JP6868774B2 - Uv−led光源を用いたバイオセンサシステム - Google Patents
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Description
図1は、本発明のガス用バイオセンサ(バイオスニファ)システムの一態様を模式的に示す図面である。このガス用バイオセンサシステムは、光入射用の光ファイバ111と、受光用の光ファイバ112とを接続してなる光ファイバプローブ113を有する。このようなプローブ113としては、市販されているものを用いてもよく、例えば、Ocean Optics Inc.(米国)から市販されている2 in 1 Optical fiber assembly(BIF600−UV/VIS)とF100−9009(Ocean Optics Inc.社製)とを組み合わせたもの等を用いることができる。
上記の中でも、ホスホリルコリン基を含むポリマーである、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)と他のモノマーとの共重合体を用いた場合、酵素を固定化した後の脱塩処理をする必要がないので好ましい。
また、酵素を担体に固定化する方法としては、他に、グルタルアルデヒドの架橋による方法を用いてもよいが、本発明においては、方法は特に限定されない。
まず、担体31に、ポリマー及び酵素の混合溶液32を塗布する。ポリマーとしては上述したものが用いられ、酵素も上述したものが用いられる。ポリマー及び酵素を溶解して混合溶液とするための溶媒としては、例えば、エタノール等が挙げられる。混合溶液中の酵素及びポリマーの濃度に特に制限はないが、通常は、酵素を、担体1cm2あたり50ユニット程度、ポリマーを、担体1cm2あたり1μL(濃度:10重量%)程度用いることが好ましい。次いで、担体上に塗布した混合溶液32を乾燥して酵素を担体31に固定化し、酵素固定化膜33を得る。乾燥は、通常、0〜8℃程度の温度で0.5〜6時間行なう。
図2は、本発明の一態様である液体試料用バイオセンサシステム10を模式的に示す図面である。本発明のバイオセンサシステムは、一つの態様として、光入射用の光ファイバ11と、受光用の光ファイバ11’とを接続してなる光ファイバプローブ12を有する。このようなプローブ12としては、上記のように、市販されているものを用いてもよい。
また、図2のバイオセンサシステムにおいては、長波長透過フィルター(ハイパスフィルター)18を用いているが、長波長透過フィルター(ハイパスフィルター)に変え、帯域フィルターを用いてもよい。この場合、例えば、450〜510nmの波長の蛍光のみを透過させる帯域フィルターを用いる。
図2に示されるバイオセンサシステム10を用いて、酵素の基質となる化合物を検出するには、光ファイバプローブ12を試料溶液に浸す。この試料溶液には、酵素の補酵素となるNADH又はNADPHが含まれている。
本発明のバイオセンサを利用することで、尿を検体とした糖尿病性ケトアシドーシスの非侵襲的な診断を補助するためのシステムを構築することが可能である。まず、糖尿病性ケトアシドーシスの疑われる被検者から尿を採取する。尿試料は分析に先だって前処理を行っても、行わなくても良い。試料を図2または図11に示される系と同様なバイオセンサシステムで分析し、尿中のアセトンを定量する。上記システムは、定量結果を表示する表示装置を含んでいてもよい。また、上記システムは、医療従事者等による診断を補助するために定量結果を分析するコンピュータを含んでいてもよい。健常者の尿中アセトン濃度は20mg/dl以下である。
本発明のバイオセンサは、妊婦糖尿病を有する又はそれが疑われる被検者、1型糖尿病を有する又はそれが疑われる被検者、太らない体質を有する又はそれが疑われる被検者、等を対象とした測定に利用可能である。特に、本発明のバイオセンサは、ケトアシドーシスの診断に利用可能である。ケトアシドーシスの診断では、アセト酢酸、3−ヒドロキシ酪酸、アセトンが測定対象となりうる。利用可能な酵素としては、3−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ(3-hydroxybutyrate dehydrogenase)、2−オキソプロピルCoMレダクターゼ(2-oxopropyl-CoM reductase)、アセト酢酸デカルボキシラーゼ(acetoacetate decarboxylase)などが挙げられる。
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
S−ADHはイソプロパノールなどの二級アルコールを基質とするが、その逆反応によりアセトンを還元すると共に、その際に電子供与体である還元型NADHを酸化して消費する。このNADHは自家蛍光(吸収波長:340nm,蛍光波長:491nm)を有することから、その減少を調べることでアセトンを測定できる。本発明者らは、図4に概要を示したように、紫外発光ダイオード(UV−LED,中心波長:335nm)と光電子増倍管(PMT)を含んで成る光ファイバ型のNADH蛍光検出系に、S−ADHを固定化した酵素膜を取り付けて、アセトンセンサを構築した。S−ADH酵素膜は、多孔質の親水性ポリテトラフルオロエチレン膜に、生体適合性膜PMEHを用いて酵素を包括固定化したものである。
蛍光検出用の光ファイバ先端にS−ADH固定化膜を装着した気液隔膜フローセルを取り付け、気相用バイオセンサとして、アセトンガスを計測した。この系では、標準的なガスジェネレータからアセトン蒸気を供給した。流速は、ニードルバルブ付流量計(タイプ:RK1200、コフロック株式会社)を用いて制御した。フローセルの液相部には、NADHを含むリン酸緩衝液(PB)を循環させた。インテリジェントポンプ(株式会社フロム)を用いてNADHを含むPBをフローセル内に循環させた。S−ADHは、過度に乾燥した状態や不適当な温度やpHなどのように化学状態が適切でないと、その比活性を失う。PBの流れは、酵素膜を湿った状態に保ち、NADHを供給し、また、反応生成物(NAD+を含む)と過度の基質を効率的に除去する。このように、循環PBを用いて反応条件を最適化した。S−ADH固定化バイオセンサの特性評価では、50μM NADHを含むPB(pH7.0,0.1M)をフローセルに循環させ、標準的なガス発生装置を用いて作製したアセトンガスをセンサ感応部に負荷した際の蛍光出力の変化を調べた。この特性評価では、標準ガスをテフロン(登録商標)チューブを通して検出領域に供給した。まず、高純度空気をテフロン(登録商標)チューブ中に流し、次いで、アセトン蒸気をバイオスニファの分析に適用した。全体的な流速は200ml/minに保った。また、高純度空気は、アセトンレベルを調整するための搬送ガスとしても使用した。NADH蛍光強度の変化は、PMTを使用して測定した。また、以下に述べるように、本センサの至適pH、NADH濃度、アセトンガスに対する選択性なども調べた。
S−ADH固定化バイオスニファを呼気中アセトンガスの計測に適用し、運動負荷実験に伴い呼気中アセトン濃度のモニタリングを実施した。本実験の趣旨を説明し同意を得た3名の健常成人(被験者A、BおよびC)において、食物を6時間摂取しない状態で、エルゴメーターにて50W(30分間)の運動負荷を与え、その後、150分間の安静状態とした。呼気ガスは適宜、サンプリングバックに採取し、S−ADH固定化バイオセンサにて呼気中アセトンガスの測定を行った。サンプリングバッグを用いた呼気計測システムの概要を図9に示す。
ER1を用いた生化学式センサにおいては、NADPHの減少変化を観察することで、ノネナールを検出、計測する。そこで、図11に示す系と同様な光学系を構築し、NADPHの蛍光検出システムを開発した。NADPH蛍光検出系の評価では、黒色に塗装したキュベット内に10mMのβ−NADPH(オリエンタル酵母工業株式会社より購入)を含む純水を300μl満たし、暗箱内に設置した後、最終濃度が1nM〜10mMとなるように純水を滴下した際のNADPH蛍光強度の変化を計測した。
ER1を用いたノネナール溶液計測用生化学式センサの作製では、図11に示されるのと同様な光学系を構築し、PTFE膜上にER1(1.3U/mg粉末,株式会社ダイセルより購入)を1.3units/cm2とPMEH10μl/cm2をそれぞれ塗布し作製した酵素膜を光ファイバプローブ先端に固定し、ノネナール溶液計測用ER1センサとした。ノネナール溶液計測用ER1センサの特性評価では、キュベット内に100μMのβ−NADPHを含むリン酸緩衝液(pH7.0,100mM)を満たし、ノネナールの溶解を十分に可能とする80%エタノール溶液を用いて、最終濃度が1nM〜1mMとなるようノネナール溶液を調製し、3分間隔で滴下した際のNADPH蛍光強度の変化を光電子増倍管にて計測した。
ER1を用いたノネナールガス計測用生化学式センサの作製では、図4に示されるのと同様な系を構築し、PTFE膜上にER1を1.3units/cm2とPMEH10μl/cm2をそれぞれ塗布し作製した酵素膜をフローセルの端面に固定し、ノネナールガス計測用ER1センサとした。生化学式ガスセンサの特性評価では、50μMのβ−NADPHを含むリン酸緩衝液(pH8.0,100mM)を1.4ml/minの流量でフローセル内部に循環させ、サンプリングバッグで作製した標準ノネナールガスを流量140ml/minでセンサ感応部に負荷した際の蛍光出力の変化を観察した。
112 受光用の光ファイバ
113 光ファイバプローブ
114 紫外線発光ダイオード
116 光入射用の帯域フィルター
118 受光用の長波長透過フィルター
120 検出器
131 コンプレッサー
132 活性炭フィルター
133 気体発生装置
134 マスフローコントローラ
135 NADH緩衝液リザーバー
140 気液隔膜フローセル
141 シリコンチューブ
142 PMMAパイプ
143 O−リング
144 酵素固定化膜
151 緩衝液流路
152 気体流路
10 バイオセンサシステム
11 光入射用の光ファイバ
11’ 受光用の光ファイバ
12 光ファイバプローブ
14 紫外線発光ダイオード
16 バンドパスフィルター(帯域フィルター)
18 長波長透過フィルター(ロングパスフィルター)もしくはバンドパスフィルター
20 検出器
22 コンピュータシステム
31 担体
32 ポリマー及び酵素の混合溶液
33 酵素固定化膜
34 光ファイバプローブ
35 シリコンチューブリング
Claims (14)
- NADH又はNADPHが発する蛍光量の減少を検出することで試料中の化学物質を検出するバイオセンサシステムであって、
該バイオセンサシステムが、
光入射用の光ファイバ及び受光用の光ファイバを含む光ファイバプローブ;
前記光入射用の光ファイバに所定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード;
補酵素であるNADH又はNADPHを含む緩衝液;
NADH又はNADPHを電子供与体として用いる酵素が固定化された膜であって、膜と試料とがNADH又はNADPHの存在下で接触するとNADH又はNADPHがそれぞれNAD+又はNADP+に変化するように酵素が固定化された膜;並びに
前記紫外線発光ダイオードからの入射光によりNADH又はNADPHが励起されて発生した緩衝液中の蛍光を前記受光用の光ファイバを通して検出する検出器
を含み、
検出器は、膜と試料とが緩衝液中のNADH又はNADPHの存在下で接触し、NADH又はNADPHがそれぞれNAD+又はNADP+に変化した後の緩衝液中の蛍光の減少を検出することを特徴とする、バイオセンサシステム。 - 膜に固定された酵素が、NADH又はNADPHを電子供与体として用いてケトンまたはアルデヒドを還元する酵素である、請求項1に記載のバイオセンサシステム。
- 膜に固定された酵素が、NADH又はNADPHを電子供与体として用いてアセトンまたはノネナールを還元する酵素である、請求項1に記載のバイオセンサシステム。
- 膜に固定された酵素が、二級アルコール脱水素酵素(S−ADH)又はエノン還元酵素(ER1)である、請求項1に記載のバイオセンサシステム。
- 検出される化学物質がアセトンである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のバイオセンサシステム。
- 検出される化学物質がノネナールである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のバイオセンサシステム。
- 試料が液体である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のバイオセンサシステム。
- 前記酵素が固定化された膜が、前記光ファイバプローブの先端に装着されていることを特徴とする、請求項7記載のバイオセンサシステム。
- 試料が気体である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のバイオセンサシステム。
- NADH又はNADPHが発する蛍光量の減少を検出することで試料中の化学物質を検出するバイオセンサシステムであって、
該バイオセンサシステムが、
光入射用の光ファイバ及び受光用の光ファイバを含む光ファイバプローブ;
前記光入射用の光ファイバに所定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード;
補酵素であるNADH又はNADPHを電子供与体として用いる酵素が固定化された膜であって、膜と試料とがNADH又はNADPHの存在下で接触するとNADH又はNADPHがそれぞれNAD+又はNADP+に変化するように酵素が固定化された膜;並びに
前記紫外線発光ダイオードからの入射光によりNADH又はNADPHが励起されて発生した蛍光を前記受光用の光ファイバを通して検出する検出器
を含み、
膜に固定された酵素が、NADH又はNADPHを電子供与体として用いてアセトンを還元する酵素であり、
検出される化学物質がアセトンであり、
試料が気体であり、
NADH又はNADPHを含む緩衝液を循環させるためのフローセルをさらに含み、該フローセルは前記酵素が固定化された膜を含み、気体試料と該緩衝液とが前記酵素が固定化された膜を介して隔てられていることを特徴とする、バイオセンサシステム。 - 試料中の化学物質を検出する方法であって、
対象の試料を準備する工程、
補酵素であるNADH又はNADPHを電子供与体として用いる酵素が固定化された膜と試料とをNADH又はNADPHの存在下で接触させてNAD+又はNADP+を生成する工程、
NADH又はNADPHが発する蛍光量を測定する工程、ならびに
NADH又はNADPHが発する蛍光量のNAD+又はNADP+の生成による減少に基づき試料中の化学物質を検出する工程、
を含む方法。 - NADH又はNADPHの濃度を調整することにより、試料中の化学物質の検出濃度範囲を調整する工程をさらに含む、請求項11記載の方法。
- 尿を検体とした糖尿病性ケトアシドーシスの非侵襲的な診断を補助するためのシステムであって、
該システムが、請求項7または8に記載のバイオセンサシステムを含み、
尿中のアセトンの計測を行うことにより、診断を補助することを特徴とする、システム。 - 呼気計測によりヒトの脂質代謝を評価するためのシステムであって、
該システムが、請求項10に記載のバイオセンサシステムを含み、
呼気中のアセトンの計測を行うことにより、脂質代謝を評価することを特徴とする、システム。
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