WO2023068566A1 - 27-하이드록시콜레스테롤을 포함하는 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

27-하이드록시콜레스테롤을 포함하는 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2023068566A1
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hydroxycholesterol
myeloid leukemia
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hematopoietic stem
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이동준
우수연
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부산대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating myeloid leukemia containing 27-hydroxycholesterol.
  • Leukemia is a general term for diseases in which leukocytes proliferate in a neoplastic manner. Types of leukemia are classified into myelogenous leukemia and lymphocytic leukemia according to the leukocytes from which the leukemia originates, and divided into acute leukemia and chronic leukemia according to the rate of progression. The clinical picture of leukemia varies depending on the type of disease and the nature of the cells involved. Lymphocytic leukemia is caused by mutations in lymphoid blood cells, myeloid leukemia in myeloid blood cells, and chronic myelogenous leukemia in mature cells. It is caused by the disorder of the lineage parental cells.
  • AML Acute myeloid leukemia
  • Symptoms of AML appear as a rapid decrease in the number of blood cells (red blood cells, platelets, and normal white blood cells) as the normal bone marrow fills with leukemia cells.
  • the main symptoms are fatigue, rapid breathing, easy bruising and bleeding, and frequent infections.
  • Acute myeloid leukemia currently uses the classification of the World Health Organization (WHO), which includes more clinically important information such as cytogenetic abnormalities, and includes 1) genetically abnormal acute myeloid leukemia, 2) acute myeloid leukemia associated with myelodysplasia. , 3) treatment-related acute myeloid leukemia, 4) unclassified acute myeloid leukemia, and 5) myeloid sarcoma.
  • WHO World Health Organization
  • leukemia and thrombocytopenia caused by damage to normal hematopoietic stem cells accompanying chemotherapy are life-threatening serious infection or bleeding complications and leukemia recurrence due to drug resistance. It is still a major barrier to leukemia treatment.
  • 27-hydroxycholesterol inhibits the proliferation of hematopoietic stem cells by increasing active oxygen in hematopoietic stem cells and activating chain endoplasmic reticulum stretch, which is important for apoptosis of hematological cancer cells. It was confirmed that apoptosis of blood cancer cells could be enhanced by activating the IRE1a, eIF2a, and CHOP signaling pathways, and the present invention was completed based on the applicability to the treatment of myelogenous leukemia.
  • the present invention has been made in consideration of the above problems, and an object of the present invention is for preventing or treating myeloid leukemia (ML) comprising 27-hydroxycholesterol or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. It is intended to provide a pharmaceutical composition.
  • ML myeloid leukemia
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating myeloid leukemia (ML), comprising administering 27-hydroxycholerol to a subject in need thereof.
  • ML myeloid leukemia
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating myeloid leukemia (ML) comprising 27-hydroxycholesterol or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • ML myeloid leukemia
  • the 27-hydroxycholesterol may inhibit the proliferation of hematopoietic stem cells.
  • the inhibition of proliferation of hematopoietic stem cells may be due to endoplasmic reticulum (ER) stress caused by generation of reactive oxygen species (ROS).
  • ER endoplasmic reticulum
  • ROS reactive oxygen species
  • the 27-hydroxycholesterol may induce apoptosis of blood cancer cells.
  • Apoptosis of the hematological cancer cells is endoplasmic reticulum caused by increased expression of one or more genes selected from the group consisting of IRE1 ⁇ (inositolrequiring kinase 1 ⁇ ), Elf2 ⁇ (eukaryotic translation initiation factor 2 ⁇ ) and CHOP (C/EBP homologous protein) (endoplasmic reticulum, ER) It may be caused by stress.
  • IRE1 ⁇ inositolrequiring kinase 1 ⁇
  • Elf2 ⁇ eukaryotic translation initiation factor 2 ⁇
  • CHOP C/EBP homologous protein
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving myeloid leukemia (ML) comprising 27-hydroxycholesterol or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • ML myeloid leukemia
  • the present invention provides a feed composition for preventing or improving myeloid leukemia (ML) comprising 27-hydroxycholesterol or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • ML myeloid leukemia
  • the present invention provides a cosmetic composition for preventing or improving myeloid leukemia (ML) comprising 27-hydroxycholesterol or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • ML myeloid leukemia
  • the present invention provides an anticancer adjuvant for the treatment of myeloid leukemia (ML) comprising 27-hydroxycholesterol or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • ML myeloid leukemia
  • the present invention provides a method for preventing or treating myeloid leukemia (ML), comprising administering 27-hydroxycholerol to a subject in need thereof.
  • ML myeloid leukemia
  • 27-hydroxycholesterol inhibits the proliferation of hematopoietic stem cells by increasing the reactive oxygen species of these hematopoietic stem cells and activating the chain endoplasmic reticulum stretch, and IRE1a, which is important for apoptosis of hematological cancer cells.
  • eIF2a, and CHOP signaling pathways can be activated to promote apoptosis of blood cancer cells, so it can be widely used in various fields of medicine, food, cosmetics, and feed for the prevention, improvement, or treatment of myelogenous leukemia.
  • Figure 1 is a result of confirming the reduction effect of 27-hydroxycholesterol on hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC), (a) of LKS cells, hematopoietic progenitor cells (HPC), and hematopoietic stem cells (HSC) As a result of flow cytometry showing the ratio, (b) Lin - Sca1 + cKit + cells (LKS), hematopoietic progenitor cells (Lin - Sca1 + cKit + CD48 + ) according to treatment of 27-hydroxycholesterol in bone marrow cells (BM cells) , A graph confirming the change in the ratio of hematopoietic stem cells (Lin - Sca1 + cKit + CD150 + CD48 - ), (c) common myeloid progenitor cells (CMP), granulocyte macrophage progenitor cells (GMP), megakaryocytic erythroid progenitor cells (ME
  • HSPC hematopoietic stem and progenitor cells
  • ROS reactive oxygen species
  • Figure 3 is a result of confirming the effect of 27-hydroxycholesterol on the growth of leukemia cells in vitro , (a) changes in the number of myeloid leukemia cells (HL60, KG1a, K562 cells) according to 27-hydroxycholesterol treatment Graph confirming [Con (negative control): HEK293T cells], (b) flow cytometry showing the cell death rate of myelogenous leukemia cells (HL60, KG1a, K562 cells) according to 27-hydroxycholesterol treatment, and (c) A graph showing the increase in apoptosis in 27-hydroxycholesterol-treated myeloid leukemia cells (HL60, KG1a, K562 cells) compared to control cells
  • Figure 4 is a result of confirming the effect of 27-hydroxycholesterol on the growth of leukemia cells in vitro .
  • ROS Reactive oxygen species
  • FIG. 4 shows the effect of 27-hydroxycholesterol on the growth of leukemia cells in vitro .
  • (d) myeloid leukemia cells treated with 27-hydroxycholesterol (HL60 cells) compared to control cells , KG1a, K562 cells) is a graph showing the ratio of differentiation (CD11b + )
  • Figure 5 is a result of confirming the effect of 27-hydroxycholesterol on the growth of leukemia cells in vitro , (a) Western confirming the increase in the ER stress response pathway in THP1 cells of 27-hydroxycholesterol Blot image, and (b) a schematic diagram showing the apoptosis inducing mechanism of 27-hydroxycholesterol.
  • Figure 6 is a result of confirming the gene expression level according to 27-hydroxycholesterol treatment, (a) Er ⁇ gene expression level related to cancer cell growth in LKS cells and hematopoietic progenitor cells (HPC) according to 27-hydroxycholesterol treatment The graph shown, (b) a graph showing the Bax gene expression level associated with cell death in LKS cells and hematopoietic progenitor cells (HPC) according to 27-hydroxycholesterol treatment, and (c) LKS according to 27-hydroxycholesterol treatment It is a graph showing the expression levels of Chop, Ire1 ⁇ , and Xbp1s genes related to endoplasmic reticulum stress in cells and hematopoietic progenitor cells (HPC).
  • HPC hematopoietic progenitor cells
  • Figure 7 is an in vivo experiment result according to mouse injection of 27-hydroxycholesterol,
  • Lin - Sca1 + cKit + cells LLS
  • HSC hematopoietic stem cells
  • Figure 8 is a graph comparing the growth of leukemia cells between 27-hydroxycholesterol and 7 ⁇ -hydroxycholesterol in (a) HL60 cells, (b) K562 cells, and (c) HEK293T cells.
  • Figure 10 is the result of RNA-sequence analysis of acute myeloid leukemia datasheet GSE116256, (a) a graph showing survival curves related to CYP7B1 expression based on acute myeloid leukemia datasheet GSE12417, (b) acute myeloid leukemia patients (AML) and a graph showing the expression of CYP7B1 in bone marrow cells from healthy donors (Healthy), (c) a graph showing hematopoietic cell composition analysis of acute myeloid leukemia patients (AML) and healthy donors (Healthy), (d) acute myeloid leukemia patients A graph confirming the expression level of CYP7B1 in all malignant cells, hematopoietic stem cells (HSC), dendritic cells (cDC), and monocytes (mono), (e) Differential correlation with CYP7B1 in normal and malignant hematopoietic stem cells (HSC) (f) biological processes of genes differentially correlated with CYP7B
  • Figure 11 is a result of confirming the effect of reducing hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) of 27-hydroxycholesterol, (a) LK cells, LKS cells, hematopoietic progenitor cells (HPC), hematopoietic stem cells ( HSC), (b) LK cells, LKS cells, hematopoietic progenitor cells (HPC), hematopoietic stem cells (HSC), monocytes (CD11b + ), neutrophils (CD11b + Gr1 + ), B Cells (B220 + ), T cells (CD3 + ) A graph showing the effect according to the concentration, and (c) a graph showing the reduction effect on cKit + cells and CD48 + cells.
  • HPC hematopoietic stem and progenitor cells
  • FIG. 12 is a schematic diagram showing a signal transduction pathway that induces apoptosis of blood cancer cells.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating myeloid leukemia (ML) comprising 27-hydroxycholesterol (27-HC) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • ML myeloid leukemia
  • 27-HC 27-hydroxycholesterol
  • the 27-hydroxycholesterol may be a compound represented by Formula 1 below.
  • 27-Hydroxycholesterol is an endogenous oxysterol with various biological functions, including activity as a selective estrogen receptor modulator (SERM) and agonist of the liver X receptor (LXR), known as a metabolite of cholesterol produced by the enzyme CYP27A1 .
  • SERM selective estrogen receptor modulator
  • LXR liver X receptor
  • the 27-hydroxycholesterol may inhibit the proliferation of hematopoietic stem cells.
  • the suppression of the proliferation of hematopoietic stem cells may be due to endoplasmic reticulum (ER) stress caused by the production of reactive oxygen species (ROS).
  • ER endoplasmic reticulum
  • ROS reactive oxygen species
  • the 27-hydroxycholesterol induces apoptosis of blood cancer cells, inhibits the stemness of blood cancer stem cells, or inhibits the blood cancer cells or cancer cells. It may be to inhibit the metastasis of stem cells.
  • apoptosis of the blood cancer cells is caused by an increase in the expression of one or more genes selected from the group consisting of IRE1 ⁇ (inositolrequiring kinase 1 ⁇ ), Elf2 ⁇ (eukaryotic translation initiation factor 2 ⁇ ), and CHOP (C/EBP homologous protein). It may be due to induced endoplasmic reticulum (ER) stress. More specifically, the apoptosis may be caused by activation of IRE1a, eIF2a, and CHOP signaling pathways. This will be described in detail with reference to FIG. 12 .
  • endoplasmic reticulum there are two types of endoplasmic reticulum: a rough endoplasmic reticulum with ribosomes and a smooth endoplasmic reticulum without ribosomes.
  • RNA is converted into protein through various processes.
  • the endoplasmic reticulum function is impaired. This condition is called endoplasmic reticulum stress.
  • endoplasmic reticulum stress occurs, cells have defense mechanisms to survive.
  • IRE1 ⁇ activates XBP1 to induce apoptosis
  • PERK and ATF-6 activates elF2 ⁇ , ATF-4 and ATF-6, respectively, and activates CHOP, thereby inducing apoptosis.
  • the concentration of 27-hydroxycholesterol or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be 1 to 20 ⁇ M, 1 to 10 ⁇ M, 3 to 9 ⁇ M, or 5 to 7 ⁇ M.
  • the concentration of 27-hydroxycholesterol or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be 1 to 20 ⁇ M, 1 to 10 ⁇ M, 3 to 9 ⁇ M, or 5 to 7 ⁇ M.
  • the present invention provides a method for inducing apoptosis comprising contacting myeloid leukemia cells with 27-hydroxycholesterol or a pharmaceutically acceptable salt thereof in vitro or ex vivo .
  • the present invention is directed to increasing reactive oxygen species, which includes contacting myeloid leukemia cells with 27-hydroxycholesterol or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in vitro or ex vivo. provides a way
  • the present invention promotes the proliferation of hematopoietic stem cells, including the step of contacting myeloid leukemia cells with 27-hydroxycholesterol or a pharmaceutically acceptable salt thereof in vitro or ex vivo. Provides a way to suppress.
  • the concentration of 27-hydroxycholesterol or a pharmaceutically acceptable salt thereof contacted with myeloid leukemia cells is in the range of 1 to 10. 20 ⁇ M, 1 to 10 ⁇ M, 3 to 9 ⁇ M, or 5 to 7 ⁇ M. Within the above range, there is an effect of further improving apoptosis inducing ability, reactive oxygen species generating ability, and hematopoietic stem cell proliferation inhibition ability by 27-hydroxycholesterol.
  • prevention used in the present invention refers to all activities that delay the progression of myeloid leukemia by inhibiting the proliferation of hematopoietic stem cells or inducing apoptosis of hematological cancer cells by administration of the composition of the present invention.
  • treatment refers to all activities that improve or beneficially change myeloid leukemia by inhibiting the proliferation of hematopoietic stem cells or inducing apoptosis of hematological cancer cells by administration of the composition of the present invention. Means an attempt to obtain a useful or desirable result, including a result.
  • a useful or desirable clinical outcome is alleviation or amelioration of one or more symptoms or conditions, reduction of disease extent, stabilization of disease state, inhibition of disease occurrence, inhibition of disease spread, delay or slowing of disease progression. , delay or slowing of disease onset, improvement or alleviation of disease state, and reduction (partial or total), but are not necessarily limited thereto.
  • treatment may mean prolonging the survival of a patient beyond what would be predicted in the absence of treatment.
  • treatment may refer to inhibition of disease progression, temporary slowing of disease progression, and more preferably relates to stopping the progression of a disease forever. In the present invention, preferably, it may mean improving the survival of a patient by promoting a blood vessel, in particular, myeloid leukemia.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated and used in the form of oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories and sterile injection solutions according to conventional methods, respectively.
  • Carriers, excipients, and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, and cellulose.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations include at least one excipient in the compound of the present invention, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, It is prepared by mixing gelatin, etc.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, solutions for oral use, emulsions, syrups, etc.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, and preservatives may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspensions.
  • injectable esters such as ethyl oleate
  • a base for the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogeratin and the like may be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention will vary depending on the age, sex, and weight of the subject to be treated, the specific disease or pathological condition to be treated, the severity of the disease or pathological condition, the route of administration, and the judgment of the prescriber. Determination of dosage based on these factors is within the level of those skilled in the art, and generally dosages range from 0.01 mg/kg/day to approximately 2000 mg/kg/day. A more preferred dosage is 0.1 mg/kg/day to 1000 mg/kg/day. Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses. The dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals such as rats, livestock, and humans through various routes. All modes of administration are contemplated, eg oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine intrathecal or intracerebrovascular injection.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating myelogenous leukemia may further include, in addition to the active ingredient, any compound or natural extract whose safety has already been verified and is known to have anticancer activity for enhancement and reinforcement of anticancer effect.
  • the present invention provides a food composition or health functional food composition for preventing or improving myeloid leukemia (ML) comprising 27-hydroxycholesterol or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • ML myeloid leukemia
  • the food or health functional food composition may further include additives selected from the group consisting of flavoring agents, flavoring agents, coloring agents, fillers, stabilizers, natural carbohydrates, nutrients, vitamins, thickeners, pH adjusting agents, preservatives, and mixtures thereof.
  • additives selected from the group consisting of flavoring agents, flavoring agents, coloring agents, fillers, stabilizers, natural carbohydrates, nutrients, vitamins, thickeners, pH adjusting agents, preservatives, and mixtures thereof.
  • the food composition of the present invention includes all forms such as functional food, nutritional supplement, health food and food additives.
  • Food compositions of this type can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
  • the composition itself can be prepared and consumed in the form of tea, juice, or drink, or can be consumed after being granulated, encapsulated, or powdered.
  • functional foods include beverages (including alcoholic beverages), fruits and their processed foods (e.g., canned fruit, bottled fruit, jam, marmalade, etc.), fish, meat, and their processed foods (e.g., ham, sausage, corned beef, etc.), Bread and noodles (e.g. udon, buckwheat noodles, ramen, spaghetti, macaroni, etc.), fruit juice, various drinks, cookies, taffy, dairy products (e.g.
  • composition of the present invention in the form of a food additive, it can be prepared and used in the form of a powder or concentrate.
  • the preferred content of 27-hydroxycholesterol in the food composition of the present invention may be 0.001 to 50%, preferably 0.01 to 30%, based on the total weight of the food composition.
  • the health functional food composition of the present invention can be prepared in general formulations such as tablets, pills, granules, powders, liquids, hard capsules, soft capsules, etc., porridge, bread, beverages, bars, It can be made in any form, such as chocolate, cookies, tea, drinks, vitamin complexes, meat, sausages, candies, noodles, and jellies.
  • food acceptable carriers or additives such as the above-mentioned excipients may be used, and known to be usable in the art for the preparation of the formulation or form to be prepared. Any carrier or additive may be used.
  • the present invention provides a feed composition for preventing or improving myeloid leukemia (ML) comprising 27-hydroxycholesterol or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • ML myeloid leukemia
  • the feed composition may additionally include known feed supplements, food additives or feed additives, and fermented feed, formulated feed, pellet form and silage, etc. can be made in the form
  • the present invention provides a cosmetic composition for preventing or improving myeloid leukemia (ML) comprising 27-hydroxycholesterol or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • ML myeloid leukemia
  • the cosmetic composition may include without limitation ingredients commonly accepted in addition to the active ingredient, such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, and pigments. and conventional adjuvants such as perfumes, and carriers.
  • the cosmetic composition may be interpreted as including various materials for skin health without limitation.
  • the present invention provides an adjuvant for the treatment of myeloid leukemia (ML) comprising 27-hydroxycholesterol or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • ML myeloid leukemia
  • the term "adjuvant for myeloid leukemia treatment” refers to a composition that synergistically increases the effect of anticancer treatment by preventing side effects caused by the anticancer agent when applied in parallel with treatment with an anticancer agent. Therefore, the adjuvant for treatment is an anticancer adjuvant and can be administered simultaneously or sequentially with an anticancer agent.
  • anticancer agent that can be used together with the myelogenous leukemia treatment adjuvant of the present invention is not particularly limited.
  • Anticancer agents can be selected based on general principles that are considered when selecting an anticancer agent, such as the type of cancer cell, the rate of absorption of the anticancer agent (treatment period and route of administration of the anticancer agent), the location of the tumor, and the size of the tumor.
  • the present invention provides a method for preventing or treating myeloid leukemia (ML), comprising administering 27-hydroxycholerol to a subject in need thereof.
  • ML myeloid leukemia
  • the term "individual” refers to a subject for hemostasis, and more specifically, may refer to a human or non-human primate, mouse, dog, cat, horse, cow, etc. mammal, It is not limited to this.
  • Bone marrow was extracted from the tibia and femur of rats using FACS staining buffer (phosphate-buffered saline, 2% FBS, penicillin/streptomycin), and then erythrocytes were lysed with ACK lysis buffer to extract bone marrow cells with 0.62 ⁇ M or 6.2 ⁇ M 27-hydroxy cholesterol was treated for 24 or 48 hours. After treatment, the cells were analyzed with FACSCanto2 equipment by attaching antibodies. As a result, the effect of 27-hydroxycholesterol on reducing hematopoietic stem progenitor cells (HSPC) was confirmed, and shown in FIGS. 1 and 11 [Con: mouse bone marrow cells not treated with anything, Chol: mouse bone marrow cells treated with cholesterol, 27HC: murine bone marrow cells treated with 27-hydroxycholesterol].
  • FACS staining buffer phosphate-buffered saline, 2% FBS, penicillin/streptomycin
  • Bone marrow cells were extracted from the tibia and femur of rats and treated with 6.2 ⁇ M 27-hydroxy cholesterol for 48 hours. To confirm apoptosis, cells treated with 27-hydroxycholesterol were collected, released in 1x Annexin binding buffer, analyzed with FACScanto2 equipment by adding Annexin V and 7AAD, and cells were analyzed with FACS staining buffer to confirm reactive oxygen species After dissolving and adding DCFDA, it was stained at 37°C for 30 minutes and ground with FACScanto2 equipment. As a result, the cell death and reactive oxygen species increasing effects of 27-hydroxycholesterol in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) were confirmed, and are shown in FIG. 2 [Con or Ctrl: mouse bone marrow cells not treated with anything, Chol: rat bone marrow cells treated with cholesterol, 27HC: rat bone marrow cells treated with 27-hydroxycholesterol].
  • HSPC hematopoietic stem and progenit
  • ROS reactive oxygen species
  • 27-hydroxycholesterol increased apoptosis of the leukemia cell line (27HC) to decrease the number of cells compared to cells that were not treated with anything (Con) and cholesterol-treated leukemia cell line (Chol).
  • FIG. [Con: leukemia cell line treated with nothing, Chol: leukemia cell line treated with cholesterol, 27HC: leukemia cell line treated with 27-hydroxycholesterol].
  • FIG. 3A it can be seen that the number of myeloid leukemia cells (HL60, KG1a, K562 cells) was significantly reduced as compared to the number of HEK293T cells, a negative control group, as the cells were treated with 27-hydroxycholesterol.
  • the myelogenous leukemia cells (HL60, KG1a, K562 cells) treated with 27-hydroxycholesterol showed an increase in reactive oxygen species compared to control cells.
  • FIGS. 4C and 4D it can be seen that the differentiation (CD11b+) of the myeloid leukemia cells (HL60, KG1a, K562 cells) treated with 27-hydroxycholesterol was increased compared to the control cells.
  • 27-hydroxycholesterol increases apoptosis and reactive oxygen species in hematopoietic stem/progenitor cells. Specifically, referring to the apoptosis induction mechanism of 27-hydroxycholesterol in FIG. 5B , it can be confirmed that 27-hydroxycholesterol increases the ROS response and induces apoptosis through the endoplasmic reticulum stress response pathway.
  • Bone marrow cells were extracted from the tibia and femur of rats and treated with 6.2 ⁇ M 27-hydroxy cholesterol for 48 hours. After treatment, PE-Cy5-CD3, PE-Cy5-CD4, PE-Cy5-CD8, PE-Cy5-CD19, PE-Cy5-B220, PE-Cy5-GR1, PE-Cy5-Ter119, PE-Sca1, APC- After adding cKit, PE-Cy7-CD150, and APC-Cy7-CD48 antibodies and staining at 4°C for 30 minutes, LKS (Lin - Sca1 + cKit + ) and hematopoietic progenitor cells (Lin - Sca1 + cKit + CD48 + ) were stained using FACSAria.
  • RNA was extracted from the cells using an RNA extraction kit, and cDNA was synthesized from RNA using a cDNA synthesis kit.
  • the synthesized cDNA was subjected to qRT-PCR using primers related to apoptosis and endoplasmic reticulum stress and SYBR-green. As a result, it was confirmed that expression of genes related to apoptosis and endoplasmic reticulum stress increased with 27-hydroxycholesterol treatment in LKS and hematopoietic progenitor cells, which are immature cells, than in whole bone marrow cells, as shown in FIG. 6 .
  • HL60 an acute myeloid leukemia cell line, and K562, a chronic myeloid leukemia cell line, were treated with 6.2 ⁇ M cholesterol, 7 ⁇ -hydroxycholesterol, and 27-hydroxycholesterol for 48 hours, and then stained with trypan blue to determine the number of cells.
  • 7 ⁇ -hydroxycholesterol did not have a significant effect on the number of leukemia cell lines, and it was confirmed that 27-hydroxycholesterol reduced the number of leukemia cell lines, as shown in FIG. 8 [Con: Leukemia cell line not treated with anything, Chol: leukemia cell line treated with cholesterol, 27HC: leukemia cell line treated with 27-hydroxycholesterol, 7aHC: leukemia cell line treated with 7 ⁇ -hydroxycholesterol].
  • the growth of leukemia cells was inhibited in the group treated with 27-hydroxycholesterol (27HC), whereas the group treated with 7 ⁇ -hydroxycholesterol (7aHC) It can be confirmed that the growth inhibitory effect of leukemia cells (HL60 cells, K562 cells) is insignificant.
  • Bone marrow cells were taken out ex vivo and treated with 6.2 ⁇ M 27-hydroxycholesterol (27-HC), followed by bone marrow transplantation.
  • bone marrow cells were extracted from the tibia and femur of a donor CD45.1 mouse and then treated with vehicle, 6.2 ⁇ M of cholesterol and 6.2 ⁇ M of 27-hydroxycholesterol for 48 hours. Then, bone marrow transplantation was performed by mixing with bone marrow cells of CD45.2 mice at a ratio of 1:1 and injecting into the tail vein of recipient CD45.2 mice irradiated with 4 Gy. One month later, blood was extracted from the veins of the recipient rats that had undergone bone marrow transplantation, and the cell ratio of the donor rats was analyzed.
  • RNA sequencing was performed using bone marrow cells from healthy donors and acute myeloid leukemia patients to confirm cell composition and genetic changes for differential expression of CYP7B1, a metabolic enzyme of 27-hydroxycholesterol. The results are shown in FIG. showed up
  • the viability was analyzed according to the expression of CYP7B1, a metabolic enzyme that consumes 27-hydroxycholesterol, and the higher the CYP7B1, the lower the survival rate.
  • the GSE116256 datasheet was analyzed and classified into 6 cell types.
  • the acute myeloid leukemia patient is a dendritic cell (cDC)
  • cDC dendritic cell
  • the ratio of normal cells (normal) and malignant cells (malignant) by cell type in patients with acute myeloid leukemia (AML) has a high ratio of dendritic cells (cDC) and progenitor cells (Prog) in malignant cells. can confirm.
  • CYP7B1 is high in all malignant cells, hematopoietic stem cells (HSC), progenitor cells (Prog), and dendritic cells (cDC) of acute myeloid leukemia patients.
  • HSC hematopoietic stem cells
  • Prog progenitor cells
  • cDC dendritic cells
  • the pharmaceutical composition containing 27-hydroxycholesterol according to the present invention inhibits proliferation of hematopoietic stem cells and apoptosis of hematological cancer cells by activating chain endoplasmic reticulum stretch by increasing active oxygen in hematopoietic stem cells. It was confirmed that by activating IRE1a, eIF2a, and CHOP signaling pathways, which are important for apoptosis, apoptosis of blood cancer cells can be promoted, and as a result, myeloid leukemia can be prevented, improved, or treated.

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Abstract

본 발명은 27-하이드록시콜레스테롤을 포함하는 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 조혈줄기세포의 활성산소를 증가시켜 연쇄적 소포체 스트레트를 활성화시킴으로써 조혈줄기세포의 증식을 억제하고, 혈액암 세포의 세포사멸(apoptosis)에 중요한 IRE1a, eIF2a, CHOP 신호전달 경로를 활성화함으로써 혈액암 세포의 세포사멸을 증진시킨 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

27-하이드록시콜레스테롤을 포함하는 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 27-하이드록시콜레스테롤을 포함하는 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
백혈병(leukemia)은 백혈구가 종양성으로 증식하는 질환을 총칭한다. 백혈병 종류는 백혈병이 기원하는 백혈구에 따라 골수성 백혈병과 림프성 백혈병으로 분류되고, 진행속도에 따라 급성 백혈병과 만성 백혈병으로 나뉜다. 백혈병의 임상양상은 질환의 유형과 침범된 세포의 성질에 따라 다양하다. 림프성 백혈병은 림프파계 혈액세포가, 골수성 백혈병은 골수계 혈액세포가, 그리고 만성 골수성 백혈병은 성숙기에 있는 세포가 변이해서 발생하며, 급성 골수성 백혈병은 비교적 초기단계의 조혈과정에서 분화를 시작하는 골수계 모세포의 장애로 초래된다.
이 중 급성 골수성 백혈병(Acute myeloid leukemia: AML)은 정상적인 백혈구의 생산을 방해하는 비정상적인 백혈병 세포가 적색 골수에서 생성, 축적되는 혈액암으로, 주로 성인, 고령자에게서 발병하며, 전체 급성 백혈병의 약 70%를 차지하는 것으로 알려져 있다. AML의 증상은 정상 골수가 백혈병 세포로 가득 차면서 혈구(적혈구, 혈소판, 정상 백혈구)의 수가 급감함으로써 나타난다. 주 증상은 피로감, 가쁜 호흡, 쉽게 멍이나 출혈이 일어나며 감염이 빈번하게 일어나는 것 등이다. AML의 원인으로 추정되는 여러가지 것들이 확인되었지만 확실한 AML의 원인은 밝혀지지 않았다. 급성 골수성 백혈병은 현재 세포유전학적 이상과 같은 임상적으로 더욱 중요한 정보를 포함하고 있는 세계보건기구(WHO)의 분류법을 사용하며 1) 유전적으로 비정상적인 급성 골수성 백혈병, 2) 골수이형성증과 관련된 급성 골수성 백혈병, 3) 치료와 관련된 급성 골수성 백혈병, 4) 분류가 되지 않는 급성 골수성 백혈병, 5) 골수성 육종으로 세분된다. 급성 골수성 백혈병으로 진단되면 항암 치료를 받게 되는데, 먼저 항암제를 이용한 완전 관해를 유도한다. 완전 관해란, 암 세포가 완전히 사라지는 단계이며, 부분 관해는 암 세포가 50% 이상 사라진 상태를 의미한다. 환자에게 항암제를 투여하면 골수에 있는 백혈병 세포가 사멸하게 되고, 동시에 정상 세포도 일시적 손상을 입어 빈혈과 혈소판 감소가 나타나며, 백혈구의 감소로 면역 능력이 급격하게 저하되어 외부로부터의 감염 위험이 증가하는 경우가 생긴다. 항암제에 의한 항암 치료가 끝나면 골수에서 백혈병 세포가 사라지고 정상 세포가 다시 골수에서 재생되어, 혈액 소견이 정상이 되면 완전 관해에 이르게 된다.
이러한 백혈병을 치료하기 위한 노력은 전 세계적으로 계속되고 있으나, 항암 치료 시 수반되는 정상 조혈모세포의 손상에 의한 백혈구감소, 혈소판 감소는 생명을 위협하는 심각한 감염 또는 출혈 합병증과 약제 내성에 의한 백혈병 재발은 여전히 백혈병 치료의 큰 장벽이다.
이에, 본 발명의 발명자들은 27-하이드록시콜레스테롤이 조혈줄기세포의 활성산소를 증가시켜 연쇄적 소포체 스트레트를 활성화시킴으로써 조혈줄기세포의 증식을 억제하고, 혈액암 세포의 세포사멸(apoptosis)에 중요한 IRE1a, eIF2a, CHOP 신호전달 경로를 활성화함으로써 혈액암 세포의 세포사멸을 증진시킬 수 있음을 확인하고, 골수성 백혈병의 치료에 응용할 수 있음에 착안하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 고려하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 27-하이드록시콜레롤을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML)의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 27-하이드록시콜레스테롤은 조혈줄기세포의 증식을 억제하는 것일 수 있다.
상기 조혈줄기세포의 증식 억제는 활성산소종(ROS) 생성에 의한 소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 스트레스에 의한 것일 수 있다.
상기 27-하이드록시콜레스테롤은 혈액암 세포의 세포사멸(apoptosis)를 유도하는 것일 수 있다.
상기 혈액암 세포의 세포사멸은 IRE1α(inositolrequiring kinase 1α), Elf2α(eukaryotic translation initiation factor 2α) 및 CHOP(C/EBP homologous protein)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현 증가로 인하여 유발되는 소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 스트레스에 의한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML) 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML) 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML) 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML) 치료용 항암 보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 27-하이드록시콜레롤을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML)의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 27-하이드록시콜레스테롤은 이 조혈줄기세포의 활성산소를 증가시켜 연쇄적 소포체 스트레트를 활성화시킴으로써 조혈줄기세포의 증식을 억제하고, 혈액암 세포의 세포사멸(apoptosis)에 중요한 IRE1a, eIF2a, CHOP 신호전달 경로를 활성화함으로써 혈액암 세포의 세포사멸을 증진시킬 수 있으므로, 골수성 백혈병의 예방, 개선 또는 치료를 위한 다양한 의약, 식품, 화장료 사료 분야에 널리 활용될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 27-하이드록시콜레스테롤의 조혈줄기·전구세포(hematopoietic stem and progenitor cells, HSPC) 감소효과를 확인한 결과로, (a) LKS 세포, 조혈전구세포 (HPC), 조혈줄기세포 (HSC)의 비율을 나타낸 유세포분석 결과, (b) 골수 세포(BM cell)에 27-하이드록시콜레스테롤의 처리에 따른 Lin-Sca1+cKit+ 세포 (LKS), 조혈전구세포 (Lin-Sca1+cKit+CD48+), 조혈줄기세포 (Lin-Sca1+cKit+CD150+CD48-)의 비율 변화를 확인한 그래프, (c) 공통 골수성 전구 세포 (CMP), 과립구 대식 전구 세포 (GMP), 거대핵 적혈구 전구 세포 (MEP), 공통 림프구성 전구 세포 (CLP)의 비율을 나타낸 유세포분석 결과, (d) 골수 세포에 27-하이드록시콜레스테롤의 처리에 따른 공통 골수성 전구 세포 (Lin-Sca1-cKit+CD34+CD16/32-), 과립구 대식 전구 세포 (Lin-Sca1-cKit+CD34+CD16/32+), 거대핵 적혈구 전구 세포 (Lin-Sca1-cKit+CD34-CD16/32-), 공통 림프구성 전구 세포 (Lin- Sca1lowcKitlow CD127+)의 비율 변화를 확인한 그래프, (e) 단핵구 (Monocyte), 중성구 (Neutrophil), B 세포 (B cell), T 세포 (T cell)의 비율을 나타낸 유세포분석 결과, 및 (f) 골수 세포에 27-하이드록시콜레스테롤의 처리에 따른 단핵구 (CD11b+), 중성구 (CD11b+Gr1+), B 세포 (B220+), T 세포 (CD3+) 비율 변화를 확인한 그래프이다.
도 2는 27-하이드록시콜레스테롤의 조혈줄기·전구세포 (HSPC)에서의 세포사멸 (apoptosis) 및 활성산소종 (ROS, reacitve oxygen species) 증가효과를 확인한 결과로, (a) LK 세포, LKS 세포, 조혈전구세포 (HPC), 조혈줄기세포 (HSC)의 세포사멸 비율을 나타낸 유세포분석 결과, (b) 대조군 세포 대비 27-하이드록시콜레스테롤이 처리된 LK 세포, LKS 세포, 조혈전구세포 (HPC), 조혈줄기세포 (HSC)에서의 세포사멸 증가 비율을 나타낸 그래프, (c) LK 세포, LKS 세포, 조혈전구세포 (HPC), 조혈줄기세포 (HSC)의 활성산소종 비율을 나타낸 유세포분석 결과, (d) 대조군 세포 대비 27-하이드록시콜레스테롤이 처리된 LK 세포, LKS 세포, 조혈전구세포 (HPC), 조혈줄기세포 (HSC)에서의 활성산소종 증가 비율을 나타낸 그래프, (e) 27-하이드록시콜레스테롤에 의해 증가된 LKS 세포, 조혈전구세포 (HPC), 조혈줄기세포 (HSC)의 활성 산소종 (ROS)의, N-acetylcysteine (NAC)에 의한 감소 효과를 나타낸 그래프 및 (f) 27-하이드록시콜레스테롤에 의한 LKS 세포, 조혈전구세포 (HPC), 조혈줄기세포 (HSC)의 비율 감소에 대한, N-acetylcysteine (NAC)에 의한 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 27-하이드록시콜레스테롤이 in vitro에서의 백혈병 세포 성장에 미치는 영향를 확인한 결과로, (a) 27-하이드록시콜레스테롤 처리에 따른 골수성 백혈병 세포(HL60, KG1a, K562 세포)의 세포 수를 변화를 확인한 그래프[Con(음성 대조군): HEK293T 세포], (b) 27-하이드록시콜레스테롤 처리에 따른 골수성 백혈병 세포(HL60, KG1a, K562 세포)의 세포 사멸 비율을 보여주는 유세포분석 결과, 및 (c) 대조군 세포 대비 27-하이드록시콜레스테롤이 처리된 골수성 백혈병 세포(HL60, KG1a, K562 세포)에서의 세포사멸 증가 비율을 나타낸 그래프이다
도 4는 27-하이드록시콜레스테롤이 in vitro에서의 백혈병 세포 성장에 미치는 영향를 확인한 결과로, (a) 27-하이드록시콜레스테롤을 처리한 골수성 백혈병 세포(HL60, KG1a, K562 세포)의 활성산소 종(ROS) 비율을 보여주는 유세포분석 결과, (b) 대조군 세포 대비 27-하이드록시콜레스테롤이 처리된 골수성 백혈병 세포(HL60, KG1a, K562 세포)에서의 활성산소종 증가 비율을 나타낸 그래프, (c) 27-하이드록시콜레스테롤 처리에 따른 골수성 백혈병 세포(HL60, KG1a, K562 세포)의 분화 (CD11b+) 비율을 보여주는 유세포분석 결과, 및 (d) 대조군 세포 대비 27-하이드록시콜레스테롤이 처리된 골수성 백혈병 세포(HL60, KG1a, K562 세포) 분화 (CD11b+) 비율을 나타낸 그래프이다
도 5는 27-하이드록시콜레스테롤이 in vitro에서의 백혈병 세포 성장에 미치는 영향를 확인한 결과로, (a) 27-하이드록시콜레스테롤의 THP1 세포에서의 소포체 스트레스 반응 경로(ER stress response pathway) 증가를 확인한 웨스턴블랏 이미지, 및 (b) 27-하이드록시콜레스테롤의 세포자멸사 유도 메커니즘을 나타낸 모식도이다.
도 6은 27-하이드록시콜레스테롤 처리에 따른 유전자 발현 수준을 확인한 결과로, (a) 27-하이드록시콜레스테롤 처리에 따른 LKS 세포와 조혈 전구 세포(HPC)에서의 암세포 성장과 관련된 Erα 유전자 발현 수준을 나타낸 그래프, (b) 27-하이드록시콜레스테롤 처리에 따른 LKS 세포와 조혈 전구 세포(HPC)에서의 세포 사멸과 관련된 Bax 유전자 발현 수준을 나타낸 그래프, 및 (c) 27-하이드록시콜레스테롤 처리에 따른 LKS 세포와 조혈 전구 세포(HPC)에서의 소포체 스트레스와 관련된 Chop, Ire1α, Xbp1s 유전자의 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 7은 27-하이드시콜레스테롤의 마우스 주입에 따른 in vivo 실험 결과로, 마우스 복강 내 27-하이드록시콜레스테롤의 접종에 따른 (a) Lin-Sca1+cKit+ 세포 (LKS), 조혈줄기세포 (HSC, Lin-Sca1+cKit+CD150+CD48-), 조혈전구세포 (HPC, Lin-Sca1+cKit+CD48+), (b) 과립구 대식 전구 세포 (GMP, Lin-Sca1-cKit+CD34+CD16/32+), 공통 골수성 전구 세포 (CMP, Lin-Sca1-cKit+CD34+CD16/32-), 공통 림프구성 전구 세포 (CLP, Lin- Sca1lowcKitlow CD127+), 거대핵 적혈구 전구 세포 (MEP, Lin-Sca1-cKit+CD34-CD16/32-), 및 (c) 단핵구 (monocyte, CD11b+), 중성구 (neutrophil, CD11b+Gr1+), B 세포 (B220+), T 세포 (CD3+)의 비율 변화를 확인한 그래프이다.
도 8은 (a) HL60 세포, (b) K562 세포 및 (c) HEK293T 세포에서 27-하이드록시콜레스테롤과 7α-하이드록시콜레스테롤 사이의 백혈병 세포 성장을 비교한 결과 그래프이다.
도 9는 27-하이드록시콜레스테롤이 ex vivo에서의 조혈줄기세포의 재생능 및 증식에 미치는 영향을 확인한 결과로, (a) 실험과정, (b) 혈액에서 공여자 마우스 CD45.1 세포를 분석한 결과 그래프, (c) 이식 후 수혜자 마우스의 혈액에서 공여자 마우스의 단핵구 (Myelo; CD11b+), B 세포 (B220+), T 세포 (CD3+) 비율을 측정한 결과 그래프, (d) 골수 세포에서 공여자 마우스인 CD45.1 세포를 분석한 결과 그래프, 및 (e) 이식 후 수혜자 마우스의 골수 세포에서 공여자 마우스의 LK 세포, LKS 세포, 조혈전구세포 (HPC), 조혈줄기세포 (HSC) 비율을 측정한 결과 그래프이다.
도 10은 급성 골수성 백혈병 데이터시트 GSE116256의 RNA-sequence 분석 결과로, (a) 급성 골수성 백혈병 데이터시트인 GSE12417을 기반으로 CYP7B1 발현과 관련된 생존 곡선을 나타낸 그래프, (b) 급성 골수성 백혈병 환자(AML)와 건강한 기증자(Healthy)의 골수 세포에서 CYP7B1의 발현을 확인한 결과 그래프, (c) 급성 골수성 백혈병 환자(AML)와 건강한 기증자(Healthy)의 조혈 세포 구성 분석을 나타낸 그래프, (d) 급성 골수성 백혈병 환자의 전체 악성 세포, 조혈줄기세포(HSC), 수지상 세포(cDC), 단핵구(mono)에서 CYP7B1의 발현량을 확인한 그래프, (e) 정상과 악성 조혈줄기세포(HSC)에서 CYP7B1과 차등적으로 상관관계가 있는 유전자의 생물학적 프로세스, 및 (f) 정상과 악성 수지상 세포(cDC)에서 CYP7B1과 차등적으로 상관관계가 있는 유전자의 생물학적 프로세스이다.
도 11은 27-하이드록시콜레스테롤의 조혈줄기·전구세포(hematopoietic stem and progenitor cells, HSPC) 감소효과를 확인한 결과로, (a) LK 세포, LKS 세포, 조혈전구세포 (HPC), 조혈줄기세포 (HSC)에서의 시간에 따른 효과를 나타낸 그래프, (b) LK 세포, LKS 세포, 조혈전구세포 (HPC), 조혈줄기세포 (HSC), 단핵구 (CD11b+), 중성구 (CD11b+Gr1+), B 세포 (B220+), T 세포 (CD3+)에서의 농도에 따른 효과를 나타낸 그래프 및 (c) cKit+ 세포와 CD48+ 세포에 대한 감소효과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 혈액암 세포의 세포사멸(apoptosis)를 유도하는 신호전달 경로를 나타낸 모식도이다.
이하, 본 발명의 실 예를 첨부된 도면들을 참조하여 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명의 실시예는 여러 가지 형태로 변형할 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래의 실시예들로 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 도면에서의 요소의 형상은 보다 명확한 설명을 강조하기 위해 과장되었다.
본 발명은 27-하이드록시콜레스테롤(27-HC) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 27-하이드록시콜레스테롤은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022013934-appb-img-000001
27-하이드록시콜레스테롤은 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM) 및 간 X 수용체(LXR)의 작용제로서의 활성을 포함하여 다양한 생물학적 기능을 갖는 내인성 옥시스테롤로서, 효소 CYP27A1에 의해 생성되는 콜레스테롤의 대사 산물로 알려져 있다. 본 발명에서는 27-하이드록시콜레스테롤이 골수성 백혈병 예방, 개선 또는 치료에 유효함을 확인하여, 27-하이드록시콜레스테롤을 유효성분으로 포함하는 골수성 백혈병 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물로 응용하고자 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 27-하이드록시콜레스테롤은 조혈줄기세포의 증식을 억제하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 조혈줄기세포의 증식 억제는 활성산소종(ROS) 생성에 의한 연쇄적 소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 스트레스에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 27-하이드록시콜레스테롤은 혈액암 세포의 세포사멸(apoptosis)를 유도하거나, 혈액암 줄기세포의 줄기세포능(stemness)을 억제하거나, 상기 혈액암 세포 또는 암 줄기세포의 전이를 억제하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 혈액암 세포의 세포사멸은 IRE1α(inositolrequiring kinase 1α), Elf2α(eukaryotic translation initiation factor 2α) 및 CHOP(C/EBP homologous protein)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현 증가로 인하여 유발되는 소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 스트레스에 의한 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 세포사멸은 IRE1a, eIF2a, CHOP 신호전달 경로의 활성화에 의해 유발되는 것일 수 있다. 이에 대해, 도 12를 참조하여 구체적으로 설명한다.
도 12를 참조하면, 소포체는 리보좀이 붙어있는 조면소포체와 리보좀이 없는 활면소포체 두 가지가 존재한다. 조면소포체에서 RNA가 다양한 과정을 거쳐 단백질로 변환된다. 그러나, 소포체가 처리할 수 있는 능력 이상의 미성숙 단백질이 소포체 내로 유입이 되면 소포체기능에 장애가 발생하는데 이러한 상태를 소포체 스트레스라고 한다. 소포체 스트레스가 발생하면 세포는 생존하기 위한 방어기전을 가진다. 소포체 스트레스가 발생하면 소포체 막에 존재하는 막단백질인 IRE1α, PERK, ATF-6이 세포사멸 경로를 활성화시켜 손상된 세포를 제거한다. 활성화된 IRE1α는 XBP1을 활성화시켜 세포 사멸을 유도하고, PERK와 ATF-6의 활성화는 각각 elF2α, ATF-4와 ATF-6을 활성화시켜 CHOP을 활성화함으로써 세포 사멸을 유도할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 농도는 1 내지 20 μM, 1 내지 10 μM, 3 내지 9 μM, 또는 5 내지 7 μM일 수 있다. 상기 범위 내에서, 27-하이드록시콜레스테롤에 의한 세포사멸 유도능, 활성산소종 생성능 및 조혈줄기세포 증식 억제능이 보다 향상되는 효과가 존재한다.
또한, 본 발명은 시험관내 (in vitro) 또는 생체외 (ex vivo)에서, 골수성 백혈병 세포와 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 접촉시키는 단계를 포함하는 세포사멸을 유도하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 시험관내 (in vitro) 또는 생체외 (ex vivo)에서, 골수성 백혈병 세포와 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 접촉시키는 단계를 포함하는 활성산소종을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 시험관내 (in vitro) 또는 생체외 (ex vivo)에서, 골수성 백혈병 세포와 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 접촉시키는 단계를 포함하는 조혈줄기세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
상기 세포사멸을 유도하는 방법, 활성산소종을 증가시키는 방법 및 조혈줄기세포의 증식을 억제하는 방법에서, 골수성 백혈병 세포와 접촉되는 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 농도는 1 내지 20 μM, 1 내지 10 μM, 3 내지 9 μM, 또는 5 내지 7 μM 일 수 있다. 상기 범위 내에서, 27-하이드록시콜레스테롤에 의한 세포사멸 유도능, 활성산소종 생성능 및 조혈줄기세포 증식 억제능이 보다 향상되는 효과가 존재한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 조혈줄기세포 증식을 억제하거나, 혈액암 세포의 세포사멸을 유도하여 골수성 백혈병의 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 조혈줄기세포 증식을 억제하거나, 혈액암 세포의 세포사멸을 유도하여 골수성 백혈병의 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, 임상적 결과를 포함하는 유용한 결과 또는 바람직한 결과를 얻기 위한 시도를 의미한다. 유용한 또는 바람직한 임상적 결과는 검출 가능하거나 가능하지 않더라도, 하나 이상의 증상 또는 상태의 완화 또는 개선, 질병 범위의 축소, 질병 상태의 안정화, 질병 발생의 억제, 질병 확산의 억제, 질병 진행의 지연 또는 늦춤, 질병 발병의 지연 또는 늦춤, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 감퇴 (부분 또는 전체)를 포함할 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, “치료”는 치료의 부재에서 예측되는 것 이상으로 환자의 생존이 연장되는 것을 의미할 수 있다. 또한, “치료”는 질병 진행의 억제, 일시적으로 질병 진행의 늦춤을 의미할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 질병의 진행을 영원히 정지시키는 것과 관련이 있다. 본 발명에서는 바람직하게는 혈액함, 특히, 골수성 백혈병을 증진시켜 환자의 생존을 향상시키는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 1000㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 유효성분 이외에, 항암 효과의 상승 및 보강을 위하여 이미 안전성이 검증되고 항암 활성을 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML) 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 또는 건강기능식품 조성물은 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제, 천연 탄수화물, 영양제, 비타민제, 증점제, pH 조절제, 방부제 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food)및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 상기 조성물 자체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류, 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등)등에 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품용 조성물 중 27-하이드록시콜레스테롤의 바람직한 함량은 식품용 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50% 일 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 30% 범위로 함유될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 정제, 환제, 과립제, 분말제, 액제, 경질캅셀제, 연질캅셀제 등과 같은 일반적인 제형으로 제조될 수 있으며, 죽, 빵, 음료, 바, 초콜릿, 쿠키, 차, 드링크제, 비타민 복합제, 육류, 소시지, 캔디, 면, 젤리 등과 같은 임의의 형태로 제조될 수 있다.
상기와 같은 여러 제형 또는 형태를 제조하기 위해, 전술한 부형제들과 같은 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 사용할 수 있으며, 제조하고자 하는 제형 또는 형태의 제조에 당해 기술 분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML) 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 27-하이드록시콜레스테롤이 사료 조성물 형태로 제공되는 경우, 상기 사료용 조성물은 공지의 사료 보조제, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 발효사료, 배합사료, 펠렛형태 및 사일리지 등의 형태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML) 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 27-하이드록시콜레스테롤이 화장료 조성물로 제공되는 경우, 상기 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 허용되는 성분들을 제한 없이 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물은 피부 건강을 위한 다양한 소재를 제한없이 포함하는 의미로 해석될 수 있다.
또한, 본 발명은 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML) 치료용 보조제를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "골수성 백혈병 치료용 보조제"는 항암제에 의한 치료와 병행하여 적용 시 상기 항암제에 의한 부작용을 방지하여 항암 치료의 효과를 상승적으로 증가시키는 조성물을 의미한다. 따라서 상기 치료용 보조제는 항암 보조제로 항암제와 함께, 동시에 또는 순차적으로 투여 가능하다.
본 발명의 골수성 백혈병 치료용 보조제와 함께 사용될 수 있는 항암제의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 항암제는 암세포의 종류, 항암제의 흡수 속도(치료기간과 항암제 투여 경로), 종양의 위치, 종양의 크기 등의 항암제 선택 시 고려하는 일반적인 원칙하에 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 27-하이드록시콜레롤을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML)의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, “개체”는 지혈의 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 소 등의 포유류를 의미할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 일 구현예를 이용하여 설명한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에서 설명된 실시예는 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이런 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
실시예 1. 27-하이드록시콜레스테롤의 조혈줄기·전구세포 (hematopoietic stem and progenitor cells, HSPC) 감소 효과 확인
쥐의 정강뼈와 대퇴골에서 FACS staining buffer (phosphate-buffered saline, 2% FBS, penicillin/streptomycin)를 이용하여 골수를 추출한 후 ACK lysis buffer를 통해 적혈구를 용해시켜 골수 세포를 추출하여 0.62 μM 또는 6.2 μM 27-하이드록시 콜레스테롤을 24시간 또는 48시간 처리하였다. 처리 후 항체를 붙여 FACSCanto2 장비로 세포를 분석하였다. 그 결과 27-하이드록시콜레스테롤의 조혈 줄기 전구세포(HSPC) 감소 효과를 확인하였고, 도 1 및 도 11에 나타내었다[Con: 아무것도 처리하지 않은 쥐 골수 세포, Chol: 콜레스테롤을 처리한 쥐 골수 세포, 27HC: 27-하이드록시콜레스테롤을 처리한 쥐 골수 세포].
도 1a 및 1b를 참조하면, 골수 세포(BM cell)에 27-하이드록시콜레스테롤을 처리함에 따라 Lin-Sca1+cKit+ 세포 (LKS), 조혈전구세포 (Lin-Sca1+cKit+CD48+), 조혈줄기세포 (Lin-Sca1+cKit+CD150+CD48-)의 비율이 감소함을 확인할 수 있다.
또한, 도 1c 및 1d를 참조하면, 골수 세포에 27-하이드록시콜레스테롤을 처리함에 따라 공통 골수성 전구 세포 (Lin-Sca1-cKit+CD34+CD16/32-), 과립구 대식 전구 세포 (Lin-Sca1-cKit+CD34+CD16/32+), 거대핵 적혈구 전구 세포 (Lin-Sca1-cKit+CD34-CD16/32-), 공통 림프구성 전구 세포 (Lin- Sca1lowcKitlow CD127+)의 비율이 감소함을 확인할 수 있다.
또한, 도 1e 및 1f를 참조하면, 골수 세포에 27-하이드록시콜레스테롤을 처리함에 따라 단핵구 (CD11b+), 중성구 (CD11b+Gr1+), B 세포 (B220+), T 세포 (CD3+) 비율은 변화가 없음을 확인할 수 있다.
또한, 도 11a를 참조하면, 골수 세포에 각각 24시간 또는 48시간 동안 27-하이드록시콜레스테롤을 처리하였을 때 LK 세포, LKS 세포, 조혈전구세포 (HPC), 조혈줄기세포 (HSC) 수가 감소함을 확인할 수 있으며, 시간 경과에 따라 유의미한 감소 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
또한, 도 11b를 참조하면, 골수 세포에 24시간 동안 27-하이드록시콜레스테롤을 각각 0.62μM과 6.2μM의 농도로 처리하였을 때 0.62μM 27-하이드록시콜레스테롤의 처리는 모든 세포에서 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있다.
또한, 도 11c를 참조하면, 27-하이드록시콜레스테롤은 cKit+ 세포와 CD48+ 세포를 감소시킴을 확인할 수 있다.
이를 통하여, 27-하이드록시콜레스테롤이 조혈줄기 전구세포에 특이적으로 세포독성 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.
실시예 2. 27-하이드록시콜레스테롤의 조혈줄기·전구세포 (HSPC)에서의 세포사멸 (apoptosis) 및 활성산소종 (ROS, reacitve oxygen species) 증가효과 확인
쥐의 정강뼈와 대퇴골에서 골수 세포를 추출하여 6.2 μM 27-하이드록시 콜레스테롤을 48시간 처리하였다. 세포 사멸을 확인하기 위해 27-하이드록시콜레스테롤을 처리한 세포를 모아 1x Annexin binding buffer에 세포를 풀어 Annexin V와 7AAD를 넣어 FACScanto2 장비로 분석하였고, 활성산소종을 확인하기 위해 세포를 FACS staining buffer에 풀어 DCFDA를 넣어준 후 37℃에서 30분간 염색하여 FACScanto2 장비로 분삭하였다. 그 결과 27-하이드록시콜레스테롤의 조혈줄기·전구세포 (HSPC)에서의 세포사멸 및 활성산소종 증가효과를 확인하여, 도 2에 나타내었다[Con 또는 Ctrl: 아무것도 처리하지 않은 쥐 골수 세포, Chol: 콜레스테롤을 처리한 쥐 골수 세포, 27HC: 27-하이드록시콜레스테롤을 처리한 쥐 골수 세포].
도 2a 내지 2b를 참조하면, 대조군 세포 대비 27-하이드록시콜레스테롤이 처리된 LKS 세포, 조혈전구세포 (HPC), 조혈줄기세포 (HSC)에서의 세포사멸이 증가하였음을 확인할 수 있다.
또한, 도 2c 및 2d를 참조하면, 대조군 세포 대비 27-하이드록시콜레스테롤이 처리된 LKS 세포, 조혈전구세포 (HPC), 조혈줄기세포 (HSC)에서의 활성산소종이 증가하였음을 확인할 수 있다.
또한, 도 2e를 참조하면, 대조군 대비 27-하이드록시콜레스테롤 처리된 LKS 세포, 조혈전구세포 (HPC), 조혈줄기세포 (HSC)에서 활성 산소종 (ROS)이 증가함을 확인하였으며, 항산화제인 N-acetylcysteine (NAC) 처리에 의해 활성 산소종 (ROS)이 감소함을 확인할 수 있다.
또한, 도 2f를 참조하면, 대조군 대비 27-하이드록시콜레스테롤 처리된 LKS 세포, 조혈전구세포 (HPC), 조혈줄기세포 (HSC)의 비율이 감소함을 확인하였으며, 항상화제인 N-acetylcysteine (NAC) 처리에 의해 위 세포들의 비율 감소가 억제됨을 확인할 수 있다.
이를 통하여, 27-하이드록시콜레스테롤은 조혈줄기·전구세포에서 세포사멸 및 활성산소종을 증가시킴을 확인하였다. 구체적으로, Cholesterol을 처리한 조혈 줄기 전구세포에서는 세포 사멸과 활성산소종의 비율이 아무것도 처리하지 않은 세포와 비슷한 반면, 27-하이드록시콜레스테롤을 처리한 세포에서 세포 사멸과 활성산소종의 비율이 증가하였다. 이를 통해 27-하이드록시콜레스테롤이 조혈 줄기 전구 세포에서 특이적으로 보이는 세포독성은 세포사멸과 활성산소종의 증가 때문이라는 것을 알 수 있다.
실시예 3. 27-하이드록시콜레스테롤이 in vitro 에서의 백혈병 세포 성장에 미치는 영향 확인
급성 골수성 백혈병 세포주인 HL60과 KG1 α, 만성 골수성 백혈병 세포주인 K562 세포에 6.2 μM 27-하이드록시콜레스테롤을 48시간 처리 후 trypan blue 염색을 하여 세포 수를 확인하였다. 또한 Annexin V와 7AAD을 넣어 FACScanto2 장비를 이용해 세포 사멸을 분석하였다. 그 결과 아무것도 처리하지 않은 세포(Con)와, 콜레스테롤을 처리한 백혈병 세포주(Chol)와 비교해 27-하이드록시콜레스테롤이 백혈병 세포주(27HC)의 세포 사멸을 증가시켜 세포 수를 감소시키는 것을 확인하여 도 3에 나타내었다[Con: 아무것도 처리하지 않은 백혈병 세포주, Chol: 콜레스테롤을 처리한 백혈병 세포주, 27HC: 27-하이드록시콜레스테롤을 처리한 백혈병 세포주].
다음으로, DCFDA 염색을 통해 세포 사멸과 활성산소종 비율을 분석하였다. 또한 27-Hydroxycholesterol이 백혈병 세포주의 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해 분화 마커인 CD11b를 염색하여 FACScanto 2 장비로 분석하였다. 그 결과 27-하이드록시 콜레스테롤을 처리한 백혈병 세포주에서 활성산소종 비율이 높은 것을 확인하여 도 4에 나타내었다[Con: 아무것도 처리하지 않은 백혈병 세포주, Chol: 콜레스테롤을 처리한 백혈병 세포주, 27HC: 27-하이드록시콜레스테롤을 처리한 백혈병 세포주].
다음으로, 27-하이드록시콜레스테롤로 유도된 세포 사멸이 소포체 스트레스가 원인인지 알아보기 위해 급성 골수성 백혈병 세포주인 HL60 세포에서 소포체 스트레스 단백질 양을 확인하였다. 27-하이드록시콜레스테롤을 48시간 처리 후 lysis buffer로 세포를 용해하여 단백질을 추출한 뒤 10% SDS-PAGE gel에서 분리하여 멤브레인으로 옮겨 anti-pIRE1α, IRE1α, PERK, ATF4, elF2α, or anti-ACTIN 항체를 넣어 4℃에서 16시간 염색 후 2차 항체를 넣어 상온에서 1시간 염색하여 ECL에 반응시켜 화학발광이미지분석기로 측정하였다. 그 결과 27-하이드록시콜레스테롤이 소포체 스트레스를 증가시키는 것을 확인하여 도 5에 나타내었다.
도 3a를 참조하면, 27-하이드록시콜레스테롤을 처리함에 따라 골수성 백혈병 세포(HL60, KG1a, K562 세포)의 세포 수는 음성 대조군인 HEK293T 세포의 세포수에 비하여 현저히 감소하였음을 확인할 수 있다.
또한, 도 3b 및 3c를 참조하면, 27-하이드록시콜레스테롤이 처리된 골수성 백혈병 세포(HL60, KG1a, K562 세포)는 대조군 세포보다 세포사멸이 증가하였음을 확인할 수 있다.
또한, 도 4a 및 도 4b를 참조하면, 27-하이드록시콜레스테롤이 처리된 골수성 백혈병 세포(HL60, KG1a, K562 세포)는 대조군 세포보다 활성산소종이 증가하였음을 확인할 수 있다.
또한, 도 4c 및 도 4d를 참조하면, 27-하이드록시콜레스테롤이 처리된 골수성 백혈병 세포(HL60, KG1a, K562 세포)는 대조군 세포보다 분화 (CD11b+) 가 증가하였음을 확인할 수 있다.
또한, 도 5a를 참조하면, 27-하이드록시콜레스테롤은 THP1 세포에서의 소포체 스트레스 반응 경로(ER stress response pathway)를 증가시킴을 확인할 수 있다.
이를 통하여, 27-하이드록시콜레스테롤은 조혈줄기·전구세포에서 세포사멸 및 활성산소종을 증가시킴을 확인하였다. 구체적으로, 도 5b의 27-하이드록시콜레스테롤의 세포자멸사 유도 메커니즘을 참조하면, 27-하이드록시콜레스테롤은 ROS 반응을 증가시키고 소포체 스트레스 반응 경로를 통해 세포자멸사를 유도함을 확인할 수 있다.
실시예 4. 27-하이드록시콜레스테롤 처리에 따른 유전자 발현 수준의 확인
쥐의 정강뼈와 대퇴골에서 골수 세포를 추출하여 6.2 μM 27-하이드록시 콜레스테롤을 48시간 처리한다. 처리 후 PE-Cy5-CD3, PE-Cy5-CD4, PE-Cy5-CD8, PE-Cy5-CD19, PE-Cy5-B220, PE-Cy5-GR1, PE-Cy5-Ter119, PE-Sca1, APC-cKit, PE-Cy7-CD150, APC-Cy7-CD48 항체를 넣고 4℃에서 30분간 염색 후 FACSAria를 이용하여 LKS(Lin-Sca1+cKit+)와 조혈전구세포 (Lin-Sca1+cKit+CD48+)를 분리하였다. 그 후 RNA 추출 키트를 이용하여 세포에서 RNA를 추출하였고, cDNA 합성 키트를 이용하여 RNA에서 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 세포 사멸과 소포체 스트레스와 관련된 프라이머 및 SYBR-green을 이용하여 qRT-PCR을 진행하였다. 그 결과 전체 골수 세포에서보다 미성숙한 세포인 LKS와 조혈 전구세포에서 27-하이드록시콜레스테롤 처리에 따른 세포 사멸과 소포체 스트레스와 관련된 유전자 발현이 증가함을 확인하여 도 6에 나타내었다.
도 6a를 참조하면, 27-하이드록시콜레스테롤을 처리함에 따라 LKS 세포와 조혈 전구 세포(HPC)에서의 암세포 성장과 관련된 Erα 유전자 발현이 증가하였음을 확인할 수 있다.
또한, 도 6b를 참조하면, 27-하이드록시콜레스테롤을 처리함에 따라 LKS 세포와 조혈 전구 세포(HPC)에서의 세포 사멸과 관련된 Bax 유전자 발현이 증가하였음을 확인할 수 있다.
또한, 도 6c를 참조하면, 27-하이드록시콜레스테롤을 처리함에 따라 LKS 세포와 조혈 전구 세포(HPC)에서의 소포체 스트레스와 관련된 Chop, Ire1α, Xbp1s 유전자의 발현이 증가하였음을 확인할 수 있다.
실시예 5. 27-하이드시콜레스테롤 in vivo 세포독성 실험
27-하이드록시콜레스테롤이 생체 내에서 세포 독성을 가지는지 확인하기 위해 에탄올, 콜레스테롤, 27-하이드록시콜레스테롤을 20mg/kg농도로 쥐의 복강에 주입하였고, 24시간 후 쥐의 정강뼈와 대퇴골에서 FACS staining buffer를 이용하여 골수 세포를 추출하여 항체를 붙여 FACSCanto2 장비로 세포를 분석하였다. 그 결과 27-하이드록시콜레스테롤은 생체 내에서 유의미한 변화를 보이지 않았다. 이를 통해 27-하이드록시콜레스테롤이 생체 내에서 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하여 도 7에 나타내었다.
실시예 6. 세포에서 27-하이드록시콜레스테롤과 7α-하이드록시콜레스테롤 사이의 백혈병 세포 성장 비교
급성 골수성 백혈병 세포주인 HL60과 만성 골수성 백혈병 세포주인 K562 세포에 6.2 μM 콜레스테롤과 7α-하이드록시콜레스테롤, 27-하이드록시콜레스테롤을 48시간 처리 후 trypan blue 염색을 하여 세포 수를 확인하였다. 그 결과 7α-하이드록시콜레스테롤은 백혈병 세포주 수에 큰 영향을 미치지 않았고, 27-하이드록시콜레스테롤은 백혈병 세포주의 세포 수를 감소시키는 것을 확인하여 도 8에 나타내었다[Con: 아무것도 처리하지 않은 백혈병 세포주, Chol: 콜레스테롤을 처리한 백혈병 세포주, 27HC: 27-하이드록시콜레스테롤을 처리한 백혈병 세포주, 7aHC: 7α-하이드록시콜레스테롤을 처리한 백혈병 세포주].
도 8a 및 도 8b를 참조하면, 27-하이드록시콜레스테롤(27HC)를 처리한 군에서는 백혈병 세포(HL60 세포, K562 세포)의 성장이 억제된 반면, 7α-하이드록시콜레스테롤(7aHC)를 처리한 군에서는 백혈병 세포(HL60 세포, K562 세포)의 성장 억제 효과가 미미함을 확인할 수 있다.
또한, 도 8c를 참조하면, 같은 산화 콜레스테롤이지만 7α-하이드록시콜레스테롤은 만성 골수성 백혈병 세포에는 영향을 미치지 못하였고, 27-하이드록시콜레스테롤보다 급성 골수성 백혈병 세포주에 미치는 영향이 약한 것으로 보아 27-하이드록시 콜레스테롤이 백혈병 세포 성장을 억제함을 확인할 수 있다.
실시예 7. 27-하이드록시콜레스테롤이 ex vivo 에서의 조혈줄기세포의 재생능 및 증식에 미치는 영향 확인
ex vivo로 골수 세포를 꺼내 6.2 μM 27-하이드록시콜레스테롤 (27-HC)를 처리 후 골수 이식을 진행하였다.
구체적으로, 도 9a를 참조하면, 공여자(Donor) CD45.1 쥐의 정강뼈와 대퇴골에서 골수 세포를 추출한 후 비히클, 6.2 μM의 콜레스테롤 및 6.2 μM의 27-하이드록시콜레스테롤을 48시간 처리하였다. 그런 다음, CD45.2 쥐의 골수 세포와 1:1 비율로 섞어 4Gy로 방사선 조사를 진행한 수혜자(Recipient) CD45.2 쥐의 미정맥에 주입하여 골수 이식을 진행하였다. 1달 후 골수 이식을 받은 수혜자 쥐의 정맥에서 혈액을 추출해 공여자 쥐의 세포 비율을 분석하였다. 쥐의 경정맥에서 혈액을 뽑아 10mM EDTA에 넣어 혈액 응고를 방지하였고, ACK lysis buffer에 넣어 적혈구를 용해시켰다. CD45.1-APC, CD45.2-FITC 항체를 붙인 후 FACSCanto 2 장비를 이용해 기증자 쥐 CD45.1 세포를 분석 하였고 27-하이드록시콜레스테롤이 조혈줄기세포의 재생능과 증식을 억제함을 확인하여 도 9a 내지 9e에 나타내었다.
도 9b를 참조하면, 혈액에서 공여자 마우스 CD45.1 세포를 분석한 결과 27-하이드록시콜레스테롤을 처리한 세포의 생착 능력이 감소함을 확인할 수 있다.
또한, 도 9c를 참조하면, 이식 후 수혜자 마우스의 혈액에서 공여자 마우스의 단핵구 (CD11b+), B 세포 (B220+), T 세포 (CD3+) 비율을 측정한 결과 27-하이드록시콜레스테롤을 처리한 세포의 비율이 감소함을 확인할 수 있다.
또한, 도 9d를 참조하면, 골수 세포에서 공여자 마우스인 CD45.1 세포를 분석한 결과 27-하이드록시콜레스테롤을 처리한 세포의 생착 능력이 감소함을 확인할 수 있다.
또한, 도 9e를 참조하면, 이식 후 수혜자 마우스의 골수 세포에서 공여자 마우스의 LK 세포, LKS 세포, 조혈전구세포 (HPC), 조혈줄기세포 (HSC) 비율을 측정한 결과 27-하이드록시콜레스테롤을 처리한 세포의 비율이 감소함을 확인할 수 있다.
이를 통하여, 27-하이드록시콜레스테롤이 혈액 및 골수 세포에서 조혈줄기세포의 재생능 및 증식을 억제하였음을 확인하였다.
실시예 8. 급성 골수성 백혈병 데이터시트 GSE116256의 RNA-sequence 분석
건강한 기증자와 급성 골수성 백혈병 환자의 골수 세포를 이용해 single cell RNA sequencing을 수행하여 27-하이드록시콜레스테롤의 대사 효소인 CYP7B1의 차등적 발현에 대한 세포 구성 및 유전자 변화를 확인하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10a를 참조하면, GSE12417 데이터 세트를 기반으로 27-하이드록시콜레스테롤을 소비하는 대사 효소인 CYP7B1 발현에 따른 생존 능력을 분석한 결과 CYP7B1이 높을수록 생존율이 감소하였다.
또한, 도 10b를 참조하면, 급성 골수성 백혈병 환자(AML)와 건강한 기증자(Healthy)의 골수 세포에서 CYP7B1의 발현을 특성화하기 위해 GSE116256 데이터시트로 분석하였고, 6개의 세포 유형으로 분류되었다.
또한, 도 10c를 참조하면, 급성 골수성 백혈병 환자와 건강(AML)한 건강한 기증자(Healthy)의 조혈 세포 구성 분석 결과로, 상단 그래프를 참조하면, 급성 골수성 백혈병 환자(AML)는 수지상 세포(cDC)와 단핵구(Mono)의 비율이 높고, 조혈줄기세포(HSC) 비율이 낮음을 확인할 수 있고, 중간 그래프를 참조하면, 급성 골수성 백혈병 환자(AML)는 악성 세포(malignant)의 비율이 높음을 확인할 수 있으며, 하단 그래프를 참조하면, 급성 골수성 백혈병 환자(AML)의 정상 세포(normal)와 악성 세포(malignant)의 세포 유형별 비율은 악성 세포에서 수지상 세포(cDC)와 전구세포(Prog)의 비율이 높음을 확인할 수 있다.
또한, 도 10d를 참조하면, 급성 골수성 백혈병 환자의 전체 악성 세포, 조혈줄기세포(HSC), 전구세포(Prog), 수지상 세포(cDC)에서 CYP7B1의 발현이 높음을 확인할 수 있다.
또한, 도 10e와 도 10f를 참조하면, 악성 세포와 정상 세포 사이에서 CYP7B1과 차등적으로 상관관계가 있는 유전자의 생물학적 과정을 나열하였을 때 CYP7B1의 차등적 발현에 의해 GTPase 활성 및 백혈구 이동 관련 유전자와 연관이 있음을 확인할 수 있다.
이를 통해 급성 골수성 백혈병 환자에서 CYP7B1 발현 억제가 백혈병 치료를 위한 화학요법 또는 방사선 치료와 함께 사용될 때 치료효과가 더 좋을 것임을 나타낸다.
따라서, 본 발명에 따른 27-하이드록시콜레스테롤을 포함하는 약학적 조성물은 조혈줄기세포의 활성산소를 증가시켜 연쇄적 소포체 스트레트를 활성화시킴으로써 조혈줄기세포의 증식을 억제하고, 혈액암 세포의 세포사멸(apoptosis)에 중요한 IRE1a, eIF2a, CHOP 신호전달 경로를 활성화함으로써 혈액암 세포의 세포사멸을 증진시킬 수 있고, 이 결과 골수성 백혈병을 예방, 개선 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.
이상의 상세한 설명은 본 발명을 예시하는 것이다. 또한 전술한 내용은 본 발명의 바람직한 실시 형태를 나타내어 설명하는 것이며, 본 발명은 다양한 다른 조합, 변경 및 환경에서 사용할 수 있다. 즉 본 명세서에 개시된 발명의 개념의 범위, 저술한 개시 내용과 균등한 범위 및/또는 당업계의 기술 또는 지식의 범위 내에서 변경 또는 수정이 가능하다. 저술한 실시예는 본 발명의 기술적 사상을 구현하기 위한 최선의 상태를 설명하는 것이며, 본 발명의 구체적인 적용 분야 및 용도에서 요구되는 다양한 변경도 가능하다. 따라서 이상의 발명의 상세한 설명은 개시된 실시 상태로 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다. 또한 첨부된 청구 범위는 다른 실시 상태도 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 27-하이드록시콜레스테롤은 조혈줄기세포의 증식을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 조혈줄기세포의 증식 억제는 활성산소종(ROS) 생성에 의한 소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 스트레스에 의한 것인, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 27-하이드록시콜레스테롤은 혈액암 세포의 세포사멸(apoptosis)를 유도하는 것인, 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 혈액암 세포의 세포사멸은 IRE1α(inositolrequiring kinase 1α), Elf2α(eukaryotic translation initiation factor 2α) 및 CHOP(C/EBP homologous protein)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현 증가로 인하여 유발되는 소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 스트레스에 의한 것인, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 농도는 1 내지 20 μM인 약학적 조성물.
  7. 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML) 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  8. 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML) 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  9. 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML) 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  10. 27-하이드록시콜레스테롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML) 치료용 항암 보조제.
  11. 27-하이드록시콜레롤을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골수성 백혈병(myeloid leukemia, ML)의 예방 또는 치료 방법.
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