverse 5’-GTCTGGATGGTCATTTCACCGC-3’
Tfam Forward 5’-ATAGGCACCGTATTGCGTGA-3’ NM_009360.4
Reverse 5’-CTGATAGACGAGGGGATGCG-3’
IL-6 Forward 5’-CCTCTGGTCTTCTGGAGTACC-3’ NM_031168.2
Reverse 5’-ACTCCTTCTGTGACTCCAGC-3’
TNF-α Forward 5’-ATGAGCACAGAAAGCATGA-3’ XM_021149735.1
Reverse 5’-AGTAGACAGAAGAGCGTGGT-3’
PPARγ Forward 5’-CAAAACACCAGTGTGAATTA-3’ XM_021164279.2
Reverse 5’-ACCATGGTAATTTCTTGTGA-3’
GSY Forward 5’-CACAGAACGGTTGTCGGACTTG-3’ NM_030678.3
Reverse 5’-AGGTGAAGTGGTCTGGAAAGGC-3’
GAPDH Forward 5’-TGGGTGTGAACCATGAGAAG-3’ XM_029478683.1
Reverse 5’-GCTAAGCAGTTGGTGGTGC-3’
5. 통계 처리
모든 분석 수치는 mean ± SEM으로 나타내었다. 수집된 결과는 SAS statistical software, version 9.4 또는 GraphPad Prism 5.0 (GraphPad software) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 시험물질 투여군과 대조군의 차이를 비교하기 위하여 Student’s t-test 및 one-way analysis variance (ANOVA)를 이용하였다. 또한, 대조군과 시험물질 투여군 간의 차이를 비교하기 위해 ANOVA로 분석 후 Duncan’s multiple range test를 이용하여 유의성을 검증하였다. p < 0.05 이상일 때만 통계적으로 유의성 있는 것으로 판단하였다.
<시험예>
<인비보 체계에서의 근피로 개선 효능 평가> - 운동 없이 시료 섭취한 경우
시험예 7: 실험동물의 체중에 미치는 영향
시험 기간 동안 매주 1회 실험동물의 체중을 측정하여 표 19에 나타내었다. 모든 시험군의 실험동물은 시험 기간 지속적으로 체중이 증가하여 정상적인 체중 변화를 나타내었다. 시험 기간 동안 대조군 (G1)과 모든 시험물질 투여군 (G2 ~ G6)간의 체중은 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
시험군 0주 1주 2주
G1 - 31.0±0.5 33.5±0.4 34.4±0.5
G2 실시예 30.8±0.5 33.5±0.6 34.0±0.6
G3 비교예 1 31.0±0.1 33.3±0.6 34.1±0.6
G4 비교예 2 31.0±0.4 33.2±0.5 34.1±0.5
G5 비교예 3 30.9±0.2 33.3±0.4 34.1±0.6
G6 비교예 4 30.9±0.4 33.4±0.6 34.1±0.5
시험예 8: 운동(강제수영) 시간에 미치는 영향
시험물질의 운동 피로 개선 효과를 평가하고자 실험동물 체중의 5%에 해당하는 추를 꼬리에 매달아 탈진 시까지의 수영 시간을 측정하여 표 20에 나타내었다.
시험군 탈진 시까지 걸리는 시간(sec)
G1 - 1119.2±125.2
G2 실시예 1236.5±119.4*
G3 비교예 1 1063.7±127.8
G4 비교예 2 1110.3±157.3
G5 비교예 3 1118.4±165.4
G6 비교예 4 1125.8±124.6
표 18을 살펴보면, 탈진 시까지 걸린 시간은 대조군 (G1)과 비교하여 실시예 투여군(G2)에서 유의적으로 증가하였다.
시험예 9: 운동(강제수영) 전후 젖산 농도에 미치는 영향
운동 시 혈중 젖산 수치의 증가는 운동 강도와 비례하는 것으로 알려져 있고, 유산소성 운동능력 지표로 젖산 역치가 이용되었으며, 운동 시 또는 회복 시의 혈중 젖산 제거 능력은 운동 수행능력과 양의 상관관계를 나타낸다.
시험물질의 투여가 운동 (강제수영) 전후 혈중 젖산 농도에 미치는 영향을 조사하여 표 19에 나타내었다.
시험군 운동(강제수영) 전후의 젖산 농도 (μmol/L)
강제수영
직전		 강제수영 직후
0 min 10 min 30 min
G1 - 1.29±0.06 14.78±1.22 11.13±0.77 8.32±1.40
G2 실시예 1.21±0.22 14.02±1.19 10.14±1.41 7.19±1.49*
G3 비교예 1 1.11±0.22 14.11±0.18 11.14±1.12 8.42±1.26
G4 비교예 2 1.21±0.06 14.77±0.24 11.14±1.17 8.39±1.51
G5 비교예 3 1.20±0.05 14.86±0.37 11.09±1.31 8.38±1.48
G6 비교예 4 1.23±0.17 14.45±0.78 10.97±1.06 8.29±1.12
상기 표 19를 살펴보면, 모든 시험군의 혈중 젖산 농도는 운동전과 비교하여 운동직후 (탈진 시)에 최대치를 나타냈으며 시간이 경과할수록 혈중 젖산 농도는 감소하였다. 특히, 실시예에 따른 조성물은 운동 전후 혈중 젖산농도를 더욱 크게 감소시키는 것을 확인하였다.
시험예 10: 혈청 지표에 미치는 영향
체중 부하 없이 일정 시간 (60분) 수영을 시행한 후 채취한 혈청 내 젖산, BUN, CREA의 함량과 CK, LDH, ALT, AST 활성을 측정하여 표 20에 나타내었다.
구분 G1 G2 G3 G4 G6
- 실시예 비교예 1 비교예 2 비교예 4
젖산 (μmol/L) 5.35±0.33 3.50±0.36* 5.22±0.36 5.12±0.27 5.06±0.52
LDH (U/L) 1030.7±124.6 965.4±168.4 1032.6±104.5 1026.4±117.5 1001.5±121.7
BUN (mg/dL) 9.54±0.72 7.88±0.47 9.26±0.64 9.27±0.14 9.01±0.19
CREA (mg/dL) 0.34±0.01 0.32±0.01 0.33±0.01 0.34±0.02 0.35±0.01
CK (U/L) 1094.5±260.5 928.0±123.3 1124.7±181.4 1065.8±118.2 1011.4±213.7
ALT (U/L) 57.88±12.10 65.99±15.85 67.86±15.45 65.13±14.59 77.24±13.68
AST (U/L) 106.45±15.81 102.57±14.19 124.15±14.19 127.46±14.87 142.31±15.88
젖산 (lactate)은 조직 내 무산소성 해당작용에서 pyruvate 가 환원되어 생성된 물질로 근세포 내의 환경을 산성화시키고 phosphorylase의 활성과 myosin ATPase 의 활성도를 저해하여 운동 수행능력을 감소시키는 원인으로 작용하기 때문에 많은 연구에서 운동에 의한 피로 지표로 이용하고 있다. Lactate dehydrogense (LDH)는 pyruvate로부터 lactate의 형성을 촉매하는 효소로써, 고강도의 운동시 과량의 pyruvate가 생성되며 이를 젖산으로 전환하는 과정을 촉매하는 LDH 활성이 증가하게 된다. 따라서 혈청 LDH 활성의 증가는 골격근의 부담이 증가하는 것으로 근 손상의 지표가 된다.
상기 표 20을 살펴보면, 혈청 내 젖산 농도는 대조군(G1)과 비교하여 실시예 투여군 (G2)에서 유의적으로 감소하였고, 혈청 내 LDH 활성은 대조군 (G1)과 비교하여 실시예 투여군 (G2)에서 감소하는 경향을 나타내었으나 유의적인 차이를 나타내지는 않았다.
<인비보 체계에서의 운동수행능력 향상 효능 평가> - 운동과 병행하여 시료 섭취한 경우
시험예 11: 실험동물의 체중
시험 기간 동안 2주에 1회 실험동물의 체중을 측정하여 하기 표 21에 나타내었다.
시험군 실험동물의 체중 (g)
0주 2주 4주 6주
A1 - 26.9±0.3 34.8±0.5 39.0±0.8 42.5±0.7
A2 실시예 26.6±0.4 32.7±0.7 35.5±1.0* 37.9±1.2*
A3 - 26.6±0.2 31.8±0.4 35.4±0.5 38.7±0.5
A4 실시예 26.6±0.3 31.4±0.3 35.0±0.5 37.8±0.8
A5 비교예 1 26.6±0.3 31.4±0.3 35.0±0.5 38.1±0.8
A6 비교예 2 26.5±0.2 31.3±0.4 35.1±0.4 38.5±0.5
A7 비교예 3 26.4±0.2 31.4±0.2 35.9±0.4 38.4±0.4
A8 비교예 4 26.6±0.2 31.7±0.4 35.3±0.4 38.6±0.3
A9 Cr 26.8±0.3 31.2±0.6 34.0±0.8 38.0±1.0
상기 표 21을 살펴보면, 모든 군의 실험동물은 시험 기간 동안 지속적으로 체중이 증가하여 정상적인 체중 변화를 나타내었다. 비운동 대조군 (A1)과 비교하여 실시예 투여군 (A2)의 체중은 4주차부터 시험 종료 시까지 체중이 유의적으로 감소하였고, 운동 대조군 (A3)의 체중은 비운동 대조군 (A1)과 비교하여 1주차부터 시험 종료 시까지 체중이 유의적으로 감소하였다.
시험예 12: 탈진 시까지의 운동시간과 운동량에 미치는 영향
시험물질의 지구력 운동 수행능력을 평가하기 위하여 경사도 10도, 속도 10 m/min으로 5분간 운동을 시작한 후, 매 1분 마다 1 m/min의 속도를 높여 운동 강도를 증가시켜 최대 25 m/min의 속도에서 탈진까지의 운동 지속시간을 측정하여 표 22에 나타내었다.
시험군 탈진시까지의 시간 및 운동량 (g)
탈진시간 (sec) 운동량
A1 - 1,119±58 1,217±127
A2 실시예 1,472±66*** 1,583±91***
A3 - 1,950±85*** 2,406±123***
A4 실시예 2,860±71+++ 3,720±54+++
A5 비교예 1 2,050±74 2,410±51
A6 비교예 2 2,084±67 2,416±75
A7 비교예 3 2,074±91 2,493±48
A8 비교예 4 2,174±94 2,693±86
A9 Cr 2,674±177++ 3,668±279++
*, ** 및 ***는 A1군과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다(A2, A3).
+, ++ 및 +++는 A3군과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다(A4~A9).
상기 표 22에 나타낸 바와 같이, 탈진 시까지의 운동시간은 비운동 대조군 (A1)이 1,119 ± 58초로 다른 시험군과 비교하여 운동시간이 가장 짧았으며, 비운동 시험군의 실시예 투여군 (A2) 및 운동 대조군 (A3)은 비운동 대조군 (A1)에 비해 탈진 시까지의 운동 시간이 유의적으로 증가하였다. 운동 시험군의 실시예 투여군 (A4) 및 Cr 투여군 (A9)은 운동 대조군 (A3)과 비교하여 탈진 시까지의 운동 시간이 유의적으로 증가하였다.
실험동물의 운동량을 산출한 결과, 비운동 대조군 (A1)에 비해 비운동 시험군의 실시예 투여군 (A2)은 운동량이 유의적으로 증가하였다. 운동 대조군 (A3)의 운동량은 비운동 대조군 (A1)과 비교하여 현저히 증가하였고, 운동 시험군의 실시예 투여군 (A4) 및 Cr 투여군 (A9)의 운동량은 운동 대조군 (A3)과 비교하여 유의적으로 증가하였다.
이는 실시예에 따른 돌외잎 추출물의 투여가 운동수행능력을 향상시키는 효과가 있음을 나타낸다.
시험예 13: 간과 근육 무게
시험 종료 후 실험동물의 부위별 근육 및 간 무게를 측정하여 표 23에 나타내었다.
시험군 간 및 근육 무게 (g)
대퇴사두근
(QF)		 장딴지근
(GA)		 가자미근
(SOL)		 장지신근
(EDL)		 간
A1 - 0.283±0.017 0.400±0.013 0.021±0.001 0.020±0.001 2.16±0.07
A2 실시예 0.280±0.014 0.392±0.010 0.021±0.001 0.021±0.001 1.87±0.08*
A3 - 0.289±0.015 0.404±0.007 0.024±0.001 0.024±0.001 1.98±0.05
A4 실시예 0.293±0.018 0.414±0.012 0.024±0.001 0.024±0.001 1.79±0.07+
A5 비교예 1 0.288±0.021 0.404±0.011 0.024±0.001 0.024±0.001 1.95±0.06
A6 비교예 2 0.289±0.024 0.405±0.013 0.023±0.001 0.024±0.001 1.94±0.08
A7 비교예 3 0.288±0.023 0.406±0.008 0.024±0.001 0.023±0.001 1.95±0.07
A8 비교예 4 0.290±0.015 0.405±0.006 0.025±0.001 0.024±0.001 1.97±0.06
A8 Cr 0.330±0.026 0.409±0.012 0.023±.001 0.022±0.001 2.08±0.05
실험동물의 체중이 운동 및 시험물질 투여에 의해 감소하였기에 체중 100g당 부위별 근육의 무게 및 간 무게를 변환하여 표 24에 나타내었다.
시험군 상대적인 간 및 근육 무게 (g/100 g body weight)
대퇴사두근
(QF)		 장딴지근
(GA)		 가자미근
(SOL)		 장지신근
(EDL)		 간
A1 - 0.668±0.040 0.940±0.031 0.049±0.001 0.047±0.001 5.08±0.15
A2 실시예 0.742±0.031 1.040±0.036 0.056±0.002* 0.056±0.002* 4.92±0.10
A3 - 0.744±0.036 1.044±0.019 0.062±0.002 0.063±0.001 5.12±0.18
A4 실시예 0.819±0.049+ 1.110±0.036+ 0.064±0.002 0.064±0.001 4.74±0.10
A5 비교예 1 0.742±0.064 1.041±0.024 0.062±0.002 0.063±0.001 5.10±0.09
A6 비교예 2 0.743±0.075 1.040±0.016 0.062±0.001 0.063±0.002 5.11±0.17
A7 비교예 3 0.745±0.057 1.044±0.021 0.062±0.002 0.063±0.002 5.12±0.19
A8 비교예 4 0.746±0.034 1.045±0.023 0.063±0.001 0.063±0.002 5.13±0.08
A9 Cr 0.873±0.067+ 1.078±0.028 0.061±0.002 0.059±0.004 5.49±0.13
상기 표 24를 살펴보면, 장딴지근 (GA), 가자미근 (SOL), 장지신근 (EDL)의 상대적 무게는 비운동 대조군 (A1)과 비교하여 운동 대조군 (A3)에서 유의적으로 증가하였다. 또한, 가자미근 (SOL), 장지신근 (EDL)의 상대적 무게는 비운동 대조군 (A1)과 비교하여 실시예 투여군 (A2)에서 유의적으로 증가하였다. 또한, 운동 시험군에서, 대퇴사두근(QF) 및 장딴지근 (GA)의 상대적인 무게는 운동 대조군 (A3)에 비해 실시예 투여군 (A4)에서 유의적으로 증가하였다.
즉, 본 발명에 따른 실시예의 조성물의 투여는 근육 증대 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
시험예 14: 혈액 생화학 분석
시험 종료 시 수집한 혈청 내 젖산, CREA, BUN의 함량과 CK, LDH, ALT, AST, ALP 활성을 측정하여 표 25에 나타내었다.
시험군 혈청 분석
CK
(U/L)		 젖산
(μmol/L)		 LDH
(U/L)		 BUN
(mg/dL)		 CREA
(mg/dL)
A1 - 393.2±80.6 6.51±0.47 1,009±77 8.57±0.41 0.335±0.014
A2 실시예 416.7±65.1 4.85±0.30* 860±94* 7.03±0.47 0.311±0.009
A3 - 552.8±64.0 7.68±0.61 1,569±91 8.39±0.34 0.324±0.015
A4 실시예 376.1±27.6+ 5.97±0.21+ 1,383±92+ 8.42±0.50 0.337±0.014
A5 비교예 1 554.6±27.4 7.76±0.23 1,557±49 8.39±0.31 0.322±0.011
A6 비교예 2 538.4±45.7 7.20±0.36 1,546±56 8.46±0.29 0.328±0.005
A7 비교예 3 556.3±31.9 7.19±0.42 1,545±53 8.45±0.38 0.326±0.012
A8 비교예 4 513.7±61.3 7.03±0.20 1,501±41 8.43±0.24 0.324±0.013
A9 Cr 521.5±68.3 5.30±0.41+ 1,169±103+ 7.84±0.47 0.363±0.006
상기 표 25를 살펴보면, 본 발명의 실시예에 따른 조성물 투여군 (A4)은 운동 대조군 (A3)에 비해 CK 및 LDH 활성, 및 혈청 내 젖산 농도가 유의적으로 감소하였다.
따라서, 상기의 결과로부터 본 발명의 실시예에 따른 조성물의 투여는 근피로 개선에 도움을 주는 것을 알 수 있다.
시험예 15: 간과 근육 (장딴지근, GA) 내 글리코겐 함량
운동 중 가장 중요한 에너지원 중 하나인 탄수화물은 글리코겐 분해 과정을 통해 근수축을 위한 에너지를 공급한다. 운동 중 혈중 glucose 농도가 감소하면, 간 또는 근육에 저장되어있는 글리코겐이 곧바로 에너지원으로 사용되게 되므로 글리코겐 분해 억제 즉, 글리코겐을 절약하여 사용한다는 것은 그만큼 오랫동안 근수축을 유지할 수 있는 능력을 갖춘다는 것을 의미한다.
이에 따라, 시험 종료 시 수집한 근육 (GA) 내 글리코겐 함량을 측정하여 하기 표 26에 나타내었다.
시험군 GA 1mg 내 글리코겐 함량
(㎍/mg GA)		 전체 GA 내 글리코겐 함량
(㎍/GA)
A1 - 3.20±0.22 1285.5±113.1
A2 실시예 3.56±0.16* 1442.1±77.2*
A3 - 2.83±0.14 1145.8±62.4
A4 실시예 3.38±0.12+ 1404.4±83.3+
A5 비교예 1 2.83±0.16 1131.1±72.6
A6 비교예 2 2.89±0.11 1141.5±64.1
A7 비교예 3 2.81±0.13 1191.3±62.8
A8 비교예 4 2.85±0.14 1268.8±37.1
A9 Cr 3.32±0.21+ 1350.5±73.7+
상기 표 26을 살펴보면, 근육 (GA) 조직 내 글리코겐 함량은 운동 시험군에서 실시예 투여군 (A4)은 운동 대조군 (A3)과 비교하여 유의적으로 증가하였다.
상기의 결과로부터 본 발명의 실시예에 따른 돌외잎 추출물이 근육 (GA) 조직의 글리코겐 함량을 증가시켜, 근 피로 감소 및 근지구력 향상에 도움을 주는 에너지원이 될 것으로 판단된다.
시험예 16: 근육 (장딴지근, GA) 내 단백질 발현 변화
본 연구에서는 시험물질의 투여가 PGC-1α 활성화에 관련된 단백질의 변화에 미치는 영향을 조사하기 위해 근육 (장딴지근, GA) 조직 lysate를 사용하여 Western blot을 실시하였다. 그리고, 상기 Western blot 분석 결과를 토대로 각 단백질에 대한 활성화 단백질의 비율을 통해 각 단백질의 활성을 평가하여 하기 표 27에 나타내었다.
시험군 p-PGC1α/PGC1α
ratio		 p-AMPK/AMPK ratio p-p38/p38
ratio		 p-Nrf2/Nrf2 ratio
A1 - 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
A2 실시예 1.11±0.07* 1.17±0.09* 1.81±0.13* 0.92±0.06
A3 - 1.38±0.42** 1.33±0.09** 0.84±0.08 1.52±0.05**
A4 실시예 2.54±0.59++ 1.78±0.05++ 1.52±0.03+ 1.57±0.06
A5 비교예 1 1.44±0.23 1.33±0.27 0.84±0.31 1.52±0.22
A6 비교예 2 1.46±0.19 1.40±0.08 0.85±0.11 1.53±0.08
A7 비교예 3 1.40±0.24 1.38±0.20 0.90±0.17 1.51±0.06
A8 비교예 4 1.57±0.31 1.41±0.09 1.06±0.07 1.52±0.08
A9 Cr 2.28±0.84+ 1.43±0.13 1.94±0.16+ 1.35±0.17+
상기 표 27을 살펴보면, 실시예 투여군에서 PGC-1α 활성화에 관련된 단백질의 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있고, 특히 운동 시험군에서 실시예 투여군 (A4)은 운동 대조군 (A3)과 비교하여 PGC1α, AMPK 및 p-38 MAPK의 활성이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있다.
이러한 결과를 통해, 규칙적인 운동훈련과 함께 실시예의 조성물의 투여는 PGC-1α 활성화에 관련된 단백질인 AMPK 및 p38 MAPK의 활성화를 유의적으로 증가시켜 미토콘드리아 생합성 및 당 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하여 운동수행능력을 향상시키는 것을 유추할 수 있다.
시험예 17: 근육 (가자미근, SOL)의 mRNA 발현 변화
근육은 생리적 수축 속도에 의해 지근과 속근으로 구분할 수 있으며, 그 중 지근은 미토콘드리아의 수가 많고 활성이 높아 피로에 대한 저항력이 높으므로 장시간 동안 운동을 가능하게 한다. 따라서 본 연구에서는 지구력 운동훈련과 시험물질의 투여가 지근에 속하는 가자미근 (SOL)의 항산화 관련 유전자 (SOD2, GPx1, UCP2, UCP3), LDH 관련 유전자 (ERRα, LDH B, MCT1), 미토콘드리아 합성관련 유전자 (Tfam, CPT-1β, mtDNA, NRF1), 에너지 대사 관련 유전자 (PGC-1α, GYS, PPARγ, PPARδ)의 발현에 미치는 영향을 조사하여 그 결과를 하기 표 28 내지 표 29에 나타내었다.
항산화 관련 mRNA 발현 변화
시험군 SOD2 GPx1 UCP2 UCP3
A1 - 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
A2 실시예 1.16±0.03* 0.79±0.10 1.23±0.05* 0.31±0.09
A3 - 1.11±0.03* 1.15±0.13 1.50±0.46 0.69±0.22
A4 실시예 1.69±0.17+ 1.31±0.06 3.59±0.53+ 0.41±0.08
A5 비교예 1 1.13±0.22 1.17±0.29 1.54±1.50 0.63±0.11
A6 비교예 2 1.15±0.11 1.15±0.16 1.54±1.06 0.60±0.13
A7 비교예 3 1.10±0.15 1.19±0.28 1.55±1.13 0.62±0.12
A8 비교예 4 1.23±0.15 1.21±0.11 1.64±0.48 0.60±0.16
A9 Cr 1.52±0.08+ 1.92±0.29++ 14.96±1.96+++ 0.87±0.22
상기 표 28을 살펴보면, 실시예 투여군에서 항산화와 관련된 단백질의 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있고, 특히 운동 시험군에서 실시예 투여군 (A4)은 운동 대조군 (A3)과 비교하여 SOD2 및 UCP2의 활성이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있다.
이러한 결과를 통해, 규칙적인 운동훈련과 함께 실시예의 조성물의 투여는 SOD2, UCP2 mRNA 발현을 증가시킴으로써 산화적 스트레스로부터 미토콘드리아를 보호하여 근육세포 손상을 억제할 수 있음을 유추할 수 있다.
LDH 관련 mRNA 발현 변화
시험군 ERRα LDH B MCT1
A1 - 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
A2 실시예 1.67±0.22* 1.76±0.49** 0.41±0.03**
A3 - 1.24±0.32 1.20±0.22 0.28±0.07**
A4 실시예 1.13±0.15 1.55±0.14++ 0.58±0.09++
A5 비교예 1 1.22±0.16 1.25±0.31 0.34±0.13
A6 비교예 2 1.20±0.21 1.25±0.24 0.30±0.12
A7 비교예 3 1.24±0.11 1.27±0.13 0.37±0.20
A8 비교예 4 1.21±0.17 1.23±0.19 0.40±0.15
A9 Cr 0.58±0.19 0.35±0.11 0.99±0.31
상기 표 29를 살펴보면, 실시예 투여군(A4)에서 LDH와 관련된 유전자 중 LDH B mRNA 발현이 운동 대조군 (A3)에 비해 유의적으로 증가하고, MCT1 mRNA 발현이 운동 대조군 (A3)에 비해 유의적으로 증가하였다.
미토콘드리아 합성 관련 mRNA 발현 변화
시험군 mtDNA Tfam CPT-1β NRF1
A1 - 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
A2 실시예 1.29±0.12* 4.74±0.32*** 0.34±0.02*** 15.52±2.59***
A3 - 1.52±0.09** 1.47±0.14* 0.38±0.03*** 4.92±0.95**
A4 실시예 4.66±0.23+++ 1.19±0.15+ 0.88±0.04+++ 12.53±1.68++
A5 비교예 1 1.58±0.57 1.47±0.34 0.39±0.02 4.94±3.06
A6 비교예 2 1.57±0.45 1.41±0.27 0.38±0.03 4.91±0.82
A7 비교예 3 1.46±0.29 1.44±0.14 0.39±0.06 4.99±0.57
A8 비교예 4 1.79±0.11 1.48±0.05 0.42±0.06 6.13±0.62
A9 Cr 1.69±0.20 1.34±0.07 0.95±0.28 9.17±2.18
상기 표 30을 살펴보면, 실시예 투여군에서 미토콘드리아 합성과 관련된 유전자의 발현이 증가하는 경향을 확인할 수 있고, 특히 운동 시험군에서 실시예 투여군 (A4)은 운동 대조군 (A3)과 비교하여 mtDNA, CPT-1β 및 NRF1 mRNA의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있다.
이러한 결과를 통해, 규칙적인 운동훈련과 병행되는 실시예의 조성물의 투여는 mtDNA, CPT-1β 및 NRF1 mRNA 발현을 증가시킴에 따라 미토콘드리아의 생합성을 증가시킴으로써 운동수행능력을 향상시킬 수 있음을 유추할 수 있다.
에너지 대사 관련 mRNA 발현 변화
시험군 PGC1α PPARγ PPARδ GSY
A1 - 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
A2 실시예 0.88±0.08 0.05±0.00*** 2.87±0.95* 2.60±0.51
A3 - 2.34±0.32** 0.54±0.12* 1.44±0.28 0.40±0.11*
A4 실시예 2.50±0.36 1.03±0.21+ 3.41±0.76++ 0.43±0.10
A5 비교예 1 2.39±0.42 0.58±0.16 1.51±0.27 0.41±0.03
A6 비교예 2 2.32±0.40 0.54±0.20 1.24±0.16 0.41±0.05
A7 비교예 3 2.38±0.37 0.57±0.08 1.37±0.21 0.42±0.03
A8 비교예 4 2.43±0.17 0.68±0.15 1.68±0.37 0.42±0.09
A9 Cr 5.09±1.22+ 0.29±0.05 3.82±0.90++ 0.92±0.31
상기 표 31을 살펴보면, 실시예 투여군에서 에너지 대사와 관련된 유전자의 발현이 증가하는 경향을 확인할 수 있고, 특히 운동 시험군에서 실시예 투여군 (A4)은 운동 대조군 (A3)과 비교하여 PPARδ의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있다.
이러한 결과를 통해, 규칙적인 운동훈련과 병행하는 실시예의 조성물의 투여는 PPARγ 및 PPARδ mRNA 발현을 증가시킴에 따라 에너지 대사를 증가시킴으로써 운동수행능력을 향상시킬 수 있음을 유추할 수 있다.
결론적으로, 지구력 운동훈련과 함께 실시예의 조성물의 투여는 근육 증대 효과를 나타내고, 운동 시 증가된 젖산 농도를 감소시켜 근피로 개선 도움을 주고, 미토콘드리아 생합성 및 당 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하여 운동수행능력을 향상시키는 것으로 판단된다. 이는 실시예의 조성물이 지구력 운동 수행 시 운동수행능력을 향상시키는 기능성 소재로의 개발 가능성을 제시한다.
<제조예>
제조예 1: 정제의 제조
실시예의 돌외잎 추출물 분말 10 mg, 비타민 E 9 mg, 비타민 C 9 mg, 갈락토올리고당 200 mg, 유당 60mg 및 맥아당 140 mg을 혼합하고 유동층 건조기를 이용하여 과립한 후 당 에스테르(sugar ester) 6 mg을 첨가한다. 이들 조성물 500 mg을 통상의 방법으로 타정하여 정제를 제조한다.
제조예 2: 캡슐의 제조
통상의 연질 캡슐제 제조방법에 따라, 실시예의 돌외잎 추출물 분말 10 mg, 비타민 C 9mg, 팜유 2mg, 식물성 경화유 8mg, 황납4mg 및 레시틴 9mg을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 연질 캡슐제를 제조하였다.
제조예 3: 환제의 제조
실시예의 돌외잎 추출물을 분쇄하여 200 mesh를 통과한 분말을 수득하였다. 상기 돌외잎 분말 5 mg에 꿀, 덱스트린, 전분, 미결정 셀룰로스, CMC 칼슘 등과 적절하게 반죽을 한 후 환제를 제조하였다.
제조예 4: 드링크제의 제조
실시예의 돌외잎 추출물 20 mg, 비타민 E 9 mg, 비타민 C 9 mg, 포도당 10 g, 구연산 0.6 g, 액상 올리고당 25 g을 혼합한 후 정제수 300 ml을 가하여 각 병에 200 ml씩 되도록 충진하였다. 병에 충진한 후 130℃에서 4~5초간 살균하여 드링크제를 제조하였다.
제조예 5: 과립제의 제조
실시예의 돌외잎 추출물 5 mg, 비타민 E 9 mg, 비타민 C 9 mg, 무수결정 포도당 250 mg 및 전분 550 mg을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하여 과립제를 제조하였다.
제조예 6: 농축액상차의 제조
실시예의 돌외잎 추출물 분말에 물을 가하여 고형분 15%의 혼합액으로 희석하였다. 이를 90 ℃에서 가열한 후 상기 돌외잎 추출물 분말 100 중량부에 대하여 10 중량부의 γ-Cyclodextrin을 가하여 혼합하였다. 상기 혼합물을 60%로 농축하여 농축액상차를 제조하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI을 100 : 20 내지 80의 중량비로 포함하는 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물을 유효성분으로 하는 운동수행능력 향상용 식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물은 상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI을 20 내지 140 mg/g로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물은 상기 지페노사이드 L을 10 내지 80 mg/g, 및 상기 지페노사이드 LI을 10 내지 60 mg/g으로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물은,
    상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI의 총 100 중량부에 대하여 5 내지 10 중량부의 Rg3를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물은,
    상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI의 총 100 중량부에 대하여 총 50 내지 90 중량부의 다물린 A 및 다물린 B를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물은,
    진세노사이드 Rg3를 1 ~ 14 mg/g, 지페노사이드 L를 15 ~ 80 mg/g, 지페노사이드 LI를 10 ~ 60 mg/g, 다물린 A를 10 ~ 20 mg/g 및 다물린 B를 10 ~ 20 mg/g으로 포함하고, 벤조피렌을 10 ppb 이하로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물은,
    건조 돌외잎을 팽윤시키는 단계; 및 상기 팽윤시킨 돌외잎을 가열한 후 건조하는 단계; 및 상기 건조한 돌외잎을 추출하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물은,
    하기 (1) 내지 (5)의 방법에 따라 제조되는 것을 특징으로 하는 식품 조성물:
    (1) 반응용기에 건조 돌외잎을 넣고, 상기 건조 돌외잎 1 중량부에 대하여 0.5 내지 13 중량부의 물을 공급하는 단계;
    (2) 상기 반응용기를 0.2 내지 10 ℃/min로 112 내지 150 ℃까지 승온시키면서 돌외잎을 팽윤시키는 단계;
    (3) 상기 반응용기를 112 내지 150 ℃에서 10분 내지 24 시간 동안 가열하는 단계;
    (4) 상기 반응용기의 압력을 해제하여 돌외잎을 건조시키는 단계; 및
    (5) 상기 건조한 돌외잎을 40 내지 100 ℃에서 열수 추출 또는 에탄올 추출하는 단계.
  9. 제8항에 있어서,
    (1) 단계의 건조 돌외잎은 돌외 생잎을 덖음 또는 증숙한 후 건조한 것임을 특징으로 하는 식품 조성물.
  10. 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI을 100 : 20 내지 80의 중량비로 포함하는 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물을 유효성분으로 하는 운동수행능력 향상용 약학 조성물.
  11. 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI을 100 : 20 내지 80의 중량비로 포함하는 돌외잎차, 돌외잎차 추출물 또는 돌외잎 추출물을 유효성분으로 하는 근육 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
PCT/KR2023/000682 2022-01-14 2023-01-13 돌외잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용 조성물 WO2023136668A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2022-0005742 2022-01-14
KR1020220005742A KR102490378B1 (ko) 2022-01-14 2022-01-14 돌외잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023136668A1 true WO2023136668A1 (ko) 2023-07-20

Family

ID=85110210

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2023/000682 WO2023136668A1 (ko) 2022-01-14 2023-01-13 돌외잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102490378B1 (ko)
WO (1) WO2023136668A1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100930580B1 (ko) * 2009-07-17 2009-12-09 주식회사 티지 바이오텍 다물린 에이 및 다물린 비 함량이 증가된 신규 돌외추출물의 제조방법 및 이를 이용한 대사질환 치료용 약학 조성물
KR20140079139A (ko) * 2012-12-18 2014-06-26 재단법인 한국한방산업진흥원 돌외 추출물로부터 다물린 a 및 다물린 b를 대량으로 분리하는 분리방법
KR20160066850A (ko) * 2014-12-03 2016-06-13 충북대학교 산학협력단 돌외 추출물을 유효성분으로 함유하는 ｌ－ｄｏｐａ－유도 운동이상증 예방 및 치료용 약학 조성물
KR20190038505A (ko) * 2017-07-21 2019-04-08 주식회사 비티씨 돌외잎 추출물을 포함하는 근육 증대용 또는 근육 손실 저해용 조성물

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100930580B1 (ko) * 2009-07-17 2009-12-09 주식회사 티지 바이오텍 다물린 에이 및 다물린 비 함량이 증가된 신규 돌외추출물의 제조방법 및 이를 이용한 대사질환 치료용 약학 조성물
KR20140079139A (ko) * 2012-12-18 2014-06-26 재단법인 한국한방산업진흥원 돌외 추출물로부터 다물린 a 및 다물린 b를 대량으로 분리하는 분리방법
KR20160066850A (ko) * 2014-12-03 2016-06-13 충북대학교 산학협력단 돌외 추출물을 유효성분으로 함유하는 ｌ－ｄｏｐａ－유도 운동이상증 예방 및 치료용 약학 조성물
KR20190038505A (ko) * 2017-07-21 2019-04-08 주식회사 비티씨 돌외잎 추출물을 포함하는 근육 증대용 또는 근육 손실 저해용 조성물

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KIM YOON HEE, JUNG JAE IN, JEON YOUNG EUN, KIM SO MI, HONG SU HEE, KIM TAE YOUNG, KIM EUN JI: "Gynostemma pentaphyllum extract and its active component gypenoside L improve the exercise performance of treadmill-trained mice", NUTRITION RESEARCH AND PRACTICE, KOREAN NUTRITION SOCIETY, KR, vol. 16, no. 3, 1 January 2022 (2022-01-01), KR , pages 298 - 313, XP093078283, ISSN: 1976-1457, DOI: 10.4162/nrp.2022.16.3.298 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102490378B1 (ko) 2023-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017030410A1 (ko) 검정콩잎 추출물 및 이로부터 분리한 플라보놀배당체를 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방 또는 치료용, 또는 항산화용 조성물
WO2009104902A2 (en) Composition for improvement of exercise performance, fatigue recovery and antioxidation activity comprising panax species plant leaves extract or processed panax species plant leaves extract, or mixture of the both
WO2022035115A1 (ko) 오리나무 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 골격근 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 이의 용도
WO2014104672A1 (en) A purified extract isolated from pseudolysimachion rotundum var. subintegrum containing abundant amount of active ingredient, the preparation thereof, and the composition comprising the same as an active ingredient for preventing or treating inflammation, allergy and asthma
WO2019135637A1 (ko) 저분자 유효 사포닌의 함량이 증대되고 벤조피렌은 저감된 돌외잎 추출물의 제조방법 및 이에 따른 돌외잎 추출물
WO2018124508A1 (ko) 3,5-디카페오일퀴닉에시드 또는 국화 추출물을 함유하는 근육 질환 예방 및 치료용 또는 근 기능 개선용 조성물
WO2011043630A2 (ko) 고 수용성 ２-하이드록시프로필-베타사이클로덱스트린을 유효성분으로 함유하는 비만 질환 예방 및 치료용 조성물
WO2014027832A1 (ko) 대장염 예방 또는 치료용 조성물
WO2020071667A1 (ko) 몰로키아 추출물을 유효성분으로 하는 장내 균총 개선용 조성물, 또는 장내 염증, 장누수증후군, 비만 또는 대사성질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물
WO2012067316A1 (ko) 테로카판계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 또는 이들의 합병증의 예방 또는 치료용, 또는 항산화용 조성물
WO2023136668A1 (ko) 돌외잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용 조성물
WO2019017677A2 (ko) 시트랄을 유효성분으로 함유하는 근력강화, 근육증강, 근육분화, 근육재생 또는 근감소증 억제효과를 갖는 조성물
WO2012081831A2 (en) Composition comprising the extract of loranthus yadoriki sieb having monoamine oxidase-inhibiting activity
WO2012138146A9 (ko) 돌콩의 열처리분말 또는 추출물을 유효성분으로 하는 당뇨병 및 당뇨합병증의 예방 및 치료를 위한 조성물
WO2009104913A2 (en) Composition comprising an extract of mixed herbs with lonicera japonica thunb and anemarrhena asphodeloides bunge for preventing and treating arthritic diseases
WO2015002430A1 (ko) 피스타시아 웨인마니폴리아 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2019083286A2 (ko) 아이론을 유효성분으로 포함 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물
WO2023128636A1 (ko) 찔레나무 뿌리 추출물을 포함하는 비만 및 대사질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물
WO2022250210A1 (ko) 돌외잎차의 제조방법 및 이에 따라 제조된 돌외잎차를 이용한 돌외잎차 추출물의 제조방법
WO2014168413A1 (en) The composition comprising a purified extract isolated from pseudolysimachion rotundum var. subintegrum containing abundant amount of active ingredient or the compounds isolated therefrom, as an active ingredient for preventing or treating chronic obstructive pulmonary disease and the use thereof
WO2019172566A1 (ko) 이오논을 유효성분으로 함유하는 항스트레스제, 항우울제 또는 항불안제 조성물
WO2024085700A1 (ko) 고려엉겅퀴, 냉이 또는 삼백초 추출물을 유효성분으로 함유하는 심근 손상의 개선, 예방 또는 치료용 조성물
WO2023136669A1 (ko) 지페노사이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용 조성물
WO2015046743A1 (ko) 댕댕이나무 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 갑상선 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2017192013A1 (ko) 팥을 포함하는 근 기능 개선 또는 운동수행능력 향상용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23740511

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE