WO2023079905A1 - 細胞剥離装置および細胞剥離方法 - Google Patents

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WO2023079905A1
WO2023079905A1 PCT/JP2022/037730 JP2022037730W WO2023079905A1 WO 2023079905 A1 WO2023079905 A1 WO 2023079905A1 JP 2022037730 W JP2022037730 W JP 2022037730W WO 2023079905 A1 WO2023079905 A1 WO 2023079905A1
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cell
ultrasonic
detachment
voltage
unit
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PCT/JP2022/037730
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幸太 佐々木
睦三 鈴木
友輔 高麗
裕久 溝田
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株式会社日立製作所
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/42—Apparatus for the treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves

Definitions

  • the present invention relates to a cell detachment device and a cell detachment method for detaching specific cells in a culture vessel from a culture surface using ultrasonic waves.
  • Cells may be grown in cell culture dishes and cell culture vessels, including cell culture plates, multiwell plates, microtiter plates, flasks, multi-cell culture flasks, and multi-layer cell culture vessels (hereinafter sometimes simply referred to as "culture vessels"). is). Cells in culture grow by adhering (adhering) to the bottom surface of the culture vessel. The grown cells form cell sheets or colonies and are used for treatment and the like.
  • Patent Documents 1 and 2 are known as methods for peeling cells adhered to a culture vessel from the vessel.
  • Patent Literature 1 describes a technique using dispase, which is an enzyme that selectively breaks adhesion between a cell culture substrate and cells.
  • Patent Document 2 describes a technique for recovering a cell sheet using a temperature-responsive polymer.
  • Patent Document 1 also degrades the extracellular matrix used for adhesion between the cells and the cell culture surface. As a result, cell function may be impaired. Furthermore, the dispase used for cell sheet recovery is expensive, increasing costs.
  • Patent Document 2 requires special processing using a temperature-responsive polymer on the cell culture surface, which increases costs. Furthermore, the technique described in Patent Document 2 detaches cells by lowering the temperature. Therefore, in this technique, some cells may detach due to exposure to room temperature lower than the temperature suitable for culture during operations such as medium exchange and microscopic observation. Therefore, in this technique, the culture operation may become more difficult than when using a general culture dish. In addition, the technique may also reduce the activity of the cells due to temperature reduction, which may lead to deterioration of the quality of the cells produced.
  • Patent Document 3 describes a technique for exfoliating cells by mechanical vibration of a piezoelectric element adhered to a cell culture vessel. According to this technique, the entire cell sheet can be detached from the culture container without contact by uniformly applying mechanical vibration to the cultured cells.
  • Patent Document 3 has the problem that it takes time to evenly detach the entire cell sheet, which is inefficient.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a cell detachment device and a cell that can efficiently detach cells from a culture container in a non-contact manner, depending on the culture state of the cells. To provide a peeling method.
  • a cell detachment device is a cell detachment device that detaches cultured cells from a culture container to which the cultured cells are adhered.
  • an ultrasonic probe having a plurality of piezoelectric elements, a moving mechanism that moves the ultrasonic probe to change the relative position of the ultrasonic probe and the culture vessel, and is connected to the plurality of piezoelectric elements a voltage application unit that applies a voltage with a delay time to the plurality of piezoelectric elements; a cell state detection unit that detects a cell state in the culture container; and the cell state obtained by the cell state detection unit. and an ablation planning unit that determines transmission conditions of the ultrasonic beam.
  • the present invention it is possible to provide a cell detachment device and a cell detachment method that can efficiently detach cells with uneven adhesiveness from the culture vessel in a non-contact manner depending on the culture state of the cells.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a cell detachment device according to a first embodiment
  • FIG. FIG. 4 is a schematic diagram illustrating an example of a movement path of an ultrasonic beam
  • FIG. 4 is an explanatory diagram showing an example of an electrical signal
  • 4 is a flow chart explaining the contents of a cell detachment method according to the first embodiment.
  • FIG. 4 is a schematic configuration diagram of a cell detachment device according to a second embodiment
  • 6 is a flow chart explaining the content of a cell detachment method according to the second embodiment.
  • FIG. 11 is a schematic configuration diagram of a cell detachment device according to a third embodiment
  • FIG. 11 is a schematic configuration diagram of a cell detachment device according to a fourth embodiment;
  • the cells adhered to the inner wall surface of the culture vessel are detached.
  • the cell detachment device according to this embodiment can be used as part of a cell culture device.
  • a method of forming a cell culture medium in a commonly used cell culture dish and culturing adherent cells will be described as an example, but the scope of the present invention is not limited to this. is not limited to this.
  • various types of adhesive cells that can be cultured can be targeted, and the cells are not limited to specific cells.
  • both a serum-free medium and a medium supplemented with serum can be employed.
  • a system in which ultrasonic waves are transmitted upward from the outside of the bottom surface of the culture container in a state where cells immersed in the medium in the culture container adhere to the bottom surface will be used.
  • the present embodiment is not limited to this system, and can be applied to a system in which ultrasonic waves are transmitted from the side or top surface of a culture vessel through a culture medium or the like.
  • an ultrasonic probe having a piezoelectric element is adhered (contacted, adhered) from the outer surface of the culture vessel, for example, the bottom surface, and arbitrarily controlled ultrasonic waves are applied to the cells in the culture vessel.
  • the ultrasonic probe and the outer surface of the culture vessel may be in contact with each other via an acoustic coupler for efficiently transmitting ultrasonic waves, or a matching layer made of water, silicone rubber, fluororubber, or the like.
  • acoustic radiation pressure is applied to cells by transmitting ultrasonic waves having a certain intensity or higher from the ultrasonic probe.
  • an acoustic stream may be generated by the transmitted ultrasonic wave.
  • Cells are detached by applying an upward force to the cells due to acoustic radiation pressure and/or acoustic current.
  • the arbitrarily controlled ultrasonic waves include, for example, the size of the ultrasonic beam at the interface between the cell and the culture vessel, the intensity of the ultrasonic beam, the transmission time of the ultrasonic beam (duty ratio, repetition interval), etc. is electronically controlled.
  • the size of the ultrasonic beam can be controlled, for example, by the following method.
  • an ultrasonic probe having a plurality of piezoelectric elements all or some of the piezoelectric elements to which voltage is applied are selected.
  • the position of the focal point is changed by giving an arbitrary delay time to the voltage applied to each piezoelectric element of the ultrasonic probe.
  • the frequency of the applied voltage is changed.
  • the distance of the ultrasonic probe from the adhesion surface between the culture vessel and the cells may be changed.
  • the intensity of the ultrasonic beam can be controlled, for example, by the following method.
  • the strength of the voltage applied to the plurality of piezoelectric elements of the ultrasonic probe is changed. Change the wavenumber of the applied voltage waveform. Select all or part of the piezoelectric elements to which the voltage is applied.
  • the transmission time of the ultrasonic beam can be controlled, for example, by the following method.
  • the wave number or application time of the voltage applied at a specific frequency to the plurality of piezoelectric elements of the ultrasonic probe is changed. Note that the specific frequency described above is determined by the dimensions and material of the piezoelectric element, and is arbitrarily determined according to the piezoelectric element.
  • the ultrasonic probe Since the ultrasonic probe has a plurality of piezoelectric elements, applying a voltage to each piezoelectric element with a time difference forms an ultrasonic beam focused on a predetermined point. Since the ultrasonic waves converge at the focused position, the ultrasonic beams are strong, and at the out-of-focus positions, the ultrasonic waves do not converge and the ultrasonic beams are weak. By increasing the wave number of the voltage or increasing the application time of the focused and strong ultrasonic beam, the strong ultrasonic beam can be transmitted to a predetermined position for a long time. As a result, the effect of detaching cells adhering to the inner wall surface of the culture vessel can be enhanced.
  • a cell state detection unit used for general cell observation such as an optical camera or an optical microscope
  • the observed cell shape, density, and other states are stored in a cell state database.
  • the detachment planning unit refers to the cell state database, calculates the transmission position of the ultrasonic waves, the size, intensity, transmission time, etc. of the ultrasonic beams, and determines the transmission conditions of the ultrasonic beams.
  • the moving mechanism moves the ultrasonic probe to an arbitrary position according to the ultrasonic wave transmission conditions determined by the ablation planning unit.
  • the voltage application unit transmits ultrasonic waves by applying a voltage to each piezoelectric element, and exfoliates cells adhering to the inner wall surface of the culture vessel.
  • the culture state of cells with uneven adhesiveness is detected according to the culture state of the cells, and the beam intensity and beam diameter are adjusted based on the detection data to locally localize the cells from outside the culture container. transmit ultrasound to promote cell detachment. Therefore, according to this embodiment, the cells can be efficiently detached from the culture vessel in a non-contact manner. Moreover, thereby, the cell culture apparatus provided with the cell detachment apparatus according to the present embodiment can automate the cell detachment process and achieve high throughput.
  • a cell detachment apparatus is an apparatus for detaching cells in culture adhered to a culture container by transmitting ultrasonic waves, and includes an ultrasonic probe, a moving mechanism, a voltage application unit, and cell state detection. and a detachment planning unit.
  • the ultrasonic probe has a plurality of piezoelectric elements that generate ultrasonic waves by applied voltage to form ultrasonic beams.
  • the moving mechanism moves the ultrasonic probe to change the relative positions of the ultrasonic probe and the culture vessel.
  • the voltage applying section is connected to the plurality of piezoelectric elements and applies a voltage while giving a delay time to the plurality of piezoelectric elements.
  • the cell state detector detects the state of cells in the culture vessel.
  • the detachment planning unit refers to the cell state obtained by the cell state detection unit and determines the transmission conditions of the ultrasonic beam.
  • the ultrasonic beam transmission conditions include at least the ultrasonic irradiation range and intensity from the ultrasonic probe.
  • the cell detachment device may include a plurality of ultrasonic probes, and the plurality of ultrasonic probes may be independently controlled.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a cell detachment device 10 according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating an example of a movement path of the ultrasonic beam 20.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram showing an example of an electrical signal.
  • FIG. 4 is a flow chart explaining the details of the cell detachment method according to the first embodiment.
  • the cell detachment device 10 transmits an ultrasonic beam 20 to cells 1 immersed in a culture solution 3 such as a medium inside a culture container 2 to detach the cells from the culture container 2. do.
  • Cells 1 adhere to the bottom surface of culture vessel 2 in the form of, for example, single cells, cell colonies, and cell sheets.
  • the cell detachment device 10 includes an ultrasonic probe 12 adhered to the outside of the culture vessel 2 and a voltage applying section 13 that applies voltage to the plurality of piezoelectric elements 11 of the ultrasonic probe 12 .
  • the cell detachment apparatus 10 includes a moving mechanism 14 that moves the relative positions of the ultrasonic probe 12 and the culture container 2 along the contact surface, and conditions of the voltage applied to the voltage applying unit 13 and the position of the ultrasonic probe 12. and a detachment planning unit 30 for calculation.
  • the ablation planning unit 30 calculates the conditions of the voltage applied to the voltage applying unit 13, the beam adjustment calculation unit 15 that adjusts the ultrasonic beam 20, and the movement amount, that is, the trajectory of the ultrasonic probe 12.
  • a probe trajectory calculator 16 is provided.
  • the cell detachment device 10 includes a cell state detection unit 18 that detects cell states, and a cell state database (DB) 17 that stores the cell states detected by the cell state detection unit 18 .
  • DB cell state database
  • the ultrasonic probe 12 has, for example, a plurality of plate-like piezoelectric elements 11 .
  • the ultrasonic probe 12 has a ground electrode on the upper surface side of the piezoelectric element 11, that is, on the culture container 2 side, and has a protective film adhered to the upper surface side of the ground electrode.
  • the protective film of the ultrasonic probe 12 is in contact with the outer surface of the culture container 2 .
  • the protective film is a thin film made of metal or resin.
  • the ultrasonic probe 12 is provided on the lower surface side of the piezoelectric element 11, that is, on the voltage applying section 13 side, and has a plurality of signal electrodes arranged concentrically.
  • the concentric array can be formed, for example, by using a plurality of ring-shaped signal electrodes with different diameters, but is not limited to this.
  • the concentric arrangement can also be achieved by concentrically arranging a plurality of dot-shaped signal electrodes.
  • the signal electrode is connected to the voltage application section 13 via a plurality of signal lines on its lower surface side, that is, the voltage application section 13 side. A connection portion between the signal electrode and the signal line is covered with resin and fixed.
  • piezoelectric element 11 for example, ceramics such as lead zirconate titanate and lead titanate, materials such as zinc oxide and lithium niobate, or composites (composite materials) are used. Materials such as gold, silver, copper, platinum, titanium, and aluminum are used for the ground electrode and the signal electrode.
  • the trajectory of the ultrasonic beam 20 by the probe trajectory calculator 16 can be arbitrarily set.
  • the probe trajectory calculation unit 16 calculates the amount of movement of the ultrasonic beam 20 so as to obtain the trajectory shown in FIG. 2, for example.
  • calculation is first performed so that the ultrasonic beam 20 has a trajectory that separates the outer edge of the cell 1 from the culture container 2 .
  • calculations are performed so that the ultrasonic beam 20 forms a spiral trajectory that spirals toward the center of the cell 1 .
  • the spiral trajectory may be calculated so that a portion of the previous outer trajectory overlaps a portion of the current inner trajectory. By doing so, it is possible to prevent the cell 1 from being detached and leaked.
  • the probe trajectory calculator 16 may calculate the trajectory so that the ultrasonic beam 20 spirals outward from the center position of the cell 1 (not shown). ). In addition, the probe trajectory calculator 16 moves the ultrasonic beam 20 linearly from an arbitrary end of the cell 1, and when it reaches the outer edge of the cell 1, it moves to the next row, turns around, and moves linearly as it is. (not shown). Further, calculation may be performed so as to form a trajectory in which cells 1 are peeled off in order from a point with a high density to a point with a low density (not shown). By doing so, the cells 1 can be efficiently detached from the culture vessel 2 .
  • the voltage application unit 13 can apply voltages to the plurality of piezoelectric elements 11 using, for example, electrical signals illustrated in FIG. 3 .
  • ⁇ i is an example of the time waveform of the voltage applied to the i-th piezoelectric element.
  • the voltage application unit 13 applies a voltage to each piezoelectric element 11 at a predetermined cycle Ts and a predetermined time T with a delay time of ⁇ tj .
  • the delay time ⁇ tj for each piezoelectric element 11 is calculated as a delay time that realizes a specific focal depth determined by the beam adjustment calculator 15 .
  • the moving mechanism 14 is a mechanism that moves the ultrasonic probe 12 along the trajectory calculated by the probe trajectory calculation unit 16 and along the contact surface with the culture container 2 .
  • the cell state database 17 saves (stores) data relating to the cell state and culture state such as the measured shape and density of the cells 1 .
  • the cell state database 17 stores ultrasonic wave control data required for detachment according to the type of cultured cells and the culture state, such as the size and intensity of the ultrasonic beam 20 and the transmission time.
  • the cell state detection unit 18 for example, a general cell observation device such as an optical camera or an optical microscope is used.
  • the cell state detector 18 measures the culture state such as the shape and density of the cells 1 and stores them in the cell state database 17 .
  • the detachment planning unit 30 From the cell state data stored in the cell state database 17, the detachment planning unit 30 reads, for example, the spatial distribution of the shape and density of the desired cells 1 being cultured. Then, the beam adjustment calculation unit 15 of the detachment planning unit 30 calculates the output of the ultrasonic beam 20, that is, the signal and intensity of the voltage to be applied to the ultrasonic probe 12 from the adhesion state of the cells 1 during culture. Also, the probe trajectory calculator 16 of the detachment planning unit 30 calculates the position of the ultrasonic probe 12 with respect to the culture container 2 . The ablation planning unit 30 provides the voltage application unit 13 with the conditions for the voltage signal to be applied to the ultrasonic probe 12 and provides the moving mechanism 14 with the conditions for the amount of movement. A calculation method in the separation planning unit 30 will be described later.
  • the detachment planning unit 30 can be configured by a computer or the like including a processor such as a CPU (Central Processing Unit) or a GPU (Graphics Processing Unit) and a memory.
  • a processor such as a CPU (Central Processing Unit) or a GPU (Graphics Processing Unit) and a memory.
  • the CPU reads and executes the computer program stored in the memory, thereby realizing the calculation functions, that is, the functions of the beam adjustment calculation unit 15 and the probe trajectory calculation unit 16 by software.
  • the detachment planning unit 30 may implement some or all of its functions by hardware.
  • the separation planning unit 30 uses custom ICs such as ASICs (Application Specific Integrated Circuits) and programmable ICs such as FPGAs (Field-Programmable Gate Arrays) to design circuits to realize their functions.
  • ASICs Application Specific Integrated Circuits
  • FPGAs Field-Programmable Gate Arrays
  • the cell detachment method according to this embodiment will be described using the flowchart of FIG.
  • the cell detachment method according to the present embodiment will be described by taking as an example a method of sequentially detaching the cell sheet, which is the cells 1, from the end toward the inside of the cell sheet, but the method is not limited to this.
  • the cell sheet may be peeled from the inside toward the edge.
  • the cells on the cell sheet may be peeled off in order from areas with high cell densities to areas with low cell densities.
  • the target may be a cell colony.
  • the cell state detection unit 18 detects the state of the cells being cultured (cell state detection step), measures the shape and density distribution of the cell sheet, the number of cells, etc., and calculates the cell state database. 17 (S41).
  • the probe trajectory calculator 16 reads out the coordinates of the end of the cell sheet relative to the origin of the cell sheet stored in the cell state database 17 (the origin is, for example, the center of the culture container 2). Next, the probe trajectory computing unit 16 computes the trajectory of the transmission point of the ultrasonic beam 20 such that the end is filled with the ultrasonic beam 20 and then spirals toward the center. Immediately after or in parallel with the calculation by the probe trajectory calculation unit 16, the beam adjustment calculation unit 15 sets the read coordinates of the edge of the cell sheet according to the cell type, cell density, and the like. With reference to the size and intensity of the ultrasonic beam 20 obtained, the conditions (delay time, etc.) of the voltage applied to each piezoelectric element 11 of the ultrasonic probe 12 are calculated (S42, exfoliation planning step).
  • the moving mechanism 14 changes the relative positions of the ultrasonic probe 12 and the culture container 2 . Specifically, the moving mechanism 14 moves the ultrasonic probe 12 to the specified position so that the center of the ultrasonic beam 20 is positioned at the initial ultrasonic transmission point (origin) (S43, moving step). Subsequently, the voltage applying unit 13 applies a voltage with a delay time to each piezoelectric element 11 of the ultrasonic probe 12 to generate ultrasonic waves and transmit the ultrasonic beams 20 (S44, transmission step). .
  • the cell state detector 18 After transmitting the ultrasonic beam 20, the cell state detector 18 checks whether or not the cell sheet is detached from the culture vessel 2 (S45). When the cell sheet is detached from the culture container 2 (YES in S45), the moving mechanism 14 moves the ultrasonic probe 12 to the next designated position calculated by the probe trajectory calculating section 16 (S47).
  • the beam adjustment calculation unit 15 recalculates the conditions of the ultrasonic beam 20 to be transmitted, such as the intensity and the transmission time (S46). . After that, the voltage applying unit 13 retransmits the ultrasonic beam 20 under the recalculated conditions (returns to S44). When the entire cell sheet is detached from the culture container 2, the transmission of the ultrasonic beam 20 is terminated. By doing so, the cell sheet can be reliably peeled from the culture vessel 2 even if the adhesion state is uneven depending on the culture state of the cells 1 .
  • the ultrasonic beam 20 immediately after the ultrasonic beam 20 is transmitted toward the cell sheet, it is checked whether the cell sheet has detached from the culture vessel 2. If the cell sheet has not been detached, the ultrasonic beam 20 is immediately emitted. The conditions are recalculated and the ultrasonic beam 20 based thereon is transmitted to the same location again. Contents of the recalculation of the conditions of the ultrasonic beam 20 include, for example, lengthening the transmission time of the ultrasonic beam 20, reducing the size of the ultrasonic beam 20, and increasing the transmission output. mentioned.
  • the cell state detection unit 18 confirms that the entire cell sheet has been detached, the cell detachment process for one cell sheet ends.
  • the moving mechanism 14 moves the ultrasonic probe 12 to the next position, that is, The cell sheet is removed from the culture vessel 2 by moving to another cell sheet or another well in one culture vessel 2 and performing the series of steps S41 to S47.
  • the cell detachment device 10 and the cell detachment method according to the present embodiment transmit the ultrasonic beam 20 to the cells 1 being cultured, thereby removing cells having uneven adhesive state depending on the culture state of the cells 1. 1 can be efficiently detached from the culture vessel 2 without contact.
  • the presence or absence of detachment of the cultured cells 1 is confirmed for each transmission point of the ultrasonic beam 20, and the ultrasonic probe 12 is moved to the next position when the detachment is confirmed.
  • the detachment planning unit 30 the beam size, intensity, transmission time, and coordinates of the ultrasonic beam 20 are calculated according to the cell state (for example, the shape of the cell sheet) read from the cell state database 17, and the entire cell sheet area is calculated.
  • Planning data for ultrasound transmission is prepared in advance so that the ultrasound beam 20 is transmitted at .
  • a desired ultrasonic beam 20 is transmitted to a desired position by the voltage applying unit 13 and the moving mechanism 14 according to the planning data, and after the ultrasonic beam 20 is transmitted once according to the planning data , the presence or absence of detachment of the cell 1 is confirmed by the cell state detection unit 18 .
  • planning data for ultrasonic wave transmission may be created again for the portions in the adhered state, and the ultrasonic beam 20 may be transmitted to detach the entire cell 1 (cell sheet).
  • FIG. 5 is a schematic configuration diagram of a cell detachment device 50 according to the second embodiment.
  • FIG. 6 is a flow chart explaining the contents of the cell detachment method according to the second embodiment. It should be noted that the present embodiment will be described with a focus on differences from the first embodiment.
  • cell state data that is, data related to the culture state such as the shape and density of the cells 1
  • the cell state detection unit 18 uses an optical camera, an optical microscope, or the like.
  • the ultrasonic probe 12 transmits a detection ultrasonic beam (not shown) for detecting whether or not the cells 1 have been detached from the culture vessel 2. do.
  • the ultrasonic beam for detection an ultrasonic wave having a lower output and a larger beam size than the ultrasonic beam 20 for exfoliation is used.
  • the sensing ultrasound beam can have a lower applied voltage than the ultrasound beam 20 for ablation.
  • the ultrasonic beam for detection may focus the ultrasonic beam 20 in the culture solution above the interface between the cell 1 and the culture container 2 .
  • the driving force exerted by the acoustic radiation pressure and/or acoustic stream causes the cell 1 to move in response to the ultrasound power.
  • a portion where the cell 1 is not detached does not move even if the ultrasonic beam for detection hits it.
  • Whether or not the cell 1 is detached from the culture vessel 2 is confirmed by measuring whether or not the cell 1 moves by the ultrasonic beam for detection by the cell state detection unit 18 .
  • the cell detachment device 50 includes a system synchronization section 19.
  • the system synchronization unit 19 In order to synchronize the time of the cell state detection unit 18 and the time of the voltage application unit 13, the system synchronization unit 19 generates a time trigger signal for transmitting the ultrasonic waves of the voltage application unit 13, and sends the signal to the cell state detection unit 18.
  • a time trigger signal can be input. Generation of the time trigger signal may be generated starting from the cell state detector 18 .
  • the system synchronization unit 19 collects voltage application time information in the voltage application unit 13 and measurement time information in the cell state detection unit 18, and obtains cell state measurement data at the time when the ultrasonic wave is being transmitted. Systems may be synchronized by reference.
  • the voltage application unit 13 in this embodiment can switch between the detection ultrasonic beam and the ultrasonic beam 20 for exfoliation by changing the applied voltage and the transmission time.
  • the cell state detection unit 18 detects whether or not the cell sheet has moved by which timing of the ultrasonic beam for detection. can be measured accurately. Therefore, the cell detachment device 50 can accurately detect the presence or absence of detachment of the cell sheet and the location (coordinates) where the cell sheet is not detached.
  • the cell detachment method according to this embodiment will be described using the flowchart of FIG.
  • the cell detachment method according to the present embodiment will be described by taking as an example a method of sequentially detaching the cell sheet, which is the cells 1, from the end toward the inside of the cell sheet, but the method is not limited to this.
  • the cell sheet may be peeled from the inside toward the edge.
  • the cells on the cell sheet may be peeled off in order from areas with high cell densities to areas with low cell densities.
  • the target may be a cell colony.
  • system synchronization unit 19 inputs a time trigger signal to the cell state detection unit 18 at the timing when the voltage application unit 13 applies voltage to each piezoelectric element 11 on the ultrasonic probe 12, but is limited to this. isn't it.
  • an ultrasonic beam for detection is transmitted from the ultrasonic probe 12 toward the cell sheet in the culture container 2 (S61).
  • the system synchronization unit 19 transmits a time trigger signal to the cell state detection unit 18 at the timing when the voltage application unit 13 applies voltage to each piezoelectric element 11 on the ultrasonic probe 12 .
  • the cell state detection unit 18 Based on the time trigger signal input from the system synchronization unit 19, the cell state detection unit 18 detects the cell state (cell state detection step) while the detection ultrasonic beam is being transmitted, and detachs the cell sheet. Presence or absence of peeling and the location of peeling are stored in the cell state database 17 (S62). The presence or absence of detachment of the cell sheet can be confirmed, for example, by checking the presence or absence of movement of the cell sheet during transmission of the ultrasonic beam for detection.
  • the probe trajectory calculator 16 reads out the coordinates of the end of the cell sheet stored in the cell state database 17 with respect to the origin (the origin is, for example, the center of the culture vessel 2).
  • the probe trajectory computing unit 16 computes the trajectory of the transmission point of the ultrasonic beam 20 such that the end is filled with the ultrasonic beam 20 and then spirals toward the center.
  • the beam adjustment calculation unit 15 calculates the size, intensity, and transmission time of the ultrasonic beam 20 based on the detachment point of the cell sheet confirmed in step S62. etc., to each piezoelectric element 11 of the ultrasonic probe 12 is calculated (S63, exfoliation planning step).
  • the moving mechanism 14 changes the relative positions of the ultrasonic probe 12 and the culture container 2 . Specifically, the moving mechanism 14 moves the ultrasonic probe 12 to the specified position so that the center of the ultrasonic beam 20 is positioned at the initial ultrasonic transmission point (origin) (S64, moving step).
  • the voltage applying unit 13 applies a voltage with a delay time to each piezoelectric element 11 of the ultrasonic probe 12 to generate ultrasonic waves and transmit the ultrasonic beams 20 (S65, transmission step). .
  • the cell state detector 18 After transmitting the ultrasonic beam 20, the cell state detector 18 checks whether or not the cell sheet is detached from the culture vessel 2 (S66). If the cell sheet is detached from the culture container 2 (YES in S66), the moving mechanism 14 moves the ultrasonic probe 12 to the next designated position calculated by the probe trajectory calculating section 16 (S68). After that, the process returns to step S61 and the same steps are performed.
  • the beam adjustment calculation unit 15 recalculates (adjusts) the conditions of the ultrasonic beam 20 to be transmitted, such as the intensity and transmission time. (S67). After that, the voltage application unit 13 retransmits the ultrasonic beam 20 under the recalculated conditions (returns to S65). When the entire cell sheet is detached from the culture container 2, the transmission of the ultrasonic beam 20 is terminated.
  • the adhesive state is uneven depending on the culture state of the cells 1, as in the first embodiment. Even in such a case, the cell sheet can be reliably separated from the culture vessel 2 .
  • FIG. 7 is a schematic configuration diagram of a cell detachment device 70 according to the third embodiment. This embodiment will also be described with a focus on differences from the first embodiment.
  • the moving mechanism 14 is used to change the relative positions of the culture container 2 and the ultrasonic probe 12 in order to change the transmission position of the ultrasonic beam 20 .
  • the cell detachment device 70 by giving a specific delay time to the voltage applied to the plurality of piezoelectric elements 11 on the ultrasonic probe 12, the central axis of the ultrasonic beam 20 is shifted to the electronic Then, the entire cell 1 is scanned (electronically scanned) so as to fill the entire cell 1 with the ultrasonic beam 20 , thereby detaching the entire cell 1 from the culture container 2 . By doing so, the cells 1 can be detached without moving the ultrasonic probe 12 by the moving mechanism 14 .
  • FIG. 7 shows an example of generation of the voltage application unit 13 and the ultrasonic beam 20 of the cell detachment device 70 according to this embodiment.
  • the voltage applying unit 13 applies a voltage to each piezoelectric element 11 with a specific delay time for electronic scanning. By doing so, the ultrasonic waves generated by each piezoelectric element 11 are focused at a specific position. Therefore, the central axis of the ultrasonic beam 20 can be tilted with a specific inclination from the central axis of the piezoelectric element 11 on the ultrasonic probe 12 .
  • the cell detachment device 70 can transmit the ultrasonic beam 20 generated in this manner toward a desired position, so that the entire cell 1 in the culture vessel 2 can be removed without driving the moving mechanism 14. It can be peeled off from the culture vessel 2 .
  • the third embodiment is different from the first embodiment only in that the delay time applied by the voltage applying unit 13 is controlled to electronically scan the ultrasonic beam 20 to detach the cell 1.
  • the method flow is similar to the first embodiment. Therefore, description of the cell detachment method according to the third embodiment is omitted here.
  • the delay time applied by the voltage applying unit 13 is set under conditions suitable for electronic scanning.
  • voltage is applied to each of the piezoelectric elements 11 used in the ultrasonic probe 12 by giving a delay time.
  • An ultrasonic wave is generated by the applied voltage to electronically scan the ultrasonic beam 20 .
  • FIG. 8 is a schematic configuration diagram of a cell detachment device 80 according to the fourth embodiment. This embodiment will also be described with a focus on differences from the first embodiment.
  • the size of the ultrasonic beam 20 can be changed by changing the delay time of the voltage applied to the plurality of piezoelectric elements 11 or by changing the number of piezoelectric elements 11 to be used.
  • an acoustic lens 21 such as a Fresnel lens or a concave type is provided between the ultrasonic probe 12 and the culture vessel 2 .
  • the cell detachment device 80 by changing the frequency of the voltage applied to the plurality of piezoelectric elements 11, the delay time, etc. according to the characteristics of the acoustic lens 21 to be used, the ultrasonic waves are focused on a specific position, and the ultrasonic beams are generated. 20 can be resized.
  • the acoustic lens 21 has the effect of converging the ultrasonic waves incident on the acoustic lens 21 in parallel to a specific position.
  • a voltage is applied to each piezoelectric element 11 to generate an ultrasonic wave, which passes through the acoustic lens 21 and forms a focal point at a specific position.
  • the ultrasonic waves can be focused even on a point that is difficult to focus without the acoustic lens 21 .
  • a plurality of acoustic lenses 21 can be provided. By doing so, a plurality of focal positions can be set.
  • the detachment planning unit 30 refers to the cell state obtained by the cell state detection unit 18 and determines the ultrasonic beam transmission conditions including the ultrasonic wave focusing condition by the acoustic lens 21 .
  • the transmission conditions are determined including, for example, the ultrasonic irradiation range and intensity of the ultrasonic probe 12 and the characteristics of the acoustic lens used.
  • the dissection planning unit 30 refers to the cell state obtained by the cell state detection unit 18, and determines ultrasonic beam transmission conditions including the characteristics of the Fresnel lens and the modulated frequency. The transmission conditions are determined including, for example, the ultrasonic irradiation range of the ultrasonic probe 12, the intensity, and the modulated frequency.
  • the fourth embodiment differs from the first embodiment only in that an ultrasonic beam 20 is transmitted to a specific position by focusing the ultrasonic waves from the piezoelectric element 11 using an acoustic lens 21.
  • the flow of the cell detachment method is the same as in the first embodiment. Therefore, description of the cell detachment method according to the fourth embodiment is omitted here.
  • the number and characteristics of the acoustic lenses 21 to be used are taken into account. to set the conditions of the voltage to be applied by the voltage applying unit 13 .
  • the size of the ultrasonic beam 20 transmitted via the Fresnel lens is Conditions suitable for detachment of cells 1 are set.
  • the beam adjustment calculator 15 determines the conditions including the frequency to be modulated in addition to the conditions (delay time, etc.) of the applied voltage to each piezoelectric element 11 of the ultrasonic probe 12 .

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Abstract

細胞の培養状態に応じて接着状態にムラのある細胞を、培養容器から非接触で効率的に剥離できる細胞剥離装置を提供する。本発明に係る細胞剥離装置（１０）は、細胞（１）が接着した培養容器（２）から前記細胞（１）を剥離するものであり、超音波を発生させて超音波ビーム（２０）とする複数の圧電素子（１１）を有する超音波プローブ（１２）と、前記超音波プローブ（１２）を移動させて、前記超音波プローブ（１２）と前記培養容器（２）の相対位置を変更可能にする移動機構（１４）と、前記複数の圧電素子（１１）に対して遅延時間を与えて電圧を印加する電圧印加部（１３）と、前記培養容器（２）内における細胞状態を検知する細胞状態検知部（１８）と、前記細胞状態検知部（１８）で得られる前記細胞状態を参照し、前記超音波ビーム（２０）の送信条件を決定する剥離計画部（３０）と、を備える。

Description

細胞剥離装置および細胞剥離方法
　本発明は、超音波で培養容器内の特定の細胞を培養面から剥離する細胞剥離装置および細胞剥離方法に関する。
　再生医療を応用した治療において、培養した細胞を用いた治療が実用化されている。細胞は、細胞培養皿および細胞培養プレート、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレート、フラスコ、多細胞培養フラスコ、および多層細胞培養容器などを含む特定の細胞培養容器（以下、単に「培養容器」という場合がある）内で増殖される。培養中の細胞は、培養容器の底面に付着（接着）して成長する。成長した細胞は、細胞シートやコロニーを形成し、治療などに用いられる。
　培養容器に接着した細胞を容器から剥離する方法として、例えば、特許文献１、２に記載された技術が知られている。
　特許文献１には、細胞培養基材と細胞との接着を選択的に切断する酵素であるディスパーゼを用いた技術が記載されている。特許文献２には、温度応答性ポリマーを用いて細胞シートを回収する技術が記載されている。
　しかし、特許文献１、２に記載の技術にはそれぞれ次のような難点が指摘されている。
　特許文献１に記載の技術では、細胞と細胞培養面の間の接着に使用される細胞外マトリクスも分解されてしまう。そのため、細胞の機能が低下する可能性がある。さらに、細胞シートの回収に使用されるディスパーゼは高価であり、コストが増大する。
　また、特許文献２に記載の技術では、細胞の培養面に温度応答性ポリマーを用いた特殊な加工が必要となり、コストが増大する。さらに、特許文献２に記載の技術は、温度を下げることで細胞を剥離させる。そのため、当該技術では、培地交換や顕微鏡での観察等の作業において培養に適した温度よりも低い室温にさらされることによって、一部の細胞が剥離してしまうことがある。したがって、当該技術には、一般的な培養ディッシュを用いる場合と比べて培養操作が困難になる場合がある。また、当該技術には、温度低下により細胞の活性が低下する可能性もあり、生成された細胞の品質低下につながる可能性がある。
　このような状況下、近年、特許文献３に記載の技術が提案されている。特許文献３には、細胞培養容器に接着した圧電素子による機械振動で、細胞を剥離する技術が記載されている。この技術によれば、培養された細胞に対して一様に機械振動を与えることで、培養容器から非接触で細胞シート全体を剥離することができる。
特開２０００－１５７６２４号公報 国際公開第２０１２／０２９８８２号 国際公開第２０１９／０４４８０４号
　しかしながら、培養容器への細胞の接着状態は、細胞の増殖によりムラがある。そのため、特許文献３に記載の技術には、細胞シート全体を満遍なく剥離するのに時間を要し、非効率的であるという問題がある。
　本発明は、上記課題に鑑みてなされたもので、その目的は、細胞の培養状態に応じて接着状態にムラのある細胞を、培養容器から非接触で効率的に剥離できる細胞剥離装置および細胞剥離方法を提供することにある。
　上記課題を解決すべく、本発明に係る細胞剥離装置は、培養された細胞が接着した培養容器から前記細胞を剥離する細胞剥離装置において、印加された電圧により超音波を発生させて超音波ビームとする複数の圧電素子を有する超音波プローブと、前記超音波プローブを移動させて、前記超音波プローブと前記培養容器の相対位置を変更可能にする移動機構と、前記複数の圧電素子と接続され、前記複数の圧電素子に対して遅延時間を与えて電圧を印加する電圧印加部と、前記培養容器内における細胞状態を検知する細胞状態検知部と、前記細胞状態検知部で得られる前記細胞状態を参照し、前記超音波ビームの送信条件を決定する剥離計画部と、を備える。
　本発明によれば、細胞の培養状態に応じて接着状態にムラのある細胞を、培養容器から非接触で効率的に剥離できる細胞剥離装置および細胞剥離方法を提供できる。
第１実施形態に係る細胞剥離装置の概略構成図である。 超音波ビームの移動経路の一例を説明する概略図である。 電気信号の一例を表す説明図である。 第１実施形態に係る細胞剥離方法の内容を説明するフローチャートである。 第２実施形態に係る細胞剥離装置の概略構成図である。 第２実施形態に係る細胞剥離方法の内容を説明するフローチャートである。 第３実施形態に係る細胞剥離装置の概略構成図である。 第４実施形態に係る細胞剥離装置の概略構成図である。
　以下、図面に基づいて、本発明の実施の形態を説明する。本実施形態では、培養容器の内壁面に接着状態にある細胞を剥離する。本実施形態に係る細胞剥離装置は、細胞培養装置の一部として用いることができる。また、本実施形態に係る細胞剥離方法では、一般的に用いられている細胞の培養ディッシュに細胞の培地を形成して接着性細胞を培養する方法を一例として記載するが、本発明の適用範囲はこれに限定されるものでない。また、本実施形態では培養可能な各種接着性細胞を対象とすることができ、特定の細胞に限定されない。また、本実施形態において細胞の培養に用いられる培地としては、無血清の培地および血清が添加された培地のいずれも採用可能である。
　本実施形態を説明するため、培養容器内の培地に浸漬した細胞が底面に接着した状態において、培養容器の底面外側から上方向に超音波を送信する体系を用いて説明する。しかし、本実施形態は、この体系に限定されるものではなく、培養容器の側面や上面から培地などを介して超音波が送信される体系を対象とすることができる。
　本実施形態に係る細胞剥離装置および方法では、培養容器の外面、例えば底面から圧電素子を有する超音波プローブを接着（当接、密着）し、培養容器内の細胞に任意に制御した超音波を送信する。このとき、超音波プローブと培養容器の外面とは、超音波を効率的に伝達するための音響カプラや、水、シリコンゴム、フッ素ゴムなどで形成された整合層を介して接してもよい。本実施形態に係る細胞剥離装置および方法では、超音波プローブから一定以上の強度を有する超音波を送信することで、細胞に音響放射圧を付与する。また、超音波の経路上では、送信された超音波によって音響流が発生しうる。音響放射圧および／または音響流により細胞に対して上方向に力が加わることで細胞を剥離する。本実施形態において、任意に制御した超音波としては、例えば、細胞と培養容器の境界面における超音波ビームのサイズ、超音波ビームの強度、超音波ビームの送信時間（デューティ比、繰り返し間隔）などが電子的に制御されたものが挙げられる。
　超音波ビームのサイズは、例えば、以下の方法により制御することができる。複数の圧電素子を有する超音波プローブにおいて、電圧を印加するすべての圧電素子あるいは一部の圧電素子を選択する。または、超音波プローブの各圧電素子に対する印加電圧に任意の遅延時間を与えて焦点の位置を変更する。または、印加する電圧の周波数を変更する。または、培養容器と細胞との接着面からの超音波プローブの距離を変更してもよい。
　超音波ビームの強度は、例えば、以下の方法により制御することができる。超音波プローブの複数の圧電素子に印加する電圧の強度を変更する。印加する電圧波形の波数を変更する。電圧を印加する圧電素子を全てあるいは一部を選択する。
　超音波ビームの送信時間は、例えば、以下の方法により制御することができる。超音波プローブの複数の圧電素子に特定の周波数で印加する電圧の波数または印加時間を変更する。なお、前記した特定の周波数は圧電素子の寸法や材質で決まるものであり、圧電素子に応じて任意に決定される。
　超音波プローブは、複数の圧電素子を有しているので、各圧電素子に時間差をつけて電圧を印加すると、所定の箇所に焦点が合うような超音波のビームが形成される。焦点の合う位置では超音波が収束するので強い超音波ビームとなり、焦点が合わない位置では超音波が収束しないので弱い超音波ビームとなる。焦点を合わせて強くした超音波ビームについて、電圧の波数を増やしたり印加時間を増やしたりすると、強い超音波ビームを所定の位置に長時間送信することができる。これにより、培養容器の内壁面に接着している細胞を剥離する効果を高めることができる。
　なお、超音波ビームのサイズ、強度、送信時間の制御方法について上記のように説明したが、これらの制御方法は前記したものに限定されない。
　培養中の細胞状態を検知するために、例えば、光学カメラや光学顕微鏡などの一般的な細胞の観察に用いられる細胞状態検知部を備えることができる。観察した細胞の形状や密度などの状態は、細胞状態データベースに保存する。そして、剥離計画部は、この細胞状態データベースを参照して、超音波の送信位置および超音波ビームのサイズ、強度、送信時間などを演算して超音波ビームの送信条件を決定する。移動機構は、剥離計画部で決定した超音波の送信条件に応じて超音波プローブを任意の位置に移動させる。電圧印加部は、各圧電素子に対して電圧を印加することで超音波を送信し、培養容器の内壁面に接着している細胞を剥離する。
　本実施形態によれば、細胞の培養状態に応じて接着状態にムラのある細胞について培養状態を検知し、その検知データに基づいてビーム強度やビーム径を調整して培養容器の外部から局所的に超音波を送信し、細胞の剥離を促進する。したがって、本実施形態によれば、培養容器から非接触で効率的に細胞を剥離することができる。また、これにより、本実施形態に係る細胞剥離装置を備える細胞培養装置は、細胞剥離工程を自動化および高スループット化することができる。
　本実施形態では、例えば、以下の構成が開示される。
　本実施形態に係る細胞剥離装置は、培養容器に接着した培養中の細胞に超音波を送信して剥離する装置であって、超音波プローブと、移動機構と、電圧印加部と、細胞状態検知部と、剥離計画部とを備える。超音波プローブは、印加された電圧により超音波を発生させて超音波ビームとする複数の圧電素子を有する。移動機構は、超音波プローブを移動させて、超音波プローブと培養容器の相対位置を変更可能にする。電圧印加部は、複数の圧電素子と接続され、複数の圧電素子に対して遅延時間を与えて電圧を印加する。細胞状態検知部は、培養容器内における細胞状態を検知する。剥離計画部は、細胞状態検知部で得られる細胞状態を参照し、超音波ビームの送信条件を決定する。ここで、超音波ビームの送信条件は、少なくとも超音波プローブからの超音波照射範囲および強度を含む。
　なお、本実施形態に係る細胞剥離装置は、超音波プローブを複数備え、複数の超音波プローブが独立に制御されてもよい。
（第１実施形態）
　図１～図４を参照して第１実施形態に係る細胞剥離装置１０および細胞剥離方法について説明する。図１は、第１実施形態に係る細胞剥離装置１０の概略構成図である。図２は、超音波ビーム２０の移動経路の一例を説明する概略図である。図３は、電気信号の一例を表す説明図である。図４は、第１実施形態に係る細胞剥離方法の内容を説明するフローチャートである。
　図１に示すように、細胞剥離装置１０は、培養容器２の内部において、培地などの培養液３に浸漬された細胞１に対して超音波ビーム２０を送信し、培養容器２から細胞を剥離する。細胞１は、例えば、単一細胞、細胞コロニーおよび細胞シートなどの態様で培養容器２の底面に接着している。
　細胞剥離装置１０は、培養容器２の外側に接着された超音波プローブ１２と、超音波プローブ１２の複数の圧電素子１１に電圧を印加する電圧印加部１３とを備える。また、細胞剥離装置１０は、超音波プローブ１２と培養容器２の相対位置を接触面に沿って移動する移動機構１４と、電圧印加部１３に印加する電圧の条件および超音波プローブ１２の位置を演算する剥離計画部３０とを備える。なお、剥離計画部３０は、電圧印加部１３に印加する電圧の条件を演算し、超音波ビーム２０の調整を行うビーム調整演算部１５と、超音波プローブ１２の移動量、すなわち、軌道を演算するプローブ軌道演算部１６とを備える。さらに、細胞剥離装置１０は、細胞状態を検知する細胞状態検知部１８と、細胞状態検知部１８で検知した細胞状態を保存する細胞状態データベース（ＤＢ）１７とを備える。
　超音波プローブ１２は、一例として、平板状の複数の圧電素子１１を有している。そして、超音波プローブ１２は、圧電素子１１の上面側、すなわち培養容器２側に接地電極を有し、この接地電極の上面側に接着された保護膜を有している。超音波プローブ１２は、この保護膜が培養容器２の外面と接する。保護膜は、金属または樹脂で形成された薄膜である。
　また、超音波プローブ１２は、圧電素子１１の下面側、すなわち電圧印加部１３側に設けられ、同心円状に配列された複数の信号電極を有している。同心円状の配列は、例えば、径の異なる円環状の信号電極を複数用いることで成すことができるが、これに限定されない。例えば、同心円状の配列は、複数のドット状の信号電極を同心円状に配置することでも成すことができる。信号電極は、その下面側、すなわち電圧印加部１３側で複数の信号線を介して電圧印加部１３と接続されている。信号電極と信号線との接続部分は樹脂で覆われ、固定されている。
　圧電素子１１は、例えば、チタン酸ジルコン酸鉛やチタン酸鉛などのセラミックス、酸化亜鉛やニオブ酸リチウムなどの材料、またはコンポジット（複合材料）が用いられている。接地電極および信号電極は、例えば、金、銀、銅、白金、チタン、アルミニウムなどの材料が用いられている。
　プローブ軌道演算部１６による超音波ビーム２０の軌道は、任意に設定できる。
　プローブ軌道演算部１６は、例えば、図２に示す軌道となるように、超音波ビーム２０の移動量を演算する。なお、図２においては、はじめに超音波ビーム２０が細胞１の外縁部を培養容器２から剥離させる軌道となるように演算する。次に、超音波ビーム２０が細胞１の中心に向かって渦を巻く渦巻状の軌道となるように演算する。また、渦巻状の軌道は、前回分の外側の軌道の一部と今回分の内側の軌道の一部とを重複させるように演算してもよい。このようにすると、細胞１の剥離漏れを防ぐことができる。
　なお、プローブ軌道演算部１６は、前記とは反対に、超音波ビーム２０が細胞１の中心位置から外側に向かって渦を巻く渦巻状となるように軌道を演算してもよい（図示せず）。また、プローブ軌道演算部１６は、超音波ビーム２０を細胞１の任意の一端から直線的に移動させ、細胞１の外縁部に達したら隣の列に移って折返し、そのまま直線的に移動させる軌道となるように演算してもよい（図示せず）。さらに、細胞１の密度の大きい箇所から小さい箇所に向かって順番に剥がす軌道となるように演算してもよい（図示せず）。これらのようにすると、細胞１を培養容器２から効率よく剥離できる。
　電圧印加部１３は、例えば、図３に例示する電気信号で複数の圧電素子１１に電圧を印加することができる。Φｉはｉ番目の圧電素子に対する印加電圧の時刻波形の一例である。図３で示すように、電圧印加部１３は、所定の周期Ｔｓかつ所定の時間Ｔで各圧電素子１１に対してΔｔｊの遅延時間をもって電圧を印加する。各圧電素子１１に対する遅延時間Δｔｊは、ビーム調整演算部１５において決定された特定の焦点深さを実現する遅延時間として算出される。
　移動機構１４は、超音波プローブ１２をプローブ軌道演算部１６で演算した軌道で、かつ培養容器２との接触面に沿って移動させる機構である。
　細胞状態データベース１７は、計測した細胞１の形状や密度などの細胞状態や培養状態に関するデータを保存（格納）する。また、細胞状態データベース１７は、培養細胞の種類や培養の状態に応じて剥離に必要となる超音波の制御データ、例えば、超音波ビーム２０のサイズや強度、送信時間などを格納する。
　細胞状態検知部１８としては、例えば、光学カメラや光学顕微鏡などの一般的な細胞観察装置が用いられる。細胞状態検知部１８は、細胞１の形状や密度などの培養状態を計測し、細胞状態データベース１７に保存する。
　剥離計画部３０は、細胞状態データベース１７に保存された細胞状態データから、例えば、培養中の所望の細胞１の形状および密度の空間分布を読み出す。そして、剥離計画部３０のビーム調整演算部１５が、培養中の細胞１の接着状態から超音波ビーム２０の出力、すなわち、超音波プローブ１２に印加する電圧の信号や強度を演算する。また、剥離計画部３０のプローブ軌道演算部１６が、培養容器２に対する超音波プローブ１２の位置を演算する。剥離計画部３０は、電圧印加部１３に、超音波プローブ１２に印加する電圧の信号の条件を与えるとともに、移動機構１４に移動量の条件を与える。なお、剥離計画部３０における演算方法については後述する。
　剥離計画部３０は、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）やＧＰＵ（Ｇｒａｐｈｉｃｓ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）等のプロセッサと、メモリとを備えたコンピュータ等によって構成できる。
　ＣＰＵが、メモリに格納されたコンピュータプログラムを読み込んで実行することにより、演算機能、つまり、ビーム調整演算部１５およびプローブ軌道演算部１６の機能をソフトウエアにより実現する。剥離計画部３０は、その一部または全部の機能をハードウエアによって実現してもよい。例えば、剥離計画部３０は、ＡＳＩＣ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｃｉｒｃｕｉｔ）のようなカスタムＩＣや、ＦＰＧＡ（Ｆｉｅｌｄ－Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｇａｔｅ　Ａｒｒａｙ）のようなプログラマブルＩＣを用いて、その機能を実現するように回路設計を行ってもよい。
　次に、本実施形態に係る細胞剥離方法について、図４のフローチャートを用いて説明する。なお、本実施形態に係る細胞剥離方法は、細胞１である細胞シートを端部から細胞シートの内部に向かって順番に剥離する方法を例にとり説明するが、これに限定されるものではない。また、細胞シートの内部から端に向かって剥がしてもよい。細胞シート上の細胞の密度の大きい箇所から小さい箇所に向かって順番に剥がしてもよい。また、対象が細胞コロニーであってもよい。
　図４に示すように、はじめに、細胞状態検知部１８が培養中の細胞状態を検知し（細胞状態検知ステップ）、細胞シートの形状や密度の分布、細胞の個数などを計測し、細胞状態データベース１７に保存する（Ｓ４１）。
　プローブ軌道演算部１６は、細胞状態データベース１７に保存された細胞シートの原点に対する（原点は例えば培養容器２の中心）細胞シートの端部の座標を読み出す。次いで、プローブ軌道演算部１６は、超音波ビーム２０によって端部上を塗りつぶし、その後に中心に向かって渦巻状になるような超音波ビーム２０の送信点の軌道を演算する。また、ビーム調整演算部１５は、プローブ軌道演算部１６の演算後直ちにまたはこれと並行して、読み出した細胞シートの端部の座標に対し、細胞の種類や細胞の密度などに応じて設定された超音波ビーム２０のサイズおよび強度を参照し、超音波プローブ１２の各圧電素子１１に対する印加電圧の条件（遅延時間など）を演算する（Ｓ４２、剥離計画ステップ）。
　続いて、移動機構１４が、超音波プローブ１２と培養容器２の相対位置を変更する。具体的には、移動機構１４が、最初の超音波送信点（原点）に超音波ビーム２０の中心が位置するように超音波プローブ１２を指定位置に移動させる（Ｓ４３、移動ステップ）。
　続いて、電圧印加部１３が、超音波プローブ１２の各圧電素子１１に対して遅延時間を与えて電圧を印加し、超音波を発生させて超音波ビーム２０を送信する（Ｓ４４、送信ステップ）。
　超音波ビーム２０を送信後、細胞状態検知部１８は、培養容器２からの細胞シートの剥離の有無を確認する（Ｓ４５）。
　細胞シートが培養容器２から剥離している場合は（Ｓ４５でＹＥＳ）、移動機構１４は、プローブ軌道演算部１６で演算した次の指定位置に超音波プローブ１２を移動させる（Ｓ４７）。
　一方、細胞シートが培養容器２から剥離していない場合は（Ｓ４５でＮＯ）、ビーム調整演算部１５において、送信する超音波ビーム２０の条件、例えば、強度、送信時間を再演算する（Ｓ４６）。その後、電圧印加部１３は、再演算した条件で超音波ビーム２０を再度送信する（Ｓ４４に戻る）。細胞シート全体が培養容器２から剥離したら、超音波ビーム２０の送信を終了する。このようにすると、細胞１の培養状態に応じて接着状態にムラがある場合でも、確実に培養容器２から細胞シートを剥離することができる。
　つまり、この実施形態では、超音波ビーム２０を細胞シートに向けて送信した直後に細胞シートが培養容器２から剥離したか否かを確認し、剥離していない場合は即座に超音波ビーム２０の条件を再演算してそれに基づく超音波ビーム２０を再度同じ個所に送信する。超音波ビーム２０の条件を再演算の内容としては、例えば、超音波ビーム２０の送信時間を長くしたり、超音波ビーム２０のサイズを絞って小さくしたり、送信出力を高くしたりすることが挙げられる。
　細胞シート全体に対して超音波ビーム２０を送信し、細胞状態検知部１８により細胞シート全体が剥離したことを確認したら、１つの細胞シートに対する細胞剥離の工程は終了となる。
　その後、１つの培養容器２内に細胞シートが複数ある場合や、マルチウェルプレートの他のウェルで細胞シートを培養している場合は、移動機構１４により超音波プローブ１２を次の位置、つまり、１つの培養容器２内の他の細胞シートや他のウェルに移動させて上記Ｓ４１～Ｓ４７の一連の工程を行い、培養容器２から細胞シートを剥離させる。
　このように、本実施形態に係る細胞剥離装置１０および細胞剥離方法は、培養中の細胞１に超音波ビーム２０を送信することで、細胞１の培養状態に応じて接着状態にムラのある細胞１を、培養容器２から非接触で効率的に剥離することができる。
　本実施形態では、超音波ビーム２０の送信点ごとに培養中の細胞１の剥離の有無を確認し、剥離が確認されたら超音波プローブ１２を次の位置に移動させる方法を説明したが、これに限定されるものではない。例えば、剥離計画部３０において、細胞状態データベース１７から読み出した細胞状態（例えば、細胞シートの形状）に応じて超音波ビーム２０のビームサイズ、強度、送信時間とその座標を演算し、細胞シート全域に超音波ビーム２０が送信されるように予め超音波送信の計画データを作成する。次いで、当該計画データに沿って電圧印加部１３および移動機構１４により所望の超音波ビーム２０を所望の位置に送信し、前記計画データに沿って超音波ビーム２０の送信が一通り成された後に、細胞状態検知部１８によって細胞１の剥離の有無を確認する。次いで、接着状態である箇所に対して再度超音波送信の計画データを作成し、超音波ビーム２０を送信することで細胞１（細胞シート）全体を剥離するようにしてもよい。
（第２実施形態）
　次に、図５および図６を参照して第２実施形態に係る細胞剥離装置５０および細胞剥離方法について説明する。図５は、第２実施形態に係る細胞剥離装置５０の概略構成図である。図６は、第２実施形態に係る細胞剥離方法の内容を説明するフローチャートである。なお、本実施形態について、第１実施形態との相違を中心に述べる。
　第１実施形態では、細胞状態を計測するために、光学カメラや光学顕微鏡などを用いた細胞状態検知部１８により細胞状態データ、つまり、細胞１の形状や密度などの培養状態に関するデータを取得した。これに対し、第２実施形態に係る細胞剥離装置５０では、細胞１が培養容器２から剥離したか否かを検知するための検知用超音波ビーム（図示せず）を超音波プローブ１２から送信する。検知用超音波ビームは、剥離のための超音波ビーム２０よりも低出力でビームサイズの大きい超音波を用いる。例えば、検知用超音波ビームは、剥離のための超音波ビーム２０よりも低い印加電圧とすることができる。また、検知用超音波ビームは、超音波ビーム２０の集束位置を細胞１と培養容器２の境界面よりも上方の培養液内としてもよい。検知用超音波ビームをすでに剥離した箇所に送信した場合、音響放射圧および／または音響流により加えられた駆動力によって細胞１が超音波の出力に応じて動く。細胞１が剥離していない箇所は、検知用超音波ビームがあたっても動かない。検知用超音波ビームによって細胞１が動くか否かを細胞状態検知部１８により計測することで、細胞１が培養容器２から剥離したか否かを確認する。
　図５に示すように、細胞剥離装置５０は、システム同期部１９を備えている。システム同期部１９は、細胞状態検知部１８の時刻と電圧印加部１３の時刻とを同期するため、電圧印加部１３の超音波の送信される時刻トリガ信号を生成し、細胞状態検知部１８に時刻トリガ信号を入力することができる。時刻トリガ信号の生成は、細胞状態検知部１８を起点に生成されてもよい。または、システム同期部１９は、電圧印加部１３における電圧印加の時刻情報と細胞状態検知部１８における計測時の時刻情報とを収集し、超音波が送信されている時刻の細胞状態の計測データを参照することでシステムを同期してもよい。
　本実施形態における電圧印加部１３は、前記した検知用超音波ビームと剥離のための超音波ビーム２０とを、印加電圧および送信時間を変更することで切り替えることができる。
　システム同期部１９が細胞状態検知部１８の時刻と電圧印加部１３の時刻とを同期させると、細胞状態検知部１８は、細胞シートがどのタイミングの検知用超音波ビームで動いたか、または動かなかったかを正確に計測することができる。したがって、細胞剥離装置５０は、細胞シートの剥離の有無や剥離していない箇所（座標）を正確に検知できるようになる。
　次に、本実施形態に係る細胞剥離方法について、図６のフローチャートを用いて説明する。なお、本実施形態に係る細胞剥離方法は、細胞１である細胞シートを端部から細胞シートの内部に向かって順番に剥離する方法を例にとり説明するが、これに限定されるものではない。また、細胞シートの内部から端に向かって剥がしてもよい。細胞シート上の細胞の密度の大きい箇所から小さい箇所に向かって順番に剥がしてもよい。また、対象が細胞コロニーであってもよい。
　また、システム同期部１９は、電圧印加部１３で超音波プローブ１２上の各圧電素子１１に電圧を印加するタイミングで細胞状態検知部１８に時刻トリガ信号を入力するが、これに限定されるものではない。
　図６に示すように、はじめに、超音波プローブ１２から培養容器２内の細胞シートに向けて検知用超音波ビームを送信する（Ｓ６１）。このとき、システム同期部１９は、電圧印加部１３が超音波プローブ１２上の各圧電素子１１に電圧を印加するタイミングで時刻トリガ信号を細胞状態検知部１８に送信する。
　細胞状態検知部１８では、システム同期部１９から入力された時刻トリガ信号に基づき、検知用超音波ビームが送信されている時間中、細胞状態を検知し（細胞状態検知ステップ）、細胞シートの剥離の有無および剥離箇所を細胞状態データベース１７に保存する（Ｓ６２）。細胞シートの剥離の有無は、例えば、検知用超音波ビーム送信中の細胞シートの動きの有無から確認することができる。
　続いて、プローブ軌道演算部１６は、細胞状態データベース１７に保存された細胞シートの原点に対する（原点は例えば培養容器２の中心）端部の座標を読み出す。次いで、プローブ軌道演算部１６は、超音波ビーム２０によって端部上を塗りつぶし、その後に中心に向かって渦巻状になるような超音波ビーム２０の送信点の軌道を演算する。また、ビーム調整演算部１５は、プローブ軌道演算部１６の演算後直ちにまたはこれと並行して、ステップＳ６２で確認した細胞シートの剥離の箇所に基づき、超音波ビーム２０のサイズ、強度、送信時間などを含めた、超音波プローブ１２の各圧電素子１１に対する印加電圧の条件を演算する（Ｓ６３、剥離計画ステップ）。
　続いて、移動機構１４が、超音波プローブ１２と培養容器２の相対位置を変更する。具体的には、移動機構１４が、最初の超音波送信点（原点）に超音波ビーム２０の中心が位置するように超音波プローブ１２を指定位置に移動させる（Ｓ６４、移動ステップ）。
　続いて、電圧印加部１３が、超音波プローブ１２の各圧電素子１１に対して遅延時間を与えて電圧を印加し、超音波を発生させて超音波ビーム２０を送信する（Ｓ６５、送信ステップ）。
　超音波ビーム２０を送信後、細胞状態検知部１８は、培養容器２からの細胞シートの剥離の有無を確認する（Ｓ６６）。
　細胞シートが培養容器２から剥離している場合は（Ｓ６６でＹＥＳ）、移動機構１４は、プローブ軌道演算部１６で演算した次の指定位置に超音波プローブ１２を移動させる（Ｓ６８）。その後、ステップＳ６１に戻って同様の工程を行う。
　一方、細胞シートが培養容器２から剥離していない場合は（Ｓ６６でＮＯ）、ビーム調整演算部１５において、送信する超音波ビーム２０の条件、例えば、強度、送信時間を再演算（調整）する（Ｓ６７）。その後、電圧印加部１３は、再演算した条件で超音波ビーム２０を再度送信する（Ｓ６５に戻る）。細胞シート全体が培養容器２から剥離したら、超音波ビーム２０の送信を終了する。このように、検知用超音波ビームを用いて細胞剥離の有無を確認する第２実施形態に係る細胞剥離方法でも第１実施形態と同様に、細胞１の培養状態に応じて接着状態にムラがある場合でも、確実に培養容器２から細胞シートを剥離することができる。
（第３実施形態）
　次に、図７を参照して第３実施形態に係る細胞剥離装置７０について説明する。図７は、第３実施形態に係る細胞剥離装置７０の概略構成図である。本実施形態も、第１実施形態との相違を中心に述べる。
　第１実施形態では、超音波ビーム２０の送信位置を変更するために移動機構１４を用いて培養容器２と超音波プローブ１２の相対位置を変更した。これに対し、第３実施形態に係る細胞剥離装置７０では、超音波プローブ１２上の複数の圧電素子１１に印加する電圧に特定の遅延時間を与えることで、超音波ビーム２０の中心軸を電子的に走査し、細胞１全体に対して超音波ビーム２０を塗りつぶすように走査（電子走査）して細胞１全体を培養容器２から剥離する。このようにすると、移動機構１４で超音波プローブ１２を移動させることなく、細胞１を剥離させることができる。
　図７は、本実施形態に係る細胞剥離装置７０の電圧印加部１３および超音波ビーム２０の生成例を示している。図７に示すように、電圧印加部１３は、各圧電素子１１に対して電子走査するための特定の遅延時間を付与して電圧を印加する。このようにすることで、各圧電素子１１において生成された超音波が特定の位置において集束することになる。そのため、超音波ビーム２０の中心軸を超音波プローブ１２上の圧電素子１１の中心軸から特定の傾きを有して傾けることができる。本実施形態に係る細胞剥離装置７０は、このようにして生成された超音波ビーム２０を所望の位置に向けて送信できるので、移動機構１４を駆動させることなく培養容器２内の細胞１全体を培養容器２から剥離することができる。
　第３実施形態では、電圧印加部１３で付与する遅延時間を制御して超音波ビーム２０を電子走査させ、細胞１を剥離する点が第１実施形態と相違しているだけであり、細胞剥離方法のフローは第１実施形態と同様である。したがって、第３実施形態に係る細胞剥離方法についてはここでの説明を省略する。
　ただし、第３実施形態に係る細胞剥離方法では、剥離計画ステップ（剥離計画部３０）において、電圧印加部１３で付与する遅延時間を、電子走査に適する条件で設定する。
　また、第３実施形態に係る細胞剥離方法では、送信ステップにおいて、超音波プローブ１２の使用するそれぞれの圧電素子１１に対して遅延時間を与えて電圧を印加し、複数の圧電素子１１は、印加された電圧により超音波を発生させて超音波ビーム２０を電子走査させる。
（第４実施形態）
　次に、図８を参照して第４実施形態に係る細胞剥離装置８０について説明する。図８は、第４実施形態に係る細胞剥離装置８０の概略構成図である。本実施形態も、第１実施形態との相違を中心に述べる。
　前述したように、超音波ビーム２０のサイズの変更は、複数の圧電素子１１に対する印加電圧の遅延時間を変更したり、使用する圧電素子１１の数を変更したりすることなどで行うことができる。これに対し、第４実施形態に係る細胞剥離装置８０では、図８に示すように、超音波プローブ１２と培養容器２との間にフレネルレンズや凹型などの音響レンズ２１を備えている。細胞剥離装置８０では、使用する音響レンズ２１の特性に応じて複数の圧電素子１１に印加する電圧の周波数、遅延時間などを変更することで、超音波を特定の位置に集束させ、超音波ビーム２０のサイズを変更することができる。
　また、音響レンズ２１は、音響レンズ２１に平行に入射した超音波を特定の位置に集束させる効果を持つ。各圧電素子１１に対して電圧が印加され生成された超音波が音響レンズ２１を通過することで、特定の位置に焦点を形成する。これにより音響レンズ２１なしでは集束が難しい点に対しても超音波を収束させることができる。また、音響レンズ２１は複数枚備えることができる。このようにすると、焦点の位置を複数設定することができる。この場合、剥離計画部３０は、細胞状態検知部１８で得られる細胞状態を参照し、音響レンズ２１による超音波の集束条件を含めた超音波ビームの送信条件を決定する。当該送信条件は、例えば、超音波プローブ１２の超音波照射範囲、強度および使用する音響レンズの特性を含んで決定する。
　また、音響レンズ２１としてフレネルレンズを使用した場合は、圧電素子１１に印加する電圧の周波数を変えることで超音波ビーム２０の焦点や超音波ビーム２０のサイズを容易に変更することができる。この場合、電圧印加部１３は、複数の圧電素子１１に対して周波数を変調して電圧を印加する。また、剥離計画部３０は、細胞状態検知部１８で得られる細胞状態を参照し、フレネルレンズの特性および変調した周波数を含めた超音波ビームの送信条件を決定する。当該送信条件は、例えば、超音波プローブ１２の超音波照射範囲、強度および当該変調した周波数を含んで決定する。
　第４実施形態では、音響レンズ２１を用いて圧電素子１１からの超音波を集束することで特定の位置に超音波ビーム２０を送信する点が第１実施形態と相違しているだけであり、細胞剥離方法のフローは第１実施形態と同様である。したがって、第４実施形態に係る細胞剥離方法についてはここでの説明を省略する。
　ただし、第４実施形態に係る細胞剥離方法では、剥離計画ステップ（剥離計画部３０）において、使用する音響レンズ２１の数や特性（例えば、超音波ビームの集束のさせ方など）などを加味して電圧印加部１３で印加する電圧の条件を設定する。
　また、第４実施形態に係る細胞剥離方法において音響レンズ２１としてフレネルレンズを使用する場合は、剥離計画ステップ（剥離計画部３０）において、フレネルレンズを介して送信される超音波ビーム２０のサイズが細胞１の剥離に適する条件で設定する。この場合、ビーム調整演算部１５は、超音波プローブ１２の各圧電素子１１に対する印加電圧の条件（遅延時間など）に加えて、変調する周波数を含めて条件を決定する。
　以上、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
　１　　　細胞
　２　　　培養容器
　３　　　培養液
　１０、５０、７０、８０　細胞剥離装置
　１１　　圧電素子
　１２　　超音波プローブ
　１３　　電圧印加部
　１４　　移動機構
　１５　　ビーム調整演算部
　１６　　プローブ軌道演算部
　１７　　細胞状態データベース
　１８　　細胞状態検知部
　１９　　システム同期部
　２０　　超音波ビーム
　２１　　音響レンズ
　３０　　剥離計画部

Claims (11)

  1. 　培養された細胞が接着した培養容器から前記細胞を剥離する細胞剥離装置において、
    　印加された電圧により超音波を発生させて超音波ビームとする複数の圧電素子を有する超音波プローブと、
    　前記超音波プローブを移動させて、前記超音波プローブと前記培養容器の相対位置を変更可能にする移動機構と、
    　前記複数の圧電素子と接続され、前記複数の圧電素子に対して遅延時間を与えて電圧を印加する電圧印加部と、
    　前記培養容器内における細胞状態を検知する細胞状態検知部と、
    　前記細胞状態検知部で得られる前記細胞状態を参照し、前記超音波ビームの送信条件を決定する剥離計画部と、
    　を備えることを特徴とする細胞剥離装置。
  2. 　請求項１に記載の細胞剥離装置において、
    　前記剥離計画部は、
    　前記超音波プローブに印加する電圧の信号を演算して前記超音波ビームの調整を行うビーム調整演算部と、
    　前記移動機構による前記超音波プローブの軌道を演算するプローブ軌道演算部と、
    　を備えることを特徴とする細胞剥離装置。
  3. 　請求項１に記載の細胞剥離装置において、
    　前記細胞状態検知部は、前記超音波プローブから検知用超音波ビームを送信し、前記検知用超音波ビームによって前記細胞が動くか否かを計測することで前記細胞の剥離状態を検知するとともに、
    　前記電圧印加部と前記細胞状態検知部の時刻を同期するシステム同期部を備えることを特徴とする細胞剥離装置。
  4. 　請求項１に記載の細胞剥離装置において、
    　前記細胞状態検知部が、光学カメラおよび光学顕微鏡のうちの少なくとも１つを備えていることを特徴とする細胞剥離装置。
  5. 　請求項１に記載の細胞剥離装置において、
    　前記電圧印加部は、前記超音波プローブの使用するそれぞれの前記圧電素子に対して遅延時間を与えて前記電圧を印加し、
    　前記複数の圧電素子は、印加された前記電圧により前記超音波を発生させて前記超音波ビームを電子走査させることを特徴とする細胞剥離装置。
  6. 　請求項１に記載の細胞剥離装置において、
    　前記細胞状態検知部で検知された細胞状態データを保存する細胞状態データベースをさらに備えることを特徴とする細胞剥離装置。
  7. 　請求項１に記載の細胞剥離装置において、
    　前記超音波ビームを集束させる一つ以上の音響レンズを備え、
    　前記剥離計画部は、前記細胞状態検知部で得られる前記細胞状態を参照し、前記音響レンズによる超音波の集束条件を含めた前記超音波ビームの送信条件を決定することを特徴とする細胞剥離装置。
  8. 　請求項１に記載の細胞剥離装置において、
    　前記超音波ビームの焦点を変更するフレネルレンズを備え、
    　前記電圧印加部は、前記複数の圧電素子に対して周波数を変調して電圧を印加し、
    　前記剥離計画部は、前記細胞状態検知部で得られる前記細胞状態を参照し、前記フレネルレンズおよび変調した前記周波数を含めた前記超音波ビームの送信条件を決定することを特徴とする細胞剥離装置。
  9. 　培養された細胞が接着した培養容器から前記細胞を剥離する細胞剥離方法において、
    　細胞状態を検知する細胞状態検知ステップと、
    　前記細胞状態検知ステップで得られた前記細胞状態を参照し、超音波ビームの送信条件を決定する剥離計画ステップと、
    　前記剥離計画ステップで決定した指定位置に超音波プローブを移動させる移動ステップと、
    　前記超音波プローブの有する複数の圧電素子に遅延時間を与えて電圧を印加し、超音波を発生させて超音波ビームを送信する送信ステップと、
    　を有することを特徴とする細胞剥離方法。
  10. 　請求項９に記載の細胞剥離方法において、
    　前記送信ステップは、前記超音波プローブの使用するそれぞれの前記圧電素子に対して遅延時間を与えて電圧を印加し、前記複数の圧電素子が、印加された前記電圧により前記超音波を発生させて前記超音波ビームを電子走査させることを特徴とする細胞剥離方法。
  11. 　請求項９に記載の細胞剥離方法において、
    　前記細胞状態検知ステップは、前記超音波プローブから検知用超音波ビームを送信し、前記検知用超音波ビームによって前記細胞が動くか否かを計測することで前記細胞の剥離状態を検知するとともに、電圧を印加した時刻と細胞の剥離状態を検知した時刻とを同期させることを特徴とする細胞剥離方法。
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