WO2023036546A1 - Polysaccharid oder polysaccharidmischung, hergestellt durch paenibacillus polymyxa - Google Patents

Polysaccharid oder polysaccharidmischung, hergestellt durch paenibacillus polymyxa Download PDF

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WO2023036546A1
WO2023036546A1 PCT/EP2022/072461 EP2022072461W WO2023036546A1 WO 2023036546 A1 WO2023036546 A1 WO 2023036546A1 EP 2022072461 W EP2022072461 W EP 2022072461W WO 2023036546 A1 WO2023036546 A1 WO 2023036546A1
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paenan
polysaccharide
iii
produced
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PCT/EP2022/072461
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Volker Sieber
Christoph Schilling
Broder RÜHMANN
Jochen Schmid
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Technische Universität München
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)

Definitions

  • Polysaccharide or mixture of polysaccharides produced by Paenibacillus polymyxa are Polysaccharide or mixture of polysaccharides produced by Paenibacillus polymyxa
  • the invention relates to a polysaccharide or polysaccharide mixture produced by a genetically modified production organism Paenibacillus polymyxa.
  • Polysaccharides are universal biopolymers that are found in all areas of life. They occur in great abundance and fulfill a variety of tasks in nature. In principle, one can categorize polysaccharides into intracellular polysaccharides, structural polysaccharides and extracellular polysaccharides according to their function and/or their localization. Starch and glycogen are examples of intracellular polysaccharides and are efficient energy storage polysaccharides in animals, algae or plants. Examples of structural polysaccharides are cellulose, chitin, xylan or mannan, which, as hard, solid structures, impart mechanical strength to plants, insects or fungi. Extracellular polysaccharides include all polysaccharides that are secreted into the extracellular space.
  • capsular polysaccharides are completely secreted into the extracellular space and do not form a shell around the cell like capsular polysaccharides, they are also referred to as exopolysaccharides (EPS).
  • EPS exopolysaccharides
  • capsular polysaccharides and exopolysaccharides are not always possible, since capsular polysaccharides are sometimes only very loosely associated with the cell membrane, and exopolysaccharides can also be found in close proximity to the cell.
  • All polysaccharides are made up of carbohydrate monomers. These monomeric sugars and their derivatives form the basic building blocks of polysaccharides. Microbial heteropolysaccharides, in contrast to their plant counterparts, are usually regularly structured and made up of repeating elements with a consistent sequence of monomers - the so-called repeating units. Depending on the species and strain, these repeating units usually consist of two to eight sugar monomers. In extreme cases, repeating units can consist of up to fourteen sugar monomers. The synthesis of these repeating units and their Links to the polysaccharides are regulated in microorganisms in so-called biosynthetic clusters, in which all the enzymes required for synthesis are usually encoded.
  • xanthan A well-known example of an industrially used EPS that has long been established on the market is xanthan. It is synthesized by Xanthomonas campestris and i.a. used in food technology as an emulsifier or foam stabilizer. But xanthan is also used outside of the food sector. It is used, for example, to adjust the viscosity of printer inks.
  • Another polysaccharide that has already been introduced to the US and EU markets is gellan. This is the EPS of the organism Sphingomonas paucimobilis, which is able to form thermoreversible gels and is accordingly used in food technology as a gelling agent and stabilizer.
  • such microbial polysaccharides are of particular interest because they can be produced at variable scales, independent of season and location.
  • Paenibacillus polymyxa produces polysaccharide under suitable fermentation conditions.
  • Paenibacillus polymyxa produces a polysaccharide that is characterized by its high viscosity.
  • This high viscosity enables the polysaccharide to be used, for example, as a rheological agent or binder in the food, cosmetics and/or pharmaceuticals sectors.
  • the high viscosity of the produced polysaccharide poses an obstacle to efficient production of the polysaccharide, since the polysaccharide imparts high viscosity to the fermentation medium, thereby making mass transport difficult, and requiring increased energy input, for example, by stirring or heating.
  • the basis for solving this task was provided by characterizing the polysaccharide and clarifying its biosynthesis. It turned out that the polysaccharide produced by Paenibacillus polymyxa is a polysaccharide mixture of three individual polysaccharides, which only shows its high viscosity through the interaction of two of these polysaccharides. The biosynthesis of each of these three individual polysaccharides was elucidated by the inventors.
  • the object according to the invention was achieved by mutagenesis, preferably targeted mutagenesis, of individual genes of Paenibacillus polymyxa, which in turn made it possible to produce the low-viscosity individual polysaccharides and/or their low-viscosity mixtures in a controlled manner.
  • the rheological properties of the polysaccharides and/or the polysaccharide mixtures can be adjusted by mixing in suitable proportions, and for example also achieve the properties of the wild-type prepared polysaccharide mixture.
  • the invention therefore relates to a production process and the variously mutated Paenibacillus polymyxa production organisms used in the production process, as well as the use of the polysaccharides or polysaccharide mixtures produced according to the invention, for example as a rheological mediator, binder, stabilizer, emulsifier or flocculant, preferably in food and pharmaceuticals - and/or cosmetics.
  • Fig. 1 shows the structure of the repeating unit of Paenan I.
  • Fig. 2 shows the structure of the repeating unit of Paenan II.
  • Fig. 3 shows the structure of the repeating unit of Paenan III.
  • Fig. 4 shows the monomer composition of polysaccharides produced.
  • Carbohydrate fingerprints of EPS from P. polymyxa DSM 365 and mutant variants were analyzed using the HT-PMP method. Based on the obtained monomer ratios and the detection of specific dimers in MS analysis, polymer compositions were assigned to the presence of different Paenan variants (I-III).
  • the AepsO variant shows the same monomer composition as the wild-type polymer, but no pyruvate or the corresponding ketal was detected.
  • Fig. 5 shows viscosity curves of Paenan variants measured at logarithmically increasing shear rates from 0.01 to 1000/s with a cone and plate geometry at 20 °C (squares ⁇ ) and without (circles o) the addition of 0.5% NaCl. All measurements were performed in triplicate, error bars show the standard deviation.
  • Fig. 6 and 7 show amplitude sweeps of 1% solutions of the specified EPS variants produced by P. polymyxa DSM 365 in the aqueous solutions and in the presence of 0.5% NaCl.
  • G' memory module;
  • G” loss modulus
  • Figures 8 and 9 show frequency sweeps of 1% solutions of the indicated EPS variants produced by P. polymyxa DSM 365 in the aqueous solutions and in the presence of 0.5% NaCl. Due to a limited LVE range of Paenan III under the applied conditions, this variant was not measured in frequency sweeps.
  • Fig. 10 and 11 show temperature sweeps from 20-75 °C of 1% solutions of the specified EPS variants, produced by P. polymyxa DSM 365, in the aqueous solutions and in the presence of 0.5% NaCl.
  • Fig. 12 shows the monomer composition of Panean wild-type compared to monomer compositions of polysaccharide mixtures that were remixed after separate individual preparation.
  • the polysaccharide produced by Paenibacillus polymyxa is a polysaccharide mixture of three individual polysaccharides. These single polysaccharides are referred to as Paenan I, Paenan II, and Paenan III.
  • the structures of the repeat unit of Paenan I, Paenan II, and Paenan III are shown in Figures 1, 2, and 3, respectively.
  • the respective molecular weights are shown in Table 4.
  • the biosynthesis of the individual polysaccharides was elucidated and it was found that the following enzymes are necessary for the production of Paenan I: the glycosyltransferases PepD and/or PepF, the pyruvyltransferase EpsO, and the undecaprenylglucose phosphotransferase PepC. Without the glycosyltransferases and the undecaprenyl-glucose phosphotransferase, the repeat unit is not formed. The pyruvyltransferase EpsO ensures that a pyruvate residue is attached to the terminal repeat unit.
  • This pyruvate residue is essential for the development of the gel character and the high viscosity of the polysaccharide mixtures produced.
  • the following enzymes are necessary for the production of Paenan II: the glycosyltransferases PepT, PepII, and/or PepV, and the undecaprenyl-glucose phosphotransferase PepQ. Without the glycosyltransferases and the undecaprenyl-glucose phosphotransferase, the repeat unit is not formed.
  • Paenan II has a GDP-L-fucose produced by the enzyme GDP-L-fucose synthase. GDP-L-fucose synthase is encoded in the fcl gene, which is unique in the Paenibacillus genome. Accordingly, the production of Paenan II can be prevented by deleting fcl.
  • the following enzymes are necessary for the production of Paenan III: the glycosyltransferases Pepl, PepJ, PepK, and/or PepL, and the undecaprenyl-glucose phosphotransferases PepC or PepQ. Without the glycosyltransferases and one of the undecaprenyl-glucose phosphotransferases, the repeat unit is not formed.
  • the polysaccharide mixtures from Paenan I and Paenan II, and the polysaccharide mixtures from Paenan II and Paenan III are of low viscosity and can be produced simultaneously without the disadvantages of a highly viscous fermentation medium occurring.
  • the low-viscosity individual polysaccharides or low-viscosity polysaccharide mixtures can be used, for example, as surface coatings, functional binders for paints, and in the food industry, for example in fruit juices or salad dressings, etc.
  • the desired positive properties of the polysaccharide mixtures can be restored after separate preparation by mixing and optionally heating. So that connects
  • the method according to the invention has the advantages of the efficient production of low-viscosity individual polysaccharides or low-viscosity polysaccharide mixtures with the advantages offered by the high-viscosity polysaccharide mixtures obtained after mixing the low-viscosity individual polysaccharides or the low-viscosity polysaccharide mixtures due to their versatility.
  • the invention thus relates on the one hand to a method for producing a polysaccharide or a polysaccharide mixture by a production organism Paenibacillus polymyxa, the method comprising at least one of the following steps separately:
  • the method according to the invention can also include the polysaccharide or polysaccharide mixture produced being purified after production.
  • Paenibacillus polymyxa The production organism that is modified by site-directed mutagenesis is Paenibacillus polymyxa.
  • Paenibacillus polymyxa DSM 365 is used in the exemplary embodiments.
  • all Paenibacillus polymyxa strains which produce the polysaccharides Paenan I, II and III under suitable fermentation conditions and/or cultivation conditions known to the person skilled in the art can be used.
  • the method according to the invention can also include that after the production and, if necessary, the purification of the polysaccharides or the polysaccharide mixtures, the polysaccharides or polysaccharide mixtures produced are mixed, whereby a polysaccharide mixture is obtained which is a mixture of the polysaccharides Paenan I and Paenan II, or a mixture of the polysaccharides Paenan I and Paenan III, or a mixture of the polysaccharides Paenan II and Paenan III, or a mixture of the polysaccharides Paenan I, Paenan II and Paenan III.
  • Example 5 when mixing, the person skilled in the art can select the type of polysaccharides or polysaccharide mixtures to be mixed, the mixing ratio, as well as the concentrations, and thus set a desired rheological behavior of the mixture obtained. For example, by mixing Paenan I and Paenan III in a ratio of 1:2 w/v, a polysaccharide mixture can be obtained that has similar rheological properties to Paenan wild-type. However, mixtures can also be produced which, for example, have a higher or lower viscosity compared to the Paenan wild type. These properties can be adjusted by those skilled in the art as desired for the particular application.
  • a genetic change resulting in the elimination of a gene's function can also be obtained by natural mutagenesis, such as mutations induced by UV radiation or chemical agents.
  • the strains mutated in this way can then be selected for the desired phenotype with little effort. Accordingly, the genetic modification within the meaning of the present invention is not limited to genetic modifications.
  • the method according to the invention can include that the genetic modification, through which at least one enzymatic function of a polysaccharide biosynthetic cluster is switched off, so that the polysaccharide Paenan I cannot be produced, is selected from genetic modifications that affect the function of the glycosyltransferase PepD and/or PepF, and/or the undecaprenyl glucose phosphotransferase PepC.
  • the method according to the invention can include that the genetic modification, by which at least one enzymatic function of a polysaccharide biosynthetic cluster is switched off, so that the polysaccharide Paenan II cannot be produced, is selected from genetic modifications that affect the function of the glycosyltransferase PepT , Pepll, and/or PepV, and/or the undecaprenyl glucose phosphotransferase PepQ, and/or the GDP-L-fucose synthase.
  • the method according to the invention can include that the genetic modification, by which at least one enzymatic function of a polysaccharide biosynthetic cluster is switched off, so that the polysaccharide Paenan III cannot be produced, is selected from genetic modifications that disrupt the function of the glycosyltransferase Pepl , PepJ, PepK, and/or PepL.
  • Polysacchand biosynthetic clusters turn off so that neither the polysaccharide Paenan II nor the polysaccharide Paenan III are produced are selected from genetic alterations affecting the function of GDP-L-fucose synthase, or the function of
  • Glycosyltransferases Pepl, PepT, Pepll, and PepV, or the function of
  • Glycosyltransferases PepK, PepT, PepII, and PepV, or the function of
  • Glycosyltransferases PepL, PepT, PepII, and PepV, or the function of
  • Exemplary genetic changes that turn off at least one enzymatic function of a polysaccharide biosynthetic cluster so that neither the polysaccharide Paenan I nor the polysaccharide Paenan III are produced are selected from genetic changes that affect the function of the glycosyltransferases PepF and PepJ, or the function of the glycosyltransferases Prevent PepD and PepJ.
  • Exemplary genetic modifications that switch off at least one enzymatic function of a polysaccharide biosynthetic cluster so that neither the polysaccharide paenan I nor the polysaccharide paenan II are produced are selected from genetic modifications that disrupt the function of undecaprenyl-glucose phosphotransferase PepQ and glycosyltransferase PepF stop.
  • the invention also relates to a composition comprising the polysaccharide paenan I but neither the polysaccharide paenan II nor the polysaccharide paenan III; or a composition comprising the polysaccharide Paenan II but neither the polysaccharide Paenan I nor the polysaccharide Paenan III; or a composition comprising the polysaccharide Paenan III but neither the polysaccharide Paenan I nor the polysaccharide Paenan II; or a composition comprising the polysaccharide Paenan I and the polysaccharide Paenan II but not the polysaccharide Paenan III; or a composition comprising the Paenan II polysaccharide and the Paenan III polysaccharide but not the Paenan I polysaccharide.
  • the invention also relates to a production organism Paenibacillus polymyxa in which at least one enzymatic function of a polysaccharide biosynthetic cluster is switched off by genetic modification, so that neither the polysaccharide Paenan II nor the polysaccharide Paenan III can be produced; or a production organism Paenibacillus polymyxa in which at least one enzymatic function of a polysaccharide biosynthetic cluster is switched off by genetic modification, so that neither the polysaccharide paenan I nor the polysaccharide paenan III can be produced; or a production organism Paenibacillus polymyxa in which at least one enzymatic function of a polysaccharide biosynthetic cluster is switched off by genetic modification, so that neither the polysaccharide paenan I nor the polysaccharide paenan II can be produced; or a production organism Paenibacillus polymyxa in which at least one enzymatic function of
  • polysaccharides or polysaccharide mixtures produced with the method according to the invention by the production organisms according to the invention can be used in many ways because of their advantageous properties, which on the one hand already can be present if a polysaccharide produced according to the invention or a polysaccharide mixture produced according to the invention is used per se, or can be obtained if a polysaccharide produced according to the invention or a polysaccharide mixture produced according to the invention is mixed with another polysaccharide produced according to the invention or another polysaccharide mixture produced according to the invention.
  • the present invention also encompasses the use of a polysaccharide comprising paenan I, paenan II, or paenan III, or a mixture of any combination of paenan I, paenan II, and paenan III, as rheological mediator, binder, stabilizer, emulsifier , or flocculants, preferably in the food, pharmaceutical, and / or cosmetics sector.
  • the polysaccharide comprising paenan I, paenan II, or paenan III, or a mixture of any combination of paenan I, paenan II, and paenan III can be used as an additive to a food product, for example, and without reference to them limited to being made from baked goods, soups, sauces, mayonnaise, ketchup, jams, marmalades, jellies, preserves (fruit and vegetables), salad dressing, ice cream, milkshakes, pudding, pickled vegetables, canned meat and fish, or as an additive in one Cosmetic product, for example and not limited to, selected from a shower gel, cosmetic creams and lotions, hair shampoo, skin creams, toothpaste, moisturizers, or as an additive in a pharmaceutical or medicinal product, for example and not to be limited to selected from wound dressings, particles for controlled drug release, eye drops, tablet coatings, capsules for food supplements, or for use in tissue engineering to support surface adhesion after operations, in water flooding for oil production, in bioremediation and wastewater treatment, for
  • P. polymyxa DSM 365 was purchased from the German Collection for Microorganisms and Cell Culture (DSMZ, Germany). Escherichia coli NEB Turbo cells (New England Biolabs, USA) were used for the plasmid constructions. E. coli S17-1 (DSMZ strain DSM 9079) was used to transform P. polymyxa DSM 365 via conjugation. The strains produced are listed in Table 1.
  • 900 ⁇ l of the recipient culture was heat shocked at 42°C for 15 min and mixed with 300 ⁇ l of the donor strain.
  • the cells were centrifuged at 6,000 ⁇ g for 2 min, resuspended in 800 ⁇ l of LB medium and dropped onto non-selective LB agar plates. After 24 h incubation at 30°C, the cells were scraped, resuspended in 500 ⁇ l LB broth and 100 ⁇ l of this was plated onto selective LB agar containing 50 pg/ml neomycin and 20 pg/ml polymyxin for counter selection. P. po/ymyxa conjugates were analyzed for successful transformation by colony PCR after incubation for 48 hours at 30°C.
  • Table 2 Some of the plasmids used and produced.
  • Table 3 Some of the oligonucleotides used. Overhangs used for the Golden Gate Assembly are shown in lowercase. Restriction sites used for cloning are underlined. For each KO construct, two sets of sgRNAs were designed, tested and listed below if successful knockouts were achieved Example 2 - Fermentative production of the polysaccharides
  • strains were grown in LB media (5 g/l yeast extract, 10 g/l tryptone, 10 g/l NaCl) supplemented with 50 pg/ml neomycin and 20 pg/ml polymyxin. Supplemented if necessary. All strains were stored in 30% glycerol at -80°C. Before culturing, the strains were streaked onto LB agar plates and allowed to grow at 30°C for 24 hours.
  • LB media 5 g/l yeast extract, 10 g/l tryptone, 10 g/l NaCl
  • All strains were stored in 30% glycerol at -80°C. Before culturing, the strains were streaked onto LB agar plates and allowed to grow at 30°C for 24 hours.
  • the fermentation medium contained 30 g/l glucose, 0.05 g/l CaCh ⁇ 2H2O, 5 g/l tryptone, 1.33 g/l MgSÜ4 ⁇ 7H2O, 1.67 g/l KH2PO4, 2 ml/l RPMI 1640 vitamin solution (Merck, Germany) and 1 ml/l trace element solution (2.5 g/l FeSO4, 2.1 g/l C4H40eNa2 x 2 H2O, 1.8 g/l MnCh x 4 H 2 O, 0.258 g/l H3BO3, 0.031 g/l CuSO 4 x 5 H 2 O, 0.023 g/l NaMoO 4 x 2 H 2 O, 0.075 g/l C0Cl2 x 7 H2O, 0.021 g/l ZnCh).
  • the preculture medium was prepared the same as the fermentation medium except for a reduced glucose concentration of 10 g/l and an additional 20 g/l MOPS, buffere
  • the fermentative production of EPS was carried out in 1 L benchtop DASGIP parallel bioreactor systems (Eppendorf, Germany) with a working volume of 500 ml, equipped with a 6-blade Rushton impeller over 28 h with a controlled pH of 6.8 and a pO2 saturation of 30% done.
  • Batch cultivations were started with an initial ODeoo of 0.1 by inoculating with an appropriate volume of preculture.
  • the biomass was separated by centrifugation (15,000 x g, 20°C, 20 min), followed by cross-flow filtration of the supernatant using a 100 kDa filtration cassette (Hydrosart, Sartorius AG, Germany).
  • the monomer composition of manufactured EPS variants was analyzed using the 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone high-throughput method (HT-PMP) (Rühmann, Schmid & Sieber, 2014). Briefly, 0.1% EPS solutions were hydrolyzed in a 96-well plate, sealed with a silicone mat, and further covered with a custom-made metal jig with 2 M TFA (90 min, 121 °C). Samples were neutralized with 3.2% NH4OH. 75L PMP master mix (0.1 M methanolic PMP:0.4% ammonium hydroxide 2:1) was added to 25 ⁇ l of neutralized hydrolyzate and incubated for 100 min at 70° C. in a thermal cycler.
  • HT-PMP 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone high-throughput method
  • each EPS variant will be named after the Paenan variants present and not after the gene deletions that lead to the respective phenotype.
  • the molecular weight of polymer variants was determined by size exclusion chromatography using an Agilent 1260 Infinity system (Agilent Technologies, Germany) equipped with a refractive index detector (SECcurity GPC1260) and a SECcurity SLD7000 seven-angle static light scattering detector (PSS Polymer Standards Service, Germany ) was equipped.
  • SECcurity GPC1260 refractive index detector
  • SECcurity SLD7000 seven-angle static light scattering detector PSS Polymer Standards Service, Germany
  • 0.5 g/l of each variant was reconstituted in 0.1 M LiNOa and 100 ⁇ l sample was injected into the system at 30 min intervals and using a TSKgel SuperMP(PW)-H precolumn and two consecutive TSKgel SuperMultipore PW-H columns (6.0mm ID x 15cm, TOSOH Bioscience, Germany) at 50°C.
  • the depyruvylated polymer also showed a small peak at around 3.0-10 6 Da, but the main molar mass was detected to be significantly higher than that of all other Paenan variants at 8.8-10 6 Da.
  • all repeat units of Paenan I appear to be modified with a pyruvate ketal. Consequently, loss of this trait in the TlepsO knockout variant could affect chain length control in P. polymyxa, resulting in increased molecular weight and different rheological behavior.
  • pyruvylation can also affect the hydrodynamic radius of the polymer and thus the SEC-MALS analysis.
  • rheological Measurements were performed using a MCR 300 stress-controlled rotational rheometer (Anton Paar, Austria) equipped with a CP 50-1 cone-plate measuring system (50 mm diameter, 1° cone angle, 50 pm measuring gap). All measurements except temperature sweeps were performed at 20°C controlled by a TEK 150P temperature unit. After applying the solution to the rheometer, all samples were incubated at 20°C for 5 minutes before starting the measurements. All experiments were performed in technical triplicates.
  • Viscosity curves were measured with a logarithmically increased shear rate from 10' 3 to 10 3 /s by measuring 3 data points per decade with a decreasing measurement time of 100-5 s per data point.
  • Amplitude sweeps were measured with a logarithmically increasing shear stress amplitude from 10' 1 to 10 3 Pa at a frequency of 1 Hz.
  • Frequency sweeps were performed in the linear viscoelastic region (LVE) with a logarithmically increasing frequency from 10' 2 to 10 Hz.
  • Temperature sweeps were performed within the LVE at a frequency of 1 Hz using a temperature ramp from 20 to 75 °C with a heating rate of 4 °C/min.
  • the rim of the cone and plate measuring system was covered with low-viscosity paraffin oil (Carl Roth, Germany) to prevent evaporation.
  • the thixotropic behavior was evaluated by a three-step oscillatory shear sequence.
  • samples were subjected to shear stress within the LVE region, followed by high oscillatory shear of 10 3 Pa for 30 s. Structural recovery was then measured over 10 min within the LVE.
  • the backbone of Paenan I does not carry a negative charge due to the lack of a uronic acid in the backbone.
  • differences in the helical arrangement of Paenan II and Paenan III could explain the strong interactions of Paenan I & III, but not between Paenan I & II and between Paenan II & III, prompting further investigations of the secondary and tertiary polymer structures.
  • polymyxa DSM 365 wild-type EPS composition containing Paenan I & II & III is suitable as a sustainable thickener for variable applications that can replace commercially available petroleum-based acrylic compounds.
  • Table 6 Viscoelastic properties of the Paenan polymer variants. nb: not determined if measurement was not possible The mixture of Paenan I & III showed gel-like properties very similar to Paenan I & II & III, suggesting that the interaction is mainly between Paenan I and Paenan III.
  • Paenan I & II & III showed lower gel strength with yield points at 13.9 Pa and 35.8 Pa with and without the presence of 0.5% NaCl and a less pronounced G" peak at the end of the LVE region in the presence of NaCl.This indicates weaker interactions of these polymers.Investigations of the amplitude sweeps of the individual polymers showed that Paenan I and II both show viscoelastic, liquid-like behavior, while Paenan III only shows purely liquid behavior Without the formation of gel-like networks, the addition of NaCl led to a decrease in G' and G", while Paenan I showed higher salt stability compared to Paenan II.
  • polysaccharides of the present invention In contrast to the native polysaccharide composition containing Paenan I & II & III, deletion of individual polymers resulted in significantly altered viscoelastic properties. While the combination of Paenan I & III still showed a distinct intermolecular network leading to a gel-like character, individual biopolymers showed liquid-like behavior that still forms films upon drying. Consequently, there are significantly different applications for the wild-type EPS composition. Thus, one application of the polysaccharides of the present invention is the formation of edible films and packaging materials similar to pullulan. On the other hand, the polysaccharides of the present invention can be used in high value biomedical applications as coating materials in controlled release pharmaceutical systems.
  • thixotropic properties were determined by a three-stage oscillatory shear stress test (Table 8). While structural recovery was observed in all Paenan combinatorial variants, only 86.8% of the initial gel strength was measured in the wild-type EPS blend after three minutes of non-destructive shear stressing. This underscores a distinct intermolecular network that requires more time to recover and coordinate noncovalent interactions between individual polymers. Similar effects of delayed structural recovery were observed for polysaccharide compositions with Paenan I & III, confirming the hypothesis that the gel-like character derives mainly from the cation-mediated interaction between the pyruvate of Paenan I and the glucuronic acid residue of Paenan III. In contrast, an immediate structural recovery was observed for all other knock-out variants, leading to the initial gel strength. Consequently, different variants could be applicable as binders imparting thixotropic behavior typically used for paints and coatings with different rheological profiles.
  • Table 8 Thixotropic recovery of Paenan variants after a three-stage oscillating shear test. The thixotropic recovery was calculated after 30/90/180 s based on G' relative to the initial values determined in the LVE area, nb: not determined for this variant due to limited LVE range
  • both the monomer composition of wild-type Paenan and its rheological properties could be restored by mixing the separately prepared polysaccharides.
  • the strong gel properties of the wild-type polymer composition are based on the interaction of the pyruvate group of Paenan I (PI) and the GIcA of Paenan III (Pill).
  • PI pyruvate group of Paenan I
  • Pill GIcA of Paenan III
  • Table 8 shows the viscosities of exemplary polysaccharide mixtures obtained by mixing separately prepared polysaccharides 1:2.
  • Apepl denotes a mutation through which the production organism carrying this mutation can no longer produce Paenan III, but only Paenan I and Paenan II.
  • a mixture can be produced which is similar to that of the wild-type (WT).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Polysaccharid oder eine Polysaccharidmischung, hergestellt durch einen genetisch veränderten Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, sowie Verfahren zur Herstellung des Polysaccharids oder der Polysaccharidmischung.

Description

Polysaccharid oder Polysaccharidmischung, hergestellt durch Paenibacillus polymyxa
Hintergrund
Die Erfindung betrifft ein Polysaccharid oder eine Polysaccharidmischung, hergestellt durch einen genetisch veränderten Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa.
Polysaccharide sind universelle Biopolymere, die in allen Lebensbereichen vorkommen. Sie kommen in hoher Fülle vor und erfüllen eine Vielfalt von Aufgaben in der Natur. Im Prinzip kann man Polysaccharide nach ihrer Funktion und/oder ihrer Lokalisation in intrazelluläre Polysaccharide, strukturelle Polysaccharide und extrazelluläre Polysaccharide kategorisieren. Stärke und Glykogen sind Beispiele für intrazelluläre Polysaccharide und sind effiziente Energiespeicherpolysaccharide in Tieren, Algen oder Pflanzen. Beispiele für strukturelle Polysaccharide sind Cellulose, Chitin, Xylan oder Mannan, die als harte, feste Strukturen Pflanzen, Insekten oder Pilzen mechanische Festigkeit verleihen. Extrazelluläre Polysaccharide umfassen alle Polysaccharide, die in den extrazellulären Raum sekretiert werden. Wenn die Polysaccharide vollständig in den extrazellulären Raum sekretiert werden, und nicht wie Kapselpolysaccharide eine Hülle um die Zelle bilden, werden sie auch als Exopolysaccharide (EPS) bezeichnet. Eine Abgrenzung zwischen Kapselpolysacchariden und Exopolysacchariden ist jedoch nicht immer eindeutig möglich, da Kapselpolysaccharide manchmal nur sehr lose mit der Zellmembran assoziiert sind, und Exopolysaccharide sich auch in nächste Nähe zu der Zelle befinden können.
Alle Polysaccharide bestehen aus Kohlenhydratmonomeren. Diese monomeren Zucker und ihre Abwandlungen bilden die Grundbauteile der Polysaccharide. Mikrobielle Heteropolysaccharide sind im Gegensatz zu ihren pflanzlichen Gegenstücken in der Regel regelmäßig strukturiert und aus sich wiederholenden Elementen mit einer konsistenten Monomersequenz aufgebaut - die sogenannten Wiederholungseinheiten. Je nach Art und Stamm bestehen diese sich wiederholenden Einheiten meist aus zwei bis acht Zuckermonomeren. In Extremfällen können Wiederholungseinheiten aus bis zu vierzehn Zuckermonomeren bestehen. Die Synthese dieser Wiederholungseinheiten und ihrer Verknüpfung zu den Polysacchariden werden in Mikroorganismen in sogenannten Biosyntheseclustern reguliert, in dem meist alle für die Synthese nötigen Enzyme kodiert sind.
Die Vielzahl an unterschiedlichen Monomeren und die Vielzahl der Möglichkeiten, diese miteinander zu verknüpfen, ermöglicht unzählige Polymervarianten. Aufgrund ihrer hohen strukturellen Variabilität haben Exopolysaccharide auch sehr vielfältige physikalische und chemische Eigenschaften. Dies macht sie zu interessanten Werkstoffen mit neuartigen Charakteristika oder zu Additiven, die einem Produkt die gewünschten Eigenschaften verleihen.
Ein bekanntes, schon lange auf dem Markt etabliertes Beispiel eines industriell genutzten EPS ist Xanthan. Es wird von Xanthomonas campestris synthetisiert und u. a. in der Lebensmitteltechnologie als Emulgator oder Schaumstabilisator eingesetzt. Aber auch außerhalb des Lebensmittelbereiches findet Xanthan Anwendung. Es wird beispielsweise zur Einstellung der Viskosität von Druckertinten benutzt. Ein weiteres Polysaccharid, welches schon auf den USA- und EU-Märkten eingeführt wurde, ist Gellan. Hierbei handelt es sich um das EPS des Organismus Sphingomonas paucimobilis, das in der Lage ist, thermoreversible Gele zu bilden und dementsprechend in der Lebensmitteltechnologie als Geliermittel und Stabilisator Verwendung findet.
Aus biotechnologischer Sicht sind solche mikrobiellen Polysaccharide von besonderem Interesse, da sie saison- und ortsunabhängig in variablen Maßstäben produziert werden können.
Es ist bekannt, dass das Gram-positive Bodenbakterium Paenibacillus polymyxa unter geeigneten Fermentationsbedingungen Polysaccharid herstellt. Insbesondere ist bekannt, dass Paenibacillus polymyxa ein Polysaccharid herstellt, das sich durch seine hohe Viskosität auszeichnet. Diese hohe Viskosität ermöglicht die Verwendung des Polysaccharids zum Beispiels als rheologischer Vermittler oder Bindemittel im Lebensmittel-, Kosmetik-, und/oder Pharmaziebereich. Auf der anderen Seite stellt die hohe Viskosität des hergestellten Polysaccharids ein Hindernis für eine effiziente Produktion des Polysaccharids dar, da das Polysaccharid dem Fermentationsmedium eine hohe Viskosität verleiht, und dadurch den Massentransport erschwert, und einen erhöhten Energieeintrag zum Beispiel durch Rühren oder Erhitzen erfordert.
Es ist Aufgabe der Erfindung ein effizientes und energiesparendes Verfahren zu Herstellung eines durch Paenibacillus polymyxa herstellbaren Polysaccharids bereitzustellen. Die Grundlage zur Lösung dieser Aufgabe wurde bereitgestellt, indem das Polysaccharid charakterisiert und seine Biosynthese aufgeklärt wurde. Es stellte sich heraus, dass das von Paenibacillus polymyxa hergestellte Polysaccharid eine Polysaccharidmischung aus drei Einzelpolysacchariden ist, die erst durch die Interaktion zweier dieser Polysaccharide die hohe Viskosität zeigt. Die Biosynthese jedes dieser drei Einzelpolysaccharide wurde von den Erfindern aufgeklärt.
Die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe erfolgte durch Mutagenese, bevorzugt gezielte Mutagenese, einzelner Gene von Paenibacillus polymyxa, was wiederum die kontrollierte Herstellung der niederviskosen Einzelpolysaccharide und/oder deren niederviskosen Mischungen ermöglichte. Die rheologischen Eigenschaften der Polysaccharide und/oder der Polysaccharidmischungen können durch Mischen in geeigneten Anteilen eingestellt werden, und zum Beispiel auch die Eigenschaften der vom Wildtyp hergestellten Polysaccharidmischung erreichen. Die Erfindung betrifft demnach ein Herstellungsverfahren, sowie die in dem Herstellungsverfahren verwendeten verschieden mutierten Produktionsorganismen Paenibacillus polymyxa, sowie die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Polysaccharide oder Polysaccharidmischungen, zum Beispiel als rheologischer Vermittler, Bindemittel, Stabilisierungsmittel, Emulsionsmittel, oder Flokkulierungsmittel, vorzugsweise im Lebensmittel-, Pharmazeutik-, und/oder Kosmetikbereich.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Abb. 1 zeigt die die Struktur der Wiederholungseinheit von Paenan I.
Abb. 2 zeigt die die Struktur der Wiederholungseinheit von Paenan II.
Abb. 3 zeigt die die Struktur der Wiederholungseinheit von Paenan III.
Abb. 4 zeigt die Monomerzusammensetzung von hergestellten Polysacchariden. Kohlenhydrat-Fingerabdrücke von EPS aus P. polymyxa DSM 365 und Mutantenvarianten wurden mit der HT-PMP-Methode analysiert. Basierend auf den erhaltenen Monomerverhältnissen und dem Nachweis spezifischer Dimere in der MS-Analyse wurden Polymerzusammensetzungen dem Vorhandensein verschiedener Paenan-Varianten (l-lll) zugeordnet. Die AepsO-Variante zeigt die gleiche Monomerzusammensetzung wie das Wildtyp-Polymer, jedoch wurde kein Pyruvat bzw. das entsprechende Ketal mehr nachgewiesen.
Abb. 5 zeigt Viskositätskurven von Paenan-Varianten gemessen bei logarithmisch ansteigenden Scherraten von 0,01 bis 1000/s mit einer Kegel-Platte-Geometrie bei 20 °C mit (Quadrate □) und ohne (Kreise o) Zugabe von 0,5 % NaCI. Alle Messungen wurden dreifach durchgeführt, Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.
Abb. 6 und 7 zeigen Amplituden-Sweeps von 1 % Lösungen der angegebenen EPS- Varianten, hergestellt von P. polymyxa DSM 365, in den wässrigen Lösungen und in Gegenwart von 0,5 % NaCI. G’: Speichermodul; G”: Verlustmodul
Abb. 8 und 9 zeigen Frequenz-Sweeps von 1 % Lösungen der angegebenen EPS-Varianten, hergestellt von P. polymyxa DSM 365, in den wässrigen Lösungen und in Gegenwart von 0,5 % NaCI. Aufgrund eines begrenzten LVE-Bereichs von Paenan III unter den angewendeten Bedingungen wurde diese Variante nicht in Frequenz-Sweeps gemessen. G’ (Kreis): Speichermodul; G” (Quadrat): Verlustmodul
Abb. 10 und 11 zeigen Temperatur-Sweeps von 20-75 °C von 1 %igen Lösungen der angegebenen EPS-Varianten, hergestellt von P. polymyxa DSM 365, in den wässrigen Lösungen und in Gegenwart von 0,5 % NaCI. G’ (Kreis): Speichermodul; G” (Quadrat): Verlustmodul
Abb. 12 zeigt die Monomerkomposition des Panean-Wildtyps im Vergleich zu Monomerkompositionen von Polysaccharidmischungen, die nach getrennter Einzelherstellung wieder vermischt wurden.
Beschreibung der Erfindung
Wie oben erwähnt, wurde von den Erfindern herausgefunden, dass das von Paenibacillus polymyxa hergestellte Polysaccharid eine Polysaccharidmischung aus drei Einzelpolysacchariden ist. Diese Einzelpolysaccharide werden als Paenan I, Paenan II, und Paenan III bezeichnet. Die Strukturen der Wiederholungseinheit von Paenan I, Paenan II, und Paenan III werden jeweils in Abbildungen 1 , 2, und 3 gezeigt. Die jeweiligen Molekulargewichte sind in Tabelle 4 gezeigt.
Die Biosynthese der Einzelpolysaccharide wurde aufgeklärt, und es wurde festgestellt, dass zur Herstellung von Paenan I folgende Enzyme notwendig sind: die Glykosyltransferasen PepD und/oder PepF, die Pyruvyltransferase EpsO, und die Undecaprenyl-Glucose- Phosphotransferase PepC. Ohne die Glykosyltransferasen und die Undecaprenyl-Glucose- Phosphotransferase wird die Wiederholungseinheit nicht gebildet. Die Pyruvyltransferase EpsO sorgt dafür, dass ein Pyruvatrest an die terminale Wiederholungseinheit angehängt wird. Dieser Pyruvatrest ist für die Ausbildung des Gelcharakters und der hohen Viskosität der hergestellten Polysaccharidmischungen essentiell. Zur Herstellung von Paenan II sind folgende Enzyme notwendig: die Glykosyltransferasen PepT, Pepll, und/oder PepV, und die Undecaprenyl-Glucose-Phosphotransferase PepQ. Ohne die Glykosyltransferasen und die Undecaprenyl-Glucose-Phosphotransferase wird die Wiederholungseinheit nicht gebildet. Außerdem weist Paenan II eine GDP-L-Fucose auf, die durch das Enzym GDP-L-Fucose-Synthase hergestellt wird. Die GDP-L-Fucose-Synthase wird im Gen fcl kodiert, das im Genom von Paenibacillus nur einmal vorkommt. Durch Deletion von fcl kann demnach die Herstellung von Paenan II unterbunden werden.
Zur Herstellung von Paenan III sind folgende Enzyme notwendig: die Glykosyltransferase Pepl, PepJ, PepK, und/oder PepL, und die Undecaprenyl-Glucose-Phosphotransferasen PepC oder PepQ. Ohne die Glykosyltransferasen und eine der Undecaprenyl-Glucose- Phosphotransferasen wird die Wiederholungseinheit nicht gebildet.
Es wurde auch festgestellt, dass Interaktion zwischen Paenan I und Paenan III zur Ausbildung des Gelcharakters und der hohen Viskosität der hergestellten Polysaccharidmischungen führt. Hierbei interagiert der Pyruvatrest an der Wiederholungseinheit von Paenan I mit der Glucuronsäure in Paenan III. Wenn also nach getrennter Herstellung der Einzelpolysaccharide eine Polysaccharidmischung hergestellt werden soll, die den Gelcharakter und die Viskosität des Paenan-Wildtyps erreichen soll, dann ist eine Ausschaltung der Funktion von EpsO im Produktionsorganismus zu unterlassen.
Somit sind auch die Polysaccharidmischungen aus Paenan I und Paenan II, sowie die Polysaccharidmischungen aus Paenan II und Paenan III niederviskos, und lassen sich gleichzeitig herstellen, ohne dass die Nachteile eines hoch viskosen Fermentationsmediums auftreten.
Diese Erkenntnisse ermöglichen nun die Mutagenese, insbesondere die gezielte Mutagenese, der kodierenden Sequenzen für diese Enzyme, wobei die Mutagenese zum Verlust der Enzymfunktion führt, und somit die Herstellung von Produktionsorganismen, die gezielt niederviskose Einzelpolysaccharide oder niederviskose Polysaccharidmischungen herstellen können. Die niederviskosen Einzelpolysaccharide oder niederviskosen Polysaccharidmischungen können zum Beispiel als Oberflächenbeschichtungen, funktionelle Bindemittel für Lacke, und in der Lebensmittelindustrie zum Beispiel in Fruchtsäften oder Salatdressings etc., eingesetzt werden.
Die gewünschten positiven Eigenschaften der Polysaccharidmischungen wie etwa einstellbare Viskosität und Gelcharakter lassen sich nach getrennter Herstellung durch Vermischen, und gegebenenfalls Erhitzen, wiederherstellen. Somit verbindet das erfindungsgemäße Verfahren die Vorteile der effizienten Produktion von niederviskosen Einzelpolysacchariden oder niederviskosen Polysaccharidmischungen mit den Vorteilen, die die nach Mischung der niederviskosen Einzelpolysaccharide oder der niederviskosen Polysaccharidmischungen erhaltenen hochviskosen Polysaccharidmischungen durch ihre vielseitige Anwendbarkeit bieten.
Die Erfindung betrifft somit zum einen ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids oder einer Polysaccharidmischung durch einen Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, wobei das Verfahren mindestens einen der folgenden Schritte getrennt voneinander umfasst:
(a) Herstellen des Polysaccharids Paenan I durch einen Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass weder das Polysaccharid Paenan II noch das Polysaccharid Paenan III hergestellt werden; und/oder
(b) Herstellen des Polysaccharids Paenan II durch einen Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass weder das Polysaccharid Paenan I noch das Polysaccharid Paenan III hergestellt werden; und/oder
(c) Herstellen des Polysaccharids Paenan III durch einen Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass weder das Polysaccharid Paenan I noch das Polysaccharid Paenan II hergestellt werden; und/oder
(d) Herstellen der Polysaccharide Paenan I und II durch einen Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass das Polysaccharid Paenan III nicht hergestellt wird; und/oder
(e) Herstellen der Polysaccharide Paenan II und III durch einen Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass das Polysaccharid Paenan I nicht hergestellt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch umfassen, dass das hergestellte Polysaccharid oder die Polysaccharidmischung nach der Herstellung aufgereinigt wird.
Der Produktionsorganismus, der durch gezielte Mutagenese verändert wird, ist Paenibacillus polymyxa. In den Ausführungsbeispielen wird Paenibacillus polymyxa DSM 365 verwendet. Jedoch können alle Paenibacillus polymyxa Stämme verwendet werden, die unter geeigneten Fermentationsbedingungen und/oder Kultivierungsbedingungen, die dem Fachmann bekannt sind, die Polysaccharide Paenan I, II, und III bilden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch umfassen, dass nach der Herstellung und gegebenenfalls der Aufreinigung der Polysaccharide oder die Polysaccharidmischungen die hergestellten Polysaccharide oder Polysaccharidmischungen vermischt werden, wodurch eine Polysaccharidmischung erhalten wird, die eine Mischung der Polysaccharide Paenan I und Paenan II, oder eine Mischung der Polysaccharide Paenan I und Paenan III, oder eine Mischung der Polysaccharide Paenan II und Paenan III, oder eine Mischung der Polysaccharide Paenan I, Paenan II und Paenan III aufweist.
Wie in Beispiel 5 gezeigt, kann der Fachmann beim Mischen die Art der Polysaccharide oder der Polysaccharidmischungen, die vermischt werden sollen, das Mischverhältnis, so wie die Konzentrationen auswählen, und somit ein gewünschtes rheologisches Verhalten der erhaltenen Mischung einstellen. Zum Beispiel kann durch Mischen von Paenan I und Paenan III in einem Verhältnis von 1:2 m/v eine Polysaccharidmischung erhalten werden, die ähnliche rheologische Eigenschaften wie der Paenan-Wildtyp hat. Es können aber auch Mischungen hergestellt werden, die zum Beispiel eine höhere oder niedrigere Viskosität im Vergleich zum Paenan-Wildtyp aufweisen. Diese Eigenschaften können durch den Fachmann wie für die jeweilige Anwendung gewünscht, eingestellt werden.
Verfahren zur gezielten Ausschaltung der Funktion eines Gens sind dem Fachmann bekannt. In den Ausführungsbeispielen wurden die Funktionen der beschriebenen Enzyme durch CRISPR-Cas9 vermittelten Knock-out der genetischen Sequenzen, die die jeweiligen Enzyme kodieren, ausgeschaltet. Die grundlegende Vorgehensweise ist in Rütering et al, Synth Biol (Oxf); 2017 Jan, beschrieben. Jegliche dem Fachmann bekannten Verfahren zur gezielten Ausschaltung der Funktion eines Gens können jedoch verwendet werden. Es ist zum Beispiele nicht unbedingt nötig, die gesamte Gensequenz zu deletieren. Es reicht aus, nur denjenigen Bereich der Gensequenz zu deletieren, der für die Funktion des Gens verantwortlich ist. Eine genetische Veränderung, die zur Ausschaltung der Funktion eines Gens führt, kann auch durch natürliche Mutagenese, wie zum Beispiel durch UV-Strahlung oder chemische Mittel hervorgerufene Mutationen, erhalten werden. Die derart mutierten Stämme können dann mit geringem Aufwand nach dem gewünschten Phänotyp selektiert werden. Demnach ist die genetische Änderung im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht auf gentechnische Veränderungen beschränkt.
Um erfindungsgemäße Produktionsorganismen zu erhalten, kann es ausreichen, nur eine Funktion eines Gens auszuschalten, solange das Ausschalten dieses Gens dazu führt, dass das nicht erwünschte Einzelpolysaccharid durch den mutierten Produktionsorganismus nicht mehr hergestellt wird. Konkrete Ausführungsformen mit beispielhaften Mutationen sind in den Beispielen aufgeführt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann umfassen, dass die genetische Veränderung, durch die mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass das Polysaccharid Paenan I nicht hergestellt werden kann, ausgewählt ist aus genetischen Veränderungen, die die Funktion der Glykosyltransferase PepD und/oder PepF, und/oder der Undecaprenyl-Glucose-Phosphotransferase PepC unterbinden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann alternativ oder zusätzlich umfassen, dass die genetische Veränderung, durch die mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass das Polysaccharid Paenan II nicht hergestellt werden kann, ausgewählt ist aus genetischen Veränderungen, die die Funktion der Glykosyltransferase PepT, Pepll, und/oder PepV, und/oder der Undecaprenyl- Glucose-Phosphotransferase PepQ, und/oder der GDP-L-Fucose-Synthase unterbinden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann alternativ oder zusätzlich umfassen, dass die genetische Veränderung, durch die mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass das Polysaccharid Paenan III nicht hergestellt werden kann, ausgewählt ist aus genetischen Veränderungen, die die Funktion der Glykosyltransferase Pepl, PepJ, PepK, und/oder PepL unterbinden.
Beispielhafte genetische Veränderungen die mindestens eine enzymatische Funktion eines
Polysacchand-Biosyntheseclusters ausschalten, so dass weder das Polysaccharid Paenan II, noch das Polysaccharid Paenan III hergestellt werden, sind ausgewählt aus genetischen Veränderungen, die die Funktion der GDP-L-Fucose-Synthase, oder die Funktion der
Glykosyltransferasen Pepl, PepT, Pepll, und PepV, oder die Funktion der
Glykosyltransferasen PepK, PepT, Pepll, und PepV, oder die Funktion der
Glykosyltransferasen PepL, PepT, Pepll, und PepV, oder die Funktion der
Glykosyltransferasen PepT un PepL unterbinden.
Beispielhafte genetische Veränderungen die mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausschalten, so dass weder das Polysaccharid Paenan I, noch das Polysaccharid Paenan III hergestellt werden, sind ausgewählt aus genetischen Veränderungen, die die Funktion der Glykosyltransferasen PepF und PepJ, oder die Funktion der Glykosyltransferasen PepD und PepJ unterbinden. Beispielhafte genetische Veränderungen die mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausschalten, so dass weder das Polysaccharid Paenan I, noch das Polysaccharid Paenan II hergestellt werden, sind ausgewählt aus genetischen Veränderungen, die die Funktion der Undecaprenyl-Glucose-Phosphotransferase PepQ und der Glykosyltransferase PepF unterbinden.
Die Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung, die das Polysaccharid Paenan I, aber weder das Polysaccharid Paenan II noch das Polysaccharid Paenan III aufweist; oder eine Zusammensetzung, die das Polysaccharid Paenan II, aber weder das Polysaccharid Paenan I noch das Polysaccharid Paenan III aufweist; oder eine Zusammensetzung, die das Polysaccharid Paenan III, aber weder das Polysaccharid Paenan I noch das Polysaccharid Paenan II aufweist; oder eine Zusammensetzung, die das Polysaccharid Paenan I und das Polysaccharid Paenan II aber nicht das Polysaccharid Paenan III aufweist; oder eine Zusammensetzung, die das Polysaccharid Paenan II und das Polysaccharid Paenan III aber nicht das Polysaccharid Paenan I aufweist.
Die Erfindung betrifft auch einen Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid- Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass weder das Polysaccharid Paenan II noch das Polysaccharid Paenan III hergestellt werden können; oder einen Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass weder das Polysaccharid Paenan I noch das Polysaccharid Paenan III hergestellt werden können; oder einen Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass weder das Polysaccharid Paenan I noch das Polysaccharid Paenan II hergestellt werden können; oder einen Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass das Polysaccharid Paenan III nicht hergestellt werden kann; oder einen Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass das Polysaccharid Paenan I nicht hergestellt werden kann.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durch die erfindungsgemäßen Produktionsorganismen hergestellten Polysaccharide oder Polysaccharidmischungen können vielseitig eingesetzt werden aufgrund ihrer vorteilhaften Eigenschaften, die zum einen schon vorliegen können, wenn ein erfindungsgemäß hergestelltes Polysaccharid oder eine erfindungsgemäß hergestellte Polysaccharidmischung an sich verwendet wird, oder erhalten werden können, wenn ein erfindungsgemäß hergestelltes Polysaccharid oder eine erfindungsgemäß hergestellte Polysaccharidmischung mit einem weiteren erfindungsgemäß hergestellten Polysaccharid oder einer weiteren erfindungsgemäß hergestellten Polysaccharidmischung gemischt werden.
Demnach umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Polysaccharids, das Paenan I, Paenan II, oder Paenan III, oder eine Mischung aus einer beliebigen Kombination von Paenan I, Paenan II, und Paenan III aufweist, als rheologischer Vermittler, Bindemittel, Stabilisierungsmittel, Emulsionsmittel, oder Flokkulierungsmittel, vorzugsweise im Lebensmittel-, Pharmazeutik-, und/oder Kosmetikbereich.
Insbesondere kann das Polysaccharid, das Paenan I, Paenan II, oder Paenan III, oder eine Mischung aus einer beliebigen Kombination von Paenan I, Paenan II, und Paenan III aufweist, verwendet werden als ein Zusatzstoff zu einem Lebensmittelprodukt, beispielsweise, und ohne auf diese beschränkt zu sein, aus Backwaren, Suppen, Soßen, Mayonnaise, Ketchup, Konfitüren, Marmeladen, Gelees, Konserven (Obst- und Gemüse), Salatdressing, Speiseeis, Milchmischgetränken, Pudding, Sauergemüse, Fleisch- und Fischkonserven, oder als ein Zusatzstoff in einem Kosmetikproduk, beispielsweise, und ohne auf diese beschränkt zu sein, ausgewählt aus einem Duschgel, Kosmetikcremes und Lotionen, Haarshampoo, Hautcremes, Zahnpaste, Feuchtigkeitscremes, oder als ein Zusatzstoff in einem pharmazeutischen oder medizinischen Produkt, beispielsweise, und ohne auf diese beschränkt zu sein, ausgewählt aus Wundauflagen, Partikeln zur kontrollierten Wirkstofffreigabe, Augentropfen, Tablettencoatings, Kapseln für Nahrungsergänzungsmittel, oder zur Verwendung im Gewebeengineering zur Unterstützung der Oberflächenadhäsion nach Operationen, im Water flooding für Erdölgewinnung, in der Bioremediation und Abwasseraufreinigung, zur Schwermetallbindung, als Zementzusatz, um Partikel während dem Aushärten in Schwebe zu halten, oder als Lackadditiv.
Das erfindungsgemäße Verfahren, sowie die erfindungsgemäßen Produktionsorganismen, sowie die erfindungsgemäßen Verwendungen werden nun im Folgenden beispielhaft erläutert.
Beispiele
Beispiel 1 - Herstellen der mutierten Produktionsorganismen
P. polymyxa DSM 365 wurde von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkultur (DSMZ, Deutschland) erworben. Escherichia coli NEB Turbo-Zellen (New England Biolabs, USA) wurden für die Plasmidkonstruktionen verwendet. E. coli S17-1 (DSMZ-Stamm DSM 9079) wurde zur Transformation von P. polymyxa DSM 365 über Konjugation verwendet. Die hergestellten Stämme sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1 : Übersicht über die hergestellten Produktionsorganismen
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Alle Knock-outs wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Rütering et al., 2017). Kurz gesagt wurden gRNAs für jedes Ziel in das Plasmid pCasPP über Golden Gate Assemblierung unter Verwendung von Bbsl kloniert. Danach wurden 1 kb Up- und Downstream-Homologieflanken des interessierenden Gens in eine einzigartige Spel-Stelle ligiert, gefolgt von der Transformation von chemisch kompetentem E. coli S17-1. P. polymyxa wurde durch Konjugation unter Verwendung von E. coli S17-1 , das die verschiedenen Plasmide aufwies, transformiert. Übernachtkulturen von Spender- und Empfängerstämmen wurden 1 :100 mit selektiven bzw. nicht-selektiven LB-Medien verdünnt und bei 37 °C für 3 h, 280 U/min kultiviert. 900 pl der Empfängerkultur wurden 15 min bei 42 °C einem Hitzeschock ausgesetzt und mit 300 pl des Spenderstamms vermischt. Die Zellen wurden 2 min bei 6.000 x g zentrifugiert, in 800 pl LB-Medium resuspendiert und auf nicht-selektive LB- Agarplatten getropft. Nach 24 h Inkubation bei 30 °C wurden die Zellen abgeschabt, in 500 pl LB-Brühe resuspendiert und 100 pl davon auf selektivem LB-Agar ausplattiert, der 50 pg/ml Neomycin und 20 pg/ml Polymyxin zur Gegenselektion enthielt. P. po/ymyxa-Konjuganten wurden nach 48-stündiger Inkubation bei 30 °C durch Kolonie-PCR auf erfolgreiche Transformation analysiert. Bestätigte Knock-out-Stämme wurden durch Kultivierung in LB- Brühe ohne antibiotischen Selektionsdruck und anschließendes Replika-Plattieren auf LB- Agarplatten sowohl mit als auch ohne Neomycin Plasmid-kuriert. Stämme, die nicht auf Platten mit Selektionsmarker wuchsen, wurden durch Sequenzierung der Zielregion verifiziert und für weitere Experimente verwendet. Alle Plasmide und Oligonukleotide, die verwendet wurden, um Knock-out-Stämme zu erhalten, sind in den folgenden Tabellen 2 und 3 aufgeführt
Tabelle 2: Einige der verwendeten und hergestellten Plasmide.
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Tabelle 3: Einige der verwendeten Oligonukleotide. Überhänge, die für die Golden Gate Assembly verwendet werden, sind in Kleinbuchstaben dargestellt. Für die Klonierung verwendete Restriktionsstellen sind unterstrichen. Für jedes KO-Konstrukt wurden zwei Sätze von sgRNAs entworfen, getestet und unten aufgelistet, wenn erfolgreiche Knock-outs erzielt wurden
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Beispiel 2 - Fermentative Produktion der Polysaccharide
Alle Medienkomponenten wurden von Carl Roth GmbH (Deutschland) bezogen, sofern nicht anders angegeben. Für Klonierungsverfahren wurden Stämme in LB-Medien gezüchtet (5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Trypton, 10 g/l NaCI) und zusätzlich mit 50 pg/ml Neomycin und 20 pg/ml Polymyxin. Ergänzt falls erforderlich. Alle Stämme wurden in 30% Glycerin bei -80°C gelagert. Vor der Kultivierung wurden die Stämme auf LB-Agarplatten ausgestrichen und 24 h bei 30°C wachsen gelassen.
Das Fermentationsmedium enthielt 30 g/l Glucose, 0,05 g/l CaCh x 2 H2O, 5 g/l Trypton, 1 ,33 g/l MgSÜ4 x 7 H2O, 1 ,67 g/l KH2PO4, 2 ml/l RPMI 1640 Vitaminlösung (Merck, Deutschland) und 1 ml/l Spurenelementlösung (2,5 g/l FeSO4, 2, 1 g/l C4H40eNa2 x 2 H2O, 1 ,8 g/l MnCh x 4 H2O, 0,258 g/l H3BO3, 0,031 g/l CuSO4 x 5 H2O, 0,023 g/l NaMoO4 x 2 H2O, 0,075 g/l C0CI2 x 7 H2O, 0,021 g/l ZnCh). Das Vorkulturmedium wurde gleich dem Fermentationsmedium hergestellt, außer einer reduzierten Glucosekonzentration von 10 g/l und zusätzlichen 20 g/l MOPS, gepuffert auf pH 7.
Die fermentative Produktion von EPS wurde in 1 L Benchtop DASGIP parallelen Bioreaktorsystemen (Eppendorf, Deutschland) mit einem Arbeitsvolumen von 500 ml, ausgestattet mit einem 6-Blatt Rushton Impeller über 28 h mit einem kontrollierten pH von 6,8 und einer pO2-Sättigung von 30 % durchgeführt. Batch-Kultivierungen wurden mit einer anfänglichen ODeoo von 0,1 durch Animpfen mit einem geeigneten Volumen an Vorkultur begonnen. Nach der Fermentation wurde die Biomasse durch Zentrifugation (15.000 x g, 20 °C, 20 min) abgetrennt, gefolgt von einer Querstromfiltration des Überstands unter Verwendung einer 100 kDa-Filtrationskassette (Hydrosart, Sartorius AG, Deutschland). Hochviskose EPS-Varianten wie zum Beispiel die vom Wildtyp hergestellte, wurden vor der Zentrifugation 1 :10 mit ddH2Ü verdünnt. Der konzentrierte Überstand wurde anschließend langsam in zwei Volumina Isopropanol gegossen. Ausgefallenes EPS wurde gesammelt und über Nacht in einem VDL53-Vakuumofen bei 40 °C (Binder, Deutschland) getrocknet. Das Trockengewicht des erhaltenen EPS wurde gravimetrisch bestimmt, bevor es in einer Kugelmühle bei 30 Hz für 1 min zu einem feinen Pulver gemahlen wurde (Mixer Mill MM400, Retsch GmbH, Deutschland).
Beispiel 3 - Charakterisierung der hergestellten Polysaccharide
Die Monomerzusammensetzung von hergestellten EPS-Varianten wurde mit der 1-Phenyl-3- methyl-5-pyrazolon-High-Throughput-Methode (HT-PMP) analysiert (Rühmann, Schmid & Sieber, 2014). Kurz gesagt wurden 0,1 % EPS-Lösungen in einer 96-Well-Platte hydrolysiert, mit einer Silikonmatte versiegelt und weiter mit einer speziell angefertigten Metallvorrichtung mit 2 M TFA (90 min, 121 °C) abgedeckt. Proben wurden mit 3,2% NH4OH neutralisiert. 75 l PMP-Mastermix (0,1 M methanolisches PMP:0,4% Ammoniumhydroxid 2:1) wurden zu 25 pl neutralisiertem Hydrolysat gegeben und 100 min bei 70 °C in einem Thermocycler inkubiert. 20 pl der derivatisierten Proben wurden mit 25 pl 0,5 M Essigsäure und 125 pl ddHaO gemischt und mit einer 0,2 pm Filterplatte (1.000 x g, 2 min) filtriert, gefolgt von HPLC-UV-MS mit einem Ultimate 3000 RS HPLC-System (Dionex, USA). Die Trennung erfolgte auf einer Umkehrphasensäule (Gravity C18, 100 x 2 mm, 1 ,8 pm Teilchengröße, Macherey-Nagel, USA), die auf 50 °C eingestellt war. Die Gradientenelution wurde unter Verwendung einer mobilen Phase A (5 mM Ammoniumacetat (pH 5,6) mit 15 % Acetonitril) und einer mobilen Phase B (100 % Acetonitril) mit einer konstanten Pumprate von 0,6 ml/min durchgeführt.
Um das Vorhandensein einzelner Paenan-Polymere nachzuweisen, wurde für jede Variante der Kohlenhydrat-Fingerabdruck bestimmt (Abb. 4). Für Paenan I wurde ein Monomerverhältnis von 3:1 :1 :1 (Glc:Man:Gal:Pyr) erwartet, während für Paenan II ein äquimolares Verhältnis von Glc:Gal:GlcA:Fuc und für Paenan III ein Monomerverhältnis von 2:2:1 (Glc:Man:GlcA) erwartet wurden. Aufgrund der hohen Anfälligkeit von Uronsäuren gegenüber einem Abbau während der chemischen Hydrolyse wurde GIcA für alle die Uronsäure enthaltenden Polysaccharidzusammensetzungen stark unterschätzt. Zusätzlich zur Monomerzusammensetzung wurden zuvor identifizierte Schlüsseldimere, die mittels MS/MS-Analyse nachgewiesen wurden, verwendet, um jeder Paenan-Variante kombinatorische Knock-out-Varianten zuzuordnen. Durch die Zuordnung der Anwesenheit von Pyruvatketalen zu Paenan I, einem GIcA-Fuc-Dimer zu Paenan II und einem GIcA-Man- Dimer zu Paenan III wurde die Polymerzusammensetzung jeder Knock-out-Variante bestimmt, während die natürliche Polysaccharidverteilung in diesen Varianten beibehalten wurde. Von nun an wird jede EPS-Variante nach den vorliegenden Paenan-Varianten benannt und nicht nach den Gendeletionen, die zum jeweiligen Phänotyp führen.
Das Molekulargewicht von Polymervarianten wurde durch Größenausschlusschromatographie unter Verwendung eines Agilent 1260 Infinity-Systems (Agilent Technologies, Deutschland) bestimmt, das mit einem Brechungsindex-Detektor (SECcurity GPC1260) und einem SECcurity SLD7000 statischen Sieben-Winkel- Lichtstreuungsdetektor (PSS Polymer Standards Service, Deutschland) ausgestattet war. Dazu wurden 0,5 g/l jeder Variante in 0,1 M LiNOa rekonstituiert und 100 pl Probe in 30 min Intervallen in das System injiziert und mit einer TSKgel SuperMP(PW)-H Vorsäule und zwei aufeinanderfolgenden TSKGel SuperMultipore PW-H-Säulen (6,0 mm ID x 15 cm, TOSOH Bioscience, Deutschland) bei 50 °C gehalten. Als Eluent wurde 0.1 M LiNOa bei einer konstanten Flussrate von 0.3 ml/min verwendet. Das absolute Molekulargewicht wurde über Lichtstreuung und Polymerkonzentration bestimmt und mit einem 12-Punkt-Pullulan-Standard (384 Da - 2,35 MDa) und einer 4,5 MDa Xanthanreferenz weiter kreuzvalidiert (Tabelle 4). Tabelle 4: Berechnete Molekulargewichte von Paenan-Varianten, erhalten durch GPC-Analyse mittels 0,5 % EPS-Lösungen in 0,1 M UNO3.
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Trotz der Anwesenheit von drei unterschiedlichen Polymeren im Wildtyp-EPS war keine klare Trennung der einzelnen Paenan-Varianten möglich. Die Analyse einzelner Paenan-Varianten ergab eine ähnliche Molekulargewichtsverteilung für Paenan I und Paenan III. Nur Paenan II scheint mit einer Größe von 5,5- 105 Da deutlich kleiner zu sein. Angesichts des geringen Anteils von Paenan II im Wildtyp-Polymer könnte dies erklären, warum frühere Versuche zur Analyse des Heteroexopolysaccharids von P. polymyxa DSM 365 nicht zwischen mehreren Paenan-Varianten unterscheiden konnten. Interessanterweise zeigte das depyruvylierte Polymer zwar ebenfalls einen kleinen Peak bei etwa 3,0- 106 Da, die Hauptmolmasse wurde jedoch im Vergleich zu allen anderen Paenan-Varianten mit 8,8- 106 Da deutlich größer detektiert. Im Vergleich zur Produktion von Xanthan, bei dem die Seitenketten unregelmäßig mit Acetyl- oder Pyruvylresten versehen sind, scheinen alle Wiederholungseinheiten von Paenan I mit einem Pyruvatketal modifiziert zu sein. Folglich könnte der Verlust dieses Merkmals in der TlepsO-Knockout-Variante die Kettenlängenkontrolle in P. polymyxa beeinflussen, was zu einem erhöhten Molekulargewicht und einem anderen rheologischen Verhalten führt. Alternativ kann die Pyruvylierung auch den hydrodynamischen Radius des Polymers und damit die SEC-MALS-Analyse beeinflussen.
Beispiel 4 - Rheologische Eigenschaften
Für die rheologische Analyse wurden 1% (w/w) Lösungen jedes Polymers in ddH2Ü bzw. 0,5% NaCI (85 mM) hergestellt. Die Leitfähigkeit jeder Lösung wurde unter Verwendung einer LF413T-ID-Elektrode (Schott Instruments, Deutschland) gemessen, um die Restsalzkonzentrationen des Fermentationsmediums zu bestimmen. Rheologische Messungen wurden unter Verwendung eines spannungsgesteuerten Rotationsrheometers MCR 300 (Anton Paar, Österreich) durchgeführt, das mit einem CP 50-1 Kegel-Platte- Messsystem (50 mm Durchmesser, 1° Kegelwinkel, 50 pm Messspalt) ausgestattet war. Alle Messungen, mit Ausnahme von Temperatur-Sweeps, wurden bei 20°C durchgeführt, die von einer TEK 150P-Temperatureinheit kontrolliert wurden. Nach dem Aufträgen der Lösung auf das Rheometer wurden alle Proben vor Beginn der Messungen 5 Minuten bei 20 °C inkubiert. Alle Experimente wurden in technischen Triplikaten durchgeführt.
Viskositätskurven wurden mit einer logarithmisch erhöhten Schergeschwindigkeit von 10'3 auf 103/s durch Messung von 3 Datenpunkten pro Dekade mit abnehmender Messzeit von 100 - 5 s pro Datenpunkt gemessen.
Amplituden-Sweeps wurden mit einer logarithmisch ansteigenden Schubspannungsamplitude von 10'1 bis 103 Pa bei einer Frequenz von 1 Hz gemessen.
Frequenz-Sweeps wurden im linear viskoelastischen Bereich (LVE) mit einer logarithmisch ansteigenden Frequenz von 10'2 bis 10 Hz durchgeführt.
Temperatur-Sweeps wurden innerhalb des LVE mit einer Frequenz von 1 Hz durchgeführt, wobei ein Temperatuanstieg von 20 auf 75 °C mit einer Heizrate von 4 °C/min angewendet wurde. Der Rand des Kegel-Platte-Messsystems wurde mit niedrigviskosem Paraffinöl (Carl Roth, Deutschland) bedeckt, um Verdunstung zu verhindern.
Das thixotrope Verhalten wurde durch eine dreistufige oszillatorische Schersequenz bewertet. In der ersten Stufe wurden die Proben innerhalb des LVE-Bereichs einer Schubspannung ausgesetzt, gefolgt von einer hohen oszillatorischen Scherung von 103 Pa für 30 s. Die strukturelle Erholung wurde dann über 10 min innerhalb der LVE gemessen.
Untersuchungen des Fließverhaltens zeigten ein generelles Scherverdünnungsverhalten aller Paenan-Varianten (Abb. 5). Die höchsten Viskositäten und das höchste Scherverdünnungsverhalten wurden für den Paenan-Wildtyp (I & II & III) mit Zugabe von NaCI beobachtet, gefolgt von Paenan-Wildtyp ohne einwertige Kationen. Alle Einzelvarianten von Paenan l-lll zeigten keine signifikant hohen Viskositäten und ein nahezu Newtonsches Fließverhalten in den mittleren Schergeschwindigkeitsbereichen. Nur Paenan-Wildtyp sowie Paenan I & III zeigten ein streng scherverdünnendes Verhalten nach dem Potenzgesetz und hohe Viskositäten, die in Gegenwart von 0,5 % NaCI anstiegen. Bei der Depyruvylierung von Paenan-Wildtyp nahm die Viskosität drastisch ab und die Zugabe von NaCI hatte nun die nachteilige Wirkung, vergleichbar mit der Depyruvylierung von Xanthan. Bei Xanthan ist die Wirkung auf durch niedrigere Kationen vermittelte intermolekulare Wechselwirkungen zwischen einzelnen Polymermolekülen zurückzuführen. Die Daten der verschiedenen Paenan-Polymere legen einen ähnlichen Effekt zwischen den Paenan I- und Paenan III- Molekülen nahe. Die Kombination von Paenan I & III zeigte fast die gleichen Eigenschaften wie die Kombination von Paenan I & II & III, was die Wechselwirkung zwischen Paenan I und III als Hauptursache für die hohe Viskosität der Polymere unterstreicht. Diese Wechselwirkung kann durch die kationenvermittelte Wechselwirkung des terminalen Pyruvatrestes von Paenan I mit der negativen Ladung der Glucuronsäure im Rückgrat von Paenan III erklärt werden. Interessanterweise führten beide Kombinationen von Paenan I & II und Paenan II & III nicht zum Verhalten des Wildtyps. Folglich schien die Glucuronsäure im Rückgrat von Paenan II nicht mit dem Pyruvylrest von Paenan I zu interagieren, wie die niedrige Viskosität dieser Kombination zeigt. Dies ist besonders interessant, da die einzelne Seitenkette von Paenan II eine bessere Zugänglichkeit der Ladung in Paenan II im Vergleich zu den beiden Seitenketten von Paenan III, die an die Glucuronsäure und die benachbarte Mannose gebunden sind, nahelegen würde (Abb. 1-3). Für die Wechselwirkungen der einzelnen Moleküle gibt es zwei Erklärungen. Erstens die Bildung einzelner Homohelices von Paenan I- bzw. II- bzw. II I-Molekülen und eine anschließende Wechselwirkung dieser Helices. Zweitens die Bildung von Heterohelices von Paenan I & II & III. Die Untersuchung der einzelnen Polymere liefert den Beweis für letzteres. Die Bildung von Homohelices würde auch auf starke Wechselwirkungen zwischen denen von Paenan I allein hinweisen, wenn, wie vermutet, die pyruvylierte Seitenkette nach außen ragt, wie in Xanthan. Andererseits würde eine nach innen ragende Seitenkette, wenn Paenan I Homohelices bilden würde, zu einer ähnlichen Struktur führen, wie sie für Diutangummi beschrieben wird und könnte auch der Grund für die verringerte Viskosität sein. Im Gegensatz zu Diutangummi trägt die Hauptkette aufgrund des Fehlens einer Uronsäure im Rückgrat von Paenan I keine negative Ladung. In allen Fällen könnten Unterschiede in der Helixanordnung von Paenan II und Paenan III die starken Wechselwirkungen von Paenan I & III erklären, aber nicht zwischen Paenan I & II sowie zwischen Paenan II & III, was Anlass zu weiteren Untersuchungen der sekundären und tertiären Polymerstrukturen gab.
Eine detaillierte Untersuchung der einzelnen Polymervarianten und der Kombination von Paenan II & III zeigte mehrere strukturviskose Bereiche, die durch bis zu drei verschiedene K- und n-Werte der Potenzgesetze der einzelnen Abschnitte angezeigt werden (Tabelle 5). Dieses Phänomen zeigte sich sowohl für Paenan I und Paenan II einzeln als auch für Kombinationen aus Paenan I & II und Paenan I & III. Für Paenan III, Paenan I & III oder die Wildtyp-Zusammensetzung wurde jedoch nur eine einzelne strukturviskose Region beobachtet. Bei Paenan I & II ist die Newton-Region in Gegenwart von NaCI stärker ausgeprägt, was der Grund für das leichte Einsetzen einer Newton-Region im Paenan- Wildtyp und Paenan I & III in Gegenwart von NaCI sein könnte. Folglich könnte dieser Effekt Paenan I bzw. Paenan II zugeschrieben werden. Tabelle 5: Modellparameter (K, n) der Potenzgesetzanpassungen der verschiedenen Paenan-Kombinationen mit und ohne Zusatz von 0,5 % NaCI. Wenn mehrere Abschnitte einzeln angepasst wurden, werden die K- und n- Werte des einzelnen Abschnitts in aufsteigender Reihenfolge des entsprechenden Schergeschwindigkeitsbereichs angezeigt.
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: zeigt Newtonsches Fließverhalten an Die grundlegenden viskoelastischen Eigenschaften, die durch den Amplituden-Sweep bestimmt wurden (Abbildungen 6 und 7) sind in Tabelle 6 aufgeführt. Paenan-Wildtyp (I & II & III) zeigte ein weiches und elastisches gelartiges Verhalten mit einer Streckgrenze von 9,1 Pa (32 % Dehnung) und einen Fließpunkt von 51,1 Pa (550 % Dehnung) mit einem Dämpfungsfaktor von 0,3 innerhalb des LVE. Die Zugabe von 0,5 % NaCI führte zu einer erhöhten Ausbeute und einem erhöhten Fließpunkt von 32,3 Pa bzw. 90,8 Pa, entsprechend einer Dehnung von 82 % bzw. 590 %. Ein Dämpfungsfaktor von 0,1 und der deutliche G”- Peak nach dem LVE weisen auf einen stärkeren, aber spröderen Gelcharakter hin. Frequenz- Sweeps (Abbildung 8) zeigten auch ein viskoelastisches, flüssigkeitsähnliches Verhalten von G' und G" für Paenan I & II & III mit überwiegend elastischem Verhalten im gesamten untersuchten Frequenzbereich, das sich bei Zugabe von NaCI eher in Richtung eines gelartigen Verhaltens verschiebt mit geringerer Frequenzabhängigkeit von sowohl G' als auch G". Sowohl mit als auch ohne Zugabe von NaCI war bei niedrigen Frequenzen kein Crossover-Punkt erkennbar, was auf eine Langzeitstabilität des Netzwerks hinweist.
Dieser Gelcharakter wird höchstwahrscheinlich durch die kationenvermittelten Wechselwirkungen zwischen den Pyruvylresten von Paenan I und der -COO- Gruppe der Glucuronsäure von Paenan III verursacht. Einen weiteren Beweis dafür lieferte die Depyruvylierung von Paenan I & II & III, die zum vollständigen Verlust der viskoelastischen Eigenschaften führte. Darüber hinaus zeigten alle einzelnen Paenan-Polymere sowie die Mischungen aus Paenan I & II und Paenan II & III vorherrschende Fluideigenschaften mit Maxwell-ähnlichem Verhalten (Abbildungen 8 und 9). Interessanterweise konnte mit Ausnahme von Paenan II in Gegenwart von NaCI kein Maxwell-Fluid-typischer Übergangspunkt bei höheren Frequenzen beobachtet werden, und die Daten deuteten auf eine beginnende Abnahme von G’ bei höheren Frequenzen hin, was zu einem Fluidverhalten sowohl bei niedrigen als auch bei hohen Frequenzen führte. Dies zeigte sich besonders bei Paenan I & III.
Die hohe Viskosität und das ausgeprägte intermolekulare Netzwerk, das zu einem gelartigen Charakter führt, machen diese Polymervariante zu einer interessanten Verbindung als rheologisches Verdickungsmittel. Ähnlich wie bei anderen mikrobiellen Polysacchariden erscheinen potenzielle Anwendungen als Rheologie-Modifikatoren in Lebensmitteln und Getränken, aber auch technische Anwendungen wie Ölbohrungen vielversprechend. Im Vergleich zu diesen Polysacchariden ist die viskosifizierende Wirkung stark erhöht, was darauf hindeutet, dass niedrigere EPS-Konzentrationen erforderlich sind, um ähnliche Ergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus hat das strukturell verwandte Polysaccharid aus P. polymyxa 2H2 kürzlich eine ausgezeichnete Kompatibilität mit häufig verwendeten Tensiden wie Laurylsulfat oder Cocamidopropylbetain gezeigt, die typischerweise in Kosmetika und Pflegeprodukten verwendet werden. Folglich ist die Verwendung der Wildtyp-EPS- Zusammensetzung von P. polymyxa DSM 365, die Paenan I & II & III enthält, als nachhaltiges Verdickungsmittel für variable Anwendungen geeignet, das kommerziell erhältliche Acrylverbindungen auf Erdölbasis ersetzen kann. Tabelle 6: Viskoelastische Eigenschaften der Paenan-Polymervarianten. n.b.: nicht bestimmt, wenn Messung nicht möglich war
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Die Mischung von Paenan I & III zeigte gelartige Eigenschaften, die denen von Paenan I & II & III sehr ähnlich waren, was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkung hauptsächlich zwischen Paenan I und Paenan III besteht. Im Vergleich zu Paenan I & II & III zeigte Paenan I & III jedoch eine geringere Gelfestigkeit mit Streckgrenzen bei 13,9 Pa und 35,8 Pa mit und ohne Anwesenheit von 0,5 % NaCI und einem weniger ausgeprägten G"-Peak am Ende der LVE-Region in Gegenwart von NaCI. Dies deutet auf schwächere Wechselwirkungen dieser Polymere hin. Untersuchungen der Amplituden-Sweeps der einzelnen Polymere zeigten, dass Paenan I und II beide ein viskoelastisches, flüssigkeitsähnliches Verhalten zeigen, während Paenan III nur ein rein flüssiges Verhalten zeigt. Ohne die Bildung von gelartigen Netzwerken führte die Zugabe von NaCI zu einer Abnahme von G’ und G”, während Paenan I eine höhere Salzstabilität im Vergleich zu Paenan II aufwies. Dies wird auch in der Mischung aus Paenan I & II deutlich, wo die Wirkung von NaCI eher mit Paenan I vergleichbar ist als mit Paenan II. Diese Effekte weisen auf eine Wechselwirkung zwischen Paenan I und II hin, die für die erhöhte Gelstärke von Paenan I & II & III im Vergleich zu Paenan I & III verantwortlich sein könnte. Da sowohl Paenan II als auch Paenan III eine Glucuronsäure im Rückgrat aufweisen, deutet die starke Wechselwirkung von Paenan I & III auf eine bessere Zugänglichkeit der Glucuronsäure von Paenan III im Vergleich zu der von Paenan II hin. Im Gegensatz dazu könnten Wechselwirkungen zwischen Paenan II und Paenan III zu einer anderen strukturellen Anordnung dieser Polymere führen, was zu einer besseren Zugänglichkeit der Glucuronsäure in Paenan II und damit zu verstärkten Wechselwirkungen zwischen Paenan I & II in der Gew.-Polymermischung führt.
Im Gegensatz zu der nativen Polysaccharidzusammensetzung, die Paenan I & II & III enthält, führte die Deletion einzelner Polymere zu signifikant veränderten viskoelastischen Eigenschaften. Während die Kombination von Paenan I & III immer noch ein ausgeprägtes intermolekulares Netzwerk zeigte, das zu einem gelartigen Charakter führte, zeigten einzelne Biopolymere ein flüssigkeitsähnliches Verhalten, das beim Trocknen immer noch Filme bildet. Folglich ergeben sich signifikant unterschiedliche Anwendungen für die Wildtyp-EPS- Zusammensetzung. Eine Anwendung der Polysaccharide der vorliegenden Erfindung ist somit die Bildung von essbaren Filmen und Verpackungsmaterialien ähnlich wie mit Pullulan. Andererseits können die Polysaccharide der vorliegenden Erfindung in hochwertigen biomedizinischen Anwendungen als Beschichtungsmaterialien in pharmazeutischen Systemen zur kontrollierten Wirkstofffreisetzung verwendet werden. Bei anderen geladenen Polysacchariden wie etwa Hyaluronsäure und Alginaten verbesserte die chemische Modifikation der funktionellen Gruppen das Targeting spezifischer Zelltypen, was effektive Wirkstoffabgabesysteme ermöglichte. Darüber hinaus haben Polysaccharide, die von anderen P. polymyxa-Stämmen produziert werden, antioxidative Aktivitäten gezeigt, die pharmakologische Anwendungen weiter verbessern könnten. Temperatur-Sweeps zeigten eine hohe Temperaturabhängigkeit der viskoelastischen Eigenschaften von Paenan I & II & III sowohl mit als auch ohne Zugabe von NaCI (Abbildungen 10 und 11). Die viskoelastischen Eigenschaften von Paenan I & III zeigten eine noch höhere Temperaturabhängigkeit, die durch Zugabe von NaCI reduziert werden konnte. Während die native Polysaccharid-Zusammensetzung, die alle drei Paenan-Varianten enthielt, in Gegenwart von NaCI bis 75 °C einen schwachen Gelcharakter beibehielt, führte die Deletion von Paenan II zu einem Verlust an Temperaturstabilität. Dies lässt auf eine stabilisierende Wirkung von Paenan II hinsichtlich der Temperaturstabilität des Polymernetzwerks schließen, was auch durch die hohe Temperaturstabilität von Paenan II im Vergleich zu Paenan I & III deutlich wird. Für Paenan II konnte während des Temperaturanstiegs ein Anstieg von G’ und G” beobachtet werden, der durch die Zugabe von NaCI noch verstärkt wurde. Dieser Effekt ähnelt dem, der bei der zuvor beschriebenen undekorierten Xanthan-Variante beobachtet wurde und könnte auch durch strukturelle Umlagerungen des einzelnen Polymers erklärt werden. Diese Effekte traten jedoch bei keiner anderen Kombination von Paenan II mit anderen Paenan-Polymeren auf, was auf eine unterschiedliche Anordnung der einzelnen Polymere im Gemisch schließen lässt, was die zuvor beschriebenen Unterschiede zwischen Paenan I & II & III und Paenan I & III in Bezug auf ihre viskoelastischen Eigenschaften noch unterstreicht.
Tabelle 7: Temperaturstabilität verschiedener Paenan-Varianten. n.b.: nicht bestimmt, wenn Messung im LVE-Bereich nicht möglich war
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Darüber hinaus wurden die thixotropen Eigenschaften durch einen dreistufigen oszillatorischen Scherspannungstest bestimmt (Tabelle 8). Während bei allen kombinatorischen Varianten von Paenan eine strukturelle Erholung beobachtet wurde, wurden bei der Wildtyp-EPS-Mischung nach drei Minuten mit einer zerstörungsfreien Scherbelastung nur 86,8% der anfänglichen Gelfestigkeit gemessen. Dies unterstreicht ein ausgeprägtes intermolekulares Netzwerk, das mehr Zeit benötigt, um nichtkovalente Wechselwirkungen zwischen einzelnen Polymeren zu erholen und zu koordinieren. Ähnliche Effekte einer verzögerten strukturellen Erholung wurden für Polysaccharidzusammensetzungen mit Paenan I & III beobachtet, was die Hypothese bestätigt, dass der gelartige Charakter hauptsächlich von der Kationen-vermittelten Wechselwirkung zwischen dem Pyruvat von Paenan I und dem Glucuronsäurerest von Paenan III herrührt. Im Gegensatz dazu wurde bei allen anderen Knock-out-Varianten eine sofortige strukturelle Erholung beobachtet, die zur anfänglichen Gelfestigkeit führte. Folglich könnten verschiedene Varianten als Bindemittel anwendbar sein, die ein thixotropes Verhalten vermitteln, das typischerweise für Lacke und Beschichtungen mit unterschiedlichen rheologischen Profilen verwendet wird.
Tabelle 8: Thixotrope Erholung von Paenan-Varianten nach einem dreistufigen oszillierenden Schertest. Die thixotrope Erholung wurde nach 30/90/180 s basierend auf G’ relativ zu den im LVE-Bereich ermittelten Anfangswerten berechnet, n.b.: für diese Variante aufgrund eingeschränkter LVE-Reichweite nicht bestimmt
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Das rheologische Verhalten der von P. polymyxa DSM 365 produzierten Heteroexopolysaccharide unter Verwendung von CRISPR-Cas9-vermittelten Knock-outs von Glycosyltransferasen wurde charakterisiert. Viskoelastische Eigenschaften einzelner Paenan- Varianten und Kombinationen davon wurden detailliert analysiert. Während die Wildtyp-EPS- Zusammensetzung eine hohe Viskosität und ein gelartiges Verhalten zeigte, zeigten Knock- out-Varianten signifikant veränderte physikalisch-chemische Eigenschaften in Abhängigkeit von den vorliegenden individuellen Polysacchariden. Folglich können verschiedene Polysaccharidzusammensetzungen für einen breiten Anwendungsbereich verwendet werden, wie beispielsweise als Verdickungsmittel oder Beschichtungsmaterialien. Beispiel 5 - Vermischen der getrennt hergestellten Polysaccharide und/oder Polysaccharidmischungen
Wie in Abbildung 12 gezeigt, konnte sowohl die Monomerzusammensetzung des Paenan- Wildtyps, als auch dessen rheologischen Eigenschaften, durch Vermischen der getrennt hergestellten Polysaccharide wiederhergestellt werden. Die starken Geleigenschaften der Wildtyp-Polymerkomposition basieren auf der Interaktion der Pyruvatgruppe von Paenan I (PI) und der GIcA von Paenan III (Pill). Durch Mischen der niederviskosen Einzelpolymere PI und PHI im Verhältnis von 1 :2 kann die natürlich produzierte Monomerkomposition der Deletionsvariante ApepQTUV nachgestellt werden und so die gelbildenen und hochviskosen Polymereigenschaften wiederhergestellt werden (siehe auch Tabelle 8).
Tabelle 8 zeigt die Viskositäten von beispielhaften Polysaccharidmischungen, die erhalten wurden, indem getrennt hergestellte Polysaccharide 1 :2 vermischt wurden.
Polymer- Gesamt-EPS- Viskosität [Pa s]* tanö**
Variante Konzentation
[g/i]
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Apepl bezeichnet eine Mutation, durch die der diese Mutation tragende Produktionsorganismus Paenan III nicht mehr herstellen kann, sondern nur Paenan I und Paenan II. Durch Mischen mit Paenan III kann somit eine Mischung hergestellt werden, die der des Wildtyps (WT) ähnlich ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass durch Wahl der Einzelpolysaccharide oder der Polysaccharidmischungen, durch das Mischungsverhältnis, und die Gesamt-EPS-Konzentration ein gewünschter Viskositätsbereich eingestellt werden kann, der der Viskosität des Paenan-Wildtyps entsprechen kann, aber auch diese unter- oder überschreiten kann. Dies zeigt die Flexibilität und damit die Vielseitigkeit in der Anwendung.

Claims

Ansprüche Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids oder einer Polysaccharidmischung durch einen Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, wobei das Verfahren mindestens einen der folgenden Schritte getrennt voneinander umfasst:
(f) Herstellen des Polysaccharids Paenan I durch einen Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass weder das Polysaccharid Paenan II noch das Polysaccharid Paenan III hergestellt werden; und/oder
(g) Herstellen des Polysaccharids Paenan II durch einen Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass weder das Polysaccharid Paenan I noch das Polysaccharid Paenan III hergestellt werden; und/oder
(h) Herstellen des Polysaccharids Paenan III durch einen Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass weder das Polysaccharid Paenan I noch das Polysaccharid Paenan II hergestellt werden; und/oder
(i) Herstellen der Polysaccharide Paenan I und II durch einen Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass das Polysaccharid Paenan III nicht hergestellt wird; und/oder
(j) Herstellen der Polysaccharide Paenan II und III durch einen Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass das Polysaccharid Paenan I nicht hergestellt wird. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das hergestellte Polysaccharid oder die Polysaccharidmischung nach der Herstellung aufgereinigt wird; und/oder wobei der Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa DSM365 ist. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die hergestellten Polysaccharide oder Polysaccharidmischungen vermischt werden, wodurch eine Polysaccharidmischung erhalten wird, die eine Mischung der Polysaccharide Paenan I und Paenan II, oder eine Mischung der Polysaccharide Paenan I und Paenan III, oder eine Mischung der Polysaccharide Paenan II und Paenan III, oder eine Mischung der Polysaccharide Paenan I, Paenan II und Paenan III aufweist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei Paenan I und Paenan III in einem Verhältnis von 1:2 m/v gemischt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die genetische Veränderung, durch die mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass das Polysaccharid Paenan I nicht hergestellt werden kann, ausgewählt ist aus genetischen Veränderungen, die die Funktion der Glykosyltransferase PepD und/oder PepF, und/oder der Undecaprenyl-Glucose-Phosphotransferase PepC unterbinden, und/oder wobei die genetische Veränderung, durch die mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass das Polysaccharid Paenan II nicht hergestellt werden kann, ausgewählt ist aus genetischen Veränderungen, die die Funktion der Glykosyltransferase PepT, Pepll, und/oder PepV, und/oder der Undecaprenyl-Glucose-Phosphotransferase PepQ unterbinden, und/oder der GDP-L-Fucose-Synthase unterbinden; und/oder wobei die genetische Veränderung, durch die mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass das Polysaccharid Paenan III nicht hergestellt werden kann, ausgewählt ist aus genetischen Veränderungen, die die Funktion der Glykosyltransferase Pepl, PepJ, PepK, und/oder PepL unterbinden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die genetische Veränderung, durch die mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass weder das Polysaccharid Paenan II, noch das Polysaccharid Paenan III hergestellt werden, ausgewählt ist aus genetischen Veränderungen, die die Funktion der Glykosyltransferasen Pepl, PepT, Pepll, und PepV, oder die Funktion der Glykosyltransferasen PepK, PepT, Pepll, und PepV, oder die Funktion der
Glykosyltransferasen PepL, PepT, PepU, und PepV, oder die Funktion der
Glykosyltransferasen PepT und PepL unterbinden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die genetische Veränderung, durch die mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass weder das Polysaccharid Paenan I, noch das Polysaccharid Paenan III hergestellt werden, ausgewählt ist aus genetischen Veränderungen, die die Funktion der Glykosyltransferasen PepF und PepJ, oder die Funktion der Glykosyltransferasen PepD und PepJ unterbinden. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die genetische Veränderung, durch die mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass weder das Polysaccharid Paenan I, noch das Polysaccharid Paenan II hergestellt werden, ausgewählt ist aus genetischen Veränderungen, die die Funktion der Undecaprenyl-Glucose-Phosphotransferase PepQ und der Glykosyltransferase PepF unterbinden. Zusammensetzung, die das Polysaccharid Paenan I, aber weder das Polysaccharid Paenan II noch das Polysaccharid Paenan III aufweist; oder
Zusammensetzung, die das Polysaccharid Paenan II, aber weder das Polysaccharid Paenan I noch das Polysaccharid Paenan III aufweist; oder Zusammensetzung, die das Polysaccharid Paenan III, aber weder das Polysaccharid Paenan I noch das Polysaccharid Paenan II aufweist; oder Zusammensetzung, die das Polysaccharid Paenan I und das Polysaccharid Paenan II aber nicht das Polysaccharid Paenan III aufweist; oder Zusammensetzung, die das Polysaccharid Paenan II und das Polysaccharid Paenan III aber nicht das Polysaccharid Paenan I aufweist. Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass weder das Polysaccharid Paenan II noch das Polysaccharid Paenan III hergestellt werden können; oder
Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass weder das Polysaccharid Paenan I noch das Polysaccharid Paenan III hergestellt werden können; oder
Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass weder das Polysaccharid Paenan I noch das Polysaccharid Paenan II hergestellt werden können; oder
Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass das Polysaccharid Paenan III nicht hergestellt werden kann; oder
Produktionsorganismus Paenibacillus polymyxa, in dem durch genetische Veränderung mindestens eine enzymatische Funktion eines Polysaccharid-Biosyntheseclusters ausgeschaltet ist, so dass das Polysaccharid Paenan I nicht hergestellt werden kann. Verwendung eines Polysaccharids, das Paenan I, Paenan II, oder Paenan III, oder eine Mischung aus einer beliebigen Kombination von Paenan I, Paenan II, und Paenan III aufweist, als rheologischer Vermittler, Bindemittel, Stabilisierungsmittel, Emulsionsmittel, oder Flokkulierungsmittel, vorzugsweise im Lebensmittel-, Pharmazeutik-, und/oder Kosmetikbereich. Verwendung nach Anspruch 11, als ein Zusatzstoff zu einem Lebensmittelprodukt, gegebenenfalls ausgewählt aus Backwaren, Suppen, Soßen, Mayonnaise, Ketchup, Konfitüren, Marmeladen, Gelees, Konserven (Obst- und Gemüse), Salatdressing, Speiseeis, Milchmischgetränken, Pudding, Sauergemüse, Fleisch- und Fischkonserven, oder als ein Zusatzstoff in einem Kosmetikprodukt, gegebenenfalls ausgewählt aus einem Duschgel, Kosmetikcremes und Lotionen, Haarshampoo, Hautcremes, Zahnpaste, Feuchtigkeitscremes, oder als ein Zusatzstoff in einem pharmazeutischen oder medizinischen Produkt, gegebenenfalls ausgewählt aus Wundauflagen, Partikeln zur kontrollierten Wirkstofffreigabe, Augentropfen, Tablettencoatings, Kapseln für Nahrungsergänzungsmittel, oder zur Verwendung im Gewebeengineering zur Unterstützung der Oberflächenadhesion nach Operationen, im Water flooding für Erdölgewinnung, in der Bioremediation und Abwasseraufreinigung, zur Schwermetallbindung, als Zementzusatz, um Partikel während dem Aushärten in Schwebe zu halten, oder als Lackadditiv.
PCT/EP2022/072461 2021-09-10 2022-08-10 Polysaccharid oder polysaccharidmischung, hergestellt durch paenibacillus polymyxa WO2023036546A1 (de)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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HE XIAOJUAN ET AL: "Effects of an EPS Biosynthesis Gene Cluster of Paenibacillus polymyxa WLY78 on Biofilm Formation and Nitrogen Fixation under Aerobic Conditions", MICROORGANISMS, vol. 9, no. 2, 1 February 2021 (2021-02-01), pages 289, XP055886225, ISSN: 2076-2607, DOI: 10.3390/microorganisms9020289 *
RÜTERING ET AL., SYNTH BIOL (OXF, January 2017 (2017-01-01)
RÜTERING MARIUS ET AL: "Rheological characterization of the exopolysaccharide Paenan in surfactant systems", CARBOHYDRATE POLYMERS, APPLIED SCIENCE PUBLISHERS , LTD BARKING, GB, vol. 181, 26 November 2017 (2017-11-26), pages 719 - 726, XP085304794, ISSN: 0144-8617, DOI: 10.1016/J.CARBPOL.2017.11.086 *
RÜTERING MARIUS ET AL: "Supporting Information Tailor-made Exopolysaccharides - CRISPR-Cas9 mediated genome editing in Paenibacillus polymyxa", 21 December 2017 (2017-12-21), pages 1 - 9, XP055983202, Retrieved from the Internet <URL:https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/synbio/2/1/10.1093_synbio_ysx007/3/ysx007_supp.pdf?Expires=1671984199&Signature=AbpGcyR3m4mploUC3ntWt1wUvX-~YgJpFUFHBXVynkShlqYRy-s7XMBVlAMlHYND-Mo-Wx0xaV9B-NtRPrGDlfZtG6aZ1kpoMxomk8eCpybBg18vHRJdgMhoKR17~2tIE0dPBCg17fxavFPMfQ5hYNx9> [retrieved on 20221120] *
RÜTERING MARIUS ET AL: "Tailor-made exopolysaccharides-CRISPR-Cas9 mediated genome editing in Paenibacillus polymyxa", SYNTHETIC BIOLOGY, vol. 2, no. 1, 1 January 2017 (2017-01-01), XP055983199, Retrieved from the Internet <URL:http://academic.oup.com/synbio/article-pdf/2/1/ysx007/33640384/ysx007.pdf> [retrieved on 20221121], DOI: 10.1093/synbio/ysx007 *
SCHILLING CHRISTOPH ET AL: "Novel Prokaryotic CRISPR-Cas12a-Based Tool for Programmable Transcriptional Activation and Repression", ACS SYNTHETIC BIOLOGY, vol. 9, no. 12, 25 November 2020 (2020-11-25), Washington DC ,USA, pages 3353 - 3363, XP093000712, ISSN: 2161-5063, DOI: 10.1021/acssynbio.0c00424 *

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