WO2023002996A1 - 検体中のウイルスを検出する方法およびウイルス検出装置 - Google Patents
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Abstract
Description
非特許文献1に開示されているように、イムノクロマトグラフィー法により抗体を用いた測定方法は多種開発されてきている。イムノクロマトグラフィー法は使用するにあたり、知識、技術、装置、環境を選ばないため、例えば、A型およびB型インフルエンザウイルスに結合する抗体を用いたイムノクロマトグラフィー法は、臨床現場で迅速にインフルエンザの判定をすることに大きく寄与している。
また、インフルエンザウイルスにおいては、非特許文献3に開示されているように、100~1000倍の感度向上に成功すれば検体を鼻汁ではなく、唾液での検査が可能となるため、医療従事者および患者の負担が軽減されることが期待されている。
式1:
簡潔化のため、[AbAg]=xとし、抗体初期濃度、抗原初期濃度を[Ab]0、[Ag]0とすれば、以下の式2の方程式が得られる。
式2:
図1から明らかなように、[Ag]0=Kd付近ではyがxの増減により大きく変化するため測定は良い感度を示すが、xが小さい領域(左部のプラトー領域)ではyはxの値にかかわらず、限りなく0に近い。この領域で、出力を電気的、化学的、光学的に増幅しても[AbAg]の値は限りなく0に近いため、非特異吸着などに依存するバックグランドノイズが同時に増幅されることになる。
[1]
検体、界面活性剤、および蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を含む試験溶液をマイクロ電極に接触させ交流電圧を印加して、マイクロ電極近傍に検体中のウイルスのヌクレオカプシドプロテインに結合した蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を濃縮する工程、
蛍光観察して検体中のウイルスの存在を検出する工程、
を含み、
前記ヌクレオカプシドプロテインが、核酸と複合体を形成している、
検体中のウイルスを検出する方法。
[2]
誘電泳動により、抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体がマイクロ電極近傍に濃縮される、[1]に記載の方法。
[3]
検体中のウイルスのエンベロープが界面活性剤により化学的に破壊される、[1]または[2]に記載の方法。
[4]
電圧印加の前後での蛍光の集合状態の蛍光画像変化を電子的に比較し、差分画像を定量値または定性判定結果に変換する工程をさらに含む、[1]~[3]のいずれかに記載の方法。
[1]~[4]のいずれかに記載の方法において、異なる波長領域で蛍光標識された複数の抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を同時に濃縮することにより、複数のウイルスを同時に検出するための方法であってもよい。
[5]
マイクロ電極を底部に備えるセルと、
マイクロ電極間に交流電圧を印加する電源と、
イメージセンサーと、
イメージを電気的に記録する手段と、
電圧印加の前後での蛍光の集合状態の蛍光画像変化を電子的に比較し、差分画像を定量値または定性判定結果に変換する手段と、を備え、
マイクロ電極近傍に検体中のウイルスのヌクレオカプシドプロテインに結合した蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を濃縮することで、抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体の有する蛍光を蛍光観察する、ウイルス検出装置。ここで、前記ヌクレオカプシドプロテインが、核酸と複合体を形成している。
[6]
ウイルスのヌクレオカプシドプロテインに結合した蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体は、検体、界面活性剤、および蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を含む試験溶液中で、ウイルスのエンベロープを界面活性剤により化学的に破壊して得る、[5]に記載のウイルス検出装置。
[7]
試験溶液に電圧を印加して、マイクロ電極近傍に検体中のウイルスのヌクレオカプシドプロテインに結合した蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体が濃縮される、[5]または[6]に記載のウイルス検出装置。
[8]
電気浸透流により試験溶液が攪拌される、[5]~[7]のいずれかに記載のウイルス検出装置。電気浸透流を発生させる電源を別途備えていてもよく、交流電圧を印加する電源が電気浸透流を発生する電源を兼ねていてもよい。
[9]
セル内に、試験溶液に乱流を発生させる突起が設けられている、[5]~[7]のいずれかに記載のウイルス検出装置。
[10]
電気浸透流の惹起と、検体中のウイルスのヌクレオカプシドプロテインに結合した蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体の濃縮を同時に実行可能な電圧が印加される、[5]~[9]のいずれかに記載のウイルス検出装置。
[11]
イメージセンサーがカラーフィルタを内蔵したカラーセンサーである、[5]~[10]のいずれかに記載のウイルス検出装置。
[12]
複数のウイルスを同時に検出するための装置であって、異なる波長領域で蛍光標識された複数の抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を同時に濃縮する、[5]~[11]のいずれかに記載のウイルス検出装置。
[13]
[1]~[4]のいずれかに記載の方法において、あるいは[5]~[12]のいずれかに記載のウイルス検出装置において、
マイクロ電極と印加電圧の電圧・周波数の組み合わせがが、少なくとも一つは電気浸透流を惹起し検査液の攪拌を行い、少なくとも一つは誘電泳動によって拡散・NP・標識抗P抗体の複合物を局所的に濃縮させることが可能である、
一つのマイクロ電極に、電気浸透流を惹起し検査液の攪拌を行うのに適した電圧・周波数の交流と、誘電泳動によって拡散・NP・標識抗P抗体の複合物を局所的に濃縮させることに適した交流を合成した交流を印加することにより、マイクロ電極上で電気浸透流による攪拌と誘電泳動による濃縮を同時に起こさせることが可能である、および/または使用しているイメージセンサーがカラーフィルタを内蔵したカラーセンサーであり、抗ウイルスNP抗体が複数混在し、それぞれの抗体は発光の波長領域が、イメージセンサーとソフトウェアの組み合わせで独立して評価可能な程度に独立しており、複数の異なるウイルスを同時に検出することが可能である、
検体中のウイルスを検出する方法、あるいはウイルス検出装置。
検体、界面活性剤、および蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を含む試験溶液をマイクロ電極に接触させ交流電圧を印加して、マイクロ電極近傍に検体中のウイルスのヌクレオカプシドプロテインに結合した蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を濃縮する工程、
蛍光観察して検体中のウイルスの存在を検出する工程、
を含み、
前記ヌクレオカプシドプロテインが、核酸と複合体を形成している、
検体中のウイルスを検出する方法に関する。
また、本発明の別の一実施形態は、ウイルス検出装置であって、
マイクロ電極を底部に備えるセルと、
マイクロ電極間に交流電圧を印加する電源と、
イメージセンサーと、
イメージを電気的に記録する手段と、
電圧印加の前後での蛍光の集合状態の蛍光画像変化を電子的に比較し、差分画像を定量値または定性判定結果に変換する手段と、を備え、
マイクロ電極近傍に検体中のウイルスのヌクレオカプシドプロテインに結合した蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を濃縮することで、抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体の有する蛍光を蛍光観察する、ウイルス検出装置に関する。
本発明においては、本発明の一実施形態のウイルス検出装置を用いて試験溶液に含まれる検体中のウイルスの存在を検出することができる。
ここで、ウイルスの存在の検出とは、ウイルスの存在の有無を確認したい検体中に、ウイルスの存在の有無を確認することである。
誘電泳動で粒子に加わる力(FDEP)は、以下の式3で与えられる。
式3:
式3から明らかなように、粒子の半径の3乗に比例して粒子に力が加わる。
細菌類は粒子径が数μmあり、誘電泳動が容易に起きるのに対し、ウイルスとして、例えば、インフルエンザウイルスはその粒子径が約0.1μmであるため、1/1000の加速度しか得られない。
ここで、NPは粒子径が約10nm弱と見積もられることから、ウイルスの場合のFDEPよりも、さらに1/1000以下となるため、NPを直接誘電泳動で濃縮することは難易度が高い。本発明者らは黒鉛に代表される非常に誘電泳動が著しく起こりやすい粒子を担体として使用することをすでに検討してきたが、NPを選択的に担体上に固定化する過程を必要とするため、反応系が複雑になっていた。
エンベロープを有するウイルスとしては、特に限定されるものではないが、例えば、コロナウイルス(Covid-19および従来型)、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、風疹ウイルス等が挙げられる。
エンベロープを有するウイルスに対して、インフルエンザウイルスや新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)のように、表面のスパイクタンパク質が頻繁に変異することから、スパイクタンパク質を標的とするのではなく、本発明では、ヌクレオカプシドプロテインを標的として、ウイルスの検出に利用している。
核酸は、対象となるウイルスによって、DNAであってもRNAであってもよいが、RNAであることが好適である。
また、ヌクレオカプシドプロテインは、対象となるウイルスのDNAやRNAに結合しているタンパク質として知られている。
本発明の一実施形態における、検体中のウイルスを検出する方法において、
検体、界面活性剤、および蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を含む試験溶液を準備する工程を含んでいてもよい。
試験溶液の準備は、ウイルス検出装置に備えられるマイクロ電極を底部に備えるセル中で行ってもよく、検体を採取するサンプル中で行ってもよく、検体を採取した後、界面活性剤、および蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を含むように試験溶液を準備してもよい。
試験溶液の準備は、ウイルスの検出方法の実施形態に応じて、適宜設定可能である。
ウイルス検出装置に備えるセルとしては、毛細管現象によって試験溶液が電極のギャップを通過していくことが可能であり、なおかつ、蛍光を観察できる透明性があるセルであれば、その材質や形状等は特に限定されるものではなく、適宜設定可能である。
セルには、界面活性剤および/または蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体が、その壁面に塗布されていてもよい。
生体由来試料の生体としては、特に限定されないが、望ましくはヒトの唾液もしくは鼻腔ぬぐい液、鼻汁を対象とする。得られた生体由来試料をそのまま検出対象としてもよく、水やアルコールなどの溶媒で試料を希釈、懸濁または溶解したものを用いてもよい。水やアルコールなどの溶媒には、界面活性剤が含まれていてもよい。
検体中のウイルスは界面活性剤を用いて化学的にエンベロープを破壊し、核酸・NPの複合体をウイルスの郭外に漏出させる。なお、準備する工程において、検体、界面活性剤、および蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を含む試験溶液を準備するが、先に検体と界面活性剤を混合して、核酸・NPの複合体をウイルスの郭外に漏出させてもよい。その後、当該溶液に対して、抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を混合してもよい。核酸・NPの複合体をウイルスの郭外に漏出させた溶液を、一度、当該複合体を濃縮するための操作を行ってから、抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を混合してもよい。
インフルエンザの場合にはRNA1分子あたりNPは約1000分子が吸着している(Biochem.J. (1983) 211, 281)。これによって核酸(インフルエンザ、新型コロナウイルスの時は単鎖のRNA)1分子に約1000分子のNPが強固に吸着した核酸・NP複合体として、NPが試験溶液内に溶出する。
NPは直接誘電泳動することは困難であるが、核酸を担体とすることで、実用的な条件で誘電泳動濃縮ができることを、以下の実施例に示すとおり本発明者らは確認した。
モノクローナル抗体の製造は従来公知の方法により実施可能であり、公知の方法により製造される抗体であってもよく、市販の抗体を用いることも可能である。
また、抗体の由来は特に問わないため、哺乳動物が挙げられ、実験動物であってもよく、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ラクダなどに由来する抗体を利用可能である。抗体としては、ヒト抗体であってもよく、また、キメラ抗体や、ヒト化抗体などを用いてもよい。
抗体は、IgG、IgA、IgM、IgDおよびIgEといったクラスがあり、IgGまたはIgMを好適に用いればよいが特に限定されず、例えば、IgGを用いる場合にもIgG1~IgG4などのサブクラスは特に限定されない。
抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体に代えて、上記で説明したこれらの抗体の断片を用いてもよい。
・励起波長が長いこと、好ましくは350nm以上、より好ましくは400nm以上。
・蛍光波長が短いこと、好ましくは1500nm以下。
・吸光係数が高いこと、好ましくはモル吸光係数が10000以上。
・量子収率が高いこと、好ましくは0.1以上。
・複数の蛍光物質を用いる場合、一方の蛍光物質を励起する波長では他方の蛍光物質は励起されず、他方の蛍光物質の蛍光を測定する際には一方の蛍光物質が発する蛍光が重ならないこと。この場合、一方の蛍光物質の蛍光により他方の蛍光物質の励起が効率よく行えるよう、一方の蛍光物質の蛍光スペクトルと他方の蛍光物質の励起スペクトルのピークが十分近いことが好ましい。さらに、一方の蛍光物質の蛍光スペクトルは十分狭く、他方の蛍光物質の励起スペクトルは十分広いことが好ましく、励起スペクトルのピークと蛍光スペクトルのピークの位置の間の差(ストークスシフト)が十分大きいことがより好ましい。
また、蛍光物質としては、以下の一部またはすべての要件を満たすことが好適である。
・標識する抗体の水溶性を阻害しないこと。
・標識した後で、NPと抗体の特異的結合を阻害しないこと。
・標識により、非標識の物質を凝集させない、および/または光散乱を増強させないこと。
蛍光物質としては、量子ドットであることが好ましい。
蛍光標識として、量子ドットと一般に呼ばれている、半導体からなる粒径数nmの蛍光粒子が有機色素の数十倍の吸光係数と量子収率を持っていて、蛍光が強くかつ半値幅が狭いので系としては高い性能を得やすい。量子ドットを抗体の糖鎖に結合する方法を取ることにより、場合によっては生じていたFv領域の化学操作によるアフィニティーの低減を完全に回避することができる点も大きな利点である。
試験溶液の撹拌により、核酸・NP複合体を試験溶液内に溶出しやすくできると共に、誘電泳動濃縮にも有用である。
電気浸透流により試験溶液の攪拌を行う場合には、電気浸透流の惹起と、検体中のウイルスのヌクレオカプシドプロテインに結合した蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体の濃縮を同時に実行可能な交流電圧を印加してもよい。
乱流を発生さえる突起の形状や場所は、試験溶液の撹拌の効果と流速の兼ね合いを考慮して、適宜設定可能である。
抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体は、NPを認識するため、核酸とNPとの複合体のNPに結合し、担体としての核酸が、マイクロ電極に誘電泳動により濃縮される。
本発明においては、試験溶液をマイクロ電極に接触させ交流電圧を印加して、マイクロ電極近傍に検体中のウイルスのヌクレオカプシドプロテインに結合した蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を濃縮する。
ウイルス検出装置は、マイクロ電極間に交流電圧を印加するための電源を備える。電源としては、特に限定されるものではなく、電極間の電界が1~10MV/mであるように交流電圧を印加可能な電源を用いればよい。
電源としては、特に限定されるものではなく、所望の周波数と電圧が確保できれる電源を用いればよい。一例を挙げると、マキシムインテグレイテッド社のMAX038を用いてもよい。
マイクロ電極近傍に濃縮された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体の蛍光を観察してもよく、マイクロ電極近傍に濃縮されていく抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体の蛍光を観察してもよい。
本発明において、ウイルスを検出可能となっているのは、NPに特異的に結合するモノクローナル抗体には、蛍光物質(望ましくは量子ドット)で標識して共存させておくことで、マイクロ電極付近に核酸・NP・標識抗体の複合体が濃縮され、なおかつその動きを蛍光の光点の動きとして捉えることが可能であることを見出したものである。すなわちNPよりNP・RNA複合体が大きな粒子であることに加えて、NP・RNA複合体がさらに抗体を介してマトリックスを形成することにより、さらに誘電濃縮が加速されることも一因として寄与している。
イメージセンサーと、
イメージを電気的に記録する手段と、を備える。
ウイルス検出装置により、マイクロ電極近傍に検体中のウイルスのヌクレオカプシドプロテインに結合した蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を濃縮することで、抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体の有する蛍光を蛍光観察するが、その場合、電圧印加の前後での蛍光の集合状態の蛍光画像変化を電子的に比較し、差分画像を定量値または定性判定結果に変換して蛍光観察を行ってよい。
したがって、ウイルス検出装置は、電圧印加の前後での蛍光の集合状態の蛍光画像変化を電子的に比較し、差分画像を定量値または定性判定結果に変換する手段をさらに備える。
イメージセンサーによる蛍光観察は、
(1)イメージセンサー上に透明な絶縁膜を設けて蛍光を測定する;
(2)検出セルの底部の外側に接するようにイメージセンサーを設けて蛍光を測定する;
(3)電極はX方向とY方向で異方性を有し、イメージセンサー上に電極と同様の異方性を有するスリットを設けて蛍光を測定する;
(4)検出セルの底部から励起光を照射し、検出セルの側面部にイメージセンサーを設けて蛍光を測定する
といった手法を適宜選択してよい。
イメージセンサーは、カラーフィルタを内蔵したカラーセンサーであってよく、一例として、SWIFT社の 顕微鏡デジタル接眼レンズ 電子アイピース 生物顕微鏡対応 500万画素 5MP HD USB2.0は電子回路がすでに装備されていて、好適に用いることができる。
蛍光観察する場合の条件も適宜設定可能であるが、励起光が一般的には300~600nmの波長を有するが、350nm以上の波長を有することが好ましく、400nm以上の波長を有することがより好ましい。
蛍光観察においては、フィルター+光センサー(フォトダイオード、フォトトランジスタ)による測定や、光っている状態を画像としてスマホ用の撮像素子で撮影し、あらかじめわかっている電極形状と照合して、画像認識させることにより、光っている部分のみを切り出すことが可能で、これによりコントラストを強調し、より精度の高い検出を行うことも可能である。
また、イメージを電気的に記録する手段としては、ハードディスク(またはSSD)等が挙げられ、イメージデータも同様に記録用ディスクに保存可能であり、USBメモリなどの外部記憶装置であってもよい。
電圧印加の前後での蛍光の集合状態の蛍光画像変化を電子的に比較し、差分画像を定量値または定性判定結果に変換する手段としては、アルゴリズムおよびこれをプログラム化したものがライブラリとして公知のものを用いてよい。一例として、オープンソースのソフトウェアとして普及しているImageJが挙げられる。ImageJを利用することで、自動化が可能となり、一連の動作、解析を全て自動化することも可能となる。イメージ間の演算は差分以外にも、排他的OR(XOR)など、基本とする画像との差異が明確になる演算方法であればよい。
図2において、1は核酸を示し、検出対象となるウイルスによって、DNAであっても、RNAであってもよい。核酸1には、ヌクレオカプシドプロテイン(NP)2が結合して、核酸・NP複合体を形成している。核酸・NP複合体は、界面活性剤により試験溶液中でウイルスから溶出して存在しており、抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体(抗NP抗体)3が、存在することで、核酸・NP・抗NP抗体の複合体が形成される。なお、抗NP抗体3は、蛍光物質4により蛍光標識されている。交流電圧の印加により、マイクロ電極5の近傍に、核酸・NP・抗NP抗体の複合体が濃縮され、抗NP抗体に標識されている蛍光物質の蛍光を観察することで、検体中のウイルスの存在が確認される。
NANOTIS法を用いれば、以下のメリットを同時に得ることができる。
・誘電泳動法で濃縮が困難な、NPを濃縮することが可能となる。
・外部から担体を加える複雑な系にすることなく、ウイルスが内在している核酸を担体とすることで、不均一系に伴いがちなばらつきを抑制できる。
・担体を加える必要がないので、試料の前処理が簡略化される。
・サンドイッチ反応のようにエピトープの異なる抗体ペアを探索する必要がないため、検出に必要な抗体は一種の抗NP抗体のみであり、系を単純化できるうえに、より短時間で新たな検出対象に対応できる。
・サンドイッチ反応をする抗体のペアはないが、突出して解離定数が低い抗体があればそれを使用して高感度化をはかることができる。
・NPは単独で扱うと、凝集、ゲル化、固相表面への吸着などの検出ノイズ要因があるが、核酸・NP複合体状態ではNPは核酸により安定化されているため、これらのノイズ要因を払拭できる。
・核酸1分子(インフルエンザでは8本の分節した単鎖RNAからなる)に対し、NPが約1000分子結合しているので、感度を得やすい。
・ウイルスは0.1μmで光学顕微鏡では捉えられないが、核酸・NP・標識抗体の動きを蛍光の光点として動きを捉えることが可能となる。
・本検出において、核酸は単なる担体として誘電泳動に寄与するのみであるが、NPはウイルス種により異なり、またNPと抗NP抗体の特異性により検出の特異性は担保できる(抗体自体が、B型インフルエンザウイルスおよびその他のウイルスのNPとの交差反応がないことを確かめられている)
・変異が起こりにくいNPの特異性により判定するため、スパイクタンパク質変異種ウイルスも検出できる。
・反応が抗原抗体1種ずつであるため、標識抗体をあらかじめ大過剰入れておくことにより高感度化をはかることができる。抗体を2種類用いるサンドイッチ系は、抗体同士の量(あるいは濃度)の偏りにより、検出範囲に影響を与えるので反応成分がシンプルなことは反応系全体の最適化を容易にする。
また、本発明のウイルス検出装置についての説明と、本発明のウイルスを検出する方法についての説明とは、相互に補完してよい。すなわち、本明細書における本発明のウイルス検出装置に関する説明は、本発明のウイルスを検出する方法についても適用され、本明細書における本発明のウイルスを検出する方法に関する説明は、本発明のウイルス検出装置についても適用される。
以下の実施例で用いた試験溶液の材料および装置は以下のとおりである。
検出物質(ウイルス):ガンマ線によって不活化したA型インフルエンザウイルスをBiorad社より入手した。商品番号はPIP021、抗原性はH1N1である。
抗体:バイオマトリックス研究所より抗A型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体(FIA-2121)を入手した。メーカーにおいて15種類の変異型のA型インフルエンザウイルスのNPについて同等に結合することと、B型インフルエンザウイルスのNPには交差反応しないことが確認されている。
蛍光標識された抗体(標識抗体):SiteClick“ Qdot” 585 Antibody Labeling Kit(Thermo Fisher Scientific製)を用いて、同社が提供しているプロトコルに従って抗体のFc領域の糖鎖に量子ドット標識をおこなった。抗体の蛍光スペクトルを図3に示す。
界面活性剤:ウイルスのエンベロープ破壊用にTriton X-100(Sigma-Aldrich)を使用した。
導電率計:堀場アドバンスドテクノ(EC-33B)
蛍光顕微鏡:ライカDFC360FX
交流発生器:KKmoon FY6800 デジタルファンクションジェネレータオシロスコープ:ヒューレットパッカード 54602B
マイクロ電極として、図4に示す形状で、ガラス基板上にクロムをフォトリソグラフィーで2種の電極を形成した。電極のギャップを中心として、2x3mmの穴を開けたシリコンシート(0.05mm厚)を貼り付け、液だめ(セル)を形成した。
電極に集まる電界の分布を確認するために、非イオン水(MerckMiilliporeのMilliQから採水した)に粒径平均2μmのグラファイトを分散させたものを液だめに入れ、20V、30kHzの交流を30秒印加した後のグラファイトの・BR>ェ布状態を図5に示す。
試験溶液中のウイルス、界面活性剤および標識抗体の各濃度が、以下の濃度となるように調整した。蛍光顕微鏡で観察しつつ、試験溶液が静止したのを確認したのち、交流電圧を印加した。混合から電圧印加までは2分以内とした。電極オシロスコープを並列に接続して周波数、電圧を常時確認した。
ウイルス濃度:0.56mg/mL
界面活性剤濃度: 0.3%
標識抗体濃度: 75 nM
試験溶液の導電率は240μS/cmであった。
あらかじめ蛍光顕微鏡上に設置したマイクロ電極の液だめに、調製したウイルスと標識抗体の混合液(5μL)をセットした。蛍光顕微鏡の録画を開始し、界面活性剤の溶液を最終濃度が上記になるよう滴下した。15秒ほど経過して溶液の揺らぎが治まったことを確認し、顕微鏡画像の動画の保存を開始した。保存開始時を0秒として、8秒後に20V、30kHzの交流電圧を印加したところ、直ちに液全体が渦巻き状に動きつつ、その動きの中で光点が集まってくる様子が確認できた。顕微鏡画像を148秒まで録画した。図6に各秒数において動画から静止画を切り出したものを示す。6秒時の静止画を参照画像とし、それぞれの静止画をImageJを用いて参照画像との差分画像を作成したものを差分として第3列に示す。これら、差分画像に対して、同じくImageJでAnalyze/Measureを実施して、各ピクセルの平均輝度を定量値として第4列に示す。時間と定量値をプロットしたものを図7に示す。
実施例1と同様にして実施した。
電極のみBAS社のAu電極(くし形、電極幅10μm、電極間隔5μm)を用いた。1kHz~20MHzまで広く探索してみたところ、2MHzで良好に誘電泳動されることが観察された。
図8は電圧印加直後の静止画を示し、図9は電圧印加15秒後の静止画を示す。
実施例1及び2を踏まえて、濃縮効果を増強した検出セルの実施の形態を図10に示す。実施例1及び2はマイクロ電極の上部に設けた液だめ(2x3x0.05mm、液だめの体積は0.3μL)にセットした試験液から検出対象物である、RNA・NP・標識抗体の複合体を電極近傍に局所的な濃縮を行なったが、検体を唾液や鼻腔ぬぐい液(望ましくは唾液)であることを想定し、標識抗体や界面活性剤含む低伝導性溶媒で2~10倍に希釈する場合、検体としては100~1000μLは容易に集めることができる。本発明によれば、低い濃度の検体からいかに濃縮して抗体の乖離乗数近辺に抗体濃度を持ってくるかを主眼ともしているので、面積の限られた微小な検出部分に、より多くの検体を接触させることにより、本発明の好適な目的を実行可能となる。そこで、図10には、この点を考慮して設計した検出セルの実施の形態を示す。図10において、111は透明な基板であり、その表面には複合電極114が設けられている。114をより詳細に描写すると、検出用のマイクロ電極115と電気浸透流発生用の電極116が設けられている。捕集効率を上げるためにはマイクロ電極は複数対であってもよい。より明確に効果を確認するためには1対であってよい。図10には1対のマイクロ電極を有する場合を示す。ここで、115は高導電性でかつ腐食しにくいAu、銅、Ptが好適で、116は実施例で電気浸透流が容易に発生したITOを材料とすることが好ましいが、同じ材料にすることが製造上のより簡便性かつ低コストである。112はカバーガラスで毛細管現象を起こすのに適切な間隔(望ましくは20~200μm)をあけて111に固定されている。113は吸水バッドで、イムノクロマトグラフィーの終端に用いられるものと同じもので良い。
試験溶液はAの場所にセットすることにより、毛細管現象でCに向かって流れ(x方向)、その際Bの領域で複合電極114に接触する。Bでは電気浸透流によって深さ方向(z方向)の攪拌が行われる。さらに、実施例1及び2と同じ原理で115においてy方向の濃縮が行われ、すなわち試験溶液を流すことにより、x、y及びz方向の濃縮が行われる。検体内に対象とするウイルスが存在すると、マイクロ電極115に光点の集積として現れ、実施例で説明したものと同じ方法でウイルスの量を計測することが可能である。実施の形態1では電気浸透流と誘電泳動を異なる電極で実施したが、これは一つの電極に集約してもよい。またz方向の攪拌は電気浸透流ではなく、流路に突起125を設けることにより乱流を発生させて機械的に攪拌することや、検出セルに振動子を接触させて機械的に攪拌することでも同様の効果が期待できる(図11)。
図12を用いて実施の形態2の説明を行う。図12において131は交流発生器1であり電気浸透流を惹起するのに適した電圧および周波数(A)を発生する。132は交流発生器2であり、誘電泳動を惹起するのに適した電圧および周波数(B)を発生する。133はミキサーであり、AとBの交流を合成してCの交流を発生する。このCの交流が検出セルに設けられたマイクロ電極134に印加される。それ以外の操作や材料は実施の形態1と同等である。この形態をとることにより、一つの電極に2種類の交流を印加することが可能となり、電気浸透流で攪拌しつつ、誘電泳動を同時に行って標識抗体・NP・RNA複合体を電極に集めて、観察することが可能となる。
蛍光観察を行う上で、抗体を標識する方法、抗体に標識される蛍光物質にはなんら限定はないが、クリック反応を利用して蛍光観察を行うことが好ましく、抗体のFc領域の糖鎖に選択的に結合する量子ドットが好適に用いられる。量子ドットとして広範な蛍光波長のキットがThermo Fisherより入手することができる。一例として、3種の量子ドット(Qd525, Qd585, Qd655)の蛍光スペクトルを図13に示す。図13から明らかなように、これらの蛍光スペクトルは半値幅が約30nmと狭く、例えばこれら3種はほとんど交わらないので、カラーイメージセンサーを用いて容易に信号を独立して得ることが可能である。しかも量子ドットは励起波長は450nm以下のすべての波長領域に渡っており、特に300nmあるいはそれより短波長の励起光で非常に高い効率で蛍光を発する。また、260nm付近のいわゆる深紫外線を発生するLEDは最近になってウイルスの不活化の需要が急速に上がり、量産によってコストが下がり、入手も容易になった。これらを組み合わせることにより、例えば抗SARS-CoV-2ウイルスNP抗体をQd525で標識し、抗A型インフルエンザウイルスNP抗体をQd585で、抗B型インフルエンザウイルスNP抗体をQd655で標識すると、一つの検体を使用した一回の測定で3種の感染を検査することが可能となる。
2 ヌクレオカプシドプロテイン(NP)
3 抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体(抗NP抗体)
4 蛍光物質
5 マイクロ電極
111、121 透明な基板
112、122 カバーガラス
113、123 吸水バッド
114、124 複合電極
115、125、134 検出用のマイクロ電極
116 電気浸透流発生用の電極
125 試験溶液に乱流を発生させる突起
131 交流発生器1
132 交流発生器2
133 ミキサー
Claims (12)
- 検体、界面活性剤、および蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を含む試験溶液をマイクロ電極に接触させ交流電圧を印加して、マイクロ電極近傍に検体中のウイルスのヌクレオカプシドプロテインに結合した蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を濃縮する工程、
蛍光観察して検体中のウイルスの存在を検出する工程、
を含み、
前記ヌクレオカプシドプロテインが、核酸と複合体を形成している、
検体中のウイルスを検出する方法。 - 誘電泳動により、抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体がマイクロ電極近傍に濃縮される、請求項1に記載の方法。
- 検体中のウイルスのエンベロープが界面活性剤により化学的に破壊される、請求項1または2に記載の方法。
- 電圧印加の前後での蛍光の集合状態の蛍光画像変化を電子的に比較し、差分画像を定量値または定性判定結果に変換する工程をさらに含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- マイクロ電極を底部に備えるセルと、
マイクロ電極間に交流電圧を印加する電源と、
イメージセンサーと、
イメージを電気的に記録する手段と、
電圧印加の前後での蛍光の集合状態の蛍光画像変化を電子的に比較し、差分画像を定量値または定性判定結果に変換する手段と、を備え、
マイクロ電極近傍に検体中のウイルスのヌクレオカプシドプロテインに結合した蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を濃縮することで、抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体の有する蛍光を蛍光観察する、ウイルス検出装置。 - ウイルスのヌクレオカプシドプロテインに結合した蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体は、検体、界面活性剤、および蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を含む試験溶液中で、ウイルスのエンベロープを界面活性剤により化学的に破壊して得る、請求項5に記載のウイルス検出装置。
- 試験溶液に電圧を印加して、マイクロ電極近傍に検体中のウイルスのヌクレオカプシドプロテインに結合した蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体が濃縮される、請求項5または6に記載のウイルス検出装置。
- 電気浸透流により試験溶液が攪拌される、請求項5~7のいずれか1項に記載のウイルス検出装置。
- セル内に、試験溶液に乱流を発生させる突起が設けられている、請求項5~7のいずれか1項に記載のウイルス検出装置。
- 電気浸透流の惹起と、検体中のウイルスのヌクレオカプシドプロテインに結合した蛍光標識された抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体の濃縮を同時に実行可能な電圧が印加される、請求項5~9のいずれか1項に記載のウイルス検出装置。
- イメージセンサーがカラーフィルタを内蔵したカラーセンサーである、請求項5~10のいずれか1項に記載のウイルス検出装置。
- 複数のウイルスを同時に検出するための装置であって、異なる波長領域で蛍光標識された複数の抗ヌクレオカプシドプロテイン抗体を同時に濃縮する、請求項5~11のいずれか1項に記載のウイルス検出装置。
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