WO2023033299A1 - 세포 유래 소포체 제조 장치 및 이를 이용한 제조 방법 - Google Patents

세포 유래 소포체 제조 장치 및 이를 이용한 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2023033299A1
WO2023033299A1 PCT/KR2022/006155 KR2022006155W WO2023033299A1 WO 2023033299 A1 WO2023033299 A1 WO 2023033299A1 KR 2022006155 W KR2022006155 W KR 2022006155W WO 2023033299 A1 WO2023033299 A1 WO 2023033299A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell
filter assembly
filter
supply line
endoplasmic reticulum
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/006155
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
정직한
김병진
배신규
Original Assignee
주식회사 엠디뮨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 엠디뮨 filed Critical 주식회사 엠디뮨
Publication of WO2023033299A1 publication Critical patent/WO2023033299A1/ko
Priority to US18/593,346 priority Critical patent/US20240200008A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/58—Reaction vessels connected in series or in parallel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/38—Caps; Covers; Plugs; Pouring means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/14—Pressurized fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/24—Recirculation of gas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/04—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by injection or suction, e.g. using pipettes, syringes, needles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M37/00—Means for sterilizing, maintaining sterile conditions or avoiding chemical or biological contamination
    • C12M37/02—Filters

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus for preparing cell-derived endoplasmic reticulum and a manufacturing method using the same. More specifically, it relates to a cell-derived endoplasmic reticulum manufacturing apparatus and a manufacturing method using the same for preparing cell-derived endoplasmic reticulum by transferring fluid containing nucleated or non-nucleated cells into a depth filter using a pressure container.
  • Extracellular vesicles refer to various types of particles secreted from cells, and include exosomes derived from the endosomal pathway and microvesicles derived from the plasma membrane. microvesicles), etc.
  • Exosomes which are spherical vesicles excreted by cells, contain various information such as protein and DNA of the mother cell, and are being used as biomarkers to actively develop cancer diagnostic markers and sensors.
  • microvesicles are a kind of organelles generally having a size of 0.03 to 1 ⁇ m, which are naturally separated from cell membranes and have a double phospholipid membrane form, and cytoplasm such as mRNA, DNA, and proteins. It contains my ingredients.
  • centrifugal separator can be used as a method for obtaining extracellular vesicle mimics, but the centrifugal separator is expensive and still has limitations in yields not meeting expectations.
  • An object of the present invention is to provide an apparatus for preparing cell-derived endoplasmic reticulum capable of easily increasing the production scale and simplifying the production process in preparing cell-derived endoplasmic reticulum and a manufacturing method using the same in order to solve the above problems.
  • the present invention provides a first pressure vessel and a second pressure vessel to which a culture medium supply line and a gas supply line are connected to one side of which a cell culture medium is supplied; a first extrusion line connected to the other side of the first pressure vessel; a second extrusion line connected to the other side of the second pressure vessel and communicating with the first extrusion line; at least one filter disposed on the first extrusion line or the second extrusion line through which the cell culture medium passes; and a harvest line communicating with the first extrusion line and the second extrusion line.
  • the filter is characterized in that at least one disposed on the first extrusion line and the second extrusion line.
  • the filter is characterized in that a depth filter (depth filter).
  • the present invention is connected to the culture medium supply line and the gas supply line to which the cell culture medium is supplied to one side, the first filter assembly and the second filter assembly provided with a filter inside; a first extrusion line connected to the other side of the first filter assembly; a second extrusion line connected to the other side of the second filter assembly and communicating with the first extrusion line; and a harvest line communicating with the first extrusion line and the second extrusion line.
  • the first filter assembly and the second filter assembly have lower ends in which at least one mounting hole is formed; a cartridge filter detachably provided in the mounting hole; a middle portion formed to accommodate the cartridge filter therein and coupled to the lower end portion; and an upper end fastened to an upper end of the middle part to seal the inside together with the lower end and the middle part.
  • first filter assembly and the second filter assembly may include a plurality of intermediate portions provided to be coupled to and detachable from each other, and an inner space may be expanded by coupling the plurality of intermediate portions to each other.
  • first filter assembly and the second filter assembly may further include a pressure regulator connected to the gas supply line to mix gas and adjust pressure.
  • first filter assembly and the second filter assembly are provided to be detachable from the mounting hole, characterized in that further comprising a cap that seals the mounting hole in a state inserted into the mounting hole.
  • the present invention is a method for producing cell-derived endoplasmic reticulum using the cell-derived endoplasmic reticulum manufacturing apparatus, a) a solution containing cells into one or more of the first pressure vessel and the second pressure vessel putting in; b) opening the gas supply line connected to the first pressure vessel and closing the gas supply line connected to the second pressure vessel to allow the solution to pass through the filter; and c) closing the gas supply line connected to the first pressure vessel and opening the gas supply line connected to the second pressure vessel so that the solution passes through the filter in the opposite direction in step b). It provides a method for preparing a cell-derived endoplasmic reticulum comprising the step.
  • the method may further include d) repeating steps b) and c) a predetermined number of times.
  • the solution is a cell culture medium
  • the step a) is characterized by injecting the cell culture medium into at least one of the first pressure vessel and the second pressure vessel through the culture medium supply line.
  • opening the gas supply line connected to the pressure vessel into which the cell culture medium is introduced allows the cell culture medium to pass through the filter; Discharging the used medium in which cells do not remain through the harvest line; and injecting a solution for suspending the cells through the harvest line.
  • the solution is a cell suspension
  • the step a) is characterized by injecting the cell suspension into one or more of the first pressure container and the second pressure container through the culture medium supply line.
  • the present invention is a method for producing cell-derived endoplasmic reticulum using the cell-derived endoplasmic reticulum manufacturing apparatus, a) inside any one or more filter assemblies of the first filter assembly and the second filter assembly through the culture medium supply line Injecting a solution containing cells into the furnace; b) the gas supply line connected to the first filter assembly is opened, and the gas supply line connected to the second filter assembly is closed so that the cell culture medium enters the cartridge inside the first filter assembly and the second filter assembly. passing through a filter; and c) closing the gas supply line connected to the first filter assembly and opening the gas supply line connected to the second filter assembly so that the cell culture medium flows in the opposite direction in step b) to the first filter assembly. and passing through the cartridge filter inside the second filter assembly.
  • the method may further include d) repeating steps b) and c) a predetermined number of times.
  • the solution is a cell culture medium
  • step a) is characterized in that the cell culture medium is introduced into at least one of the first filter assembly and the second filter assembly through the culture medium supply line.
  • step a) opening the gas supply line connected to the filter assembly into which the cell culture medium is introduced to allow the cell culture medium to pass through the filter; Discharging the used medium in which cells do not remain through the harvest line; and injecting a solution for suspending the cells through the harvest line.
  • the solution is a cell suspension
  • step a) is characterized in that the cell suspension is introduced into at least one of the first filter assembly and the second filter assembly through the culture medium supply line.
  • filtration or extrusion of cells is performed in the first filter assembly and the second filter assembly, or filtration and extrusion of cells are performed simultaneously.
  • the present invention has the effect of stably, economically, and mass-producing cell-derived endoplasmic reticulum through a simplified process.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing an apparatus for manufacturing cell-derived vesicles according to a first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram schematically illustrating an apparatus for manufacturing cell-derived vesicles according to a second embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram schematically illustrating an apparatus for manufacturing cell-derived endoplasmic reticulum according to a third embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram schematically illustrating an apparatus for manufacturing cell-derived vesicles according to a fourth embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 and 6 are exploded perspective views of the filter assembly.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating the results of productivity, particle concentration, particle size, PDI, protein concentration, and DNA concentration trend according to the number of extrusions when cells are harvested and extruded using the apparatus for producing cell-derived endoplasmic reticulum according to a second embodiment of the present invention it is a drawing
  • 9 is a diagram of the results of the average extrusion process time according to various parameters.
  • 10 is a diagram of the results of productivity and average extrusion processing time according to the amount of PBS per cell and the temperature of PBS.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing an apparatus for manufacturing cell-derived vesicles according to a first embodiment of the present invention.
  • the apparatus 10 for preparing cell-derived vesicles according to the first embodiment of the present invention includes a pressure vessel 100 and a filter 110.
  • a culture medium supply line 102 through which cell culture medium is supplied is connected to one side of the pressure vessel 100, a gas supply line 104, and a vent line 106, and an extrusion line 112 is connected to the other side.
  • At least one filter 110 through which the cell culture fluid discharged from the pressure vessel 100 passes is disposed, and at an end of the extrusion line 112, a harvest line communicating with the extrusion line 112 (114) is provided.
  • the filter 110 is preferably a depth filter.
  • valves 120 are installed in the culture medium supply line 102, the gas supply line 104, the vent line 106, the extrusion line 112, and the harvest line 114, respectively, to control the opening and closing of the corresponding lines or to supply Alternatively, the pressure of the discharged fluid may be adjusted.
  • Gas such as air or nitrogen is supplied from a separate gas tank (not shown) connected to the gas supply line 104 through the gas supply line 104 .
  • a cell harvesting method for separating spent media from a cell culture medium using the cell-derived endoplasmic reticulum manufacturing apparatus 10 according to the first embodiment of the present invention is as follows.
  • the cell culture medium is supplied into the pressure vessel 100 through the culture medium supply line 102 .
  • the gas supply line 104 connected to the gas tank is opened, and the vent line 106 is closed so that the cell culture solution passes through the filter 110 through the extrusion line 112 under a predetermined pressure, and the harvest line ( 114) to discharge the spent media in which the cells do not remain.
  • a method for preparing cell-derived endoplasmic reticulum using the cell-derived endoplasmic reticulum manufacturing apparatus 10 according to the first embodiment of the present invention is as follows.
  • the spent media is discharged and the following steps are additionally performed.
  • a solution suitable for suspending cells such as phosphate buffered saline (PBS)
  • PBS phosphate buffered saline
  • the final extrusion solution may include cell-derived endoplasmic reticulum.
  • cell harvesting, cell suspension preparation, and extrusion are performed only within the cell-derived endoplasmic reticulum manufacturing apparatus. , the risk of contamination or deformation of cells exposed to the external environment is reduced, the process can be simplified, and there are advantages in improving the process speed.
  • a cell suspension may be supplied into the pressure vessel 100 through the culture solution supply line 102 instead of the cell culture solution.
  • the step of forming a cell suspension in the pressure container 100 by injecting a solution suitable for suspending cells through a cell harvesting method and the harvesting line 114 may be omitted.
  • the cell suspension may be a solution obtained by harvesting cells from a cell culture medium through centrifugation and resuspending cells in a solution suitable for resuspending cells such as PBS.
  • FIG. 2 is a diagram schematically illustrating an apparatus for manufacturing cell-derived vesicles according to a second embodiment of the present invention.
  • the cell-derived endoplasmic reticulum manufacturing apparatus 20 according to the second embodiment of the present invention has a structure in which the cell-derived endoplasmic reticulum manufacturing apparatus 10 according to the first embodiment is symmetrically connected.
  • the culture medium supply lines 102 and 102' through which the cell culture medium is supplied, the gas supply lines 104 and 104', and the vent lines 106 and 106' are connected to one side.
  • a harvest line 114 communicating with the first extrusion line 110 and the second extrusion line 112 '.
  • valves 120 are installed in the culture medium supply lines 102 and 102', the gas supply lines 104 and 104', the vent lines 106 and 106', the extrusion lines 112 and 112', and the harvest line 114, respectively, to open and close the corresponding lines. can be adjusted or the pressure of the fluid supplied or discharged can be adjusted.
  • the gas supply lines 104 and 104' communicate with each other and can be connected to one gas tank (not shown), and the flow direction and pressure of the supplied gas can be adjusted by adjusting the opening and closing of the valve 120. there is.
  • the filters 110 and 110' are preferably depth filters, but the type of filter is not limited thereto, and any type of filter may be used as long as it is applicable to the production of cell-derived endoplasmic reticulum, such as a membrane filter.
  • FIG. 3 is a diagram schematically illustrating an apparatus for manufacturing cell-derived endoplasmic reticulum according to a third embodiment of the present invention.
  • the cell-derived endoplasmic reticulum manufacturing apparatus 30 according to the third embodiment of the present invention has only one filter 110 except that it is provided.
  • Other configurations are the same as those of the cell-derived endoplasmic reticulum manufacturing apparatus 20 of the second embodiment.
  • the cell-derived endoplasmic reticulum manufacturing apparatuses 20 and 30 according to the second and third embodiments of the present invention may be formed in a structure in which three or more pressure vessels 100 are connected in parallel.
  • the added pressure vessel 100 has a gas supply line 104 and an extrusion line 112 connected to the culture medium supply line 102, the vent line 106, the gas tank and the harvest line 114, respectively, as described above. ) is installed.
  • a filter 110 may be disposed on the added extrusion line 112 as needed.
  • a method for preparing cell-derived endoplasmic reticulum using the cell-derived endoplasmic reticulum manufacturing apparatus 20 or 30 according to the second or third embodiment of the present invention is as follows.
  • the cell culture medium is introduced into one or more of the first pressure vessel 100 and the second pressure vessel 100' through the culture medium supply lines 102 and 102'.
  • the gas supply lines 104 and 104' connected to the gas tank are opened so that the cell culture medium passes through the filters 110 and 110' through the extrusion lines 112 and 112' under a predetermined pressure, and the cells are harvested through the harvest line 114. Drain any remaining spent media.
  • a solution suitable for suspending cells such as phosphate buffered saline (PBS)
  • PBS phosphate buffered saline
  • the gas supply line 104 connected to the first pressure vessel 100 is opened and the vent line 106 is closed.
  • the gas supply line 104' provided in the second pressure vessel 100' is closed and the vent line 106' is opened so that the cell suspension in the first pressure vessel 100 flows through the first extrusion line 112. After passing through the filters 110 and 110', it is moved to the second pressure container 100'.
  • the gas supply line 104 connected to the first pressure container 100 is closed and the vent line 106 is opened.
  • the gas supply line 104' provided in the second pressure vessel 100' is opened and the vent line 106' is closed so that the cell suspension contained in the second pressure vessel 100' is discharged from the previous step. It flows in the opposite direction, that is, in the direction from the second pressure vessel 100' to the first pressure vessel 100, and passes through the filters 110 and 110'.
  • the process of alternately opening and closing the gas supply lines 104 and 104' is repeated a predetermined number of times to allow the cell suspension to pass through the filters 110 and 110' while reciprocating a plurality of times, thereby increasing the production efficiency of cell-derived endoplasmic reticulum.
  • the harvest line 114 is opened to obtain a final extrusion solution.
  • the final extrusion solution may include cell-derived endoplasmic reticulum.
  • the cell culture medium in the step of injecting the cell culture medium into the pressure vessel, the cell culture medium is subjected to the first pressure Among the vessel 100 and the second pressure vessel 100', it may be put into a pressure vessel adjacent to the filter 110.
  • cell harvesting and extrusion are carried out only within the cell-derived endoplasmic reticulum manufacturing apparatus. Since this is done, there are advantages in that the risk of contamination or transformation of cells exposed to the external environment is reduced, the process can be simplified, and the process speed is improved.
  • the cell suspension may be supplied into the pressure vessels 100 and 100' through the culture medium supply lines 102 and 102'.
  • the spent media in which cells do not remain are discharged through the harvest line 114 and a solution suitable for suspending the cells is injected into the pressure vessels 100 and 100' through the harvest line 114.
  • the step of forming a cell suspension may be omitted.
  • the cell suspension may be a solution obtained by harvesting cells from a cell culture medium through centrifugation and resuspending cells in a solution suitable for resuspending cells such as PBS.
  • FIGS. 5 and 6 are exploded perspective views of a filter assembly.
  • the culture medium supply lines 102 and 102 'to which the cell culture medium is supplied, the gas supply lines 104 and 104', and the vent lines 106 and 106' are connected to one side, ,
  • each line (102, 102', 104, 104', 106, 106', 112, 112', 114) is provided with a valve 120, and the connection relationship thereof is the cell-derived endoplasmic reticulum manufacturing apparatus (20, 30) according to the second and third embodiments. ) is configured in the same way as
  • the filter 220 is not separately installed on the extrusion lines 112 and 112', but is provided in the filter assemblies 200 and 200'. There is a difference from the devices 20 and 30 of the third embodiment.
  • the filter assemblies 200 and 200' include a lower end 210 in which at least one mounting hole 212 is formed, a cartridge filter 220 detachably provided in the mounting hole 212, and a cartridge filter 220 therein. Equipped with a middle part 230 formed to be accommodated and coupled to the lower end 210, and an upper end 240 that is fastened to the upper end of the middle part 230 to seal the lower end 210 and the middle part 230 and the inside. do.
  • the lower part 210, the middle part 230, and the upper part 240 serve as a pressure vessel in which the inside is sealed in a state of being coupled to each other, and the cell culture medium supplied therein is filtered through the cartridge filter 220 or is extruded
  • the extrusion lines 112 and 112' are connected to the lower end 210, and the culture medium supply lines 102 and 102', the gas supply lines 104 and 104', and the vent lines 106 and 106' are connected to the upper end 240.
  • the filter assemblies 200 and 200 ′ may include a plurality of intermediate parts 230 provided to be coupled to and detachable from each other.
  • the inner space of the filter assemblies 200 and 200' can be expanded by coupling the plurality of intermediate parts 230 to each other, and through this method, the extrusion scale and manufacturing capacity can be easily adjusted as needed.
  • the maximum capacity of the pressure vessel (100, 100') is 2L and the applicable filter area is 0.026m 2 ⁇ 0.1m 2
  • the capacity of the filter assembly (200, 200') is 5L ⁇ 30L and the applicable filter area is 0.026m 2 ⁇ 0.1m 2 is 0.45 m 2 ⁇ 2.7 m 2
  • the maximum capacity of the filter assemblies 200 and 200' depends on the increase in the quantity of the middle part 230 or the expansion of the lower part 210, and the applicable filter area is the mounting hole 212 It has the advantage of increasing productivity in that it can be additionally increased according to facility expansion.
  • the cartridge filter 220 may be mounted as many as the number of mounting holes 212 formed in the mounting hole 212 formed at the lower end 210, but, if necessary, a smaller number than the number of mounting holes 212 It is also possible that the cartridge filter 220 is mounted.
  • a cap 214 for closing may be additionally provided.
  • the cap 214 is detachably provided in the mounting hole 212 and is formed to seal the mounting hole 212 while being inserted into the mounting hole 212 .
  • the filter assemblies 200 and 200' are connected to the gas supply lines 104 and 104' and may further include a pressure regulator for gas mixing and pressure control.
  • the cell-derived endoplasmic reticulum manufacturing apparatus 40 may be formed in a structure in which three or more filter assemblies 200 are connected in parallel.
  • the added filter assembly 200 includes the culture medium supply line 102, the vent line 106, the gas supply line 104 connected to the gas tank and the harvest line 114, respectively, and the extrusion line 112, as described above. ) is installed.
  • the first filter assembly 200 and the second filter assembly 200' through the culture medium supply line
  • the cell culture medium is introduced into one or more of the filter assemblies.
  • the gas supply lines 104 and 104' connected to the gas tank are opened and the vent lines 106 and 106' are closed so that the cell culture medium passes through the cartridge filter 220 inside the filter assembly 200 and 200' under a predetermined pressure, Through the harvest line 114, spent media without remaining cells is discharged.
  • a solution suitable for suspending cells such as phosphate buffered saline (PBS) is injected through the harvest line 114 to filter assembly ( 200,200') to form a cell suspension.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the gas supply line 104 provided in the first filter assembly 200 is opened and the vent line 106 is closed.
  • the gas supply line 104' provided in the second filter assembly 200' is closed and the vent line 106' is opened so that the cell suspension is supplied to the first filter assembly 200 and the second filter assembly 200'. ) to pass through the cartridge filter 220 inside.
  • the gas supply line 104 connected to the first filter assembly 200 is closed and the vent line 106 is opened.
  • the gas supply line 104' provided in the second filter assembly 200' is opened and the vent line 106' is closed so that the cell suspension accommodated in the second filter assembly 200' is removed from the previous step. It flows in the opposite direction, that is, in the direction from the second filter assembly 200' to the first filter assembly 200, and passes through the cartridge filter 220.
  • the process of alternately opening and closing the gas supply lines 104 and 104' is repeated a predetermined number of times to allow the cell suspension to reciprocate through the filter 220, thereby increasing the production efficiency of cell-derived endoplasmic reticulum.
  • the harvest line 114 is opened to obtain a final extrusion solution.
  • the final extrusion solution may include cell-derived endoplasmic reticulum.
  • the process of manufacturing cell-derived endoplasmic reticulum using the cell-derived endoplasmic reticulum manufacturing apparatus 40 according to the fourth embodiment of the present invention since cell harvesting and extrusion are performed only within the cell-derived endoplasmic reticulum manufacturing apparatus, the cells are externally The risk of contamination or deformation due to exposure to the environment is reduced, the process can be simplified, and the process speed is improved.
  • the cell suspension may be introduced into the filter assemblies 200 and 200' through the culture medium supply lines 102 and 102'.
  • the spent media in which cells do not remain are discharged through the harvest line 114 and a solution suitable for resuspending the cells is injected through the harvest line 114 into the filter assembly 200 or 200'.
  • the step of forming a cell suspension may be omitted.
  • the cell suspension may be a solution obtained by harvesting cells from a cell culture medium through centrifugation and resuspending cells in a solution suitable for resuspending cells such as PBS.
  • the concentration and size of the particles were measured using Zetaview equipment (Particle metric). Equipment preparation and cleaning procedures were carried out according to the manufacturer's instructions. Samples prepared for analysis were diluted using a PBS solution passed through a 0.1 ⁇ m pore filter to 50 to 200 particles/frame, and particle concentration and particle size were measured using 1 mL of the sample.
  • PDI was measured using a Zatasizer NanoZS (Malvern).
  • the prepared sample was diluted using a PBS solution passed through a 0.1 ⁇ m pore filter to obtain a 600-1200 derived count rate, and then 1-2 mL of the sample was placed in a cuvette (Rooll) and measured.
  • Protein and DNA concentrations were measured using a QubitTM 4 Fluorometer (Invitrogen).
  • QubitTM Protein Assay Kit and QubitTM dsDNA HS Assay Kit were used to measure protein and DNA concentrations, respectively.
  • the sample and standard solutions were mixed with the working solution by vortexing, and the solution for protein measurement was reacted for 15 minutes and the solution for DNA measurement for 2 minutes at room temperature. Afterwards, each reacted solution was placed in a QubitTM 4 Fluorometer chamber and the final concentration was measured according to the manufacturer's instructions.
  • one depth filter (Sartopure PP3 Capsules, total membrane area: 0.026 m 2 , retention rates: 0.65 ⁇ m) is connected to a pressure vessel, and air is supplied to the pressure vessel. Connect the gas supply line. 500 mL of HEK293 cell culture medium concentration 5.78E+06 cells/mL was put into a pressure vessel. The medium (spent media) used in the harvest line was discharged by pressurizing with 0.1 bar of air. The draining time of the medium used was 120 seconds.
  • the cell extrusion process was performed as shown in ⁇ Experimental Examples 2 to 17> below.
  • HEK293 cell culture medium concentration 7.87E+06 cells/mL 500 mL was harvested by centrifugation. The harvested cells were resuspended in 500 mL room temperature phosphate buffered saline (PBS), and then put into two pressure vessels in half. One valve of the gas supply line was closed and the other was opened so that the cell solution resuspended in one direction passed through the filter.
  • PBS room temperature phosphate buffered saline
  • Opening and closing the left and right valves in opposite directions was repeated a total of 60 times.
  • the air pressure supplied to the pressure vessel was 1 bar for the first extrusion and 2.5 bar for 2 to 60 extrusions.
  • the particle concentration in the final extrusion solution was measured, and the productivity of particles per cell was analyzed as 11,563 particles/cell.
  • two depth filters (Sartopure PP3 Capsules, total membrane area: 0.052 m 2 , retention rates: 0.65 ⁇ m) are connected between pressure vessels, and a gas supply line is connected to each pressure vessel to supply air.
  • 500 mL of HEK293 cell culture medium concentration 7.65E+06 cells/mL was harvested by centrifugation. The harvested cells were resuspended in 500 mL of room temperature PBS, and then put into two pressure vessels in half.
  • One valve of the gas supply line was closed and the other was opened so that the cell solution resuspended in one direction passed through the filter.
  • the left and right valves were opened and closed in reverse, and a total of 100 times were passed.
  • the air pressure supplied to the pressure vessel was 1 bar for the first extrusion and 2.5 bar for 2 to 100 extrusions.
  • the particle concentration in the final extrusion solution was measured, and the productivity of particles per cell was analyzed as 17,300 particles/cell.
  • two depth filters (Sartopure PP3 Capsules, total membrane area: 0.052 m 2 , retention rates: 0.65 ⁇ m) are connected between pressure vessels, and a gas supply line is connected to each pressure vessel to supply air.
  • 300 mL of HEK293 cell culture medium concentration 5.80E+06 cells/mL was harvested by centrifugation. The harvested cells were resuspended in 500 mL of room temperature PBS, and then put into two pressure vessels in half. One valve of the gas supply line was closed and the other was opened so that the cell solution resuspended in one direction passed through the filter. Opening and closing the left and right valves in opposite directions was repeated a total of 90 times.
  • the air pressure supplied to the pressure vessel was 1 bar for the first extrusion and 2.5 bar for extrusions 2 to 90 times.
  • the particle concentration in the final extrusion solution was measured, and the productivity of particles per cell was analyzed as 17,241 particles/cell.
  • two depth filters (Sartopure PP3 Capsules, total membrane area: 0.052 m 2 , retention rates: 0.65 ⁇ m) are connected between pressure vessels, and a gas supply line is connected to each pressure vessel to supply air.
  • HEK293 cell culture medium concentration 3.15E+06 cells/mL 584 mL was put into two pressure vessels in half.
  • Both valves of the gas supply line were opened and pressurized at 0.2 bar to discharge spent media to the harvest line.
  • the medium drain time used was 29 seconds.
  • 5 to 10 mL was sampled after sufficiently mixing the medium used physically, and the sample was evenly distributed on the surface of a 100 mm culture petri-dish for cell observation.
  • Back-flushing which is a process of resuspending the harvested cells inside the extrusion device, was performed by injecting 300 mL of PBS at room temperature back into the harvest line using a peristaltic pump. Back-flushing time took a total of 81 seconds.
  • one valve of the gas supply line was closed and the other valve was opened to allow the resuspended cell solution to pass through the filter in one direction. Opening and closing the left and right valves in opposite directions was repeated a total of 120 times.
  • the air pressure supplied to the pressure vessel was carried out at 1.0 bar.
  • the particle concentration in the final extrusion solution was measured and the productivity of particles per cell was analyzed as 15.492 particles/cell.
  • two depth filters (Sartopure PP3 Capsules, total membrane area: 0.052 m 2 , retention rates: 0.65 ⁇ m) are connected between pressure vessels, and a gas supply line is connected to each pressure vessel to supply air.
  • 500 mL of HEK293 cell culture medium concentration 3.15E+06 cells/mL was put into two pressure vessels in half.
  • Both valves of the gas supply line were opened and pressurized at 0.2 bar to discharge spent media to the harvest line.
  • the medium drain time used was 30 seconds.
  • two depth filters (Sartopure PP3 Capsules, total membrane area: 0.052 m 2 , retention rates: 0.65 ⁇ m) are connected between pressure vessels, and a gas supply line is connected to each pressure vessel to supply air.
  • 400 mL of HEK293 cell culture medium concentration 7.62E+06 cells/mL was put into two pressure vessels in half each.
  • Both valves of the gas supply line were opened and pressurized at 0.2 bar to discharge the used medium to the harvest line.
  • the medium drain time used was 33 seconds.
  • two depth filters (Sartopure PP3 Capsules, total membrane area: 0.052 m 2 , retention rates: 0.65 ⁇ m) were connected between pressure vessels, and a gas supply line for supplying nitrogen (N 2 ) gas to each pressure vessel. connected. 575 mL of HEK293 cell culture medium concentration 5.22E+06 cells/mL was put into two pressure vessels in half each. Both valves of the gas supply line were opened and pressurized at 0.2 bar to discharge the used medium to the harvest line. The media evacuation time used was 4 minutes. As a result of analyzing the medium used by the method for analyzing cell retention in the used medium described in Experimental Example 5, it was analyzed that there were no cells remaining in the used medium.
  • two depth filters (Sartopure PP3 Capsules, total membrane area: 0.052 m 2 , retention rates: 0.65 ⁇ m) were connected between pressure vessels, and a gas supply line for supplying nitrogen (N 2 ) gas to each pressure vessel. connected. 575 mL of HEK293 cell culture medium concentration 5.22E+06 cells/mL was put into two pressure vessels in half each. Both valves of the gas supply line were opened and pressurized at 0.2 bar to discharge the used medium to the harvest line. The media evacuation time used was 4 minutes. As a result of analyzing the medium used by the method for analyzing cell retention in the used medium described in Experimental Example 5, it was analyzed that there were no cells remaining in the used medium.
  • two depth filters (Sartopure PP3 Capsules, total membrane area: 0.052 m 2 , retention rates: 0.65 ⁇ m) were connected between pressure vessels, and a gas supply line for supplying nitrogen (N 2 ) gas to each pressure vessel. connected. 575 mL of HEK293 cell culture medium concentration 5.22E+06 cells/mL was put into two pressure vessels in half each. Both valves of the gas supply line were opened and pressurized at 0.2 bar to discharge the used medium to the harvest line. The media evacuation time used was 4 minutes. As a result of analyzing the medium used by the method for analyzing cell retention in the used medium described in Experimental Example 5, it was analyzed that there were no cells remaining in the used medium.
  • two depth filters (Sartopure PP3 Capsules, total membrane area: 0.052 m 2 , retention rates: 0.65 ⁇ m) were connected between pressure vessels, and a gas supply line for supplying nitrogen (N 2 ) gas to each pressure vessel. connected. 684 mL of HEK293 cell culture medium concentration 4.38E+06 cells/mL was put into two pressure vessels in half. Both valves of the gas supply line were opened and pressurized at 0.2 bar to discharge the used medium to the harvest line. As a result of analyzing the medium used by the method for analyzing cell retention in the used medium described in Experimental Example 5, it was analyzed that there were no cells remaining in the used medium.
  • two depth filters (Sartopure PP3 Capsules, total membrane area: 0.052 m 2 , retention rates: 0.65 ⁇ m) were connected between pressure vessels, and a gas supply line for supplying nitrogen (N 2 ) gas to each pressure vessel. connected. 667 mL of HEK293 cell culture medium concentration 4.80E+06 cells/mL was put into two pressure vessels in half. Both valves of the gas supply line were opened and pressurized at 0.2 bar to discharge the used medium to the harvest line. As a result of analyzing the medium used by the method for analyzing cell retention in the used medium described in Experimental Example 5, it was analyzed that there were no cells remaining in the used medium.
  • the cell extrusion process was performed as in ⁇ Experimental Example 18> below.
  • one depth filter (Sartopure PP3 MiDicaps, total membrane area: 0.05 m 2 , retention rates: 0.65 ⁇ m) was connected between pressure vessels, and a gas supply line for supplying nitrogen (N 2 ) gas to each pressure vessel. connected.
  • N 2 nitrogen
  • 620 mL of HEK293 cell culture medium concentration 3.72E+06 cells/mL was put into a pressure vessel connected to the forward direction of the depth filter. Both valves of the gas supply line were opened and pressurized at 0.2 bar to discharge the used medium to the harvest line.
  • a total of four cartridge depth filters (Sartopure PP3 Cartridge, total membrane area: 1.8 m 2 , retention rates: 0.65 ⁇ m) were mounted on the filter assembly. Specifically, two cartridge depth filters were mounted on each lower end of the two filter assemblies, and the idle mounting hole was closed with a cap. Thereafter, a gas supply line for supplying nitrogen (N 2 ) gas was connected to each filter assembly. HEK293 cell culture medium concentration 6.00E+06 cells/mL 12.5 L was put into two filter assemblies, half each. Both valves of the gas supply line were opened and pressurized at 0.4 bar to discharge the used medium to the harvest line. The media evacuation time used was 5 minutes.
  • a total of four cartridge depth filters (Sartopure PP3 Cartridge, total membrane area: 1.8 m 2 , retention rates: 0.65 ⁇ m) were mounted on the filter assembly. Specifically, two cartridge depth filters were mounted on each lower end of the two filter assemblies, and the idle mounting hole was closed with a cap. Thereafter, a gas supply line for supplying nitrogen (N 2 ) gas was connected to each filter assembly. HEK293 cell culture medium concentration 6.00E+06 cells/mL 12.5 L was put into two filter assemblies, half each. Both valves of the gas supply line were opened and pressurized at 0.4 bar to discharge the used medium to the harvest line. The medium drain time used was 22 minutes.
  • a total of four cartridge depth filters (Sartopure PP3 Cartridge, total membrane area: 1.8 m 2 , retention rates: 0.65 ⁇ m) were mounted on the filter assembly. Specifically, two cartridge depth filters were mounted on each lower end of the two filter assemblies, and the idle mounting hole was closed with a cap. Thereafter, a gas supply line for supplying nitrogen (N 2 ) gas was connected to each filter assembly. HEK293 cell culture medium concentration 6.00E+06 cells/mL 12.5 L was put into two filter assemblies, half each. Both valves of the gas supply line were opened and pressurized at 0.4 bar to discharge the used medium to the harvest line. The media evacuation time used was 19 minutes.
  • a total of four cartridge depth filters (Sartopure PP3 Cartridge, total membrane area: 1.8 m 2 , retention rates: 0.65 ⁇ m) were mounted on the filter assembly. Specifically, two cartridge depth filters were mounted on each lower end of the two filter assemblies, and the idle mounting holes were closed with caps. Thereafter, a gas supply line for supplying nitrogen (N 2 ) gas was connected to each filter assembly. HEK293 cell culture medium concentration 6.00E+06 cells/mL 12.5 L was put into two filter assemblies, half each. Both valves of the gas supply line were opened and pressurized at 0.4 bar to discharge the used medium to the harvest line. The media evacuation time used was 21 minutes.
  • FIG. 8 is a diagram of the productivity results of particles per cell according to various parameters
  • FIG. 9 is a diagram of the average extrusion processing time result according to various parameters
  • FIG. 10 is a diagram of the amount of PBS per cell and the temperature of PBS. This is a diagram of the results of the productivity of particles per cell and the average extrusion process time per cell according to the results. As shown, it can be confirmed that mass production of cell-derived endoplasmic reticulum is possible with high efficiency using the apparatus for producing cell-derived endoplasmic reticulum of the present invention.
  • the cell-derived endoplasmic reticulum manufacturing apparatus and manufacturing method using the same of the present invention reduce the risk of contamination and deformation by preparing cell-derived endoplasmic reticulum in an environment with minimal external exposure, and can be stably, economically and mass-produced, and necessary It is very beneficial because the production capacity can be easily adjusted according to this.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 세포 유래 소포체 제조 장치 및 이를 이용한 제조 방법에 관한 것으로, 일측에 세포 배양액이 공급되는 배양액 공급라인과 가스 공급라인이 연결되고, 내부에는 필터가 구비되는 제1 필터 어셈블리 및 제2 필터 어셈블리; 상기 제1 필터 어셈블리의 타측에 연결되는 제1 압출라인; 상기 제2 필터 어셈블리의 타측에 연결되고 상기 제1 압출라인에 연통되는 제2 압출라인; 및 상기 제1 압출라인 및 상기 제2 압출라인에 연통되는 수확라인을 포함하는 세포 유래 소포체 제조 장치 및 이를 이용한 세포 유래 소포체 제조 방법에 관한 것이다. 이러한 본 발명은 세포 유래 소포체를 단순화된 공정을 통해 안정적이면서도 경제적이고 대량으로 제조할 수 있는 효과가 있다.

Description

세포 유래 소포체 제조 장치 및 이를 이용한 제조 방법
본 발명은 세포 유래 소포체 제조 장치 및 이를 이용한 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 유핵 또는 무핵 세포가 포함된 유체를 압력용기를 이용해 깊이 필터 내로 이행함으로써 세포 유래 소포체를 제조하기 위한 세포 유래 소포체 제조 장치 및 이를 이용한 제조 방법에 관한 것이다.
세포외 소포체(extracellular vesicles)는 세포에서 분비되는 다양한 종류의 입자를 지칭하며, 크게는 엔도좀 경로(endosomal pathway)에서 유래하는 엑소좀(exosomes)과 원형질막(plasma membrane)에서 유래하는 마이크로 베지클(microvesicles) 등으로 구분될 수 있다.
세포에 의해 배출되는 구형 소낭인 엑소좀(exosomes)은 모세포의 단백질, DNA 등의 다양한 정보를 지니고 있어, 이를 바이오 마커로 활용하여 암진단 마커 및 센서 개발이 활발히 진행되고 있다.
또한, 마이크로베지클(microvesicles)은 일반적으로 0.03~1㎛의 크기를 가지는 세포 소기관의 일종으로서 세포의 세포막으로부터 자연 유리되어 이중 인지질(phospholipid) 막 형태를 가지고 있으며, mRNA, DNA 및 단백질 등의 세포질 내 성분을 함유하고 있다.
근래에는 이러한 세포외 소포체를 이용한 약물전달체 연구가 활발히 진행되고 있으며, 미량의 약물을 베지클에 캡슐화시켜 특정 부위에 해당 약물을 전달할 수 있는 바, 세포외 소포체를 이용한 다양한 의료분야에서 활용성이 커지고 있다. 특히 마이크로베지클은 세포막에서 직접적으로 유리됨으로써 모세포의 항원체를 그대로 보유하고 있으므로 백신 등의 활용 가능성이 매우 높다.
그러나, 세포로부터 얻을 수 있는 세포외 소포체의 양이 매우 한정적이므로, 최근에는 이를 인위적으로 많은 양을 얻기 위한 세포외 소포모사체 제조방법이 요구되고 있다.
통상적으로, 세포외 소포모사체를 얻기 위한 방법으로 원심분리기가 이용될 수 있으나, 원심 분리기는 가격이 높고 여전히 수득량이 기대에 미치지 못하는 한계가 있다.
본 발명은 상기한 문제를 해결하기 위해 세포 유래 소포체를 제조함에 있어 생산 규모를 용이하게 증대하고 생산 공정을 단순화할 수 있는 세포 유래 소포체 제조 장치 및 이를 이용한 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위해 본 발명은 일측에 세포 배양액이 공급되는 배양액 공급라인과 가스 공급라인이 연결되는 제1 압력용기 및 제2 압력용기; 상기 제1 압력용기의 타측에 연결되는 제1 압출라인; 상기 제2 압력용기의 타측에 연결되고 상기 제1 압출라인에 연통되는 제2 압출라인; 상기 제1 압출라인 또는 상기 제2 압출라인 상에 배치되어 상기 세포 배양액이 통과하는 적어도 하나의 필터; 및 상기 제1 압출라인 및 상기 제2 압출라인에 연통되는 수확라인을 포함하는 세포 유래 소포체 제조 장치를 제공한다.
이때, 상기 필터는 상기 제1 압출라인 및 상기 제2 압출라인 상에 적어도 하나씩 배치되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 필터는 깊이 필터(depth filter)인 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명은 일측에 세포 배양액이 공급되는 배양액 공급라인과 가스 공급라인이 연결되고, 내부에는 필터가 구비되는 제1 필터 어셈블리 및 제2 필터 어셈블리; 상기 제1 필터 어셈블리의 타측에 연결되는 제1 압출라인; 상기 제2 필터 어셈블리의 타측에 연결되고 상기 제1 압출라인에 연통되는 제2 압출라인; 및 상기 제1 압출라인 및 상기 제2 압출라인에 연통되는 수확라인을 포함하는 세포 유래 소포체 제조 장치를 제공한다.
이때, 상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리는 적어도 하나의 장착홀이 형성되는 하단부; 상기 장착홀에 탈착가능하도록 구비되는 카트리지 필터; 내부에 상기 카트리지 필터가 수용되도록 형성되고 상기 하단부에 결합되는 중간부; 및 상기 중간부의 상단에 체결되어 상기 하단부, 상기 중간부와 함께 내부를 밀폐시키는 상단부를 구비하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리는 서로 결합 및 분리가능하도록 구비되는 복수의 상기 중간부를 구비하고, 복수의 상기 중간부들이 서로 결합됨으로써 내부 공간이 확장될 수 있다.
또한, 상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리는 상기 가스 공급라인에 연결되어 가스 혼합 및 압력 조절을 위한 압력 조절기를 더 구비할 수 있다.
또한, 상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리는 상기 장착홀에 탈착가능하도록 구비되고, 상기 장착홀에 삽입된 상태에서 상기 장착홀을 밀폐시키는 캡을 더 구비하는 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명은 상기의 세포 유래 소포체 제조 장치를 이용한 세포 유래 소포체를 제조하는 방법으로서, a) 상기 제1 압력용기 및 상기 제2 압력용기 중 어느 하나 이상의 압력용기 내부로 세포를 포함하는 용액을 투입하는 단계; b) 상기 제1 압력용기에 연결된 상기 가스 공급라인을 개방하고, 상기 제2 압력용기에 연결된 상기 가스 공급라인은 폐쇄시켜 상기 용액이 상기 필터를 통과하도록 하는 단계; 및 c) 상기 제1 압력용기에 연결된 상기 가스 공급라인을 폐쇄하고, 상기 제2 압력용기에 연결된 상기 가스 공급라인은 개방하여 상기 용액이 상기 b) 단계에서의 반대 방향으로 상기 필터를 통과하도록 하는 단계를 포함하는 세포 유래 소포체를 제조하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 방법은 d) 상기 b) 단계 및 상기 c) 단계를 미리 정해진 횟수만큼 반복하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 용액은 세포 배양액이고, 상기 a) 단계는 상기 배양액 공급라인을 통해 상기 제1 압력용기 및 상기 제2 압력용기 중 어느 하나 이상의 압력용기 내부로 상기 세포 배양액을 투입하는 것을 특징으로 한다.
이때, 상기 a) 단계와 상기 b) 단계 사이에 상기 세포 배양액이 투입된 압력용기에 연결된 상기 가스 공급라인을 개방하여 상기 세포 배양액이 상기 필터를 통과하도록 하는 단계; 상기 수확라인을 통해 세포가 잔류하지 않는 사용된 배지를 배출하는 단계; 및 상기 수확라인을 통해 상기 세포를 부유시키기 위한 용액을 주입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 용액은 세포 부유액이고, 상기 a) 단계는 상기 배양액 공급라인을 통해 상기 제1 압력용기 및 상기 제2 압력용기 중 어느 하나 이상의 압력용기 내부로 상기 세포 부유액을 투입하는 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명은 상기의 세포 유래 소포체 제조 장치를 이용한 세포 유래 소포체를 제조하는 방법에 있어서, a) 상기 배양액 공급라인을 통해 상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리 중 어느 하나 이상의 필터 어셈블리 내부로 세포를 포함하는 용액을 투입하는 단계; b) 상기 제1 필터 어셈블리에 연결된 상기 가스 공급라인을 개방하고, 상기 제2 필터 어셈블리에 연결된 상기 가스 공급라인은 폐쇄시켜 상기 세포 배양액이 상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리 내부의 상기 카트리지 필터를 통과하도록 하는 단계; 및 c) 상기 제1 필터 어셈블리에 연결된 상기 가스 공급라인을 폐쇄하고, 상기 제2 필터 어셈블리에 연결된 상기 가스 공급라인은 개방하여 상기 세포 배양액이 상기 b) 단계에서의 반대 방향으로 상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리 내부의 상기 카트리지 필터를 통과하도록 하는 단계를 포함하는 것을 세포 유래 소포체를 제조하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 방법은 d) 상기 b) 단계 및 상기 c) 단계를 미리 정해진 횟수만큼 반복하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 용액은 세포 배양액이고, 상기 a) 단계는 상기 배양액 공급라인을 통해 상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리 중 어느 하나 이상의 필터 어셈블리 내부로 상기 세포 배양액을 투입하는 것을 특징으로 한다.
이때, 상기 a) 단계와 상기 b) 단계 사이에 상기 세포 배양액이 투입된 필터 어셈블리에 연결된 상기 가스 공급라인을 개방하여 상기 세포 배양액이 상기 필터를 통과하도록 하는 단계; 상기 수확라인을 통해 세포가 잔류하지 않는 사용된 배지를 배출하는 단계; 및 상기 수확라인을 통해 상기 세포를 부유시키기 위한 용액을 주입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 용액은 세포 부유액이고, 상기 a) 단계는 상기 배양액 공급라인을 통해 상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리 중 어느 하나 이상의 필터 어셈블리 내부로 상기 세포 부유액을 투입하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리 내에서 세포의 여과 또는 압출이 이루어지거나, 세포의 여과 및 압출이 동시에 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 세포 유래 소포체를 단순화된 공정을 통해 안정적이면서도 경제적이고 대량으로 제조할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 제1 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명의 제2 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 제3 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 제4 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 5 및 도 6은 필터 어셈블리의 분해사시도이다.
도 7은 본 발명의 제2 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치를 이용하여 세포 수확 및 압출 시, 압출 횟수에 따른 생산성, 입자농도, 입자크기, PDI, 단백질 농도, DNA 농도 경향 결과에 대한 도시한 도면이다.
도 8은 다양한 파라미터에 따른 세포당 입자의 생산성 결과에 대한 도면이다.
도 9는 다양한 파라미터에 따른 1회 평균 압출 공정시간 결과에 대한 도면이다.
도 10은 세포당 PBS양 및 PBS 온도에 따른 생산성 및 1회 평균 압출 공정시간 결과에 대한 도면이다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면들을 참조하여 상세하게 설명한다. 우선 각 도면의 구성 요소들에 참조 부호를 첨가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 설명할 것이나, 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정하거나 제한되지 않고 당업자에 의해 실시될 수 있음은 물론이다.
도 1은 본 발명의 제1 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치를 개략적으로 도시한 도면이다.
본 발명의 제1 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(10)는 압력용기(100)와 필터(110)를 포함하여 구성된다.
구체적으로 압력용기(100)의 일측에는 세포 배양액이 공급되는 배양액 공급라인(102)과 가스 공급라인(104) 및 벤트라인(106)이 연결되고, 타측에는 압출라인(112)이 연결된다.
압출라인(112)의 경로 상에는 압력용기(100)에서 배출된 세포 배양액이 통과하는 적어도 하나의 필터(110)가 배치되고, 압출라인(112)의 단부에는 압출라인(112)에 연통되는 수확라인(114)이 구비된다.
이때, 필터(110)는 깊이 필터(depth filter)인 것이 바람직하다.
또한, 배양액 공급라인(102), 가스 공급라인(104), 벤트라인(106), 압출라인(112) 및 수확라인(114)에는 각각 밸브(120)가 설치되어 해당 라인의 개폐를 조절하거나 공급 또는 배출되는 유체의 압력을 조절할 수 있다.
가스 공급라인(104)을 통해서는 가스 공급라인(104)에 연결된 별도의 가스탱크(미도시)로부터 공기 또는 질소 등의 기체가 공급된다.
본 발명의 제1 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(10)를 이용하여 세포 배양액에서 사용된 배지(spent media)를 분리하는 세포 수확(cell harvest) 방법은 다음과 같다.
먼저, 배양액 공급라인(102)을 통해 압력용기(100) 내부로 세포 배양액을 공급한다. 이후, 가스탱크에 연결된 가스 공급라인(104)을 개방하고, 벤트라인(106)은 폐쇄시켜 소정의 압력하에서 세포 배양액이 압출라인(112)을 통해 필터(110)를 통과하도록 하고, 수확라인(114)을 통해 세포가 잔류하지 않는 사용된 배지(spent media)를 배출한다.
본 발명의 제1 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(10)를 이용하여 세포 유래 소포체를 제조하는 방법은 다음과 같다.
상기 세포 수확(cell harvest)방법에서, 사용된 배지(spent media)를 배출한 뒤 다음의 단계를 추가로 진행한다.
먼저, 가스 공급라인(104)이 폐쇄된 상태에서, 수확라인(114)을 통해 인산완충생리식염수(phosphate buffer saline, PBS)와 같이 세포를 부유시키는데에 적합한 용액을 주입하여 압력용기(100) 내에 세포 부유액을 형성한다. 이후, 가스탱크에 연결된 가스 공급라인(104)을 개방하고 벤트라인(106)은 폐쇄시켜 소정의 압력하에서 압력용기(100) 내의 세포 부유액이 압출라인(112)을 통해 필터(110)를 통과하도록 하고, 수확라인(114)을 통해 최종압출 용액을 수득한다.
이때, 상기 최종압출 용액은 세포 유래 소포체를 포함할 수 있다.
위와 같이 본 발명의 제1 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(10)를 이용하여 세포 유래 소포체를 제조하는 과정에서, 세포 수확, 세포 부유액 제조, 압출이 세포 유래 소포체 제조 장치 내에서만 이뤄지기 때문에, 세포가 외부 환경에 노출되어 오염되거나 변형될 위험이 줄어들고, 공정을 단순화할 수 있으며, 공정 속도의 향상에 이점이 있다.
한편, 상기 세포 유래 소포체 제조방법에서, 세포 배양액 대신 세포 부유액을 배양액 공급라인(102)을 통해 압력용기(100) 내부로 공급할 수 있다. 이때, 세포 수확(cell harvest) 방법 및 수확라인(114)을 통해 세포를 부유시키는데에 적합한 용액을 주입하여 압력용기(100) 내에 세포 부유액을 형성하는 단계를 생략할 수 있다. 또한, 이때, 세포 부유액은 세포 배양액에서 원심분리를 통해 세포를 수확하고 PBS 등의 세포를 부유시키는데에 적합한 용액으로 세포를 재부유시킨 용액일 수 있다.
도 2는 본 발명의 제2 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치를 개략적으로 도시한 도면이다.
본 발명의 제2 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(20)는 상기한 제1 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(10)가 대칭적으로 연결된 구조를 갖는다.
구체적으로 제2 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(20)는 일측에 세포 배양액이 공급되는 배양액 공급라인(102,102')과 가스 공급라인(104,104') 및 벤트라인(106,106')이 연결되는 제1 압력용기(100) 및 제2 압력용기(100')와, 제1 압력용기의(100) 타측에 연결되는 제1 압출라인(112), 제2 압력용기(100')의 타측에 연결되고 제1 압출라인(112)에 연통되는 제2 압출라인(112'), 제1 압출라인(112) 및 제2 압출라인(112') 상에 각각 배치되어 세포 배양액이 통과하는 필터(110,110'), 및 제1 압출라인(110)과 제2 압출라인(112')에 연통되는 수확라인(114)을 포함한다.
또한, 배양액 공급라인(102,102'), 가스 공급라인(104,104'), 벤트라인(106,106'), 압출라인(112,112') 및 수확라인(114)에는 각각 밸브(120)가 설치되어 해당 라인의 개폐를 조절하거나 공급 또는 배출되는 유체의 압력을 조절할 수 있다.
이때, 가스 공급라인(104,104')은 서로 연통되어 하나의 가스탱크(미도시)에 연결될 수 있으며, 밸브(120)의 개폐 및 개폐 정도의 조절을 통해 공급되는 가스의 유동방향 및 압력을 조절할 수 있다.
또한, 필터(110,110')는 깊이 필터(depth filter)인 것이 바람직하나, 필터의 종류는 이에 국한되지 않고 멤브레인 필터(membrane filter) 등 세포 유래 소포체 제조에 적용이 가능한 것이라면 어떤 종류의 필터가 사용되어도 무방하다.
도 3은 본 발명의 제3 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치를 개략적으로 도시한 도면이다.
본 발명의 제3 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(30)는 상기한 제2 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(20)와 비교할 때 하나의 필터(110)만을 구비한다는 점을 제외하고 다른 구성은 제2 실시예의 세포 유래 소포체 제조 장치(20)와 동일하게 구성된다.
구체적으로 도시하지는 않았으나, 본 발명의 제2 및 제3 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(20,30)는 3개 이상의 압력용기(100)가 병렬로 연결된 구조로 형성될 수 있다.
이 경우 추가된 압력용기(100)에는 상기한 바와 마찬가지로 배양액 공급라인(102)과 벤트라인(106), 가스탱크 및 수확라인(114)에 각각 연결되는 가스 공급라인(104)과 압출라인(112)이 설치된다.
또한, 추가된 압출라인(112) 상에는 필요에 따라 필터(110)가 배치될 수 있다.
본 발명의 제2 실시예 또는 제3 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(20,30)를 이용하여 세포 유래 소포체를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 배양액 공급라인(102,102')을 통해 제1 압력용기(100) 및 제2 압력용기(100') 중 어느 하나 이상의 압력용기 내부로 세포 배양액을 투입한다.
이후, 가스탱크에 연결된 가스 공급라인(104,104')을 개방하여 소정의 압력하에서 세포 배양액이 압출라인(112,112')을 통해 필터(110,110')를 통과하도록 하고, 수확라인(114)을 통해 세포가 잔류하지 않는 사용된 배지(spent media)를 배출한다. 그 다음으로, 가스 공급라인(104,104')이 폐쇄된 상태에서, 수확라인(114)을 통해 인산완충생리식염수(phosphate buffer saline, PBS)와 같이 세포를 부유시키는데에 적합한 용액을 주입하여 압력용기(100,100') 내에 세포 부유액을 형성한다.
이어서, 제1 압력용기(100)에 연결된 가스 공급라인(104)을 개방하고 벤트라인(106)은 폐쇄한다. 또한, 제2 압력용기(100')에 구비된 가스 공급라인(104')은 폐쇄하고 벤트라인(106')은 개방시켜 제1 압력용기(100) 내의 세포 부유액이 제1 압출라인(112)을 거쳐 필터(110,110')를 통과한 후 제2 압력용기(100')로 이동되도록 한다.
이후, 이전 단계와는 반대로 제1 압력용기(100)에 연결된 가스 공급라인(104)은 폐쇄하고 벤트라인(106)은 개방한다. 또한, 제2 압력용기(100')에 구비된 가스 공급라인(104')은 개방하고 벤트라인(106')은 폐쇄하여 제2 압력용기(100')에 수용되었던 세포 부유액이 이전 단계에서의 반대 방향으로, 즉, 제2 압력용기(100')에서 제1 압력용기(100)로 향하는 방향으로 흘러 필터(110,110')를 통과하도록 한다.
위와 같이 가스 공급라인(104,104')을 번갈아가며 개폐시키는 과정을 미리 정해진 횟수만큼 반복하여 세포 부유액이 필터(110,110')를 복수 회 왕복하면서 통과하도록 함으로써 세포 유래 소포체의 생산 효율을 높일 수 있다.
세포 부유액이 소정횟수 반복하여 필터(110,110')를 통과하도록 한 후에는 수확라인(114)을 개방하여 최종압출 용액을 수득한다.
이때, 상기 최종압출 용액은 세포 유래 소포체를 포함할 수 있다.
한편, 상기 제조방법에서, 제3 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(30)를 이용하여 세포 유래 소포체를 제조하는 경우, 세포 배양액을 압력용기 내부로 투입하는 단계에서, 세포 배양액은 제1 압력용기(100) 및 제2 압력용기(100') 중 필터(110)와 인접한 압력용기에 투입될 수 있다.
위와 같이 본 발명의 제2 실시예 또는 제3 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(20,30)를 이용하여 세포 유래 소포체를 제조하는 과정에서, 세포 수확과 압출이 세포 유래 소포체 제조 장치 내에서만 이뤄지기 때문에, 세포가 외부 환경에 노출되어 오염되거나 변형될 위험이 줄어들고, 공정을 단순화할 수 있으며, 공정 속도가 향상되는 이점이 있다.
한편, 상기 세포 유래 소포체 제조방법에서, 세포 배양액 대신 세포 부유액을 배양액 공급라인(102,102')을 통해 압력용기(100,100') 내부로 공급할 수 있다. 이때, 수확라인(114)을 통해 세포가 잔류하지 않는 사용된 배지(spent media)를 배출하는 단계 및 수확라인(114)을 통해 세포를 부유시키는데에 적합한 용액을 주입하여 압력용기(100,100') 내에 세포 부유액을 형성하는 단계를 생략할 수 있다. 또한, 이때, 세포 부유액은 세포 배양액에서 원심분리를 통해 세포를 수확하고 PBS 등의 세포를 부유시키는데에 적합한 용액으로 세포를 재부유시킨 용액일 수 있다.
도 4는 본 발명의 제4 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치를 개략적으로 도시한 도면이고, 도 5 및 도 6은 필터 어셈블리의 분해사시도이다.
본 발명의 제4 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(40)는 일측에 세포 배양액이 공급되는 배양액 공급라인(102,102')과 가스 공급라인(104,104') 및 벤트라인(106,106')이 연결되고, 내부에는 필터(220)가 구비되는 제1 필터 어셈블리(200) 및 제2 필터 어셈블리(200')와, 제1 필터 어셈블리(200)의 타측에 연결되는 제1 압출라인(112), 제2 필터 어셈블리(200')의 타측에 연결되고 제1 압출라인(112)에 연통되는 제2 압출라인(112'), 및 제1 압출라인(112)과 제2 압출라인(112')에 연통되는 수확라인(114)을 포함한다.
또한, 각 라인(102,102',104,104',106,106',112,112',114)에는 밸브(120)가 구비되며, 그 연결관계는 제2 및 제3 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(20,30)와 동일하게 구성된다.
다만, 제4 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(40)에서 필터(220)는 압출라인(112,112') 상에 별도로 설치되지 않고, 필터 어셈블리(200,200') 내에 구비된다는 점에서 제2 및 제3 실시예의 장치(20,30)와 차이가 있다.
구체적으로 필터 어셈블리(200,200')는 적어도 하나의 장착홀(212)이 형성되는 하단부(210)와, 장착홀(212)에 탈착가능하도록 구비되는 카트리지 필터(220), 내부에 카트리지 필터(220)가 수용되도록 형성되고 하단부(210)에 결합되는 중간부(230), 및 중간부(230)의 상단에 체결되어 하단부(210), 중간부(230)와 내부를 밀폐시키는 상단부(240)를 구비한다.
여기서 하단부(210), 중간부(230) 및 상단부(240)는 서로 결합된 상태에서 내부가 밀폐된 압력용기의 역할을 하며, 그 내부로 공급되는 세포 배양액은 카트리지 필터(220)를 통해 여과 또는 압출된다.
이때, 하단부(210)에는 압출라인(112,112')이 연결되고, 상단부(240)에는 배양액 공급라인(102,102'), 가스 공급라인(104,104') 및 벤트라인(106,106')이 연결된다.
또한, 도 6에 도시된 바와 같이 필터 어셈블리(200,200')는 서로 결합 및 분리가능하도록 구비되는 복수의 중간부(230)를 구비할 수 있다. 복수의 중간부(230)들은 서로 결합됨으로써 필터 어셈블리(200,200') 내부 공간이 확장될 수 있으며, 이러한 방식을 통해 압출 규모 및 제조 용량을 필요에 따라 용이하게 조절할 수 있게 된다.
일반적으로 압력용기(100,100')의 수용 가능한 최대 용량이 2L이고 적용가능한 필터 면적이 0.026m2 ~ 0.1m2 인 것에 비해 필터 어셈블리(200,200')의 수용 가능한 용량은 5L ~ 30L이고 적용 가능한 필터 면적은 0.45m2 ~ 2.7m2 이며, 필터 어셈블리(200,200')의 최대 용량은 결합되는 중간부(230)의 수량 증가 또는 하단부(210) 확장에 따라서, 그리고 적용 가능한 필터 면적은 장착홀(212) 증설에 따라서 추가로 증가할 수 있다는 점에서 생산성을 높일 수 있는 장점이 있다.
한편, 하단부(210)에 형성되는 장착홀(212)에는 형성된 장착홀(212)의 갯수만큼 카트리지 필터(220)가 장착될 수 있으나, 필요에 따라서는 장착홀(212)의 갯수보다 적은 수의 카트리지 필터(220)가 장착되는 것도 가능하다.
이 경우 세포 배양액의 원활한 압출 성능을 보장하기 위해서 카트리지 필터(220)가 장착되지 않은 유휴 장착홀(212)은 폐쇄하는 것이 바람직한데, 이를 위해 필터 어셈블리(200,200')는 유휴 장착홀(212)을 폐쇄하기 위한 캡(214)을 추가로 구비할 수 있다.
이러한 캡(214)은 장착홀(212)에 탈착가능하도록 구비되고, 장착홀(212)에 삽입된 상태에서 장착홀(212)을 밀폐시키도록 형성된다.
또한, 필터 어셈블리(200,200')는 가스 공급라인(104,104')에 연결되어 가스 혼합 및 압력 조절을 위한 압력 조절기를 더 구비할 수 있다.
구체적으로 도시하지는 않았으나, 본 발명의 제4 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(40)는 3개 이상의 필터 어셈블리(200)가 병렬로 연결된 구조로 형성될 수 있다.
이 경우 추가된 필터 어셈블리(200)에는 상기한 바와 마찬가지로 배양액 공급라인(102)과 벤트라인(106), 가스탱크 및 수확라인(114)에 각각 연결되는 가스 공급라인(104), 압출라인(112)이 설치된다.
본 발명의 제4 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(40)를 이용하여 세포 유래 소포체를 제조하기 위해서는 먼저, 배양액 공급라인을 통해 제1 필터 어셈블리(200) 및 제2 필터 어셈블리(200') 중 어느 하나 이상의 필터 어셈블리 내부로 세포 배양액을 투입한다. 이후, 가스탱크에 연결된 가스 공급라인(104,104')을 개방하고 벤트라인(106,106')은 폐쇄하여 소정의 압력하에서 세포 배양액이 필터 어셈블리(200,200') 내부의 카트리지 필터(220)를 통과하도록 하고, 수확라인(114)을 통해 세포가 잔류하지 않는 사용된 배지(spent media)를 배출한다. 그 다음으로, 가스 공급라인(104,104')이 폐쇄된 상태에서, 수확라인(114)을 통해 인산완충생리식염수(phosphate buffer saline, PBS)와 같이 세포를 부유시키는데에 적합한 용액을 주입하여 필터 어셈블리(200,200') 내에 세포 부유액을 형성한다.
이어서, 제1 필터 어셈블리(200)에 구비된 가스 공급라인(104)을 개방하고 벤트라인(106)은 폐쇄한다. 또한, 제2 필터 어셈블리(200')에 구비된 가스 공급라인(104')은 폐쇄하고 벤트라인(106')은 개방시켜 세포 부유액이 제1 필터 어셈블리(200) 및 제2 필터 어셈블리(200') 내부의 카트리지 필터(220)를 통과하도록 한다.
이후 제1 필터 어셈블리(200)에 연결된 가스 공급라인(104)을 폐쇄하고 벤트라인(106)은 개방한다. 또한, 제2 필터 어셈블리(200')에 구비된 가스 공급라인(104')은 개방하고 벤트라인(106')은 폐쇄하여 제2 필터 어셈블리(200')에 수용되었던 세포 부유액이 이전 단계에서의 반대 방향으로, 즉, 제2 필터 어셈블리(200')에서 제1 필터 어셈블리(200)로 향하는 방향으로 흘러 카트리지 필터(220)를 통과하도록 한다.
이처럼 가스 공급라인(104,104')을 번갈아가며 개폐시키는 과정을 미리 정해진 횟수만큼 반복하여 세포 부유액이 필터(220)를 왕복하도록 함으로써 세포 유래 소포체의 생산 효율을 높일 수 있다.
세포 부유액이 소정횟수 반복하여 필터(220)를 통과하도록 한 후에는 수확라인(114)을 개방하여 최종압출 용액을 수득한다.
이때, 상기 최종압출 용액은 세포 유래 소포체를 포함할 수 있다.
위와 같이 본 발명의 제4 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(40)를 이용하여 세포 유래 소포체를 제조하는 과정에서, 세포 수확과 압출이 세포 유래 소포체 제조 장치 내에서만 이뤄지기 때문에, 세포가 외부 환경에 노출되어 오염되거나 변형될 위험이 줄어들고, 공정을 단순화할 수 있으며, 공정 속도가 향상되는 이점이 있다.
한편, 상기 세포 유래 소포체 제조방법에서, 세포 배양액 대신 세포 부유액을 배양액 공급라인(102,102')을 통해 필터 어셈블리(200,200') 내부로 투입할 수 있다. 이때, 수확라인(114)을 통해 세포가 잔류하지 않는 사용된 배지(spent media)를 배출하는 단계 및 수확라인(114)을 통해 세포를 부유시키는데에 적합한 용액을 주입하여 필터 어셈블리(200,200') 내에 세포 부유액을 형성하는 단계를 생략할 수 있다. 또한, 이때, 세포 부유액은 세포 배양액에서 원심분리를 통해 세포를 수확하고 PBS 등의 세포를 부유시키는데에 적합한 용액으로 세포를 재부유시킨 용액일 수 있다.
이하, 본 발명의 제1 내지 제4 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(10,20,30,40)를 이용하여 진행한 실험예들을 서술한다.
실험예에 있어서 입자농도와 크기 측정, PDI 측정, 단백질과 DNA 농도 측정은 공통적으로 다음과 같이 수행하였다.
입자 농도 및 크기 측정
입자의 농도와 크기는 Zetaview 장비(Particle metrix)를 사용하여 측정하였다. 장비 준비와 세척과정은 제조사의 방침에 따라 진행하였다. 분석을 위해 준비된 샘플은 50~200 particles/frame 이 되도록 0.1μm의 공극을 갖는 필터에 통과시킨 PBS용액을 이용하여 희석하였으며, 샘플 1 mL을 사용해 입자 농도와 입자의 크기를 측정하였다.
PDI 측정
PDI는 Zatasizer NanoZS(Malvern)를 사용해 측정하였다. 준비된 샘플은 600~1200 derived count rate가 되도록 0.1μm의 공극을 갖는 필터에 통과시킨 PBS용액을 이용하여 희석한 후, 샘플 1~2 mL을 cuvette (Kartell)에 넣어 측정하였다.
단백질 농도 및 DNA 농도 측정
단백질과 DNA 농도는 Qubit™ 4 Fluorometer(Invitrogen)를 사용해 측정하였다. 준비된 샘플은 단백질과 DNA 농도를 측정하기 위해 각각 Qubit™ Protein Assay Kit와 Qubit™ dsDNA HS Assay Kit를 사용하였다. 샘플 및 스탠다드(standard) 용액을 워킹(working) 용액과 볼텍싱(vortexing)하여 혼합하고 단백질 측정을 위한 용액은 15분, DNA 측정을 위한 용액은 2분 동안 실온에서 반응시켰다. 이후 반응된 각 용액은 Qubit™ 4 Fluorometer 챔버에 넣고 제조사 방침을 따라 최종 농도를 측정하였다.
본 발명의 제1 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(10)를 이용하여 아래의 <실험예 1>과 같이 세포 수확을 위한 테스트를 진행하였다.
실험예 1
세포 수확(harvest)을 위하여 압력용기(pressure vessel)에 1개의 깊이 필터(Sartopure PP3 Capsules, 총 막면적: 0.026 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 연결하고 압력용기에는 공기(air) 공급을 위해 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 5.78E+06 cells/mL 500 mL을 압력용기에 투입하였다. 0.1bar의 공기(air)로 가압하여 수확라인으로 사용된 배지(spent media)를 배출하였다. 사용된 배지의 배출 시간은 120초였다.
사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석을 위해 물리적으로 사용된 배지를 충분히 혼합한 후 5~10 mL을 샘플링하였고, 세포관찰을 위하여 100mm culture petri-dish 표면에 샘플을 고르게 분포하였다. 그 다음 Olympus CKX53 도립현미경을 이용하여 4X, 10X, 그리고 40X 배율에서 육안확인 하였다. 확인 결과, 사용된 배지 내 잔류한 세포는 없는 것으로 분석되었다.
본 발명의 제2 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(20)를 이용하여 아래의 <실험예 2~17>과 같이 세포 압출 공정을 진행하였다.
실험예 2
세포 압출을 위하여 압력용기 사이에 2개의 깊이 필터(Sartopure PP3 Capsules, 총 막면적: 0.052 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 연결하고, 각 압력용기에는 공기(air) 공급을 위해 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 7.87E+06 cells/mL 500 mL을 원심분리하여 수확하였다. 수확된 세포는 500 mL 상온의 인산완충식염생리수(phosphate buffer saline, PBS)에 재부유한 후, 2개의 압력용기에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 60번 통과하였다. 압력용기에 공급되는 공기 압력은 첫 번째 압출 시 1bar 그리고 2~60번 압출시에는 2.5 bar로 수행되었다. 최종압출 용액 내 입자농도를 측정하였고, 세포당 입자의 생산성은 11,563 particles/cell 로 분석되었다.
실험예 3
세포 압출을 위하여 압력용기 사이에 2개의 깊이 필터(Sartopure PP3 Capsules, 총 막면적: 0.052 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 연결하고 각 압력용기에는 공기(air) 공급을 위해 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 7.65E+06 cells/mL 500 mL을 원심분리하여 수확하였다. 수확된 세포는 500 mL 상온의 PBS에 재부유한 후, 2개의 압력용기에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 100번 통과하였다. 압력용기에 공급되는 공기 압력은 첫 번째 압출 시 1bar 그리고 2~100번 압출시에는 2.5 bar로 수행되었다. 최종압출 용액 내 입자농도를 측정하였고, 세포당 입자의 생산성은 17,300 particles/cell 로 분석되었다.
실험예 4
세포 압출을 위하여 압력용기 사이에 2개의 깊이 필터(Sartopure PP3 Capsules, 총 막면적: 0.052 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 연결하고 각 압력용기에는 공기(air) 공급을 위해 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 5.80E+06 cells/mL 300 mL을 원심분리하여 수확하였다. 수확된 세포는 500 mL 상온의 PBS에 재부유한 후, 2개의 압력용기에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 90번 통과하였다. 압력용기에 공급되는 공기 압력은 첫 번째 압출 시 1bar 그리고 2~90번 압출시에는 2.5 bar로 수행되었다. 최종압출 용액 내 입자농도를 측정하였고, 세포당 입자의 생산성은 17,241 particles/cell 로 분석되었다.
실험예 5
세포 압출을 위하여 압력용기 사이에 2개의 깊이 필터(Sartopure PP3 Capsules, 총 막면적: 0.052 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 연결하고 각 압력용기에는 공기(air) 공급을 위해 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 3.15E+06 cells/mL 584 mL를 2개의 압력용기에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 양쪽 밸브를 열고 0.2bar 로 가압하여 사용된 배지(spent media)를 수확라인으로 배출하였다. 사용된 배지 배출 시간은 29초였다. 사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석을 위해 물리적으로 사용된 배지를 충분히 혼합한 후 5~10 mL을 샘플링하였고, 세포관찰을 위한 100 mm culture petri-dish 표면에 샘플을 고르게 분포하였다. 그 다음 Olympus CKX53 도립현미경을 이용하여 4X, 10X, 그리고 40X 배율에서 육안확인 하였으며, 사용된 배지 내 잔류하고 있는 세포는 없는 것으로 분석되었다. 연동펌프(peristaltic pump)를 이용해 상온의 PBS 300 mL을 수확라인으로 역주입하여 압출장치 내부에 수확된 세포를 재부유시키는 공정인 백-플러싱(back-flushing)을 수행하였다. 백-플러싱 시간은 총 81초가 걸렸다. 압출을 위하여 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 120번 통과하였다. 압력용기에 공급되는 공기 압력은 1.0 bar로 수행되었다. 최종압출 용액 내 입자농도를 측정하였고 세포당 입자의 생산성은 15.492 particles/cell 로 분석되었다.
실험예 6
세포 압출을 위하여 압력용기 사이에 2개의 깊이 필터(Sartopure PP3 Capsules, 총 막면적: 0.052 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 연결하고 각 압력용기에는 공기(air) 공급을 위해 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 3.15E+06 cells/mL 500 mL를 2개의 압력용기에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 양쪽 밸브를 열고 0.2bar 로 가압하여 사용된 배지(spent media)를 수확라인으로 배출하였다. 사용된 배지 배출 시간은 30초였다. 실험예 5에 기재된 사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석 방법으로 사용된 배지를 분석한 결과, 사용된 배지 내 잔류하고 있는 세포는 없는 것으로 분석되었다. 연동펌프를 이용해 상온의 PBS 300 mL을 수확라인으로 백-플러싱하였다. 백-플러싱 시간은 총 90초가 걸렸다. 압출을 위하여 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 100번 통과하였다. 압력용기에 공급되는 공기 압력은 첫 번째는 1.0 bar, 그리고 2~100번째는 2.5bar로 수행되었다. 최종압출 용액 내 입자농도, 입자크기, PDI, 단백질 농도, DNA 농도를 측정하였고 세포당 입자의 생산성은 30,476 particles/cell 로 분석되었다. 이에 대한 분석결과는 도 7에 도시된 바와 같다.
실험예 7
세포 압출을 위하여 압력용기 사이에 2 개의 깊이 필터(Sartopure PP3 Capsules, 총 막면적: 0.052 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 연결하고 각 압력용기에는 공기(air) 공급을 위해 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 7.62E+06 cells/mL 400 mL를 2개의 압력용기에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 양쪽 밸브를 열고 0.2bar 로 가압하여 사용된 배지를 수확라인으로 배출하였다. 사용된 배지 배출 시간은 33 초였다. 실험예 5에 기재된 사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석 방법으로 사용된 배지를 분석한 결과, 사용된 배지 내 잔류하고 있는 세포는 없는 것으로 분석되었다. 연동펌프를 이용해 상온의 PBS 400 mL을 수확라인으로 백-플러싱 하였다. 백-플러싱 시간은 총 120초가 걸렸다. 압출을 위하여 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 80번 통과하였다. 압력용기에 공급되는 공기 압력은 첫 번째는 1.0 bar, 그리고 2~80번째는 2.5bar로 수행되었다. 최종압출 용액 내 입자농도를 측정하였고 세포당 입자의 생산성은 23,622 particles/cell 로 분석되었다.
실험예 8
세포 압출을 위하여 압력용기 사이에 2개의 깊이 필터(Sartopure PP3 Capsules, 총 막면적: 0.052 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 연결하고 각 압력용기에는 공기(air) 공급을 위해 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 7.52E+06 cells/mL 390 mL를 2개의 압력용기에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 양쪽 밸브를 열고 0.2bar 로 가압하여 사용된 배지를 수확라인으로 배출하였다. 실험예 5에 기재된 사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석 방법으로 사용된 배지를 분석한 결과, 사용된 배지 내 잔류하고 있는 세포는 없는 것으로 분석되었다. 연동펌프를 이용해 상온의 PBS 200 mL을 수확라인으로 백-플러싱 하였다. 압출을 위하여 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 80번 통과하였다. 압력용기에 공급되는 공기 압력은 첫 번째는 1.0 bar, 그리고 2~80번째는 2.5bar로 수행되었다. 최종압출 용액 내 입자농도를 측정하였고 세포당 입자의 생산성은 12,275 particles/cell 로 분석되었다.
실험예 9
세포 압출을 위하여 압력용기 사이에 2개의 깊이 필터(Sartopure PP3 Capsules, 총 막면적: 0.052 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 연결하고 각 압력용기에는 질소(N2)가스 공급을 위해 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 3.46E+06 cells/mL 867 mL를 2개의 압력용기에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 양쪽 밸브를 열고 0.2bar 로 가압하여 사용된 배지를 수확라인으로 배출하였다. 실험예 5에 기재된 사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석 방법으로 사용된 배지를 분석한 결과, 사용된 배지 내 잔류하고 있는 세포는 없는 것으로 분석되었다. 연동펌프를 이용해 상온의 PBS 400 mL을 수확라인으로 백-플러싱 하였다. 압출을 위하여 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 70번 통과하였다. 압력용기에 공급되는 질소가스 압력은 첫 번째는 1.0 bar, 그리고 2~70번째는 2.5 bar로 수행되었다. 1회 평균 압출 소요시간은 36초로 측정되었다. 최종압출 용액 내 입자농도를 측정하였고 세포당 입자의 생산성은 24,001 particles/cell 로 분석되었다.
실험예 10
세포 압출을 위하여 압력용기 사이에 2개의 깊이 필터(Sartopure PP3 MiDicaps, 총 막면적: 0.1 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 연결하고 각 압력용기에는 질소(N2)가스 공급을 위해 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 8.13E+06 cells/mL 643 mL를 2개의 압력용기에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 양쪽 밸브를 열고 0.2bar 로 가압하여 사용된 배지를 수확라인으로 배출하였다. 실험예 5에 기재된 사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석 방법으로 사용된 배지를 분석한 결과, 사용된 배지 내 잔류하고 있는 세포는 없는 것으로 분석되었다. 연동펌프를 이용해 상온의 PBS 800 mL을 수확라인으로 백-플러싱 하였다. 압출을 위하여 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 50번 통과하였다. 압력용기에 공급되는 질소가스 압력은 첫 번째는 1.0 bar, 그리고 2~50번째는 2.5 bar로 수행되었다. 1회 평균 압출 소요시간은 56초로 측정되었다. 최종압출 용액 내 입자농도를 측정하였고 세포당 입자의 생산성은 22,955 particles/cell 로 분석되었다.
실험예 11
세포 압출을 위하여 압력용기 사이에 2개의 깊이 필터(Sartopure PP3 MiDicaps, 총 막면적: 0.1 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 연결하고 각 압력용기에는 질소(N2)가스 공급을 위한 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 8.09E+06 cells/mL 793 mL를 2개의 압력용기에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 양쪽 밸브를 열고 0.2bar 로 가압하여 사용된 배지를 수확라인으로 배출하였다. 실험예 5에 기재된 사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석 방법으로 사용된 배지를 분석한 결과, 사용된 배지 내 잔류하고 있는 세포는 없는 것으로 분석되었다. 연동펌프를 이용해 상온의 PBS 800 mL을 수확라인으로 백-플러싱 하였다. 압출을 위하여 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 70번 통과하였다. 압력용기에 공급되는 질소가스 압력은 첫 번째는 1.0 bar, 그리고 2~70번째는 2.5 bar로 수행되었다. 1회 평균 압출 소요시간은 47초로 측정되었다. 최종압출 용액 내 입자농도를 측정하였고 세포당 입자의 생산성은 34,916 particles/cell 로 분석되었다.
실험예 12
세포 압출을 위하여 압력용기 사이에 2개의 깊이 필터(Sartopure PP3 Capsules, 총 막면적: 0.052 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 연결하고 각 압력용기에는 질소(N2)가스 공급을 위한 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 5.22E+06 cells/mL 575 mL를 2개의 압력용기에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 양쪽 밸브를 열고 0.2 bar 로 가압하여 사용된 배지를 수확라인으로 배출하였다. 사용된 배지 배출 시간은 4분 이었다. 실험예 5에 기재된 사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석 방법으로 사용된 배지를 분석한 결과, 사용된 배지 내 잔류하고 있는 세포는 없는 것으로 분석되었다. 연동펌프를 이용해 상온의 PBS 800 mL을 수확라인으로 백-플러싱 하였다. 백-플러싱 시간은 총 2분이 걸렸다. 압출을 위하여 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 80번 통과하였다. 압력용기에 공급되는 질소가스 압력은 첫 번째는 1.0 bar, 그리고 2~80번째는 2.5 bar로 수행되었다. 최종압출 용액 내 입자농도를 측정하였고 세포당 입자의 생산성은 18,124 particles/cell 로 분석되었다.
실험예 13
세포 압출을 위하여 압력용기 사이에 2개의 깊이 필터(Sartopure PP3 Capsules, 총 막면적: 0.052 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 연결하고 각 압력용기에는 질소(N2)가스 공급을 위한 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 5.22E+06 cells/mL 575 mL를 2개의 압력용기에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 양쪽 밸브를 열고 0.2 bar 로 가압하여 사용된 배지를 수확라인으로 배출하였다. 사용된 배지 배출 시간은 4분 이었다. 실험예 5에 기재된 사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석 방법으로 사용된 배지를 분석한 결과, 사용된 배지 내 잔류하고 있는 세포는 없는 것으로 분석되었다. 연동펌프를 이용해 상온의 PBS 1,600 mL을 수확라인으로 백-플러싱 하였다. 백-플러싱 시간은 총 4분이 걸렸다. 압출을 위하여 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 70번 통과하였다. 압력용기에 공급되는 질소가스 압력은 첫 번째는 1.0 bar, 그리고 2~70번째는 2.5 bar로 수행되었다. 최종압출 용액 내 입자농도를 측정하였고 세포당 입자의 생산성은 23,389 particles/cell 로 분석되었다.
실험예 14
세포 압출을 위하여 압력용기 사이에 2개의 깊이 필터(Sartopure PP3 Capsules, 총 막면적: 0.052 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 연결하고 각 압력용기에는 질소(N2)가스 공급을 위한 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 5.22E+06 cells/mL 575 mL를 2개의 압력용기에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 양쪽 밸브를 열고 0.2 bar 로 가압하여 사용된 배지를 수확라인으로 배출하였다. 사용된 배지 배출 시간은 4분 이었다. 실험예 5에 기재된 사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석 방법으로 사용된 배지를 분석한 결과, 사용된 배지 내 잔류하고 있는 세포는 없는 것으로 분석되었다. 연동펌프를 이용해 37℃ 인산완충식염생리수 800 mL을 수확라인으로 백-플러싱 하였다. 백-플러싱 시간은 총 2분이 걸렸다. 압출을 위하여 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 80번 통과하였다. 압력용기에 공급되는 질소가스 압력은 첫 번째는 1.0 bar, 그리고 2~80번째는 2.5 bar로 수행되었다. 최종압출 용액 내 입자농도를 측정하였고 세포당 입자의 생산성은 23,988 particles/cell 로 분석되었다.
실험예 15
세포 압출을 위하여 압력용기 사이에 2개의 깊이 필터(Sartopure® PP3 Capsules, 총 막면적: 0.052 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 연결하고 각 압력용기에는 질소(N2)가스 공급을 위한 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 4.56E+06 cells/mL 658 mL를 2개의 압력용기에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 양쪽 밸브를 열고 0.2 bar 로 가압하여 사용된 배지를 수확라인으로 배출하였다. 실험예 5에 기재된 사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석 방법으로 사용된 배지를 분석한 결과, 사용된 배지 내 잔류하고 있는 세포는 없는 것으로 분석되었다. 연동펌프를 이용해 37℃ PBS 1,600 mL을 수확라인으로 백-플러싱 하였다. 압출을 위하여 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 70번 통과하였다. 압력용기에 공급되는 질소가스 압력은 첫 번째는 1.0 bar, 그리고 2~70번째는 2.5 bar로 수행되었다. 1회 평균 압출 소요시간은 68초로 측정되었다. 최종압출 용액 내 입자농도를 측정하였고 세포당 입자의 생산성은 26,146 particles/cell 로 분석되었다.
실험예 16
세포 압출을 위하여 압력용기 사이에 2개의 깊이 필터(Sartopure PP3 Capsules, 총 막면적: 0.052 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 연결하고 각 압력용기에는 질소(N2)가스 공급을 위한 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 4.38E+06 cells/mL 684 mL를 2개의 압력용기에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 양쪽 밸브를 열고 0.2 bar 로 가압하여 사용된 배지를 수확라인으로 배출하였다. 실험예 5에 기재된 사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석 방법으로 사용된 배지를 분석한 결과, 사용된 배지 내 잔류하고 있는 세포는 없는 것으로 분석되었다. 연동펌프를 이용해 37℃ PBS 800 mL을 수확라인으로 백-플러싱 하였다. 압출을 위하여 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 70번 통과하였다. 압력용기에 공급되는 질소가스 압력은 첫 번째는 1.0 bar, 그리고 2~70번째는 2.5 bar로 수행되었다. 1회 평균 압출 소요시간은 37초로 측정되었다. 최종압출 용액 내 입자농도를 측정하였고 세포당 입자의 생산성은 23,800 particles/cell 로 분석되었다.
실험예 17
세포 압출을 위하여 압력용기 사이에 2개의 깊이 필터(Sartopure PP3 Capsules, 총 막면적: 0.052 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 연결하고 각 압력용기에는 질소(N2)가스 공급을 위한 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 4.80E+06 cells/mL 667 mL를 2개의 압력용기에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 양쪽 밸브를 열고 0.2 bar 로 가압하여 사용된 배지를 수확라인으로 배출하였다. 실험예 5에 기재된 사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석 방법으로 사용된 배지를 분석한 결과, 사용된 배지 내 잔류하고 있는 세포는 없는 것으로 분석되었다. 연동펌프를 이용해 37℃ PBS 400 mL을 수확라인으로 백-플러싱 하였다. 압출을 위하여 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 70번 통과하였다. 압력용기에 공급되는 질소가스 압력은 첫 번째는 1.0 bar, 그리고 2~70번째는 2.5 bar로 수행되었다. 1회 평균 압출 소요시간은 21초로 측정되었다. 최종압출 용액 내 입자농도를 측정하였고 세포당 입자의 생산성은 16,374 particles/cell 로 분석되었다.
본 발명의 제3 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(30)를 이용하여 아래의 <실험예 18>과 같이 세포 압출 공정을 진행하였다.
실험예 18
세포 압출을 위하여 압력용기 사이에 1개의 깊이 필터(Sartopure PP3 MiDicaps, 총 막면적: 0.05 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 연결하고 각 압력용기에는 질소(N2)가스 공급을 위한 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 3.72E+06 cells/mL 620 mL를 깊이 필터 정방향과 연결된 압력용기에 투입하였다. 가스 공급라인의 양쪽 밸브를 열고 0.2 bar 로 가압하여 사용된 배지를 수확라인으로 배출하였다. 실험예 5에 기재된 사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석 방법으로 사용된 배지를 분석한 결과, 사용된 배지 내 잔류하고 있는 세포는 없는 것으로 분석되었다. 연동펌프를 이용해 37℃ PBS 615 mL을 수확라인으로 백-플러싱 하였다. 압출을 위하여 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 70번 통과하였다. 압력용기에 공급되는 질소가스 압력은 첫 번째는 1.0 bar, 그리고 2~70번째는 2.5 bar로 수행되었다. 1회 평균 압출 소요시간은 37초로 측정되었다. 최종압출 용액 내 입자농도를 측정하였고 세포당 입자의 생산성은 29,343 particles/cell 로 분석되었다.
본 발명의 제4 실시예에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치(40)를 이용하여 아래의 <실험예 19~22>와 같이 세포 압출 공정을 진행하였으며, [표 1]은 <실험예20~22>에 따른 crude-CDV 대량생산 결과를 나타낸 것이다.
구분 dP
(bar)		 1회 평균압출
공정시간
(초)		 회수무게 (kg) 입자농도 (×1011 particles/mL) Size (nm) PDI DNA
(μg/mL)		 생산성
YP/C
실험예 20 0.20 36.8 17.3 0.84 159.1 0.285 4.80 17,920
실험예 21 0.26 28.3 18.4 0.63 159.3 0.314 5.02 13,440
실험예 22 0.19 30.9 18.7 0.69 164.6 0.333 4.80 14,720
Mean 0.22 32.0 18.1 0.72 161 0.311 4.87 15,360
STDEV 0.04 4.4 0.7 0.11 3 0.024 0.13 2,308
% CV 17.5 13.6 4.1 15.0 1.9 7.8 2.6 15.0
dP= 압출 시, 압출 용액에서 측정되는 최대 최소 압력 차이의 평균
실험예 19
세포 압출을 위하여 필터 어셈블리에 총 4개의 카트리지 깊이 필터(Sartopure PP3 Cartridge, 총 막면적: 1.8 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 장착하였다. 구체적으로, 2개의 필터 어셈블리에 구비되는 각 하단부에 카트리지 깊이 필터(cartridges depth filter)를 2개씩 장착하고, 유휴 장착홀은 캡으로 폐쇄하였다. 이후 각 필터 어셈블리에는 질소(N2)가스 공급을 위한 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 6.00E+06 cells/mL 12.5 L를 2개의 필터 어셈블리에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 양쪽 밸브를 열고 0.4 bar 로 가압하여 사용된 배지를 수확라인으로 배출하였다. 사용된 배지 배출 시간은 5분이었다. 실험예 5에 기재된 사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석 방법으로 사용된 배지를 분석한 결과, 사용된 배지 내 잔류하고 있는 세포는 없는 것으로 분석되었다. 연동펌프를 이용해 37℃ PBS 20 L을 수확라인으로 백-플러싱 하였다. 백-플러싱 시간은 총 16분이 걸렸다. 압출을 위하여 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터 어셈블리 내부의 카트리지 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 70번 통과하였다. 필터 어셈블리에 공급되는 질소가스 압력은 첫 번째는 1.0 bar, 그리고 2~70번째는 2.5 bar로 수행되었다. 1회 평균 압출 소요시간은 32.2초로 측정되었다. 최종압출 용액 내 입자농도, 입자크기, PDI, DNA농도를 측정하였고 세포당 입자의 생산성은 17,493 particles/cell 로 분석되었다.
실험예 20
세포 압출을 위하여 필터 어셈블리에 총 4개의 카트리지 깊이 필터(Sartopure PP3 Cartridge, 총 막면적: 1.8 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 장착하였다. 구체적으로, 2개의 필터 어셈블리에 구비되는 각 하단부에 카트리지 깊이 필터(cartridges depth filter)를 2개씩 장착하고, 유휴 장착홀은 캡으로 폐쇄하였다. 이후 각 필터 어셈블리에는 질소(N2)가스 공급을 위한 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 6.00E+06 cells/mL 12.5 L를 2개의 필터 어셈블리에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 양쪽 밸브를 열고 0.4 bar 로 가압하여 사용된 배지를 수확라인으로 배출하였다. 사용된 배지 배출 시간은 22분이었다. 실험예 5에 기재된 사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석 방법으로 사용된 배지를 분석한 결과, 사용된 배지 내 잔류하고 있는 세포는 없는 것으로 분석되었다. 연동펌프를 이용해 37℃ PBS 16 L을 수확라인으로 백-플러싱 하였다. 백-플러싱 시간은 총 9분이 걸렸다. 압출을 위하여 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터 어셈블리 내부의 카트리지 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 70번 통과하였다. 필터 어셈블리에 공급되는 질소가스 압력은 첫 번째는 1.0 bar, 그리고 2~70번째는 2.5 bar로 수행되었다. 1회 평균 압출 소요시간은 36.8초로 측정되었다. 최종압출 용액 내 입자농도, 입자크기를 측정하였고 세포당 입자의 생산성은 17,920 particles/cell 로 분석되었다.
실험예 21
세포 압출을 위하여 필터 어셈블리에 총 4개의 카트리지 깊이 필터(Sartopure PP3 Cartridge, 총 막면적: 1.8 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 장착하였다. 구체적으로, 2개의 필터 어셈블리에 구비되는 각 하단부에 카트리지 깊이 필터(cartridges depth filter)를 2개씩 장착하고, 유휴 장착홀은 캡으로 폐쇄하였다. 이후 각 필터 어셈블리에는 질소(N2)가스 공급을 위한 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 6.00E+06 cells/mL 12.5 L를 2개의 필터 어셈블리에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 양쪽 밸브를 열고 0.4 bar 로 가압하여 사용된 배지를 수확라인으로 배출하였다. 사용된 배지 배출 시간은 19분이었다. 실험예 5에 기재된 사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석 방법으로 사용된 배지를 분석한 결과, 사용된 배지 내 잔류하고 있는 세포는 없는 것으로 분석되었다. 연동펌프를 이용해 37℃ PBS 16 L을 수확라인으로 백-플러싱 하였다. 백-플러싱 시간은 총 9분이 걸렸다. 압출을 위하여 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터 어셈블리 내부의 카트리지 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 70번 통과하였다. 필터 어셈블리에 공급되는 질소가스 압력은 첫 번째는 1.0 bar, 그리고 2~70번째는 2.5 bar로 수행되었다. 1회 평균 압출 소요시간은 28.3초로 측정되었다. 최종압출 용액 내 입자농도, 입자크기, PDI, DNA농도를 측정하였고 세포당 입자의 생산성은 13,440 particles/cell 로 분석되었다.
실험예 22
세포 압출을 위하여 필터 어셈블리에 총 4개의 카트리지 깊이 필터(Sartopure PP3 Cartridge, 총 막면적: 1.8 m2, retention rates: 0.65 ㎛)를 장착하였다. 구체적으로, 2개의 필터 어셈블리에 구비되는 각 하단부에 카트리지 깊이 필터를 2개씩 장착하고, 유휴 장착홀은 캡으로 폐쇄하였다. 이후 각 필터 어셈블리에는 질소(N2)가스 공급을 위한 가스 공급라인을 연결하였다. HEK293 세포 배양액 농도 6.00E+06 cells/mL 12.5 L를 2개의 필터 어셈블리에 절반씩 투입하였다. 가스 공급라인의 양쪽 밸브를 열고 0.4 bar 로 가압하여 사용된 배지를 수확라인으로 배출하였다. 사용된 배지 배출 시간은 21분이었다. 실험예 5에 기재된 사용된 배지 내 세포 잔류여부 분석 방법으로 사용된 배지를 분석한 결과, 사용된 배지 내 잔류하고 있는 세포는 없는 것으로 분석되었다. 연동펌프를 이용해 37℃ PBS 16 L을 수확라인으로 백-플러싱 하였다. 백-플러싱 시간은 총 9분이 걸렸다. 압출을 위하여 가스 공급라인의 한쪽 밸브는 잠그고 다른 한쪽은 열어 한 방향으로 재부유된 세포 용액이 필터 어셈블리 내부의 카트리지 필터를 통과하도록 하였다. 좌우 밸브를 반대로 열고 닫기를 반복하여 총 70번 통과하였다. 필터 어셈블리에 공급되는 질소가스 압력은 첫 번째는 1.0 bar, 그리고 2~70번째는 2.5 bar로 수행되었다. 1회 평균 압출 소요시간은 30.9초로 측정되었다. 최종압출 용액 내 입자농도, 입자크기, PDI, DNA농도를 측정하였고 세포당 입자의 생산성은 14,720 particles/cell 로 분석되었다.
한편, 도 8은 다양한 파라미터에 따른 세포당 입자의 생산성 결과에 대한 도면이고, 도 9는 다양한 파라미터에 따른 1회 평균 압출 공정시간 결과에 대한 도면이며, 도 10은 세포당 PBS양 및 PBS 온도에 따른 세포당 입자의 생산성 및 1회 평균 압출 공정시간 결과에 대한 도면이다. 도시된 바와 같이 본 발명의 세포 유래 소포체 제조 장치를 이용하여 높은 효율로 세포 유래 소포체의 대량 생산이 가능함을 확인할 수 있다.
상술한 바와 같이 본 발명의 세포 유래 소포체 제조 장치 및 이를 이용한 제조 방법은 세포 유래 소포체를 외부 노출이 최소화된 환경에서 제조하여 오염 및 변형 위험을 낮추고, 안정적이면서도 경제적이고 대량으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 생산 용량을 용이하게 조절할 수 있어 매우 유익한 것이다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정, 변경 및 치환이 가능할 것이다. 따라서 본 발명에 개시된 실시예 및 첨부된 도면들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예 및 첨부된 도면에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 청구 범위에 의해서 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (19)

  1. 일측에 세포 배양액이 공급되는 배양액 공급라인과 가스 공급라인이 연결되는 제1 압력용기 및 제2 압력용기;
    상기 제1 압력용기의 타측에 연결되는 제1 압출라인;
    상기 제2 압력용기의 타측에 연결되고 상기 제1 압출라인에 연통되는 제2 압출라인;
    상기 제1 압출라인 또는 상기 제2 압출라인 상에 배치되어 상기 세포 배양액이 통과하는 적어도 하나의 필터; 및
    상기 제1 압출라인 및 상기 제2 압출라인에 연통되는 수확라인을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체 제조 장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 필터는 상기 제1 압출라인 및 상기 제2 압출라인 상에 적어도 하나씩 배치되는 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체 제조 장치.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 필터는 깊이 필터(depth filter)인 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체 제조 장치.
  4. 일측에 세포 배양액이 공급되는 배양액 공급라인과 가스 공급라인이 연결되고, 내부에는 필터가 구비되는 제1 필터 어셈블리 및 제2 필터 어셈블리;
    상기 제1 필터 어셈블리의 타측에 연결되는 제1 압출라인;
    상기 제2 필터 어셈블리의 타측에 연결되고 상기 제1 압출라인에 연통되는 제2 압출라인; 및
    상기 제1 압출라인 및 상기 제2 압출라인에 연통되는 수확라인을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체 제조 장치.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리는
    적어도 하나의 장착홀이 형성되는 하단부;
    상기 장착홀에 탈착가능하도록 구비되는 카트리지 필터;
    내부에 상기 카트리지 필터가 수용되도록 형성되고 상기 하단부에 결합되는 중간부; 및
    상기 중간부의 상단에 체결되어 상기 하단부, 상기 중간부와 함께 내부를 밀폐시키는 상단부를 구비하는 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체 제조 장치.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리는
    서로 결합 및 분리가능하도록 구비되는 복수의 상기 중간부를 구비하고, 복수의 상기 중간부들이 서로 결합됨으로써 내부 공간이 확장되는 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체 제조 장치.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리는
    상기 가스 공급라인에 연결되어 가스 혼합 및 압력 조절을 위한 압력 조절기를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체 제조 장치.
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리는
    상기 장착홀에 탈착가능하도록 구비되고, 상기 장착홀에 삽입된 상태에서 상기 장착홀을 밀폐시키는 캡을 더 구비하는 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체 제조 장치.
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치를 이용한 세포 유래 소포체를 제조하는 방법에 있어서,
    a) 상기 제1 압력용기 및 상기 제2 압력용기 중 어느 하나 이상의 압력용기 내부로 세포를 포함하는 용액을 투입하는 단계;
    b) 상기 제1 압력용기에 연결된 상기 가스 공급라인을 개방하고, 상기 제2 압력용기에 연결된 상기 가스 공급라인은 폐쇄시켜 상기 용액이 상기 필터를 통과하도록 하는 단계; 및
    c) 상기 제1 압력용기에 연결된 상기 가스 공급라인을 폐쇄하고, 상기 제2 압력용기에 연결된 상기 가스 공급라인은 개방하여 상기 용액이 상기 b) 단계에서의 반대 방향으로 상기 필터를 통과하도록 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체를 제조하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    d) 상기 b) 단계 및 상기 c) 단계를 미리 정해진 횟수만큼 반복하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체를 제조하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 용액은 세포 배양액이고,
    상기 a) 단계는
    상기 배양액 공급라인을 통해 상기 제1 압력용기 및 상기 제2 압력용기 중 어느 하나 이상의 압력용기 내부로 상기 세포 배양액을 투입하는 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체를 제조하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 a) 단계와 상기 b) 단계 사이에
    상기 세포 배양액이 투입된 압력용기에 연결된 상기 가스 공급라인을 개방하여 상기 세포 배양액이 상기 필터를 통과하도록 하는 단계;
    상기 수확라인을 통해 세포가 잔류하지 않는 사용된 배지를 배출하는 단계; 및
    상기 수확라인을 통해 상기 세포를 부유시키기 위한 용액을 주입하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체를 제조하는 방법.
  13. 제 9 항에 있어서,
    상기 용액은 세포 부유액이고,
    상기 a) 단계는
    상기 배양액 공급라인을 통해 상기 제1 압력용기 및 상기 제2 압력용기 중 어느 하나 이상의 압력용기 내부로 상기 세포 부유액을 투입하는 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체를 제조하는 방법.
  14. 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 세포 유래 소포체 제조 장치를 이용한 세포 유래 소포체를 제조하는 방법에 있어서,
    a) 상기 배양액 공급라인을 통해 상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리 중 어느 하나 이상의 필터 어셈블리 내부로 세포를 포함하는 용액을 투입하는 단계;
    b) 상기 제1 필터 어셈블리에 연결된 상기 가스 공급라인을 개방하고, 상기 제2 필터 어셈블리에 연결된 상기 가스 공급라인은 폐쇄시켜 상기 세포 배양액이 상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리 내부의 상기 카트리지 필터를 통과하도록 하는 단계; 및
    c) 상기 제1 필터 어셈블리에 연결된 상기 가스 공급라인을 폐쇄하고, 상기 제2 필터 어셈블리에 연결된 상기 가스 공급라인은 개방하여 상기 세포 배양액이 상기 b) 단계에서의 반대 방향으로 상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리 내부의 상기 카트리지 필터를 통과하도록 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체를 제조하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    d) 상기 b) 단계 및 상기 c) 단계를 미리 정해진 횟수만큼 반복하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체를 제조하는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 용액은 세포 배양액이고,
    상기 a) 단계는
    상기 배양액 공급라인을 통해 상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리 중 어느 하나 이상의 필터 어셈블리 내부로 상기 세포 배양액을 투입하는 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체를 제조하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 a) 단계와 상기 b) 단계 사이에
    상기 세포 배양액이 투입된 필터 어셈블리에 연결된 상기 가스 공급라인을 개방하여 상기 세포 배양액이 상기 필터를 통과하도록 하는 단계;
    상기 수확라인을 통해 세포가 잔류하지 않는 사용된 배지를 배출하는 단계; 및
    상기 수확라인을 통해 상기 세포를 부유시키기 위한 용액을 주입하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체를 제조하는 방법.
  18. 제 14 항에 있어서,
    상기 용액은 세포 부유액이고,
    상기 a) 단계는
    상기 배양액 공급라인을 통해 상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리 중 어느 하나 이상의 필터 어셈블리 내부로 상기 세포 부유액을 투입하는 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체를 제조하는 방법.
  19. 제 14 항에 있어서,
    상기 제1 필터 어셈블리 및 상기 제2 필터 어셈블리 내에서 세포의 여과 또는 압출이 이루어지거나, 세포의 여과 및 압출이 동시에 이루어지는 것을 특징으로 하는 세포 유래 소포체를 제조하는 방법.
PCT/KR2022/006155 2021-09-02 2022-04-29 세포 유래 소포체 제조 장치 및 이를 이용한 제조 방법 WO2023033299A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18/593,346 US20240200008A1 (en) 2021-09-02 2024-03-01 Device for manufacturing cell-derived vesicles and manufacturing method using same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163240215P 2021-09-02 2021-09-02
US63/240,215 2021-09-02

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US18/593,346 Continuation US20240200008A1 (en) 2021-09-02 2024-03-01 Device for manufacturing cell-derived vesicles and manufacturing method using same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023033299A1 true WO2023033299A1 (ko) 2023-03-09

Family

ID=85411469

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/006155 WO2023033299A1 (ko) 2021-09-02 2022-04-29 세포 유래 소포체 제조 장치 및 이를 이용한 제조 방법

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20240200008A1 (ko)
WO (1) WO2023033299A1 (ko)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060019014A (ko) * 2004-08-26 2006-03-03 최재영 세포형 필터 카트리지 및 그를 이용하여 시료 용액을 흡착정제하는 방법
KR20140043623A (ko) * 2012-10-02 2014-04-10 정휘동 필터 어셈블리 및 이를 포함하는 정수기
WO2019213567A1 (en) * 2018-05-04 2019-11-07 Genzyme Corporation Perfusion bioreactor with filtration systems
KR102134906B1 (ko) * 2020-01-22 2020-07-17 주식회사 엠디뮨 멤브레인 모듈을 포함하는 세포 압출장치 및 이를 이용한 세포 압출방법
KR102142479B1 (ko) * 2020-01-09 2020-08-07 주식회사 엠디뮨 세포 압출기 및 세포 압출방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060019014A (ko) * 2004-08-26 2006-03-03 최재영 세포형 필터 카트리지 및 그를 이용하여 시료 용액을 흡착정제하는 방법
KR20140043623A (ko) * 2012-10-02 2014-04-10 정휘동 필터 어셈블리 및 이를 포함하는 정수기
WO2019213567A1 (en) * 2018-05-04 2019-11-07 Genzyme Corporation Perfusion bioreactor with filtration systems
KR102142479B1 (ko) * 2020-01-09 2020-08-07 주식회사 엠디뮨 세포 압출기 및 세포 압출방법
KR102134906B1 (ko) * 2020-01-22 2020-07-17 주식회사 엠디뮨 멤브레인 모듈을 포함하는 세포 압출장치 및 이를 이용한 세포 압출방법

Also Published As

Publication number Publication date
US20240200008A1 (en) 2024-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021141207A1 (ko) 세포 압출기 및 세포 압출방법
WO2023033299A1 (ko) 세포 유래 소포체 제조 장치 및 이를 이용한 제조 방법
WO2021177531A1 (ko) 고형화된 유체의 이탈을 방지할 수 있는 신속한 세포배양검사 장치
WO2021187880A1 (ko) 기능성 엑소좀 제조를 위한 십자류 여과장치의 새로운 용도
WO2011093652A2 (ko) 중공사막 모듈
WO2019160222A1 (ko) 케미컬 필터 고정장치
WO2023177208A1 (ko) 수율이 향상된 유산균 유래 세포외소포의 제조방법
WO2016090579A1 (zh) 血液crp质控物及其质控方法
WO2022097984A1 (ko) 3 차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포의 제조방법
WO2023018109A1 (ko) 유체 처리 시스템 및 이를 이용한 원심 분리 방법
WO2022154332A1 (ko) 애널라이트 검사 장치 및 이를 이용한 애널라이트 검사 방법
WO2021107450A1 (ko) 세포배양장치
WO2016140494A1 (en) Apparatus and method for detecting pollution location and computer readable recording medium
WO2021066506A1 (ko) 원심 분리 장치용 챔버 및 이를 포함하는 원심 분리 장치
WO2024029691A1 (ko) 초음파 검사 장치의 프로브 모듈
WO2020226215A1 (ko) 이온 전도성 필름을 이용한 전기 영동 방식의 생체 시료 염색 방법 및 염색 장치
WO2015190730A1 (ko) 세포를 함유하는 오일 내 하이드로겔 에멀젼, 세포외 구획화 방법 및 신규효소 초고속 스크리닝법
WO2021010676A1 (ko) 순환하는 유동체로 다양한 캡슐을 제조하는 캡슐제조장치
WO2022098018A1 (ko) 한랭쇼크를 이용한 전구세포 획득 방법 및 이를 이용한 엑소좀 생산 방법
WO2021177530A1 (ko) 정확한 관찰이 용이한 신속한 세포배양검사 장치
WO2013042868A1 (en) Method of obtaining silkworm gland-derived hydrolysate
WO2024085683A1 (ko) 바이오리액터
WO2014168367A1 (ko) 단일세포 전기영동측정칩, 칩 홀딩유닛 및 단일세포 전기영동처리장치
WO2024085682A1 (ko) 바이오리액터 시스템
WO2022169258A1 (ko) 세포 내 흡수능이 증대된 세포 유래 베시클 및 이의 제조 방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22864808

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 22864808

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1