WO2022202714A1 - メルケル細胞活性化剤、シナプス小胞の増強剤、神経伝達物質放出促進剤、メルケル細胞の神経伝達物質放出活性の評価方法、並びにメルケル細胞の神経伝達物質放出促進剤のスクリーニング方法 - Google Patents

メルケル細胞活性化剤、シナプス小胞の増強剤、神経伝達物質放出促進剤、メルケル細胞の神経伝達物質放出活性の評価方法、並びにメルケル細胞の神経伝達物質放出促進剤のスクリーニング方法 Download PDF

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も絵 東條
健太朗 加治屋
歳斗 坂口
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株式会社 資生堂
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    • C12N2503/02—Drug screening

Definitions

  • the present invention relates to a Merkel cell activator and an enhancer of synaptic vesicles in Merkel cells.
  • the present invention also relates to a method for evaluating the neurotransmitter release activity of Merkel cells, a method for screening a neurotransmitter release-enhancing agent using such an evaluation method, and a neurotransmitter screened by such a screening method. It also relates to release enhancers.
  • Receptors related to tactile sensation are excited by mechanical stimuli, and signals are sent to the brain via sensory nerves.
  • Receptors for such mechano-stimulation include Merkel cells existing in the deepest part of the epidermis, Meissner's corpuscles existing in the outermost layer of the dermis, Pacinian corpuscles existing in the deep dermis, and Ruffini endings.
  • Merkel cells are synaptically connected to the terminals of sensory nerves, and when excited by mechanical stimulation, neurotransmitters are secreted into the synapses and information is transmitted to the sensory nerves. It has been suggested that the Piezo2 channel of Merkel cells is involved in the sensing of mechanical stimulation (Non-Patent Document 1: Nature (2014) volume 509, pages 622-626).
  • Non-Patent Document 6 a decrease in Merkel cells causes allonesis, in which itching is induced by stimuli that normally do not cause itching, and that activation of Merkel cells suppresses itching. Furthermore, it has been reported that PIEZO2-deficient subjects cannot induce sensitization or pain responses even at the site of skin inflammation, suggesting that PIEZO2 channels are therapeutic targets for allodynia, which causes pain with non-noxious stimuli that normally do not cause pain. It has been reported that it becomes (Non-Patent Document 6)
  • the olfactory receptor OR2AT4 is expressed in keratinocytes, which are the main constituent cells of the epidermis, and its agonist Sandalore acts on OR2AT4 to induce intracellular signals and promote wound healing.
  • Non-Patent Document 2 J Investigative Dermatology (2014) vol. 134, p. 2823-2832.
  • OR2AT4 is expressed in the sheath cells of hair follicles and that application of sandalore causes hair elongation (Patent Document 1: JP-A-2019-519502, Non-Patent Document 3: Nat Commun. (2016) Sep 18;9(1):3624).
  • the inventors are conducting intensive research on skin care that focuses on the sense of touch, with the goal of obtaining drugs that activate Merkel cells.
  • OR2AT4 an olfactory receptor expressed in the skin
  • OR2AT4 was expressed in Merkel cells.
  • Merkel cells are activated by applying sandalol, which is an agonist of OR2AT4, to the Merkel cells, resulting in the present invention.
  • the invention thus relates to: [A1-1] The following formula: [In the formula, R 1 and R 2 together form a double bond or R 1 and R 2 together form a cyclopropyl group; R 3 and R 4 are the same or different and are independently selected from hydrogen, methyl, or R 3 and R 4 together form a double bond; R5 and R6 are the same or different and are independently selected from hydrogen, methyl, or R5 and R6 together form a double bond; or R5 and R6 are , together form a cyclopropyl group; R7 is methyl or ethyl; R8 is hydrogen or methyl]
  • An activator of Merkel cells comprising a compound represented by [A1-2]
  • [A4-1] The following formula: [In the formula, R 1 and R 2 together form a double bond or R 1 and R 2 together form a cyclopropyl group; R 3 and R 4 are the same or different and are independently selected from hydrogen, methyl, or R 3 and R 4 together form a double bond; R5 and R6 are the same or different and are independently selected from hydrogen, methyl, or R5 and R6 together form a double bond; or R5 and R6 are , together form a cyclopropyl group; R7 is methyl or ethyl; R8 is hydrogen or methyl]
  • An agent for enhancing synaptic vesicles in Merkel cells comprising a compound represented by [A4-2]
  • For use in the treatment, prevention or alleviation of at least one symptom selected from the group consisting of itching, pruritus, allonesis, and allodynia through enhancement of synaptic vesicles in Merkel cells The formula for: [In the formula, R 1 and R 2 together
  • the present inventors focused on the tactile sensation that can be perceived by skin care, etc., and conducted intensive research on the mechanism of releasing neurotransmitters by excitation of Merkel cells.
  • the present inventors have found that the neurotransmitter release activity of Merkel cells can be evaluated by measuring the change in fluorescence intensity value before and after depolarizing stimulation under a microscope, leading to the present invention.
  • the invention thus relates to: [B1] A method for evaluating neurotransmitter releasing activity of Merkel cells in a skin sample, comprising: culturing a skin sample in a medium containing a fluorescent tracer of a neurotransmitter; applying a depolarizing stimulus; The above evaluation method, comprising measuring changes in fluorescence intensity values of Merkel cells before and after depolarizing stimulation under a fluorescence microscope. [B2] The evaluation method according to item B1, wherein the neurotransmitter fluorescent tracer is a monoamine neurotransmitter fluorescent tracer. [B3] The evaluation method according to item B1 or B2, wherein the skin sample is a human skin sample.
  • a method for screening a Merkel cell neurotransmitter release enhancer in a skin sample comprising: culturing a skin sample in a medium containing a fluorescent tracer of a neurotransmitter; adding a candidate neurotransmitter release-enhancing agent; Measuring the change in the fluorescence intensity value of the Merkel cells before and after the addition under a fluorescence microscope.
  • the neurotransmitter fluorescent tracer is a monoamine neurotransmitter fluorescent tracer.
  • a neurotransmitter release enhancer in Merkel cells comprising a compound represented by [B7-2]
  • Any of items B7-1 to B7-5, B8, B9, or B10 for treating, preventing, or alleviating at least one symptom selected from the group consisting of itching, pruritus, allonesis, and allodynia A neurotransmitter release-enhancing agent, compound, cosmetic method, enhancement method, or use according to any one of claims 1 to 3.
  • FIG. 1 shows the results of co-staining skin samples with CK8 and OR2AT4, which are Merkel cell markers, and observing them under a fluorescence microscope.
  • A is a scalp sample
  • B is an abdominal skin sample, showing photographs taken by co-staining with CK8 and OR2AT4.
  • C The left side of the graph shows the number of OR2AT4 and CK8 double-positive cells in a given area in a scalp sample.
  • the right side of the graph shows the ratio of OR2AT4 and CK8 double positive cells to CK8 positive cells in scalp samples.
  • D The left side of the graph shows the number of cells double positive for OR2AT4 and CK8 in a given area in abdominal samples.
  • FIG. 2 shows the results of co-staining skin samples with CK18 and OR2AT4, which are Merkel cell markers, and observing them under a fluorescence microscope.
  • A is a scalp sample
  • B is an abdominal skin sample, showing photographs taken by co-staining with CK18 and OR2AT4.
  • C The left side of the graph shows the number of OR2AT4 and CK18 double-positive cells in a given area in a scalp sample.
  • the right side of the graph shows the ratio of OR2AT4 and CK18 double positive cells to CK18 positive cells in scalp samples.
  • FIG. 3 shows the results of co-staining skin samples with CK20 and OR2AT4, which are Merkel cell markers, and observing them under a fluorescence microscope.
  • A is a scalp sample and
  • B is an abdominal skin sample, showing photographs taken by co-staining with CK20 and OR2AT4.
  • C The left side of the graph shows the number of OR2AT4 and CK20 double-positive cells in a given area in a scalp sample.
  • FIG. 4 shows photographs taken under a fluorescence microscope of CK20-positive cells expressing piccolo in samples to which sandalore was applied (FIG. 4A: control (vehicle), FIG. 4B: sandalool).
  • FIG. 4A control (vehicle)
  • FIG. 4B sandalool
  • FIG. 4C is a graph showing the number of piccolo-expressing CK20-positive cells counted in a given region in a photograph taken under a fluorescence microscope.
  • FIG. 5A shows iPS cell-derived sensory neural progenitor cells.
  • FIG. 5B shows the amount of mRNA expression of type I collagen when the culture supernatant of iPS cell-derived sensory neural progenitor cells (conditioned medium) was added to fibroblasts. Shown as a relative value compared to the case. Error bars are mean ⁇ SD, ** indicates statistical significance by unpaired t-test ( ** P ⁇ 0.01).
  • FIG. 5A shows iPS cell-derived sensory neural progenitor cells.
  • FIG. 5B shows the amount of mRNA expression of type I collagen when the culture supernatant of iPS cell-derived sensory neural progenitor cells (conditioned medium) was added to fibroblasts. Shown as a relative value compared to the case. Error bars are mean ⁇ SD, ** indicates statistical significance by un
  • FIG. 6A shows the mRNA expression level of type I collagen when the medium supernatant of iPS cell-derived sensory neural progenitor cells stimulated with a test substance (lavender oil: LO 0.005%) was added to fibroblasts.
  • FIG. 6B shows the mRNA expression level of type I collagen when the above test substances were added directly to fibroblasts at the same concentration.
  • collagen production is shown as a relative value with the control (no test substance added: control) set to 100%. Error bars are mean ⁇ SD, * indicates statistically significant difference by unpaired t-test ( * P ⁇ 0.05), n. s. indicates no statistically significant difference.
  • FIG. 7 shows the mRNA expression level of type I collagen when a test substance (lavender oil: LO 0.02%) was added directly to fibroblasts at a higher concentration (4-fold) than in FIG. 6B. Collagen production is shown as a relative value with the control (no test substance added: control) set to 100%. Error bars are mean ⁇ SD, ** indicates statistically significant difference by unpaired t-test ( ** p ⁇ 0.01), n. s. indicates no statistically significant difference.
  • FIG. 8 is a photograph showing changes in fluorescence after 0, 200, 400 and 600 seconds in Merkel cells incorporating a fluorescent tracer (FFN206).
  • FIG. 8A shows the fluorescence change when sandalore stimulation was applied from 300 seconds to 600 seconds, and FIG.
  • FIG. 8B shows the fluorescence change when the BSS solution was refluxed from 300 seconds to 600 seconds as a control. show.
  • FIG. 9 is a graph showing changes in fluorescence intensity values of Merkel cells in fluorescence imaging for 10 minutes. At 5 minutes (300 seconds), sandalore was introduced and fluorescence intensity values decreased (filled circles). As a control, at 5 minutes (300 seconds), BSS solution was perfused (open squares).
  • the present invention provides sandalol (3-methyl-5-(2,2,3-trimethyl-cyclopent-3-en-1-yl)-pentan-2-ol [CAS: 65113-99-7]), or It relates to activators of Merkel cells, including analogues thereof.
  • a sandal roll is represented by the following formula:
  • Sandalol was developed and marketed as a compound with a sandalwood-like odor.
  • the fragrance component of sandalwood is mainly composed of santalol and further includes its stereoisomers.
  • Alpha and beta forms of santalol are known. Due to its complicated structure, it is difficult to synthesize sandalol, and fragrances having a sandalwood-like scent with a simpler structure have been synthesized, and sandalol is one of them.
  • Sandalore acts as an agonist of OR2AT4, one of the olfactory receptors.
  • Sandalol and its analogues are mentioned as a compound which has an agonistic effect
  • sandalol analogues having an agonistic action on OR2AT4 include brahmanol (2-methyl-4-(2,2,3-trimethyl-3-cyclopenten-1-yl)-butan-1-ol [CAS: 72089 -08-8]) (Non-Patent Document 2).
  • Brahmanol is represented by the formula:
  • Sandalol or analogs thereof that act as agonists of OR2AT4 include, by way of example, the following compounds:
  • Sandalol or its analogues may, for example, have the following formula: [In the formula, R 1 and R 2 together form a double bond or R 1 and R 2 together form a cyclopropyl group; R 3 and R 4 are the same or different and are independently selected from hydrogen, methyl, or R 3 and R 4 together form a double bond; R5 and R6 are the same or different and are independently selected from hydrogen, methyl, or R5 and R6 together form a double bond; or R5 and R6 are , together form a cyclopropyl group; R7 is methyl or ethyl; R8 is hydrogen or methyl] Relating to the compound represented by These compounds may contain optical isomers. These compounds, like sandalol, can act as agonists of OR2AT4. In addition, these compounds, like Sandalore, activate Merkel cells and promote the release of neurotransmitters from Merkel cells.
  • Activation of Merkel cells refers to the promotion of proliferation or maturation of Merkel cells.
  • Merkel cells undergo changes in their expression markers as they mature.
  • CK8, CK18, and CK20 are used as Merkel cell markers.
  • CK8 is expressed in an undifferentiated state
  • CK18 is expressed in activated Merkel cells
  • CK20 is expressed in a mature state (PLoS Genet (2016) Jul. 14;12(7):e1006151.).
  • Merkel cells can be activated by applying the Merkel cell activator of the present invention. Specifically, by applying a Merkel cell activator, the activated Merkel cells increase the expression of proteins involved in synaptic vesicles, such as Piccolo. This activation of Merkel cells promotes the release of neurotransmitters into synapses, thereby enhancing tactile sensation.
  • Another aspect of the present invention relates to an agent for enhancing synaptic vesicles in Merkel cells, containing Sandalore or an analogue thereof.
  • a potentiator of synaptic vesicles in Merkel cells containing sandalore or an analogue thereof By applying a potentiator of synaptic vesicles in Merkel cells containing sandalore or an analogue thereof, the number of synaptic vesicles in Merkel cells is increased. Enhancement of synaptic vesicles improves the efficiency of neurotransmission between Merkel cells and neurons, and activates neurons involved in tactile sensation. Activation of nerve cells existing in the dermal layer increases collagen production in dermal fibroblasts. Accordingly, the present invention also relates to collagen production-enhancing agents comprising sandalore or analogues thereof.
  • Yet another aspect of the present invention relates to a composition for treating, preventing, or alleviating at least one symptom selected from the group consisting of itching, pruritus, allonesis, and allodynia, comprising Sandalore or an analogue thereof.
  • a method of activating Merkel cells in vitro or in vivo a method of promoting release of neurotransmitters from Merkel cells in vitro or in vivo comprising applying Sandalore or an analogue thereof also related to A method for activating Merkel cells in vitro and a method for promoting the release of neurotransmitters from Merkel cells in vitro include culturing a group of cells or tissue containing Merkel cells in a solution containing sandalore or an analogue thereof. Including process.
  • Methods of activating Merkel cells in vivo, methods of enhancing release of neurotransmitters from Merkel cells in vivo comprise administering sandalore or an analog thereof to any subject.
  • the Merkel cell activator and neurotransmitter release promoter of the present invention are agents for treating, preventing, or alleviating at least one symptom selected from the group consisting of itching, pruritus, allonesis, and allodynia.
  • Subjects to whom Sandalore or an analogue thereof is administered include, for example, subjects with decreased activity of Merkel cells, subjects with decreased tactile sensation, subjects with decreased collagen production, itching, skin pruritus, allonesis, and allodynia.
  • Sandalol or its analogs can be administered by any route such as transdermal, oral, transmucosal, nasal, intravenous, intraarterial, or subcutaneous. Transmucosal administration is preferred.
  • the Sandalol or its analogues can be applied to any skin, such as the skin of the face, head, neck, limbs, trunk.
  • the Merkel cell activator, synaptic vesicle enhancer, and/or neurotransmitter release enhancer of the present invention may be incorporated into cosmetics, pharmaceuticals, or quasi-drugs, respectively. These agents may be administered orally or parenterally, eg transdermally.
  • transdermal administration it can be formulated into an external preparation for skin.
  • the external skin preparation is not particularly limited as long as it can be applied to the skin, and examples include solution, emulsified, solid, semi-solid, powder, powder dispersion, water-oil two-layer separation, and water-oil.
  • Any dosage form can be applied, such as powder three-layer separated form, ointment form, gel form, aerosol form, mousse form, stick form, and the like.
  • bases and excipients commonly used in external skin preparations such as preservatives, emulsifiers and pH adjusters, may be used.
  • face or body cosmetics such as lotions, milky lotions, serums, creams, lotions, packs, essences, and gels
  • makeup cosmetics such as foundations, makeup bases, and concealers, and even It can be blended into bath agents and the like.
  • Merkel cells are activated, resulting in activation of nerve cells and promotion of collagen production associated therewith. It may be used in cosmetics intended to improve wrinkles and sagging by promoting collagen production.
  • the Merkel cell activator, synaptic vesicle enhancer, and/or neurotransmitter release enhancer of the present invention has a desired effect, such as a Merkel cell activation effect, synaptic enhancement effect, or release of neurotransmitters from Merkel cells. It can be arbitrarily selected from the viewpoint of exerting the release promoting effect or promoting collagen production. From the viewpoint of blending as an external skin preparation, Sandalol or its analogs can be blended at 0.0005% to 0.5%. From the viewpoint of sufficiently exhibiting the effect, it can be blended preferably at 0.001% or more, and more preferably at 0.005% or more. From the viewpoint of avoiding a strong odor, the content is preferably 0.1% or less, more preferably 0.05% or less.
  • the present invention relates to a method for evaluating neurotransmitter releasing activity of Merkel cells in skin samples.
  • evaluation methods include the following steps: culturing a skin sample in a medium containing a fluorescent tracer of a neurotransmitter; applying a depolarizing stimulus; Measuring changes in fluorescence intensity values of Merkel cells before and after depolarizing stimulation under a fluorescence microscope.
  • a washing step or medium replacement step may be performed.
  • Such methods may be performed under perfusion conditions. Such methods allow direct and immediate assessment of the neurotransmitter releasing activity of Merkel cells.
  • Merkel cells are cells that exist in the deepest part of the epidermis and function as receptors for mechanical stimulation. When Merkel cells are excited and depolarized by mechanical stimulation, neurotransmitters are secreted into the synaptic cleft and signals are transmitted to sensory neurons via synapses. It has been suggested that the Piezo2 channel of Merkel cells is involved in the sensing of mechanical stimuli. Merkel cells undergo changes in their expression markers as they mature. For identification of Merkel cells in a skin sample, for example, a fluorescent dye such as Quinacrine or FMdye that is specifically incorporated into Merkel cells may be used as a marker. In another aspect, a protein expressed in Merkel cells may be detected as a marker, and as an example, at least one cell surface marker selected from the group consisting of CK8, CK18, and CK20 may be used.
  • a skin sample may be a sample containing Merkel cells, and may contain cells other than Merkel cells.
  • the skin sample may be derived from any animal, but is preferably derived from humans from the viewpoint of developing cosmetics and pharmaceuticals.
  • Cells other than Merkel cells may be cells contained in the skin such as epidermal cells and dermal cells, and cells of the nervous system such as nerve cells may be contained.
  • the skin sample may be a skin sample obtained from a subject or a culture. More preferably, a cultured skin model constructed three-dimensionally by culturing epidermal cells or dermal cells may be used.
  • Neurotransmitter release activity is determined by the amount of neurotransmitters released from Merkel cells.
  • Merkel cells When Merkel cells receive a depolarizing stimulus, the stimulus is transmitted by releasing neurotransmitters into the synaptic cleft. Some of the neurotransmitters released into the synaptic cleft are received by neuronal receptors and cause neuronal excitation. Also, some of the neurotransmitters released into the synaptic cleft are reuptaken via receptors expressed in Merkel cells.
  • One example of neurotransmitters released by Merkel cells is monoamine neurotransmitters.
  • neurotransmitter release activity is determined by loading Merkel cells with a fluorescent tracer of a neurotransmitter and measuring changes in the fluorescent tracer within the cell upon depolarization.
  • a neurotransmitter fluorescent tracer is dissolved in a medium at a concentration of 1 to 50 ⁇ M and cultured for 30 minutes to 12 hours to be incorporated into Merkel cells.
  • Fluorescent tracers refer to analogues of neurotransmitters that allow fluorescence observation.
  • FFN206 (4-(2-aminoethyl)-7-(methylamino)-2H-1-benzopyran-2-one dihydrochloride)
  • Non-Patent Document 4 Neuron (2016) 19:100(6):1401-1413
  • FFN511 (9-(2-aminoethyl)-2,3,6,7-tetrahydro-1H,5H,11H-[ 1]-Benzopyrano[6,7,8-ij]quinolizin-11-one)) is used.
  • Fluorescence intensity values may be measured in whole cells or may be determined in specific regions near synapses, such as regions of synaptic vesicles.
  • the depolarizing stimulus may be mechanical stimulus or drug stimulus.
  • Mechanical stimulation can be imparted by applying the probe to the Merkel cells. Mechanical stimulation can be applied until cell deformation is observed.
  • Drug stimulation is applied by applying agents that cause depolarization. Such agents include sandalol or its analogues. More specifically, a depolarizing stimulus can be imparted by introducing a medium containing an agent that induces depolarization under perfusion conditions.
  • Another aspect of the present invention may relate to a screening method for a Merkel cell neurotransmitter release-enhancing agent using the method for evaluating the neurotransmitter release activity of Merkel cells.
  • screening methods specifically involve the following steps: culturing a skin sample in a medium containing a fluorescent tracer of a neurotransmitter; adding a candidate neurotransmitter release-enhancing agent; Under a fluorescence microscope, measure the change in fluorescence intensity value of Merkel cells before and after addition.
  • Such a screening method enables screening for neurotransmitter release-enhancing agents that enhance neurotransmitter release in Merkel cells.
  • a washing step or medium replacement step may be performed.
  • Such methods may be performed under perfusion conditions.
  • a candidate substance can be selected as a Merkel cell neurotransmitter release facilitator if the fluorescence intensity value decreases significantly.
  • Candidate substances for neurotransmitter release accelerators can be substances belonging to any library, such as cosmetic material library, extract library, drug library, and compound library.
  • a neurotransmitter release-enhancing agent can induce depolarization of Merkel cells, and can also be referred to as a depolarization stimulator or a Merkel cell activator.
  • a neurotransmitter release-enhancing agent induces depolarization of Merkel cells and promotes neurotransmitter release from Merkel cells.
  • By promoting the release of neurotransmitters the efficiency of neurotransmission between Merkel cells and neurons is improved, and the neurons involved in tactile sensation are activated.
  • a neurotransmitter release accelerator at a lower concentration, it is possible to sensitize the Merkel cells in a state where the Merkel cells are easily depolarized, that is, it is also called a Merkel cell sensitization accelerator. be able to. This results in activation of Merkel cells even with weaker mechanical stimuli.
  • the efficiency of neurotransmission between Merkel cells and nerve cells is improved, and nerve cells related to touch are activated.
  • Activation of nerve cells existing in the dermal layer increases collagen production in dermal fibroblasts.
  • the present invention also relates to collagen production-enhancing agents, including neurotransmitter release-enhancing agents.
  • Another aspect of the present invention may relate to a neurotransmitter release-enhancing agent selected by the screening method described above. Specifically, sandalore and its analogues have been screened as neurotransmitter release enhancers. Therefore, the present invention may also relate to a neurotransmitter release enhancer or collagen production enhancer containing at least one selected from the group consisting of sandalol and analogues thereof.
  • Example 1 Merkel Cell Distribution in Scalp and Abdominal Skin Samples Skin samples Temporal and occipital human scalp or abdominal skin were obtained from healthy subjects (20 to 60 years old: 13 in total) who underwent regular cosmetic surgery or plastic surgery, informed consent and ethical approval (University of Muenster) was used after obtaining Human scalps were obtained from 3 males and 3 females, and abdominal skin was obtained from 6 females and 1 male.
  • Fluorescent immunohistochemically stained scalp and abdominal skin samples were cut into 4 mm pieces, embedded in OCT and frozen in liquid nitrogen.
  • OCT-embedded samples were sectioned on a Leica cryostat.
  • tissue cryosections were fixed with 4% paraformaldehyde, preincubated with 10% goat serum (for OR2AT4) or 5% goat serum + 0.3% Triton X-100, and corresponding primary antibody solutions. Incubation was performed overnight at 4°C. Incubation was performed for 45 minutes at room temperature in the solution of secondary antibody. Nuclei were stained with DAPI (1 ⁇ g/ml).
  • anti-OR2AT4 antibody As primary antibodies, anti-OR2AT4 antibody (sold by Eurogentech, product number: custom made, 1910432), anti-CK8 antibody (sold by Progen, product number: GP-CK8) and anti-CK18 antibody (sold by Progen, product number : GP-CK18), followed by Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody (sold by Invitrogen, product number: A-11008) as a secondary antibody, Goat anti-Mouse IgG (H+ L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody (sold by Invitrogen, product number: A-11030) and Fluorescein (FITC)-conjugated AffiniPure Goat Anti Guinea Pig IgG (H+L) (sold by Jackson ImmunoResearch, product number: 106-095-003) were used for each primary antibody used.
  • DAPI manufactured by Sigma-Aldrich, product number: 10236276001
  • Quantitative Immunohistomorphometry Staining intensity was assessed by quantitative (immuno)histomorphometry31,32 using NIH ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, USA) in well-defined reference areas.
  • Example 2 Changes in piccolo expression due to application of sandal roll to scalp samples Skin samples Temporal and occipital human scalps were obtained from healthy female subjects (ages 47-60) who underwent routine cosmetic surgery and were used after obtaining informed consent and ethical approval (University of Muenster). Fluorescent Immunohistochemical Staining Occipital Head of Female Subjects Age 60 (Donor 1), Male (Donor 2), Male (Donor 2), Male (Donor 3), Female (Donor 4), Female (Donor 4), and Female (Donor 5) Scalp samples containing hair follicles were obtained by 6 mm punches from (donors 1, 2, 3, 4) or the temporal region (donor 5).
  • the obtained samples were placed in DMEM/F12 medium supplemented with 25 ng/ml NGF and cultured at 37° C. in a 5% CO 2 humidified atmosphere (day 0). On day 1, medium was replaced with medium containing Sandalore (500 ⁇ M). Medium containing 0.1% DMSO was used as a control. Samples were collected on day 3, embedded in OCT and frozen in liquid nitrogen. OCT-embedded samples were sectioned on a Leica cryostat. For primary antibody staining, tissue cryosections were fixed with 4% paraformaldehyde, preincubated with 5% goat serum + 0.3% Triton X-100, and incubated overnight at 4°C in a solution of the corresponding primary antibodies. gone.
  • DAPI (manufacturer: Sigma-Aldrich, product number: 10236276001) was used for nuclear staining. Photographs taken with a fluorescence microscope are shown (Fig. 4A: Vehicle (control), Fig. 4B: Sandalore). The number of piccolo-expressing CK20-positive cells in a given area in a photograph taken under a fluorescence microscope was counted and shown graphically (Fig. 4C). Sandalore increased the number of piccolo-expressing Merkel cells.
  • Example 3 Effect of sensory nerve cells to promote type I collagen production of fibroblasts (1) Culturing of sensory nerve cells Human iPS cell-derived sensory nerve progenitor cells (i-SNs, ax0055, Axol Bioscience, Cambridge, United Kingdom) Cultures were performed according to the manufacturer's instructions (Fig. 5A). Specifically, these cells were plated on a 24-well plate coated with Sure-Bond XF (ax0053) and added with 25 ng/mL GDNF, 25 ng/mL BDNF, 10 ng/mL NGF, and 10 ng/mL NT-3. It was cultured in Sensor Neuron Maintenance Medium (SNMM, ax0060) added.
  • SNMM Sensor Neuron Maintenance Medium
  • the cells were cultured for 5 weeks while changing half of the medium every 3 to 4 days to differentiate into sensory neurons. After culturing for 5 weeks, the culture medium was collected to obtain the supernatant.
  • Type I collagen production in fibroblasts stimulated by sensory nerve cells (2-1) Stimulation by sensory nerve cells
  • Fibroblasts are separated from neonatal foreskin fibroblasts obtained after informed consent, The cells were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium (Life Technologies Japan Ltd., Tokyo, Japan) containing % fetal bovine serum for 2 days at 37° C. in a humidified atmosphere of 95% air and 5% CO 2 .
  • the culture supernatant (300 ⁇ l) obtained by the above method (1) was mixed with the fibroblast culture medium at a ratio of 1:1, cultured for 4 hours, and collagen production was performed by the following method (2-2). was measured.
  • the medium for iPS cell-derived sensory nerve progenitor cells shown above was mixed with the fibroblast culture medium at a ratio of 1:1 instead of the culture medium supernatant.
  • Fig. 5B The results are shown in Fig. 5B.
  • neuronal cell culture supernatant was added (conditioned medium)
  • fibroblast type I collagen mRNA expression level was significantly increased compared to the control without addition (control). This suggests that the components derived from nerve cells have the effect of promoting the production of collagen by fibroblasts.
  • Example 4 Collagen Production Promoting Action Via Nerve Activation by Stimulation of Various Substances
  • nerves are activated.
  • Type I collagen production was measured using the culture supernatant of nerve cells stimulated with lavender oil, which was confirmed to be a type I.
  • Test substance Lavender oil essential oil containing 30% or more linalyl acetate obtained by steam-distilling Lavandula vera DC. flowers
  • Capsaicin (Sigma-Aldrich), which is a TRPV1 known ligand, and cinnamaldehyde (CNM 125 ⁇ M) (Sigma-Aldrich) were also used as test substances.
  • Capsaicin (Sigma-Aldrich)
  • CCM 125 ⁇ M) cinnamaldehyde
  • Culture of Human iPS Cell-Derived Sensory Neural Progenitor Cells The total amount (600 ⁇ l) of the supernatant of neural progenitor cells cultured for 5 weeks or more using the same material and method as in Example 4 was collected, and the test substance in (1) above was collected.
  • DMEM was prepared by adjusting the final concentration of the above test substances to the same final concentration of 0.005% lavender oil, directly mixed with fibroblasts, and left to stand for 4 hours to collect RNA.
  • type I collagen was measured by quantitative real-time PCR on the recovered RNA.
  • Example 5 Effects of Direct Addition of Test Substances at Higher Concentrations Higher concentrations of test substances than those used in Example 5 were used to investigate the effects of direct additions. Specifically, except that the test substance of Example 5 was added to a final concentration of 0.02% lavender oil, it was applied directly to fibroblasts in the same manner as in the control experiment of Example 5, and collagen was measured. gone. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 7, high concentrations of the test substance stimulated the production of type I collagen in fibroblasts. However, the effect was not observed at low concentrations (Fig. 6B), suggesting that the production of type I collagen in fibroblasts was promoted via neuronal activation by neuroactive substances such as lavender oil. It is suggested.
  • Example 6 Neurotransmitter release by Merkel cells in fresh human skin (ex vivo) Preparation of samples Acquire fresh skin excised from the abdomen of a 42-year-old healthy female subject and a 48-year-old healthy subject who underwent cosmetic surgery, obtain informed consent and ethical approval, and experiment within 5 days after excision. used for The skin was exposed to a 25 units/ml dispase-PBS solution for 15 minutes at 37° C. to peel off the epidermis.
  • Epidermis detached from fresh human skin was treated with a high potassium extracellular solution (5 mM NaCl, 140 mM KCl, 10 mM HEPES (pH 7.4), 10 mM D-glucose, 2 mM MgCl) containing FFN206 (Tocris, Catalog No. 5043). 2 , and 2 mM CaCl 2 ) for 30 minutes to allow specific uptake of the fluorescently labeled neurotransmitter FFN206 into Merkel cells.
  • a high potassium extracellular solution 5 mM NaCl, 140 mM KCl, 10 mM HEPES (pH 7.4), 10 mM D-glucose, 2 mM MgCl) containing FFN206 (Tocris, Catalog No. 5043). 2 , and 2 mM CaCl 2 ) for 30 minutes to allow specific uptake of the fluorescently labeled neurotransmitter FFN206 into Merkel cells.
  • FFN206 signals were observed for 10 minutes on the epidermis containing Merkel cells in which FFN206 had been taken up under perfusion conditions.
  • a BSS (Balanced salt solution) solution (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES (pH 7.4), 10 mM D-glucose, 2 mM MgCl 2 and 2 mM CaCl 2 ) was perfused as a baseline for the first 5 minutes.
  • a 500 ⁇ M Sandalore (Givaudan)/BSS solution was refluxed from 5 minutes (300 s) to the end of observation (600 s) (A).
  • the BSS solution was refluxed after 5 minutes (after 300 s) until the end of observation (600 s).
  • Luminance value data was acquired by Fluoview (Olympus).
  • FIG. 8(A) shows changes in luminance values in the mouse epidermis, and it was observed that Sandalore activates Merkel cells via OR2AT4 expressed in Merkel cells and promotes the release of neurotransmitters.

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Abstract

触覚に着目したスキンケアの提供を目的とする。サンダロール及びその類縁体が、メルケル細胞を活性化させる作用を有することを見出し、サンダロール及びその類縁体を含むメルケル細胞活性化剤を提供する。また、活性化されたメルケル細胞がシナプス小胞を多く含むことを見出し、サンダロール及びその類縁体を含む、シナプス小胞増強剤を提供する。また、蛍光トレーサーを取り込ませたメルケル細胞について蛍光顕微鏡下で、脱分極刺激の前後における蛍光輝度値の変化を測定することで、メルケル細胞の神経伝達物質放出活性を評価できることを見出し、メルケル細胞の神経伝達物質放出促進剤のスクリーニング方法を提供する。

Description

メルケル細胞活性化剤、シナプス小胞の増強剤、神経伝達物質放出促進剤、メルケル細胞の神経伝達物質放出活性の評価方法、並びにメルケル細胞の神経伝達物質放出促進剤のスクリーニング方法
　本発明は、メルケル細胞活性化剤、及びメルケル細胞におけるシナプス小胞の増強剤に関する。
　また、本発明は、メルケル細胞の神経伝達物質放出活性の評価方法にも関しており、かかる評価方法を利用した神経伝達物質放出促進剤のスクリーニング方法、並びにかかるスクリーニング方法によりスクリーニングされた神経伝達物質放出促進剤にも関する。
　触覚に関係する受容器は、機械的な刺激によって興奮し、それによりシグナルが知覚神経を介して脳に送られる。このような機械刺激の受容器として、表皮の最深部に存在するメルケル細胞、真皮最外層に存在するマイスナー小体、真皮深層にあるパチニ小体、ルフィニ終末などが挙げられる。メルケル細胞には、知覚神経の終末がシナプス結合されており、機械刺激を受けて興奮するとシナプスに神経伝達物質が分泌され、知覚神経へ情報が伝わる。機械刺激の感知にはメルケル細胞のＰｉｅｚｏ２チャネルが関与していることが示唆されている（非特許文献１：Nature (2014) volume 509, pages 622-626）。また、メルケル細胞の減少により、通常は痒みを感じないような刺激で痒みが誘発されるアロネシスを引き起こすこと、さらにメルケル細胞を活性化することにより痒みを抑制することが報告されている（非特許文献５）。さらに、ＰＩＥＺＯ２欠乏者では皮膚炎症部位においても感作又は疼痛反応を誘導できないことを報告しており、ＰＩＥＺＯ２チャンネルが、通常痛みを引き起こさないような非侵害刺激で痛みを生じさせるアロディニアの治療標的となることが報告されている（非特許文献６）
　一方で、表皮の主な構成細胞であるケラチノサイトにおいて嗅覚受容体であるＯＲ２ＡＴ４が発現し、そのアゴニストであるサンダロールがＯＲ２ＡＴ４に作用することにより、細胞内シグナルが惹起され、創傷治癒を促進することが報告されている（非特許文献２:J Investigative Dermatology (2014) vol. 134, p. 2823-2832）。さらには、ＯＲ２ＡＴ４が毛包の鞘細胞に発現しており、サンダロールの適用により毛髪伸長を引き起こすことが報告されている（特許文献１：特表２０１９－５１９５０２号公報、非特許文献３：Nat Commun. (2018) Sep 18;9(1):3624）。
特表２０１９－５１９５０２号公報
Nature (2014) volume 509, p. 622-626 Journal of Investigative Dermatology (2014) 134:2823-2832 Nat Commun. (2018) Sep 18; 9(1):3624 Neuron (2018)19:100(6):1401-1413 Science. 2018 May 04; 360(6388): 530-533. doi:10.1126/science.aar570 Sci Transl Med. （2018）10（462）eaat9892. doi: 10.1126/scitranslmed.aat9892
　本発明者らは、触覚に着目したスキンケアについて鋭意研究を行っており、メルケル細胞を活性化させる薬剤の取得を目的とする。
　また、従来メルケル細胞の活性は、メルケル細胞により発現される所定のタンパク質の量の変化を指標に評価されていた。しかしながら、所定のタンパク質の量は、数時間～数日といった比較的長い期間で変化するものであり、即時的な活性を評価することはできていなかった。また、そのようなタンパク質の量は、メルケル細胞の活性を間接的に測定しているにすぎなかった。そこで、本発明は、メルケル細胞において、脱分極の際の直接及び即時的な活性を測定することを目的とする。
　本発明者らは、皮膚において発現する嗅覚受容体であるＯＲ２ＡＴ４に着目し、ケラチノサイト以外の細胞種での存在を検討したところ、驚くべきことにメルケル細胞においてＯＲ２ＡＴ４が発現していることを見出した。さらに、ＯＲ２ＡＴ４のアゴニストであるサンダロールをメルケル細胞に適用することで、メルケル細胞が活性化することを見出し、本発明に至った。
　そこで本発明は下記に関する：
［Ａ１－１］　下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　［式中、
Ｒ1及びＲ2は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ1及びＲ2は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ3及びＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ3及びＲ4は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ5及びＲ6は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ5及びＲ6は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ5およびＲ6は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ7は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ8は、水素またはメチルである］
で表される化合物を含む、メルケル細胞の活性化剤。
［Ａ１－２］　メルケル細胞の活性化を介した痒み、皮膚掻痒症、アロネシス、及びアロディニアからなる群から選ばれる少なくとも１の症状の治療又は予防において使用するための、下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　［式中、
Ｒ1及びＲ2は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ1及びＲ2は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ3及びＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ3及びＲ4は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ5及びＲ6は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ5及びＲ6は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ5およびＲ6は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ7は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ8は、水素またはメチルである］
で表される化合物。
［Ａ１－３］　下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　［式中、
Ｒ1及びＲ2は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ1及びＲ2は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ3及びＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ3及びＲ4は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ5及びＲ6は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ5及びＲ6は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ5およびＲ6は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ7は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ8は、水素またはメチルである］
で表される化合物を投与することを含む、メルケル細胞の活性化を介した美容方法。
［Ａ１－４］　メルケル細胞の活性化を必要とする対象に下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　［式中、
Ｒ1及びＲ2は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ1及びＲ2は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ3及びＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ3及びＲ4は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ5及びＲ6は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ5及びＲ6は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ5およびＲ6は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ7は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ8は、水素またはメチルである］
で表される化合物を投与すること含む、メルケル細胞の活性化方法。
［Ａ１－５］　メルケル細胞活性化剤の製造のための、下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 　［式中、
Ｒ1及びＲ2は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ1及びＲ2は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ3及びＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ3及びＲ4は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ5及びＲ6は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ5及びＲ6は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ5およびＲ6は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ7は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ8は、水素またはメチルである］
で表される化合物の使用。
［Ａ２］　前記化合物が、サンダロール又はブラマノールである、項目Ａ１－１～Ａ１－５に記載の活性化剤、化合物、美容方法、活性化方法、又は使用。
［Ａ３］　触覚を増強する、項目Ａ１－１～Ａ１－５又はＡ２に記載の活性化剤、化合物、美容方法、活性化方法、又は使用。
［Ａ３－２］痒み、皮膚掻痒症、アロネシス、及びアロディニアからなる群から選ばれる少なくとも１の症状の治療、予防、又は軽減するための、項目Ａ１－１～Ａ１－５、Ａ２、又はＡ３のいずれか一項に記載の活性化剤、化合物、美容方法、活性化方法、又は使用。
［Ａ４－１］　下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　［式中、
Ｒ1及びＲ2は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ1及びＲ2は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ3及びＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ3及びＲ4は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ5及びＲ6は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ5及びＲ6は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ5およびＲ6は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ7は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ8は、水素またはメチルである］
で表される化合物を含む、メルケル細胞におけるシナプス小胞の増強剤。
［Ａ４－２］　メルケル細胞におけるシナプス小胞の増強を介した、痒み、皮膚掻痒症、アロネシス、及びアロディニアからなる群から選ばれる少なくとも１の症状の治療、予防又は軽減において使用するための、下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 　［式中、
Ｒ1及びＲ2は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ1及びＲ2は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ3及びＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ3及びＲ4は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ5及びＲ6は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ5及びＲ6は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ5およびＲ6は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ7は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ8は、水素またはメチルである］
で表される化合物。
［Ａ４－３］下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 　［式中、
Ｒ1及びＲ2は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ1及びＲ2は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ3及びＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ3及びＲ4は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ5及びＲ6は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ5及びＲ6は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ5およびＲ6は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ7は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ8は、水素またはメチルである］
で表される化合物を投与することを含む、メルケル細胞におけるシナプス小胞の増強を介した美容方法。
［Ａ４－４］　メルケル細胞におけるシナプス小胞の増強を必要とする対象に、下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 　［式中、
Ｒ1及びＲ2は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ1及びＲ2は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ3及びＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ3及びＲ4は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ5及びＲ6は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ5及びＲ6は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ5およびＲ6は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ7は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ8は、水素またはメチルである］
で表される化合物を投与することを含む、メルケル細胞におけるシナプス小胞の増強方法。
［Ａ４－５］　メルケル細胞におけるシナプス小胞の増強剤の製造のための、下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　［式中、
Ｒ1及びＲ2は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ1及びＲ2は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ3及びＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ3及びＲ4は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ5及びＲ6は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ5及びＲ6は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ5およびＲ6は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ7は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ8は、水素またはメチルである］
で表される化合物の使用。
［Ａ５］　前記化合物が、サンダロール又はブラマノールである、項目Ａ４－１～Ａ４－５に記載の増強剤、化合物、美容方法、増強方法、又は使用。
［Ａ６］　前記増強剤が、メルケル細胞－神経細胞間の神経伝達効率を向上させる、項目Ａ４－１～Ａ４－５又はＡ５に記載の増強剤、化合物、美容方法、増強方法、又は使用。
［Ａ７］　触覚を増強する、項目Ａ４－１～Ａ４－５、Ａ５、又はＡ６のいずれか一項に記載の増強剤、化合物、美容方法、増強方法、又は使用。
［Ａ８］　コラーゲン産生を増強する、項目Ａ４－１～Ａ４－５、又はＡ５～Ａ７のいずれか一項に記載の増強剤、化合物、美容方法、増強方法、又は使用。
［Ａ９］痒み、皮膚掻痒症、アロネシス、及びアロディニアからなる群から選ばれる少なくとも１の症状の治療、予防、又は軽減するための、項目Ａ４－１～Ａ４－５、又はＡ５～Ａ８のいずれか一項に記載の増強剤、化合物、美容方法、増強方法、又は使用。
　さらに、本発明者らは、スキンケア等で知覚できる触覚に着目し、メルケル細胞の励起により神経伝達物質を放出するメカニズムに対して鋭意研究を行ったところ、蛍光トレーサーを取り込ませたメルケル細胞について蛍光顕微鏡下で、脱分極刺激の前後における蛍光輝度値の変化を測定することで、メルケル細胞の神経伝達物質放出活性を評価できることを見出し、本発明に至った。
　そこで本発明は下記に関する：
［Ｂ１］
　皮膚試料におけるメルケル細胞の神経伝達物質放出活性の評価方法であって、
　神経伝達物質の蛍光トレーサーを含む培地中で皮膚試料を培養し；
　脱分極刺激を付与し；
　蛍光顕微鏡下で、脱分極刺激の前後におけるメルケル細胞の蛍光輝度値の変化を測定する
　を含む、前記評価方法。
［Ｂ２］　前記神経伝達物質の蛍光トレーサーが、モノアミン神経系伝達物質の蛍光トレーサーである、項目Ｂ１に記載の評価方法。
［Ｂ３］　前記皮膚試料が、ヒト皮膚試料である、項目Ｂ１又はＢ２に記載の評価方法。
［Ｂ４］　皮膚試料におけるメルケル細胞の神経伝達物質放出促進剤のスクリーニング方法であって、
　神経伝達物質の蛍光トレーサーを含む培地中で皮膚試料を培養し；
　神経伝達物質放出促進剤の候補物質を添加し；
　蛍光顕微鏡下で、添加前後のメルケル細胞の蛍光輝度値の変化を測定する
　を含む、前記スクリーニング方法。
［Ｂ５］　前記神経伝達物質の蛍光トレーサーが、モノアミン神経系伝達物質の蛍光トレーサーである、項目Ｂ４に記載のスクリーニング方法。
［Ｂ６］　前記皮膚試料が、ヒト皮膚試料である、項目Ｂ４又はＢ５に記載のスクリーニング方法。
［Ｂ７-１］　下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 　［式中、
Ｒ1及びＲ2は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ1及びＲ2は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ3及びＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ3及びＲ4は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ5及びＲ6は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ5及びＲ6は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ5およびＲ6は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ7は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ8は、水素またはメチルである］
で表される化合物を含む、メルケル細胞における神経伝達物質放出促進剤。
［Ｂ７-２］　メルケル細胞における神経伝達物質放出促進を介した、痒み、皮膚掻痒症、アロネシス、及びアロディニアからなる群から選ばれる少なくとも１の症状の治療又は予防において使用するための、下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 　［式中、
Ｒ1及びＲ2は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ1及びＲ2は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ3及びＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ3及びＲ4は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ5及びＲ6は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ5及びＲ6は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ5およびＲ6は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ7は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ8は、水素またはメチルである］
で表される化合物。
［Ｂ７-３］　下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 　［式中、
Ｒ1及びＲ2は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ1及びＲ2は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ3及びＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ3及びＲ4は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ5及びＲ6は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ5及びＲ6は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ5およびＲ6は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ7は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ8は、水素またはメチルである］
で表される化合物を投与することを含む、メルケル細胞における神経伝達物質放出促進を介した美容方法。
［Ｂ７-４］　メルケル細胞における神経伝達物質放出を必要とする対象に、下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 　［式中、
Ｒ1及びＲ2は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ1及びＲ2は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ3及びＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ3及びＲ4は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ5及びＲ6は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ5及びＲ6は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ5およびＲ6は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ7は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ8は、水素またはメチルである］
で表される化合物を投与することを含む、メルケル細胞における神経伝達物質放出促進方法。
［Ｂ７-５］　メルケル細胞における神経伝達物質放出促進剤の製造のための、下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 　［式中、
Ｒ1及びＲ2は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ1及びＲ2は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ3及びＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ3及びＲ4は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ5及びＲ6は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ5及びＲ6は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ5およびＲ6は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ7は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ8は、水素またはメチルである］
で表される化合物の使用。
［Ｂ８］　前記化合物が、サンダロール又はブラマノールである、項目Ｂ７－１～Ｂ７－５に記載の神経伝達物質放出促進剤、化合物、美容方法、促進方法、又は使用。
［Ｂ９］　触覚を増強する、項目Ｂ７－１～Ｂ７－５又はＢ８に記載の神経伝達物質放出促進剤、化合物、美容方法、促進方法、又は使用。
［Ｂ１０］　コラーゲン産生を増強する、項目Ｂ７－１～Ｂ７－５、Ｂ８又はＢ９のいずれか一項に記載の神経伝達物質放出促進剤、化合物、美容方法、促進方法、又は使用。
［Ｂ１１］痒み、皮膚掻痒症、アロネシス、及びアロディニアからなる群から選ばれる少なくとも１の症状の治療、予防、又は軽減するための、項目Ｂ７－１～Ｂ７－５、Ｂ８、Ｂ９又はＢ１０のいずれか一項に記載の神経伝達物質放出促進剤、化合物、美容方法、増強方法、又は使用。
　サンダロール及び／又はその類縁体を適用することで、メルケル細胞を活性化することが可能になる。メルケル細胞の活性化を介して、触覚に着目したスキンケアの提供が可能となる。
　また、メルケル細胞が脱分極した際の神経伝達物質放出活性を評価することが可能になる。かかる評価方法を利用し、神経伝達物質放出活性促進剤をスクリーニングすることが可能になる。さらに、サンダロール及びその類縁化合物が神経伝達物質放出活性促進剤としてスクリーニングされた。
図１は、メルケル細胞のマーカーであるＣＫ８とＯＲ２ＡＴ４とで皮膚試料を共染色し蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す。（Ａ）は頭皮試料において、（Ｂ）は腹部皮膚試料において、ＣＫ８とＯＲ２ＡＴ４とを共染色して撮影された写真を示す。 （Ｃ）グラフ左側は、頭皮試料における所定の領域中のＯＲ２ＡＴ４及びＣＫ８の二重陽性の細胞数を示す。グラフ右側は、頭皮試料におけるＣＫ８陽性細胞に対するＯＲ２ＡＴ４及びＣＫ８二重陽性の細胞の割合を示す。（Ｄ）グラフ左側は、腹部試料における所定の領域中のＯＲ２ＡＴ４及びＣＫ８の二重陽性の細胞数を示す。グラフ右側は、腹部試料におけるＣＫ８陽性細胞に対するＯＲ２ＡＴ４及びＣＫ８二重陽性の細胞の割合を示す。 図２は、メルケル細胞のマーカーであるＣＫ１８とＯＲ２ＡＴ４とで皮膚試料を共染色して蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す。（Ａ）は頭皮試料において、（Ｂ）は腹部皮膚試料において、ＣＫ１８とＯＲ２ＡＴ４とを共染色して撮影された写真を示す。 （Ｃ）グラフ左側は、頭皮試料における所定の領域中のＯＲ２ＡＴ４及びＣＫ１８の二重陽性の細胞数を示す。グラフ右側は、頭皮試料におけるＣＫ１８陽性細胞に対するＯＲ２ＡＴ４及びＣＫ１８二重陽性の細胞の割合を示す。（Ｄ）グラフ左側は、腹部試料における所定の領域中のＯＲ２ＡＴ４及びＣＫ１８の二重陽性の細胞数を示す。グラフ右側は、腹部試料におけるＣＫ１８陽性細胞に対するＯＲ２ＡＴ４及びＣＫ１８二重陽性の細胞の割合を示す。 図３は、メルケル細胞のマーカーであるＣＫ２０とＯＲ２ＡＴ４とで皮膚試料を共染色して蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す。（Ａ）は頭皮試料において、（Ｂ）は腹部皮膚試料において、ＣＫ２０とＯＲ２ＡＴ４とを共染色して撮影された写真を示す。 （Ｃ）グラフ左側は、頭皮試料における所定の領域中のＯＲ２ＡＴ４及びＣＫ２０の二重陽性の細胞数を示す。グラフ右側は、頭皮試料におけるＣＫ２０陽性細胞に対するＯＲ２ＡＴ４及びＣＫ２０二重陽性の細胞の割合を示す。（Ｄ）グラフ左側は、腹部試料における所定の領域中のＯＲ２ＡＴ４及びＣＫ２０の二重陽性の細胞数を示す。グラフ右側は、腹部試料におけるＣＫ２０陽性細胞に対するＯＲ２ＡＴ４及びＣＫ２０二重陽性の細胞の割合を示す。 図４は、サンダロールを適用した試料におけるピッコロを発現するＣＫ２０陽性細胞について蛍光顕微鏡下で撮影された写真を示す（図４Ａ：対照（ビヒクル）、図４Ｂ：サンダロール）。 図４Ｃは、蛍光顕微鏡下で撮影された写真において所定の領域中のピッコロを発現するＣＫ２０陽性細胞数を計測して示したグラフである。 図５Ａは、ｉＰＳ細胞由来感覚神経前駆細胞を示す。図５Ｂは、ｉＰＳ細胞由来感覚神経前駆細胞の培養上清液（馴化培地）を、線維芽細胞に添加した場合の、Ｉ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現量を、非馴化培地を線維芽細胞に添加した場合と比較した相対値で示す。エラーバーは平均値±ＳＤ、**は、対応のないｔ検定により統計的有意差があることを示す（**Ｐ＜０．０１）。 図６Ａは、試験物質（ラベンダーオイル：ＬＯ　０．００５％）で刺激したｉＰＳ細胞由来感覚神経前駆細胞の培地上清を線維芽細胞に添加した場合のＩ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現量を示す。図６Ｂは、上記試験物質が同じ濃度になるよう線維芽細胞に直接加えた場合のＩ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現量を示す。各図において、コラーゲン産生は、対照（試験物質無添加：対照）を１００％とした相対値で示す。エラーバーは平均値±ＳＤ、*は対応のないｔ検定により統計的有意差があることを示し（*Ｐ＜０．０５）、ｎ．ｓ．は統計的有意差がないことを示す。 図７は、図６Ｂの場合より高濃度（４倍）の試験物質（ラベンダーオイル：ＬＯ　０．０２％）を線維芽細胞に直接加えた場合のＩ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現量を示す。コラーゲン産生は、対照（試験物質無添加：対照）を１００％とした相対値で示す。エラーバーは平均値±ＳＤ、**は対応のないｔ検定により統計的有意差があることを示し（**ｐ＜０．０１）、ｎ．ｓ．は統計的有意差がないことを示す。 図８は、蛍光トレーサー（ＦＦＮ２０６）を取り込ませたメルケル細胞について、０、２００、４００、６００秒後の蛍光変化を示す写真である。図８Ａでは、３００秒時から６００秒時までサンダロール刺激を付与した際の蛍光変化を示し、図８Ｂでは、対照として、３００秒時から６００秒時までＢＳＳ溶液を還流した際の蛍光変化を示す。 図９は、１０分間の蛍光イメージングにおけるメルケル細胞の蛍光輝度値の変化を示すグラフである。５分（３００秒）の時点で、サンダロールが導入され、蛍光輝度値が減少した（黒丸）。対照として、５分（３００秒）の時点で、ＢＳＳ溶液の還流が行われた（白四角）。
　本発明は、サンダロール（３－メチル－５－（２，２，３－トリメチル－シクロペンタ－３－エン－１－イル）－ペンタン－２－オール［ＣＡＳ：６５１１３－９９－７］）、又はその類縁体を含むメルケル細胞の活性化剤に関する。サンダロールは下記の式により表される：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　サンダロールは、サンダルウッド様の香りを有する化合物として開発され、市販されている。サンダルウッドの香り成分は、主にサンタロールから構成され、さらにその立体異性体を含む。サンタロールにはα体及びβ体が知られている。その複雑な構造のため、サンタロールの合成は困難であり、より簡素な構造のサンダルウッド様の香りを有する香料が合成されており、サンダロールはその一種である。サンダロールは、嗅覚受容体の一つであるＯＲ２ＡＴ４のアゴニストとして作用する。ＯＲ２ＡＴ４のアゴニスト作用を有する化合物として、サンダロール又はその類縁体が挙げられる。ＯＲ２ＡＴ４のアゴニスト作用を有するサンダロール類縁体としては、一例としてブラマノール（２－メチル－４－（２，２，３－トリメチル－３－シクロペンテン－１－イル）－ブタン－１－オール［ＣＡＳ：７２０８９－０８－８］）が挙げられる（非特許文献２）。ブラマノールは下記の式により表される：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　ＯＲ２ＡＴ４のアゴニストとして作用するサンダロール又はその類縁体としては、一例として下記化合物が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　サンダロール又はその類縁体は、一例として下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 　［式中、
Ｒ1及びＲ2は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ1及びＲ2は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ3及びＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ3及びＲ4は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ5及びＲ6は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ5及びＲ6は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ5およびＲ6は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ7は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ8は、水素またはメチルである］
で表される化合物に関する。これらの化合物には光学異性体が含まれてもよい。これらの化合物は、サンダロールと同様に、ＯＲ２ＡＴ４のアゴニストとして作用しうる。さらに、これらの化合物は、サンダロールと同様に、メルケル細胞を活性化し、またメルケル細胞からの神経伝達物質の放出を促進する。
　メルケル細胞の活性化とは、メルケル細胞の増殖又は成熟の促進をいう。メルケル細胞はその成熟過程に応じて発現マーカーに変化が生じる。メルケル細胞マーカーとしては、ＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ２０が用いられるが、未分化状態ではＣＫ８を発現し、活性化されたメルケル細胞ではＣＫ１８及び成熟化状態でＣＫ２０を発現する（PLoS Genet (2016) Jul 14;12(7):e1006151.）。本発明のメルケル細胞の活性化剤を適用することにより、メルケル細胞を活性化することができる。具体的に、メルケル細胞活性化剤を適用することで、活性化されたメルケル細胞は、シナプス小胞に関わるタンパク質、例えばピッコロ（Ｐｉｃｃｏｌｏ）の発現が増大する。このようにメルケル細胞が活性化することで、シナプスへの神経伝達物質の放出が促進され、それにより触覚が増強される。
　本発明の別の態様では、サンダロール又はその類縁体を含む、メルケル細胞におけるシナプス小胞の増強剤に関する。サンダロール又はその類縁体を含むメルケル細胞におけるシナプス小胞の増強剤を適用することにより、メルケル細胞中のシナプス小胞数が増加する。シナプス小胞が増強されることにより、メルケル細胞－神経細胞間の神経伝達効率が向上し、触覚に関わる神経細胞が活性化する。真皮層に存在する神経細胞が活性化することで、真皮線維芽細胞におけるコラーゲン産生が増大する。したがって、本発明は、サンダロール又はその類縁体を含む、コラーゲン産生促進剤にも関する。本発明のさらに別の態様では、サンダロール又はその類縁体を含む、痒み、皮膚掻痒症、アロネシス、及びアロディニアからなる群から選ばれる少なくとも１の症状の治療、予防、又は軽減用の組成物に関していてもよい。
　本発明の別の態様では、サンダロール又はその類縁体を適用することを含む、インビトロ又はインビボにおいてメルケル細胞を活性化する方法、インビトロ又はインビボにおいてメルケル細胞からの神経伝達物質の放出を促進する方法にも関する。インビトロにおけるメルケル細胞を活性化する方法、インビトロにおけるメルケル細胞からの神経伝達物質の放出を促進する方法では、メルケル細胞を含む細胞群又は組織を、サンダロール又はその類縁体を含む溶液中で培養する工程を含む。インビボにおけるメルケル細胞を活性化する方法、インビボにおけるメルケル細胞からの神経伝達物質の放出を促進する方法は、任意の対象に対してサンダロール又はその類縁体を投与する工程を含む。インビボにおいてメルケル細胞を活性化することにより、痒み、皮膚掻痒症、アロネシス、及びアロディニアからなる群から選ばれる少なくとも１の症状の治療、予防、又は軽減することができる。したがって、本発明のメルケル細胞活性化剤、神経伝達物質の放出促進剤は、痒み、皮膚掻痒症、アロネシス、及びアロディニアからなる群から選ばれる少なくとも１の症状の治療、予防、又は軽減剤であってもよい。サンダロール又はその類縁体を投与する対象は、一例としてメルケル細胞の活性が低下している対象、触覚が鈍化している対象、コラーゲン産生が低下している対象、痒み、皮膚掻痒症、アロネシス、及びアロディニアからなる群から選ばれる少なくとも１の症状を患うか又はかかる症状の予防又は軽減を望む対象である。サンダロール又はその類縁体の投与は、経皮、経口、経粘膜、経鼻、静脈内、動脈内、皮下など任意の経路で投与することができるが、メルケル細胞に作用させる観点から経皮又は経粘膜投与が好ましい。経皮的にサンダロール又はその類縁体を投与する場合、任意の皮膚、例えば顔面、頭部、頸部、四肢、体幹の皮膚にサンダロール又はその類縁体を適用することができる。
　本発明のメルケル細胞活性化剤、シナプス小胞増強剤、及び/又は神経伝達物質放出促進剤は、それぞれ化粧料、医薬品又は医薬部外品に配合されてもよい。これらの薬剤は、経口、又は非経口、例えば経皮投与されてもよい。経皮投与される場合、皮膚外用剤に剤形することができる。皮膚外用剤は、皮膚に適用可能であれば特に限定されず、例えば、溶液状、乳化状、固形状、半固形状、粉末状、粉末分散状、水－油二層分離状、水－油－粉末三層分離状、軟膏状、ゲル状、エアゾール状、ムース状、スティック状等、任意の剤型が適用できる。皮膚外用剤に剤形される場合には、皮膚外用剤に通常用いられる基剤、及び賦形剤、例えば保存剤、乳化剤、ｐＨ調整剤などが用いられてもよい。化粧料に配合する場合、化粧水、乳液、美容液、クリーム、ローション、パック、エッセンス、ジェル等の顔用又は体用の化粧料や、ファンデーション、化粧下地、コンシーラー等のメーキャップ化粧料、さらには浴用剤などに配合することができる。本発明の成分を含む化粧品を用いることにより、メルケル細胞を活性化し、神経細胞の活性化及びそれに伴うコラーゲン産生促進をもたらす。コラーゲン産生の促進により、シワ、たるみの改善を目的とした化粧料に使用されてもよい。
　本発明のメルケル細胞活性化剤、シナプス小胞増強剤、及び/又は神経伝達物質放出促進剤は、所望の効果、例えばメルケル細胞活性化効果、シナプス増強効果、又はメルケル細胞からの神経伝達物質の放出促進効果を発揮させる観点又はコラーゲン産生を促進させる観点で任意に選択することができる。皮膚外用剤として配合する観点からは、サンダロール又はその類縁体を０．０００５％～０．５％で配合することができる。効果を十分に発揮させる観点から、好ましくは０．００１％以上で配合でき、さらに好ましくは０．００５％以上で配合することができる。強いにおいを避ける観点から、好ましくは０．１％以下で配合することができ、さらに好ましくは０．０５％以下で配合することができる。
　本発明は、皮膚試料におけるメルケル細胞の神経伝達物質放出活性の評価方法に関する。具体的には、かかる評価方法は、以下の工程：
　神経伝達物質の蛍光トレーサーを含む培地中で皮膚試料を培養し；
　脱分極刺激を付与し；
　蛍光顕微鏡下で、脱分極刺激の前後におけるメルケル細胞の蛍光輝度値の変化を測定する
　を含む。蛍光トレーサーを含む培地中で皮膚試料を培養する工程の後に、洗浄工程、又は培地の置換工程が行われてもよい。かかる方法は、灌流条件下で行われうる。かかる方法により、メルケル細胞の神経伝達物質放出活性を直接及び即時的に評価することが可能となる。
　メルケル細胞は、表皮最深部に存在する細胞であり、機械刺激の受容器としての機能を果たす。機械刺激によってメルケル細胞が興奮し、脱分極すると、シナプス間隙に神経伝達物質が分泌され、シナプスを介して知覚神経へとシグナルが伝達される。機械刺激の感知にはメルケル細胞のＰｉｅｚｏ２チャネルが関与していることが示唆されている。メルケル細胞はその成熟過程に応じて発現マーカーに変化が生じる。皮膚試料中のメルケル細胞の特定には、一例としてＱｕｉｎａｃｒｉｎｅやＦＭｄｙｅといったメルケル細胞に特異的に取り込まれる蛍光色素をマーカーとしてもよい。また、別の態様では、メルケル細胞に発現するタンパク質をマーカーとして検出してもよく、一例としてＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ２０からなる群から選ばれる少なくとも１つの細胞表面マーカーが使用されてもよい。
　皮膚試料とは、メルケル細胞を含む試料であればよく、メルケル細胞以外の細胞が含まれていてもよい。皮膚試料は、任意の動物由来であってよいが、化粧料や医薬品の開発の観点からはヒト由来が好ましい。メルケル細胞以外の細胞としては、表皮細胞や真皮細胞等の皮膚に含まれる細胞であってもよいし、神経細胞などの神経系の細胞が含まれていてもよい。皮膚試料としては、対象から取得された皮膚試料であってもよいし、培養物であってもよい。より好ましくは、表皮細胞や真皮細胞を培養し、３次元に構築された培養皮膚モデルを用いてもよい。
　神経伝達物質放出活性とは、メルケル細胞から放出される神経伝達物質の量により決定される。メルケル細胞は脱分極刺激を受けると、シナプス間隙へと神経伝達物質を放出することで、刺激が伝達される。シナプス間隙に放出された神経伝達物質の一部は、神経の受容体により受容されて神経の励起を引き起こす。また、シナプス間隙に放出された神経伝達物質の一部は、メルケル細胞に発現する受容体を介して再取り込みされる。メルケル細胞が放出する神経伝達物質としては、一例としてモノアミン神経系伝達物質が挙げられる。本発明では、神経伝達物質放出活性は、メルケル細胞に神経伝達物質の蛍光トレーサーを取り込ませて、脱分極時の細胞内の蛍光トレーサーの変化を測定することで決定される。神経伝達物質の蛍光トレーサーは、一例として培地中に１～５０μＭの濃度で溶解し、３０分～１２時間培養することでメルケル細胞に取り込まれる。蛍光トレーサーは、蛍光観察が可能である神経伝達物質のアナログを意味する。メルケル細胞への取り込み及びメルケル細胞からの放出を観察する観点から、一例としてＦＦＮ２０６（４－（２－アミノエチル）－７－（メチルアミノ）－２Ｈ－１－ベンゾピラン－２－オン　ジヒドロクロリド）（非特許文献４：Neuron (2018)19:100(6):1401-1413)やＦＦＮ５１１（（９－（２－アミノエチル）－２，３，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ－［１］－ベンゾピラノ［６，７，８－ｉｊ］キノリジン－１１－オン））が用いられる。
　脱分極時の細胞内の蛍光トレーサーについては蛍光顕微鏡下で試料を観察し、脱分極前の蛍光輝度値と脱分極刺激後の蛍光輝度値とを測定する。蛍光輝度値の測定は経時的に行われてもよい。経時的に計測される場合、蛍光は退色するため、退色を考慮して蛍光輝度値を補正してもよい。脱分極刺激後に蛍光トレーサーは、神経伝達物質と共にシナプス間隙へと放出されることから、細胞中の蛍光輝度値が減少する。蛍光輝度値は、細胞全体で測定してもよいし、シナプス付近の特定領域、例えばシナプス小胞の領域で決定されてもよい。
　脱分極刺激としては、機械刺激であってもよいし、薬物刺激であってもよい。メルケル細胞に対しプローブを適用することで機械刺激を付与しうる。細胞の変形が認められるまで機械刺激を付与しうる。薬物刺激は、脱分極を引き起こす薬剤を適用することで付与される。このような薬剤としては、サンダロール又はその類縁体が挙げられる。より具体的には、灌流条件下で、脱分極を引き起こす薬剤を含む培地を導入することで、脱分極刺激が付与されうる。
　本発明の別の態様では、メルケル細胞の神経伝達物質放出活性の評価方法を利用した、メルケル細胞の神経伝達物質放出促進剤のスクリーニング方法に関してもよい。かかるスクリーニング方法は、具体的に以下の工程：
　神経伝達物質の蛍光トレーサーを含む培地中で皮膚試料を培養し；
　神経伝達物質放出促進剤の候補物質を添加し；
　蛍光顕微鏡下で、添加前後のメルケル細胞の蛍光輝度値の変化を測定する
　を含む。かかるスクリーニング方法により、メルケル細胞において神経伝達物質放出を促進する神経伝達物質放出促進剤をスクリーニングすることができる。蛍光トレーサーを含む培地中で皮膚試料を培養する工程の後に、洗浄工程、又は培地の置換工程が行われてもよい。かかる方法は、灌流条件下で行われうる。蛍光輝度値が有意に減少した場合に、候補物質を、メルケル細胞の神経伝達物質放出促進剤として選択することができる。
　神経伝達物質放出促進剤の候補物質としては、化粧品素材ライブラリー、エキスライブラリー、医薬品ライブラリー、化合物ライブラリーなど任意のライブラリーに属する物質を使用することができる。神経伝達物質放出促進剤は、メルケル細胞の脱分極を誘導することができ、脱分極刺激剤、メルケル細胞活性化剤ともいうことができる。
　神経伝達物質放出促進剤は、メルケル細胞の脱分極を誘導し、メルケル細胞からの神経伝達物質放出を促進する。神経伝達物質の放出を促進することで、メルケル細胞－神経細胞間の神経伝達効率が向上し、触覚に関わる神経細胞が活性化する。また、別の観点では、神経伝達物質放出促進剤をより低い濃度で用いることで、メルケル細胞を脱分極しやすい状態、すなわちメルケル細胞を感作させることができ、メルケル細胞感作促進剤ともいうことができる。これにより、より弱い機械刺激でもメルケル細胞が活性化することになる。これにより、メルケル細胞－神経細胞間の神経伝達効率が向上し、触覚に関わる神経細胞が活性化する。真皮層に存在する神経細胞が活性化することで、真皮線維芽細胞におけるコラーゲン産生が増大する。したがって、本発明は、神経伝達物質放出促進剤を含む、コラーゲン産生促進剤にも関する。
　本発明の別の態様では、上述のスクリーニング方法により選択された神経伝達物質放出促進剤に関してもよい。具体的に、サンダロール及びその類縁体が、神経伝達物質放出促進剤としてスクリーニングされている。したがって、本発明は、サンダロール及びその類縁体からなる群から選ばれる少なくとも１を含む、神経伝達物質放出促進剤又はコラーゲン産生促進剤に関してもよい。
実施例１：頭皮試料及び腹部皮膚試料におけるメルケル細胞の分布
皮膚試料
　側頭部及び後頭部のヒト頭皮又は腹部皮膚を通常の美容整形又は形成外科を行った健常被験者（２０～６０歳：合計１３名）から取得し、インフォームドコンセント及び倫理承認（Ｍｕｅｎｓｔｅｒ大学）を得た後に用いた。ヒト頭皮は、３名の男性、３名の女性から取得し、腹部皮膚は６名の女性、１名の男性から取得した。
蛍光免疫組織化学染色
　頭皮試料及び腹部皮膚試料を４ｍｍの小片に切り分け、ＯＣＴに包埋し、液体窒素中で凍結させた。ＯＣＴ包埋試料をＬｅｉｃａ　ｃｒｙｏｓｔａｔで切片にした。一次抗体染色として、組織凍結切片を４％パラホルムアルデヒドで固定し、１０％ヤギ血清（ＯＲ２ＡＴ４用）又は５％ヤギ血清＋０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００でプレインキュベートを行い、そして対応する一次抗体の溶液中で４℃で一晩インキュベートを行った。二次抗体の溶液中で室温で４５分間インキュベートを行った。ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を用いて核を染色した。
　一次抗体として、抗ＯＲ２ＡＴ４抗体（販売元：Eurogentech、製品番号：custom made, 1910432）、抗ＣＫ８抗体（販売元：Progen、製品番号：GP-CK8）及び抗ＣＫ１８抗体（販売元：Progen、製品番号：GP-CK18）を用い、次いで二次抗体としてGoat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody（販売元：Invitrogen、製品番号：A-11008）、Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody（販売元：Invitrogen、製品番号：A-11030）、及びFluorescein (FITC) - conjugated AffiniPure Goat Anti Guinea Pig IgG (H+L)（販売元：Jackson ImmunoResearch、製品番号：106-095-003）を、それぞれ使用した一次抗体に合わせて用いた。核染色にはDAPI (販売元：Sigma-Aldrich、製品番号：10236276001)を用いた。
　ＯＲ２ＡＴ４とＣＫ８について共染色した結果を示した（図１Ａ：頭皮、図１Ｂ：腹部皮膚）、所定の領域中のＯＲ２ＡＴ４及びＣＫ８二重陽性の細胞数を計数した（図１Ｃ左、図１Ｄ左）、ＣＫ８陽性細胞数に対するＯＲ２ＡＴ４及びＣＫ８二重陽性の細胞数の割合を示した（図１Ｃ右、図１Ｄ右）。頭皮及び腹部皮膚の表皮において、ＣＫ８陽性の未熟メルケル細胞のうち約５０～６０％の細胞が、ＯＲ２ＡＴ４を発現した。
　ＯＲ２ＡＴ４とＣＫ１８について共染色した結果を示した（図２Ａ：頭皮、図２Ｂ：腹部皮膚）、所定の領域中のＯＲ２ＡＴ４及びＣＫ１８二重陽性の細胞数を計数した（図２Ｃ左、図２Ｄ左）、ＣＫ１８陽性細胞数に対するＯＲ２ＡＴ４及びＣＫ１８二重陽性の細胞数の割合を示した（図２Ｃ右、図２Ｄ右）。頭皮及び腹部皮膚の表皮において、ＣＫ１８陽性の中間成熟メルケル細胞のうち約５０％の細胞が、ＯＲ２ＡＴ４を発現した。
　ＯＲ２ＡＴ４とＣＫ２０について共染色した結果を示した（図３Ａ：頭皮、図３Ｂ：腹部皮膚）、所定の領域中のＯＲ２ＡＴ４及びＣＫ２０二重陽性の細胞数を計数した（図３Ｃ左、図３Ｄ左）、ＣＫ２０陽性細胞数に対するＯＲ２ＡＴ４及びＣＫ８二重陽性の細胞数の割合を示した（図３Ｃ右、図３Ｄ右）。
頭皮及び腹部皮膚の表皮において、ＣＫ２０陽性の成熟メルケル細胞のうち約７０～８５％の細胞が、ＯＲ２ＡＴ４を発現した。
定量的免疫組織形態計測
　染色強度を、明確に定義された参照領域においてＮＩＨ　ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ，　Ｂｅｔｈｅｓｄａ，　ＭＤ，　ＵＳＡ）を用いて、定量的（免疫）組織形態計測３１、３２により評価した。
実施例２：頭皮試料に対するサンダロール塗布によるピッコロ発現の変化
皮膚試料
　側頭部及び後頭部のヒト頭皮を通常の美容整形を行った健常女性被験者（４７～６０歳）から取得し、インフォームドコンセント及び倫理承認（Ｍｕｅｎｓｔｅｒ大学）を得た後に用いた。
蛍光免疫組織化学染色
　６０歳女性（ドナー１）、５５歳男性（ドナー２）、４７歳男性（ドナー３）、４０歳女性（ドナー４）、及び４０歳女性（ドナー５）の女性被験者の後頭部（ドナー１、２、３、４）又は側頭部（ドナー５）から、毛包を含む頭皮試料を６ｍｍパンチにより取得した。取得された試料を、２５ｎｇ／ｍｌＮＧＦ添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に配置し、３７℃５％ＣＯ2加湿雰囲気下で培養した（０日目）。１日目に、培地をサンダロール（５００μＭ）含有培地に置換した。対照として０．１％ＤＭＳＯ含有培地を用いた。３日目に試料を回収し、ＯＣＴに包埋し、液体窒素中で凍結させた。ＯＣＴ包埋試料をＬｅｉｃａ　ｃｒｙｏｓｔａｔで切片にした。一次抗体染色として、組織凍結切片を４％パラホルムアルデヒドで固定し、５％ヤギ血清＋０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００でプレインキュベートを行い、そして対応する一次抗体の溶液中で４℃で一晩インキュベートを行った。二次抗体の溶液中で室温で４５分間インキュベートを行った。ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を用いて核を染色した。
一次抗体として、抗ＣＫ２０抗体（販売元：Progen、製品番号：61054）及び抗ピッコロ抗体（販売元：Novus Biologicals (Tocris)、製品番号：NBP1-90250）を用い、次いで二次抗体としてGoat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody（販売元：Invitrogen、製品番号：A-11008）、Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody（販売元：Invitrogen、製品番号：A-11030）を、それぞれ使用した一次抗体に合わせて用いた。核染色にはDAPI (販売元：Sigma-Aldrich、製品番号：10236276001)を用いた。蛍光顕微鏡で撮影された写真を示す（図４Ａ：Ｖｅｈｉｃｌｅ　（対照）、図４Ｂ：サンダロール）。蛍光顕微鏡下で撮影された写真において所定の領域中のピッコロを発現するＣＫ２０陽性の細胞数を計数し、グラフ化して示した（図４Ｃ）。サンダロールは、ピッコロを発現するメルケル細胞数を増加させた。
実施例３：感覚神経細胞による線維芽細胞のＩ型コラーゲン産生促進作用
（１）感覚神経細胞の培養
　ヒトｉＰＳ細胞由来感覚神経前駆細胞（ｉ－ＳＮｓ，　ａｘ００５５，　Ａｘｏｌ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ）を製造元の説明書に沿って培養した（図５Ａ）。具体的には、これらの細胞をＳｕｒｅ－Ｂｏｎｄ　ＸＦ（ａｘ００５３）でコーティングした２４　ｗｅｌｌプレートにプレーティングし、２５ｎｇ／ｍＬ　ＧＤＮＦ、２５ｎｇ／ｍＬ　ＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍＬ　ＮＧＦ、及び１０ｎｇ／ｍＬ　ＮＴ－３を添加したＳｅｎｓｏｒｙ　Ｎｅｕｒｏｎ　Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＮＭＭ，　ａｘ００６０）にて培養した。培地の半量を３～４日毎に交換しつつ５週間培養し、感覚神経細胞に分化させた。５週間の培養後、培養液を収集し上清を得た。
（２）感覚神経細胞による刺激を与えた線維芽細胞におけるＩ型コラーゲン産生
（２－１）感覚神経細胞による刺激
　線維芽細胞は、インフォームドコンセント後に得た新生児包皮線維芽細胞を分離させ、１０％ウシ胎児血清を含有するダルベッコの改変イーグル培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｊａｐａｎ　Ｌｔｄ．、東京、日本）にて３７℃、９５％大気および５％ＣＯ2の加湿雰囲気中で２日間増殖させた。上記（１）の方法で得た培養液の上清（３００μｌ）を繊維芽細胞の培養液に１：１の割合で混合し、４時間培養し、下記（２－２）の方法によりコラーゲン産生を測定した。対照として、培養液の上清の代わりに上記に示したｉＰＳ細胞由来感覚神経前駆細胞用の培地を繊維芽細胞の培養液に１：１の割合で混合したものを用いた。
（２－２）定量的リアルタイムＰＣＲによるＩ型コラーゲン産生の測定
　血清飢餓後、神経細胞の培地上清の存在下または非存在下で４時間培養した線維芽細胞からＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（２５０）（ＱＩＡＧＥＮ　＃７４１０６）を用いて全ＲＮＡを単離した。定量的リアルタイムＰＣＲにより、Ｉ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現量を測定した。具体的には、ＴａｑＭａｎ　ＲＮＡ－ｔｏ－Ｃ　１Ｓｔｅｐ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　＃４３９２９３８）、ＴａｑＭａｎプローブおよびＩ型コラーゲンα１のプライマー（Ｈｓ００１６４００４，　Ｔａｑｍａｎ，　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。内部対照としてβアクチン（Ｈｓ０１０６０６６５）を用い、発現量はβアクチンに対し正規化して求めた。
　結果を図５Ｂに示す。神経細胞培養液の上清を添加した場合（馴化培地）、添加しない対照（対照）に比べて線維芽細胞のＩ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現量が有意に増加した。これにより、神経細胞に由来する成分が線維芽細胞のコラーゲンの産生を促進する作用があることが示唆される。
実施例４：各種物質の刺激による神経活性化を介するコラーゲン産生促進作用
　次に神経活性化を介して線維芽細胞のＩ型コラーゲンの産生を促進することを確認するために、神経を活性化させることが確認されたラベンダーオイルで刺激された神経細胞の培養上清を用い、Ｉ型コラーゲン産生を測定した。
（１）試験物質
　フランス　バイヤン社から購入したラベンダーオイル（Ｌａｖａｎｄｕｌａ　ｖｅｒａ　ＤＣ．の花を水蒸気蒸留して得られた酢酸リナリルを３０％以上含む精油）を使用した。また、試験物質として、ＴＲＰＶ１公知リガンドであるカプサイシン（Ｃａｐ）（シグマアルドリッチ）、シンナムアルデヒド（ＣＮＭ　１２５μＭ）（シグマアルドリッチ）も用いた。
（２）ヒトｉＰＳ細胞由来感覚神経前駆細胞の培養
　実施例４と同じ材料および方法で５週間以上培養した神経前駆細胞の上清の全量（６００μｌ）を回収し、上記（１）の試験物質を線維芽細胞を含む培地における最終濃度が０．００５％ラベンダーオイルとなるように添加して調製した培地５００μｌを再び神経前駆細胞に加え、１５分間インキュベーター内で静置した。同様に試験物質として、０．２５μＭカプサイシン（Ｃａｐ　０．２５μＭ）、シンナムアルデヒド（ＣＮＭ　１２５μＭ）を用いて同じ試験を行った。その後、試験物質を含む上清を回収し、ＤＭＥＭを加え、上清：ＤＭＥＭ＝１：３の割合で混合した。実施例４と同様の方法にて１２ウェルプレートで培養した線維芽細胞に、上記混合物を１ｍｌずつ適用し、４時間静置後ＲＮＡを回収した。対照として、上記試験物質を最終濃度が同じく０．００５％ラベンダーオイルとなるように調製したＤＭＥＭを作製し線維芽細胞に直接混合し、４時間静置後ＲＮＡを回収した。回収ＲＮＡについて実施例４と同様に定量的リアルタイムＰＣＲによるＩ型コラーゲンの測定を行った。
　結果を図６に示す。図６Ａに示すように、ラベンダーオイルで刺激したｉＰＳ細胞由来感覚神経前駆細胞の培養上清は、線維芽細胞のＩ型コラーゲン産生を促進する結果となった。しかしながら、図６Ｂのように、神経活性化を介さず同じ濃度のラベンダーオイルを直接線維芽細胞に添加した場合、有意なＩ型コラーゲン産生の促進は見られなかった。
実施例５：高濃度の試験物質の直接添加による影響
　実施例５の対象よりも高濃度の試験物質を用い直接添加による影響を調べた。具体的には、実施例５の試験物質を最終濃度が０．０２％ラベンダーオイルとなるように添加した以外は実施例５の対照実験と同じ方法により直接線維芽細胞に適用しコラーゲンの測定を行った。
　結果を図７に示す。図７に示すように、高濃度の試験物質では線維芽細胞のＩ型コラーゲン産生促進が見られた。しかしながら、その効果は低濃度では見られなかった（図６Ｂ）ことに鑑みると、線維芽細胞のＩ型コラーゲン産生がラベンダーオイルなどの神経活性化物質による神経活性化を介して促進されたことが示唆される。
実施例６：ヒト新鮮皮膚（ｅｘ　ｖｉｖｏ）におけるメルケル細胞による神経伝達物質の放出
試料の調製
　美容整形を行った４２歳の女性健常被験者及び４８歳性健常被験者の腹部から切除された新鮮皮膚を取得し、インフォームドコンセント及び倫理承認を得た後、切除後５日以内に実験に用いた。２５ｕｎｉｔｓ／ｍｌディスパーゼ－ＰＢＳ溶液に１５分３７℃で皮膚を晒し、表皮を剥離した。
　ヒト新鮮皮膚から剥離した表皮を、ＦＦＮ２０６（Ｔｏｃｒｉｓ社、Ｃａｔａｌｏｇ　Ｎｏ．　５０４３）を含有する高カリウム細胞外溶液（５ｍＭのＮａＣｌ、１４０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ　Ｄ－グルコース、２ｍＭ　ＭｇＣｌ2、及び２ｍＭ　ＣａＣｌ2）中で３０分間培養し、蛍光標識神経伝達物質ＦＦＮ２０６をメルケル細胞に特異的に取り込ませた。
　還流条件でＦＦＮ２０６を取り込ませたメルケル細胞を含む表皮について、１０分間ＦＦＮ２０６シグナルの観察を行った。初めの５分間はベースラインとしてＢＳＳ（Ｂａｌａｎｃｅｄ　ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）溶液（１４０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ　Ｄ－グルコース、２ｍＭ　ＭｇＣｌ2、及び２ｍＭ　ＣａＣｌ2）を還流した。５分後（３００ｓ後）から観察終了（６００ｓ）まで、５００μＭ　サンダロール（Ｇｉｖａｕｄａｎ社）／ＢＳＳ溶液を還流した（Ａ）。対照として、５分後（３００ｓ後）から観察終了（６００ｓ）までＢＳＳ溶液を還流した。輝度値データはＦｌｕｏｖｉｅｗ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）により取得した。
　ｃｅｌｌＳｅｎｓ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）、ＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）をＦＦＮ２０６の輝度値による細胞応答評価に用いた。ＦＦＮ２０６シグナルに沿ってＲＯＩを作成し、ＲＯＩ内の平均輝度値の時間変化を評価した。各ＲＯＩでベースラインの輝度値変化を非線形近似により求め、ベースラインの近似結果に基づいて退色の影響を排除した輝度値を求めた。ベースライン３００ｓの平均輝度値を各タイムポイントの輝度値から除することにより、正規化した輝度値（％）を算出した。細胞応答評価の指標として、サンダロール刺激時（３００ｓ以降）以降に、正規化された輝度値が各ＲＯＩのベースラインの平均値から３Ｓ．Ｄ．以上低下したものとした（図８Ａ）。一方、対照では、５分後のＢＳＳ溶液還流による輝度値の低下は見られなかった（図８Ｂ）。
　５００μＭ　サンダロール刺激によるＦＦＮ２０６の放出を確認するために、１０分間ライブセルイメージングを行いＦＦＮ２０６シグナルの輝度値を観察した。その結果、サンダロール刺激に対してメルケル細胞が反応していることが分かった（図８及び図９）。図８及び図９では３００ｓ時点のＳａｎｄａｌｏｒｅ刺激流入後にベースラインから算出した反応ラインを超えて輝度値が低下し続けていることがわかる。図８（Ａ）ではマウス表皮内での輝度値変化を示しており、Ｓａｎｄａｌｏｒｅはメルケル細胞に発現するＯＲ２ＡＴ４を介してメルケル細胞を活性化し、神経伝達物質の放出を促進することが観察された。

Claims (18)

  1. 　下記の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　［式中、
    Ｒ１及びＲ２は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ１及びＲ２は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
    Ｒ３及びＲ４は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ３及びＲ４は、一緒に二重結合を形成し；
    Ｒ５及びＲ６は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ５及びＲ６は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ５およびＲ６は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
    Ｒ７は、メチルまたはエチルであり；
    Ｒ８は、水素またはメチルである］
    で表される化合物を含む、メルケル細胞の活性化剤。
  2. 　前記化合物が、サンダロール又はブラマノールである、請求項１に記載の活性化剤。
  3. 　触覚を増強する、請求項１又は２に記載の活性化剤。
  4. 　下記の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　［式中、
    Ｒ１及びＲ２は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ１及びＲ２は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
    Ｒ３及びＲ４は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ３及びＲ４は、一緒に二重結合を形成し；
    Ｒ５及びＲ６は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ５及びＲ６は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ５およびＲ６は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
    Ｒ７は、メチルまたはエチルであり；
    Ｒ８は、水素またはメチルである］
    で表される化合物を含む、メルケル細胞におけるシナプス小胞の増強剤。
  5. 　前記化合物が、サンダロール又はブラマノールである、請求項４に記載の増強剤。
  6. 　前記増強剤が、メルケル細胞－神経細胞間の神経伝達効率を向上させる、請求項４又は５に記載の増強剤。
  7. 　触覚を増強する、請求項４～６のいずれか一項に記載の増強剤。
  8. 　コラーゲン産生を増強する、請求項４～７のいずれか一項に記載の増強剤。
  9. 　皮膚試料におけるメルケル細胞の神経伝達物質放出活性の評価方法であって、
    　神経伝達物質の蛍光トレーサーを含む培地中で皮膚試料を培養し；
    　脱分極刺激を付与し；
    　蛍光顕微鏡下で、脱分極刺激の前後におけるメルケル細胞の蛍光輝度値の変化を測定する
    　を含む、前記評価方法。
  10. 　前記神経伝達物質の蛍光トレーサーが、モノアミン神経系伝達物質の蛍光トレーサーである、請求項９に記載の評価方法。
  11. 　前記皮膚試料が、ヒト皮膚試料である、請求項９又は１０に記載の評価方法。
  12. 　皮膚試料におけるメルケル細胞の神経伝達物質放出促進剤のスクリーニング方法であって、
    　神経伝達物質の蛍光トレーサーを含む培地中で皮膚試料を培養し；
    　神経伝達物質放出促進剤の候補物質を添加し；
    　蛍光顕微鏡下で、添加前後のメルケル細胞の蛍光輝度値の変化を測定する
    　を含む、前記スクリーニング方法。
  13. 　前記神経伝達物質の蛍光トレーサーが、モノアミン神経系伝達物質の蛍光トレーサーである、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
  14. 　前記皮膚試料が、ヒト皮膚試料である、請求項１２又は１３に記載のスクリーニング方法。
  15. 　下記の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　［式中、
    Ｒ１及びＲ２は、一緒に二重結合を形成するか、またはＲ１及びＲ２は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
    Ｒ３及びＲ４は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ３及びＲ４は、一緒に二重結合を形成し；
    Ｒ５及びＲ６は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択されるか、またはＲ５及びＲ６は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ５およびＲ６は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
    Ｒ７は、メチルまたはエチルであり；
    Ｒ８は、水素またはメチルである］
    で表される化合物を含む、メルケル細胞における神経伝達物質放出促進剤。
  16. 　前記化合物が、サンダロール又はブラマノールである、請求項１５に記載の神経伝達物質放出促進剤。
  17. 　触覚を増強する、請求項１５又は１６に記載の神経伝達物質放出促進剤。
  18. 　コラーゲン産生を増強する、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の神経伝達物質放出促進剤。
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