WO2023106464A1 - 신규 다이페나진 화합물 및 이의 암 또는 신경염증질환 예방 또는 치료 용도 - Google Patents

신규 다이페나진 화합물 및 이의 암 또는 신경염증질환 예방 또는 치료 용도 Download PDF

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WO2023106464A1
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신희재
이화선
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한국해양과학기술원
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Definitions

  • the present invention relates to novel diphenazine compounds and uses thereof.
  • Marine fungi have been continuously studied and are known to produce a large number of novel compounds. While conducting research to find novel bioactive substances derived from deep-sea microorganisms, the present inventors discovered an uncommon yeast fungus Cystobasidium laryngis IV17-028 isolated from the mid-ocean ridge of the Indian Ocean. In the preceding literature ( Mar. Drugs, 2019 , 17 , 482), three new derivatives of the phenazine family were isolated from strain IV17-028, and these derivatives showed anti-inflammatory activity in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Confirmed.
  • Phenazine compounds were known to be produced by bacteria (Streptomyces and Pseudomonas) and some archaea until they were isolated from C. laryngis IV17-028 strain.
  • the phenazine backbone with redox activity is responsible for electron shuttle, reduction of reactive oxygen species, gene expression regulation, biofilm formation, quorum sensing signal and intracellular oxidation. It is involved in the maintenance of reduction homeostasis. Therefore, phenazine-based compounds are attracting attention because of the aforementioned diverse roles and wide range of physiological activities.
  • dimeric phenazines such as esmeradine AB, phenazostatin AD, ijumiphenazine AB, phenaziolin AE and diastaphenazine have been relatively unreported, and phenazostatin D (pseudonocar reported from Dia species), the others are reported to be isolated only from Streptomyces species.
  • phenazostatin AC has been reported to protect neuronal hybridoma N-18-RE-105 cells from glutamate toxicity to prevent cerebral ischemic injury.
  • the present inventors isolated and identified the structure of phenazostatin E-J, a novel diphenazine compound, semi-synthesized some of them, and confirmed the anticancer effect and physiological activity of these compounds against neuroinflammation to complete the present invention.
  • Patent Document 001 Registered Patent Publication KR10-2120907
  • Non-Patent Document 001 Mar. Drugs, 2019 , 17 , 482.
  • An object to be solved by the present invention is to provide a novel diphenazine compound, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a use of the novel diphenazine compound, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer-related diseases, comprising the step of administering the novel diphenazine compound, its optical isomer, and its pharmaceutically acceptable salt to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a novel diphenazine compound represented by Formula 1, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • X is , or is,
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each independently , -OH, -COH, -COOH, -COOCH 3 or -COCH 3 .
  • the present invention (-CHCH 3 OH) is and means that all are possible.
  • the X is When , Formula 1 has a structure shown in Formula 2 below.
  • R 1 is defined the same as in Formula 1.
  • the X is When , Formula 1 has a structure shown in Formula 3 below.
  • R 2 and R 3 are defined the same as in Formula 1.
  • the X is When , Formula 1 has a structure shown in Formula 4 below.
  • R 4 is defined the same as in Formula 1.
  • the X is When , R 1 is , -COOH, or -COCH 3 , but is not limited thereto.
  • the X is When , R 1 is , -COOH, or -COCH 3 , but is not limited thereto.
  • the X is When , R 1 is , -COOH, or -COCH 3 , but is not limited thereto.
  • the compound of Formula 1 may be any one selected from the group consisting of the following compounds:
  • the compound represented by Formula 1 of the present invention may contain one or more asymmetric carbons, and thus may exist as racemates, racemic mixtures, single enantiomers, diastereomeric mixtures, and individual diastereomers. there is.
  • each stereoisomer of the compound represented by Formula 1 can be stereospecifically synthesized using optically pure starting materials and/or reagents of known arrangement.
  • the compound of Formula 1 may be any one selected from the group consisting of the compounds of Table 1 below.
  • the pharmaceutically acceptable salt refers to a salt commonly used in the pharmaceutical industry, for example, an inorganic ion salt prepared from calcium, potassium, sodium and magnesium, hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, bromic acid, inorganic acid salts prepared from iodic acid, perchloric acid and sulfuric acid; Acetic acid, trifluoroacetic acid, citric acid, maleic acid, succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, manderic acid, propionic acid, lactic acid, glycolic acid, gluconic acid, galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid, glucuronic acid, aspartic acid organic acid salts prepared from acids, ascorbic acid, carbonic acid, vanillic acid, hydroiodic acid, and the like; sulfonic acid salts prepared from methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic
  • the present invention is Cystobasidium larynges IV17-028 ( Cystobasidium laryngis IV17-028) KCTC 13720BP strain or a step of isolating a diphenazine compound represented by Formula 1, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof from a culture thereof; Provided is a method for preparing a compound of, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Cystobasidium larynges IV17-028 Cystobasidium laryngis IV17-0228
  • the culture of KCTC 13720BP strain can be obtained by culturing the strain in a liquid medium or a solid medium.
  • the medium may include, but is not limited to, glucose, starch syrup, dextrin, starch, molasses, animal oil or vegetable oil as a carbon source.
  • the medium may include bran, soybean meal, wheat, malt, cottonseed meal, fish meal, cornstarch, broth, yeast extract, ammonium sulfate, sodium nitrate, or urea as a nitrogen source.
  • the medium may contain salt, potassium, magnesium, cobalt, chlorine, phosphoric acid, sulfuric acid or other inorganic salts that promote ion production, if necessary.
  • the culture may be cultured while shaking or standing, and the culture temperature may be about 20 ° C to about 37 ° C, preferably about 25 ° C to about 30 ° C.
  • the compound of Formula 1 can be obtained by subjecting the strain or its culture to solvent extraction, concentration, and column chromatography.
  • concentration may be concentrated by adding a solvent to the strain or its culture and evaporating the extract under reduced pressure.
  • a solvent ethyl acetate, chloroform, methylene chloride, and a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms may be used, and preferably ethyl acetate, chloroform, methylene chloride, and methanol may be used.
  • the chromatography may be column chromatography, plate chromatography, paper chromatography or thin layer chromatography depending on the form of the stationary phase. Alternatively, it may be HPLC (high performance liquid chromatography) or gas chromatography depending on the physical characteristics of the mobile phase.
  • the compound of Formula 1 can be obtained by fractionation by silica flash column chromatography using an ethyl acetate extract of the strain or its culture, followed by purification by HPLC using a mixed solvent of methanol and water.
  • the present invention (a) Cystobasidium laringis IV17-028 ( Cystobasidium laryngis IV17-028) culturing the KCTC 13720BP strain;
  • step (b) extracting the culture solution of step (a) with ethyl acetate
  • step (d) stepwise elution of the chloroform extract of step (c) with CH 2 Cl 2 /MeOH
  • the stepwise elution step is eluting with a solvent having a v/v ratio of CH 2 Cl 2 and MeOH of 10:0, 20:1, 10:1, 5:1, or 1:1;
  • step (e) stepwise elution of the product eluted in step (d) with MeOH/H 2 O
  • the stepwise elution step is to elute with a solvent having a v/v ratio of MeOH and H 2 O of 1:4, 2:3, 3:2, 4:1, and 5:0; and
  • the present invention provides a use of a diphenazine compound represented by Formula 1, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each independently , -OH, -COH, -COOH, -COOCH 3 or -COCH 3 .
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the diphenazine compound of Chemical Formula 1, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the diphenazine compound of Formula 1, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Non-limiting examples of cancer in the present invention include pseudomyxoma, intrahepatic cholangiocarcinoma, hepatoblastoma, liver cancer, thyroid cancer, colon cancer, testicular cancer, myelodysplastic syndrome, glioblastoma, oral cancer, lip cancer, mycosis fungoides, acute myelogenous leukemia, acute lymphoma Constitutive leukemia, basal cell carcinoma, ovarian cancer, ovarian epithelial cancer, ovarian germ cell cancer, male breast cancer, brain cancer, pituitary adenoma, multiple myeloma, gallbladder cancer, biliary tract cancer, colorectal cancer, chronic myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, retinoblastoma, choroidal blackhead tumor, diffuse large B-cell lymphoma, ampulla of Vater, bladder cancer, peritoneal cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, rhinosinus cancer, non-small cell lung cancer
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating neuroinflammatory diseases comprising the diphenazine compound of Formula 1, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Non-limiting examples of neuroinflammatory diseases in the present invention include encephalitis, multiple sclerosis, depression, stroke, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Lou Gehrig's disease, Huntington's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, post-traumatic stress disorder, schizophrenia, and amyotrophic dystrophy. Hardening etc. are mentioned.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the diphenazine compound of Formula 1, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may be a mixture of saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and one or more of these components, and, if necessary, antioxidants and buffers. , bacteriostatic agents and other conventional additives may be added.
  • diluents such as aqueous solutions, suspensions, and emulsions, pills, capsules, granules, or tablets.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be a patch, liquid, pill, capsule, granule, tablet, suppository or the like.
  • These formulations may be prepared by a conventional method used for formulation in the art or a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (recent edition), Mack Publishing Company, Easton PA, and formulated into various formulations depending on each disease or component It can be.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically applied) depending on the desired method, and the dosage is determined according to the patient's weight, age, sex, health The range varies depending on the condition, diet, administration time, administration method, excretion rate, and disease type and severity.
  • the daily dose of the compound of Formula 1 of the present invention is about 0.01 to 1000 mg/kg, preferably 0.1 to 100 mg/kg, and may be administered once or several times a day.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain at least one active ingredient exhibiting the same or similar efficacy in addition to the diphenazine compound of Formula 1, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention relates to the treatment of cancer, including the step of administering a therapeutically effective amount of the diphenazine compound of Formula 1, its optical isomer, or its pharmaceutically acceptable salt in Formula 1 to a mammal, including a human, or Provides a way to prevent
  • the present invention is a neuroinflammatory disease comprising the step of administering a therapeutically effective amount of the diphenazine compound of Formula 1, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof of Formula 1 to a mammal, including a human. Methods for treatment or prevention are provided.
  • therapeutically effective amount used herein refers to an amount of the diphenazine compound of Formula 1, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof effective for preventing or treating cancer or neuroinflammatory disease.
  • the treatment method of the present invention includes not only addressing the disease itself prior to the onset of symptoms, but also inhibiting or avoiding its symptoms, by administering the compound of Formula 1 above.
  • the prophylactic or therapeutic dose of a particular active ingredient will vary depending on the nature and severity of the disease or condition and the route by which the active ingredient is administered. Dosage and frequency of dosing will vary according to the age, weight and response of the individual patient. A suitable dosage regimen can be readily selected by those skilled in the art who take these factors into account.
  • the treatment method of the present invention may further include the administration of a therapeutically effective amount of an additional active agent to help treat a disease together with the compound of Formula 1, the additional active agent together with the compound of Formula 1 They may exhibit synergistic or auxiliary effects.
  • the present invention provides a food composition for preventing or improving cancer, comprising the diphenazine compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a food composition for preventing or alleviating neuroinflammatory diseases comprising the diphenazine compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the food composition of the present invention can be used as a health functional food.
  • health functional food refers to food manufactured and processed using raw materials or ingredients having functional properties useful for the human body in accordance with the Health Functional Food Act No. 6727, and “functional” refers to the structure of the human body. And it refers to intake for the purpose of obtaining useful effects for health purposes such as regulating nutrients for functions or physiological functions.
  • the food composition of the present invention may contain conventional food additives, and the suitability as the "food additive" is determined in accordance with the General Rules of the Code of Food Additives and General Test Methods approved by the Korea Food and Drug Administration, unless otherwise specified. It is judged according to the standards and standards for
  • the food composition of the present invention contains the compound of Formula 1 in an amount of 0.01 to 95%, preferably 1 to 80%, based on the total weight of the composition. can do.
  • it can be prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, beverages, and the like.
  • the present invention is intended to provide a use of the diphenazine compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the preparation of a drug for the treatment of cancer and/or neuroinflammatory disease.
  • the compound of Formula 1 for the preparation of a drug may be mixed with acceptable adjuvants, diluents, carriers, etc., and may be prepared as a combined preparation with other active agents to have a synergistic action of the active ingredients.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating cancer-related diseases, comprising administering the diphenazine compound of Chemical Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need thereof.
  • the cancer-related disease is not particularly limited thereto, but pseudomyxoma, intrahepatic cholangiocarcinoma, hepatoblastoma, liver cancer, thyroid cancer, colon cancer, testicular cancer, myelodysplastic syndrome, glioblastoma, oral cancer, lip cancer, mycosis fungoides, Acute myelogenous leukemia, acute lymphocytic leukemia, basal cell cancer, ovarian cancer, ovarian epithelial cancer, ovarian germ cell cancer, brain cancer, pituitary adenoma, multiple myeloma, gallbladder cancer, biliary tract cancer, colorectal cancer, chronic myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, retinoblastoma ,
  • novel diphenazine compound, its optical isomer or its pharmaceutically acceptable salt according to the present invention selectively exhibits excellent cytotoxicity to cancer cell lines and thus has an excellent preventive or therapeutic effect against the above-mentioned types of cancer, By exhibiting neuroinflammatory disease inhibitory activity in LPS-induced microglial cells, it has an excellent preventive or therapeutic effect on the above-mentioned types of neuroinflammatory diseases.
  • Figure 2 shows the core of the 1 H- 1 H COSY and HMBC correlations of compounds 1 to 6.
  • Figure 4 shows experimental and calculated ECD spectra for compounds 1 and 2.
  • Figure 6 shows the experimental and calculated ECD spectra for compound 4.
  • Figure 8A shows the effects of compounds 1 to 6, 8 and 9 on NO production in BV-2 microglia induced by LPS
  • B of Figure 8 shows the effects of compounds 1 to 6, 8 and 9 on cells represents the survival rate.
  • Figure 9A shows the effect of compound 6 on LPS-induced NO production in BV-2 microglia
  • Figure 9B shows the cell viability of microglia treated with compound 6.
  • EIMS data were obtained using Agilent's 6100 single quadrupole mass spectrometer, and HRESIMS data were obtained using Waters' SYNPT G2 Q-TOF mass spectrometer at the Korea Basic Science Institute (KBSI) in Cheongju, Korea.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Columns for HPLC were YMC-pack Silica (250 mm ⁇ 10 mm, 5 ⁇ m) and YMC-Triart C 18 (250 mm ⁇ 10 mm, 5 ⁇ m and 250 mm ⁇ 4.6 mm, 5 ⁇ m).
  • Silica gel 60 (Merck, 230-400 mesh) and reverse-phase silica gel (YMC-Gel ODS-A, 12 nm, S-75 ⁇ m) were used as fillers for open column chromatography. Mass culture was carried out using a 100 L fermentor from Fermentec. All solvents were HPLC grade or distilled solvents.
  • Cystobasidium laryngis IV17-028 (GenBank accession number: MK131277) was isolated from deep-sea sediments collected at a depth of 4,317 m in the Indian Ocean.
  • Cystobasidium laryngis IV17-028 ( Cystobasidium laryngis IV17-028) strain was cultured on Bennett's (BN) agar medium at 28 ° C for 7 days, then the strain was cultured in 600 mL of BN broth (10 g of glucose in 1 L of distilled water). , Yeast extract 1g, tryptone 2g, beef extract 1g, glycerol 5g, and sea salt 32g included) were inoculated into a 2 L flask and seed cultured at 28° C. for 5 days while stirring at 140 rpm. The seed culture was inoculated into a 100 L fermentor containing 60 L BN liquid medium, and mass culture was performed for 10 days under conditions of 28 ° C., 50 rpm and 20 LPM.
  • Cystobasidium laryngis IV17-028 ( Cystobasidium laryngis IV17-028) strain was deposited on November 20, 2018 and was given accession number KCTC 13720BP.
  • the 60 L mass culture medium was extracted twice with the same amount of ethyl acetate (EtOAc), for a total of 120 L.
  • EtOAc ethyl acetate
  • the EtOAc extract was concentrated to give about 46 g of crude extract.
  • 33.7 g of the crude extract was sequentially fractionated with 1 L of water, n - hexane, chloroform, ethyl acetate (EtOAc), and n -butanol ( n -BuOH) to obtain 5.8 and 14.5, respectively. , 1.1 and 0.9 g were obtained.
  • Compound 1 (0.2 mg each, 0.4 ⁇ mol) was put into two 350 ⁇ L tubes, and dried with N 2 gas. After putting a small amount of 4-dimethylaminopyridine (DMAP) and a stirring magnet, the mixture was vacuum dried for 16 hours. After adding 80 ⁇ L of anhydrous pyridine, the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes. Then, after adding 3 ⁇ L of S - or R -MTPA-Cl to each tube, the mixture was stirred at room temperature for 16 hours. The reactants were concentrated with N 2 gas at 40 °C.
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • the MC layer was dried with anhydrous magnesium sulfate (MgSO 4 ), filtered, and concentrated under reduced pressure to obtain 0.8 mg of a mixture containing 3.
  • the mixture was analyzed by normal phase HPLC (YMC-Pack SIL, 250 mm ⁇ 4.6 mm, 5 ⁇ m; EtOAc/Hex/MeOH (v/v, 50:50:0.02); flow rate: 0.7 mL/min; detector: UV; wavelength: 254 nm) to obtain 3 (0.3 mg, t R 19 min).
  • ( R )-saphenic acid (17.8 mg, 0.066 mmol) was dissolved in 1 mL of anhydrous dimethylformamide (DMF), followed by hydroxybenzotriazole (HOBt, 10.2 mg, 0.066 mmol), 1- (3-Diethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDCI HCl, 12.6 mg, 0.066 mmol) and 4-dimethylaminopyridine (DMAP, 4.8 mg, 0.039 mmol) were sequentially added and heated to 0 ° C. was stirred for 10 minutes. Then, compound 8 (21.2 mg, 0.079 mmol) was added and stirred at room temperature for 21 hours.
  • DMF dimethylformamide
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • the oxygen-substituted methine hydrogen H-12' ( ⁇ H 5.24) and methyl hydrogen H-13' ( ⁇ H 1.12) are connected to C-6' ( ⁇ C 143.7) and C-7' ( ⁇ C 127.9), respectively. was confirmed through HMBC.
  • the linkage of the two saphenic acids is from H-13 ( ⁇ H 2.00) to C-6 ( ⁇ C 145.8) in the C-ring, C-4' ( ⁇ C 150.9) in the A'-ring, and H in the C-ring.
  • the relative structure of compound 1 could not be determined unambiguously due to insufficient signal in the coupling constants or NOESY data.
  • the theoretically predictable structure of Compound 1 has four possibilities due to the presence of two chirals (C-12 and C-12').
  • C-12 and C-12' were determined using a modified Mosher's method. 1 was reacted with S- or R-MTPA esters 1a and 1b, respectively.
  • the 1 H NMR signals of 1a and 1b were determined through COZY spectrum analysis, and the ⁇ H value was calculated as ⁇ S-ester ⁇ R-ester (FIG. 3). Based on these results, the absolute structure of C-12' was confirmed to be R.
  • Compound 3 was a pale green amorphous solid, and was confirmed to have a molecular formula of C 30 H 20 N 4 O 5 (unsaturation of 23) based on HRESIMS data.
  • the 1D NMR spectrum of compound 3 (Table 2) was similar to compound 1 and compound 2. However, instead of the secondary alcohol present in Compounds 1 and 2, an acetyl group (C-12', ⁇ C 200.3) was present. Accordingly, it was found that the structure of compound 3 is an oxidized form of compound 1 or 2.
  • the specific rotation values of oxidized 1 and compound 3 were compared. After oxidizing compound 1, it was purified using HPLC, and confirmed to be identical to compound 3 through LC-MS and 1 H NMR spectrum. The specific rotation value of oxidized compound 1 ([ ⁇ ] 25 D -10) showed a negative value equal to 3 ([ ⁇ ] 25 D -30). Therefore, the absolute structure of C-12 was determined to be R.
  • the linkage of the two saphenic acids is H-2' ( ⁇ H 9.16) to C-12 ( ⁇ C 39.7), H-12 ( ⁇ H 5.97) to C-3' ( ⁇ C 149.6), C-4' ( ⁇ C 131.7), C-5a ( ⁇ C 142.2), C-6 ( ⁇ C 144.2), and C-7 ( ⁇ C 129.1).
  • compound 5 showed overlapping of two singlet hydrogen signals ⁇ H 7.90 (s, H-7' and H-9').
  • the positions of the two carboxylic acids were determined via HMBC correlations from H-2 ( ⁇ H 8.93) to C-11 ( ⁇ C 165.7) and from H-2′ ( ⁇ H 8.90) to C-11′ ( ⁇ C 165.9). Confirmed.
  • compound 6 was also determined through 1D and 2D NMR data analysis.
  • the oxygen-substituted methine hydrogen ( ⁇ H 7.65, H-12) was shifted to a lower field than that of other compounds 1-5.
  • the linkage between the two saphenic acids is from H-7 ( ⁇ H 8.54) to C-12 ( ⁇ C 70.0) and from H-12 ( ⁇ H 7.65) and H-2' ( ⁇ H 8.33) to the A' ring. It was confirmed that the ester bond was formed through the HMBC link signal to C-11' ( ⁇ C 165.8) of the carboxylic acid.
  • the absolute structure of C-12' was confirmed to be R using a modified Mosher method.
  • NO production to confirm anti-cerebral neuroinflammation activity was evaluated by measuring nitrite concentration in the medium using Griess reagent, and cell viability was evaluated using MTT assay.
  • BV-2 microglia were cultured in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) supplemented with 5% heat-inactivated FBS and 50 ⁇ g/mL of penicillin-streptomycin at 37°C in a 5% CO 2 incubator.
  • Compounds of various concentrations (10, 20, 50, and 100 ⁇ M) were treated for 1 hour in a 96-well plate in which pre-cultured cells (2.5 ⁇ 10 4 cells/mL) were dispensed, and LPS (200 ng/mL) was added.
  • Cytotoxicity to BV-2 microglia was measured using the MTT assay. All compounds were composed of saphenic acid, but showed a great difference in activity intensity according to the connected pattern of the two saphenic acids (FIG. 8 and Table 4). In particular, compound 6 showed the most excellent IC 50 value at a concentration of 0.3 ⁇ M (FIG. 9). This means that the activity of 6 is at least 54 times (8, 16.3 ⁇ M) and up to 552 times (1, 165.6 ⁇ M) more active than other compounds.
  • Compound 1 and Compound 2 are diastereomers of each other, and Compound 3 was an oxidized form of Compound 1, but Compound 3 (34.7 ⁇ M) was 5 times more potent than Compound 1 (165.6 ⁇ M), and Compound 2 (90.2 ⁇ M) was 5 times more potent than Compound 1 (165.6 ⁇ M). It showed about 2 times stronger activity than compound 1 (165.6 ⁇ M) (Table 4). As mentioned above, it was found that differences in unique steric hindrance resulting from the conformation of C-12 (FIG. 5) affect activity. In a cell viability test, compound 6 showed strong cytotoxicity up to a concentration of 1 ⁇ M.
  • compound 6 Since compound 6 showed anti-cerebral neuroinflammation activity differently from other compounds, it was attempted to synthesize compound 6 for further physiological activity experiments.
  • the semi-synthesized 6 was synthesized through an EDCI coupling reaction using saphenic acid (Compound 8), and showed the same 1 H, 13 C and MS spectra as the natural product 6.
  • compound 7 which is a byproduct of an oxidized form of compound 6, was also obtained (FIG. 10).
  • the structure of compound 7 is ( R )-6-(1-((6-acetylphenazine-1-carbonyl)oxy)ethyl)phenazine-1-carboxylic acid (( R )-6-(1- ((6-acetylphenazine-1-carbonyl) oxy)ethyl)phenazine-1-carboxylic acid).
  • the cytotoxicity test was evaluated by sulforhodamine B (SRB) assay for six human cancer cell lines.
  • Human cancer cell lines, ACHN (kidney), NCI-H23 (lung), PC-3 (prostate), NUGC-3 (stomach), MDA-MB-231 (breast), and HCT-15 (colon) were tested by ATCC (American Type Culture Collection).
  • the cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) at 37°C in a 5% CO 2 incubator.
  • FBS fetal bovine serum
  • the tested compounds did not show cytotoxicity, but only compound 6 and compound 7, which is an oxidized form of compound 6, showed 2-19 times stronger cytotoxicity than the positive control adriamycin. In addition, compound 6 showed 4-6 times stronger activity than compound 7.
  • NUGC-3 a gastric cancer cell, showed the strongest activity with a GI 50 value of 7.7 nM, which was 19 times more potent than adriamycin.

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Abstract

본 발명은, 신규 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다. 본 발명에 따른 신규 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 인간 암 세포주에 대한 세포 독성을 나타내어 암 세포의 성장을 억제함으로써, 위 언급된 종류의 암에 대하여 우수한 예방 또는 치료 효과를 가지며, LPS에 의해 유도된 염증실험에서 미세아교세포의 신경염증 저해 활성을 나타냄으로써 위 언급된 종류의 신경염증 질환에 대하여 우수한 예방 또는 치료 효과를 가진다.

Description

신규 다이페나진 화합물 및 이의 암 또는 신경염증질환 예방 또는 치료 용도
본 발명은 신규 다이페나진 화합물 및 이의 용도에 관한 것이다.
해양 곰팡이는 지속적으로 연구되어 오고 있으며, 많은 수의 신규화합물을 생산하는 것으로 알려져 있다. 심해 미생물 유래의 신규 생리활성물질을 찾기 위한 연구를 진행하던 중 본 발명자들은, 인도양 중앙 해령대에서 분리된 흔하지 않은 효모성 곰팡이 시스토바시디움 라린지스(Cystobasidium laryngis) IV17-028을 발견하였다. 선행문헌(Mar. Drugs, 2019, 17, 482)에서, IV17-028 균주에서 새로운 페나진(phenazine) 계열의 유도체 3개를 분리하였고, 이 유도체들이 LPS 자극된 RAW 264.7 세포에서 항염활성을 나타내는 것을 확인하였다. 페나진 계열의 화합물들은 C. laryngis IV17-028 균주에서 분리되기 전까지, 세균(스트렙토마이세스와 슈도모나스)과 일부 고세균에서 생산되는 것으로 알려져 있었다. 산화 환원력(redox activity)을 가진 페나진 골격은 전자 셔틀(electron shuttle), 활성 산소(reactive oxygen species)의 감소, 유전자 발현 조절, 생물막(biofilm) 형성, 쿼럼센싱(quorum sensing) 신호 및 세포내 산화환원 항상성의 유지 등에 관여한다. 따라서, 페나진 계열 화합물들은 앞서 언급한 다양한 역할과 폭 넓은 생리활성 때문에 관심을 받고 있다. 특히, 에스메라딘 A-B, 페나조스타틴 A-D, 이주미페나진 A-B, 페나지오린 A-E 및 다이아스타페나진과 같은 페나진 이량체(dimeric phenazine)는 상대적으로 보고된 바가 적고, 페나조스타틴 D(슈도노카르디아 종에서 보고됨)를 제외한 나머지는 스트렙토마이세스 종에서만 분리된 것으로 보고되어 있다. 보고된 페나진 이량체 중에서, 페나조스타틴 A-C는 뇌 허혈성 손상을 막기 위한 글루타메이트 독성으로부터 뉴런의 하이브리도마 N-18-RE-105 세포를 보호하는 것으로 보고되어 있다.
본 발명자들은, 신규 다이페나진 화합물인 페나조스타틴 E-J의 분리 및 구조를 동정하고, 그중 일부 화합물을 반합성 하였으며, 이들 화합물의 항암효과 및 신경염증에 대한 생리활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
(특허문헌 001) 등록특허공보 KR10-2120907
(비특허문헌 001) Mar. Drugs, 2019, 17, 482.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 신규 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 신규 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 신규한 다이페나진 화합물, 이의 광학 이성질체 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
화학식 1의 화합물
본 발명은 전술한 기술적 과제를 해결하기 위해, 하기 화학식 1의 신규 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000001
상기 화학식 1에서
X는
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000002
,
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000003
또는
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000004
이며,
R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000005
, -OH, -COH, -COOH, -COOCH3 또는 -COCH3이다.
본 발명의 화학식에서 단일 결합을 나타내는 선 대신 기호 "
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000006
"가 사용된 경우, 이는 해당 결합의 입체 배열에 따라 입체 중심의 입체 배열이 결정되지 않았다는 것을 의미한다.
일 예시로, 상기 화학식 1에서 사용된 기호 "
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000007
"는 화학식 1이 하기 화학식 1-1 및 1-2의 구조를 가질 수 있다는 것을 의미한다.
[화학식 1-1]
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000008
[화학식 1-2]
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000009
또한, 본 발명에서 기호 "
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000010
"는 또 다른 기에 대한 치환기의 부착 지점을 나타내므로, 이를 기호 단일 결합을 나타내는 선 대신 사용된 "
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000011
"와 혼동해서는 안된다.
일 예시로서, 본 발명의
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000012
(-CHCH3OH)는
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000013
와
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000014
가 모두 가능함을 의미한다.
일 구현예에서, 상기 X가
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000015
일 때, 상기 화학식 1은 하기 화학식 2와 같은 구조를 갖는다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000016
상기 화학식 2에서 R1은 화학식 1과 동일하게 정의된다.
일 구현예에서, 상기 X가
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000017
일 때, 상기 화학식 1은 하기 화학식 3과 같은 구조를 갖는다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000018
상기 화학식 3에서 R2 및 R3은 화학식 1과 동일하게 정의된다.
일 구현예에서, 상기 X가
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000019
일 때, 상기 화학식 1은 하기 화학식 4와 같은 구조를 갖는다.
[화학식 4]
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000020
상기 화학식 4에서 R4는 화학식 1과 동일하게 정의된다.
본 발명의 구체예에서, 상기 X가
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000021
일 때, R1은
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000022
, -COOH, 또는 -COCH3이나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체예에서, 상기 X가
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000023
일 때, R1은
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000024
, -COOH, 또는 -COCH3이나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체예에서, 상기 X가
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000025
일 때, R1은
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000026
, -COOH, 또는 -COCH3 이나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체예에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다:
4-((R)-1-(6-카르복시페나진-1-일)에틸)-6-((R)-1-히드록시에틸)페나진-1-카르복실산;
4-((S)-1-(6-카르복시페나진-1-일)에틸)-6-((R)-1-히드록시에틸)페나진-1-카르복실산;
(R)-6-아세틸-4-(1-(6-카르복시페나진-1-일)에틸)페나진-1-카르복실산.
3-((S)-1-(6-카르복시페나진-1-일)에틸)-6-((R)-1-히드록시에틸)페나진-1-카르복실산;
8-((R)-1-(6-카르복시페나진-1-일)에틸)-6-((R)-1-히드록시에틸)페나진-1-카르복실산;
6-((R)-1-((6-((R)-1-히드록시에틸)페나진-1-카르보닐)옥시)에틸)페나진-1-카르복실산; 및
(R)-6-(1-((6-아세틸페나진-1-카르보닐)옥시)에틸)페나진-1-카르복실산.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 1개 이상의 비대칭 탄소를 함유할 수 있으며, 이에 따라 라세미체, 라세믹 혼합물, 단일의 에난티오머, 부분입체이성체 혼합물 및 각각의 부분입체이성체로서 존재할 수 있다.
이러한 이성질체는 종래 기술, 예를 들어 화학식 1로 표시된 화합물은 관크로마토그래피 또는 HPLC 등의 분할에 의해 분리가 가능하다. 또는, 화학식 1로 표시되는 화합물 각각의 입체 이성질체는 공지된 배열의 광학적으로 순수한 출발 물질 및/또는 시약을 사용하여 입체 특이적으로 합성할 수 있다.
또한, 본 발명의 구체예에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 표 1의 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000027
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000028
본 발명에서, 약학적으로 허용가능한 염은 의약업계에서 통상적으로 사용되는 염을 의미하며, 예를 들어 칼슘, 포타슘, 소듐 및 마그네슘 등으로 제조된 무기이온염, 염산, 질산, 인산, 브롬산, 요오드산, 과염소산 및 황산 등으로 제조된 무기산염; 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 하이드로 아이오딕산 등으로 제조된 유기산염; 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 및 나프탈렌설폰산 등으로 제조된 설폰산염; 글리신, 아르기닌, 라이신 등으로 제조된 아미노산염; 및 트리메틸아민, 트라이에틸아민, 암모니아, 피리딘, 피콜린 등으로 제조된 아민염 등이 있으나, 열거된 이들 염에 의해 본 발명에서 의미하는 염의 종류가 한정되는 것은 아니다.
화학식 1의 화합물의 제조방법
본 발명은 시스토바시디움 라린지스 IV17-028 (Cystobasidium laryngis IV17-028) KCTC 13720BP 균주 또는 이의 배양물로부터 하기 화학식 1로 표시되는 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 분리하는 단계;를 포함하는 화학식 1의 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 시스토바시디움 라린지스 IV17-028 (Cystobasidium laryngis IV17-028) KCTC 13720BP 균주의 배양물은 균주를 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양하여 얻을 수 있다. 상기 배지는 탄소원으로서 비제한적인 예로 글루코오스, 물엿, 덱스트린, 전분, 당밀, 동물유 또는 식물유를 포함할 수 있다. 또한, 상기 배지는 질소원으로서 비제한적인 예로 밀기울, 대두박, 소맥, 맥아, 면실박, 어박, 콘스팁리커, 육즙, 효모 추출물, 황산암모늄, 질산소다 또는 요소를 포함할 수 있다. 또한, 상기 배지는 필요에 따라 식염, 칼륨, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산 또는 기타 이온 생성을 촉진하는 무기염류를 포함할 수 있다. 배양은 진탕 또는 정치하면서 배양하는 것일 수 있고, 배양 온도는 약 20℃ 내지 약 37℃일 수 있고, 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 30℃일 수 있다.
화학식 1의 화합물은 상기 균주 또는 이의 배양물을 용매 추출, 농축, 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 얻을 수 있다. 상기 농축은 균주 또는 이의 배양물에 용매를 가하여 추출액을 감압 증발시켜 농축하는 것일 수 있다. 상기 용매는 에틸아세테이트, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드, 탄소 수 1 내지 4개의 저급 알코올을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 에틸아세테이트, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드 및 메탄올을 사용할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 정지상의 형태에 따라 컬럼 크로마토그래피, 평판 크로마토그래피, 종이 크로마토그래피 또는 얇은 막 크로마토그래피일 수 있다. 또는 이동상의 물리적 특성에 따라 HPLC (고성능 액체 크로마토그래피), 가스 크로마토그래피일 수 있다.
본 발명의 구체예에 따르면, 균주 또는 이의 배양물의 에틸아세테이트 추출물을 이용하여 실리카 플래시 컬럼 크로마토그래피로 분획한 후 메탄올 및 물의 혼합 용매를 이용하여 HPLC로 정제하여 화학식 1의 화합물을 얻을 수 있다.
따라서 본 발명은 (a) 시스토바시디움 라린지스 IV17-028 (Cystobasidium laryngis IV17-028) KCTC 13720BP 균주를 배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 배양액을 에틸아세테이트로 추출하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 추출물을 클로로포름으로 추출하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 클로로포름 추출물을 CH2Cl2/MeOH로 단계적으로 용출시키는 단계로서
상기 단계적 용출은 CH2Cl2와 MeOH의 v/v비가 10:0, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1인 용매로 용출하는 것인 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 용출된 결과물을 MeOH/H2O로 단계적으로 용출시키는 단계로서
상기 단계적 용출은 MeOH와 H2O의 v/v비가 1:4, 2:3, 3:2, 4:1, 5:0인 용매로 용출하는 것인 단계; 및
(f) 용출된 분획을 80% 메탄올로 용출시키고 분리된 화학식 1의 화합물을 정제하는 단계를 포함하는, 화학식 1의 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 제조 방법을 제공한다.
화학식 1의 화합물의 용도
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000029
상기 화학식 1에서
X는
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000030
,
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000031
또는
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000032
이며,
R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000033
, -OH, -COH, -COOH, -COOCH3 또는 -COCH3이다.
본 발명은 상기 화학식 1의 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 화학식 1의 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 암의 비제한적인 예는 가성점액종, 간내 담도암, 간모세포종, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 구순암, 균상식육종, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 기저세포암, 난소암, 난소상피암, 난소생식세포암, 남성유방암, 뇌암, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 만성림프구백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 미만성거대B세포림프종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비부비동암, 비소세포폐암, 비호지킨림프종, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아뇌암, 소아림프종, 소아백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신경모세포종, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 악성 연부조직　암, 악성골암, 악성림프종, 악성중피종, 악성흑색종, 안암, 외음부암, 요관암, 요도암, 원발부위불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관암, 윌름스암, 유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성 골암, 전이성뇌암, 종격동암, 중피종, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 카포시 육종, 파제트병, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 횡문근육종, 후두암, 흉막암, 또는 흉선암 등을 들 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 1의 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 신경염증 질환의 비제한적인 예는 뇌염증 질환, 다발성 경화증, 우울증, 뇌졸중, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 루게릭 병, 헌팅턴 병, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 정신분열증 및 근위축성측색경화등을 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 화학식 1의 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1 종 이상 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 패치제, 액제, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 좌제 등일 수 있다. 이들 제제는 당 분야에서 제제화에 사용되는 통상의 방법 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법으로 제조될 수 있으며 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 다양한 제제로 제제화 될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환 종류 및 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 화학식 1의 화합물의 일일 투여량은 약 0.01 내지 1000 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 화학식 1의 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 외에 동일 또는 유사한 약효를 나타내는 유효성분을 1 종 이상 더 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 1의 상기 화학식 1의 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 치료학적으로 유효한 양을 인간을 포함하는 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 화학식 1의 상기 화학식 1의 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 치료학적으로 유효한 양을 인간을 포함하는 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 신경염증 질환 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 치료학적으로 유효한 양이라는 용어는 암 또는 신경염증 질환의 예방 또는 치료에 유효한 상기 화학식 1의 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 양을 나타낸다.
본 발명의 치료방법은 상기 화학식 1의 화합물을 투여함으로써, 징후의 발현 전에 질병 그 자체를 다룰 뿐만 아니라, 이의 징후를 저해하거나 피하는 것을 또한 포함한다. 질환의 관리에 있어서, 특정 활성 성분의 예방적 또는 치료학적 용량은 질병 또는 상태의 본성(nature)과 심각도, 그리고 활성 성분이 투여되는 경로에 따라 다양할 것이다. 용량 및 용량의 빈도는 개별 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 다양할 것이다. 적합한 용량 용법은 이러한 인자를 당연히 고려하는 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 쉽게 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 치료방법은 상기 화학식 1의 화합물과 함께 질환 치료에 도움이 되는 추가적인 활성 제제의 치료학적으로 유효한 양의 투여를 더 포함할 수 있으며, 추가적인 활성제제는 상기 화학식 1의 화합물과 함께 시너지 효과 또는 보조적 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 1의 다이페나진 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 화학식 1의 다이페나진 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경염증 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안정청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
본 발명의 식품 조성물은 암 및/또는 신경염증 질환의 예방 및/또는 개선을 목적으로, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화학식 1의 화합물을 0.01 내지 95 %, 바람직하게는 1 내지 80 % 중량백분율로 포함할 수 있다. 또한, 암 관련 질환 및/또는 신경염증 질환의 예방 및/또는 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환, 음료 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
또한, 본 발명은 암 및/또는 신경염증 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 상기 화학식 1의 다이페나진 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공하고자 한다. 약제의 제조를 위한 상기 화학식 1의 화합물은 허용되는 보조제, 희석제, 담체 등을 혼합할 수 있으며, 기타 활성제제와 함께 복합 제제로 제조되어 활성 성분들의 상승 작용을 가질 수 있다.
본 발명의 조성물, 용도, 치료방법에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.
본 발명은 상기 화학식 1의 다이페나진 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 관련 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다. 이 때 상기 암 관련 질환이라 함은 이에 특별히 한정되는 것은 아니나, 가성점액종, 간내 담도암, 간모세포종, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 구순암, 균상식육종, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 기저세포암, 난소암, 난소상피암, 난소생식세포암, 뇌암, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 만성림프구백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 미만성거대B세포림프종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비부비동암, 비소세포폐암, 비호지킨림프종, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아뇌암, 소아림프종, 소아백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신경모세포종, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 악성 연부조직　암, 악성골암, 악성림프종, 악성중피종, 악성흑색종, 안암, 외음부암, 요관암, 요도암, 원발부위불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관암, 윌름스암, 유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성 골암, 전이성뇌암, 종격동암, 중피종, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 카포시 육종, 파제트병, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 횡문근육종, 후두암, 흉막암, 및 흉선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 신규 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 선택적으로 우수하게 암세포주에 세포독성을 나타냄으로써 위 언급된 종류의 암에 대하여 우수한 예방 또는 치료 효과를 가지며, LPS-유도된 미세아교세포에서의 신경염증 질환 저해 활성을 나타냄으로써 위 언급된 종류의 신경염증 질환에 대하여 우수한 예방 또는 치료 효과를 가진다.
도 1은 화합물 1 내지 6, 화합물 8 및 화합물 9를 분획하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 화합물 1 내지 6의 1H-1H COSY 및 HMBC 상관관계의 핵심을 나타낸 것이다.
도 3은 화합물 1, 2, 4, 5 및 6의 MTPA 에스테르의 △δH 값을 (δS-ester-δR-ester) ppm으로 나타낸 것이다.
도 4는 화합물 1 및 2에 대한 실험 및 계산 ECD 스펙트라를 나타낸 것이다.
도 5는 화합물 1 및 화합물 2의 입체 구조를 나타낸 것이다.
도 6은 화합물 4에 대한 실험 및 계산 ECD 스펙트라를 나타낸 것이다.
도 7은 화합물 5에 대한 실험 및 계산 ECD 스펙트라를 나타낸 것이다.
도 8의 A는 화합물 1 내지 6, 8 및 9의 LPS에 의해 유도된 BV-2 미세아교세포 내의 NO 생성에 대한 효과를 나타낸 것이고, 도 8의 B는 화합물 1 내지 6, 8 및 9의 세포생존률을 나타낸 것이다.
도 9의 A는 화합물 6의 LPS에 의해 유도된 BV-2 미세아교세포 내의 NO 생성에 대한 효과를 나타낸 것이고, 도 9의 B는 화합물 6의 처리에 의한 미세아교세포의 세포생존률을 나타낸 것이다.
도 10은 화합물 6의 반합성과정과 그로부터 화합물 7이 생성되는 반응식을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명 화합물 1 내지 9의 화학구조를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상위한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1.다이페나진 화합물의 생산
실험 장치
비선광도는 Rudolph analytical사의 Autopol Ⅲ S2 편광계를 사용하여 측정하였다. CD 스펙트럼 측정은 대한민국 창원에 있는 창원대학교 공동실험관에 있는 JASCO사의 J-1500 편광계를 이용하였다. UV 스펙트럼은 Shimadzu 사의 UV-1650PC 분광광도계를 통해 얻었고, IR 스펙트럼은 JASCO 사의 FT/IR-4100 분광광도계를 이용하여 얻었다. NMR 스펙트럼은 Bruker사의 AVANCE Ⅲ 600 분광기로 1H은 600 MHz, 13C은 150 Hz에서 측정하였고, 3 mm 프로브를 사용하여 얻었다. 화학적 이동 값은 CDCl3의 용매피크(δH 7.24, δC 77.23)를 기준으로 하였다. EIMS 데이터는 Agilent사의 6100 단일 사중극자 질량분석기를 사용하여 얻었고, HRESIMS 데이터는 대한민국 청주에 있는 한국기초과학지원연구원 (KBSI)의 Waters사의 SYNPT G2 Q-TOF 질량분석기를 통하여 얻었다. PrimeLine사의 바이너리 펌프와 Shodex사의 RI-101 굴절률 검출기와 S3210 가변형 UV 검출기로 구성된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하였다. HPLC용 칼럼은 YMC-pack Silica(250 mm × 10 mm, 5 μm), YMC-Triart C18(250 mm × 10 mm, 5 μm 와 250 mm × 4.6 mm, 5 μm)를 사용하였다. 개방형 칼럼 크로마토그래피 용 충진제는 Silica gel 60(Merck, 230-400 mesh)과 역상형 실리카젤(YMC-Gel ODS-A, 12 nm, S-75 μm)을 사용하였다. 대량배양은 퍼멘텍 사의 100 L 발효기를 이용하여 진행하였다. 모든 용매는 HPLC 등급 또는 증류된 용매를 사용하였다.
IV17-028 균주의 분리 및 대량 배양
시스토바시디움 라린지스 IV17-028 (Cystobasidium laryngis IV17-028) (GenBank 수탁번호: MK131277)는 인도양 수심 4,317 m에서 채집된 심해 퇴적토에서 분리하였다.
시스토바시디움 라린지스 IV17-028 (Cystobasidium laryngis IV17-028) 균주를 Bennett (BN) 한천 배지에서 28℃에서 7일 동안 배양하였고, 이후 균주를 600 mL의 BN 액체 배지 (증류수 1L 중에 글루코오스 10g, 효모 추출물 1g, 트립톤 2g, 쇠고기 추출물 1g, 글리세롤 5g 및 해수염 32g 포함)가 들어 있는 2 L 플라스크에 접종하여 140rpm으로 교반하면서 28℃에서 5일 동안 종균 배양하였다. 종균 배양액을 60 L BN 액체 배지가 든 100 L 발효기에 접종하였고, 28℃, 50 rpm, 20 LPM의 조건으로 10일간 대량배양을 진행하였다.
상기 시스토바시디움 라린지스 IV17-028 (Cystobasidium laryngis IV17-028) 균주를 2018년 11월 20일에 기탁하여 기탁번호 KCTC 13720BP를 부여받았다.
화합물의 분리
60 L 대량배양액을 동량의 에틸아세테이트(EtOAc)로 2번, 총 120 L를 추출하였다. EtOAc 추출물은 농축하여 조추출물 약 46 g을 수득하였다. 이 중, 조추출물 33.7 g을 물 1 L와 n-헥산(n-hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트 (EtOAc), n-부탄올(n-BuOH) 등과 순차적으로 분획하여, 각각 5.8, 14.5, 1.1, 0.9 g을 얻었다. 클로로포름 농축물 5.8 g을 실리카 플래시 컬럼 크로마토그래피를 메틸렌 클로라이드(CH2Cl2):메탄올(MeOH) (v/v, 10:0, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1)의 비율로 혼합한 유기용매를 단계적으로 용출하였다. CH2Cl2/MeOH (20:1) 분획물을 총 9개로 나누어 받았다. 이 중, 6-7번 소분획물 4.8 을 역상 플래시 컬럼 크로마토그래피를 메탄올:물 (v/v, 1:4, 2:3, 3:2, 4:1, 5:0)의 비율로 혼합한 유기용매를 단계적으로 용출하였고, 각각의 분획물을 3개씩 나누었다. 3번째 80% 메탄올 분획물 468.5 mg을 순상 HPLC (YMC-Pack SIL 250 mm × 10 mm, 5 μm; EtOAc/Hex/MeOH (v/v, 45:55:0.02); 유속: 2.0 mL/min; 검출기: RI)하여 6개의 화합물 (1: 15.6 mg, tR 34 min, 2: 1.9 mg, tR 39 min, 3: 3.0 mg, tR 40 min, 4: 4.0 mg, tR 37 min, 5: 1.9 mg, tR 29 min, 6: 1.8 mg, tR 23 min)을 분리정제 하였다. (도 1)
1. 4-(( R )-1-(6-카르복시페나진-1-일)에틸)-6-(( R )-1-히드록시에틸)페나진-1-카르복실산 [4-(( R )-1-(6-carboxyphenazin-1-yl)ethyl)-6-(( R )-1-hydroxyethyl)phenazine-1-carboxylic acid] (페나조스타틴 E)
연녹색의 무정형; [α]25 D-167 (c 0.1, CHCl3); UV (CHCl3) λmax (log ε) 371 (1.45), 253 (2.06) nm; IR (CHCl3) γmax 3360, 2922, 1728, 1456, 1219, 770 cm-1; 1H 및 13C NMR 데이터, 표 2; HRESIMS m/z 541.1487 [M + Na]+ (calcd for C30H22N4O5Na, 541.1488).
2. 4-(( S )-1-(6-카르복시페나진-1-일)에틸)-6-(( R )-1-히드록시에틸)페나진-1-카르복실산 [4-(( S )-1-(6-carboxyphenazin-1-yl)ethyl)-6-(( R )-1-hydroxyethyl)phenazine-1-carboxylic acid] (페나조스타틴 F)
연녹색의 무정형; [α]25 D+88 (c 0.1, CHCl3); UV (CHCl3) λmax (log ε) 371 (1.14), 253 (1.74) nm; IR (CHCl3) γmax 3728, 3629, 3360, 2922, 1727, 1452, 1218, 770 cm-1; 1H 및 13C NMR 데이터, 표 2; HRESIMS m/z 541.1489 [M + Na]+ (calcd for C30H22N4O5Na, 541.1488).
3. ( R )-6-아세틸-4-(1-(6-카르복시페나진-1-일)에틸)페나진-1-카르복실산 [( R )-6-acetyl-4-(1-(6-carboxyphenazin-1-yl)ethyl)phenazine-1-carboxylic acid] (페나조스타틴 G)
연녹색의 무정형; [α]25 D-33 (c 0.1, CHCl3); UV (CHCl3) λmax (log ε) 372 (1.62), 255 (2.21) nm; IR (CHCl3) γmax 2925, 2855, 2703, 1732, 1459, 1261, 760 cm-1; 1H 및 13C NMR 데이터, 표 2; HRESIMS m/z 539.1331 [M + Na]+ (calcd for C30H20N4O5Na, 539.1331).
4. 3-(( S )-1-(6-카르복시페나진-1-일)에틸)-6-(( R )-1-히드록시에틸)페나진-1-카르복실산 [3-(( S )-1-(6-carboxyphenazin-1-yl)ethyl)-6-(( R )-1-hydroxyethyl)phenazine-1-carboxylic acid] (페나조스타틴 H)
연녹색의 무정형; [α]25 D-137 (c 0.1, CHCl3); UV (CHCl3) λmax (log ε) 372 (1.61), 259 (2.19) nm; IR (CHCl3) γmax 3452, 2957, 2689, 1721, 1617, 1459, 1261, 773 cm-1; 1H 및 13C NMR 데이터, 표 3; HRESIMS m/z 541.1486 [M + Na]+ (calcd for C30H22N4O5Na, 541.1488).
5. 8-(( R )-1-(6-카르복시페나진-1-일)에틸)-6-(( R )-1-히드록시에틸)페나진-1-카르복실산 [8-(( R )-1-(6-carboxyphenazin-1-yl)ethyl)-6-(( R )-1-hydroxyethyl)phenazine-1-carboxylic acid] (페나조스타틴 I)
연녹색의 무정형; [α]25 D-33 (c 0.1, CHCl3); UV (CHCl3) λmax (log ε) 371 (0.52), 253 (1.07) nm; IR (CHCl3) γmax 3356, 3190, 2922, 2855, 1657, 1458, 1218, 770 cm-1; 1H 및 13C NMR 데이터, 표 3; HRESIMS m/z 541.1487 [M + Na]+ (calcd for C30H22N4O5Na, 541.1488).
6. 6-(( R )-1-((6-(( R )-1-히드록시에틸)페나진-1-카르보닐)옥시)에틸)페나진-1-카르복실산 [6-(( R )-1-((6-(( R )-1-hydroxyethyl)phenazine-1-carbonyl)oxy)ethyl)phenazine-1-carboxylic acid] (페나조스타틴 J)
연녹색의 무정형; [α]25 D-27 (c 0.1, CHCl3); UV (CHCl3) λmax (log ε) 371 (1.53), 253 (2.14) nm; IR (CHCl3) γmax 3353, 2925, 2855, 1731, 1462, 1261, 773 cm-1; 1H 및 13C NMR data, 표 4; HRESIMS m/z 541.1491 [M + Na]+ (calcd for C30H22N4O5Na, 541.1488).
화합물 1 내지 3의 CDCl3 내 1H NMR (600MHz) 및 13C NMR (150MHz) 결과는 아래 표 2에 나타내었으며, 화합물 4 내지 6의 CDCl3 내 1H NMR (600MHz) 및 13C NMR (150MHz) 결과는 아래 표 3에 나타내었다.
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000034
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000035
화합물 1,2,4-6의 MTPA 에스터화
화합물 1,2,4-6의 절대구조를 확인하기 위해 변형된 모셔의 방법을 이요하기 위해 화합물 1,2,4-6을 MTPA 에스터화 시켰다.
화합물 1(0.2 mg 씩, 0.4 μmol)을 두개의 350 μL 튜브에 넣은 뒤, N2 가스로 건조시켰다. 소량의 4-다이메틸아미노피리딘 (DMAP)과 교반 자석을 넣은 뒤, 16시간 동안 진공건조 시켰다. 무수 피리딘(pyridine) 80 μL 넣은 뒤, 상온에서 5분간 교반 하였다. 그리고나서, S- 또는 R-MTPA-Cl 를 3 μL씩 각각의 튜브에 첨가한 뒤, 상온에서 16시간 동안 교반 하였다. 반응물은 40 ℃, N2 가스로 농축하였다. 반응물을 MC에 녹인 뒤, 1N 염화수소 (HCl), 포화 탄산수소나트륨 (NaHCO3) 용액과, 소금물 (Brine)로 씻어내었다. 유기층은 무수 황산마그네슘 (MgSO4)으로 수분을 제거한 뒤, 필터하여 감압 농축하였다. 나머지 화합물 2, 4-6도 동일한 방법으로 S- 또는 R-MTPA 에스터화 하였다. MTPA 에스터화된 화합물들의 입체중심 주변의 화학적 이동값은 1H와 COSY 스펙트럼 분석을 통하여 확인하였다. (도 3)
화합물 1의 S-MTPA 에스터(1a): 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 9.0586(d, J = 7.5 Hz, H-2'), 8.2041(d, J = 7.5 Hz, H-3'), 8.1139(d, J = 8.7, H-9'), 7.7693(t, J = 8.7 Hz, H-8'), 6.1745(q, J = 6.8 Hz, H-12'), 1.4882(d, J = 6.6 Hz, H-13'); EIMS m/z [M-H]- 733.0.
화합물 1의 R-MPTA 에스터(1b): 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 9.0679(d, J = 7.2 Hz, H-2'), 8.2268(d, J = 7.2 Hz, H-3'), 8.1503(d, J = 8.5, H-9'), 7.8398(t, J = 8.5, H-8'), 7.6749(d, J = 6.54 Hz, H-7'), 6.2077(q, J = 6.3 Hz, H-12'), 1.4642(d, J = 6.3 Hz, H-13'); EIMS m/z [M-H]- 733.0.
화합물 2의 S-MTPA 에스터 (2a): 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 9.0661(d, J = 7.4 Hz, H-2'), 8.2226(d, J = 7.4 Hz, H-3'), 8.1107(d, J = 9.0 Hz, H-9'), 7.7821 (dd, J = 9.0, 7.0 Hz, H-8'), 7.4820(d, J = 7.0 Hz, H-7'), 6.7208(q, J = 6.4 Hz, H-12'), 0.2577(d, J = 6.4 Hz, H-13'); EIMS m/z [M-H]- 733.2.
화합물 2의 R-MPTA 에스터 (2b): 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 9.0702(d, J = 7.4 Hz, H-2'), 8.2310(d, J = 7.4 Hz, H-3'), 8.1468(dd, J = 8.8 Hz, H-9'), 7.8482 (dd, J = 8.8, 6.9 Hz, H-8'), 7.6516(d, J = 6.9 Hz, H-7'), 6.7446(q, J = 6.8 Hz, H-12'), 0.2452(d, J = 6.8 Hz, H-13'); EIMS m/z [M-H]- 732.8.
화합물 4의 S-MTPA 에스터 (4a): 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 9.1782(s, H-2'), 8.4088(s, H-4'), 8.2189(d, J = 8.7 Hz, H-9'), 8.0346(t, J = 8.7 Hz, H-8'), 7.6273(d, J = 7.26 Hz, H-7'), 7.4198(m, H-12'), 1.7915(d, J = 6.6 Hz, H-13'); EIMS m/z [M-H]- 733.1.
화합물 4의 R-MPTA 에스터 (4b): 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 9.1890(s, H-2'), 8.4171(s, H-4'), 8.2166(d, J = 8.2 Hz, H-9'), 8.0350(t, J = 7.0 Hz, H-8'), 7.8905(d, J = 7.0 Hz, H-7'), 7.4577(m, H-12'), 1.7543(d, J = 6.4 Hz, H-13'); EIMS m/z [M-H]- 733.2.
화합물 5의 S-MTPA 에스터 (5a): 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.9125(d, J = 6.5 Hz, H-2'), 8.5408(d, J = 8.2 Hz, H-4'), 8.0195(t, J = 8.2 Hz, H-3'), 7.8040 (s, H-7'), 7.7920(s, H-9'), 7.4318(overlapped, H-12'), 1.8636(d, J = 6.4 Hz, H-13'); EIMS m/z [M-H]- 733.0.
화합물 5의 R-MPTA 에스터 (5b): 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.9219(d, J = 6.2 Hz, H-2'), 8.5464(d, J = 8.5 Hz, H-4'), 8.0275(t, J = 8.5 Hz, H-3'), 7.8971 (s, H-7'), 7.8844(s, H-9'), 7.4356(overlapped, H-12'), 1.8202(d, J = 6.5 Hz, H-13'); EIMS m/z [M-H]- 733.1.
화합물 6의 S-MTPA 에스터 (6a): 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.4381(dd, J = 7.6, 1.6 Hz, H-4'), 8.3300(dd, J = 6.9, 1.6 Hz, H-2'), 8.1671(d, J = 8.8 Hz, H-9'), 7.8912(t, J = 6.9 Hz, H-3'), 7.7465(t, J = 8.8 Hz, H-10'), 7.6186 (d, J = 7.1 Hz, H-7'), 7.4842(overlapped, H-12'), 1.8529(d, J = 6.1 Hz, H-13'); EIMS m/z [M-H]- 732.9.
화합물 6의 R-MPTA 에스터 (6b): 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.4432(d, J = 8.3 Hz, H-4'), 8.3404(d, J = 6.7 Hz, H-2'), 8.1975(d, J = 6.9 Hz, H-9'), 7.8990 (t, J = 8.3 Hz, H-3'), 7.8451(t, J = 6.9 Hz, H-10'), 7.8712(d, J = 8.4 Hz, H-7'), 7.5073(overlapped, H-12'), 1.8137(d, J = 6.4 Hz, H-13'); EIMS m/z [M-H]- 733.2.
화합물 1의 산화를 통한 화합물 3의 확인
화합물 3의 절대구조는 화합물 1을 산화시켜 화합물 3을 제조함으로써 확인하였다.
화합물 1(1.5 mg, 2.89 μmol)을 2 mL 갈색 바이알에 넣고, N2 가스로 건조하였다. Dess-Martin periodinane(7.4 mg, 17.36 μmol)을 1이 든 바이알에 넣은 뒤, 16시간 진공건조 시켰다. 무수 MC(800 μL)를 넣은 뒤, 상온에서 18시간 동안 교반 하였다. 반응물을 MC로 희석한 뒤, 1:1 10% 싸이티오황산 나트륨(Na2S2O3)/포화 탄산수소나트륨(NaHCO3)과 소금물(Brine)로 씻었다. MC 층은 무수 황산 마그네슘(MgSO4)로 수분을 제거한 뒤, 필터하여 감압 농축하여 3이 포함된 혼합물 0.8 mg을 얻었다. 혼합물을 순상 HPLC(YMC-Pack SIL, 250 mm × 4.6 mm, 5 μm; EtOAc/Hex/MeOH(v/v, 50:50:0.02); 유속: 0.7 mL/min; 검출기: UV; 파장: 254 nm)를 이용하여 3(0.3 mg, t R 19 min)을 얻었다.
산화된 화합물 1 (화합물 3): [α]25 D-10 (c 0.1, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 8.93(d, J = 7.5 Hz, H-2와 H-2'), 8.41(d, J = 8.3 Hz, H-9'), 8.17(d, J = 6.1 Hz, H-7'), 8.16 (d, J = 7.3 Hz, H-9), 8.15(d, J = 8.0 Hz, H-4), 8.03(t, J = 8.3 Hz, H-8'), 7.92(d, J = 7.5 Hz, H-3'), 7.91(t, J = 8.0 Hz, H-3), 7.89(t, J = 8.6 Hz, H-8), 7.71(d, J = 8.6 Hz, H-7), 7.04(q, J = 7.1 Hz, H-12), 2.67(s, H-13'), 2.02(d, J = 7.1 Hz, H-13); EIMS m/z [M-H]- 515.2.
화합물 6의 가수분해
화합물 6의 C-12의 절대구조를 확인하고자 (R)-사페닉산과 비선광도 값을 비교하기 위해 화합물 6을 6N 염화수소(HCl)로 가수분해하였다.
화합물 6(0.2 mg, 0.4 μmol)이 든 4 mL 갈색 바이알에, 6N 염화수소(HCl) 200 μL을 넣고 80 ℃에서 30분 동안 교반하였다. 반응이 종료됨은 LC-MS를 통해 확인하였고, 6의 가수분해물은 40 ℃, N2 가스로 농축하였다.
화합물 6의 가수분해물: [α]25 D-10 (c 0.1, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 8.98 (d, J = 6.8 Hz, H-2), 8.52(d, J = 8.5 Hz, H-4), 8.19(d, J = 8.6 Hz, H-7), 8.05(d, J = 8.5 Hz, H-3), 7.98(t, J = 8.6 Hz, H-8), 7.94(d, J = 6.9 Hz, H-9), 5.83(q, J = 6.6 Hz, H-12), 1.80(d, J = 6.6 Hz, H-13); EIMS m/z [M + H]+ 269.1.
화합물 6의 반합성 과정 및 화합물 7의 합성
화합물 8로서 (R)-사페닉산 (17.8 mg, 0.066 mmol)을 무수 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF) 1 mL에 녹인 뒤, 하이드록시벤조트리아졸(HOBt, 10.2 mg, 0.066 mmol), 1-(3-다이에틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 염산염(EDCI·HCl, 12.6 mg, 0.066 mmol)과 4-다이메틸아미노피리딘(DMAP, 4.8 mg, 0.039 mmol)을 순차적으로 넣고, 0 ℃에서 10분간 교반 하였다. 그리고 나서 화합물 8(21.2 mg, 0.079 mmol)을 넣고, 상온에서 21시간 동안 교반 하였다. 반응물을 감압 농축한 뒤, 에틸 아세테이트(EtOAc)에 다시 녹인 뒤, 소금물(Brine)로 세번 씻었다. 에틸 아세테이트 층은 무수 황산 마그네슘(MgSO4)으로 수분을 제거한 뒤, 감압 농축하였다. 농축된 혼합물을 순상 HPLC(YMC-pack SIL; 250 × 10 mm; 5 μm; EtOAc:Hex:MeOH (v/v, 50:50:0.1); 유속: 2.5 mL/min; 검출기: RI)로 합성된 화합물 6 (6.9 mg, t R 22.5 min, 수득율: 19.4%)과 부산물인 화합물 7이 포함된 혼합물을 얻었다. 화합물 7이 포함된 혼합물은 순상 HPLC(YMC-pack SIL; 250 Х 10 mm; 5 μm; EtOAc:Hex:MeOH (v/v, 40:60:0.1); 유속: 2.5 mL/min, 검출기: RI)를 이용하여 화합물 7 (0.4 mg, t R 30 min)을 분리정제 하였다. (도 10)
반합성된 화합물 6: [α]25 D-120 (c 0.1, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 8.96(d, J = 7.0 Hz, H-2), 8.60(d, J = 8.6 Hz, H-4), 8.53(d, J = 7.0 Hz, H-7) , 8.37(d, J = 8.7 Hz, H-4'), 8.32(d, J = 6.8 Hz, H-2'), 8.22(d, J = 8.7 Hz, H-9), 8.14(d, J = 8.5 Hz, H-9'), 8.04(overlapped, H-3 and, H-8), 7.89(t, J = 7.7 Hz, H-3'), 7.83(t, J = 7.0 Hz, H-8'), 7.79(d, J = 6.2 Hz, H-7'), 7.64(q, J = 6.8 Hz, H-12), 5.72(m, H-12'), 4.81(d, J = 5.3 Hz, OH), 1.97(d, J = 6.5 Hz, H-13), 1.79(d, J = 6.6 Hz, H-13'); EIMS m/z [M + H]+ 541.2.
부산물인 화합물 7: [α]25 D-123 (c 0.1, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 9.00(dd, J = 7.1, 1.5 Hz, 1H), 8.62(dd, J = 8.6, 1.4 Hz, 1H), 8.49(m, 1H), 8.43(dd, J = 8.7, 1.4 Hz, 1H), 8.39(dd, J = 8.6, 1.4 Hz, 1H), 8.36(dd, J = 6.8, 1.4 Hz, 1H), 8.25(dd, J = 8.7, 1.3Hz, 1H), 8.22(dd, J = 6.8, 1.4 Hz, 1H). 8.06(t, J = 7.0 Hz, 1H), 8.05(t, J = 7.0 Hz, 1H), 7.93(d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.92(d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.66(q, J = 6.7 Hz, 1H), 3.08(s, 3H), 1.99(d, J = 6.5 Hz, 3H); EIMS m/z [M + H]+ 539.1.
구조결정을 위한 전산 분석
초기 기하학 최적화(initial geometry)와 구조 검색(conformational search)은 Conflex 8(Rev. B, Conflex Corp., 도쿄, 일본) 프로그램을 사용하여 얻었다. ECD를 위한 최적화와 계산은 Gaussian 16(Rev. B.01, Gaussian Corp., 코네티컷, 미국) 프로그램을 사용하여 수행하였다. 구조 검색(conformational search)은 MMFF94s force field를 사용하여 계산하였고, 검색범위는 10 Kcal/mol로 제한하였다. 화합물 1-2와 화합물 4-5는 ground state method에서 Hatree-Fock/6-31+G(d,p), 가스 상으로 최적화 하였다. ECD 스펙트럼의 이론적 계산은 TD-SCF method에서 Hartree-FoCK/6-31+G(d,p), gas phase로 계산하였다. ECD 스펙트럼은 SpecDis(v. 1.71) 프로그램으로 σ = 0.30 - 0.50 eV의 값으로 시뮬레이션 되었다. 모든 계산된 곡선들은 실험 스펙트럼과 맞추기 위하여, +20 - 60 nm 정도 조절하였다.
화합물 1 내지 6의 입체구조 결정
화합물 1은 연녹색의 무정형 고체로 분리되었다. 화합물 1의 분자식은 HR-ESIMS에서 C30H22N4O5의 [M + Na]+ 피크에 해당하는 m/z 541.1487 (calcd for 541.1488)를 확인하였다. 화합물 1은 22의 불포화도를 가졌다. 화합물 1의 1H (표 2)과 HSQC 스펙트럼은 11개의 방향족의 수소 신호[δ H 8.95 (d, J = 7.4 Hz, H-2'), 8.93 (dd, J = 7.1, 1.4 Hz, H-2), 8.33 (dd, J = 8.7, 1.4 Hz, H-4), 8.15 (dd, J = 9.0, 1.4 Hz, H-9'), 8.13 (dd, J = 8.7, 0.7 Hz, H-9), 8.02 (d, J = 7.4 Hz, H-3'), 7.95 (dd, J = 8.7, 7.1 Hz, H-3), 7.91 (dd, J = 9.0, 6.8 Hz, H-8'), 7.86 (dd, J = 8.7, 7.0 Hz, H-8), 7.77 (d, J = 6.8 Hz, H-7') and 7.67 (d, J = 7.0 Hz, H-7)], 하나의 메틴 신호[δH 7.07 (q, J = 7.0 Hz, H-12)], 하나의 산소와 치환된 메틴 신호[δH 5.24 (q, J = 6.8 Hz, H-12')], 2개의 메틸 신호[δH 2.00 (d, J = 7.0 Hz, H-13) 와 1.12 (d, J = 6.8 Hz, H-13')]를 확인하였다. 13C(표1)과 HSQC 스펙트럼에서 2개의 카보닐 탄소 [δC 166.1 (C-11')과 166.0 (C-11)], 13개의 3차 탄소 [δ C 150.9 (C-4'), 145.8 (C-6), 143.7 (C-6'), 142.9 (C-4a), 142.3 (C-5a), 141.3 (C-5a'), 140.5 (C-9a), 140.4 (C-9a'), 140.2 (C-10a, C-4a'), 140.0 (C-10a'), 125.0 (C-1) 및 123.6 (C-1')], 11개의 방향족 탄소 [δC 137.7 (C-2), 137.5 (C-2'), 135.6 (C-4), 133.4 (C-8'), 133.2 (C-8), 130.5 (C-3), 128.8 (C-7), 128.6 (C-3'), 127.9 (C-7'), 127.2 (C-9') 및 126.9 (C-9)], 2개의 메틴 [δC 67.8 (C-12')과 34.1 (C-12)] 그리고 2개의 메틸 [δC 22.9 (C-13')와 21.4 (C-13)] 신호를 확인하였다. 특징적인 UV 스펙트럼(λ max 253과 371 nm), 1H과 13C NMR 데이터 [δH 8.95 - 7.7 ppm 대의 벗겨진 방향족 수소 신호, 8개의 질소를 포함하는 4차탄소 신호(δC 142.9, 142.3, 141.3, 140.5, 140.4, 140.2×2, 140.0), 2개의 카복실산(δC 166.1과 166.0), 2개의 메틴(δC 67.8과 34.1), 2개의 메틸기(δC 22.9와 21.4)]는 페나진 링을 포함하는 1,6-이중치환된 사페닉산과 매우 유사하였고, 화합물 1이 사페닉산의 이량체임을 확인하였다. COSY 스펙트럼 분석을 통해 6개의 스핀 시스템[H-2(δH 8.93)/H-4(δH 8.33), H-7(δH 7.67)/H-9(δH 8.13), H-12(δH 7.07)/H-13(δH 2.00), H-2'(δH 8.95)/H-3'(δH 8.02), H-7'(δH 7.77)/H-9'(δH 8.15) 및 H-12'(δH 5.24)/H-13'(δH 1.12)]을 확인하였다. 두 카복실산의 위치는 HMBC의 상호관계[H-2(δH 8.93)와 C-11 (δC 166.0), H-2'(δH 8.95)과 C-11'(δC 166.1)]를 통해 결정되었다. 산소가 치환된 메틴 수소 H-12'(δH 5.24)와 메틸 수소 H-13'(δH 1.12)는 C-6'(δC 143.7)와 C-7'(δC 127.9)에 각각 연결됨을 HMBC를 통해 확인하였다. 두 사페닉산의 연결됨은 H-13(δH 2.00)에서 C-고리의 C-6 (δC 145.8), A'-고리의 C-4'(δC 150.9)으로, C-고리의 H-7(δH 7.67)과 A'-고리의 H-3'(δH 8.02)에서 C-12(δC 34.1)로의 HMBC 상호연결을 통해 확인하였다. 화합물 1의 1H, 13C NMR 스펙트럼은 기존에 보고된 페나조스타틴 C(phenazostatin C)와 매우 유사하였다. 이 둘의 차이는 화합물 1이 카복실릭 메틸 에스터 대신 카복실산과 C-6'의 위치에 이차 알콜을 가지고 있는 것이다.
짝지음 상수(coupling constatnts)나 NOESY 데이터에서의 불충분한 신호로 화합물 1의 상대구조를 분명하게 정할 수 없었다. 이론적으로 예상 가능한 화합물 1의 구조는 두 개의 카이랄(C-12 와 C-12')의 존재로 4가지의 가능성이 있다. 먼저, C-12'의 절대구조는 변형된 모셔의 방법(Mosher's method)을 이용하여 결정하였다. 1을 S- 또는 R-MTPA 에스터 1a 와 1b로 각각 반응시켰다. 1a와 1b의 1H NMR 신호들은 COSY 스펙트럼 분석을 통해 정하였고, ΔδH값은 δS-esterδR-ester으로 계산하였다(도 3). 이러한 결과를 바탕으로 C-12'의 절대구조는 R 인 것으로 확인되었다. 남은 두 개의 부분 입체 이성질체(12R, 12'R 과 12S, 12'R)는 가우시안 16을 이용하여 이론적인 ECD 스펙트럼을 계산하여 측정한 ECD 스펙트럼과 비교하였다. 화합물 1의 실제 ECD 곡선은 12R, 12'R-형태의 이성질체와 일치하였다(도 5). 따라서 C-12의 절대구조는 R인 것으로 결정하였다.
화합물 2는 연녹색의 무정형 고체로 얻어졌다. 화합물 2의 분자식은 HR-ESIMS 데이터를 기반으로 화합물 1과 같은 C30H22N4O5이었다. 화합물 2의 1H과 13C NMR 스펙트럼(표 2) 또한 1과 매우 유사하였으나, H-12'신호(ΔδH 4.95, m)만 달라 화합물 2의 평면구조는 화합물 1과 동일하였다. 그러나, 화합물 2의 비선광도(optical rotation)의 값이 화합물 1과는 반대로 나왔으며, ECD 스펙트럼 또한 곡선이 반대로 나타났다[화합물 1: [α]25 D-167 (c 0.1, CHCl3); ECD (CHCl3) λmax (Δε) 242 (-38.20), 268 (+148.53), 화합물 2: [α]25 D+88 (c 0.1, CHCl3); ECD (CHCl3) λmax (Δε) 247 (+15.90), 272 (-24.16)]. 화합물 1과 화합물 2의 유사점들과 차이점들은 이들이 서로 입체 이성질체임을 보여주었다. 화합물 2의 C-12'에 대한 절대구조는 화합물 1과 동일한 방식으로 변형된 모셔의 방법으로 R-구조임을 확인하여, 화합물 2의 절대구조는 12S, 12'R-구조임을 확인하였다. 흥미롭게도, 에스터화된 2a 와 2b의 H-13'의 화학적 이동값은 각각 δH 0.26 와 δH 0.24로 1a(δH 1.49) 과 1b(δH 1.46)의 값보다 1.2 ppm 더 업 필드(upfield)로 이동하였다. 이는 12S-배향으로 인한 독특한 입체장애 때문인 것으로 보인다(도 5).
화합물 3은 연녹색의 무정형의 고체로, HRESIMS 데이터를 바탕으로 분자식 C30H20N4O5(불포화도 23)임을 확인하였다. 화합물 3의 1D NMR 스펙트럼(표 2)은 화합물 1 및 화합물 2와 유사하였다. 그러나, 화합물 1, 2에 존재하였던 이차 알콜 대신, 아세틸 그룹 (C-12', δC 200.3)이 존재하였다. 따라서, 화합물 3의 구조는 1 또는 2의 산화된 형태임을 알 수 있었다. C-12의 절대구조를 결정하기 위해, 산화된 1과 화합물 3의 비선광도 값을 비교하였다. 화합물 1을 산화시킨 뒤, HPLC를 이용하여 순수하게 분리하였고, LC-MS와 1H NMR 스펙트럼을 통해 화합물 3과 동일 함을 확인하였다. 산화된 화합물 1([α]25 D-10)의 비선광도 값은 3([α]25 D-30)과 같은 음의 값을 보였다. 따라서 C-12의 절대구조는 R인 것으로 결정하였다.
화합물 4-6은 HRESIMS 데이터에서 화합물 1, 2와 동일한 분자식 C30H22N4O5를 나타냈으나, 1H NMR 스펙트럼의 갈라짐 양식(splitting pattern)이 화합물 1, 2 와는 달랐다. 이는 화합물 4-6이 화합물 1, 2의 부분 입체 이성질체임을 의미한다. 화합물 4의 1H NMR 스펙트럼에서, 2개의 단일항(singlet) 수소 신호 (δH 9.16, s, H-2'과 δH 8.41, s, H-4')를 나타내었다. A'고리에 존재하는 카복실산의 위치는 H-2'(δH 9.16)과 C-11'(δC 166.2) 사이의 HMBC 상관관계를 통하여 확인하였다. 두 사페닉산의 연결을 H-2'(δH 9.16)에서 C-12 (δC 39.7)로, H-12(δH 5.97)에서 C-3'(δC 149.6), C-4'(δC 131.7), C-5a(δC 142.2), C-6(δC 144.2), 그리고 C-7(δC 129.1)로의 HMBC 신호를 통하여 확인하였다 (도 2). 화합물 4와 달리, 화합물 5는 두개의 단일항 수소 신호 δH 7.90(s, H-7'과 H-9')가 겹쳐 나타났다. 두 카복실산의 위치는 H-2(δH 8.93)에서 C-11(δC 165.7)로, H-2'(δH 8.90)에서 C-11'(δC 165.9)으로의 HMBC 상관관계를 통해 확인하였다. 따라서 중첩된 두개의 단일항 수소는 C'고리에 속해 있었다. 두 사페닉 산의 연결은 H-12(δH 6.78)에서 C-7(δC 128.5)과 C-8'(δC 143.6)으로의 HMBC 상관관계를 통해 확인하였다. 이러한 결과는, 화합물 4는 C고리와 A'고리가 C-12를 통해 연결되어 있는 반면, 화합물 5는 C고리와 C'고리가 C-12를 통해 연결되어 있음을 나타내었다. 화합물 4와 5의 절대구조는 화합물 1, 2와 동일한 방식으로 결정하였다(도 6, 7). 따라서, 화합물 4와 5의 절대구조는 12S, 12'R과 12R, 12'R인 것으로 각각 결정하였다.
마지막으로, 화합물 6 또한, 1D 및 2D NMR 데이터 분석을 통하여 결정하였다. 화합물 6의 1H NMR 스펙트럼은 산소가 치환된 메틴 수소(δH 7.65, H-12)가 다른 화합물 1-5의 값보다 다운필드(downfield)로 이동해 있었다. 두 사페닉산 간의 연결은 H-7(δH 8.54)에서 C-12(δC 70.0)로, H-12(δH 7.65)과 H-2'(δH 8.33)에서 A'고리에 연결된 카복실산의 C-11'(δC 165.8)로의 HMBC 연결 신호를 통하여 에스터 결합을 이루고 있음을 확인하였다. C-12'의 절대구조는 변형된 모셔의 방법을 이용하여 R임을 확인하였다. C-12의 절대구조를 확인하기 위해, 화합물 6을 6N 염화수소(HCl)로 가수분해한 뒤, 그 가수분해물을 화합물 8인 (R)-사페닉산과 함께 비선광도 값을 비교하였다. 화합물 6의 가수분해물의 비선광도 값([α]25 D-10)은 (R)-사페닉산(화합물 8)([α]25 D-13)과 동일한 음의 값을 보였다. 결과적으로, 화합물 6의 절대구조는 12R, 12'R 로 결정되었다.
실험예 1. 다이페나진 화합물의 항뇌신경염증 활성 및 세포 생존력 평가
항뇌신경염증 활성을 확인하기 위한 NO생성은 Griess 시약을 사용하여 배지 내의 아질산염(nitrite) 농도를 측정함으로써 평가하였고, 세포 생존력은 MTT assay를 이용하여 평가하였다. 간략하게, BV-2 미세아교세포를 5% heat-inactivated FBS와 페니실린-스트렙토마이신 50 μg/mL를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)배지에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 미리 배양한 세포(2.5 Х 104 cells/mL)를 분주한 96-well plate에 다양한 농도(10, 20, 50 및 100 μM)의 화합물들을 1시간 동안 처리하고, LPS(200 ng/mL)를 처리하고 24시간 배양하였다. 상층액을 Griess 시약과 섞고, 10분간 상온에서 배양하였다. Nitrite 농도는 세포배양 배지에 준비된 sodium nitrite 표준용액을 사용하여 결정하였다. 마이크로플레이트 리더기로 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존력을 평가하기 위해서, 세포(2.5 × 104 cells/mL)를 분주한 96-well plate에 다양한 농도(10, 20, 50 및 100 μM)의 화합물들을 1시간 동안 처리하고, LPS(200 ng/mL)를 처리하고 24시간 배양하였다. 각각의 well에 MTT 용액(0.5 mg/mL)을 첨가한 뒤, 37 ℃, 4 시간 동안 배양하였다. 상층액을 제거하고, 형성된 formazan crystal을 DMSO에 녹였다. 이를 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 화합물 6의 IC50값을 구하기 위해서, NO 생성 및 MTT 분석을 앞서 기술한 것과 동일한 방식으로 농도(0.25, 0.5 및 1 μM)만 다르게 진행하였다. (표 4) 실험은 3반복 진행하였다.
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000036
BV-2 미세아교세포(microglia)에 대한 세포독성을 MTT 분석을 이용해 측정하였다. 모든 화합물들은 사페닉산 부분으로 구성되어 있으나, 두 사페닉산의 연결된 패턴에 따라 활성 세기에 큰 차이를 보였다(도 8 및 표 4). 특히, 화합물 6이 0.3 μM 농도의 가장 뛰어난 IC50 값을 보였다(도 9). 이는 6의 활성이 다른 화합물들 보다 최소 54배(8, 16.3 μM)에서 최고 552배(1, 165.6 μM)까지 더 뛰어난 활성을 나타냄을 의미한다. 화합물 1과 화합물 2는 서로 부분 입체 이성질체 관계이고, 화합물 3은 화합물 1의 산화된 형태였으나, 화합물 3(34.7 μM)은 화합물 1(165.6 μM)보다 5배 더 강하고, 화합물 2(90.2 μM)는 화합물 1(165.6 μM) 보다 약 2배 더 강한 활성을 보였다(표 4). 앞서 언급한 바와 같이, C-12의 입체구조로부터 기인되는 독특한 입체적 장애의 차이(도 5)가 활성에 영향을 준다는 것을 발견하였다. 세포 생존력(cell viability) 시험에서, 화합물 6이 1 μM의 농도까지 강력한 세포독성을 보였다.
화합물 6은 다른 화합물들과 다르게 항뇌신경염증 활성을 보였기 때문에, 추가적인 생리활성 실험을 위해 화합물 6을 합성하고자 하였다. 반합성된 6은 사페닉산(화합물 8)을 이용하여 EDCI 커플링 반응을 통해 합성되었고, 천연물 6과 동일한 1H, 13C 및 MS 스펙트럼을 보였다. 화합물 6의 정제과정 중, 화합물 6의 산화된 형태의 부산물인 화합물 7도 얻게 되었다(도 10). 화합물 7의 1H NMR 스펙트럼이 화합물 6과 비슷하였으나, 산소가 치환된 메틴(δH 5.72, 1H)과 연결된 메틸의 신호(δH 1.97, d, 3H)가 아세틸기의 신호(δH 3.08, s, 3H)로 변한 것을 확인하였다. 화합물 7의 분자량 또한 화합물 6보다 적은 분자량 516 인 것을 LRESIMS 스펙트럼에서 확인하여 화합물 7이 화합물 6의 산화된 형태임을 나타내었다. 따라서 화합물 7의 구조는 (R)-6-(1-((6-아세틸페나진-1-카르보닐)옥시)에틸)페나진-1-카르복실산 ((R)-6-(1-((6-acetylphenazine-1-carbonyl) oxy)ethyl)phenazine-1-carboxylic acid)로 결정하였다.
실험예 2. 다이페나진 화합물의 항암활성 분석
세포독성 테스트는 6개의 인간 암세포주에 대해 술포로다민 B (sulforhodamine B, SRB) 분석으로 평가하였다. 인간의 암세포주, ACHN(신장), NCI-H23(폐), PC-3(전립선), NUGC-3(위), MDA-MB-231(유방) 및 HCT-15(결장)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였다. 세포는 10% FBS(fetal bovine serum)이 첨가된 RPMI 1640배지로 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 세포(8 × 103 cells/well)를 96-well plate에 분주하고 하루동안 배양한 뒤, 0.1% DMSO에 녹인 화합물 1-8 및 화합물 9로써 종래 공지된 (R)-6-(1-((2-아미노벤조일)옥시)에틸)페나진-1-카르복실산 (R)-(6-(1-((2-aminobenzoyl)oxy)ethyl)phenazine-1-carboxylic acid)과 양성대조군 아드리아마이신을 세포에 처리하였다. 48 시간동안 배양한 뒤, 50% 트리클로로초산(trichloroacetic acid, 50 μg/mL)으로 고정하고 1% 아세트산(acetic acid)에 녹인 0.4% surfohodamine B로 염색하였다. 염색되지 않은 것은 1% 아세트산으로 씻어 제거하고, 단백질과 결합된 것은 10 mM Tris base(pH 10.5)로 추출하여 광학밀도(optical density)를 측정하였다. 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하고, GI50값은 GraphPad Prism 4.0을 사용하여 계산하였다.
테스트된 화합물은 세포독성을 보이지 않았으나, 화합물 6과 화합물 6이 산화된 형태인 화합물 7에서만 양성대조군 아드리아마이신(Adriamycin)보다 2-19배 더 강력한 세포독성을 나타내었다. 또한 화합물 6은 화합물 7보다 4-6배 더 강력한 활성을 보였다. 특히, 위암세포인 NUGC-3에서는 GI50 값이 7.7 nM으로 가장 강력한 활성을 보였으며, 이는 아드리아마이신보다 19배 더 강력하였다. 이러한 결과는 C'고리의 하이드록시 그룹과 에스터 결합이 활성에 큰 역할을 함을 나타내었다. 하기의 표 5에 화합물 1-9의 6종의 암세포들에 대한 세포독성 결과를 나타내었다 (GI50 = μM).
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000037
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13270BP
수탁일자 : 20181120
Figure PCTKR2021018714-appb-img-000038

Claims (15)

  1. 하기 화학식 1의 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2021018714-appb-img-000039
    상기 화학식 1에서
    X는
    Figure PCTKR2021018714-appb-img-000040
    ,
    Figure PCTKR2021018714-appb-img-000041
    또는
    Figure PCTKR2021018714-appb-img-000042
    이며,
    R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로
    Figure PCTKR2021018714-appb-img-000043
    , -OH, -COH, -COOH, -COOCH3 또는 -COCH3이다.
  2. 제1항에 있어서, X는
    Figure PCTKR2021018714-appb-img-000044
    이고, R1은
    Figure PCTKR2021018714-appb-img-000045
    , -COOH, 또는 -COCH3인 것인, 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항에 있어서, X는
    Figure PCTKR2021018714-appb-img-000046
    이고, R1은
    Figure PCTKR2021018714-appb-img-000047
    , -COOH, 또는 -COCH3 인 것인, 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항에 있어서, X는
    Figure PCTKR2021018714-appb-img-000048
    이고, R1은
    Figure PCTKR2021018714-appb-img-000049
    , -COOH, 또는 -COCH3 인 것인, 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1의 화합물이 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    4-((R)-1-(6-카르복시페나진-1-일)에틸)-6-((R)-1-히드록시에틸)페나진-1-카르복실산;
    4-((S)-1-(6-카르복시페나진-1-일)에틸)-6-((R)-1-히드록시에틸)페나진-1-카르복실산;
    (R)-6-아세틸-4-(1-(6-카르복시페나진-1-일)에틸)페나진-1-카르복실산.
    3-((S)-1-(6-카르복시페나진-1-일)에틸)-6-((R)-1-히드록시에틸)페나진-1-카르복실산;
    8-((R)-1-(6-카르복시페나진-1-일)에틸)-6-((R)-1-히드록시에틸)페나진-1-카르복실산;
    6-((R)-1-((6-((R)-1-히드록시에틸)페나진-1-카르보닐)옥시)에틸)페나진-1-카르복실산; 및
    (R)-6-(1-((6-아세틸페나진-1-카르보닐)옥시)에틸)페나진-1-카르복실산.
  6. 시스토바시디움 라린지스 IV17-028 (Cystobasidium laryngis IV17-028) KCTC 13720BP 균주 또는 이의 배양물로부터 하기 화학식 1로 표시되는 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 분리하는 단계;를 포함하는 화학식 1의 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2021018714-appb-img-000050
    상기 화학식 1에서
    X는
    Figure PCTKR2021018714-appb-img-000051
    ,
    Figure PCTKR2021018714-appb-img-000052
    또는
    Figure PCTKR2021018714-appb-img-000053
    이며,
    R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로
    Figure PCTKR2021018714-appb-img-000054
    , -OH, -COH, -COOH, -COOCH3 또는 -COCH3이다.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 암은 가성점액종, 간내 담도암, 간모세포종, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 구순암, 균상식육종, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 기저세포암, 난소암, 난소상피암, 난소생식세포암, 남성유방암, 뇌암, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 만성림프구백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 미만성거대B세포림프종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비부비동암, 비소세포폐암, 비호지킨림프종, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아뇌암, 소아림프종, 소아백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신경모세포종, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 악성 연부조직　암, 악성골암, 악성림프종, 악성중피종, 악성흑색종, 안암, 외음부암, 요관암, 요도암, 원발부위불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관암, 윌름스암, 유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성 골암, 전이성뇌암, 종격동암, 중피종, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 카포시 육종, 파제트병, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 횡문근육종, 후두암, 흉막암, 및 흉선암으로 이루어진 군에서 어느 하나 이상 선택되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 암은 가성점액종, 간내 담도암, 간모세포종, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 구순암, 균상식육종, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 기저세포암, 난소암, 난소상피암, 난소생식세포암, 남성유방암, 뇌암, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 만성림프구백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 미만성거대B세포림프종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비부비동암, 비소세포폐암, 비호지킨림프종, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아뇌암, 소아림프종, 소아백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신경모세포종, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 악성 연부조직　암, 악성골암, 악성림프종, 악성중피종, 악성흑색종, 안암, 외음부암, 요관암, 요도암, 원발부위불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관암, 윌름스암, 유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성 골암, 전이성뇌암, 종격동암, 중피종, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 카포시 육종, 파제트병, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 횡문근육종, 후두암, 흉막암, 및 흉선암으로 이루어진 군에서 어느 하나 이상 선택되는 것인, 암 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 신경염증 질환은 뇌염증 질환, 다발성 경화증, 우울증, 뇌졸중, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 루게릭 병, 헌팅턴 병, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 정신분열증 및 근위축성측색경화증으로 이루어진 군에서 어느 하나 이상 선택되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경염증 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 신경염증 질환은 뇌염증 질환, 다발성 경화증, 우울증, 뇌졸중, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 루게릭 병, 헌팅턴 병, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 정신분열증 및 근위축성측색경화증으로 이루어진 군에서 어느 하나 이상 선택되는 것인, 신경염증 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 다이페나진 화합물, 이의 광학이성질체 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 관련 질환의 예방 또는 치료 방법.
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