WO2022265185A1 - 효소적 산화를 이용한 말토비온산 제조방법 - Google Patents

효소적 산화를 이용한 말토비온산 제조방법 Download PDF

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WO2022265185A1
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maltobionic acid
solution
exchange resin
saccharide
maltose
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김형섭
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김학준
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    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
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    • C12Y101/03004—Glucose oxidase (1.1.3.4)

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing maltobionic acid, and more particularly, to a method for preparing high-purity maltobionic acid from a maltose-containing solution through enzymatic oxidation and various process conditions.
  • Sugars are generally substances with low antioxidant activity. According to Hu et al. [Hu et al., In vitro evaluation of the antioxidant activities of carbohydrates, Bioactive Carbohydratesand Dietary Fiber 7 (2016) 19-27], monosaccharides and oligosaccharides such as glucose and fructose are about 10% even at a concentration of about 2,000 ppm. show less antioxidant activity.
  • Sugars are widely used as food materials or cosmetic materials, and when high antioxidant activity is given to sugars, their application fields can be much more diverse.
  • Representative oxidized saccharides having antioxidant activity include gluconic acid and maltobionic acid (MBA).
  • Maltobionic acid is a substance obtained by oxidizing maltose (malt sugar) with bromine water and has the following chemical structure.
  • U.S. Patent Publication No. 2016-0081387 includes converting starch into maltose through an enzymatic reaction; and a method for producing maltobionic acid including converting maltose into maltobionic acid through an enzymatic reaction, and that maltobionic acid can be used as a food additive having an antioxidant effect.
  • the present invention was derived under the conventional technical background, and an object of the present invention is to provide a method for preparing high-purity maltobionic acid in powder form from a maltose-containing solution.
  • the inventors of the present invention combined unit processes constituting the entire process, such as an enzymatic oxidation reaction process, a purification process by ion exchange resin, and a solidification process, to produce high-purity maltobionic acid from maltose at a commercial level, and the final product, After exploring various conditions of unit processes that affect the quality of maltobionic acid, parameters capable of producing high-purity maltobionic acid from maltose at a commercial level were established.
  • one embodiment of the present invention is (a) preparing a maltose-containing saccharide solution; and (b) obtaining a reaction product-containing solution through an enzymatic oxidation reaction.
  • the method for preparing maltobionic acid according to an embodiment of the present invention may further include (c) obtaining a maltobionic acid-containing saccharide solution through decolorization and filtration.
  • the method for preparing maltobionic acid according to an embodiment of the present invention may further include (d) obtaining a purified maltobionic acid-containing saccharide solution through ion exchange resin purification.
  • the method for producing maltobionic acid according to an embodiment of the present invention may preferably further include (e) obtaining powdered purified maltobionic acid through spray drying.
  • step (a) maltose-containing saccharides having a maltose content of 90% by weight or more based on the total weight of saccharide solids are dissolved in water or mixed with water. It consists in preparing a maltose-containing saccharide solution having a solids concentration of 15 to 25 Brix by dilution.
  • the maltose-containing saccharide solution prepared in step (a) may include 90 to 95 wt % of maltose and 5 to 10 wt % of other sugars based on the total weight of the saccharide solids.
  • the other saccharides include glucose as a main component and may also include a small amount of oligosaccharides having a degree of polymerization of 3 to 12 having glucose as a unit structure.
  • the maltose-containing saccharide solution prepared in step (a) preferably has a maltose content of 95% by weight or more based on the total weight of saccharide solids.
  • a maltose-containing saccharide solution according to a preferred embodiment may include 95 to 99% by weight of maltose, 0.1 to 2% by weight of isomaltose, and 0.5 to 4% by weight of other sugars based on the total weight of saccharide solids.
  • the other saccharides may be composed of oligosaccharides having a degree of polymerization of 3 to 12 having glucose as a unit structure.
  • step (b) is performed by adding 4.0 to 5.0% (v/w) of carbohydrate oxidase and catalase to the maltose-containing saccharide solution based on the weight of the saccharide solid content. 0.1 to 0.8% (v/w) was added and the enzyme was oxidized under the conditions of a temperature of 22 to 37 ° C, a pH of 6 to 8, an aeration rate of 0.9 to 1.5 vvm and an agitation rate of 100 to 400 rpm. It consists in allowing the reaction to proceed for 15 to 30 hr to obtain a reaction product containing solution.
  • the amount of carbohydrate oxidase added is preferably 4.1 to 4.8% by weight, and 4.2 to 4.5% by weight, based on the weight of the saccharide solid content of the maltose-containing saccharide solution, considering the conversion rate of the enzyme oxidation reaction. more preferable
  • the amount of catalase added in step (b) is preferably 0.15 to 0.75% by weight, more preferably 0.15 to 0.5% by weight, based on the weight of saccharide solids in the maltose-containing saccharide solution, considering the conversion rate of the enzyme oxidation reaction. desirable.
  • the temperature of the enzyme oxidation reaction is preferably 24 to 37 ° C, more preferably 25 to 35 ° C, considering the conversion rate.
  • the pH of the enzyme oxidation reaction is preferably 6.5 to 7.5 considering the conversion rate.
  • the pH condition of the enzyme oxidation reaction is controlled by a weak basic substance or a weak basic substance solution.
  • the type of the weak base material is not particularly limited as long as it does not decrease the activity of the enzyme, and examples thereof include sodium bicarbonate, sodium carbonate, potassium hydrogen carbonate, and potassium carbonate, preferably sodium bicarbonate.
  • the aeration rate during the enzymatic oxidation reaction is preferably 0.9 to 1.2 vvm considering the conversion rate.
  • the stirring speed during the enzymatic oxidation reaction is preferably 150 to 350 rpm, more preferably 180 to 250 rpm, considering the conversion rate.
  • the enzymatic oxidation reaction time is preferably 15 to 28 hr, and more preferably 18 to 24 hr, in consideration of conversion rate and economy.
  • the solution containing the reaction product obtained in step (b) has a maltobionic acid content of 90% by weight or more, preferably 95% by weight or more, based on the total weight of the saccharide solids.
  • step (c) may include treating the reaction product-containing solution with activated carbon to decolorize and filtering the solution to obtain a maltobionic acid-containing saccharide solution.
  • the decolorization may be performed by adding a predetermined amount of activated carbon to the reaction product-containing solution and stirring for a predetermined time.
  • the amount of activated carbon added may be selected from 1 to 6% by weight based on the solid weight of the solution containing the reaction product.
  • the filtration may be performed by passing the decolorized reaction product-containing solution through various known filter media.
  • the type of the filter medium is not limited, and includes, for example, filter cloth, porous metal, metal fiber, glass fiber, porous plastic, porous ceramic, etc., and is preferably a porous diatomaceous earth filter medium safely used in the food industry.
  • the maltobionic acid-containing saccharide solution is sequentially passed through a strongly basic anion exchange resin, a strongly acidic cation exchange resin, and a mixed-phase ion exchange resin to obtain purified maltobionic acid. It may consist in obtaining a diacid-containing saccharide solution.
  • the mixed phase ion exchange resin is a resin in which a strongly acidic cation exchange resin and a strongly basic anion exchange resin are mixed.
  • the space velocity of the maltobionic acid-containing saccharide solution is preferably 1 to 6 ml/min, and 2 to 5 ml/min, considering the pH or conductivity of the purified maltobionic acid-containing saccharide solution. min is more preferred.
  • the strongly basic anion exchange resin used in the step (d) is preferably a macroporous type considering the purification capacity and pH or conductivity of the purified maltobionic acid-containing saccharide solution.
  • the strongly acidic cation exchange resin is preferably a gel type considering the pH or conductivity of the purified maltobionic acid-containing saccharide solution.
  • step (d) the volume ratio of the strongly basic anion exchange resin:strongly acidic cation exchange resin:mixed bed ion exchange resin is 1:(0.25-2):( It is preferably 0.25 to 1) and more preferably 1: (0.3 to 1): (0.3 to 1).
  • step (d) the mixing volume ratio of the strongly acidic cation exchange resin:strongly basic anion exchange resin constituting the mixed-phase ion exchange resin is 1:(0.1 to 0.5 when considering the pH or conductivity of the purified maltobionic acid-containing saccharide solution. ) and more preferably 1: (0.2 to 0.3).
  • step (e) the solid concentration of the purified maltobionic acid-containing saccharide solution is adjusted to 10 to 40 Brix and then sprayed through an atomizer. and injecting into a chamber inside the drier to obtain powdered purified maltobionic acid.
  • the solid concentration of the saccharide solution containing maltobionic acid purified in step (e) is preferably adjusted to 15 to 35 Brix before being supplied to the spray dryer for smooth powdering.
  • the injection rate of the maltobionic acid-containing saccharide solution purified in the step (e) may be selected from a wide range according to the treatment capacity of the spray dryer, for example, from 500 to 1,000 ml/hour.
  • the temperature of the inlet which is a passage through which the saccharide solution containing maltobionic acid purified in the step (e) is injected into the inner chamber of the spray dryer, is preferably 135 to 170 ° C, and more preferably 140 to 160 ° C for smooth powderization. desirable.
  • the atomizer rotation speed is preferably 600 to 900 rpm for smooth powdering, and more preferably 600 to 800 rpm.
  • the outlet temperature of the inner chamber of the spray dryer is preferably 100 to 135 ° C, more preferably 110 to 130 ° C.
  • the conversion rate of maltose to maltobionic acid can be 99% or more, and the purity is 95% or more without using a separate chromatographic separation process. can produce warm acid.
  • a maltose-containing saccharide product (manufacturer: Daesang Co., Ltd.) was diluted with ion-exchanged water to prepare a maltose-containing saccharide solution having a solid concentration of 20 Brix.
  • an enzymatic oxidation reaction was performed for 24 hr under the conditions of a reaction temperature of 25° C., an aeration rate of 1 vvm, and an agitation rate of 300 rpm.
  • the reaction pH was kept constant at about 7 using a 1M sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) solution.
  • the reaction product solution was heated to about 80° C. and treated for about 2 hr to inactivate the enzyme. Thereafter, the reaction product solution was cooled to room temperature and filtered to obtain a maltobionic acid-containing saccharide solution.
  • a maltobionic acid-containing saccharide solution was prepared under the same conditions and in the same manner as in Preparation Example 1, except that conditions such as the solid concentration of the maltose-containing saccharide solution, the temperature of the enzyme oxidation reaction, the aeration rate or the stirring speed were changed. obtained.
  • Table 1 summarizes the manufacturing process conditions used in Preparation Examples 1 to 6.
  • a purified maltose product (manufacturer: Daesang Co., Ltd.) was diluted with ion-exchanged water to prepare a purified maltose solution having a solid concentration of 20 Brix.
  • an enzymatic oxidation reaction was performed for 24 hr under the conditions of a reaction temperature of 25° C., an aeration rate of 1 vvm, and an agitation rate of 200 rpm.
  • the reaction pH was kept constant at about 7 using a 1M sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) solution.
  • the reaction product solution was heated to about 80° C. and treated for about 2 hr to inactivate the enzyme. Thereafter, the reaction product solution was cooled to room temperature and filtered to obtain a maltobionic acid-containing saccharide solution.
  • a purified maltose product (manufacturer: Daesang Co., Ltd.) was diluted with ion-exchanged water to prepare a purified maltose solution having a solid concentration of 20 Brix.
  • Glucose oxidase (Supplier: Novozymes) and Catalase (Supplier: Novozymes), which are saccharide oxidases, were respectively 5.2% (v/w) and 1.3% (v/w) based on the weight of sugar solids in the purified maltose solution.
  • reaction product solution was heated to about 80° C. and treated for about 2 hr to inactivate the enzyme. Thereafter, the reaction product solution was cooled to room temperature and filtered to obtain a maltobionic acid-containing saccharide solution.
  • a purified maltose product (manufacturer: Daesang Co., Ltd.) was diluted with ion-exchanged water to prepare a purified maltose solution having a solid concentration of 20 Brix.
  • an enzymatic oxidation reaction was performed for 24 hr under the conditions of a reaction temperature of 25° C., an aeration rate of 1 vvm, and an agitation rate of 200 rpm.
  • the reaction pH was kept constant at about 7 using a 1M sodium hydroxide (NaOH) solution.
  • the reaction product solution was heated to about 80° C. and treated for about 2 hr to inactivate the enzyme. Thereafter, the reaction product solution was cooled to room temperature and filtered to obtain a maltobionic acid-containing saccharide solution.
  • Table 3 summarizes the sugar components and contents of the maltobionic acid-containing saccharide solutions obtained in the purified maltose product (manufacturer: Daesang Co., Ltd.) and Preparation Examples 7 to 9.
  • Glucose is the main component, and a small amount of oligosaccharides having a degree of polymerization of 3 to 12 having glucose as a unit structure is also included.
  • glucose oxidase-catalase combination was changed instead of the multi-dase-catalase combination, the conversion rate to maltobionic acid was significantly decreased.
  • sodium hydroxide (NaOH) a strong base
  • sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) sodium bicarbonate
  • a high-purity maltose product (manufacturer: Junsei Chemical Co., Ltd.) was diluted with ion-exchanged water to prepare a high-purity maltose solution having a solid concentration of 20 Brix.
  • an enzymatic oxidation reaction was performed for 24 hr under the conditions of a reaction temperature of 25° C., an aeration rate of 1 vvm, and an agitation rate of 200 rpm.
  • the reaction pH was kept constant at about 7 using a 1M sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) solution.
  • the reaction product solution was heated to about 80° C. and treated for about 2 hr to inactivate the enzyme. Thereafter, the reaction product solution was cooled to room temperature and filtered to obtain a maltobionic acid-containing saccharide solution.
  • Saccharides containing maltobionic acid under the same conditions and in the same manner as in Preparation Example 10, except that the addition amounts of carbohydrate oxidase, carbohydrate oxidase (Supplier: Novozymes) and catalase (Supplier: Novozymes) were changed. A solution was obtained.
  • Table 4 summarizes the addition amount of saccharide oxidase used in Preparation Examples 10 to 21.
  • Table 5 summarizes the sugar components and contents of the high-purity maltose product (manufacturer: Junsei Chemical Co., Ltd.) and the maltobionic acid-containing saccharide solutions obtained in Preparation Examples 10 to 21.
  • saccharides of high-purity maltose products composed of oligosaccharides having a degree of polymerization of 3 to 12 having glucose as a unit structure.
  • the added amount of carbohydrate oxidase is 4.0 to 5.0% (v/w) based on the weight of saccharide solids in the high-purity maltose solution
  • the added amount of catalase is 0.1 to 0.1% based on the weight of saccharide solids in the high-purity maltose solution.
  • a high conversion rate was shown at 0.8% (v/w).
  • a high-purity maltose product (manufacturer: Junsei Chemical Co., Ltd.) was diluted with ion-exchanged water to prepare a high-purity maltose solution having a solid concentration of 20 Brix.
  • an enzymatic oxidation reaction was performed for 24 hr under the conditions of a reaction temperature of 25° C., an aeration rate of 1 vvm, and an agitation rate of 200 rpm.
  • the reaction pH was kept constant at about 7 using a 1M sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) solution.
  • the reaction product solution was heated to about 80° C. and treated for about 2 hr to inactivate the enzyme. Thereafter, the reaction product solution was cooled to room temperature and filtered to obtain a maltobionic acid-containing saccharide solution.
  • the sugar components and contents of the obtained maltobionic acid-containing saccharide solution were analyzed by HPLC.
  • Carbohydrate oxidase (Supplier: Novozymes) and Catalase (Supplier: Novozymes), which are saccharide oxidases, were added under the same conditions and in the same manner as in Preparation Example 22, except that the enzyme oxidation reaction temperature was different. A saccharide solution containing maltobionic acid was obtained. The sugar components and contents of the obtained maltobionic acid-containing saccharide solution were analyzed by HPLC.
  • the amount of carbohydrate oxidase added is 4.0 to 4.3% based on the weight of the saccharide solids in the high-purity maltose solution. (v/w), the amount of catalase added is 0.2% (v/w) relative to the weight of the saccharide solid content of the high-purity maltose solution, and the enzyme oxidation reaction time at which the conversion rate is close to 100% when the enzyme oxidation reaction temperature is 25 to 35°C was 15-20 hr.
  • a high-purity maltose product (manufacturer: Junsei Chemical Co., Ltd.) was diluted with ion-exchanged water to prepare a high-purity maltose solution having a solid concentration of 20 Brix.
  • an enzymatic oxidation reaction was performed for 24 hr under the conditions of a reaction temperature of 25° C., an aeration rate of 1 vvm, and an agitation rate of 200 rpm.
  • the reaction pH was kept constant at about 7 using a 1M sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) solution.
  • the reaction product solution was decolored by treatment with activated carbon in an amount corresponding to 4% by weight based on the weight of the solid content, and filtered through porous diatomaceous earth having a size of 0.2 ⁇ m to obtain a maltobionic acid-containing saccharide solution.
  • a high-purity maltose solution with a solid concentration of 20 Brix, a saccharide solution containing maltobionic acid that has undergone enzymatic oxidation/decolorization/diatomaceous earth filtration, and a commercial maltobionic acid product (manufacturer: Carbosynth) have a solid concentration of 20 Brix.
  • the pH and conductivity of the phosphorus solution were compared, and the results are summarized in Table 7 below.
  • a maltobionic acid-containing saccharide solution obtained by converting a high-purity maltose solution having a solid content concentration of 20 Brix into maltobionic acid through enzymatic oxidation and decolorizing and diatomaceous earth filtration was commercially available maltobionic acid.
  • the obtained saccharide solutions containing maltobionic acid were passed through various combinations of ion exchange resins to obtain purified saccharide solutions containing maltobionic acid, and changes in pH and conductivity were observed.
  • the types and information of the cation exchange resin and anion exchange resin used are as follows.
  • Sodium bicarbonate used as a pH adjusting agent in the process of preparing the maltobionic acid-containing saccharide solution exists as sodium ions, carbon dioxide, and water in the liquid phase. was carried out.
  • the purified maltobionic acid-containing saccharide solution had a lower pH and significantly higher conductivity than commercial maltobionic acid products.
  • the maltobionic acid-containing saccharide solution was purified using various combinations of ion exchange resins.
  • purification using an ion exchange resin is performed by sequentially passing the stock solution through a cation exchange resin and an anion exchange resin, but when a saccharide solution containing maltobionic acid is passed through a cation exchange resin, maltobionic acid may exist in the form of anions, Maltobionic acid present in the form has room for removal by being adsorbed on the anion exchange resin. Therefore, the present inventors carried out purification by sequentially passing the maltobionic acid-containing saccharide solution through an anion exchange resin and a cation exchange resin.
  • the maltobionic acid-containing saccharide solution passed through the cation exchange resin may have a rather low pH value, it was further passed through a mixed-phase ion exchange resin for purification.
  • the flow rate (space volume) of the saccharide solution containing maltobionic acid was 3 ml/min.
  • Table 8 summarizes the results of purification by passing the saccharide solution containing maltobionic acid through an ion exchange resin.
  • Resin:Gel type strongly acidic cation exchange resin It is determined that it is preferable to purify by sequentially passing through a mixed phase resin (a resin in which the strong acid cation exchange resin and the strong base anion exchange resin are mixed in a volume ratio of 4:1) do.
  • a high-purity maltose product (manufacturer: Junsei Chemical Co., Ltd.) was diluted with ion-exchanged water to prepare a high-purity maltose solution having a solid concentration of 20 Brix.
  • an enzymatic oxidation reaction was performed for 24 hr under the conditions of a reaction temperature of 25° C., an aeration rate of 1 vvm, and an agitation rate of 200 rpm.
  • the reaction pH was kept constant at about 7 using a 1M sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) solution.
  • the reaction product solution was decolored by treatment with activated carbon in an amount corresponding to 4% by weight based on the weight of the solid content, and filtered through porous diatomaceous earth having a size of 0.2 ⁇ m to obtain a maltobionic acid-containing saccharide solution.
  • the saccharide solution containing maltobionic acid was mixed with a macroporous type strong basic anion exchange resin: gel type strong acid cation exchange resin: mixed phase resin (the strong acid cation exchange resin and the strong acid cation exchange resin) having a volume ratio of 1:1:1.
  • a basic anion exchange resin was sequentially passed through a resin mixed in a volume ratio of 4:1) to obtain a purified maltobionic acid-containing saccharide solution.
  • the purified saccharide solution containing maltobionic acid was composed of about 96% by weight of maltobionic acid, about 3% by weight of maltose, and about 1% by weight of saccharide by-products based on the total weight of saccharide solids.
  • the purified maltobionic acid-containing saccharide solution was concentrated to prepare a maltobionic acid-containing saccharide concentrate having a solid concentration of about 80 Brix. Thereafter, maltobionic acid-containing saccharide concentrate was added to ethanol having a purity of about 98% at a volume ratio of 1:1, mixed with shaking to induce precipitation of maltobionic acid, and dehydration was repeated at least 10 times in total.
  • the induction of precipitation of maltobionic acid by ethanol was found to be significantly less economical because the amount of ethanol used was excessive and the removal of ethanol was not easy.
  • the purified maltobionic acid-containing saccharide solution was concentrated to prepare a maltobionic acid-containing saccharide concentrate having a solid concentration of about 35 Brix. Thereafter, the spray drying of the maltobionic acid-containing saccharide concentrate was performed while adjusting the inlet temperature of the spray dryer and the atomizer rotation speed.
  • the melting point of maltose is 102°C, and the melting point of maltobionic acid is expected to be below 100°C, and the initial spray drying conditions are inlet temperature 125°C and outlet temperature 85 It was set in the range of ⁇ 90 ° C and atomizer rotation speed 500 ⁇ 1000 rpm.
  • the saccharide concentrate containing maltobionic acid sprayed through an atomizer at an inlet temperature of 125° C. was not pulverized and existed in a liquid form on the inner chamber wall of the spray dryer. Then, the inlet temperature was set to 200 ° C, which is much higher than the melting point of maltose, the outlet temperature was 145 ° C, and the atomizer rotation speed was 500 rpm. Spray drying was performed.
  • the saccharide concentrate containing maltobionic acid was not powdered.
  • the spray drying conditions were set to an inlet temperature of 150 ° C, an outlet temperature of 121 ° C, an atomizer rotation speed of 700 rpm, and a maltobionic acid-containing saccharide concentrate injection rate of 700 ml / hour.
  • two types of maltobionic acid-containing saccharide concentrates having solid concentrations of 15 Brix and 35 Brix were used. As a result, powdering of the saccharide concentrate containing maltobionic acid was smoothly achieved.
  • the spray drying conditions of the saccharide concentrate containing maltobionic acid were determined as follows.
  • the purified maltobionic acid-containing saccharide solution was concentrated to prepare a maltobionic acid-containing saccharide concentrate having a solid concentration of about 90 Brix. Thereafter, maltobionic acid seed crystals were added to the maltobionic acid-containing saccharide concentrate in an amount of up to 20% based on the weight of the maltobionic acid-containing saccharide concentrate, and the temperature was gradually lowered from 90 °C to 15 °C to attempt crystallization.
  • maltobionic acid has strong hygroscopicity and is soluble even at room temperature, and therefore crystallization by cooling was not achieved even at high concentrations.

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Abstract

본 발명에 따른 말토비온산 제조방법은 고형분 농도가 15~25 브릭스(Brix)이고 당류 고형분 전체 중량을 기준으로 말토스 함량이 90 중량% 이상인 말토스 함유 당류 용액을 준비하는 단계; 및 상기 말토스 함유 당류 용액에 당류 고형분 중량 대비 카보하이드레이트옥시다제(Carbohydrate oxidase) 4.0~5.0%(v/w) 및 카탈라제(Catalase) 0.1~0.8%(v/w)를 첨가하고 22~35℃의 온도 조건, 6~8의 pH 조건, 0.9~1.2 vvm의 에어레이션(aeration) 속도 조건 및 150~300 rpm의 교반 속도 조건으로 효소 산화반응을 15~30 hr 동안 진행시켜 반응 산물 함유 용액을 수득하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 제조방법을 사용하는 경우 말토스의 말토비온산으로의 전환율을 99% 이상으로 할 수 있고, 별도의 크로마토그래피 분리 공정을 사용하지 않고도 순도가 95% 이상이고 분말 형태인 고순도 말토비온산을 생산할 수 있다.

Description

효소적 산화를 이용한 말토비온산 제조방법
본 발명은 말토비온산의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 효소적 산화 및 다양한 공정 조건을 통해 말토스 함유 용액으로부터 고순도의 말토비온산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
당류는 일반적으로 항산화 활성이 낮은 물질이다. Hu 등[Hu et al., In vitro evaluation of the antioxidant activities of carbohydrates, Bioactive Carbohydratesand Dietary Fibre 7 (2016) 19-27]에 따르면 포도당, 과당과 같은 단당 및 올리고당은 약 2,000 ppm의 농도에서도 약 10% 미만의 항산화 활성을 보인다.
당류는 식품 소재나 화장품 소재로 널리 사용되는데, 당류에 높은 항산화 활성이 부여되는 경우 이의 적용 분야는 훨씬 더 다양해질 수 있다. 항산화 활성을 가지는 대표적인 산화 당류로는 글루콘산(Gluconic acid), 말토비온산(Maltobionic acid, MBA)이 있다.
말토비온산은 말토스(맥아당)를 브롬수로 산화시켜 얻는 물질로서 다음과 같은 화학 구조를 갖는다. 미국 공개특허공보 제2016-0081387호에는 전분을 효소 반응을 통해 말토스로 전환하는 단계; 및 말토스를 효소 반응을 통해 말토비온산으로 전환하는 단계를 포함하는 말토비온산 제조방법과 함께 말토비온산이 항산화 효과를 가지는 식품 첨가제로 사용될 수 있다는 점이 개시되어 있다.
[말토비온산의 화학 구조]
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본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 말토스 함유 용액으로부터 분말 형태의 고순도 말토비온산을 제조하는 방법을 제공하는데에 있다.
본 발명의 발명자들은 말토스로부터 고순도의 말토비온산을 상업적 수준으로 제조하기 위해 효소 산화반응 공정, 이온교환수지에 의한 정제공정, 고형화 공정 등과 같이 전체 공정을 구성하는 단위공정들을 조합하고 최종 생산물인 말토비온산의 품질에 영향을 미치는 단위공정들의 다양한 조건들을 탐색한 후 말토스로부터 고순도의 말토비온산을 상업적 수준으로 제조할 수 있는 파라미터들을 확립하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 (a) 말토스 함유 당류 용액을 준비하는 단계; 및 (b) 효소 산화반응을 통해 반응 산물 함유 용액을 수득하는 단계를 포함하는 말토비온산 제조방법을 제공한다. 본 발명의 일 예에 따른 말토비온산 제조방법은 바람직하게는 (c) 탈색 및 여과를 통해 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 말토비온산 제조방법은 바람직하게는 (d) 이온교환수지 정제를 통해 정제된 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 말토비온산 제조방법은 바람직하게는 (e) 분무건조를 통해 분말화된 정제 말토비온산을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 일 예에 따른 말토비온산 제조방법을 각 단계별로 나누어 설명한다.
(a) 말토스 함유 당류 용액을 준비하는 단계
본 발명의 일 예에 따른 말토비온산 제조방법에서 (a) 단계는 당류 고형분 전체 중량을 기준으로 말토스 함량이 90 중량% 이상인 말토스 함유 당류를 물(water)에 용해하거나 물(water)로 희석하여 고형분 농도를 15~25 브릭스(Brix)인 말토스 함유 당류 용액을 준비하는 것으로 구성된다.
상기 (a) 단계를 통해 준비되는 말토스 함유 당류 용액은 당류 고형분 전체 중량을 기준으로 말토스 90~95 중량% 및 기타 당류 5~10 중량%를 포함할 수 있다. 상기 기타 당류는 포도당(Glucose)이 주성분이고, 포도당(Glucose)을 단위구조로 가지는 중합도 3~12의 올리고당도 소량 포함할 수 있다.
또한, 상기 (a) 단계를 통해 준비되는 말토스 함유 당류 용액은 바람직하게는 당류 고형분 전체 중량을 기준으로 말토스 함량이 95 중량% 이상이다. 예를 들어, 바람직한 일 예에 따른 말토스 함유 당류 용액은 당류 고형분 전체 중량을 기준으로 말토스 95~99 중량%, 이소말토스 0.1~2 중량% 및 기타 당류 0.5~4 중량%를 포함할 수 있다. 상기 기타 당류는 포도당(Glucose)을 단위구조로 가지는 중합도 3~12의 올리고당으로 구성될 수 있다.
(b) 효소 산화반응을 통해 반응 산물 함유 용액을 수득하는 단계
본 발명의 일 예에 따른 말토비온산 제조방법에서 (b) 단계는 말토스 함유 당류 용액에 당류 고형분 중량 대비 카보하이드레이트옥시다제(Carbohydrate oxidase) 4.0~5.0%(v/w) 및 카탈라제(Catalase) 0.1~0.8%(v/w)를 첨가하고 22~37℃의 온도 조건, 6~8의 pH 조건, 0.9~1.5 vvm의 에어레이션(aeration) 속도 조건 및 100~400 rpm의 교반 속도 조건으로 효소 산화반응을 15~30 hr 동안 진행시켜 반응 산물 함유 용액을 수득하는 것으로 구성된다. 상기 (b) 단계에서 카보하이드레이트옥시다제(Carbohydrate oxidase) 첨가량은 효소 산화반응 전환율을 고려할 때 말토스 함유 당류 용액의 당류 고형분 중량 대비 4.1~4.8 중량%인 것이 바람직하고, 4.2~4.5 중량%인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 (b) 단계에서 카탈라제(Catalase)의 첨가량은 효소 산화반응 전환율을 고려할 때 말토스 함유 당류 용액의 당류 고형분 중량 대비 0.15~0.75 중량%인 것이 바람직하고, 0.15~0.5 중량%인 것이 더 바람직하다. 상기 (b) 단계에서 효소 산화반응 온도는 전환율을 고려할 때 24~37℃인 것이 바람직하고 25~35℃인 것이 더 바람직하다. 상기 (b) 단계에서 효소 산화반응 pH는 전환율을 고려할 때 6.5~7.5인 것이 바람직하다. 또한, 효소 산화반응 pH 조건은 약염기성 물질 또는 약염기성 물질 용액에 의해 조절된다. 상기 약염기성 물질의 종류는 효소의 활성을 저하시키는 않는 것이라면 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 탄산수소나트륨, 탄산나트륨, 탄산수소칼륨, 탄산칼륨 등이 있고, 이중 탄산수소나트륨인 것이 바람직하다. 상기 (b) 단계에서 효소 산화반응시 에어레이션(aeration) 속도 조건은 전환율을 고려할 때 0.9~1.2 vvm인 것이 바람직하다. 상기 (b) 단계에서 효소 산화반응시 교반 속도 조건은 전환율을 고려할 때 150~350 rpm인 것이 바람직하고, 180~250 rpm인 것이 더 바람직하다. 상기 (b) 단계에서 효소 산화반응 시간은 전환율 및 경제성을 고려할 때 15~28 hr인 것이 바람직하고 18~24 hr인 것이 더 바람직하다. 상기 (b) 단계에서 수득한 반응 산물 함유 용액은 당류 고형분 전체 중량을 기준으로 말토비온산 함량이 90 중량% 이상이고 바람직하게는 95 중량% 이상이다.
(c) 탈색 및 여과를 통해 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하는 단계
본 발명의 바람직한 일 예에 따른 말토비온산 제조방법에서 (c) 단계는 반응 산물 함유 용액을 활성탄으로 처리하여 탈색하고 여과하여 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하는 것으로 구성될 수 있다. 상기 탈색은 반응 산물 함유 용액에 소정량의 활성탄을 첨가하고 소정의 시간 동안 교반하여 진행될 수 있다. 활성탄의 첨가량은 반응 산물 함유 용액의 고형분 중량 대비 1~6 중량%에서 선택될 수 있다. 상기 여과는 탈색 처리된 반응 산물 함유 용액을 공지의 다양한 여과재에 통과시켜 진행될 수 있다. 상기 여과재는 그 종류가 제한되지 않으며, 예를 들어 여과포, 다공성 금속, 금속 섬유, 유리섬유, 다공성 플라스틱, 다공성 세라믹 등이 있으며, 식품 공업에서 안전하게 사용되는 다공성 규조토 여과재인 것이 바람직하다.
(d) 이온교환수지 정제를 통해 정제된 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하는 단계
본 발명의 바람직한 일 예에 따른 말토비온산 제조방법에서 (d) 단계는 말토비온산 함유 당류 용액을 강염기성 음이온 교환수지, 강산성 양이온 교환수지 및 혼상 이온교환수지에 순차적으로 통과시켜 정제된 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하는 것으로 구성될 수 있다. 상기 혼상 이온교환수지는 강산성 양이온 교환수지 및 강염기성 음이온 교환수지를 혼합한 수지이다. 상기 (d) 단계에서 말토비온산 함유 당류 용액의 통액 속도(space velocity)는 정제된 말토비온산 함유 당류 용액의 pH 또는 전도도를 고려할 때 1~6 ㎖/min인 것이 바람직하고 2~5 ㎖/min인 것이 더 바람직하다. 상기 (d) 단계에서 사용되는 강염기성 음이온 교환수지는 정제용량, 정제된 말토비온산 함유 당류 용액의 pH 또는 전도도를 고려할 때 매크로다공성(Macroporous) 타입인 것이 바람직하다. 또한, 상기 강산성 양이온 교환수지는 정제된 말토비온산 함유 당류 용액의 pH 또는 전도도를 고려할 때 겔(Gel) 타입인 것이 바람직하다. 또한, 상기 (d) 단계에서 강염기성 음이온 교환수지:강산성 양이온 교환수지:혼상 이온교환수지의 부피비는 정제된 말토비온산 함유 당류 용액의 pH 또는 전도도를 고려할 때 1:(0.25~2):(0.25~1)인 것이 바람직하고 1:(0.3~1):(0.3~1)인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 (d) 단계에서 혼상 이온교환수지를 구성하는 강산성 양이온 교환수지:강염기성 음이온 교환수지의 혼합 부피비는 정제된 말토비온산 함유 당류 용액의 pH 또는 전도도를 고려할 때 1:(0.1~0.5)인 것이 바람직하고 1:(0.2~0.3)인 것이 더 바람직하다.
(e) 분무건조를 통해 분말화된 정제 말토비온산을 수득하는 단계
본 발명의 바람직한 일 예에 따른 말토비온산 제조방법에서 (e) 단계는 정제된 말토비온산 함유 당류 용액의 고형분 농도를 10~40 브릭스(Brix)로 조절한 후 아토마이저(Atomizer)를 통해 분무건조기 내부 챔버로 주입하여 분말화된 정제 말토비온산을 수득하는 것으로 구성될 수 있다. 상기 (e) 단계에서 정제된 말토비온산 함유 당류 용액의 고형분 농도는 원활한 분말화를 위해 분무건조기에 공급되기 전에 15~35 브릭스(Brix)로 조절되는 것이 바람직하다. 상기 (e) 단계에서 정제된 말토비온산 함유 당류 용액의 주입 속도는 분무건조기의 처리 용량에 따라 다양한 범위에서 선택될 수 있고 예를 들어 500~1,000 ㎖/hour 범위에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 (e) 단계에서 정제된 말토비온산 함유 당류 용액을 분무건조기 내부 챔버로 주입하는 통로인 주입구 온도는 원활한 분말화를 위해 135~170℃인 것이 바람직하고, 140~160℃인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 (e) 단계에서 아토마이저(Atomizer) 회전 속도는 원활한 분말화를 위해 600~900 rpm인 것이 바람직하고, 600~800 rpm인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 (e) 단계에서 분무건조기 내부 챔버의 출구 온도는 100~135℃인 것이 바람직하고, 110~130℃인 것이 더 바람직하다.
본 발명에 따른 제조방법을 사용하는 경우 말토스의 말토비온산으로의 전환율을 99% 이상으로 할 수 있고, 별도의 크로마토그래피 분리 공정을 사용하지 않고도 순도가 95% 이상이고 분말 형태인 고순도 말토비온산을 생산할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
1. 말토스 함유 당류 제품을 이용한 말토비온산 제조공정 조건 확립
제조예 1.
말토스 함유 당류 제품(제조사 : 대상주식회사)을 이온교환수로 희석하여 고형분 농도가 각각 20 브릭스(Brix)인 말토스 함유 당류 용액을 제조하였다. 당류 산화효소인 카보하이드레이트옥시다제(Carbohydrate oxidase; 공급자 : Novozymes) 및 카탈라제(Catalase; 공급자 : Novozymes)를 각각 말토스 함유 당류 용액의 당류 고형분 중량 대비 5.2%(v/w) 및 1.3%(v/w)의 양으로 첨가하고 반응 온도 25℃, 에어레이션(aeration) 속도 1 vvm 및 교반 속도 300 rpm의 조건에서 24 hr 동안 효소 산화반응을 진행시켰다. 효소 산화반응이 진행되는 동안 1M 농도의 탄산수소나트륨(NaHCO3) 용액을 이용하여 반응 pH를 약 7로 일정하게 유지시켰다. 효소 산화반응 시간이 완료된 후 반응 산물 용액을 약 80℃로 승온하고 약 2 hr 동안 처리하여 효소를 실활시켰다. 이후, 반응 산물 용액을 실온으로 냉각시킨 후 여과하여 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하였다.
제조예 2 내지 제조예 6.
말토스 함유 당류 용액의 고형분 농도, 효소 산화반응 온도, 에어레이션(aeration) 속도 또는 교반 속도 등의 조건을 다르게 한 점을 제외하고는 제조예 1과 동일한 조건 및 동일한 방법으로 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하였다.
하기 표 1에 제조예 1 내지 제조예 6에서 사용한 제조공정 조건을 정리하였다.
제조예 구분 제조공정 조건
말토스 함유 당류 용액의 고형분 농도(Brix) 효소 산화반응 온도(℃) 에어레이션(aeration) 속도(vvm) 교반 속도(rpm)
제조예 1 20 25 1 300
제조예 2 20 30 1 300
제조예 3 20 40 1 300
제조예 4 30 25 1 300
제조예 5 20 25 1 200
제조예 6 20 25 0.8 300
말토스 함유 당류 제품(제조사 : 대상주식회사) 및 제조예 1 내지 제조예 6에서 수득한 말토비온산 함유 당류 용액의 당 성분 및 함량을 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석 조건은 다음과 같다.
* 칼럼 및 온도 : Aminex HPX-87C Column, 85℃
* 이동상 및 유량 : 물(water), 0.6 ㎖/min
* 검출기 : RID
하기 표 2에 말토스 함유 당류 제품(제조사 : 대상주식회사) 및 제조예 1 내지 제조예 6에서 수득한 말토비온산 함유 당류 용액의 당 성분 및 함량을 정리하였다.
분석 시료 구분 당 성분 및 함량(중량%, HPLC 피크 면적에 의한 당류 고형분 전체 중량 기준) 전환율(%)
Maltobionic acid Maltose Limit dextrin Glucose
말토스 함유 당류 제품 - 75±1 21±1 4±1 -
제조예 1 53.56 21.41 21.3 3.73 71.4
제조예 2 53.86 23.4 17.05 5.69 71.8
제조예 3 43.98 32.43 19.92 3.67 58.6
제조예 4 28.74 47.46 19.77 4.03 38.3
제조예 5 57.84 18.87 19.67 3.62 77.12
제조예 6 40.11 36.15 16.96 6.78 53.48
* 한계 덱스트린(Limit dextrin) : 전분을 아밀라아제로 분해하였을 때 더 이상 분해되지 않고 남은 덱스트린
상기 표 2에서 보이는 바와 같이 말토스 함유 당류 용액을 효소 산화반응에 의해 말토비온산으로 전환하는 경우, 다음과 같은 공정 조건에서 높은 전환율을 보였다. 특히 말토비온산의 전환율은 말토스 함유 당류 용액의 당류 고형분 농도 및 에어레이션 속도에 크게 영향을 받는 것으로 나타났다.
* 말토스 함유 당류 용액의 당류 고형분 농도 : 20 브릭스(Brix)
* 효소 산화반응 온도 : 25~30℃/경제적 관점에서 25℃
* 에어레이션(aeration) 속도 : 1 vvm
* 교반 속도 : 200 rpm
2. 정제 말토스 제품을 이용한 말토비온산 제조공정 조건 확립
제조예 7.
정제 말토스 제품(제조사 : 대상주식회사)을 이온교환수로 희석하여 고형분 농도가 20 브릭스(Brix)인 정제 말토스 용액을 제조하였다. 당류 산화효소인 카보하이드레이트옥시다제(Carbohydrate oxidase; 공급자 : Novozymes) 및 카탈라제(Catalase; 공급자 : Novozymes)를 각각 정제 말토스 용액의 당류 고형분 중량 대비 5.2%(v/w) 및 1.3%(v/w)의 양으로 첨가하고 반응 온도 25℃, 에어레이션(aeration) 속도 1 vvm 및 교반 속도 200 rpm의 조건에서 24 hr 동안 효소 산화반응을 진행시켰다. 효소 산화반응이 진행되는 동안 1M 농도의 탄산수소나트륨(NaHCO3) 용액을 이용하여 반응 pH를 약 7로 일정하게 유지시켰다. 효소 산화반응 시간이 완료된 후 반응 산물 용액을 약 80℃로 승온하고 약 2 hr 동안 처리하여 효소를 실활시켰다. 이후, 반응 산물 용액을 실온으로 냉각시킨 후 여과하여 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하였다.
제조예 8.
정제 말토스 제품(제조사 : 대상주식회사)을 이온교환수로 희석하여 고형분 농도가 20 브릭스(Brix)인 정제 말토스 용액을 제조하였다. 당류 산화효소인 글루코스옥시다제(Glucose oxidase; 공급자 : Novozymes) 및 카탈라제(Catalase; 공급자 : Novozymes)를 각각 정제 말토스 용액의 당류 고형분 중량 대비 5.2%(v/w) 및 1.3%(v/w)의 양으로 첨가하고 반응 온도 25℃, 에어레이션(aeration) 속도 1 vvm 및 교반 속도 200 rpm의 조건에서 24 hr 동안 효소 산화반응을 진행시켰다. 효소 산화반응이 진행되는 동안 1M 농도의 탄산수소나트륨(NaHCO3) 용액을 이용하여 반응 pH를 약 7로 일정하게 유지시켰다. 효소 산화반응 시간이 완료된 후 반응 산물 용액을 약 80℃로 승온하고 약 2 hr 동안 처리하여 효소를 실활시켰다. 이후, 반응 산물 용액을 실온으로 냉각시킨 후 여과하여 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하였다.
제조예 9.
정제 말토스 제품(제조사 : 대상주식회사)을 이온교환수로 희석하여 고형분 농도가 20 브릭스(Brix)인 정제 말토스 용액을 제조하였다. 당류 산화효소인 카보하이드레이트옥시다제(Carbohydrate oxidase; 공급자 : Novozymes) 및 카탈라제(Catalase; 공급자 : Novozymes)를 각각 정제 말토스 용액의 당류 고형분 중량 대비 5.2%(v/w) 및 1.3%(v/w)의 양으로 첨가하고 반응 온도 25℃, 에어레이션(aeration) 속도 1 vvm 및 교반 속도 200 rpm의 조건에서 24 hr 동안 효소 산화반응을 진행시켰다. 효소 산화반응이 진행되는 동안 1M 농도의 수산화나트륨(NaOH) 용액을 이용하여 반응 pH를 약 7로 일정하게 유지시켰다. 효소 산화반응 시간이 완료된 후 반응 산물 용액을 약 80℃로 승온하고 약 2 hr 동안 처리하여 효소를 실활시켰다. 이후, 반응 산물 용액을 실온으로 냉각시킨 후 여과하여 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하였다.
정제 말토스 제품(제조사 : 대상주식회사) 및 제조예 7 내지 제조예 9에서 수득한 말토비온산 함유 당류 용액의 당 성분 및 함량을 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석 조건은 다음과 같다.
* 칼럼 및 온도 : Aminex HPX-87C Column, 85℃
* 이동상 및 유량 : 물(water), 0.6 ㎖/min
* 검출기 : RID
하기 표 3에 정제 말토스 제품(제조사 : 대상주식회사) 및 제조예 7 내지 제조예 9에서 수득한 말토비온산 함유 당류 용액의 당 성분 및 함량을 정리하였다.
분석 시료 구분 당 성분 및 함량(중량%, HPLC 피크 면적에 의한 당류 고형분 전체 중량 기준) 전환율(%)
Maltobionic acid Maltose 기타 당류
정제 말토스 제품 - 90±1 10±1 -
제조예 7 88.66 0 11.34 98.5
제조예 8 3.1 71.54 25.36 3.4
제조예 9 47.08 34.96 17.96 52.3
* 정제 말토스 제품의 기타 당류 : 포도당(Glucose)이 주성분이고, 포도당(Glucose)을 단위구조로 가지는 중합도 3~12의 올리고당도 소량 포함됨상기 표 3에서 보이는 바와 같이 당류 산화효소 시스템을 카보하이드레이트옥시다제-카탈라제 조합 대신 글루코스옥시다제-카탈라제 조합으로 변경하는 경우 말토비온산으로의 전환율이 현저하게 감소하였다. 또한, 효소 산화반응 pH 조절제로 약염기인 탄산수소나트륨(NaHCO3) 대신 강염기인 수산화나트륨(NaOH)을 사용하는 경우 효소 활성이 저하되고 말토비온산으로의 전환율이 크게 감소하였다.
3. 고순도 말토스 제품을 이용한 말토비온산 제조공정 조건 확립
(1) 효소 첨가량 조건 확립
제조예 10.
고순도 말토스 제품(제조사 : Junsei Chemical Co.,Ltd.)을 이온교환수로 희석하여 고형분 농도가 20 브릭스(Brix)인 고순도 말토스 용액을 제조하였다. 당류 산화효소인 카보하이드레이트옥시다제(Carbohydrate oxidase; 공급자 : Novozymes) 및 카탈라제(Catalase; 공급자 : Novozymes)를 각각 고순도 말토스 용액의 당류 고형분 중량 대비 2.6%(v/w) 및 0.16%(v/w)의 양으로 첨가하고 반응 온도 25℃, 에어레이션(aeration) 속도 1 vvm 및 교반 속도 200 rpm의 조건에서 24 hr 동안 효소 산화반응을 진행시켰다. 효소 산화반응이 진행되는 동안 1M 농도의 탄산수소나트륨(NaHCO3) 용액을 이용하여 반응 pH를 약 7로 일정하게 유지시켰다. 효소 산화반응 시간이 완료된 후 반응 산물 용액을 약 80℃로 승온하고 약 2 hr 동안 처리하여 효소를 실활시켰다. 이후, 반응 산물 용액을 실온으로 냉각시킨 후 여과하여 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하였다.
제조예 11 내지 제조예 21.
당류 산화효소인 카보하이드레이트옥시다제(Carbohydrate oxidase; 공급자 : Novozymes) 및 카탈라제(Catalase; 공급자 : Novozymes)의 첨가량을 다르게 한 점을 제외하고는 제조예 10과 동일한 조건 및 동일한 방법으로 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하였다.
하기 표 4에 제조예 10 내지 제조예 21에서 사용한 당류 산화효소 첨가량을 정리하였다.
제조예 구분 당류 산화효소 첨가량(고순도 말토스 용액 당류 고형분 중량 대비, v/w %)
카보하이드레이트옥시다제 카탈라제
제조예 10 2.6 0.16
제조예 11 3.0 0.5
제조예 12 3.5 1
제조예 13 3.5 0.5
제조예 14 4 1
제조예 15 4.25 0.25
제조예 16 4.3 0.15
제조예 17 4.3 0.2
제조예 18 4.3 0.25
제조예 19 4.4 0.25
제조예 20 4.5 0.1
제조예 21 4.5 0.5
고순도 말토스 제품(제조사 : Junsei Chemical Co.,Ltd.) 및 제조예 10 내지 제조예 21에서 수득한 말토비온산 함유 당류 용액의 당 성분 및 함량을 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석 조건은 다음과 같다.
* 칼럼 및 온도 : Aminex HPX-87C Column, 85℃
* 이동상 및 유량 : 물(water), 0.6 ㎖/min
* 검출기 : RID
하기 표 5에 고순도 말토스 제품(제조사 : Junsei Chemical Co.,Ltd.) 및 제조예 10 내지 제조예 21에서 수득한 말토비온산 함유 당류 용액의 당 성분 및 함량을 정리하였다.
분석 시료 구분 당 성분 및 함량(중량%, HPLC 피크 면적에 의한 당류 고형분 전체 중량 기준)
Maltose Isomaltose Glucose Maltobionic acid 기타 당류
고순도 말토스 제품 96.8 0.7 - - 2.5
제조예 10 32.7 0.4 2.8 63.7 0.5
제조예 11 15.9 0.265 1.7 81.4 0.7
제조예 12 19.9 0.26 2.2 46.8 0.84
제조예 13 10.34 0.18 0.44 87.21 1.84
제조예 14 14.2 0.4 2.5 82.7 0.2
제조예 15 2.90 0.36 1.02 94.51 1.21
제조예 16 2.80 0.22 - 96.08 1.63
제조예 17 0.6 0.37 - 97.90 1.13
제조예 18 2.63 0.34 - 96.24 0.79
제조예 19 2.90 0.32 - 95.38 1.40
제조예 20 4.55 0.32 0.87 93.55 0.71
제조예 21 2.40 0.28 0.18 95.36 1.79
* 고순도 말토스 제품의 기타 당류 : 포도당(Glucose)을 단위구조로 가지는 중합도 3~12의 올리고당으로 구성됨상기 표 5에서 보이는 바와 같이, 고순도 말토스 용액을 효소 산화반응에 의해 말토비온산으로 전환하는 경우, 카보하이드레이트옥시다제(Carbohydrate oxidase)의 첨가량이 고순도 말토스 용액의 당류 고형분 중량 대비 4.0~5.0%(v/w)이고 카탈라제(Catalase)의 첨가량이 고순도 말토스 용액의 당류 고형분 중량 대비 0.1~0.8%(v/w)일 때 높은 전환율을 보였다.
(2) 효소 산화반응 온도 조건 확립
제조예 22.
고순도 말토스 제품(제조사 : Junsei Chemical Co.,Ltd.)을 이온교환수로 희석하여 고형분 농도가 20 브릭스(Brix)인 고순도 말토스 용액을 제조하였다. 당류 산화효소인 카보하이드레이트옥시다제(Carbohydrate oxidase; 공급자 : Novozymes) 및 카탈라제(Catalase; 공급자 : Novozymes)를 각각 고순도 말토스 용액의 당류 고형분 중량 대비 4.3%(v/w) 및 0.2%(v/w)의 양으로 첨가하고 반응 온도 25℃, 에어레이션(aeration) 속도 1 vvm 및 교반 속도 200 rpm의 조건에서 24 hr 동안 효소 산화반응을 진행시켰다. 효소 산화반응이 진행되는 동안 1M 농도의 탄산수소나트륨(NaHCO3) 용액을 이용하여 반응 pH를 약 7로 일정하게 유지시켰다. 효소 산화반응 시간별로 반응 산물 용액을 샘플링한 후 반응 산물 용액을 약 80℃로 승온하고 약 2 hr 동안 처리하여 효소를 실활시켰다. 이후, 반응 산물 용액을 실온으로 냉각시킨 후 여과하여 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하였다. 수득한 말토비온산 함유 당류 용액의 당 성분 및 함량을 HPLC로 분석하였다.
제조예 23 내지 제조예 27.
당류 산화효소인 카보하이드레이트옥시다제(Carbohydrate oxidase; 공급자 : Novozymes) 및 카탈라제(Catalase; 공급자 : Novozymes)의 첨가량, 효소 산화반응 온도를 다르게 한 점을 제외하고는 제조예 22와 동일한 조건 및 동일한 방법으로 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하였다. 수득한 말토비온산 함유 당류 용액의 당 성분 및 함량을 HPLC로 분석하였다.
하기 표 6에 제조예 22 내지 제조예 27에서 사용한 당류 산화효소 첨가량, 효소 산화반응 온도 및 수득한 말토비온산 함유 당류 용액의 당류 고형분 중량 기준으로 말토스(maltose) 함량이 1 중량% 미만이 되었을 때의 효소 산화반응 시간을 정리하였다.
제조예 구분 당류 산화효소 첨가량(고순도 말토스 용액 당류 고형분 중량 대비, v/w %) 효소 산화반응 온도(℃) 말토스 함량이 1 중량% 미만이 되는 효소 산화반응 시간
카보하이드레이트옥시다제 카탈라제
제조예 22 4.3 0.2 25 20 hr
제조예 23 4.3 0.2 32 18 hr
제조예 24 4.3 0.2 35 15 hr
제조예 25 4.0 0.2 35 18 hr
제조예 26 3.8 0.2 35 전환율 미달성
제조예 27 3.3 0.2 35 전환율 미달성
상기 표 6에서 보이는 바와 같이, 고순도 말토스 용액을 효소 산화반응에 의해 말토비온산으로 전환하는 경우, 카보하이드레이트옥시다제(Carbohydrate oxidase)의 첨가량이 고순도 말토스 용액의 당류 고형분 중량 대비 4.0~4.3%(v/w)이고 카탈라제(Catalase)의 첨가량이 고순도 말토스 용액의 당류 고형분 중량 대비 0.2%(v/w) 수준이고 효소 산화반응 온도 25~35℃일때 전환율이 100% 가까이 되는 효소 산화반응 시간은 15~20 hr 이었다. 반면, 카보하이드레이트옥시다제(Carbohydrate oxidase)의 첨가량이 고순도 말토스 용액의 당류 고형분 중량 대비 3.3~3.8%(v/w)인 경우 다른 조건과 관계없이 전환율이 90%에 미치지 못하였다.
(3) 정제 조건 확립
고순도 말토스 제품(제조사 : Junsei Chemical Co.,Ltd.)을 이온교환수로 희석하여 고형분 농도가 20 브릭스(Brix)인 고순도 말토스 용액을 제조하였다. 당류 산화효소인 카보하이드레이트옥시다제(Carbohydrate oxidase; 공급자 : Novozymes) 및 카탈라제(Catalase; 공급자 : Novozymes)를 각각 고순도 말토스 용액의 당류 고형분 중량 대비 4.3%(v/w) 및 0.2%(v/w)의 양으로 첨가하고 반응 온도 25℃, 에어레이션(aeration) 속도 1 vvm 및 교반 속도 200 rpm의 조건에서 24 hr 동안 효소 산화반응을 진행시켰다. 효소 산화반응이 진행되는 동안 1M 농도의 탄산수소나트륨(NaHCO3) 용액을 이용하여 반응 pH를 약 7로 일정하게 유지시켰다. 이후, 반응 산물 용액을 고형분 중량 대비 4 중량%에 해당하는 양의 활성탄으로 처리하여 탈색하고 0.2 ㎛ 크기의 다공성 규조토로 여과하여 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하였다.
고형분 농도가 20 브릭스(Brix)인 고순도 말토스 용액, 효소 산화반응/탈색/규조토 여과를 거친 말토비온산 함유 당류 용액 및 상업적인 말토비온산 제품(제조사 : Carbosynth)의 고형분 농도가 20 브릭스(Brix)인 용액의 pH, 전도도를 비교하였고 그 결과를 하기 표 7에 정리하였다.
시료 구분 pH 전도도
고형분 농도가 20 브릭스(Brix)인 고순도 말토스 용액 4.74 21.7
효소 산화반응/탈색/규조토 여과를 거친 말토비온산 함유 당류 용액 5.92 13,750
상업적인 말토비온산 제품(제조사 : Carbosynth)의 고형분 농도가 20 브릭스(Brix)인 용액 2.3 2,920
상기 표 7에서 보이는 바와 같이 고형분 농도가 20 브릭스(Brix)인 고순도 말토스 용액을 효소 산화반응시켜 말토비온산으로 전환하고 탈색 및 규조토 여과를 거쳐 수득한 말토비온산 함유 당류 용액은 상업적인 말토비온산에 비해 상당량의 불순물이 존재하였다.수득한 말토비온산 함유 당류 용액을 다양한 조합의 이온교환수지에 통과시켜 정제된 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하였고 pH, 전도도 변화 등을 관찰하였다. 사용한 양이온 교환수지 및 음이온 교환수지의 종류 및 정보는 다음과 같다.
* TRILITE SCR-B : 겔(Gel) 타입 강산성 양이온 교환수지
* LEWATIT S4268 : 매크로다공성(Macroporous) 타입 강염기성 음이온 교환수지
* LEWATIT S6268 : 겔(Gel) 타입 강염기성 음이온 교환수지
말토비온산 함유 당류 용액을 제조하는 과정에서 pH 조절제로 사용한 탄산수소나트륨은 액상에서 나트륨 이온, 이산화탄소 및 물(water)로 존재하기 때문에 말토비온산 함유 당류 용액을을 강산성 양이온 교환수지에만 통과시켜 정제를 실시하였다. 그 결과 정제된 정제된 말토비온산 함유 당류 용액은 상업적인 말토비온산 제품에 비해 pH는 낮고 전도도는 상당히 높았다. 말토비온산 함유 당류 용액을 제조하는 과정에서 pH 조절제로 사용한 탄산수소나트륨 외에도 반응시 생성되는 불순물이 존재할 수 있기 때문에 다양한 조합의 이온교환수지를 사용하여 말토비온산 함유 당류 용액을 정제하였다. 일반적으로 이온교환수지에 의한 정제는 원액을 양이온 교환수지 및 음이온 교환수지에 순차적으로 통과시켜 실시하지만 말토비온산 함유 당류 용액은 양이온 교환수지에 통과시키면 말토비온산이 음이온 형태로 존재할 수 있고, 음이온 형태로 존재하는 말토비온산은 음이온 교환수지에 흡착되어 제거될 여지가 있다. 따라서, 본 발명자는 말토비온산 함유 당류 용액을 음이온 교환수지 및 양이온 교환수지에 순차적으로 통과시켜 정제를 실시하였다. 다만, 양이온 교환수지를 통과한 말토비온산 함유 당류 용액은 다소 낮은 pH 값을 보일 수 있기 때문에 이후 혼상 이온교환수지에 추가적으로 통과시켜 정제하였다. 말토비온산 함유 당류 용액의 통액 속도(Space Volume)은 3 ㎖/min 이었다.
하기 표 8에 말토비온산 함유 당류 용액을 이온교환수지에 통과시켜 정제한 결과를 정리하였다.
이온교환수지 조합 pH 전도도 정제 용량
SCR-B 1.89 3,280 6.7
부피비가 1:1:1인 S4268:SCR-B:혼상수지1 2.17 2,810 2.2
부피비가 1:2:1인 S4268:SCR-B:혼상수지1 2.2 2,720 2.0
부피비가 2:1:1인 S4268:SCR-B:혼상수지1 2.25 2,660 1.8
부피비가 3:1:1인 S4268:SCR-B:혼상수지1 2.29 2,580 1.3
부피비가 2:1:1인 S6268:SCR-B:혼상수지2 2.26 2,670 0.5
* 혼상수지1 : SCR-B 양이온 교환수지 및 S4268 음이온 교환수지를 4:1의 부피비로 혼합하여 제조함* 혼상수지2 : SCR-B 양이온 교환수지 및 S6268 음이온 교환수지를 4:1의 부피비로 혼합하여 제조함
* 정제 용량 : 말토비온산 함유 당류 용액 처리량/이온교환수지 부피
상기 표 8에서 보이는 바와 같이 정제된 말토비온산 함유 당류 용액의 pH, 전도도 및 정제 용량을 고려할 때 말토비온산 함유 당류 용액을 부피비가 1:1:1인 매크로다공성(Macroporous) 타입 강염기성 음이온 교환수지:겔(Gel) 타입 강산성 양이온 교환수지: 혼상수지(상기 강산성 양이온 교환수지 및 상기 강염기성 음이온 교환수지를 4:1의 부피비로 혼합한 수지)에 순차적으로 통과시켜 정제하는 것이 바람직할 것으로 판단된다.
(4) 고형화 조건 확립
고순도 말토스 제품(제조사 : Junsei Chemical Co.,Ltd.)을 이온교환수로 희석하여 고형분 농도가 20 브릭스(Brix)인 고순도 말토스 용액을 제조하였다. 당류 산화효소인 카보하이드레이트옥시다제(Carbohydrate oxidase; 공급자 : Novozymes) 및 카탈라제(Catalase; 공급자 : Novozymes)를 각각 고순도 말토스 용액의 당류 고형분 중량 대비 4.3%(v/w) 및 0.2%(v/w)의 양으로 첨가하고 반응 온도 25℃, 에어레이션(aeration) 속도 1 vvm 및 교반 속도 200 rpm의 조건에서 24 hr 동안 효소 산화반응을 진행시켰다. 효소 산화반응이 진행되는 동안 1M 농도의 탄산수소나트륨(NaHCO3) 용액을 이용하여 반응 pH를 약 7로 일정하게 유지시켰다. 이후, 반응 산물 용액을 고형분 중량 대비 4 중량%에 해당하는 양의 활성탄으로 처리하여 탈색하고 0.2 ㎛ 크기의 다공성 규조토로 여과하여 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하였다. 이후, 말토비온산 함유 당류 용액을 부피비가 1:1:1인 매크로다공성(Macroporous) 타입 강염기성 음이온 교환수지:겔(Gel) 타입 강산성 양이온 교환수지: 혼상수지(상기 강산성 양이온 교환수지 및 상기 강염기성 음이온 교환수지를 4:1의 부피비로 혼합한 수지)에 순차적으로 통과시켜 정제된 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하였다. 정제된 말토비온산 함유 당류 용액은 당류 고형분 전체 중량을 기준으로 말토비온산(Maltobionic acid) 약 96 중량%, 말토스(Maltose) 약 3 중량% 및 당류 부산물 약 1 중량%로 이루어졌다.
이후, 정제된 말토비온산 함유 당류 용액의 고형화를 1) 에탄올에 의한 침전, 2) 분무건조(Spray drying) 및 3) 냉각에 의한 결정화와 같이 3가지 방법으로 진행하고 그 결과를 비교하였다.
1) 에탄올에 의한 침전
정제된 말토비온산 함유 당류 용액을 농축하여 고형분 농도가 약 80 브릭스(Brix)인 말토비온산 함유 당류 농축액을 제조하였다. 이후 순도가 약 98%인 에탄올에 말토비온산 함유 당류 농축액을 1:1의 부피비로 첨가하고 진탕 혼합하여 말토비온산의 침전을 유도하고 탈수하였으며 총 10회 이상 반복하였다. 상기 에탄올에 의한 말토비온산의 침전 유도는 에탄올의 사용량이 과다하고 에탄올의 제거도 쉽지 않으므로 경제성이 현저하게 떨어지는 것으로 나타났다.
2) 분무건조(Spray drying)
정제된 말토비온산 함유 당류 용액을 농축하여 고형분 농도가 약 35 브릭스(Brix)인 말토비온산 함유 당류 농축액을 제조하였다. 이후, 분무건조기의 주입구 온도(Inlet temperature)와 아토마이저(Atomizer) 회전 속도를 조절하면서 말토비온산 함유 당류 농축액의 분무건조를 실시하였다.
말토스(Maltose)의 녹는점은 102℃이고 이를 통해 말토비온산의 녹는점을 100℃ 이하로 예상하고, 처음 분무건조 실시 조건을 주입구 온도(Inlet temperature) 125℃, 출구 온도(Outlet temperature) 85~90℃ 및 아토마이저(Atomizer) 회전 속도 500~1000 rpm의 범위로 설정하였다. 그러나, 주입구 온도(Inlet temperature) 125℃의 조건에서 아토마이저(Atomizer)를 통해 분무된 말토비온산 함유 당류 농축액은 분말화가 되지 않고 액상 형태로 분무건조기 내부 챔부 벽에 존재하였다. 이후, 주입구 온도(Inlet temperature)를 말토스의 녹는점보다 훨씬 높은 200℃로 설정하고 출구 온도(Outlet temperature) 145℃ 및 아토마이저(Atomizer) 회전 속도 500 rpm의 조건에서 말토비온산 함유 당류 농축액의 분무건조를 실시하였다. 그 결과 말토비온산 함유 당류 농축액의 분말화가 이루어지지 않았다. 다시, 분무건조 실시 조건을 주입구 온도(Inlet temperature) 150℃, 출구 온도(Outlet temperature) 121℃ 및 아토마이저(Atomizer) 회전 속도 700 rpm 및 말토비온산 함유 당류 농축액 주입속도 700 ㎖/hour으로 설정하였다. 또한, 말토비온산 함유 당류 농축액은 고형분 농도가 15 브릭스(Brix)와 35 브릭스(Brix)인 2가지 종류를 사용하였다. 그 결과 말토비온산 함유 당류 농축액의 분말화가 원활하게 이루어졌다. 최종적으로 말토비온산 함유 당류 농축액의 분무건조 조건을 다음과 같이 결정하였다.
* 말토비온산 함유 당류 농축액의 고형분 농도 : 15~35 브릭스(Brix)
* 말토비온산 함유 당류 농축액 주입 속도 : 700 ㎖/hour
* 주입구 온도(Inlet temperature) : 150℃
* 출구 온도(Outlet temperature) : 121℃
* 아토마이저(Atomizer) 회전 속도 : 700 rpm
3) 냉각에 의한 결정화
정제된 말토비온산 함유 당류 용액을 농축하여 고형분 농도가 약 90 브릭스(Brix)인 말토비온산 함유 당류 농축액을 제조하였다. 이후, 말토비온산 함유 당류 농축액에 말토비온산 종정(種晶; seed crystal)을 말토비온산 함유 당류 농축액 중량 대비 20%까지 첨가하고 온도를 90℃에서 15℃까지 서서히 낮추어 결정화를 시도하였다. 그러나, 말토비온산은 흡습력이 강해 상온에서도 녹는 특성이 있고, 이로 인해 높은 농도에서도 냉각에 의한 결정화가 이루어지지 않았다.
이상에서와 같이 본 발명을 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

  1. (a) 고형분 농도가 15~25 브릭스(Brix)이고 당류 고형분 전체 중량을 기준으로 말토스 함량이 90 중량% 이상인 말토스 함유 당류 용액을 준비하는 단계; 및
    (b) 상기 말토스 함유 당류 용액에 당류 고형분 중량 대비 카보하이드레이트옥시다제(Carbohydrate oxidase) 4.0~5.0%(v/w) 및 카탈라제(Catalase) 0.1~0.8%(v/w)를 첨가하고 22~37℃의 온도 조건, 6~8의 pH 조건, 0.9~1.5 vvm의 에어레이션(aeration) 속도 조건 및 100~400 rpm의 교반 속도 조건으로 효소 산화반응을 15~30 hr 동안 진행시켜 반응 산물 함유 용액을 수득하는 단계를 포함하는 방법으로서,
    상기 pH 조건은 약염기성 물질 또는 약염기성 물질 용액에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 말토비온산 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 말토스 함유 당류 용액은 당류 고형분 전체 중량을 기준으로 말토스 함량이 95 중량% 이상이고, 상기 (b) 단계의 반응 산물 함유 용액은 당류 고형분 전체 중량을 기준으로 말토비온산 함량이 95 중량% 이상인 것을 특징으로 하는 말토비온산 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 약염기성 물질은 탄산수소나트륨인 것을 특징으로 하는 말토비온산 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, (c) 상기 반응 산물 함유 용액을 활성탄으로 처리하여 탈색하고 여과하여 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하는 단계를 더 포함하는, 말토비온산 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 여과는 다공성 규조토 여과재를 사용하는 것을 특징으로 하는, 말토비온산 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, (d) 상기 말토비온산 함유 당류 용액을 강염기성 음이온 교환수지, 강산성 양이온 교환수지 및 혼상 이온교환수지에 순차적으로 통과시켜 정제된 말토비온산 함유 당류 용액을 수득하는 단계를 더 포함하고,
    상기 혼상 이온교환수지는 강산성 양이온 교환수지 및 강염기성 음이온 교환수지를 혼합한 수지인 것을 특징으로 하는, 말토비온산 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 강염기성 음이온 교환수지는 매크로다공성(Macroporous) 타입이고, 상기 강산성 양이온 교환수지는 겔(Gel) 타입이고, 상기 강염기성 음이온 교환수지:강산성 양이온 교환수지:혼상 이온교환수지의 부피비는 1:(0.25~2):(0.25~1)이고, 상기 혼상 이온교환수지를 구성하는 강산성 양이온 교환수지:강염기성 음이온 교환수지의 혼합 부피비는 1:(0.1~0.5)인 것을 특징으로 하는 말토비온산 제조방법.
  8. 제6항에 있어서, (e) 상기 정제된 말토비온산 함유 당류 용액의 고형분 농도를 10~40 브릭스(Brix)로 조절한 후 아토마이저(Atomizer)를 통해 분무건조기 내부 챔버로 주입하여 분말화된 정제 말토비온산을 수득하는 단계를 더 포함하고,
    상기 말토비온산 함유 당류 용액을 분무건조기 내부 챔버로 주입하는 통로인 주입구 온도는 135~170℃이고 아토마이저(Atomizer) 회전 속도는 600~900 rpm인 것을 특징으로 하는 말토비온산 제조방법.
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