WO2022210133A1 - 顕微鏡 - Google Patents

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WO2022210133A1
WO2022210133A1 PCT/JP2022/013324 JP2022013324W WO2022210133A1 WO 2022210133 A1 WO2022210133 A1 WO 2022210133A1 JP 2022013324 W JP2022013324 W JP 2022013324W WO 2022210133 A1 WO2022210133 A1 WO 2022210133A1
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WO
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wavelength
optical filter
light
boundary
optical
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PCT/JP2022/013324
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翔大 土田
康徳 森下
優太 忍足
Original Assignee
株式会社ニコン
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N2021/6463—Optics
    • G01N2021/6471—Special filters, filter wheel

Definitions

  • the present invention relates to microscopes.
  • Patent Document 1 JP-A-2000-056228
  • the microscope may have an illumination optical system for irradiating the sample with excitation light. It may have a detector that detects fluorescence emitted from the specimen. It may have viewing optics that direct the fluorescence to the detector.
  • the observation optical system may have a first optical filter whose reflection and transmission wavelength characteristics are variable according to the position at which light is incident, and is arranged in the optical path of the light reflected by the first optical filter.
  • It may have a second optical filter whose transmission boundary wavelength changes with respect to a position along one direction and transmits light having a longer wavelength than the first boundary wavelength at the position where the reflected light is incident,
  • the optical filter is arranged in the optical path of the light reflected by the first optical filter, the transmission boundary wavelength changes with respect to the position along the first direction, and is shorter than the second boundary wavelength at the position where the reflected light is incident.
  • the first demarcation wavelength may be shorter than the second demarcation wavelength.
  • the first optical filter may have different wavelength characteristics depending on the position along the first direction.
  • the first optical filter may be arranged at an angle of less than 45 degrees in a plane that intersects the first direction with respect to incident light.
  • the second optical filter and the third optical filter may be movable along the first direction.
  • the first optical filter may be movable along the first direction.
  • the first direction may be the direction of gravity. Either one of the second optical filter and the third optical filter may be inclined with respect to the other in a plane intersecting the first direction.
  • the observation optical system may further include a concave mirror that collects the light reflected by the first optical filter between the second optical filter and the third optical filter.
  • the observation optical system may further include a concave mirror that converts the light reflected by the first optical filter into a parallel beam and makes it enter the second optical filter and the third optical filter.
  • the observation optical system may have a reflective element that reflects at least part of the light that has passed through the first optical filter, and that is arranged in the optical path of the light reflected by the reflective element.
  • a fourth optical filter may have a boundary wavelength that changes with respect to a position along a direction, and transmits light having a longer wavelength than the third boundary wavelength at the position where the reflected light is incident, and is reflected by the reflective element.
  • a fifth boundary wavelength that changes with respect to the position along the first direction and that transmits light having a longer wavelength than the fourth boundary wavelength at the position where the reflected light is incident; It may have an optical filter.
  • the third boundary wavelength may be shorter than the fourth boundary wavelength.
  • the reflective element may be a sixth optical filter or a total reflection mirror whose wavelength characteristics of reflection and transmission are variable depending on the position at which light is incident.
  • a first optical filter, a second optical filter and a third optical filter may be housed in the first unit, a sixth optical filter or reflective element, a fourth optical filter and a fifth optical filter.
  • a filter may be stored in the second unit.
  • the first unit and the second unit may be configured to be insertable and removable.
  • a first detector that receives a portion of the light reflected by the first optical filter that has passed through the second optical filter and the third optical filter;
  • There may be a second detector that receives a portion of the transmitted light.
  • the light receiving surface of the first detector and the light receiving surface of the second detector may face the same direction.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the structure of a microscope 101 for observing a sample 210;
  • FIG. An example of an observation system post-stage 140 and a detection unit 160 is schematically shown. It is a schematic diagram which shows the function of LVF254 as an example.
  • FIG. 3 is a schematic diagram illustrating a wavelength range detectable by a detector 161 through a wavelength selection unit 151; Detectable ranges of four wavelength selection units 151, 152, 153, 154 are shown schematically. It schematically shows changing the detectable range in the wavelength selection unit 151 .
  • a light source 110 is shown schematically.
  • 4 is an example of a flowchart showing an observation procedure of the microscope 101; 4 is a flow chart showing details of step S12 for creating and editing an imaging channel.
  • FIG. 10 shows an example of a setting screen 300 of FIG. 9.
  • FIG. 10 An example of the setting screen 310 in step S14 for setting LVF and the like for the imaging channel is shown.
  • FIG. 10 is a flow chart showing details of step S16 for setting a combination of an imaging channel and an actual channel;
  • FIG. 13 shows an example of a setting screen 320 of FIG. 12.
  • FIG. It is an example of the setting screen 330 of step S18 which sets laser intensity, and step S18 which sets the sensitivity of a detector.
  • 4 is a flow chart showing details of step S24, which is internal control for acquiring an image.
  • 1 is a flow diagram for acquiring fluorescence spectral distributions using microscope 101.
  • FIG. A setting screen 450 corresponding to FIG. 16 is shown.
  • FIG. 18 is a schematic diagram illustrating an acquisition wavelength range and a detection wavelength range under observation conditions set on a setting screen 450 shown in FIG. 17;
  • FIG. FIG. 4 illustrates a fluorescence spectral profile at a certain position of specimen 210 detected by microscope 101;
  • FIG. 20 is an example showing a display image 460 displaying images acquired in the embodiment of FIGS. 17-19;
  • FIG. 18 is a schematic diagram illustrating an acquisition wavelength range and a detection wavelength range under observation conditions set on the setting screen 450 shown in FIG. 17 for each imaging channel;
  • FIG. 4 is a timing chart for executing an example of acquiring a plurality of fluorescence spectral distributions using the microscope 101.
  • the observation system rear stage 142 of another example is shown typically.
  • the observation system rear stage 144 of another example is shown typically.
  • a modification of the observation system rear stage 140 is shown schematically.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of a microscope 101 for observing a specimen 210.
  • the microscope 101 is a confocal microscope and includes a light source 110 , an illumination optical system 220 , an observation optical system 240 , a detector 160 , an information processor 170 and a controller 180 .
  • the illumination optical system 220 and the observation optical system 240 share some optical elements. Note that the microscope 101 does not need to have all of these configurations. It doesn't have to be.
  • the light source 110 emits laser light with a wavelength used as excitation light when observing the specimen 210 with fluorescence.
  • the excitation light emitted from the light source 110 enters the illumination optical system 220 .
  • the illumination optical system 220 irradiates the sample 210 with excitation light.
  • the illumination optical system 220 has a dichroic mirror 121 , a galvanometer scanner 130 , a relay lens 122 , a lens 192 and an objective lens 191 .
  • the dichroic mirror 121 has the characteristic of reflecting the wavelength of the excitation light emitted from the light source 110 and transmitting light of other wavelengths.
  • the excitation light incident from the light source 110 is reflected by the dichroic mirror 121 to change its propagation direction, and enters the galvanometer scanner 130 .
  • the galvanometer scanner 130 has a pair of galvanometer mirrors 131 and 132 that reflect incident light.
  • the galvanomirror 131 is rotatable around the x-axis in FIG. 1, and the galvanomirror 132 is rotatable around the y-axis.
  • the excitation light incident on the galvanometer scanner 130 is reflected by the pair of galvanometer mirrors 131 and 132 and then enters the objective lens 191 via the relay lens 122 and the lens 192 .
  • the excitation light from the relay lens 122 is collimated by the lens 192 and then focused on the sample 210 by the objective lens 191 .
  • the galvanometer scanner 130 scans the sample 210 with excitation light two-dimensionally (x and y directions in FIG. 1).
  • the specimen 210 contains, for example, a fluorescent substance, and in that case, fluorescence is emitted from the condensed position on the specimen 210 .
  • the emitted light emitted from the specimen 210 also includes components other than fluorescence, such as reflected light of excitation light.
  • the radiation light emitted from the specimen 210 passes through the objective lens 191 and the lens 192 and enters the relay lens 122 .
  • the focal position of the lens 192 and the focal position of the excitation light on the specimen 210 are optically conjugate.
  • the emitted light that has entered the relay lens 122 passes through the galvanometer scanner 130 and enters the dichroic mirror 121 .
  • a component of the emitted light that has the same wavelength as the excitation light is reflected by the dichroic mirror 121 and guided to the light source 110 side.
  • a component of the emitted light having a wavelength different from that of the excitation light is transmitted through the dichroic mirror 121 .
  • the dichroic mirror 121 cannot completely remove the wavelength component of the excitation light. Therefore, the emitted light that has passed through the dichroic mirror 121 still contains the component of the excitation light wavelength.
  • the observation optical system 240 shares the dichroic mirror 121 , the galvanometer scanner 130 , the relay lens 122 , the lens 192 and the objective lens 191 with the illumination optical system 220 .
  • the observation optical system 240 further has a reflecting mirror 123 , a condenser lens 124 , a pinhole 125 , a collimating lens 126 , an observation system rear stage 140 and a detection section 160 .
  • the pinhole 125 is arranged at a focal position of the objective lens 191 and a conjugate position. Therefore, the pinhole 125 allows only the light emitted from the condensing position, which is the focal point of the objective lens 191, to pass therethrough, and blocks the light from other points as noise.
  • the observation optical system 240 guides fluorescence emitted from the sample 210 to the detection section 160 .
  • the detector 160 detects fluorescence emitted from the specimen 210 .
  • the detection unit 160 outputs an electrical signal corresponding to the intensity of the detected fluorescence to the information processing device 170 . Details of the observation system rear stage 140 of the observation optical system 240 and the detection unit 160 will be described later.
  • the information processing device 170 has a control unit 171 , a display unit 172 , and input units 173 and 174 .
  • the control unit 171 has an interface for the detection unit 160, executes image processing to generate an image from the signal acquired from the detection unit 160, and stores and saves the generated image.
  • the display unit 172 is formed by an LCD panel, a CRT device, or the like, and in addition to displaying the generated image to the user, it also displays a user interface when various settings are input to the microscope 101 .
  • the input units 173 and 174 include a character input device such as a keyboard and a pointing device such as a mouse, and are used when the user inputs settings and operation instructions to the microscope 101 .
  • the information processing device 170 communicates with the control device 180 and is also used as a user interface for the control device 180 .
  • the control device 180 holds set values relating to the operations of the galvanometer scanner 130, the post-observation system 140, the detection unit 160, and the like, and controls these operations. Further, the control device 180 may perform all or part of image processing and the like in the information processing device 170 in order to reduce the load on the information processing device 170 . That is, the control device 180 may perform all or part of the operations performed by the control unit 171 of the information processing device 170 . Also, the control unit 171 of the information processing device 170 may perform all or part of the operations performed by the control device 180 .
  • FIG. 2 schematically shows an example of the observation system rear stage 140 and the detection section 160.
  • the observation system rear stage 140 has four wavelength selection units 151 , 152 , 153 and 154 .
  • the detector 160 has four detectors 161, 162, 163, 164 corresponding to the four wavelength selection units 151, 152, 153, 154, respectively.
  • the wavelength selection unit 151 has an LVF (Linear Variable Filter) 250, a concave mirror 252, a pair of LVFs 254 and 256, and a condenser lens 258.
  • LVF Linear Variable Filter
  • the LVFs 250, 254, and 256 have dielectric layers on a transparent substrate whose film thickness changes along a predetermined direction (the z-direction in the figure). and the wavelength characteristics of the reflection change.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the functions of the LVF 254 as an example.
  • the LVF 254 has a dielectric layer on a transparent substrate whose film thickness changes along a predetermined direction (the z-direction in the figure), and the wavelength characteristics of reflection and transmission change according to the position at which light is incident. do. More specifically, the boundary wavelength, which is the boundary between the transmitted wavelength and the reflected wavelength, changes depending on the position in the z direction where the light is incident. Therefore, the driving unit 402 moves the LVF 254 in the z-direction to change the wavelength characteristics of the incident light from the fixed optical path.
  • the LVF 254 and the drive unit 402 form an optical filter 400 whose transmission and reflection wavelength characteristics are dynamically variable.
  • the graph shown on the right side of FIG. 3 shows the wavelength characteristics of the LVF254.
  • the vertical axis indicates wavelength and the horizontal axis indicates transmittance.
  • the LVF 254 having the wavelength characteristics shown in FIG. 2 is a long-pass filter that transmits light with wavelengths longer than the boundary wavelength and reflects light with wavelengths shorter than the boundary wavelength.
  • the LVF 250 on which the light from the collimator lens 126 is incident functions as a reflecting element having different reflection and transmission characteristics depending on the wavelength of the incident light, that is, as a dichroic mirror.
  • the LVF 250 is a long-pass filter that reflects light with wavelengths shorter than the boundary wavelength and transmits light with wavelengths longer than the boundary wavelength.
  • the incident light path is split into two by the LVF 250 according to the wavelength.
  • the LVF 250 can be moved in the z-direction by a driving unit, similar to the optical filter 400 shown in FIG. Thereby, the boundary wavelength for incident light can be dynamically changed.
  • the LVF 250 is arranged with an inclination of less than 45 degrees, preferably 22.5 degrees or less in the xy plane with respect to the light incident from the collimator lens 126 . That is, the light receiving surface rotates around the z-axis so that the angle of incidence of light on the LVF 250 (that is, the angle between the normal to the incident surface of the LVF 250 and the principal ray direction) is less than 45 degrees, preferably 22.5 degrees or less. is rotating to By reducing the incident angle in this way, the ellipticity of the spot shape incident on the LVF 250 is maintained at a value close to 1, and the area of the spot shape is reduced.
  • the shape of the spot incident on the incident surface of the LVF 250 is an elliptical shape extending in the direction in which the incident surface is tilted.
  • the short axis of this elliptical shape remains the diameter D of the light beam, while the long axis becomes D/cos ⁇ (where ⁇ is the incident angle). Therefore, the area of the spot shape is smaller and the ellipticity is closer to 1 when ⁇ is 22.5 degrees than when ⁇ is 45 degrees. Therefore, it is possible to suppress the deterioration of the spectral resolution of the incident spot on the LVF 250 .
  • the incident surface of the LVF 250 is at a position rotated around the z-axis.
  • the direction in which the boundary wavelength changes in the LVF 250 is the z direction.
  • the long axis of the ellipse spreads in a direction orthogonal to the z-axis, that is, in a direction in which the boundary wavelength does not change. Therefore, it is possible to further suppress the deterioration of the spectral resolution of the incident spot on the LVF 250 .
  • the direction in which the LVF 250 is driven is also the z direction. Therefore, when the z direction is the vertical direction, that is, the direction of gravity, the backlash of the mechanical system that drives the LVF 250 is pushed downward by its own weight.
  • the concave mirror 252 is arranged between the LVF 250 and the pair of LVFs 254 and 256 in the optical path of the wavelength selection unit 151 . That is, the short-wavelength light reflected by the LVF 250 enters the concave mirror 252 . Concave mirror 252 focuses the reflected light between a pair of LVFs 254 , 256 . As a result, the spot diameters of the light beams incident on both of the pair of LVFs 254 and 256 can be reduced, and the degradation of spectral resolution at each of the LVFs 254 and 256 can be suppressed.
  • the focal length of the collimator lens 126 is made smaller than the focal length of the concave mirror 252
  • the diameter of the spot incident on each of the pair of LVFs 254 and 256 can be reduced, thereby further suppressing the deterioration of the spectral resolution. can be done.
  • the LVF 254 is a long-pass filter arranged so that the boundary wavelength changes with respect to the position along the z-direction.
  • the LVF 256 is a short-pass filter arranged such that the boundary wavelength varies with position along the z-direction.
  • the boundary wavelength of LVF 254 is shorter than the boundary wavelength of LVF 256 . Since the pair of LVFs 254 and 256 are arranged facing each other, they function as a bandpass filter that transmits a specific wavelength range.
  • the LVFs 254 and 256 can each be moved in the z direction by a driving unit, and can dynamically change the boundary wavelength for incident light whose incident position is fixed. It is preferable that the pair of LVFs 254 and 256 be arranged so that the tendency of the boundary wavelengths of the positions along the z-direction is similar to each other. That is, the LVFs 254 and 256 are preferably arranged such that both boundary wavelengths are shifted to the short wavelength side (or both boundary wavelengths are shifted to the long wavelength side) as the position advanced in the +z direction.
  • the light transmitted through the pair of LVFs 254 and 256 is condensed by a condensing lens 258 and enters the detector 161 .
  • the detector 161 is, for example, a highly sensitive photoelectric conversion element such as a photomultiplier tube, and outputs an electrical signal corresponding to the detected fluorescence to the information processing device 170 via the control device 180 .
  • FIG. 4 is a schematic diagram for explaining the wavelength range detectable by the detector 161 through the wavelength selection unit 151.
  • the wavelength selection unit 151 the reflectance is shown on the vertical axis because the reflectance of the LVF 250 should be noted rather than the transmittance.
  • the LVF 250 reflects the short wavelength side
  • the LVF 254 cuts (light shields) the short wavelength side
  • the LVF 256 cuts (light shields) the long wavelength side.
  • the boundary wavelength of LVF 254 is shorter than the boundary wavelengths of LVF 250 and LVF 256 .
  • a predetermined wavelength range can be transmitted and set as a detectable range of the detector 161 .
  • the LVF 250 function as a dichroic mirror, the light transmitted through the LVF 250 can be transferred to the subsequent stage such as the wavelength selection unit 152 to detect other wavelength bands.
  • Wavelength selection units 152 and 153 are arranged after the wavelength selection unit 151 .
  • the wavelength selection unit 152 has an LVF 260 , a concave mirror 262 , a pair of LVFs 264 and 266 and a condenser lens 268 .
  • the wavelength selection unit 153 has an LVF 270 , a concave mirror 272 , a pair of LVFs 274 and 276 and a condenser lens 278 .
  • the wavelength selection units 152 and 153 have the same configuration as the wavelength selection unit 151 except for the points described later, so the description thereof is omitted.
  • a wavelength selection unit 154 is further arranged after the wavelength selection unit 153 .
  • the wavelength selection unit 154 has a concave mirror 282 , a pair of LVFs 284 and 286 and a condenser lens 288 .
  • the wavelength selection unit 154 also has the same configuration as the wavelength selection unit 151 except that it does not have the LVF 250 and that it will be described later.
  • the concave mirror 282 can be said to be a total reflection mirror from the viewpoint that it does not transmit a specific wavelength.
  • the detector 160 is provided with detectors 162, 163, and 164 that receive light from the wavelength selection units 152, 153, and 154, respectively. Since these detectors 162, 163, and 164 have the same configuration as the detector 161, description thereof will be omitted. In addition, in the form of FIG. 2, light is incident on the detectors 161, 162, 163, and 164 from the y-direction. In other words, the detection planes of detectors 161, 162, 163, and 164 are all parallel to the zx plane and oriented in the same direction.
  • FIG. 5 schematically shows the detectable ranges of the four wavelength selection units 151, 152, 153, and 154. To simplify the drawing, illustration of the transmittance and reflectance of the LVFs 250, 260, and 270 functioning as dichroic mirrors is omitted.
  • the detectable ranges of the four wavelength selection units 151, 152, 153, and 154 are set in order from the short wavelength side. That is, a detectable range 1 is set by the pair of LVFs 254 and 256 of the wavelength selection unit 151, and a detectable range 2 is set by the pair of LVFs 264 and 266 of the wavelength selection unit 152 on the longer wavelength side. Similarly, the detectable range 3 is set on the longer wavelength side than the detection range 2 by the pair of LVFs 274 and 276 of the wavelength selection unit 153, and the pair of LVFs 284 and 286 of the wavelength selection unit 154 on the longer wavelength side. A detectable range 4 is set.
  • the observation system rear stage 140 and the detection unit 160 can detect fluorescence from the sample 210 in four different wavelength ranges. It can also be said to have four different channels of detection. In the following description, these channels may be called real channels from the viewpoint that each of these channels has a substantial optical system.
  • FIG. 6 schematically shows changing the detectable range in the wavelength selection unit 151.
  • FIG. 6 To simplify the drawing, illustration of the transmittance and reflectance of the LVF 250 functioning as a dichroic mirror is omitted.
  • All the LVFs 250, 254, 256 included in the wavelength selection unit 151 are movable along the z-direction where the boundary characteristics change. Therefore, for example, by arranging the LVFs 250, 254, 256 at corresponding z-positions, the detectable range A in FIG. By doing so, the detectable range B in FIG. 6 can be set. That is, the optical system of one wavelength selection unit 151 can detect a plurality of different wavelength ranges in a time division manner.
  • each detection time when different wavelength ranges are detected in a time division manner may be called a pass.
  • FIG. 7 schematically shows the light source 110.
  • the light source 110 has four laser light sources 111, 112, 113, and 114 that emit light with different wavelengths.
  • the wavelength of the laser light emitted from the laser light source 111 is 405 nm
  • the wavelength of the laser light emitted from the laser light source 112 is 488 nm
  • the wavelength of the laser light emitted from the laser light source 113 is 561 nm.
  • the wavelength of the laser light emitted from the light source 114 is 640 nm.
  • a mirror 115 reflects the laser light emitted from the laser light source 114 .
  • the dichroic mirror 116 transmits the laser light reflected by the mirror 115 and reflects the laser light emitted from the laser light source 113 .
  • the dichroic mirror 117 transmits the laser light transmitted and reflected by the dichroic mirror 116 and reflects the laser light emitted from the laser light source 112 .
  • the dichroic mirror 118 reflects the laser light transmitted and reflected by the dichroic mirror 117 and transmits the laser light emitted from the laser light source 111 .
  • the dichroic mirror 121 may be switched according to the user's desired number of excitation lights incident on the sample surface at the same time and the setting change of the fluorescence acquisition wavelength range, and several types are prepared and arranged on the wheel.
  • FIG. 8 is an example of a flowchart showing the observation procedure of the microscope 101.
  • the user designates the microscope 101 for a region where fluorescence observation is to be performed on the specimen 210 (step S10).
  • the desired acquisition wavelength range is specified by the user, and created and edited as an imaging channel (S12). Imaging channels will be described later.
  • a pair of corresponding LVFs is set based on the imaging channel (S14), and a combination of the imaging channel and the actual channel is set (S16).
  • the laser intensity is then set (S18) and the detector sensitivity is set (S20) for each imaging channel.
  • FIG. 9 is a flowchart showing details of step S12 for creating and editing an imaging channel
  • FIG. 10 shows an example of a setting screen 300 in that case.
  • the setting screen 300 is displayed on the display unit 172 to accept input from the user.
  • An input field 301 is a field for selecting a fluorescent dye
  • input fields 302 and 303 are fields for inputting wavelengths on the short wavelength side and the long wavelength side of the acquisition wavelength range, respectively.
  • the emission spectrum information is selected from luminescent dyes (S100: Yes), and a list of selectable fluorescent dyes is displayed in the input field 301.
  • Selectable fluorescent dyes are stored in advance in the memory of the control unit 171 together with corresponding acquisition wavelength ranges.
  • a luminescent dye receives selection by the user from the list (S102).
  • the tab in the input field 301 is not selected, it is assumed that the emission spectrum information is not selected from the luminescent dye (S100: No), and the user inputs numerical values in the input fields 302 and 303 to obtain the acquired wavelength.
  • the setting of the range that is, the wavelengths on the long wavelength side and the short wavelength side of light emission is accepted (S104).
  • the setting of the imaging channel name is accepted in the input field 304 (S106).
  • Imaging channels are created and edited as described above. At this point, the imaging channel is not associated with the actual optical system of the microscope 101, more specifically, with the actual channel, and can be said to be a temporary channel. In the example of FIG. 10, no fluorescent dye is specified, and the acquisition wavelength range "400 nm to 450 nm" is set as the imaging channel specified by the name "IM_Ch1".
  • FIG. 11 shows an example of the setting screen 310 of step S14 for setting a pair of LVFs for the imaging channel.
  • corresponding emission spectra 341, 345, excitation lights 340, 343, and detectable ranges 342, 346 are shown schematically with respect to wavelength on the horizontal axis. is represented.
  • a detection prohibition range 347 is displayed around the excitation light 343 corresponding to the fact that the excitation light 343 is within the detectable range 346 .
  • the profiles of the emission spectra 341 and 345 and the wavelengths of the excitation lights 340 and 343 are stored in advance in the memory of the controller 171 together with the corresponding fluorescent dyes.
  • the wavelength of the acquisition wavelength range is set as a numerical value in the imaging channel
  • the emission spectrum is displayed on the setting screen 310 with a rectangle having the maximum value for the range and the minimum value (typically zero) for other ranges. may be expressed.
  • the detectable ranges 342, 346 are displayed by default corresponding to the emission spectra 341, 345.
  • the detectable ranges 342 and 346 are initially set to have the half widths of the emission spectra 341 and 345 .
  • the dashed lines on the left and right of the detectable ranges 342 and 346 can be moved from the default display position by the user by dragging and dropping with a mouse pointer.
  • the left dashed line corresponds to the LVF boundary wavelength of the long-pass filter
  • the right dashed line corresponds to the LVF boundary wavelength of the short-pass filter. Therefore, by pressing the OK button 305 after the setting by the user, for the imaging channel "IM_Ch1", the wavelength at the left dashed line position of the detectable range 342 at that time is set to the LVF boundary wavelength of the long-pass filter. , the wavelength at the position of the dashed line on the right is set as the boundary wavelength of the LVF of the short-pass filter.
  • the boundary wavelength of the LVF that functions as a dichroic mirror is automatically set under a predetermined condition with respect to the boundary wavelength of the LVF of the short-pass filter that determines the long wavelength side of the detectable range.
  • the boundary wavelength of the LVF that functions as a dichroic mirror is set to a wavelength that is 10 nm longer than the boundary wavelength of the LVF of the short-pass filter (broken line on the right side of detectable range 342 in the drawing).
  • FIG. 12 is a flowchart showing the details of step S16 for setting the combination of the imaging channel and the real channel
  • FIG. 13 shows an example of the setting screen 320 in that case.
  • FIG. 13 shows an example in which four imaging channels are created, and four imaging channel names such as "IM_Ch1" are displayed in the display column 352 correspondingly.
  • the display column 350 displays lasers that can be used with the microscope 101 .
  • four laser light sources 111, 112, 113, 114 can be used in the example of FIG. 7, the display column 350 of FIG. , "640 nm" are represented schematically.
  • detectors that can be used with the microscope 101 are displayed.
  • four detectors are schematically represented in the display column 356 of FIG.
  • the type of detector for example, if it is a photomultiplier tube, "PMT" indicating that fact may be displayed.
  • the laser light source and the imaging channel can be linked as long as the laser light source has a shorter wavelength than the minimum wavelength value of the acquisition wavelength range when the imaging channel is set, and they are linked one-to-one.
  • they may be linked one-to-N or N-to-1 (N is an integer of 2 or more).
  • N is an integer of 2 or more.
  • the laser light source and the imaging channel are associated one-to-one.
  • the imaging channel may be selected first, and the laser light source associated therewith may be selected later.
  • the method of associating the imaging channels with the detectors may be the same as the method of associating the laser light sources with the imaging channels.
  • the imaging channels and detectors may be linked one-to-one, or may be linked one-to-N or N-to-1.
  • the imaging channels and detectors are linked in a two-to-one relationship.
  • the imaging channels and detectors are linked other than one-to-one, it takes time to drive the LVF, switch the filter cube by the filter wheel, and arrange the optical elements. Fluorescence from specimen 210 may not be detected simultaneously in time.
  • the dichroic mirror in a situation where a dichroic mirror (LVF or a dichroic mirror with a built-in filter cube) is placed in the upstream optical path (optical path until reaching the detector) of the detector to be linked, the dichroic mirror has a long pass characteristic. In some cases, the range detectable by the detector to which it is tied is longer than the boundary wavelength of the dichroic mirror.
  • the combination of the imaging channel and the real channel of the microscope 101 is set.
  • FIG. 14 is an example of the setting screen 330 of step S18 for setting the laser intensity and step S20 for setting the sensitivity of the detector.
  • Display columns 331, 332, and 333 display the imaging channels and detection wavelength ranges that have been set so far.
  • the setting screen 330 further has a slider 334 for setting the detector sensitivity (for example, applied voltage) corresponding to the imaging channel and a slider 335 for setting the intensity of the excitation light.
  • a slider 334 for setting the detector sensitivity (for example, applied voltage) corresponding to the imaging channel
  • a slider 335 for setting the intensity of the excitation light.
  • FIG. 15 is a flowchart showing details of step S24, which is internal control for acquiring an image.
  • an optical system such as the z-direction positions of the LVFs 250, 260, 264, 266, etc. is set based on the combination with the actual channel corresponding to the imaging channel corresponding to the first pass.
  • the control device 180 starts outputting excitation light from the designated laser light source 111 or the like of the light sources 110 (S140), and drives the galvanometer mirrors 131 and 132 so that the designated observation region is irradiated with the excitation light. (S142, S144).
  • the laser light source 111 or the like is specified based on the fluorescence imaging channel to be detected.
  • the detection unit 160 detects fluorescence included in the detectable range corresponding to the imaging channel (S144).
  • control device 180 saves the detected intensity, and It is determined whether the detection of the specified number of pixels on one scanning line has been completed (S148).
  • the control device 180 increments the number of detected pixels in the X coordinate (S150), and returns the control to step S144.
  • the microscope 101 again drives the galvanomirror 131 to move the condensing position of the excitation light to the position of another pixel on the same line (S144), and detects the light intensity of fluorescence again (S146). ).
  • control device 180 scans the number of scanning lines in the initially specified observation area. It is determined whether the detection of has been completed. (S152). If the number of detected scanning lines has not reached the specified number of scanning lines (S152: NO), the control device 180 increments the number of detections in the Y coordinate (S154), and returns the control to step S142. Therefore, the controller 180 drives the controller 133 of the galvanomirror 130 to move the excitation light condensing position to another scanning line and detect the fluorescence light intensity again.
  • the control device 180 detects the fluorescence light intensity in the observation area based on the value of the detected fluorescence light intensity.
  • An observation image is constructed (S156). The constructed observation image may be displayed in the display field 336 of the setting screen 330 of the display unit 172 or may be stored in a storage unit (not shown) provided in the information processing device 170 .
  • the control device 180 determines whether the detection of the specified number of paths has been completed. (S158). If the detected number of passes does not reach the specified number of passes (S158: NO), the controller 180 increments the number of passes (S160), and performs the imaging channel corresponding to the next pass. Based on the combination with the channel, the optical system is set by driving the LVF 250 (S162), and the control returns to step S140. Therefore, the control device 180 outputs excitation light from the laser light source 111 or the like designated by the imaging channel, and detects the fluorescence light intensity again.
  • the control device 180 stops outputting the laser light source (S174). This completes the observation operation in the microscope 101 .
  • multiband detection that is, simultaneous multicolor detection is possible using four stages of wavelength selection units, that is, four actual channels.
  • a pair of LVFs 254 and 256 are used as band-pass filters, so by changing the z-direction positions of the LVFs 254 and 256, the wavelength band to be transmitted can be easily changed.
  • multipath detection that is, multicolor detection in time division is possible with one real channel.
  • the fluorescence spectrum distribution of the sample 210 is obtained by narrowing the width of the detection wavelength range that is detected at one time (once) and similarly continuously acquiring fluorescence images. can be obtained.
  • FIG. 16 is a flow chart for acquiring the fluorescence spectrum distribution using the microscope 101
  • FIG. 17 shows a setting screen 450 corresponding to FIG.
  • the same reference numerals are given to the same configurations and operations as those in FIGS. 1 to 15, and description thereof will be omitted.
  • This observation pattern is a case where the wavelength selection unit 151 is used to drive a pair of LVFs 254 and 256 to acquire fluorescence multiple times.
  • the wavelength range detected at one time (at one time) is 20 nm, and by repeating this 14 times, a fluorescence spectrum profile from 430 nm to 710 nm is obtained.
  • the setting screen 450 of FIG. 17 is displayed on the display unit 172 when creating/editing an imaging channel in step S12 of FIG.
  • An input field 411 can set the value of the wavelength of light (excitation light) emitted by the light source 110, and in the illustrated example, 405 nm is specified.
  • the input units 173 and 174 of the information processing device 170 can be used.
  • Input fields 412 and 414 are areas for input when setting numerical values for the acquisition wavelength range of the fluorescence spectrum emitted from the specimen 210 .
  • the input units 173 and 174 of the information processing device 170 can be used for input to the input fields 412 and 414 .
  • the input field 412 is an area for inputting the short wavelength end of the acquisition wavelength range
  • the input field 414 is an area for inputting the long wavelength end.
  • an acquisition wavelength range of 430 nm to 710 nm is set.
  • the input field 451 sets the detection wavelength range for detecting the fluorescence spectrum at once (once) in the acquisition wavelength range set in the input fields 412 and 414 above.
  • the detection wavelength range here corresponds to the wavelength resolution of the fluorescence spectrum profile. In the illustrated example, it is set to detect fluorescence intensity at intervals of 20 nm. Therefore, in this example, detection of 14 bands is designated for the wavelength band from 430 nm to 710 nm.
  • the number of bands to be detected in the acquisition wavelength range set in the input fields 412 and 414 may be input. In this case, the wavelength resolution is automatically set based on the input number of bands.
  • the input field 413 graphically displays the acquisition wavelength range and wavelength resolution set in the input fields 451, 412, and 414, and directly operates the bar displayed in the input field 413 to obtain the wavelength range to be acquired. can also be entered.
  • the numerical values in the input fields 412 and 414 and the bar displayed in the input field 413 are interlocked.
  • FIG. 18 is a schematic diagram explaining the acquisition wavelength range and the detection wavelength range under the observation conditions set on the setting screen 450 shown in FIG.
  • the specimen 210 is irradiated with excitation light with a wavelength of 405 nm specified in the input field 411 .
  • the fluorescence image is acquired 14 times at intervals of 20 nm with the wavelength resolution (detection wavelength range) specified in the input field 451.
  • the short wavelength side is cut (light shielded) by the LVF 254 and the long wavelength side is cut (light shielded) by the LVF 256 .
  • the control device 180 causes the LVF 254 to cut (light shield) the lower wavelength band from the lower limit of each detection wavelength range, and the LVF 256 to cut (light shield) the higher band than the upper limit of the same range.
  • the drive units 402 of the LVFs 254 and 256 are operated respectively to shift the detection wavelength range to a band adjacent to the detection wavelength range in which the fluorescence intensity has already been detected (Fig. 16 of S222, S162).
  • FIG. 19 is a diagram illustrating the fluorescence spectrum profile at a certain position of the specimen 210 detected by the microscope 101.
  • the microscope 101 detects fluorescence intensity for each detection wavelength range for a plurality of detection wavelength ranges. Therefore, by plotting the fluorescence intensity of the detected image on a graph with wavelength ⁇ on the horizontal axis and intensity on the vertical axis, a spectral profile at each detection position of the sample 210 can be generated as shown in FIG. Note that the spectral profile is displayed in area 420, for example. A two-dimensional image obtained by summing the fluorescence intensities (luminescence intensities) detected for each detection wavelength range may be further displayed in the area 419 of the setting screen 450 .
  • FIG. 20 is an example showing a display image 460 displaying the images acquired in the embodiments of FIGS. 17-19.
  • Observed image 448 is an observed image constructed in a predetermined detection wavelength range.
  • Display image 460 includes multiple image display fields 443 that tile multiple observation images 448 constructed at different detection wavelength ranges. Thereby, the user can observe the observation image 448 of each detection wavelength range at once.
  • wavelength selection units 151 and 152 are used to drive a pair of LVFs 254 and 256 and a pair of LVFs 264 and 266, respectively, to acquire fluorescence a plurality of times.
  • the wavelength selection unit 151 sets the wavelength range to be detected at one time (at one time) to 20 nm, and acquires a fluorescence spectrum profile from 430 nm to 610 nm by repeating fluorescence acquisition nine times. Fluorescence spectrum profile from 650 nm to 710 nm is obtained by repeating the fluorescence acquisition 6 times with a detection wavelength range of 10 nm.
  • the setting screen 450 of FIG. 17 is displayed on the display unit 172 for each imaging channel.
  • the input field 411 of the imaging channel "IM_Ch1” is set to 405 nm, and the input fields 412, 414 are set to the acquisition wavelength range from 430 nm to 610 nm.
  • the input field 451 is set to detect fluorescence intensity at intervals of 20 nm. Therefore, in the imaging channel "IM_Ch1", detection of 9 bands is designated for the wavelength band from 430 nm to 610 nm.
  • 640 nm is specified in the input field 411 of the imaging channel "IM_Ch2", and the acquisition wavelength range from 650 nm to 710 nm is set in the input fields 412 and 414.
  • FIG. The input field 451 is set to detect fluorescence intensity at intervals of 10 nm. Therefore, in the imaging channel "IM_Ch2", detection of 6 bands is designated for the wavelength band from 650 nm to 710 nm.
  • Imaging channel “IM_Ch1” is associated with laser light source “405 nm” and detector “D_161”
  • imaging channel “IM_Ch2” is associated with laser light source “640 nm” and detector “D_162”.
  • FIG. 21 is a schematic diagram for explaining the acquisition wavelength range and the detection wavelength range under the observation conditions set on the setting screen 450 shown in FIG. 17 for each imaging channel.
  • the specimen 210 is irradiated with excitation light with a wavelength of 405 nm specified in the input field 411 of the imaging channel “IM_Ch1”.
  • the fluorescence image is acquired nine times at intervals of 20 nm with the wavelength resolution (detection wavelength range) specified in the input field 451.
  • the specimen 210 is irradiated with the excitation light with a wavelength of 640 nm specified in the input field 411 of the imaging channel "IM_Ch2".
  • the fluorescence image is acquired six times at intervals of 10 nm with the wavelength resolution (detection wavelength range) specified in the input field 451.
  • FIG. 22 is a timing chart for executing an example of acquiring a plurality of fluorescence spectral distributions using the microscope 101.
  • the laser light source 111 irradiates the specimen 210 with excitation light having a wavelength of 405 nm during the period T1, and the detector "D_161" detects fluorescence emitted from the specimen 210 during the period T2.
  • the pair of LVFs 254 and 256 drive the driving units 402 to shift the detection wavelength range to a band adjacent to the detection wavelength range in which fluorescence intensity has already been detected.
  • the laser light source 114 irradiates the specimen 210 with excitation light having a wavelength of 640 nm during the period T4, and the detector "D_162" detects fluorescence generated from the specimen 210 during the period T5.
  • the pair of LVFs 264 and 266 drive the drive units 402 in period T6 to shift the detection wavelength range to a band adjacent to the detection wavelength range in which the fluorescence intensity has already been detected.
  • the start times of the periods T4 and T5 are the end times of the periods T1 and T2, and the start times of the periods T1 and T2 are the end times of the periods T4 and T5.
  • the period T3 starts at the end of the periods T1 and T2, and the period T6 starts at the end of the periods T4 and T5. Furthermore, the start time of the period T3 is the start time of the periods T4 and T5, and the start time of the period T6 is the start time of the periods T1 and T2.
  • the wavelength selection unit 151 is used to irradiate the sample 210 with excitation light having a wavelength of 405 nm, and fluorescence is detected by the detector "D_161.”
  • the drive units 402 of the LVFs 264 and 266 of the wavelength selection unit 152 are driven, and the wavelength selection unit 152 is used to irradiate the sample 210 with excitation light having a wavelength of 640 nm, and fluorescence is detected by the detector “D_162”.
  • the drive units 402 of the LVFs 254 and 256 of the wavelength selection unit 151 are driven. Thereby, fluorescence detection can be performed efficiently.
  • FIG. 23 schematically shows an observation system rear stage 142 of another example.
  • Wavelength selection units 155, 156, 157, and 158 in the rear stage 142 of the observation system have condenser lenses 259, 269, 279, and 289 in addition to the configuration of the wavelength selection units 151, 152, 153, and 154 in the rear stage 140 of the observation system. .
  • the wavelength selection unit 155 will be described as a representative, and description of the other wavelength selection units 152, 153, and 154 will be omitted because they have the same configuration.
  • the condensing lens 259 condenses the incident light.
  • the focal position of the condensing lens 259 is arranged to match the focal position of the concave mirror 252 .
  • the concave mirror 252 reflects the incident light into a parallel light beam. Therefore, since a parallel beam of light is incident on each of the pair of LVFs 254 and 256, the film thicknesses of the LVFs 254 and 256 are substantially the same for all of the beams in the pair of beams, and a decrease in spectral resolution can be suppressed. .
  • the focal length of the condenser lens 259 is made smaller than the focal length of the concave mirror 252
  • the diameter of the spot incident on each of the pair of LVFs 254 and 256 can be reduced, thereby further suppressing the decrease in spectral resolution. be able to.
  • FIG. 24 schematically shows another observation system rear stage 144 .
  • the observation system rear stage 144 has a wavelength selection unit 145 before the wavelength selection unit 151 .
  • the wavelength selection unit 145 has a dichroic mirror 230 , bandpass filters 232 and 234 and a condenser lens 236 .
  • the dichroic mirror 230 and the bandpass filters 232 and 234 are attached to, for example, a filter cube, and reflect a predetermined wavelength band as one unit and transmit another predetermined wavelength range.
  • the filter cube may be mounted on a filter wheel together with other filter cubes with different reflection and transmission wavelength bands, any of which may be insertable into the optical path.
  • the light reflected by the dichroic mirror 230 and transmitted by the bandpass filter 234 is collected by the condenser lens 236 and detected by the detector 161 .
  • the light transmitted through the dichroic mirror 230 and the bandpass filter 232 is incident on the subsequent wavelength selection unit 151 and the like, and is detected as necessary.
  • the principal ray is shifted in the y direction by an amount corresponding to the plate thickness of the dichroic mirror 230.
  • the LVF 250 and the like functioning as dichroic mirrors in the subsequent wavelength selection unit 151 and the like are arranged in a direction in which the wavelength characteristics, that is, the boundary wavelength does not change in the y direction. Therefore, the reflection/transmission characteristics of the wavelength selection unit 151 and the like are hardly affected by the shift in the y direction.
  • the observation system rear stage 144 further has a wavelength selection unit 146 downstream of the wavelength selection unit 152 .
  • the wavelength selection unit 146 has a dichroic mirror 290 , bandpass filters 292 and 294 and a condenser lens 296 .
  • the wavelength selection unit 146 has the same configuration as the wavelength selection unit 145 except that the selected wavelength may be different, so the description is omitted.
  • FIG. 25 schematically shows a modified example of the observation system rear stage 140.
  • the LVF 256 is arranged with a slight inclination, for example, about 1 degree, in the xy plane with respect to the principal ray.
  • the light reflected without passing through the LVF 256 is incident on different z-positions of the LVF 256 while being multiple-reflected between the pair of LVFs 254 and 256, causing light in an undesired band to reach the detector 161.
  • a slight inclination for example, about 1 degree
  • the LVF 254 may be tilted within the xy plane. Also, the same arrangement may be made in another wavelength selection unit 152 or the like.
  • multi-band detection that is, multi-color simultaneous detection is possible using the multistage wavelength selection unit 151 or the like. Furthermore, since a pair of LVFs 254, 256 and the like are used as bandpass filters in at least one wavelength selection unit 151, the transmitted wavelength band can be easily changed by changing the z-direction positions of the LVFs 254, 256. . As a result, one wavelength selection unit 151 can perform multipath detection, that is, multicolor detection by time division.
  • the wavelength selection unit 151 and the like are provided in four stages.
  • the number of stages is not limited to this, and may be two or more stages, thereby enabling multiband detection, that is, multicolor simultaneous detection.
  • the LVF 254 and the like of the pair of LVF 254, 256 and the like are long-pass filters, and the LVF 256 and the like are sheet-pass filters.
  • LVF 254, etc. may be short-pass filters and LVF 256, etc. may be long-pass filters.
  • wavelengths on the longer wavelength side are selected as the wavelength selection unit 152 in the latter stage is placed.
  • wavelengths on the shorter wavelength side may be selected as the wavelength selection unit 152 in the subsequent stage is placed.
  • each of the wavelength selection units may be unitized, so to speak, by housing members such as the LVF constituting itself in a housing or attaching it to a base member. In that case, the wavelength selection unit may be insertable/removable with respect to the microscope 101 .

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Abstract

顕微鏡であって、標本に励起光を照射する照明光学系と、標本から発せられた蛍光を検出する検出器と、蛍光を検出器に導く観察光学系とを有し、観察光学系は、光が入射する位置に応じて反射および透過する波長特性が可変する第１の光学フィルタと、第１の光学フィルタで反射された光の光路に配され、第１の方向に沿った位置に対して透過の境界波長が変化し、反射した光の入射する位置における第１の境界波長より長波長の光を透過する第２の光学フィルタと、第１の光学フィルタで反射された光の光路に配され、第１の方向に沿った位置に対して透過の境界波長が変化し、反射した光の入射する位置における第２の境界波長より短波長の光を透過する第３の光学フィルタとを含み、第１の境界波長は、第２の境界波長より短波長である。

Description

顕微鏡
　本発明は、顕微鏡に関する。
　波長特性が調整可能である帯域通過フィルタを備える蛍光顕微鏡がある（例えば、特許文献１参照）。
［先行技術文献］
［特許文献］
　　［特許文献１］　特開２０００－０５６２２８号公報
一般的開示
　本発明の第１の態様においては、顕微鏡であって、標本に励起光を照射する照明光学系を有してよい。標本から発せられた蛍光を検出する検出器を有してよい。蛍光を検出器に導く観察光学系を有してよい。観察光学系は、光が入射する位置に応じて反射および透過する波長特性が可変する第１の光学フィルタを有してよく、第１の光学フィルタで反射された光の光路に配され、第１の方向に沿った位置に対して透過の境界波長が変化し、反射した光の入射する位置における第１の境界波長より長波長の光を透過する第２の光学フィルタを有してよく、第１の光学フィルタで反射された光の光路に配され、第１の方向に沿った位置に対して透過の境界波長が変化し、反射した光の入射する位置における第２の境界波長より短波長の光を透過する第３の光学フィルタを有してよい。第１の境界波長は、第２の境界波長より短波長であってよい。
　第１の光学フィルタは、第１の方向に沿った位置に応じて波長特性が異なってよい。第１の光学フィルタは、入射する光に対し、第１の方向に交差する面内で、４５度未満で傾斜して配されてよい。第２の光学フィルタおよび第３の光学フィルタは第１の方向に沿って移動可能であってよい。第１の光学フィルタは、第１の方向に沿って移動可能であってよい。第１の方向は重力方向であってよい。第２の光学フィルタおよび第３の光学フィルタのいずれか一方に対し他方が第１の方向に交差する面内で傾斜して配されてよい。観察光学系は、第１の光学フィルタで反射された光を、第２の光学フィルタと第３の光学フィルタとの間に集光する凹面鏡を更に含んでよい。観察光学系は、第１の光学フィルタで反射された光を平行光束にして第２の光学フィルタおよび第３の光学フィルタに入射させる凹面鏡を更に含んでよい。
　観察光学系は、第１の光学フィルタを透過した光が入射し、少なくとも一部の光を反射する反射素子を有してよく、反射素子で反射された光の光路に配され、第１の方向に沿った位置に対して境界波長が変化し、反射した光の入射する位置における第３の境界波長より長波長の光を透過する第４の光学フィルタを有してよく、反射素子で反射された光の光路に配され、第１の方向に沿った位置に対して境界波長が変化し、反射した光の入射する位置における第４の境界波長より長波長の光を透過する第５の光学フィルタを有してよい。第３の境界波長は、第４の境界波長より短波長であってよい。
　反射素子は、光が入射する位置に応じて反射および透過する波長特性が可変する第６の光学フィルタ、又は、全反射鏡であってよい。第１の光学フィルタ、第２の光学フィルタ、及び第３の光学フィルタは第１ユニット内に格納されていてよく、第６の光学フィルタ又は反射素子、第４の光学フィルタ、及び第５の光学フィルタは第２ユニット内に格納されていてよい。第１ユニットおよび第２ユニットは挿脱可能に構成されていてよい。第１の光学フィルタで反射された光の一部であって、第２の光学フィルタ及び第３の光学フィルタを経た光を受光する第１検出器を有してよく、第１の光学フィルタを透過した光の一部を受光する第２検出器を有してよい。第１検出器の受光面及び第２検出器の受光面は、同じ方向を向いていてよい。
　なお、上記の発明の概要は、本発明の特徴の全てを列挙したものではない。また、これらの特徴群のサブコンビネーションもまた、発明となりうる。
標本２１０を観察する顕微鏡１０１の構造を示す模式図である。 観察系後段１４０及び検出部１６０の一例を模式的に示す。 一例としてＬＶＦ２５４の機能を示す模式図である。 波長選択ユニット１５１を透過して検出器１６１で検出可能な波長範囲を説明する概略図である。 ４つの波長選択ユニット１５１、１５２、１５３、１５４の検出可能範囲を模式的に示す。 波長選択ユニット１５１において検出可能範囲を変更することを模式的に示す。 光源１１０を模式的に示す。 顕微鏡１０１の観察手順を示すフローチャートの一例である。 イメージングチャンネルを作成・編集するステップＳ１２の詳細を示すフローチャートである。 図９の設定画面３００の一例を示す。 イメージングチャンネルに対してＬＶＦ等を設定するステップＳ１４の設定画面３１０の一例を示す。 イメージングチャンネルと実チャンネルとの組み合わせを設定するステップＳ１６の詳細を示すフローチャートである。 図１２の設定画面３２０の一例を示す。 レーザ強度を設定するステップＳ１８および検出器の感度設定するステップＳ１８の設定画面３３０の一例である。 画像を取得するための内部制御であるステップＳ２４の詳細を示すフローチャートである。 顕微鏡１０１を用いて蛍光スペクトル分布を取得するための流れ図である。 図１６に対応した設定画面４５０を示す。 図１７に示した設定画面４５０で設定された観察条件での取得波長範囲および検出波長範囲を説明する模式図である。 顕微鏡１０１で検出された標本２１０のある位置での蛍光スペクトルプロファイルを例示する図である。 図１７から図１９の実施形態において取得された画像を表示する表示画像４６０を示す例である。 イメージングチャンネル毎に図１７に示した設定画面４５０で設定された観察条件での取得波長範囲および検出波長範囲を説明する模式図である。 顕微鏡１０１を用いて複数の蛍光スペクトル分布を取得する例を実行するタイミングチャートである。 別例の観察系後段１４２を模式的に示す。 さらに別例の観察系後段１４４を模式的に示す。 観察系後段１４０の変形例を模式的に示す。
　以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、以下の実施形態は請求の範囲にかかる発明を限定するものではない。また、実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。
　図１は、標本２１０を観察する顕微鏡１０１の構造を示す模式図である。顕微鏡１０１は、共焦点顕微鏡であり、光源１１０、照明光学系２２０、観察光学系２４０、検出部１６０、情報処理装置１７０および制御装置１８０を備える。照明光学系２２０と観察光学系２４０とは一部の光学素子を共有する。なお、顕微鏡１０１は、これらすべての構成を有する必要はなく、例えば、光源１１０を有していなくてもよいし、情報処理装置１７０を有していなくてもよいし、制御装置１８０を有していなくてもよい。
　光源１１０は、標本２１０を蛍光で観察する場合の励起光として使用される波長のレーザ光を射出する。光源１１０から射出された励起光は、照明光学系２２０に入射する。
　照明光学系２２０は、標本２１０に励起光を照射する。照明光学系２２０は、ダイクロイックミラー１２１、ガルバノスキャナ１３０、リレーレンズ１２２、レンズ１９２、対物レンズ１９１を有する。ダイクロイックミラー１２１は、光源１１０から射出された励起光の波長を反射し、それ以外の波長の光を透過する特性を有する。光源１１０から入射した励起光は、ダイクロイックミラー１２１に反射されて伝播方向を変え、ガルバノスキャナ１３０に入射される。
　ガルバノスキャナ１３０は、入射した光を反射する一対のガルバノミラー１３１、１３２を有する。ガルバノミラー１３１は図１のｘ軸回りに回転可能であり、ガルバノミラー１３２はｙ軸回りに回転可能である。ガルバノスキャナ１３０に入射した励起光は、一対のガルバノミラー１３１、１３２により反射された後、リレーレンズ１２２、レンズ１９２を介して、対物レンズ１９１に入射する。
　リレーレンズ１２２からの励起光は、レンズ１９２により平行光束にされた後、対物レンズ１９１により標本２１０上に集光される。
　ガルバノスキャナ１３０のガルバノミラー１３１、１３２の向きを制御部１３３で制御することにより、標本２１０上において励起光の集光位置を変えることができる。よって、ガルバノスキャナ１３０により標本２１０上において励起光を二次元的（図１のｘ、ｙ方向）に走査する。
　標本２１０には例えば蛍光物質が含まれており、その場合には標本２１０上の集光位置から蛍光が放射される。ただし、標本２１０から放射される放射光は、励起光の反射光等、蛍光以外の成分も含む。
　標本２１０から放射された放射光は、対物レンズ１９１、レンズ１９２を通過してリレーレンズ１２２に入射する。レンズ１９２の焦点位置と、標本２１０における励起光の集光位置とは、光学的に共役である。リレーレンズ１２２に入射した放射光は、ガルバノスキャナ１３０を通過してダイクロイックミラー１２１に入射する。
　放射光のうち、励起光と同じ波長の成分は、ダイクロイックミラー１２１に反射されて、光源１１０側に導かれる。放射光のうち、励起光と異なる波長を有する成分は、ダイクロイックミラー１２１を透過する。
　なお、ダイクロイックミラー１２１は、励起光の波長成分を完全に取り除くことができるわけではない。このため、ダイクロイックミラー１２１を透過した放射光には、依然として励起光波長の成分も含まれている。
　観察光学系２４０は、上記ダイクロイックミラー１２１、ガルバノスキャナ１３０、リレーレンズ１２２、レンズ１９２および対物レンズ１９１を照明光学系２２０と共有する。観察光学系２４０はさらに、反射ミラー１２３、集光レンズ１２４、ピンホール１２５、コリメートレンズ１２６、観察系後段１４０及び検出部１６０を有する。
　ダイクロイックミラー１２１を通過して反射ミラー１２３に反射された放射光は、集光レンズ１２４を通じて、ピンホール１２５に入射する。ここで、ピンホール１２５は、対物レンズ１９１の焦点位置と共役な位置に配されている。このため、ピンホール１２５は、対物レンズ１９１の焦点である集光位置から放射された光に限って通過させ、その他の点からの光をノイズとして遮光する。
　観察光学系２４０は、標本２１０から発せられた蛍光を検出部１６０に導く。検出部１６０は、標本２１０から発せられた蛍光を検出する。検出部１６０は、検出した蛍光の強度に応じた電気信号を、情報処理装置１７０に出力する。観察光学系２４０の観察系後段１４０および検出部１６０の詳細は後述する。
　情報処理装置１７０は、制御部１７１、表示部１７２、入力部１７３、１７４を有する。制御部１７１は、検出部１６０に対するインターフェイスを有すると共に、検出部１６０から取得した信号から画像を生成する画像処理を実行し、更に、生成された画像を格納して保存する。
　表示部１７２は、ＬＣＤパネル、ＣＲＴ装置等により形成され、生成された画像をユーザに表示する他に、顕微鏡１０１に各種設定を入力する場合のユーザインターフェースの表示等も担う。入力部１７３、１７４は、キーボード等の文字入力装置、マウス等のポインティングデバイスを含み、ユーザが顕微鏡１０１に設定、動作の指示等を入力する場合に使用される。
　更に、情報処理装置１７０は、制御装置１８０と通信して、制御装置１８０に対するユーザインターフェースとしても使用される。制御装置１８０は、ガルバノスキャナ１３０、観察系後段１４０および検出部１６０等の動作に関する設定値を保持して、これらの動作を制御する。また、制御装置１８０は、情報処理装置１７０の負荷を軽減する目的で、情報処理装置１７０における画像処理等の全部または一部を実行してもよい。つまり、制御装置１８０は、情報処理装置１７０の制御部１７１で行う動作の全部または一部を実行してもよい。　また、情報処理装置１７０の制御部１７１は、制御装置１８０で行う動作の全部または一部を実行してもよい。
　図２は、観察系後段１４０及び検出部１６０の一例を模式的に示す。観察系後段１４０は４つの波長選択ユニット１５１、１５２、１５３、１５４を有する。さらに、検出部１６０は４つの波長選択ユニット１５１、１５２、１５３、１５４のそれぞれに対応して４つの検出器１６１、１６２、１６３、１６４を有する。
　波長選択ユニット１５１は、ＬＶＦ（Linear Variable Filter）２５０、凹面鏡２５２、一対のＬＶＦ２５４、２５６、集光レンズ２５８を有する。このうち、ＬＶＦ２５０、２５４、２５６は、予め定められた方向（図中のｚ方向）に沿って膜厚が変化する誘電体層を透明基板上に有し、光が透過する位置に応じて透過および反射の波長特性が変化する。
　図３は、一例としてＬＶＦ２５４の機能を示す模式図である。ＬＶＦ２５４は、予め定められた方向（図中のｚ方向）に沿って膜厚が変化する誘電体層を透明基板上に有し、光が入射する位置に応じて反射および透過する波長特性が変化する。より詳しくは、光が入射するｚ方向の位置によって、透過する波長と反射する波長との境界である境界波長が変化する。よって、ＬＶＦ２５４を駆動部４０２によりｚ方向に移動させて、固定された光路からの入射光に対する波長特性を変化させる。ＬＶＦ２５４と駆動部４０２とにより、透過および反射の波長特性が動的に可変な光学フィルタ４００を形成している。
　図３の右側に示すグラフは、ＬＶＦ２５４の波長特性を示す。図３に示されるグラフにおいて、縦軸は波長、横軸は透過率を示す。図２に示される波長特性を有するＬＶＦ２５４は、境界波長よりも長い波長の光を透過し、境界波長よりも波長が短い光を反射するロングパスフィルタである。
　図２に戻り、コリメートレンズ１２６からの光が入射するＬＶＦ２５０は、入射した光の波長により反射および透過の特性が異なる反射素子、すなわち、ダイクロイックミラーとして機能する。ＬＶＦ２５０は、境界波長よりも短い波長の光を反射し、境界波長よりも波長が長い光を透過するロングパスフィルタである。ＬＶＦ２５０により入射された光路が波長に応じて２分割される。
　ＬＶＦ２５０は図３に示した光学フィルタ４００と同様に、駆動部によりｚ方向に移動可能である。これにより入射光に対する境界波長を動的に変化させることができる。
　ＬＶＦ２５０は、コリメートレンズ１２６から入射する光に対しｘｙ面内で４５度未満、好ましくは２２．５度以下で傾斜して配される。すなわち、ＬＶＦ２５０への光の入射角（すなわち、ＬＶＦ２５０の入射面の法線と主光線方向との成す角）が４５度未満、好ましくは２２．５度以下となるように受光面がｚ軸周りに回転している。このように入射角を小さくすることにより、ＬＶＦ２５０に入射するスポット形状の楕円率が１に近い値に維持されスポット形状の面積が小さくなる。より詳細にはＬＶＦ２５０の入射面に入射するスポット形状は入射面を傾ける方向に伸びた楕円形状となる。この楕円形状の短軸は光束直径Ｄのままである一方、長軸はＤ／ｃｏｓθ（θは入射角）となる。したがって、θが４５度よりも２２．５度の方がスポット形状の面積は小さくなり、楕円率も１に近い。よって、ＬＶＦ２５０での入射スポットにおけるスペクトル分解能の低下を抑制することができる。
　さらに、ＬＶＦ２５０の入射面はｚ軸周りに回転した位置にある。また、ＬＶＦ２５０で境界波長が変化する方向はｚ方向である。これにより、楕円の長軸はｚ軸に直交する方向、すなわち、境界波長が変化しない方向に広がる。したがって、ＬＶＦ２５０での入射スポットにおけるスペクトル分解能の低下をより抑制することができる。
　さらに、ＬＶＦ２５０を駆動する方向もｚ方向である。よって、ｚ方向が鉛直方向すなわち重力方向である場合には、ＬＶＦ２５０を駆動する機械系のガタが自重によって下方に寄せられるから、駆動による位置再現性が高く、位置決め精度を高くすることができる。
　凹面鏡２５２は波長選択ユニット１５１の光路において、ＬＶＦ２５０と一対のＬＶＦ２５４、２５６との間に配されている。すなわち、ＬＶＦ２５０で反射された短波長側の光は凹面鏡２５２に入射する。凹面鏡２５２は、反射した光を一対のＬＶＦ２５４、２５６の間に集光させる。これにより、一対のＬＶＦ２５４、２５６の両方に入射する光束のスポット径を小さくして、それぞれのＬＶＦ２５４、２５６でのスペクトル分解の低下を抑制することができる。さらに、コリメートレンズ１２６の焦点距離を凹面鏡２５２の焦点距離よりも小さくすると、一対のＬＶＦ２５４、２５６のそれぞれに入射するときのスポット径を小さくすることができるので、スペクトル分解能の低下をさらに抑制することができる。
　ＬＶＦ２５４は、ｚ方向に沿った位置に対して境界波長が変化するように配されたロングパスフィルタである。ＬＶＦ２５６は、ｚ方向に沿った位置に対して境界波長が変化するように配されたショートパスフィルタである。ＬＶＦ２５４の境界波長は、ＬＶＦの２５６の境界波長より短波長である。このような一対のＬＶＦ２５４、２５６が向かい合って配されているので、特定の波長範囲を透過するバンドパスフィルタとして機能する。
　ＬＶＦ２５４、２５６はＬＶＦ２５０と同様に、それぞれ駆動部によりｚ方向に移動可能であり、入射位置が固定された入射光に対する境界波長を動的に変化させることができる。なお、一対のＬＶＦ２５４、２５６は互いにｚ方向に沿った位置の境界波長の傾向が同様となるよう配されることが好ましい。すなわち、ＬＶＦ２５４、２５６は＋ｚ方向に進んだ位置ほど両方の境界波長が短波長側に（または両方の境界波長が長波長側に）シフトするように配されることが好ましい。
　一対のＬＶＦ２５４、２５６を透過した光は集光レンズ２５８で集光されて、検出器１６１に入射する。検出器１６１は、例えば光電子増倍管（Photomultiplier Tube）等の高感度な光電気変換素子であり、検出した蛍光に応じた電気信号を制御装置１８０を介して情報処理装置１７０に出力する。
　図４は、波長選択ユニット１５１を透過して検出器１６１で検出可能な波長範囲を説明する概略図である。ここで、波長選択ユニット１５１に関して、ＬＶＦ２５０の透過率よりも反射率に着目すべきであるので縦軸は反射率を示した。
　図４に示されるように、ＬＶＦ２５０で短波長側を反射し、ＬＶＦ２５４で短波長側をカット（遮光）し、ＬＶＦ２５６で長波長側をカット（遮光）する。さらに、ＬＶＦ２５４の境界波長は、ＬＶＦ２５０の境界波長およびＬＶＦ２５６の境界波長より短波長である。これにより、予め定められた波長範囲を透過させて検出器１６１の検出可能範囲とすることができる。さらに、ＬＶＦ２５０をダイクロイックミラーとして機能させることにより、ＬＶＦ２５０を透過した光を波長選択ユニット１５２等の後段に受け渡して他の波長帯域も検出することができる。
　波長選択ユニット１５１よりも後段には、波長選択ユニット１５２および１５３が配される。波長選択ユニット１５２は、ＬＶＦ２６０、凹面鏡２６２、一対のＬＶＦ２６４、２６６、集光レンズ２６８を有する。波長選択ユニット１５３は、ＬＶＦ２７０、凹面鏡２７２、一対のＬＶＦ２７４、２７６、集光レンズ２７８を有する。これら波長選択ユニット１５２および１５３の構成は、後述する点を除き波長選択ユニット１５１と同様の構成を有するので説明を省略する。
　波長選択ユニット１５３の後段にはさらに波長選択ユニット１５４が配される。波長選択ユニット１５４は、凹面鏡２８２、一対のＬＶＦ２８４、２８６、集光レンズ２８８を有する。波長選択ユニット１５４も、ＬＶＦ２５０を有しない点および後述する点を除いて波長選択ユニット１５１と同様の構成を有するので説明を省略する。なお、凹面鏡２８２は特定の波長を透過させるものではないという観点から、全反射鏡であるともいえる。
　検出部１６０には、波長選択ユニット１５２、１５３、１５４からの光をそれぞれ受光する検出器１６２、１６３、１６４が配される。これら検出器１６２、１６３、１６４は検出器１６１と同様の構成であるので説明を省略する。なお、図２の形態において、検出器１６１、１６２、１６３，１６４にはいずれもｙ方向から光が入射する。言い換えると、検出器１６１、１６２、１６３，１６４の検出面はいずれもｚｘ平面に平行であって、同じ方向を向いている。
　図５は、４つの波長選択ユニット１５１、１５２、１５３、１５４の検出可能範囲を模式的に示す。なお、図を簡略化するためにダイクロイックミラーとして機能しているＬＶＦ２５０、２６０、２７０の透過率および反射率の図示を省略した。
　図５に示す例において、４つの波長選択ユニット１５１、１５２、１５３、１５４の検出可能範囲は短波長側から順に設定されている。すなわち、波長選択ユニット１５１の一対のＬＶＦ２５４，２５６により検出可能範囲１が設定され、それよりも長波長側に波長選択ユニット１５２の一対のＬＶＦ２６４，２６６により検出可能範囲２が設定される。同様に、検出範囲２よりも長波長側に、波長選択ユニット１５３の一対のＬＶＦ２７４，２７６により検出可能範囲３が設定され、それよりも長波長側に波長選択ユニット１５４の一対のＬＶＦ２８４，２８６により検出可能範囲４が設定される。
　図５に示す例によれば、観察系後段１４０および検出部１６０により、標本２１０からの蛍光を４つの異なる波長範囲で検出することができる。これは４つの異なる検出のチャンネルを有しているということもできる。以降の説明においてこれらのチャンネルの各々が実体的な光学系を有するという観点からこれらを実チャンネルと呼ぶことがある。
　図６は、波長選択ユニット１５１において検出可能範囲を変更することを模式的に示す。なお、図を簡略化するためにダイクロイックミラーとして機能しているＬＶＦ２５０の透過率および反射率の図示を省略した。
　波長選択ユニット１５１に含まれるＬＶＦ２５０、２５４、２５６はいずれも、境界特性が変化するところのｚ方向に沿って移動可能である。したがって、例えばＬＶＦ２５０、２５４、２５６をそれぞれ対応するｚ位置に配することにより、図６の検出可能範囲Ａを設定することができるとともに、ＬＶＦ２５０、２５４、２５６をそれぞれ対応する他のｚ位置に配することにより、図６の検出可能範囲Ｂを設定することができる。すなわち、一つの波長選択ユニット１５１の光学系において、時分割で複数の異なる波長範囲を検出することができる。
　この場合に、ＬＶＦ２５４とＬＶＦ２５６との両方をｚ軸に沿って同じ方向に同じ量で移動させると、検出可能範囲が帯域幅をほぼ保ったまま短波長側または長波長側にシフトする。一方、ＬＶＦ２５４とＬＶＦ２５６との少なくとも一方をｚ軸に沿って相対的に逆方向に移動させると、検出可能範囲の帯域幅が広くまたは狭くなる。
　なお他の波長選択ユニット１５２、１５３、１５４においても同様の方法により時分割で複数の異なる波長範囲を検出することができる。以降の説明において、異なる波長範囲を時分割で検出する場合の各検出時をパスと呼ぶことがある。
　図７は、光源１１０を模式的に示す。光源１１０は、互いに異なる波長の光を出射する４つのレーザ光源１１１、１１２、１１３、１１４を有する。例えばレーザ光源１１１から射出されるレーザ光の波長が４０５ｎｍであり、レーザ光源１１２から射出されるレーザ光の波長が４８８ｎｍであり、レーザ光源１１３から射出されるレーザ光の波長が５６１ｎｍであり、レーザ光源１１４から射出されるレーザ光の波長が６４０ｎｍである。
　ミラー１１５はレーザ光源１１４から出射したレーザ光を反射する。ダイクロイックミラー１１６は、ミラー１１５で反射されたレーザ光を透過するとともに、レーザ光源１１３から出射したレーザ光を反射する。ダイクロイックミラー１１７は、ダイクロイックミラー１１６を透過および反射したレーザ光を透過するとともに、レーザ光源１１２から出射したレーザ光を反射する。ダイクロイックミラー１１８は、ダイクロイックミラー１１７を透過および反射したレーザ光を反射するとともに、レーザ光源１１１から出射したレーザ光を透過する。
　光源１１０から出射したレーザ光は図１に示したダイクロイックミラー１２１に入射する。ダイクロイックミラー１２１は、ユーザにより希望する、標本面に同時入射する励起光の数や蛍光取得波長範囲の設定変更に応じて切り替える事があり、数種類が用意され、ホイールの上に配置されている。
　図８は、顕微鏡１０１の観察手順を示すフローチャートの一例である。まず、ユーザにより、標本２１０に対して蛍光観察を実行する領域を顕微鏡１０１が指定される（ステップＳ１０）。
　次に、ユーザにより希望する取得波長範囲が指定され、イメージングチャンネルとして作成及び編集される（Ｓ１２）。イメージングチャンネルについては後述する。
　上記イメージングチャンネルに基づいて対応する一対のＬＶＦが設定され（Ｓ１４）、イメージングチャンネルと実チャンネルとの組み合わせが設定される（Ｓ１６）。その後、各イメージングチャンネルについてレーザ強度が設定され（Ｓ１８）、検出器の感度が設定される（Ｓ２０）。
　設定が終わったら画面取得ボタンが押し下げられるまで待機する（Ｓ２２：Ｎｏ）。画面取得ボタンが押し下げられたら（Ｓ２２：Ｙｅｓ）、内部制御により画像を取得して（Ｓ２４）、動作が終了する。
　図９は、イメージングチャンネルを作成・編集するステップＳ１２の詳細を示すフローチャートであり、図１０は、その場合の設定画面３００の一例を示す。
　まず設定画面３００が表示部１７２に表示され、ユーザからの入力を受け付ける。入力欄３０１は蛍光色素を選択する欄であり、入力欄３０２、３０３はそれぞれ取得波長範囲の短波長側および長波長側の波長を入力する欄である。
　入力欄３０１のタブが選択されると、発光スペクトル情報を発光色素から選択するものと解され（Ｓ１００：Ｙｅｓ）、当該入力欄３０１に選択可能な蛍光色素の一覧が表示される。選択可能な蛍光色素は対応する取得波長範囲と共に予め制御部１７１のメモリに格納されている。一覧の中から発光色素がユーザによる選択を受け付ける（Ｓ１０２）。
　一方、入力欄３０１のタブが選択されない場合は、発光スペクトル情報を発光色素から選択しないものと解され（Ｓ１００：Ｎｏ）、入力欄３０２、３０３へユーザから数値が入力されることにより、取得波長範囲、すなわち発光の長波長側および短波長側の波長の設定を受け付ける（Ｓ１０４）。ステップＳ１０２またはＳ１０４の次に、入力欄３０４でイメージングチャンネル名の設定を受け付ける（Ｓ１０６）。
　上記の通りイメージングチャンネルが作成および編集される。当該イメージングチャンネルは、この時点では顕微鏡１０１の実際の光学系、より詳細には実チャンネルとは紐づいていない、いわば仮のチャンネルであるともいえる。図１０の例では、蛍光色素は特定されておらず、取得波長範囲「４００ｎｍから４５０ｎｍ」が、名前「ＩＭ＿Ｃｈ１」で特定されるイメージングチャンネルとして設定されている。
　図１１は、イメージングチャンネルに対して一対のＬＶＦを設定するステップＳ１４の設定画面３１０の一例を示す。図１１の例では、２つのイメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ１」と「ＩＭ＿Ｃｈ２」について、それぞれ対応する発光スペクトル３４１、３４５、励起光３４０、３４３、検出可能範囲３４２、３４６が横軸の波長に対して模式的に表されている。さらにイメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ２」において、検出可能範囲３４６の中に励起光３４３が入っていることに対応して励起光３４３の周囲に検出禁止範囲３４７が表示されている。
　発光スペクトル３４１、３４５のプロファイルおよび励起光３４０、３４３の波長は、対応する蛍光色素と共に予め制御部１７１のメモリに格納されている。なお、イメージングチャンネルにおいて取得波長範囲の波長が数値として設定された場合には、当該範囲を最大値、その他の範囲を最小値（典型的にはゼロ）とする矩形で発光スペクトルを設定画面３１０に表してもよい。
　検出可能範囲３４２、３４６は、発光スペクトル３４１、３４５に対応してデフォルトで表示される。例えば、発光スペクトル３４１、３４５の半値幅となるように検出可能範囲３４２、３４６が初期設定される。さらに、検出可能範囲３４２、３４６の左右の破線は、ユーザによってマウスポインターでドラッグアンドドロップ等でデフォルトの表示位置から移動可能である。
　ここで左の破線はロングパスフィルタのＬＶＦの境界波長に対応し、右の破線はショートバスフィルタのＬＶＦの境界波長に対応する。したがって、ユーザによる設定後にＯＫボタン３０５が押下されることにより、イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ１」について、その時点での検出可能範囲３４２の左の破線の位置の波長がロングパスフィルタのＬＶＦの境界波長に設定され、右の破線の位置の波長がショートバスフィルタのＬＶＦの境界波長に設定される。
　さらに、ダイクロイックミラーとして機能するＬＶＦの境界波長は、検出可能範囲の長波長側を決めている上記ショートパスフィルタのＬＶＦの境界波長に対して予め定められた条件で自動的に設定される。例えば、ダイクロイックミラーとして機能するＬＶＦの境界波長は、ショートパスフィルタのＬＶＦの境界波長（図中の検出可能範囲３４２の右側の破線）に対して１０ｎｍだけ長波長側の波長に設定される。
　イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ２」に対しても同様に設定される。なお、キャンセルボタン３０６の押下により、イメージングチャンネルを設定する図１０の設定画面３００に戻る。
　図１２は、イメージングチャンネルと実チャンネルとの組み合わせを設定するステップＳ１６の詳細を示すフローチャートであり、図１３は、その場合の設定画面３２０の一例を示す。図１３は、４つのイメージングチャンネルが作成された例を示しており、それに対応して表示欄３５２に４つのイメージングチャンネル名「ＩＭ＿Ｃｈ１」等が表示されている。
　表示欄３５０には、顕微鏡１０１で使用が可能なレーザが表示されている。図７の例において４つのレーザ光源１１１、１１２、１１３、１１４が使用可能であることに対応して、図１３の表示欄３５０には、それぞれの波長「４０５ｎｍ」、「４８８ｎｍ」、「５６１ｎｍ」、「６４０ｎｍ」とともに４つのレーザ光源が模式的に表されている。
　表示欄３５６には、顕微鏡１０１で使用が可能な検出器が表示されている。図２の例において４つの検出器１６１、１６２、１６３、１６４が使用可能であることに対応して、図１３の表示欄３５６には、４つの検出器が模式的に表されている。この場合に、検出器の種類、例えば光電子増倍管であればその旨を示す「ＰＭＴ」などを表示してもよい。
　レーザ光源とイメージングチャンネルとの紐づけを受け付ける（Ｓ１２０）。この場合に、表示欄３５０のレーザ光源のいずれかがドラッグされると当該レーザ光源からドラッグ位置まで線が表示されて、表示欄３５２のいずれかのイメージングチャンネル上でドロップされることにより、当該レーザ光源とイメージングチャンネルとの間に設定画面３２０で線が引かれてそれらが紐づけられたことが示される。
　この場合に、レーザ光源とイメージングチャンネルとは、イメージングチャンネル設定時の取得波長範囲の最小波長値よりも、短波長にあるレーザ光源であれば紐づけが可能であり、１対１に紐づけられてもよいし、１対Ｎ、Ｎ対１（Ｎは２以上の整数）で紐づけられてもよい。図１３の例ではレーザ光源とイメージングチャンネルとは１対１に紐づけられている。なお、イメージングチャンネルが先に選択され、それと紐づけるレーザ光源が後から選択されてもよい。
　イメージングチャンネルと検出器との紐づけを受け付ける（Ｓ１２２）。この場合に、イメージングチャンネルと検出器との紐づけの方法は、レーザ光源とイメージングチャンネルとの紐づけと同様の方法であってよい。
　この場合に、イメージングチャンネルと検出器とは１対１に紐づけられてもよいし、１対Ｎ、Ｎ対１で紐づけられてもよい。図１３の例ではイメージングチャンネルと検出器とは２対１に紐づけられている。
　ここで、イメージングチャンネルと検出器とが１対１以外で紐づけられた場合、ＬＶＦを駆動させたり、フィルタホイールによるフィルタキューブを切替させたり、光学素子を配置する制御時間を必要とする為、標本２１０からの蛍光を時間的に同時に検出できないことがある。また、紐づけ対象の検出器の上流光路（検出器に到達するまでの光路）に、ダイクロイックミラー（ＬＶＦまたはフィルタキューブ内臓品ダイクロイックミラー）が配置されている状況で、そのダイクロイックミラーがロングパス特性である場合には、紐づけ対象の検出器によって検出可能な範囲はダイクロイックミラーの境界波長よりも長波長となる。
　説明例として、図２の場合、紐づけ対象の検出器１６４の場合、上流光路（検出器に到達するまでの光路）に、ダイクロイックミラー（ＬＶＦまたはフィルタキューブ内臓品ダイクロイックミラー）は、２７０、２６０、２５０なる。
　イメージングチャンネルの取得波長範囲が、紐づけ対象の検出器の上流光路に配置されたダイクロイックミラー（複数存在することもある）の境界波長より、長波長になるまで、ダイクロイックミラーの特性を変更する制御（ＬＶＦを駆動、フィルターキューブ切替）をしない限り、イメージングチャンネルと紐づけ対象の検出器とは紐づけられない。複数の検出器のうち、蛍光を受光しない検出器が存在する場合は、その検出器の上流光路中の最も近いダイクロイックミラーによって入射した蛍光が分光（一部透過、残り反射）されず、全て透過するように、ＬＶＦによるダイクロイックミラーの場合は、境界波長を最も短波長側に移動させる、または、フィルタキューブに内蔵されたダイクロイックミラーの場合は、フィルタキューブが無いポジションまでホイールを回転させる、の設定が自動的にされる。紐づけられない場合には、エラーがユーザに通知される。
　そこで、それらを時分割で検出するためにパスが設定される。図１３の例では、１つの検出器「Ｄ＿１６２」に２つのイメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ１」、「ＩＭ＿Ｃｈ２」が紐づけられている。よって、２つのパスを設定し、時間的に先の「パス１」でイメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ１」における蛍光を検出器「Ｄ＿１６２」で検出し、時間的に後の「パス２」でイメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ２」における蛍光を検出器「Ｄ＿１６２」で検出する。
　以上により、イメージングチャンネルと顕微鏡１０１の実チャンネルとの組み合わせが設定される。
　図１４は、レーザ強度を設定するステップＳ１８および検出器の感度設定するステップＳ２０の設定画面３３０の一例である。表示欄３３１、３３２、３３３には、それまでに設定したイメージングチャンネルおよび検出波長範囲が表示されている。
　設定画面３３０はさらに、イメージングチャンネルに対応した検出器感度（例えば印加電圧）を設定するためのスライダ３３４および励起光の強度を設定するためのスライダ３３５を有する。入力部１７４等で当該スライダ３３４、３３５をドラッグして左右に移動させることで、イメージングチャンネルごとの感度および励起光強度が設定される。さらに、設定画面３３０の画面取得ボタン３３７が押し下げられると、図８のステップＳ２２に基づいて、画像を取得するための内部制御が行われる（Ｓ２４）。
　図１５は、画像を取得するための内部制御であるステップＳ２４の詳細を示すフローチャートである。まず最初のパスに対応するイメージングチャンネルに対応して、実チャンネルとの組み合わせに基づき、ＬＶＦ２５０、２６０、２６４、２６６等のｚ方向位置などの光学系が設定される。
　制御装置１８０は、光源１１０のうちの指定されたレーザ光源１１１等で励起光の出力を開始し（Ｓ１４０）、指定された観察領域に励起光が照射されるようにガルバノミラー１３１、１３２を駆動する（Ｓ１４２、Ｓ１４４）。ここでレーザ光源１１１等は、検出しようとする蛍光のイメージングチャンネルに基づいて指定される。これにより、検出部１６０は、当該イメージングチャンネルに対応した検出可能範囲に含まれる蛍光を検出する（Ｓ１４４）。
　こうして、ステップＳ１４４およびステップＳ１４６の一連の動作により、集光位置から発生した蛍光の強度が検出されると、制御装置１８０は、検出された強度を保存した上で、当初指定された観察領域における１走査線上で指定された画素数の検出が完了したかどうかを判断する（Ｓ１４８）。
　検出した画素数が指定された画素数に達していない場合（Ｓ１４８：ＮＯ）、制御装置１８０は、Ｘ座標における検出数をインクリメントして（Ｓ１５０）、制御をステップＳ１４４に戻す。これにより、顕微鏡１０１は、再びガルバノミラー１３１を駆動して、励起光の集光位置を、同一ライン上の他の画素の位置に移動させ（Ｓ１４４）、再び蛍光の光強度を検出する（Ｓ１４６）。
　これらステップＳ１４４およびステップＳ１４６の動作を繰り返し、蛍光の光強度を検出した画素数が指定の画素数に達した場合（Ｓ１４８：ＹＥＳ）、制御装置１８０は、当初指定された観察領域における走査ライン数の検出が完了したか否かを判断する。（Ｓ１５２）。検出した走査ライン数が指定された走査ライン数に達していない場合（Ｓ１５２：ＮＯ）、制御装置１８０は、Ｙ座標における検出数をインクリメントして（Ｓ１５４）、制御をステップＳ１４２に戻す。そこで、制御装置１８０は、ガルバノミラー１３０の制御部１３３を駆動し、励起光の集光位置を他の走査線上に移動させ、再び蛍光の光強度を検出させる。
　蛍光の光強度を検出した走査ライン数が指定された観察領域の走査線ラインに達した場合（Ｓ１５２：ＹＥＳ）、制御装置１８０は、検出した蛍光の光強度の値に基づいて、観察領域における観察画像を構築する（Ｓ１５６）。構築された観察画像は、表示部１７２の設定画面３３０の表示欄３３６に表示してもよいし、情報処理装置１７０に設けられた記憶部（図示せず）に格納してもよい。
　ステップＳ１５６の次に、制御装置１８０は、指定されたパス数の検出が完了したか否かを判断する。（Ｓ１５８）。検出したパス数が指定されたパス数に達していない場合（Ｓ１５８：ＮＯ）、制御装置１８０は、パス数をインクリメントして（Ｓ１６０）、次のパスに対応するイメージングチャンネルに対応して、実チャンネルとの組み合わせに基づき、ＬＶＦ２５０を駆動する等して光学系を設定し（Ｓ１６２）、制御をステップＳ１４０に戻す。そこで、制御装置１８０は、当該イメージングチャンネルで指定されたレーザ光源１１１等で励起光を出力し、再び蛍光の光強度を検出させる。
　検出されたパス数が指定されたパス数に達した場合（Ｓ１６２：ＹＥＳ）、制御装置１８０は、レーザ光源の出力を停止する（Ｓ１７４）。これにより顕微鏡１０１における観察の動作が終了する。
　以上、本実施形態の顕微鏡１０１によれば、４段の波長選択ユニットすなわち４つの実チャンネルを用いて、マルチバンド検出すなわち多色同時検出が可能である。さらに、少なくとも１つの実チャンネルにおいて、例えば、一対のＬＶＦ２５４，２５６をバンドパスフィルタとして使用しているので、ＬＶＦ２５４，２５６のｚ方向位置を変更することにより、透過する波長帯域を簡便にできる。それにより、１つの実チャンネルでマルチパス検出すなわち時分割で多色検出が可能である。
　一対のＬＶＦ２５４，２５６を備えた実チャンネルでは、一度（一回）に検出する検出波長範囲の幅をより狭くして同様に連続的に蛍光画像を取得することで、標本２１０の蛍光スペクトル分布を得ることが出来る。
　図１６は、顕微鏡１０１を用いて蛍光スペクトル分布を取得するための流れ図であり、図１７は図１６に対応した設定画面４５０を示す。図１６および図１７において、図１から図１５と同一の構成および動作については同じ参照番号を付して説明を省略する。
　この観察パターンは、波長選択ユニット１５１を用いて、一対のＬＶＦ２５４，２５６を駆動して、複数回蛍光を取得する場合である。ここでは一度に（一回で）検出する波長範囲を２０ｎｍとし、それを１４回繰り返すことで４３０ｎｍから７１０ｎｍまでの蛍光スペクトルプロファイルを取得する。
　図１７の設定画面４５０は、図１６のステップＳ１２でイメージングチャンネルの作成・編集を行う場合に、表示部１７２に表示される。入力フィールド４１１は、光源１１０により射出される光（励起光）の波長の値を設定できるが、図示の例では、４０５ｎｍが指定されている。入力フィールド４１１への入力は、情報処理装置１７０の入力部１７３、１７４を使用できる。
　入力フィールド４１２、４１４は、標本２１０から放射される蛍光スペクトルの取得波長範囲を数値で設定する場合に入力する領域である。入力フィールド４１２、４１４への入力には、情報処理装置１７０の入力部１７３、１７４を使用できる。入力フィールド４１２は取得波長範囲の短波長端を入力する領域であり、入力フィールド４１４は長波長端を入力する領域である。図示の例では、波長４３０ｎｍから７１０ｎｍの取得波長範囲が設定されている。
　入力フィールド４５１は、上記の入力フィールド４１２、４１４で設定された取得波長範囲において一度に（一回で）蛍光スペクトルを検出する検出波長範囲を設定する。なお、ここでの検出波長範囲は、蛍光スペクトルプロファイルの波長分解能に相当する。図示の例では、２０ｎｍ間隔で蛍光強度を検出することが設定されている。よって、この例では、波長４３０ｎｍから７１０ｎｍの帯域について、１４帯域の検出が指定されることになる。なお、検出波長範囲を設定することに代えて、上記の入力フィールド４１２、４１４で設定された取得波長範囲において検出する帯域の数が入力できるようになっていてもよい。この場合には入力された帯域の数に基づいて波長分解能が自動的に設定される。
　入力フィールド４１３は、入力フィールド４５１、４１２、４１４において設定された取得波長範囲と波長分解能とがグラフィックで表示されると共に、入力フィールド４１３に表示されたバーを直接に操作して、取得する波長範囲を入力することもできる。入力フィールド４１２、４１４の数値と入力フィールド４１３に表示されたバーとは連動している。
　図１８は、図１７に示した設定画面４５０で設定された観察条件での取得波長範囲および検出波長範囲を説明する模式図である。この場合の蛍光スペクトル取得においては、入力フィールド４１１で指定された波長４０５ｎｍの励起光が標本２１０に照射される。また、入力フィールド４１２、４１４で指定された波長４３０ｎｍから７１０ｎｍまでの取得波長範囲において、入力フィールド４５１で指定した波長分解能（検出波長範囲）で、２０ｎｍおきに１４回、蛍光画像を取得する。
　この場合に、各検出波長範囲において、短波長側がＬＶＦ２５４によりカット（遮光）され、長波長側がＬＶＦ２５６によりカット（遮光）される。言い換えると、制御装置１８０は、各検出波長範囲の下限から低い波長帯域をＬＶＦ２５４でカット（遮光）し、同範囲の上限よりも高い帯域をＬＶＦ２５６でカット（遮光）させる。また、ひとつの検出波長範囲において蛍光画像を取得すると、ＬＶＦ２５４、２５６の駆動部４０２をそれぞれ動作させて、検出波長範囲を、すでに蛍光強度を検出した検出波長範囲に隣接した帯域にずらす（図１６のＳ２２２、Ｓ１６２）。
　図１９は、顕微鏡１０１で検出された標本２１０のある位置での蛍光スペクトルプロファイルを例示する図である。顕微鏡１０１は、上記のような動作を繰り返すことにより、複数の検出波長範囲について、検出波長範囲毎に蛍光強度を検出する。よって、検出された画像の蛍光強度を横軸波長λ、縦軸強度のグラフにプロットすることにより、図１９に示すように、標本２１０の各検出位置でのスペクトルプロファイルを生成できる。なお、スペクトルプロファイルは、例えば、領域４２０に表示される。なお、検出波長範囲毎に検出された蛍光強度（発光強度）を足し合わせた二次元画像を設定画面４５０の領域４１９にさらに表示してもよい。
　図２０は、図１７から図１９の実施形態において取得された画像を表示する表示画像４６０を示す例である。観察画像４４８は、所定の検出波長範囲で構築された観察画像である。表示画像４６０は、異なる検出波長範囲で構築された複数の観察画像４４８をタイル状に表示する複数の画像表示フィールド４４３を有する。これにより、ユーザは、それぞれの検出波長範囲の観察画像４４８を一度に観察することができる。
　さらに、顕微鏡１０１を用いて、複数の蛍光スペクトル分布を取得する例を説明する。この観察パターンは、波長選択ユニット１５１、１５２を用いて、一対のＬＶＦ２５４，２５６、及び一対のＬＶＦ２６４，２６６をそれぞれ駆動して、それぞれ複数回蛍光を取得する場合である。波長選択ユニット１５１は、一度に（一回で）検出する波長範囲を２０ｎｍとし、蛍光取得を９回繰り返すことで４３０ｎｍから６１０ｎｍまでの蛍光スペクトルプロファイルを取得し、波長選択ユニット１５２は、一度に（一回で）検出する波長範囲を１０ｎｍとし、蛍光取得を６回繰り返すことで６５０ｎｍから７１０ｎｍまでの蛍光スペクトルプロファイルを取得する。
　図１６のステップＳ１２でイメージングチャンネルの作成・編集を行う場合に、イメージングチャンネル毎に図１７の設定画面４５０が表示部１７２に表示される。イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ１」の入力フィールド４１１には、４０５ｎｍが設定され、入力フィールド４１２、４１４には、波長４３０ｎｍから６１０ｎｍの取得波長範囲が設定される。入力フィールド４５１には、２０ｎｍ間隔で蛍光強度を検出することが設定されている。よって、イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ１」では、波長４３０ｎｍから６１０ｎｍの帯域について、９帯域の検出が指定されることになる。また、イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ２」の入力フィールド４１１には、６４０ｎｍが指定され、入力フィールド４１２、４１４には、波長６５０ｎｍから７１０ｎｍの取得波長範囲が設定される。入力フィールド４５１には、１０ｎｍ間隔で蛍光強度を検出することが設定される。よって、イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ２」では、波長６５０ｎｍから７１０ｎｍの帯域について、６帯域の検出が指定されることになる。
　図１６のステップＳ１６でイメージングチャンネルと実チャンネルとの組み合わせ設定を行う場合、図１３の設定画面３２０が表示部１７２に表示される。この設定画面３２０において、表示欄３５０のレーザ光源と表示欄３５２のイメージチャンネルと表示欄３５６の検出器とを紐づける。イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ１」は、レーザ光源「４０５ｎｍ」と検出器「Ｄ＿１６１」とに紐づけ、イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ２」は、レーザ光源「６４０ｎｍ」と検出器「Ｄ＿１６２」と紐づける。
　図２１は、イメージングチャンネル毎に図１７に示した設定画面４５０で設定された観察条件での取得波長範囲および検出波長範囲を説明する模式図である。この場合の蛍光スペクトル取得においては、イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ１」の入力フィールド４１１で指定された波長４０５ｎｍの励起光が標本２１０に照射される。また、入力フィールド４１２、４１４で指定された波長４３０ｎｍから６１０ｎｍまでの取得波長範囲において、入力フィールド４５１で指定した波長分解能（検出波長範囲）で、２０ｎｍおきに９回、蛍光画像を取得する。イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ２」の入力フィールド４１１で指定された波長６４０ｎｍの励起光が標本２１０に照射される。また、入力フィールド４１２、４１４で指定された波長６５０ｎｍから７１０ｎｍまでの取得波長範囲において、入力フィールド４５１で指定した波長分解能（検出波長範囲）で、１０ｎｍおきに６回、蛍光画像を取得する。
　図２２は、顕微鏡１０１を用いて複数の蛍光スペクトル分布を取得する例を実行するタイミングチャートである。レーザ光源１１１は、期間Ｔ１において、波長４０５ｎｍの励起光を標本２１０に照射し、検出器「Ｄ＿１６１」は、期間Ｔ２において、標本２１０から発生する蛍光を検出する。一対のＬＶＦ２５４，２５６は、期間Ｔ３において、駆動部４０２をそれぞれ駆動させて、検出波長範囲をすでに蛍光強度を検出した検出波長範囲に隣接した帯域にずらす。
　レーザ光源１１４は、期間Ｔ４において、波長６４０ｎｍの励起光を標本２１０に照射し、検出器「Ｄ＿１６２」は、期間Ｔ５において、標本２１０から発生する蛍光を検出する。一対のＬＶＦ２６４，２６６は、期間Ｔ６において、駆動部４０２をそれぞれ駆動させて、検出波長範囲をすでに蛍光強度を検出した検出波長範囲に隣接した帯域にずらす。
　期間Ｔ４、期間Ｔ５の開始時は、期間Ｔ１、期間Ｔ２の終了時であり、期間Ｔ１、期間Ｔ２の開始時は、期間Ｔ４、期間Ｔ５の終了時である。また、期間Ｔ３の開始時は、期間Ｔ１、期間Ｔ２の終了時であり、期間Ｔ６の開始時は、期間Ｔ４、期間Ｔ５の終了時である。　さらに、期間Ｔ３の開始時は、期間Ｔ４、期間Ｔ５の開始時であり、期間Ｔ６の開始時は、期間Ｔ１、期間Ｔ２の開始時である。
　つまり、ＬＶＦを駆動して静定するまでの時間を考慮して、波長選択ユニット１５１を用いて、波長４０５ｎｍの励起光を標本２１０に照射して、検出器「Ｄ＿１６１」で蛍光を検出している期間に、波長選択ユニット１５２のＬＶＦ２６４，２６６の駆動部４０２それぞれ駆動させて、波長選択ユニット１５２を用いて、波長６４０ｎｍの励起光を標本２１０に照射して、検出器「Ｄ＿１６２」で蛍光を検出している期間に、波長選択ユニット１５１のＬＶＦ２５４，２５６の駆動部４０２それぞれ駆動させている。これにより、効率的に蛍光検出を行うことができる。
　図２３は、別例の観察系後段１４２を模式的に示す。観察系後段１４２において図２の観察系後段１４０と同一の構成には同一の参照番号を付して説明を省略する。
　観察系後段１４２の波長選択ユニット１５５、１５６、１５７、１５８は、観察系後段１４０の波長選択ユニット１５１、１５２、１５３、１５４の構成に加えて、集光レンズ２５９、２６９、２７９、２８９を有する。代表して波長選択ユニット１５５について説明し、他の波長選択ユニット１５２、１５３、１５４については同様の構成であるので説明を省略する。
　集光レンズ２５９は入射光を集光するが、ここで、集光レンズ２５９の焦点位置を凹面鏡２５２の焦点位置に一致させるように配置する。これにより、凹面鏡２５２は入射光を反射して並行光束にする。したがって、一対のＬＶＦ２５４、２５６のそれぞれには並行光束が入射するから、光束内のいずれの光線についてもＬＶＦ２５４、２５６に対する実質的な膜厚が同じになり、スペクトル分解能の低下を抑制することができる。さらに、集光レンズ２５９の焦点距離を凹面鏡２５２の焦点距離よりも小さくすると、一対のＬＶＦ２５４、２５６のそれぞれに入射するときのスポット径を小さくすることができるので、スペクトル分解能の低下をさらに抑制することができる。
　図２４は、さらに別例の観察系後段１４４を模式的に示す。観察系後段１４４において図２の観察系後段１４０と同一の構成には同一の参照番号を付して説明を省略する。
　観察系後段１４４は、波長選択ユニット１５１よりも前段に波長選択ユニット１４５を有する。波長選択ユニット１４５は、ダイクロイックミラー２３０と、バンドパスフィルタ２３２、２３４と、集光レンズ２３６とを有する。
　ダイクロイックミラー２３０およびバンドパスフィルタ２３２、２３４は例えばフィルタキューブに取り付けられており、一つのユニットとして予め定められた波長帯域を反射し、他の予め定められた波長領域を透過する。さらに、当該フィルタキューブは、反射および透過の波長帯域が異なる他のフィルタキューブとともにフィルタホイールに搭載され、それらのいずれかを光路に挿入可能であってもよい。
　ダイクロイックミラー２３０で反射されてバンドパスフィルタ２３４で透過した光が、集光レンズ２３６で集光されて、検出器１６１で検出される。一方、ダイクロイックミラー２３０およびバンドパスフィルタ２３２を透過した光は、後段の波長選択ユニット１５１等に入射して、必要に応じて検出される。
　光がダイクロイックミラー２３０を透過するときに、ダイクロイックミラー２３０の板厚に対応した分だけ主光線がｙ方向にシフトする。しかしながら、後段の波長選択ユニット１５１等においてダイクロイックミラーとして機能するＬＶＦ２５０等はｙ方向について波長特性、すなわち境界波長が変化しない向きに配されている。したがって、当該ｙ方向へのシフトに対して波長選択ユニット１５１等の反射・透過特性はほとんど影響を受けない。
　観察系後段１４４は、さらに波長選択ユニット１５２よりも後段に波長選択ユニット１４６を有する。波長選択ユニット１４６は、ダイクロイックミラー２９０と、バンドパスフィルタ２９２、２９４と、集光レンズ２９６とを有する。波長選択ユニット１４６は、選択される波長が異なってよいことを除けば、波長選択ユニット１４５と同様の構成なので、説明を省略する。
　図２５は、観察系後段１４０の変形例を模式的に示す。図２５の観察系後段１４０において、ＬＶＦ２５６が主光線に対してｘｙ面内で少し、例えば１度程度傾斜して配される。これにより、ＬＶＦ２５６を透過しないで反射した光が一対のＬＶＦ２５４、２５６の間を多重反射するうちにＬＶＦ２５６の異なるｚ位置に入射して所望しない帯域の光を検出器１６１に到達させてしまうという不具合を避けることができる。
　ＬＶＦ２５６を傾けるのに代えて、またはこれに加えて、ＬＶＦ２５４をｘｙ面内で傾けてもよい。また、他の波長選択ユニット１５２等において同様の配置をしてもよい。
　以上、いずれの実施形態においても、多段の波長選択ユニット１５１等を用いてマルチバンド検出すなわち多色同時検出が可能である。さらに、少なくとも１つの波長選択ユニット１５１において、一対のＬＶＦ２５４，２５６等をバンドパスフィルタとして使用しているので、ＬＶＦ２５４，２５６のｚ方向位置を変更することにより、透過する波長帯域を簡便に変更できる。それにより、１つの波長選択ユニット１５１でマルチパス検出すなわち時分割で多色検出が可能である。
　なお、いずれの実施形態においても、波長選択ユニット１５１等は４段である。しかしながら、段数はこれに限られず２段以上であればよく、それによりマルチバンド検出すなわち多色同時検出が可能である。
　また、上記いずれの実施形態においても一対のＬＶＦ２５４、２５６等のうちのＬＶＦ２５４等がロングパスフィルタであり、ＬＶＦ２５６等がシートパスフィルタである。これに代えて、ＬＶＦ２５４等がショートパスフィルタであり、ＬＶＦ２５６等がロングパスフィルタであってもよい。
　また、上記いずれの実施形態においても、後段の波長選択ユニット１５２になるほど長波長側の波長を選択している。これに代えて、後段の波長選択ユニット１５２になるほど短波長側の波長を選択するようにしてもよい。また、波長選択ユニットのそれぞれは、自身を構成するＬＶＦ等の部材を筐体内に格納したり、ベース部材に取り付けるようにして、いわばユニット化してもよい。その場合に、波長選択ユニット単位で顕微鏡１０１に対して挿脱可能であってもよい。
　以上、本発明を実施の形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。上記実施の形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。その様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、請求の範囲の記載から明らかである。
　請求の範囲、明細書、および図面中において示した装置、システム、プログラム、および方法における動作、手順、ステップ、および段階等の各処理の実行順序は、特段「より前に」、「先立って」等と明示しておらず、また、前の処理の出力を後の処理で用いるのでない限り、任意の順序で実現しうることに留意すべきである。請求の範囲、明細書、および図面中の動作フローに関して、便宜上「まず、」、「次に、」等を用いて説明したとしても、この順で実施することが必須であることを意味するものではない。
１０１　顕微鏡、１１０　光源、１１１、１１２、１１３、１１４　レーザ光源、１１５、１２３　ミラー、１１６、１１７、１１８、１２１、２３０、２９０　ダイクロイックミラー、１２２　リレーレンズ、１２４　集光レンズ、１２６　コリメートレンズ、１２５　ピンホール、１３０　ガルバノスキャナ、１３１、１３２　ガルバノミラー、１４０、１４２、１４４　観察系後段、１４６、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７，１５８　波長選択ユニット、１６０　検出部、１６１、１６２、１６３、１６４　検出器、１７０　情報処理装置、１７１　制御部、１７２　表示部、１７３、１７４　入力部、１８０　制御装置、１９１　対物レンズ、１９２　レンズ、２１０　標本、２２０　照明光学系、２３０、　ダイクロイックミラー、２３２、２３４、２９２、２９４　バンドパスフィルタ、２３６、２５８、２５９、２６８、２６９、２７８、２７９、２８８、２８９、２９６　集光レンズ、２４０　観察光学系、２５０、２５４、２５６、２６０、２６４、２６６、２７０、２７４、２７６、２８４、２８６　ＬＶＦ、２５２、２６２、２７２、２８２　凹面鏡、３００、３１０、３３０　設定画面、３０１、３０２、３０３、３０４　入力欄、３０５　ＯＫボタン、３０６　キャンセルボタン、３３４、３３５　スライダ、３３１、３３２、３３３、３３６、３５０、３５２　表示欄、３３７　画面取得ボタン、３４０、３４３　励起光、３４１、３４５　発光スペクトル、３４２、３４６　検出可能範囲、３４７　検出禁止範囲、４００　光学フィルタ、４０２　駆動部

Claims (13)

  1. 　顕微鏡であって、
    　標本に励起光を照射する照明光学系と、
    　前記標本から発せられた蛍光を検出する検出器と、
    　蛍光を前記検出器に導く観察光学系とを有し、
    　前記観察光学系は、
    　光が入射する位置に応じて反射および透過する波長特性が可変する第１の光学フィルタと、
    　前記第１の光学フィルタで反射された光の光路に配され、第１の方向に沿った位置に対して透過の境界波長が変化し、前記反射した光の入射する位置における第１の境界波長より長波長の光を透過する第２の光学フィルタと、
    　前記第１の光学フィルタで反射された光の光路に配され、前記第１の方向に沿った位置に対して透過の境界波長が変化し、前記反射した光の入射する位置における第２の境界波長より短波長の光を透過する第３の光学フィルタと
    を含み、
    　前記第１の境界波長は、前記第２の境界波長より短波長である顕微鏡。
  2. 　前記第１の光学フィルタは、前記第１の方向に沿った位置に応じて前記波長特性が異なる請求項１に記載の顕微鏡。
  3. 　前記第１の光学フィルタは、前記入射する光に対し、前記第１の方向に交差する面内で、４５度未満で傾斜して配される請求項２に記載の顕微鏡。
  4. 　前記第２の光学フィルタおよび前記第３の光学フィルタは前記第１の方向に沿って移動可能である請求項１から３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  5. 　前記第１の光学フィルタは、前記第１の方向に沿って移動可能である請求項１から４のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  6. 　前記第１の方向は重力方向である請求項１から５のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  7. 　前記第２の光学フィルタおよび前記第３の光学フィルタのいずれか一方に対し他方が前記第１の方向に交差する面内で傾斜して配される請求項１から６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  8. 　前記観察光学系は、前記第１の光学フィルタで反射された光を、前記第２の光学フィルタと前記第３の光学フィルタとの間に集光する凹面鏡を更に含む請求項１から７のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  9. 　前記観察光学系は、前記第１の光学フィルタで反射された光を平行光束にして前記第２の光学フィルタおよび前記第３の光学フィルタに入射させる凹面鏡を更に含む請求項１から７のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  10. 　前記観察光学系は、
    　前記第１の光学フィルタを透過した光が入射し、少なくとも一部の光を反射する反射素子と、
    　前記反射素子で反射された光の光路に配され、前記第１の方向に沿った位置に対して境界波長が変化し、前記反射した光の入射する位置における第３の境界波長より長波長の光を透過する第４の光学フィルタと、
    　前記反射素子で反射された光の光路に配され、前記第１の方向に沿った位置に対して境界波長が変化し、前記反射した光の入射する位置における第４の境界波長より長波長の光を透過する第５の光学フィルタと
    をさらに含み、
    　前記第３の境界波長は、前記第４の境界波長より短波長である請求項１から９のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  11. 　前記反射素子は、光が入射する位置に応じて反射および透過する波長特性が可変する第６の光学フィルタ、又は、全反射鏡である請求項１０に記載の顕微鏡。
  12. 　前記第１の光学フィルタ、前記第２の光学フィルタ、及び前記第３の光学フィルタは第１ユニット内に格納され、
    　前記第６の光学フィルタ又は前記反射素子、前記第４の光学フィルタ、及び前記第５の光学フィルタは第２ユニット内に格納され、
    　前記第１ユニット及び前記第２ユニットは挿脱可能に構成されている
    請求項１０又は１１に記載の顕微鏡。
  13. 　前記第１の光学フィルタで反射された光の一部であって、前記第２の光学フィルタ及び第３の光学フィルタを経た光を受光する第１検出器と、
    　前記第１の光学フィルタを透過した光の一部を受光する第２検出器と
    をさらに備え、
    　前記第１検出器の受光面及び前記第２検出器の受光面は、同じ方向を向いている請求項１から１２のいずれか一項に記載の顕微鏡。
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