WO2022270557A1 - 酵素膜、及び生体ガス計測装置 - Google Patents

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enzyme membrane
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biogas
coenzyme
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浩二 三林
貴博 荒川
浩司 當麻
美華 鈴木
行哉 佐川
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国立大学法人東京医科歯科大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/497—Physical analysis of biological material of gaseous biological material, e.g. breath

Definitions

  • the technology of the present disclosure relates to a biogas measuring device that measures a target substance contained in biogas, and an enzyme membrane used in the biogas measuring device.
  • International Publication No. 2019/103130 discloses a biological gas measuring device that measures ethanol as a target substance.
  • an enzyme membrane wetted with a solution containing coenzyme NAD + and having alcohol dehydrogenase immobilized thereon is exposed to biogas.
  • ethanol contained in the biogas is converted to acetaldehyde by alcohol dehydrogenase, and coenzyme NADH is produced from coenzyme NAD + .
  • coenzyme NADH is produced from coenzyme NAD + .
  • excitation light of a predetermined wavelength fluorescence emitted from the coenzyme NADH is detected and ethanol is measured.
  • International Publication No. 2019/103130 discloses an enzyme membrane in which alcohol dehydrogenase is immobilized on a 100% cotton mesh that does not have autofluorescence.
  • An object of the technology of the present disclosure is to provide an enzyme membrane that can be used multiple times or continuously for a long time, and a biological gas measuring device using the enzyme membrane.
  • the enzyme membrane according to the first aspect is an enzyme membrane used in a biological gas measuring device for measuring a target substance contained in a biological gas, wherein the porous membrane material having a self-assembled monolayer is coated with an enzyme is immobilized by chemical bonding.
  • the biological gas measuring device is wetted with a solution containing a coenzyme, exposed to the biological gas, and immobilized with the enzyme that catalyzes a chemical reaction of the target substance accompanied by a chemical change of the coenzyme.
  • a detection unit that detects the emitted fluorescence.
  • an enzyme membrane that can be used multiple times or continuously for a long time, and a biological gas measuring device using the enzyme membrane.
  • FIG. 2 is a flow diagram showing the procedure of a method for immobilizing an enzyme on an enzyme membrane according to this embodiment.
  • 1 is a drawing schematically showing a porous membrane material used for an enzyme membrane according to this embodiment.
  • 3B is a drawing schematically showing a state in which a metal film is formed on the porous membrane material shown in FIG. 3A.
  • FIG. 3C is a drawing schematically showing a state in which a self-assembled monolayer is formed on the porous membrane material shown in FIG. 3B.
  • FIG. FIG. 3D is a drawing schematically showing a state in which an enzyme is immobilized on the porous membrane material shown in FIG. 3C.
  • FIG. It is a graph which shows the evaluation result of a comparative example. It is a graph which shows the evaluation result of an Example.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a biological gas measuring device 10 according to this embodiment.
  • the biological gas measuring device 10 shown in FIG. 1 measures target substances contained in the biological gas 90 .
  • the biological gas 90 include skin gas, exhaled gas, gas released from mucous membranes such as conjunctiva, and evaporated gas from bodily fluids such as sweat and tears secreted from the body.
  • the target substance is ethanol.
  • the biological gas measuring device 10 measures ethanol using the following reactions and phenomena as an example. That is, in the biogas measuring device 10, ethanol is converted into acetaldehyde by a primary alcohol dehydrogenase (hereinafter referred to as ADH ). ) is used to generate reduced nicotinamide adenine dinucleotide (hereinafter referred to as NADH), which is a coenzyme.
  • ADH primary alcohol dehydrogenase
  • NADH reduced nicotinamide adenine dinucleotide
  • the biological gas measurement apparatus 10 utilizes an excitation phenomenon in which NADH is excited by absorbing ultraviolet rays having a wavelength of around 340 nm as excitation light and emits fluorescence having a wavelength of around 491 nm.
  • the biological gas measuring device 10 includes an enzyme membrane 20, an irradiation section 30, a detection section 40, and a bandpass filter 50, as shown in FIG.
  • the enzyme membrane 20 is a membrane in which an enzyme 25 is immobilized on a porous membrane material 22 .
  • This enzyme 25 catalyzes a chemical reaction of a target substance that accompanies a chemical change of a coenzyme.
  • ADH is used as the enzyme 25 .
  • porous membrane material 22 materials conventionally used for immobilizing the enzyme 25 can be used without particular limitation.
  • materials include resins such as polytetrafluoroethylene, polydimethylsiloxane, polypropylene, polyethylene, polymethyl methacrylate, and polystyrene, and fibers such as cotton.
  • resins such as polytetrafluoroethylene, polydimethylsiloxane, polypropylene, polyethylene, polymethyl methacrylate, and polystyrene
  • fibers such as cotton.
  • Materials that can be used as the porous membrane material 22 are also described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2016-220573, the contents of which are
  • the size of the pores of the porous membrane material 22 is not particularly limited as long as the enzymatic reaction is possible, but the diameter is usually about 200 to 1000 ⁇ m, preferably about 150 ⁇ m in terms of the efficiency of the enzymatic reaction. good. Moreover, the porosity of the porous membrane material 22 is preferably 60 to 90%. As the porous membrane material 22, for example, a mesh woven from the above material, preferably cotton, can be used.
  • the thickness of the porous membrane material 22 is not particularly limited, it is preferably 1 to 300 ⁇ m, more preferably 100 to 200 ⁇ m.
  • the enzyme membrane 20 is at least partially wetted with a solution containing NAD + . As a result, NAD + is imparted to the enzyme membrane 20 .
  • the enzyme membrane 20 wetted with a solution containing NAD + and having ADH immobilized thereon is exposed to the biological gas 90.
  • FIG. As a result, ethanol contained in the biogas 90 is converted by ADH into acetaldehyde, and NADH is produced from NAD + .
  • ADH is used as the enzyme 25 because the target substance is ethanol.
  • the enzyme 25 is not limited to this. selected.
  • the enzyme 25 may be secondary alcohol dehydrogenase (S-ADH).
  • the target substances are acetone (coenzyme: NADH), 2-propanol (coenzyme: NAD + ), and the like.
  • an aldehyde dehydrogenase may be used as the enzyme 25 .
  • the target substance is acetaldehyde, 2-nonenal (coenzyme: NAD + ), or the like.
  • FALDH formaldehyde dehydrogenase
  • the target substance is formaldehyde (coenzyme: NAD + ).
  • the irradiation unit 30 irradiates the enzyme membrane 20 with excitation light of a predetermined wavelength.
  • the irradiation unit 30 irradiates, for example, the entire enzyme membrane 20 with excitation light of a predetermined wavelength.
  • the irradiating unit 30 irradiates at least a portion of the enzyme membrane 20 wetted with a solution containing NAD + (in other words, a portion where NADH is produced) with excitation light of a predetermined wavelength. good.
  • the irradiation unit 30 specifically has a light emitting diode 32 as a light source and a bandpass filter 34 .
  • the light-emitting diode 32 emits ultraviolet light, which is excitation light of a predetermined wavelength corresponding to the excitation phenomenon of the coenzyme.
  • NADH absorbs ultraviolet rays of 340 nm
  • the bandpass filter 34 is a filter that transmits light of a specific wavelength out of the light from the light emitting diodes 32 .
  • the bandpass filter 34 for example, one that passes ultraviolet rays of 330 to 350 nm is used assuming that ultraviolet rays of wavelengths of 300 to 370 nm are incident from the light emitting diodes 32.
  • FIG. As such a band-pass filter 34, a commercially available one can be used without particular limitation.
  • the irradiating unit 30 irradiates NADH with excitation light of a predetermined wavelength, thereby causing NADH to emit fluorescence.
  • This fluorescence has a specific wavelength different from the predetermined wavelength of the excitation light.
  • the excitation phenomenon in NADH emits fluorescence at 450-510 nm, more specifically around 491 nm.
  • the irradiation section 30 may have at least a light source, and may be configured without the bandpass filter 34 .
  • the light source is not limited to the light emitting diode 32.
  • the light source may be a light source such as a mercury lamp, as long as it emits excitation light of a predetermined wavelength that causes the coenzyme excitation phenomenon.
  • the detector 40 detects fluorescence emitted from NADH. Then, the biological gas measuring device 10 measures the target substance by detecting fluorescence.
  • the fluorescence intensity has a correlation with the concentration of the target substance.
  • the biological gas measuring apparatus 10 quantitatively visualizes and measures the two-dimensional distribution of the concentration of the target substance by detecting the two-dimensional distribution of fluorescence intensity.
  • the detection unit 40 for example, a detection unit having sensitivity to a specific wavelength of fluorescence (specifically, around 491 nm), for example, a camera, a photomultiplier tube, a photodiode detector, or the like is used. .
  • the excitation phenomenon in NADH emits fluorescence at 450-510 nm, more specifically around 491 nm.
  • the bandpass filter 50 is a filter that transmits only fluorescence emitted from NADH that has a specific wavelength.
  • the bandpass filter 50 for example, one that transmits only fluorescence with a wavelength of 480 to 500 nm is used.
  • a band-pass filter 50 a commercially available one can be used without particular limitation.
  • the biological gas measuring device 10 includes a housing 11 that accommodates each component (specifically, the enzyme membrane 20, the irradiation unit 30, the detection unit 40, and the bandpass filter 50). ing.
  • the inside of the housing 11 is, for example, a darkroom.
  • the biological gas measuring device 10 also has a supply pipe 12 that supplies the biological gas 90 to the enzyme membrane 20 .
  • a supply pipe 12 that supplies the biological gas 90 to the enzyme membrane 20 .
  • the enzyme membrane 20 is washed with a washing liquid such as Tris-HCl buffer and then replenished with a solution containing NAD + .
  • biogas measuring device 10 using the enzyme membrane 20 is not limited to the configuration described above.
  • the biological gas measuring device 10 using the enzyme membrane 20 for example, the biological gas measuring device described in International Publication No. 2019/103130 may be used. It is applicable to all biogas measuring devices that measure biogas using an enzyme film. Note that the content described in International Publication No. 2019/103130 is also incorporated herein by reference.
  • the method for immobilizing the enzyme 25 includes, for example, a film forming step 81, a forming step 82, and an immobilizing step 83.
  • the metal film 23 is formed on the porous film material 22 (see FIG. 3A).
  • 3A, 3B, 3C, and 3D are diagrams schematically showing cross sections of the porous membrane material 22 when viewed in a direction orthogonal to the thickness direction.
  • the porous film material 22 on which the metal film 23 is formed is indicated by reference numeral 22A.
  • porous membrane material 22 any material conventionally used for immobilizing the enzyme 25 can be used without particular limitation.
  • a cotton mesh is used as an example of the porous membrane material 22 .
  • the metal film 23 is formed on the porous film material 22 by a method such as sputtering and vapor deposition.
  • the material of the metal film 23 for example, metals such as gold, silver, copper, aluminum, platinum, palladium, and alloys containing these are used. Among them, it is preferable to use gold from the viewpoint of chemical stability and ease of forming a self-assembled monolayer 24, which will be described later.
  • the metal film 23 is formed to have a thickness of, for example, 5 nm to 200 nm, preferably 40 nm to 100 nm.
  • the self-assembled monolayer 24 is formed on the porous film material 22A on which the metal film 23 has been formed in the film formation step 81.
  • the self-assembled monolayer 24 is a layer that chemically bonds and immobilizes the metal film 23 and the enzyme 25 .
  • the porous film material 22 on which the self-assembled monomolecular film 24 is formed is indicated by reference numeral 22B.
  • the self-assembled monolayer 24 is formed by immersing the porous film material 22A with the metal film 23 formed thereon in a solution containing the following substances.
  • solvents such as ethanol and alcohols such as isopropyl alcohol (IPA) can be used.
  • concentration of the solution is, for example, several tens of ⁇ mol/L to several mmol/L.
  • the immersion time in the solution is, for example, several tens of minutes to several tens of hours. Immersion in the solution is performed, for example, at room temperature (eg, 25°C).
  • a substance that can be used as the self-assembled monolayer 24 for example, a substance that satisfies all of the following conditions (1) to (3) is used. (1) Having a functional group that reacts with the metal atoms of the metal film 23 to form a chemical bond (2) Having a functional group that reacts with the enzyme 25 to form a chemical bond via the binding substance 26 described later (3) ) having an intermolecular interaction that forms a thin film by self-assembly
  • Examples of the functional group in (1) above include a thiol group that reacts with a metal atom such as a gold atom to form a chemical bond.
  • Examples of the functional group (2) include an amino group, a carboxyl group, and an ester group.
  • Alkane monothiols include, for example, cysteamine, 3-amino-1-propanethiol, 6-amino-1-hexanethiol, 8-amino-1-octanethiol, 11-amino-1-undecanethiol, and 16-amino -1-hexadecanethiol.
  • Thiol polyethylene glycol amines include, for example, amino-EG6-hexadecanethiol and amino-EG6-undecanethiol.
  • alkanedithiols include dithiol alkane aromatic-PEG6-NHNH2.
  • the number of carbon atoms in the longest straight-chain portion of the substance that satisfies all of the above (1) to (3) is, for example, 3-16, preferably 8-16.
  • the self-assembled monolayer 24 is illustrated such that the molecules are arranged two-dimensionally in one direction. It is thought that it exists irregularly three-dimensionally.
  • Immobilization step 83 In the immobilization step 83, as shown in FIG. 3D, the enzyme 25 is immobilized on the porous membrane material 22B on which the self-assembled monolayer 24 has been formed in the formation step 82. As shown in FIG. Specifically, in the immobilization step 83 , the porous membrane material 22B is immersed in a solution containing the enzyme 25 . The immersion time in the solution is, for example, several tens of minutes to several hours.
  • the porous membrane material 22B is immersed in a solution containing a binding substance 26 that chemically bonds the enzyme 25 and the self-assembled monolayer 24 .
  • the immersion time in the solution is, for example, several tens of minutes to several hours.
  • the enzyme 25 is chemically bound to the self-assembled monolayer 24 via the binding substance 26.
  • the enzyme 25 is immobilized on the porous membrane material 22 on which the metal membrane 23 is formed. That is, in the immobilization method of the enzyme 25, the enzyme 25 is immobilized on the porous membrane material 22 using chemical bonding instead of immobilizing the enzyme 25 by entanglement with the fibers of the porous membrane material 22. It is.
  • the binding substance 26 also chemically bonds the enzymes 25 to each other.
  • any substance conventionally used to immobilize the enzyme 25 can be used without particular limitation.
  • the functional group in (1) above is an amino group, glutaraldehyde, for example, is used as the binding substance 26 .
  • the enzyme 25 is immobilized by chemical bonding to the porous film material 22B on which the self-assembled monolayer 24 is formed.
  • an enzyme membrane (hereinafter referred to as an enzyme membrane A) in which an enzyme 25 is immobilized on a porous membrane material 22 by a conventional method (specifically, for example, the method disclosed in Non-Patent Document 1 mentioned above) Then, it is presumed that the activity of the enzyme 25 is lowered as follows.
  • the enzyme 25 is immobilized on the porous membrane material 22 not by chemical bonding but by entanglement with the fibers of the porous membrane material 22. It is considered that there is a high degree of freedom for For this reason, it is presumed that the enzyme 25 is likely to separate from the porous membrane material 22, for example, by washing the enzyme membrane 20 when performing measurements a plurality of times.
  • the enzyme 25 is a protein and has a three-dimensional structure.
  • the enzyme 25 has a high degree of freedom with respect to the porous membrane material 22, it is presumed that the three-dimensional structure cannot be maintained and denaturation is likely to occur, because the load when catalyzing the chemical reaction of the target substance is large.
  • the enzyme 25 is immobilized by chemical bonding to the porous membrane material 22B on which the self-assembled monolayer 24 is formed. It is presumed that the enzyme 25 is less likely to separate from the porous membrane material 22 even when the enzyme membrane 20 is washed for multiple measurements.
  • the enzyme 25 is immobilized by chemical bonding to the porous membrane material 22B on which the self-assembled monolayer 24 is formed, even if a load is generated when catalyzing the chemical reaction of the target substance. , the three-dimensional structure of the enzyme 25 is maintained, and it is assumed that it is difficult to denature. Therefore, it is considered that the activity of the enzyme 25 is maintained in the enzyme membrane 20 according to the present embodiment. As a result, it is possible to provide the enzyme membrane 20 that can be used multiple times or continuously for a long period of time, and the biological gas measuring device 10 using the enzyme membrane 20 .
  • the output decreases step by step for each measurement.
  • the output does not drop, or even if the output drops, the drop is smaller than in the case of FIG.
  • the horizontal axis of the graphs shown in FIGS. 4 and 5 indicates the number of measurements.
  • the vertical axis of the graphs shown in FIGS. 4 and 5 indicates the difference in the average fluorescence intensity with respect to the average fluorescence intensity before supplying the biogas 90 to the enzyme membrane 20 .
  • the enzyme membrane according to the first aspect is an enzyme membrane used in a biological gas measuring device for measuring a target substance contained in a biological gas, and is a porous membrane material having a self-assembled monolayer, Enzymes are immobilized by chemical bonds.
  • the self-assembled monolayer is formed on the porous membrane material made of metal.
  • the metal is gold.
  • the self-assembled monolayer is made of a material that satisfies the following conditions (1) to (3). (1) Having a functional group that reacts with the metal atom to form a chemical bond (2) Having a functional group that reacts with the enzyme to form a chemical bond via a predetermined binding substance (3) Self-organization have an intermolecular interaction that forms a thin film by
  • the self-assembled monolayer is formed from any substance selected from the group consisting of alkanemonothiol, thiolpolyethyleneglycolamine, and alkanedithiol. ing.
  • the functional group (1) is an amino group
  • the binding substance is glutaraldehyde
  • the porous membrane material is cotton mesh.
  • the biogas measuring device is wetted with a solution containing a coenzyme and exposed to the biogas, and the enzyme that catalyzes a chemical reaction of the target substance accompanied by a chemical change of the coenzyme is immobilized.
  • an enzyme membrane according to any one of the first to seventh aspects, which has been transformed into an enzyme membrane; an irradiation unit that irradiates excitation light of a predetermined wavelength toward the enzyme membrane; and the coenzyme chemically changed by the excitation light.
  • a detection unit that detects fluorescence emitted from the coenzyme upon excitation.

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Abstract

酵素膜は、生体ガス中に含まれる対象物質を計測する生体ガス計測装置に用いられる酵素膜であって、自己組織化単分子膜を有する多孔性膜材に対して、酵素が化学結合により固定化されている。

Description

酵素膜、及び生体ガス計測装置
　本開示の技術は、生体ガス中に含まれる対象物質を計測する生体ガス計測装置、及び生体ガス計測装置に用いられる酵素膜に関する。
　国際公開第２０１９／１０３１３０号公報には、対象物質としてのエタノールを計測する生体ガス計測装置が開示されている。この生体ガス計測装置では、補酵素ＮＡＤ＋を含有する溶液で湿潤され、且つ、アルコール脱水素酵素を固定化した酵素膜に対して、生体ガスを暴露させる。これにより、生体ガス中に含まれるエタノールが、アルコール脱水素酵素により、アセトアルデヒドに変換されると共に、補酵素ＮＡＤ＋から補酵素ＮＡＤＨが生成される。この補酵素ＮＡＤＨに対して、所定波長の励起光を照射することで、補酵素ＮＡＤＨから発せられた蛍光を検出して、エタノールを計測する。また、国際公開第２０１９／１０３１３０号公報には、自家蛍光を有さない１００％コットンのメッシュに対して、アルコール脱水素酵素を固定化した酵素膜が開示されている。
　生体ガス計測装置に用いられる酵素膜の作製法について記載された文献としては、以下の文献がある。
　Kenta Iitani, Koji Toma, Takahiro Arakawa, and Kohji Mitsubayashi. ACS Sensors 2020 5 (2), 338-345：Transcutaneous Blood VOC Imaging System (Skin-Gas Cam) with Real-Time Bio-Fluorometric Device on Rounded Skin Surface
　上記文献には、生体ガス計測装置に用いられる酵素膜の作製法として、アルコール脱水素酵素を含むＢＳＡ溶液にコットンメッシュを浸し、グルタルアルデヒドを用いて、アルコール脱水素酵素を固定化する固定化方法が開示されている。
　上記文献に開示された固定化方法にて酵素が固定された酵素膜を用いて、生体ガス中に含まれる対象物質を計測する場合では、酵素の活性が低下するため、長時間の連続的な計測、及び、複数回の計測が困難であった。
　本開示の技術は、複数回の使用、又は長時間の連続使用が可能な酵素膜、及びこれを用いた生体ガス計測装置を提供することを課題とする。
　第１態様に係る酵素膜は、生体ガス中に含まれる対象物質を計測する生体ガス計測装置に用いられる酵素膜であって、自己組織化単分子膜を有する多孔性膜材に対して、酵素が化学結合により固定化されている。
　第２態様に係る生体ガス計測装置は、補酵素を含有する溶液で湿潤され、且つ前記生体ガスに暴露され、前記補酵素の化学変化を伴う前記対象物質の化学反応を触媒する前記酵素が固定化された前記第１態様に係る酵素膜と、前記酵素膜へ向けて所定波長の励起光を照射する照射部と、化学変化した前記補酵素が前記励起光により励起されて該補酵素から発せられた蛍光を検出する検出部と、を備える。
　本開示の技術によれば、複数回の使用、又は長時間の連続使用が可能な酵素膜、及びこれを用いた生体ガス計測装置を提供することが可能となる。
本実施形態に係る生体ガス計測装置を模式的に示す図面である。 本実施形態に係る酵素膜における酵素の固定化方法の手順を示すフロー図である。 本実施形態に係る酵素膜に用いられる多孔性膜材を模式的に示す図面である。 図３Ａに示す多孔性膜材に対して、金属膜を成膜した状態を模式的に示す図面である。 図３Ｂに示す多孔性膜材に対して、自己組織化単分子膜を形成した状態を模式的に示す図面である。 図３Ｃに示す多孔性膜材に対して、酵素を固定化した状態を模式的に示す図面である。 比較例の評価結果を示すグラフである。 実施例の評価結果を示すグラフである。
　以下に、本開示の実施形態の一例を図面に基づき説明する。なお、本明細書中において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
　生体ガス計測装置１０
　本実施形態に係る生体ガス計測装置１０について説明する。図１は、本実施形態に係る生体ガス計測装置１０を模式的に示す図面である。
　図１に示された生体ガス計測装置１０は、生体ガス９０中に含まれる対象物質を計測する。生体ガス９０としては、皮膚ガスや呼気ガス、結膜などの粘膜からの放出ガス、体内から分泌される汗や涙等の体液の蒸発ガスなどがある。生体ガス計測装置１０では、一例として、エタノールを対象物質とする。
　ここで、生体ガス計測装置１０は、一例として、以下の反応及び現象を利用して、エタノールを計測する。すなわち、生体ガス計測装置１０では、エタノールが、一級アルコール脱水素酵素（以下、ＡＤＨという）により、アセトアルデヒドに変換される反応に伴い、補酵素である酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋という）から補酵素である還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨという）が生成される反応を利用する。また、生体ガス計測装置１０では、ＮＡＤＨが、励起光としての波長３４０ｎｍ付近の紫外線を吸収することで励起され、波長４９１ｎｍ付近の蛍光を発する励起現象を利用する。
　以下、生体ガス計測装置１０の具体的な構成について説明する。生体ガス計測装置１０は、図１に示すように、酵素膜２０と、照射部３０と、検出部４０と、バンドパスフィルタ５０と、を備えている。
　酵素膜２０
　酵素膜２０は、多孔性膜材２２に酵素２５が固定化された膜である。この酵素２５は、補酵素の化学変化を伴う対象物質の化学反応を触媒するものである。本実施形態では、酵素２５として、ＡＤＨが用いられる。
　多孔性膜材２２としては、従来より、酵素２５を固定化するために用いられている材料のものを特に制限なく用いることができる。このような材料としては、例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリジメチルシロキサン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリスチレン等の樹脂や、コットン等の繊維が挙げられる。この中でも、コットンを用いることが望ましい。コットンは、自家蛍光が小さく、また、吸水性が高いためである。コットンは、自家蛍光が小さいことで、ＮＡＤＨで生じる発光の検出への影響を低減できる。また、コットンは、吸水性が高いことで、ＮＡＤ＋を含有する後述の溶液を保持する機能を確保できる。なお、多孔性膜材２２として使用可能な材質については特開２０１６－２２０５７３号公報にも記載されており、それらの内容は参照によって本明細書にも取り込まれる。
　多孔性膜材２２の孔のサイズには、酵素反応を可能とする限り特に制限はないが、通常は、直径２００～１０００μｍ程度であり、酵素反応の効率性の点で、好ましくは１５０μｍ程度がよい。また、多孔性膜材２２の空隙率は６０～９０％であることが好ましい。多孔性膜材２２としては、例えば、上記材料、望ましくはコットンにより織られたメッシュを用いることができる。
　多孔性膜材２２の厚みは、特に限定されないが、好ましくは１～３００μｍであり、さらに好ましくは１００μｍ～２００μｍである。
　酵素膜２０は、ＮＡＤ＋を含有する溶液で少なくとも一部が湿潤される。これにより、酵素膜２０に対して、ＮＡＤ＋が付与されている。
　そして、生体ガス計測装置１０では、ＮＡＤ＋を含有する溶液で湿潤され、且つ、ＡＤＨを固定化した酵素膜２０に対して、生体ガス９０を暴露させる。これにより、生体ガス９０中に含まれるエタノールが、ＡＤＨにより、アセトアルデヒドに変換されると共に、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨが生成される。
　なお、酵素２５を多孔性膜材２２に固定化する酵素２５の固定化方法については、後述する。
　酵素２５の変形例
　本実施形態では、対象物質がエタノールであるため、酵素２５としてＡＤＨを用いたが、これに限られず、酵素２５は、生体ガス９０中の対象物質に応じて種々の中から選択される。
　例えば、酵素２５として、二級アルコール脱水素酵素（Ｓ－ＡＤＨ）を用いてもよい。この場合では、対象物質は、アセトン（補酵素：ＮＡＤＨ）、２－プロパノ－ル（補酵素：ＮＡＤ＋）などとなる。
　また、例えば、酵素２５として、アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）を用いてもよい。この場合では、対象物質は、アセトアルデヒド又は２－ノネナール（補酵素：ＮＡＤ＋）などとなる。
　また、例えば、酵素２５として、ホルムアルデヒド脱水素酵素（ＦＡＬＤＨ）を用いてもよい。この場合では、対象物質は、ホルムアルデヒド（補酵素：ＮＡＤ＋）となる。
　照射部３０
　照射部３０は、酵素膜２０に向けて所定波長の励起光を照射する。照射部３０は、例えば、酵素膜２０全体に対して、所定波長の励起光を照射する。なお、照射部３０は、少なくとも、酵素膜２０において、ＮＡＤ＋を含有する溶液にて湿潤された部分（換言すれば、ＮＡＤＨが生成される部分）に対して所定波長の励起光を照射すればよい。
　照射部３０は、具体的には、光源としての発光ダイオード３２と、バンドパスフィルタ３４と、を有している。発光ダイオード３２は、補酵素の励起現象に応じた所定波長の励起光である紫外線を照射する。本実施形態では、ＮＡＤＨが３４０ｎｍの紫外線を吸収するという性質を利用するため、発光ダイオード３２としては、３００～３７０ｎｍ、好ましくは３４０ｎｍ付近の波長の紫外線を発光するものが用いられる。
　バンドパスフィルタ３４は、発光ダイオード３２からの光のうち、特定の波長のものを透過するフィルタである。バンドパスフィルタ３４としては、例えば、発光ダイオード３２から３００～３７０ｎｍの波長の紫外線が入射するとして３３０～３５０ｎｍの紫外線を通過させるものが用いられる。このようなバンドパスフィルタ３４としては市販のものを特に制限なく用いることができる。
　照射部３０では、ＮＡＤＨに対して、所定波長の励起光を照射することで、ＮＡＤＨから蛍光が発せられる。この蛍光は、励起光が有する所定波長とは異なる特定波長を有する。ＮＡＤＨにおける励起現象では、４５０～５１０ｎｍ、より具体的には４９１ｎｍ付近の蛍光が発せられる。
　なお、照射部３０としては、少なくとも、光源を有していればよく、バンドパスフィルタ３４を有さない構成であってもよい。
　また、光源としては、発光ダイオード３２に限られるものではない。例えば、光源としては、水銀ランプなどの光源であってもよく、補酵素の励起現象を生じさせる所定波長の励起光を照射するものであればよい。
　検出部４０、及びバンドパスフィルタ５０
　検出部４０は、ＮＡＤＨから発せられた蛍光を検出する。そして、生体ガス計測装置１０では、蛍光を検出することで、対象物質を測定する。ここで、蛍光の強度は、対象物質の濃度と相関関係を有する。生体ガス計測装置１０では、具体的には、蛍光の強度の二次元分布を検出することで、対象物質の濃度の二次元の分布を定量的に可視化計測する。
　検出部４０としては、例えば、蛍光が有する特定波長（具体的には、４９１ｎｍ付近）に感度を有する検出部であって、例えば、カメラ、光電子増倍管、及びフォトダイオード検出器などが用いられる。
　前述のように、ＮＡＤＨにおける励起現象では、４５０～５１０ｎｍ、より具体的には４９１ｎｍ付近の蛍光が発せられる。
　バンドパスフィルタ５０は、ＮＡＤＨから発せられた蛍光のうち、特定の波長のものだけを透過するフィルタである。バンドパスフィルタ５０としては、例えば、４８０～５００ｎｍの波長の蛍光のみを透過させるものが用いられる。このようなバンドパスフィルタ５０としては市販のものを特に制限なく用いることができる。
　生体ガス計測装置１０の補足
　生体ガス計測装置１０は、各構成部（具体的には、酵素膜２０、照射部３０、検出部４０、及びバンドパスフィルタ５０）が収容される筐体１１を備えている。筐体１１の内部は、例えば、暗室とされている。
　また、生体ガス計測装置１０は、酵素膜２０へ生体ガス９０を供給する供給管１２を備えている。供給管１２が酵素膜２０へ生体ガス９０を供給することで、生体ガス９０が酵素膜２０に対して暴露される。
　生体ガス計測装置１０において、対象物質を複数回計測する場合では、酵素膜２０は、トリス塩酸緩衝液等の洗浄液により洗浄された後、ＮＡＤ＋を含有する溶液が補充される。
　生体ガス計測装置１０の変形例
　酵素膜２０を用いた生体ガス計測装置１０の一例としては、前述した構成に限られるものではない。酵素膜２０を用いた生体ガス計測装置１０の一例としては、例えば、国際公開第２０１９／１０３１３０号公報に記載された生体ガス計測装置であってもよく、本実施形態に係る酵素膜２０は、酵素膜を用いて生体ガスを計測する生体ガス計測装置全般に適用可能である。なお、国際公開第２０１９／１０３１３０号公報に記載された内容は参照によって本明細書にも取り込まれる。
　酵素２５の固定化方法
　酵素２５の固定化方法は、図２に示すように、一例として、成膜工程８１と、形成工程８２と、固定化工程８３と、を有する。酵素２５の固定化方法では、成膜工程８１、形成工程８２、及び固定化工程８３は、この順で実行される。
　成膜工程８１
　成膜工程８１では、図３Ｂに示すように、多孔性膜材２２（図３Ａ参照）に対して金属膜２３を成膜する。なお、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、及び図３Ｄは、多孔性膜材２２を厚み方向に対する直交方向から見た場合の断面を模式的に示す図面である。また、図３Ｂでは、金属膜２３が成膜された多孔性膜材２２を、符号２２Ａにて示している。
　多孔性膜材２２としては、前述のように、従来より、酵素２５を固定化するために用いられている材料のものを特に制限なく用いることができる。多孔性膜材２２としては、一例として、コットンメッシュが用いられる。
　金属膜２３は、具体的には、スパッタ、及び蒸着等の方法により、多孔性膜材２２に成膜される。金属膜２３の材料としては、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、白金、パラジウム、及びこれらを含む合金等の金属が用いられる。この中でも、化学的な安定性、及び、後述する自己組織化単分子膜２４の形成のしやすさ等の観点から、金が用いることが望ましい。金属膜２３は、例えば、厚さ５ｎｍ～２００ｎｍ、好ましくは、厚さ４０ｎｍ～１００ｎｍに成膜される。
　形成工程８２
　形成工程８２では、図３Ｃに示すように、成膜工程８１にて金属膜２３が成膜された多孔性膜材２２Ａに対して、自己組織化単分子膜２４を形成する。自己組織化単分子膜２４としては、金属膜２３と酵素２５とを化学結合して固定化する層である。なお、図３Ｃ、及び図３Ｄでは、自己組織化単分子膜２４を形成された多孔性膜材２２を、符号２２Ｂにて示している。
　形成工程８２では、具体的には、金属膜２３が成膜された多孔性膜材２２Ａを、下記の物質を含む溶液に浸漬することで自己組織化単分子膜２４を形成する。
　当該溶液の溶媒としては、エタノール、及びイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）等のアルコールなどの溶媒を用いることができる。当該溶液の濃度としては、例えば、数十μｍｏｌ／Ｌ～数ｍｍｏｌ／Ｌとされる。溶液への浸漬時間は、例えば、数十分～数十時間とされる。溶液への浸漬は、例えば、常温（例えば、２５℃）にて行われる。
　自己組織化単分子膜２４として用いることが可能な物質としては、例えば、以下の（１）～（３）の条件を全て満たす物質が用いられる。
　（１）金属膜２３の金属原子と反応して化学結合を生じる官能基を有すること
　（２）酵素２５と反応して後述の結合物質２６を介して化学結合を生じる官能基を有すること
　（３）自己組織化により薄膜を形成する分子間相互作用を有すること
　上記（１）の官能基としては、例えば、金原子等の金属原子と反応して化学結合を生じるチオール基などがある。上記（２）の官能基としては、例えば、アミノ基、カルボキシル基、及びエステル基などがある。
　上記（１）～（３）を全て満たす物質としては、例えば、アルカンモノチオール、チオールポリエチレングリコールアミン、及びアルカンジチオールが挙げられる。アルカンモノチオールとしては、例えば、システアミン、３－アミノ－１－プロパンチオール、６－アミノ－１－ヘキサンチオール、８－アミノ－１－オクタンチオール、１１－アミノ－１－ウンデカンチオール、及び１６－アミノ－１－ヘキサデカンチオールが挙げられる。
　チオールポリエチレングリコールアミンとしては、例えば、アミノ－EG6－ヘキサデカンチオール、アミノ－EG6－ウンデカンチオールが挙げられる。
　アルカンジチオールとしては、例えば、ジチオールアルカン芳香族－PEG6-NHNH2が挙げられる。
　上記（１）～（３）を全て満たす物質における最長直鎖部分の炭素数は、例えば、３～１６とされ、望ましくは、８～１６とされる。
　なお、図３Ｃ、及び図３Ｄでは、自己組織化単分子膜２４は、分子が二次元状に一方向に配置されているように、図示しているが、実際には、繊維の曲面に沿って三次元的に不規則に存在するものと考えられる。
　固定化工程８３
　固定化工程８３では、図３Ｄに示すように、形成工程８２にて自己組織化単分子膜２４が形成された多孔性膜材２２Ｂに対して、酵素２５を固定化する。具体的には、固定化工程８３では、多孔性膜材２２Ｂを、酵素２５を含む溶液に浸漬する。溶液への浸漬時間は、例えば、数十分～数時間とされる。
　次に、多孔性膜材２２Ｂを、酵素２５と自己組織化単分子膜２４とを化学結合する結合物質２６を含む溶液に浸漬する。溶液への浸漬時間は、例えば、数十分～数時間とされる。
　これにより、酵素２５が、結合物質２６を介して自己組織化単分子膜２４に化学結合される。この結果、酵素２５が、金属膜２３が成膜された多孔性膜材２２に対して固定化される。すなわち、酵素２５の固定化方法では、多孔性膜材２２の繊維との絡み合いにより、酵素２５を固定化するのではなく、化学結合を用いて、酵素２５を多孔性膜材２２に固定化するものである。
　また、本実施形態では、結合物質２６は、酵素２５同士も化学結合している。結合物質２６としては、従来より、酵素２５を固定化するために用いられている物質を特に制限なく用いることができる。上記（１）の官能基がアミノ基である場合には、結合物質２６としては、例えば、グルタルアルデヒドが用いられる。
　本実施形態に係る作用効果
　本実施形態では、自己組織化単分子膜２４が形成された多孔性膜材２２Ｂに対して、酵素２５が化学結合により固定化されている。
　ここで、従来法（具体的には、例えば前述の非特許文献１に開示の方法）で、酵素２５が多孔性膜材２２に対して固定化された酵素膜（以下、酵素膜Ａという）では、以下のように、酵素２５の活性が低下するものと推測される。
　酵素膜Ａでは、化学結合ではなく、多孔性膜材２２の繊維との絡み合いにより、酵素２５が多孔性膜材２２に対して固定化されるものと推測され、酵素２５の多孔性膜材２２に対する自由度が高いものと考えられる。このため、例えば、複数回測定する際の酵素膜２０の洗浄により、酵素２５が多孔性膜材２２から離脱しやすいと推測される。
　ここで、酵素２５は、蛋白質であり、三次元構造を有している。対象物質の化学反応を触媒する際の負荷が大きいため、酵素２５の多孔性膜材２２に対する自由度が高い場合では、三次元構造が維持できずに、変性しやすいと推測される。
　これに対して、本実施形態に係る酵素膜２０では、自己組織化単分子膜２４が形成された多孔性膜材２２Ｂに対して、酵素２５が化学結合により固定化されているので、例えば、複数回測定する際の酵素膜２０の洗浄を行った場合でも、酵素２５が多孔性膜材２２から離脱しにくいと推測される。
　また、自己組織化単分子膜２４が形成された多孔性膜材２２Ｂに対して、酵素２５が化学結合により固定化されることで、対象物質の化学反応を触媒する際の負荷が生じても、酵素２５の三次元構造が維持され、変性しにくいと推測される。このため、本実施形態に係る酵素膜２０では、酵素２５の活性が維持されるものと考えられる。この結果、複数回の使用、又は長時間の連続使用が可能な酵素膜２０、及びこれを用いた生体ガス計測装置１０を提供することが可能となる。
　評価
　酵素膜２０を適用した生体ガス計測装置１０（以下、実施例という）と、酵素膜２０に替えて酵素膜Ａを適用した生体ガス計測装置１０（以下、比較例という）とを用いて、対象物質の計測を５回行った場合の出力（すなわち蛍光の発光強度）の推移を評価した。
　５回の計測では、実施例及び比較例において、酵素膜２０及び酵素膜Ａの交換を行わず、同じ酵素膜２０及び酵素膜Ａを使用し続けた。また、５回の計測では、計測毎に、トリス塩酸緩衝液により洗浄された後、ＮＡＤ＋を含有する溶液を同量補充し、同量の生体ガス９０を供給した。
　この結果、図４に示すように、比較例では、計測毎に、出力が段階的に低下する。これに対して、実施例では、図５に示すように、出力の低下が生じないか、出力の低下が生じても、図４の場合に比べ、低下の幅が小さい。
　なお、図４及び図５に示すグラフの横軸は、計測回数が何回目であるかを示す。図４及び図５に示すグラフの縦軸は、生体ガス９０を酵素膜２０に供給する前における平均蛍光強度に対する平均蛍光強度の差分を示す。
　付記
　第１態様に係る酵素膜は、生体ガス中に含まれる対象物質を計測する生体ガス計測装置に用いられる酵素膜であって、自己組織化単分子膜を有する多孔性膜材に対して、酵素が化学結合により固定化されている。
　第２態様に係る酵素膜では、前記第１態様において、前記自己組織化単分子膜は、金属で成膜された前記多孔性膜材に対して形成されている。
　第３態様に係る酵素膜では、前記第２態様において、前記金属は、金である。
　第４態様に係る酵素膜では、前記第２又は第３態様において、前記自己組織化単分子膜は、以下の（１）～（３）の条件を満たす物質により形成されている。
（１）前記金属の原子と反応して化学結合を生じる官能基を有すること
（２）前記酵素と反応して所定の結合物質を介して化学結合を生じる官能基を有すること
（３）自己組織化により薄膜を形成する分子間相互作用を有すること
　第５態様に係る酵素膜では、前記第４態様において、前記自己組織化単分子膜は、アルカンモノチオール、チオールポリエチレングリコールアミン、及びアルカンジチオールから成る群より選ばれたいずれかの物質から形成されている。
　第６態様に係る酵素膜では、前記第４又は第５態様において、前記（１）の官能基は、アミノ基であり、前記結合物質は、グルタルアルデヒドである。
　第７態様に係る酵素膜では、前記第１～第６態様のいずれかにおいて、前記多孔性膜材は、コットンメッシュである。
　第８態様に係る生体ガス計測装置は、補酵素を含有する溶液で湿潤され、且つ前記生体ガスに暴露され、前記補酵素の化学変化を伴う前記対象物質の化学反応を触媒する前記酵素が固定化された前記第１～第７態様のいずれか１つに係る酵素膜と、前記酵素膜へ向けて所定波長の励起光を照射する照射部と、化学変化した前記補酵素が前記励起光により励起されて該補酵素から発せられた蛍光を検出する検出部と、を備える。
　２０２１年６月２５日に出願された日本国特許出願２０２１－１０５７７８号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (8)

  1. 　生体ガス中に含まれる対象物質を計測する生体ガス計測装置に用いられる酵素膜であって、自己組織化単分子膜を有する多孔性膜材に対して、酵素が化学結合により固定化されている酵素膜。
  2. 　前記自己組織化単分子膜は、金属で成膜された前記多孔性膜材に対して形成されている
    　請求項１に記載の酵素膜。
  3. 　前記金属は、金である
    　請求項２に記載の酵素膜。
  4. 　前記自己組織化単分子膜は、以下の（１）～（３）の条件を満たす物質により形成されている
    　請求項２又は３に記載の酵素膜。
    　（１）前記金属の原子と反応して化学結合を生じる官能基を有すること
    　（２）前記酵素と反応して所定の結合物質を介して化学結合を生じる官能基を有すること
    　（３）自己組織化により薄膜を形成する分子間相互作用を有すること
  5. 　前記自己組織化単分子膜は、アルカンモノチオール、チオールポリエチレングリコールアミン、及びアルカンジチオールから成る群より選ばれたいずれかの物質から形成されている
    　請求項４に記載の酵素膜。
  6. 　前記（１）の官能基は、アミノ基であり、
    　前記結合物質は、グルタルアルデヒドである
    　請求項４又は５に記載の酵素膜。
  7. 　前記多孔性膜材は、コットンメッシュである
    　請求項１～６のいずれか１項に記載の酵素膜。
  8. 　補酵素を含有する溶液で湿潤され、且つ前記生体ガスに暴露され、前記補酵素の化学変化を伴う前記対象物質の化学反応を触媒する前記酵素が固定化された請求項１～７のいずれか１項に記載の酵素膜と、
    　前記酵素膜へ向けて所定波長の励起光を照射する照射部と、
    　化学変化した前記補酵素が前記励起光により励起されて該補酵素から発せられた蛍光を検出する検出部と、
    　を備える生体ガス計測装置。
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