BR112021015826A2 - Composição cosmética - Google Patents

Abstract

composição cosmética. a presente invenção refere-se a métodos não terapêuticos de melhoramento de um humor do indivíduo e de tratamento de pele sensível.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO COSMÉTICA".

[001] A presente invenção refere-se a composições cosméticas com- preendendo um extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico.

[002] Sensibilidade da pele (também chamada "comichão na pele", "pele reativa", "desconforto na pele", "sensação de pele esticada)" é uma condição típica em que um conjunto de fatores de estresse dispara uma cascata de reações biológicas, finalmente levando a inflamação e ver- melhidão, frequentemente emparelhadas com sensações de pontadas e coceiras. As principais causas de pele sensível são predisposições ge- néticas, fatores hormonais, envelhecimento e fatores exógenos. A mi- crobiota da pele também tem um impacto no estado de sensibilidade da pele por disparo do sistema imune da pele. Uma perda típica de diversi- dade microbiota é observada em condições de pele relacionadas a sen- sibilidade.

[003] Pele sensível é submetida a uma barreira de pele alterada, per- mitindo penetração de várias substâncias e patógenos oportunistas, assim resultando na ativação do sistema imune e recrutamento de células imu- nes. Então, a liberação de citocinas levará a vermelhidão e inflamação vi- síveis.

[004] No longo prazo, indivíduos com pele sensível podem sofrer de inflamação crônica. Isso leva a um sistema de defesa exausto que afetará não apenas a pele, mas o bem-estar do indivíduo no geral.

[005] Desconforto na pele pode impactar o humor do indivíduo, influ- encia sua autoconfiança, e aumenta suas dificuldades em um contexto so- cial devido a essa sensação da pele negativa persistente e aparência.

[006] É, portanto, desejável aperfeiçoar o humor de uma pessoa que sofre de pele sensível.

[007] É anteriormente desejável prover cuidado de pele eficaz para pele sensível.

[008] Surpreendentemente, agora verificou-se que, por aplicação de um extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico a uma pele do indiví- duo, o dito humor do indivíduo é significativamente aperfeiçoado.

[009] Portanto, em um primeiro aspecto, a presente invenção provê um método não terapêutico de melhoramento de um humor do indivíduo, compreendendo a etapa de aplicação de uma composição cosmética com- preendendo um extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico à pele do indivíduo.

[0010] Anteriormente verificou-se que a aplicação de um extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico a pele sensível tem um efeito posi- tivo sobre a condição da pele. Em particular, é capaz de amaciar e confor- tar a pele.

[0011] Portanto, em um segundo aspecto, a presente invenção provê um método não terapêutico de tratamento de pele sensível, compreen- dendo a etapa de aplicação de uma composição cosmética compreen- dendo um extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico à pele.

[0012] Em particular, verificou-se que foi possível reduzir vermelhidão em pele sensível por aplicação da composição cosmética compreendendo o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico à pele.

[0013] Anteriormente verificou-se que foi possível alcamar pele sensí- vel por aplicação da composição cosmética compreendendo o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico à pele.

[0014] Ainda anteriormente verificou-se que foi possível reduzir infla-

mação na pele sensível por aplicação da composição cosmética compre- endendo o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico à pele.

[0015] Ainda anteriormente verificou-se que foi possível melhorar a composição da microbiata da pele em pele sensível por aplicação da com- posição cosmética compreendendo o extrato de Phaeodactylum tricornu- tum hidrofílico à pele.

[0016] O extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico é também capaz de proteger a matriz extra-celular contra inflamação crônica através de regulação epigenética.

[0017] Vantajosamente, a composição cosmética compreendendo o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico é aplicada a pele facial.

[0018] Phaeodactylum tricornutum é uma microalga. Vinda da classe dominante de fitoplâncton marinho, as diatomáceas, esta microalga é en- contrada em águas marinhas costeiras ou salgadas em zonas temperadas, e tem plastos (plasts) marrons, amarelos ou verde-amarelos. Phaeodac- tylum tricornutum é uma diatomácea penada e produz morfos ovais, fusi- formes e trirradiados após as mudanças no meio de cultura, luz e tempe- ratura. O morfotipo fusiforme é o mais comum na cultura. O tamanho das células é cerca de 20-25 µm de comprimento e de 4-5 µm de largura. As células são principalmente solitárias ou ocasionalmente ligadas em pares. Phaeodactylum tricornutum é amplamente usado na aquacultura de crus- táceo e molusco porque tem um alto teor de ácidos graxos poliinsaturados, especialmente ácido eicosapentaenoico.

[0019] O uso de um extrato de Phaeodactylum tricornutum como um agente cosmético foi anteriormente descrito na US 2004/0136945 A1. O produto respectivo é atualmente vendido sob o nome comercial Megas- sane® por Givaudan. No entanto, em contraste com a presente invenção, a US 2004/0136945 A1 refere-se a um extrato lipofílico (ou oleoso) de

Phaeodactylum tricornutum. Uma comparação detalhada dos extratos lipo- fílico e hidrofílico é provida nos exemplos 14 e 15 abaixo. Em particular, eles têm uma composição totalmente diferente, e o extrato lipofílico não exige qualquer atividade anti-inflamatória.

[0020] Em uma concretização da invenção, o extrato de Phaeodac- tylum tricornutum hidrofílico usado na composição cosmética da presente invenção é um extrato aquoso de Phaeodactylum tricornutum.

[0021] Em uma concretização da invenção, a composição cosmética compreende de 0,1 a 10% v/v do extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico, mais de preferência de 0,5 a 5% v/v, e com mais preferência de 1 a 3% v/v.

[0022] Tipicamente, a composição cosmética usada nos métodos da presente invenção anteriormente compreende um excipiente cosmetica- mente aceitável.

[0023] Composições cosméticas, e em particular composições de cui- dado da pele, da presente invenção podem conter um ou mais excipientes cosmeticamente aceitáveis. Quaisquer excipientes comumente usados na preparação de preparações cosméticas para o uso na pele humana podem ser empregados na presente invenção. Excipientes adequados incluem, mas não são limitados a ingredientes que podem influenciar propriedades organolépticas não são limitados a ingredientes que podem influenciar as propriedades organolépticas, penetração da pele, e a biodisponibilidade do extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico. Mais especificamente, e- les incluem líquidos, Tais como água, óleos ou ingredientes tensoativos, incluindo aqueles de petróleo, animal, planta ou de origem sintética, tais como e não restritos a, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral óleo de gergelim, óleo de rícino, polissorbatos, ésteres de sorbitano, sulfatos de éter, sulfatos, betaínas, glicosídeos, maltosídeos, álcoois graxos, nonoxi- nóis, poloxâmeros, polioxietilenos, polietileno glicóis, dextrose, glicerol, di- gitonina, e semelhantes.

[0024] A formulação para aplicação tópica à pele pode tomar qualquer forma. Por exemplo, a composição cosmética, e em particular a composi- ção de cuidado da pele, pode estar na forma de uma composição de lipos- soma, lipossomas mistos, oleossomas, niossomas, etosomas, milipartícu- las, micropartículas, nanopartículas e nanopartículas de lipídeo sólido, ve- sículas, micelas, micelas mistas de ingredientes tensoativos, micelas mis- tas de tensoingrediente ativo - fosfolipídeo, miliesferas, microesferas e na- noesferas, lipoesferas, milicápsulas, microcápsulas e nanocápsulas, bem como microemulsões e nanoemulsões, que podem ser adicionados para conseguir uma maior penetração do extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico.

[0025] A composição cosmética, e em particular a composição de cui- dado da pele, pode ser produzida em qualquer forma sólida, líquida ou se- missólida para a aplicação à pele topicamente ou por aplicação transdér- mica. Assim, essas preparações de aplicação tópica ou transdérmica in- cluem, mas não são restritas a, cremes, múltiplas emulsões, tais como não restritas a, óleo e/ou silicone em emulsões aquosas, emulsões de água em óleo e/ou silicone, emulsões de tipo água/óleo/água ou água/silicone/ á- gua, e emulsões de tipo óleo/água/óleo ou silicone/água/silicone, micro- emulsões, emulsões e/ou soluções, cristais líquidos, composições anidra, dispersões aquosas, óleos, leites, bálsamos, espumas, loções aquosas ou oleosas, géis aquosos ou oleosos, creme, soluções hidro-alcoólicas, solu- ções hidro-glicólicas, hidrogéis, linimentos, soros, sabonetes, máscara fa- cial, seruns, películas de polissacarídeo, pomadas, mousses, pomadas,

pastas, pós, barras, lápis e sprays ou aerossóis (sprays), incluindo formu- lações com enxague ou sem enxague.

[0026] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de um extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico para o melhoramento de um humor do indivíduo.

[0027] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de um extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico para o tratamento de pele sensível.

[0028] Os efeitos de uma composição cosmética compreendendo um extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico em indivíduos tendo pele sensível foram investigados no curso de um estudo clínico de longo prazo acima de 28 dias (para detalhes, vide os exemplos abaixo). Durante esse tempo, os indivíduos aplicaram um creme facial contendo um extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico duas vezes por dia a sua pele facial. As condições de humor do indivíduo e pele facial foram avaliadas antes e depois dos 28 dias.

[0029] Influência no humor foi medida usando duas técnicas não ver- bais: Mood Portraits® e avaliação de comunicação verbal de acordo com Emotion Decoding System®.

[0030] O método de Mood Portraits® usa imagens para medir respos- tas emocionais e de humor do consumidor. Foi descrito para uma diferente finalidade em Churchill e outros: "Comparison of methods used to study consumer emotions associated com fragrância", Food Quality and Prefe- rence, 21 (2010), 1108–1113. Em contraste com isso estudo anterior, que lida com a influência instantânea de uma fragrância cheirada por um indi- víduo, a presente invenção é com base em um estudo de longo prazo.

[0031] O método de Mood Portraits® é capaz de eliciar resposta es- pontânea dos consumidores, superando a barreira de uso de palavras ou escalas. Foi provado como sendo mais discriminatória do que o humor pa- drão atribuem métodos de escala. O método fornece um perfil de humor confiável para cada produto testado e provê percepções sobre como con- sumidores respondem a diferentes produtos e as emoções eles evocam.

[0032] Uma descrição detalhada de como Mood Portraits® foi usado para a avaliação dos efeitos da composição cosmética compreendendo um extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico usado nos métodos da presente invenção é descrito no exemplo 3. Nesse estudo, um melhora- mento significa ingrediente ativo em comparação com a condição de par- tida foi demonstrada, com uma diminuição de humor ingrediente ativo e um aumento de confidência quando da aplicação do creme facial contendo ex- trato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico.

[0033] Emotion Decoding System® (Tcherkassof e outros: "Facial ex- pressions of emotions: A methodological contribution to the study of spon- taneous and dynamic emotional faces", European Journal of Social Psy- chology, 2007, 37, 1325-1345; and Mehrabian e outros: "Decoding of In- consistent Communications", Journal of Personality and Social Psychology, 1967, 6, 108-114), por outro lado, é um método desenvolvido por Marina Cavassilas, PhD in Linguistics and expert in non-verbal communication. Envolve a análise de acima de 200 reações não verbais, incluindo reações faciais, posturas, gestos e voz.

[0034] O estudo é descrito em detalhes no exemplo 4.

[0035] A análise de comunicação não verbal demonstrou um claro me- lhoramento da felicidade e força moral dos indivíduos para aqueles que usam o ingrediente ativo, enquanto aqueles que usam placebo mostraram um comportamento emocional neutro tantas emoções positivas e negati- vas.

[0036] Na conclusão, a composição cosmética compreendendo um ex- trato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico demonstrou significativa- mente evocar emoções positivas e emoções negativas. Em particular, foi capaz de evocar as emoções Confident, Invigorated, Sensuality, and Pro- tection. O placebo, por outro lado, não evocou qualquer uma daquelas e- moções.

[0037] Efeitos sobre a pele sensível foram avaliados por meio de vários estudos in vitro, ex vivo, e clínicos descritos em mais detalhes nos exem- plos abaixo.

[0038] Usando-se análise transcriptômico, foi demonstrado que o ex- trato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico tem propriedades anti-infla- matórias. De fato, uma modulação significativa de expressão de gene en- volvido na inflamação e calmante de pele foi encontrado.

[0039] Usando um modelo de irritação ex vivo, foi confirmado que o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico é eficiente contra pele sensível, que está relacionado a problemas tais como infiltração de células imunes, secreção de citocina que levam a inflamação.

[0040] O extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico também le- vou a uma inibição significativa de transmigração de monócito através do endotélio com um efeito dependente de dose.

[0041] Usando-se um modelo de pele sensível, foi demonstrado que aplicação tópica de extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico a uma concentração de 3% v/v reduziu uma redução significativa em recruta- mento de célula imune, diminuiu o receptor de dor TRPV1, e inibiu a pro- dução de cintocina pró-inflamatória (IL8).

[0042] Além disso, foi evidenciado que extrato de Phaeodactylum tri- cornutum hidrofílico é capaz de significativamente melhorar a produção de beta-defensina, que está envolvida na defesa antimicrobiana.

[0043] Na conclusão, verificou-se que, através de regulação genética e epigenética, extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico age: redução do recrutamento de célula imune, redução dos mediadores pró-inflamatórios (redução de IL8), diminuição da sensação de dor (TRPV1), aumento da defesa antimicrobiana da pele, e reequilibração e proteção de microbiota da pele.

[0044] Em um estudo clínico, a reatividade de pele a capsaicina foi tes- tada depois de 28 dias de tratamento com o extrato de Phaeodactylum tri- cornutum hidrofílico a uma concentração de 3%. Os resultados mostraram um melhoramento significativo de reatividade de pele a capsaicina em comparação com placebo.

[0045] Em um outro estudo clínico, verificou-se que o extrato de Phae- odactylum tricornutum hidrofílico age sobre a microbiota da pele para pro- teger e melhorar sua composição, reequilibrando seu equilíbrio da pele sensível a condições de pele normal.

[0046] A presente invenção é anteriormente ilustrada por meio dos se- guintes exemplos não limitantes: Exemplo 1: Preparação de o extrato Phaeodactylum tricornutum hidrofílico

[0047] 505,86 g de biomassa congelada de Phaeodactylum tricornu- tum (ex NECTON (Portugal), MICROPHYT (França) ou INNOVALG (França); matéria seca >15%) foi adicionado a 979 g de água. A solução foi agitada com um agitador magnético e foi aquecida para 50°C. Então, o pH foi ajustado para 4,5 com ácido sulfúrico (0,99 g) e 1,1 g de enzima (celluclast 1,5L de Novozymes) foram adicionados a mistura. Depois de duas horas de hidrólise, a enzima foi inativada por aquecimento da solução para 90°C por 10 minutos. Depois do resfriamento, o pH foi trazido para 5 com hidróxido de sódio (1,25 g). A solução foi então centrifugada por 20 minutos a 4500 rpm e o sobrenadante foi filtrado sobre placas de celulose que variam de 1,5 μm a 0,3 μm. A solução foi então filtrada sobre placas de carvão vegetal ativado para desordorizar o produto antes da filtração de esterilização final. No fim do processo, o extrato foi estabilizado por adição de 3% de Minasolve Green B (preservingrediente ativo oriundo de Mina- solve; mistura de pentileno glicol, benzoato de sódio, ácido benzoico e á- gua). Exemplo 2: Preparação de Composições de cuidado da pele Compreen- dendo o extrato Phaeodactylum tricornutum hidrofílico

[0048] Para os estudos in vitro, as seguintes composições foram pre- paradas:

[0049] Análise epigenética e transcriptômica (exemplos 5 e 6):

[0050] O extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico do exemplo 1 foi diluído a 3% v/v em meio de cultura (meio de basal ceratinócito basal (KBM)).

[0051] Transmigração de célula imune (exemplo 9): O extrato de Phae- odactylum tricornutum hidrofílico do exemplo 1 foi diluído a diferentes con- centrações (% v/v) no meio de cultura (Meio de crescimento endotelial (EGM)).

[0052] Para os estudos ex vivo, as seguintes composições foram pre- paradas:

[0053] Modelo de pele irritada (exemplo 7): O extrato de Phaeodac- tylum tricornutum hidrofílico do exemplo 1 foi diluído a 1% e 3% v/v, res- pectivamente, na solução salina tamponada por fosfato (PBS).

[0054] TRPV1, liberação de IL8, Infiltração de célula imune (CD1a) (e- xemplo 8): O extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico do exemplo 1 foi diluído a 3% v/v em solução salina tamponada por fosfato (PBS).

[0055] Produção de β-defensina-2 (exemplo 10): O extrato de Phaeo- dactylum tricornutum hidrofílico do exemplo 1 foi diluído a 3% v/v na solu- ção salina tamponada por fosfato (PBS).

[0056] Para os estudos clínicos (exemplos 3, 4, 11, e 12), a seguinte composição foi preparada:

[0057] Fórmula cremosa com 3% v/v do extrato de Phaeodactylum tri- cornutum hidrofílico do exemplo 1, tendo a seguinte composição: Nome de INCI % AQUA/ÁGUA 89,7 ÁLCOOL CETÍLICO, GLICERIL ESTEARATO, PEG-75 5,0 ESTEARATO, CETETH-20, ESTEARATO-20 ISODECIL NEOPENTANOATO 4,5 EXTRATO DE PHAEODACTYLUM TRICORNUTUM 3,0 FENOXIETANOL, METIL PARABENO, PROPIL PARABENO, ETIL 0,4

PARABENO DIMETICONA 0,3 FRAGRÂNCIA, HEXIL CINAMAL, BUTILFENIL METILPROPIONAL, 0,1 CITRONELOL, ALFA ISOMETIL IONONA, HIDROXI-ISOEXIL 3-

CICLOEXENO CARBOXALDEÍDO Exemplo 3: Teste de Mood Portraits® Materiais e Método

[0058] Estudo clínico de 28 dias em 42 voluntários femininas tendo pele sensível (idade de 18-50).

[0059] Todos os participantes completaram o teste de Mood Portraits® no Dia 0 (linha de bases) e Dia 28 (pós-uso) antes de começar os testes clínicos descritos nos exemplos 11, 12 e 13 abaixo.

[0060] Participantes foram aleatoriamente distribuídos a 2 grupos: In- grediente ativo (3% v/v de extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico em uma formulação cremosa de pele) vs. placebo (formulação cremosa de pele sem de extrato de Phaeodactylum tricornutum); produtos anonimisa- dos foram aplicados duas vezes diariamente, na manhã e à noite, por par- ticipantes.

[0061] Comparações de humores (percentagens de imagens selecio- nadas) foram calculadas para cada condição de teste (linha de bases = D0; ingrediente ativo; placebo).

[0062] Em ambos os pontos de tempo, a participantes foram pedidos para pensar em sua pele, em particular sua pele facial, e para selecionar as imagens que melhor corresponderam às emoções que vieram a sua mente.

[0063] Os resultados para linha de bases (dia 0), ingrediente ativo no dia 28, e placebo no dia 28 são mostrados nas seguintes Figuras: Visão geral Imagens de topo Dia 0 Figura 1 Figura 2 Dia 28 (ingrediente Figura 3 Figura 4 ativo) Dia 28 (placebo) Figura 5 Figura 6

[0064] Os efeitos são sumarizados na Figura 7.

[0065] Dia 0 resultados mostram que participantes tinham resposta e- mocional muito negativa quando pensando sobre sua pele facial. Esses resultados confirmam que tendo um desconforto e pele sensível tem um real impacto sobre um humor do indivíduo.

[0066] No Dia 28, participantes têm uma resposta emocional significa- tivamente mais positiva quando pensando sobre sua pele facial; com o grupo ingrediente ativo evocando respostas de humor mais significativas positivas.

[0067] 50% de participantes selecionados de imagens negativas em respostas a como eles sentiam sobre sua pele no dia Dia 0 vs. 6% para o ingrediente ativo e 13% para o placebo no Dia 28.

[0068] Imagens de topo para Ingrediente ativo e Placebo são similares; isso reflete o efeito de placebo quando da realização de uma experiência clínica de cuidado da pele. No entanto, o gráfico de perfil de humor indivi- dual de indicou mais efeitos de humor significativos positivos do que o pla- cebo.

[0069] Humores revigorados, fortalecidos e confiantes foram significa- mente evocados no grupo de ingrediente ativo vs não significamente evo- cados no grupo de placebo.

[0070] Humor negativo foi significativamente não evocado no grupo de ingrediente ativo, indicando uma mudança positiva em como eles sentiam sobre sua pele facial desde Dia 0. Exemplo 4: Emotion Decoding System®

[0071] Estudo clínico de 28 dias em 40 voluntárias femininas (idade de 18-50) tendo pele sensível.

[0072] Uma entrevista individual face a face foi conduzida, de 5-10 mi- nutos cada pessoa, como um teste cego, monádico sequencial. Reações não verbais foram coletadas e decodificadas de vídeos por Marina Cavas- silas, usando-se Emotion Decoding System®.

[0073] Participantes foram aleatoriamente distribuídos a 2 grupos: In- grediente ativo (3% v/v extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico em uma formulação cremosa de pele) vs. placebo (formulação cremosa de pele sem extrato de Phaeodactylum tricornutum); produtos anonimisados foram aplicados duas vezes diariamente, na manhã e à noite.

[0074] O ingrediente ativo demonstrou ser muito emocionalmente efi- caz, provocando um número significativamente mais alto de emoções po- sitivas e emoções negativas significativamente mais baixas vs. placebo.

[0075] O ingrediente ativo também gerado uma faixa mais ampla de emoções positivas (sensualidade, proteção, felicidade, apaziguamento, fortaleza) do que o placebo, e apenas um único tipo de emoção negativa (agressão); enquanto que placebo geraram uma faixa mais ampla de emo- ções negativas (agressão, desagradabilidade, contrariedade, desinte- resse).

[0076] Quantitativamente, o ingrediente ativo gerou mais do que duas vezes o número de emoções positivas do que placebo e três vezes menos emoções negativas do que placebo. Os resultados iluminam a eficácia do extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico para o melhoramento de um humor do indivíduo, em particular para um indivíduo tendo pele sensí- vel. Exemplo 5: Modulação epigenética usando sistema de comunicação de célula exossoma

[0077] Tratamento de NHEK com extrato de Phaeodactylum tricornu- tum hidrofílico

[0078] Queratinócitos foram tratados com o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico a 1% diretamente no meio de cultura (meio basal Epilife a 60 µM cálcio complementado com HKGS, Penicilina e estreptomi- cina) por 24 horas. Extração de exossoma e estimulação de NHDF

[0079] Queratinócitos foram semeados em frascos T175 (BD Falcon) até as células alcançarem 80% de confluência. Então, o meio foi trocado por meio de cultura fresca com ou sem tratamento e células foram incuba- das por 24 ou 48 horas antes da extração de exossomas. 15 ml de sobre- nadantes foram coletados e fragmento celular foi removido por centrifuga- ção por 30 min a 3500 g e 4°C. O meio de cultura foi centrifugado na coluna de filtragem (dispositivos de filtragem de centrífuga Amicon Ultra-15 100K, Merk-Millipore). Exossomas oriundos de meios de cultura de células con- centrados foram isolados usando Exo-Prep (HansaBioMed) de acordo com as instruções do fabricante. Exossomas transformados em pelotas foram ressuspensas em 100 μl de PBS 1X estéril.

[0080] Exossomas em suspensão foram quantificados usando um kit de ensaio quantificação de exossoma EXOCET (System Biosciences), de acordo com as instruções do fabricante. Esse kit de quantificação como uma medição direta de atividade de esterase conhecida como estando dentro dos exossomas. É um ensaio enzimático, colorimétrico, lido a OD405 nm.

[0081] Fibroblastos foram tratados com meio de cultura (DMEM meio (com piruvato, glutamax, 4,5 g/l de glicose; GIBCO) complementado com 10% de FBS, penicilina e estreptomicina) enriquecidos com a mesma quantidade de exossomas purificada de queratinócito meio de cultura (tra- tado ou não tratado) por 24 horas. Análise de miRNA por qPCR em tempo real

[0082] RNA total com miRNA NHFDs foi extraído e foi purificado u- sando-se kit de isolamento de RNA miRCURY (de Exiqon), após as instru- ções do fabricante. Controle de qualidade e quantificação de RNA total fo- ram realizados kit de Agilent RNA Nano e bioanalisador de Analysis Agilent

2100. Para quantificação alvo de mRNA, RNA total foi transcrito reverso com o kit de síntese de cDNA Superscript VILO (ThermoFisher) de acordo com as instruções do fabricante. PCR quantitativo foi realizado com um kit

Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante usando-se o CFX-connect (Biorad). Todas as ex- periências foram realizadas em duplicata para cada réplica biológica. Os resultados foram normalizados para a expressão de GAPDH de controle endógena.

[0083] Para a quantificação de micro-RNA, RNA total foi transcrito re- verso com o kit II Universal cDNA Synthesis (Exiqon) de acordo com as instruções do fabricante. Reações de transcrição reversas foram diluídas, e uma fração de cDNA diluído foi usado para cada PCR quantitativo. PCR quantitativo foi realizado com um kit de mistura principal Exilent SYBR Green (Exiqon) de acordo com as instruções do fabricante usando-se o CFX-connect (Biorad). Todas as experiências foram realizadas em dupli- cata para cada replicação biológica. Os resultados foram normalizados para expressão de RNU1A.

[0084] miRNA testado: miR-21. miR-21 está na interseção de senes- cência, inflamação, e doenças relacionadas a idade (Olivieri e outros, "Age- related differences in the expression of circulating microRNAs: miR-21 as a new circulating marker of inflammaging", Mecanismos de envelhecimento e desenvolvimento 133 (2012) 675–685). Parece desempenhar um papel principal no envelhecimento por promoção de expressão de MMPs (3 e 9) através de silenciamento autofágico, e degradação de colágeno. Análise Estatística

[0085] A comparação de diferentes parâmeteros foi realizada com o teste de Student. P < 0,05 é considerado como sendo estatisticamente sig- nificativo. Resultados

[0086] Depois de ser tratado por 24 horas com o extrato de Phaeodac-

tylum tricornutum hidrofílico a 1% v/v, exossomas oriundos de queratinóci- tos sobrenadantes foram aplicados como um tratamento para a cultura de fibroblastos por 24 horas. Extração de miRNA de fibroblastos revelou uma diminuição significativa de expressão de miR21 (-56%, valor p < 0,001) com o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico a 1% (Figura 8). Isso evidencia uma comunicação intra-celular entre queratinócitos e fi- broblastos através do sistema de comunicação de célula - célula exosso- mal.

[0087] Em conclusão, esse estudo evidenciou que o Phaeodactylum tricornutum hidrofílico induz um controle epigenético de inflamação através da inibição de miR21 do graças ao sistema de comunicação de célula - célula exossomal. Exemplo 6: Análise Transcriptônicas Condições de Cultura de Células

[0088] Queratinócitos epidermais de ser humano normal (NHEKs; K36A) foram semeados em 300 000 células por cavidade em placas espe- cíficas revestidas com Colágeno I em placa de 6 cavidades. As células de NHEKs foram postas em repouso por uma noite em meio de KBM Gold (meio basal de Queratinócito, isto é, meio de cultura específico para que- ratinócitos sem suplementos) antes da estimulação. Células foram estimu- ladas com 3% v/v de extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico. Extração de RNA e RT-qPCR

[0089] Depois de 6 horas e 18 horas de estimulação, RNA total foi ex- traído usando-se Trizol (extração de guanidínio tiocianato-fenol-clorofór- mio):

[0090] Adição de 1 ml de Trizol por cavidade e desempenho de vários ciclos de aspiração/descarga em um tubo de 2 ml.

[0091] Incubação a temperatura ambiente por 5 minutos e adição de

200 µL de uma mistura de Clorofórmio:IAA (24:1).

[0092] Agitação vigorosa três vezes por 10 s.

[0093] Incubação a temperatura ambiente por 3 minutos, seguido por centrifugação a 12'000 G por 15 min a 4°C.

[0094] Coleta da fase aquosa (fase superior límpida) em um tubo de 1,5 ml.

[0095] Adição de 500 µl de isopropanol para precipitar RNA e mistura- ção por leve inversão.

[0096] Incubação a temperatura ambiente por 10 minutos, seguido por centrifugação a 12'000 G por 10 minutos a 4°C.

[0097] Eliminação de sobrenadante, seguido por lavagem da pelota de RNA com 1 mL de EtOH a 75%.

[0098] Centrifugação a 7'500 G por 5 minutos a 4°C, e lavagem nova- mente com 1 mL de EtOH a 75%.

[0099] Depois da última lavagem, a pelota de RNA foi seca e então foi dissolvida em água pura (10 µL).

[00100] A quantidade e pureza de RNA total extraído foi quantificada por espectroscopia (razão de 260 nm : 280 nm e de 260 nm : 230 nm).

[00101] As amostras de RNA total foram diluídas a 1/20 em água pura antes da análise.

[00102] Todas as concentrações foram ajustadas para 250 ng/µL para cada condição, e a qualidade de RNA foi determinada por migração de gel. Retro-transcrição de RNA

[00103] As amostras de RNA total foram retro-transcritivas para cDNA usando o kit de síntese de cDNA Verso cDNA (ex Thermo Fisher Scientific) como descrito abaixo. 500 ng de RNA total foram retro-transcritivos para cDNA (2 µL)

[00104] Condições de reação de retro-transcrição:

tampão de síntese de cDNA 5x 4 µL dNTP (5mM) 2 µL OligodT 0,25 µL Hexâmeros 0,75 µL Mistura Verso Enzimática 1 µL Melhorador de RT 1 µL Água 9 µL

[00105] RNA Total (250 ng/µL) 2 µL

[00106] Volume total: 20 µl dando 500 ng para 20 µL: 25 ng/µL. Retro- transcrição foi realizada em 4 µL de RNA (250 ng/µL): 1000 ng.

[00107] Programa usado: LID 103°C -> Esperar -> 42°C - 2 min -> Pausar pressionar ENTER -> 42°C- 30 min -> 95°C – 2 min -> Hold 10°C Fim

[00108] cDNA obtido foi validado por PCR clássico usando-se iniciado- res de actina de ser humano, que é um gene governante bem conhecido.

[00109] Mistura de PCR foi composta de: Tampão 10X 2,5 µL MgCl2 (25 mM) 1,5 µL dNTP (10 mM) 0,5 µL Iniciadores (sentido e reverso) 10 µM 1 µL Taq (polimerase) 0,1 µL Água (qsp 24,5 µL) 18,9 µL cDNA 0,5 µL

[00110] Programa usado: LID 103°C -> Esperar -> 94°C - 3 min -> Pau- sar pressionar ENTER -> 94°C – 3 min (ativação enzimática) -> 94°C - 30 s (hibridização) -> 60°C - 30 s (Tm) -> 72°C – 30 s (alongamento) -> repe- tição de hibridização, Tm e alongamento 39 vezes -> 72°C - 10 min (alon- gamento final) -> FIM

[00111] qPCR na placa de TaqMan (Applied)

[00112] Os cDNAs foram diluídas a 1/25 em água pura = 2 ng/µL de cDNA. 5 µL de cDNA (10 ng) foram depositados por cavidade e foram completados com a mistura Taqman PCR para10 µL final (life Technolo- gies).

[00113] Programa usado: 50°C por 2 min -> 95°C por 10 min -> 95°C por 15 seg -> 60°C por 1 min + leitura de placa-> repetição (95°C por 15 seg -> 60°C por 1 min + leitura de placa) por 39 mais vezes -> FIM Resultados

[00114] Análise transcriptônica foi realizada por RT-qPCR nas placas epidermais. Os resultados são apresentados abaixo por comparação com controles (células não tratadas) e são normalizados com a média dos dois genes governantes mais estáveis (IPO8 e EIF2B1). Gráficos de Volcano foram usados para identificar modificações significativas induzidas pelo tra- tamento. Uma variação de gene é considerada como significativa quando o valor p é inferior a 0,05.

[00115] Depois de 6 horas de estimulação, 23 genes foram significativa- mente modulados por pelo menos 30% pelo extrato de Phaeodactylum tricor- nutum hidrofílico, e 25 genes depois de 18 horas de estimulação. Resultados são mostrados na Figura 9 (Modulação de gene depois de 6 horas e 18 horas de tratamento com 3% de extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico. teste de Student; * : valor p < 0,05 ; ** : valor p < 0,01 ; *** : valor p < 0,001.).

[00116] Em ambos os períodos de estimulação, uma distinção clara en- tre as condições tratadas e não tratadas foi observada e uma maior parte dos genes regulados para baixo, entre eles genes envolvidos na inflama- ção e calmante da pele.

[00117] O estudo transcriptômico revela que o extrato de Phaeodac-

tylum tricornutum hidrofílico é adequado para o tratamento de pele sensí- vel. Exemplo 7: modelo ex vivo de pele irritada

[00118] Modelo de pele humana mantida em condições de sobrevivên- cia

[00119] Três fragmentos de pele de ser humano normais foram obtidos em cirurgia plástica oriundos de tecido de pele residual, oriundos de dife- rentes doadoras femininas (idade de 45, 66, e 30). Fragmentos de pele foram cortados em pedaços de 1 cm² e foram lavados três vezes usando- se antibióticos.

[00120] Biopsias de pele foram colocadas com o epitélio voltado para cima, em uma interface de ar/líquido, nos insertos de cultura (tamanho do poro do filtro 12 μm; Costar, VWR International, Fontenay-sous-Bois, França). Esses insertos foram ajustados em uma placa de 12 cavidades a 37°C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. As culturas de ór- gãos foram conservadas com meio essencial mínimo de Dulbecco (Invitro- gen Corporation, Paisley, UK) contendo antibióticos (100 U/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina; Invitrogen), 200 μg/ml de L-glutamina (Invi- trogen Corporation, Paisley, UK) e soro de bezerro fetal (DAP, Neuf-Bri- sach, França). Meio foi adicionado às cavidades de modo que a superfície do meio fosse nivelada com o filtro. Os fragmentos foram mantidos vivos ex vivo por 24 horas. Pele irritada com sulfato de laurila de sódio (nível epidérmico) e substância P (nível dérmico)

[00121] Nas amostras de pele acima mantidas em sobrevivência, a adi- ção de substância P a 10 μM no meio de cultura permite obtenção de uma dilatação vascular com edema e avanço de elementos inflamatórios (linfó- citos e mastócitos) na derme. A aplicação de sulfato de laurila de sódio

(SLS) a 2% (produto tensoativo aniônico conhecido como cruzando a bar- reira cutânea) permite obtenção de uma irritação cutânea com alteração epitelial. Aplicação tópica do extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico

[00122] No Dia 0, o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico em duas diferentes concentrações (1% e 3% v/v) foi aplicado sobre a epi- derme. Após duas horas, 2% de SLS foram aplicados sobre a epiderme durante duas horas, então foram enxaguados na solução salina tamponada por fosfato (PBS). Então, o meio de cultura foi refrescado e 10 µM de Subs- tância P foram adicionados no meio de cultura para criar um modelo de inflamação. Uma condição de controle foi feita com Capsazepina, que per- mite o bloqueamento da ação de substância P.

[00123] No Dia 1, uma terceira aplicação do extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico foi feita. Depois de 7 horas, fragmentos de pele fo- ram fixados em formaldeído e sobrenadantes foram coletados para ensaios de citocinas. Análise histológica de alterações na epiderme

[00124] Fatias histológicas foram criadas a partir de fragmentos fixados em formaldeído e foram encerradas em parafina. Manchamento por hema- luneosina foi efetuado. Análise da epiderme foi efetuada sobre a fatia his- tológica inteira (usando-se um microscópio Olympus® BX41, ampliação de x40). Células modificadas foram contadas em cada fatia e nas células epi- dermais por campo de visão a fim de determinar a percentagem de células alteradas.

[00125] Classificações Semi-quantitativas (de 0 a 3) foram aplicadas à fatia inteira examinada a fim de quantificar alterações eventuais ao epité- lio.

[00126] Mudanças nos queratinócitos foram analisadas dentro da epi- derme: classificação 0: nenhuma alteração; classificação 1: redução leve de afinidade de tingimento com o uso de eosina para o citoplasma de célula e com o uso de hemateína para o núcleo; classificação 2: forte claridade do núcleo da célula ou presença de um halo claro circundando o núcleo; classificação 3: aparência vazia da célula ou de necrose eosi- nofílica (cerca de 50% da totalidade das células). Análise Estatística

[00127] Os resultados foram apresentados sob data média de dados obtidos a partir de três experiências independentes no mínimo. As medias foram expressas com erro padrão para média (SEM). Teste T de Student foi usado para análise estatística com ns: não significativo, *: p<0,05, **: p<0,01 e ***: p<0,001. Avaliação de Alteração de Epiderme

[00128] A análise morfológica mostrou a modificação drástica de aspectos de epiderme e derme refletindo uma pele sensível e inflamada. Capsazepina usada aqui como uma molécula de referência neutralizou esses efeitos e res- taurou a pele para um aspecto de pele saudável (Figura 10: Análise morfoló- gica dos explantes de pele cultivados em condições normais e de inflamação depois do tratamento com o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico a 1% e 3% usando manchamento de Hematoxilina-Eosina).

[00129] A classificação da alteração da epiderme foi realizada pela ava- liação anapatologista. Sulfato de laurila de sódio (SLS) induziu uma irrita- ção cutânea moderada com alterações epidérmicas significativas (classifi-

cação de 1,35) em comparação com pele não tratada. Uma proteção sig- nificativa da pele contra SLS foi obtida depois da aplicação do extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico a 1% e 3% com classificações res- pectivas de 1,05 (-22%) e 0,98 (-27%) versus 1,35 para SLS. Um resultado similar foi obtido com capsazepina com a classificação de 0,18 (-87%).

[00130] Na conclusão, o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofí- lico significativamente protege e restaura a pele da irritação. Exemplo 8: Tratamento de pele sensível Modelo de pele de ser humano mantido na sobrevivência

[00131] Fragmentos de pele oriundos de 3 Indivíduos caucasianos (fe- mininas, idade de 33, 44, e 52) obtidos por abdominoplastia foram cortados em pedaços de 1 cm² e lavados três vezes usando-se antibióticos. Gordura subcutânea e derme inferior foram mecanicamente removidas sob um es- tereomicroscópio usando-se um bisturi cirúrgico.

[00132] Biopsias de pele foram colocadas com o epitélio voltado para cima, em uma interface de ar/líquido, nos insertos de cultura (tamanho do poro do filtro 12 µm; Costar, VWR International, Fontenay-sous-Bois, França). Esses insertos foram ajustados em uma placa de 12 cavidades por 24 horas a 37°C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. As culturas de órgãos foram conservadas com meio essencial mínimo de Dul- becco (Invitrogen Corporation, Paisley, RU) contendo antibiótico, L-gluta- mina, extrato pituitário de bovino, fatores de crescimento e soro de bezerro fetal(DAP, Neuf-Brisach, França). Meio foi adicionado às cavidades de modo que a superfície do meio fosse nivelada com o filtro. Aplicação do extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico

[00133] Extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico foi topica- mente aplicado preventivamente a J0, duas horas antes da realização de modelo de pele sensível e agressão por UVB.

[00134] O modelo de pele sensível consistiu em uma aplicação tópica de 15 µL/cm² de 1% SLS durante uma hora, seguido por um enxague (PBS 1x) então adição de 5 µM de capsaícina no meio de cultura. Uma sessão de UVB a 2 J/cm² (lâmpada Vilber Lourmat) foi realizada duas horas depois da preparação do modelo de pele sensível para ajudar a reforçar a reativi- dade dessa pele.

[00135] Uma comparação entre quatro condições foi feita: pele não tratada pele tratada por extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofí- lico a 3% pele sensível (capsaícina e SLS + agressão de UVB) pele sensível + extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico a 3%

[00136] Depois de 24 horas de sobrevivência, fragmentos de pele foram tirados e foram fixados em formaldeído. Sobrenadantes de cultura foram coletados e foram congelados a -32°C para o ensaio de IL8. Avaliação imunoistoquímica de CD1a para células dendríticas

[00137] Células de Langerhans foram iluminadas na epiderme com um anticorpo monoclonal de camundongo contra CD1a (Dako, clone 010, não diluído). A imunodetecção foi feita com uma técnica indireta de imunopero- xidase em 3 níveis, ampliada (kit CSAII, DAKO) e manchada em vermelho por AEC (3-amino-9-etilcarbazol). O número de células epiteliais CD1a po- sitivas foi contado em 10 áreas da fatia histológica (ampliação x400). Desconforto e sensação dolorosa - avaliação imunoistoquímica de recep- tores de TRPV1

[00138] Receptores TRPV1 foram iluminados na epiderme com a anti- corpo de IgG policlonal de coelho (Novus, gene ID 7442, 1/750 diluído). A imunodetecção foi feita com uma técnica indireta de imunoperoxidase em

3 níveis, ampliada (kit CSAII, DAKO) e manchada em vermelho por AEC (3-amino-9-etilcarbazol). Uma classificação semi-quantitativa da intensi- dade do imunomanchamento foi usada nessas lâminas (de 0: nenhum manchamento até 4: manchamento muito importante) em 10 áreas da fatia histológica (ampliação x400). Inflamação - ensaio de IL-8

[00139] O ensaio de IL-8, citocina pró-inflamatória (ng/ml) foi realizado a partir de meio de cultura por uma técnica de imunoensaio com leitura espectrofotométrica (λ 450 nm) (kit ELISA, BioTechne). Análise Estatística

[00140] Valores médios e desvios padrão foram calculados para n =3 (triplicata que é finalmente n = 9). A normalidade das amostras da pele de controle das amostras da pele de controle foi verificada usando o teste de Shapiro-Wilk. Se um p> 0,05 fosse obtido, o grupo foi considerado normal e a comparação de diferentes parâmetros pode ser realizada com o teste de Student. Se o grupo não for normal, teste de Wilcoxon foi realizado. Em qualquer caso, p < 0,05 foi considerado como sendo estatisticamente sig- nificativo. Resultados: quantificação de células dendríticas (DC) na epiderme (CD1a)

[00141] Um aumento significativo de 104% no número de células den- dríticas foi observado na pele sensível em comparação com a pele de con- trole. A aplicação de 3% de extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofí- lico significativamente reduziu o número de células dendríticas por 32,6% em comparação com a pele sensível. Assim, o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico parece proteger pele sensível no nível ex vivo por redução de recrutamento de células imunes.

Resultados: Desconforto e dor – expressão de TRPV1

[00142] O modelo de pele sensível significativamente aumentou expres- são de receptor de TRPV1 na epiderme por 29,1% em comparação com a pele de controle. A aplicação de extrato de Phaeodactylum tricornutum hi- drofílico a 3% reduziu a expressão do receptor de TRPV1 no nível da epi- derme em pele sensível com um efeito próxima de ser significativo (valor p = 0,052).

[00143] Isso mostra no nível ex vivo que o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico é capaz de reduzir a sensação de dor de tipo pon- tada, que é característica de peles sensíveis. Resultados de Ensaio de IL-8

[00144] Um aumento significativo de secreção de IL-8 por 49,8% foi ob- servado na pele sensível em comparação com a pele de controle. A apli- cação de 3% de extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico significa- tivamente reduziu o nível de IL-8 por 26,4% (valor p < 0,01) em compara- ção com a pele sensível. O extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofí- lico mostra aqui sua capacidade de reduzir a resposta inflamatória em mo- delo ex vivo de pele sensível. Exemplo 9: Recrutamento de monócitos em sistemas microfluídico

[00145] Células endoteliais de veia umbilical de ser humano (HUVECs) foram cultivadas em lâminas de câmara por 2-3 dias e então foram tratadas por umas outras 10 horas com TNFalfa (fator de necrose de tumor; 500 U/mL) ou extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico. Monócitos (85%-95%) foram purificados a partir de sangue citratado coletado de dois doadores saudáveis independentes (cada um feito em triplicata) usando- se um kit de isolamento de monócito (Miltenyi Biotec). As lâminas contendo a monocamada de HUVEC cultivada foram então ligadas a uma câmara de fluxo a 37°C e o fluxo gerado sobre a monocamada de HUVEC por perfusão do tampão de lavagem, ou uma suspensão de monócito usando uma bomba calibrada. A taxa de fluxo foi representativa de pequenas vê- nulas (0,05 Pa).

[00146] O primeiro estágio do ensaio era um procedimento de lavagem, onde o tampão de lavagem foi perfundido sobre os HUVECs. Monócitos foram então perfundidos sobre os HUVECs ativados por 5 min seguido por tampão de lavagem por 55 min. Imagens dos monócitos capturadas sob fluxo foram feitas usando-se microscópio de contraste de fase, e uma câ- mara de alta resolução.

[00147] Imagens individuais foram registradas a cada 30 s e foram com- piladas em sequências de filme, permitindo análise de monócitos individu- ais sobre grandes áreas. Monócitos aderentes à superfície dos HUVECs têm uma aparência de fase branca enquanto que aqueles que transmigra- ram têm uma aparência de fase preta. Eventos de adesão foram registra- dos como o de número de células por campo unitário (mm²). Eventos de transmigração foram apresentados como uma percentagem de monócitos totais capturados a partir do fluxo por campo unitário. A totalidade das ex- periências foi realizada usando campos em triplicata e foram apresentadas como um valor médio com + medições de erro padrão (+SEM).

[00148] Quatro concentrações diferentes de extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico foram testadas: 0,5%, 1%, 3% e 10%.

[00149] Análise estatística assumiu distribuições paramétricas, e foi conduzida usando-se o teste T de Student. Valores P oriundos das classi- ficações de significância são apresentados nas figuras como se segue: *: valor p < 0,05 ; **: valor p < 0,01 ; ***: valor p < 0,005. (Bradfield e outros, Blood, 2008).

[00150] Resultados:

[00151] Taxas de transmigração de monócito primário sob fluxo foram comparáveis entre o controle de tampão e o extrato de Phaeodactylum tri- cornutum hidrofílico a 0,5% para os dois doadores. Aumento da concentra- ção do extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico em HUVECS re- duziu a transmigração de um modo dependente de dose com uma redução significativa observada a 1%, 3% e 10%.

[00152] O controle positivo M1/70 (anticorpo de anti-mac-1) significati- vamente reduziu transmigração de monócitos (valor p < 0.001), validando essa experiência.

[00153] Esses dados confirmam a observação anterior do estudo ex vivo, meios esses que o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico tem um efeito anti-inflamatório significativo sobre HUVECS estimulado por TNF-α estimulado por redução de recrutamento de monócitos. Exemplo 10: Propriedade antimicrobiana através de produção de β-de- fensina-2 ex vivo Cultura de Explantes de Pele

[00154] Tecidos de pele de ser humano frescos derivados de biopsia de mama foram desinfetados com etanol a 70% e banhos sucessivos com antibióticos e agentes antifúngicos. A partir desses tecidos, punções de biopsias de 6 mm foram incubadas em insertos de 12 mm com 8 µm de porosidade e selados com 5 mg/ml de Matrigel (Corning®). Um meio espe- cífico para sobrevivência de longo prazo de pele de ser humano foi adicio- nado no fundo de cada cavidade estando em contato com a derme, permi- tindo que o tecido esteja em uma interfase de ar-líquido. Tecidos foram incubados de um dia para o outro a 37°C, 5% de CO2. Tratamento Tópico

[00155] De 3 a 5 amostras de tecido por condição de 3 doadores inde- pendentes (idade de 55, 60, e 66) foram usados para esta segunda parte.

Após a incubação de um dia para o outro, tecidos foram topicamente tra- tados por aplicação de 10 µl de solução sobre a epiderme: Não tratado: PBS estéril

[00156] Phaeodactylum tricornutum: 3% (v/v) de extrato de Phaeodac- tylum tricornutum hidrofílico em PBS estéril

[00157] Tratamentos foram renovados a cada manhã e a cada noite por 3 dias e o meio foi mudado no Dia 1 à noite. Meio foi então coletado no Dia 3 à noite e foi armazenado a -20°C até a dosagem de ELISA. Quantificação de beta-Defensina-2

[00158] Meio de cultura de tecido foi usado para quantificar β-Defen- sina-2 liberada pelas amostras de tecido com um ensaio de Elisa. Resumi- damente, sobrenadantes foram incubados em uma placa de 96 cavidades pré-revestida com um anticorpo de anti-β-Defensina-2 e foram incubados por duas horas a temperatura ambiente sob agitação orbital. Depois de 4 lavagens com o tampão de ensaio provido pelo fornecedor, um anticorpo de β-Defensina-2 anti-humana biotinilada foi adicionado em cada cavidade e foi incubado por 2 horas a temperatura ambiente sob agitação. Depois de 4 outras lavagens, um anticorpo secundário acoplado com peroxidade de rábano picante (SA-HRP) foi adicionado em cada cavidade e foi incu- bado por 30 minutos a temperatura ambiente sob agitação. Cavidades fo- ram lavadas 4 vezes novamente e substrato de 3,3',5,5'-Tetrametilbenzi- dina (TMB) foi adicionado por 20 minutos no escuro sob agitação orbital. Catálise de TMB por HRP gerou uma coloração azul que foi então para por adição de solução de parada (solução de HCl), completando as mudanças de cor de azul até amarelo. Densidade ótica foi medida a 450 nm com uma leitora de microplaca. Análise Estatística

[00159] A normalidade das amostras foi verificada usando-se o teste

Shapiro-Wil. Se for obtido um p> 0,05, o grupo é considerado normal e a comparação dos diferentes parâmetros pode ser realizada com o teste de Student. Se o grupo não é normal, o teste de Wilcoxon foi realizado. Po- tenciais valores aberrantes foram excluídos somente se o teste de Dixon confirmou que esses valores foram significativamente aberrantes com um p < 0,05.

[00160] Em qualquer caso, p < 0,05 é considerado como estatistica- mente significativo. Resultados

[00161] Extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico a 3% foi topi- camente aplicado sobre um explante de pele duas vezes ao dia por dois dias. Dosagem no meio de cultura evidenciou um aumento significativo de liberação de β-Defensina-2 por +71% (valor p < 0,01), mostrando que a aplicação tópica do extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico é tam- bém capaz de melhorar a defesa anti-microbiana da pele. Exemplo 11: Atividade calmante (estudo clínico) Composições testadas (INCI)

[00162] Placebo: AQUA/ÁGUA, ÁLCOOL CETÍLICO, GLICERIL ESTEARATO, PEG-75 ESTEARATO, CETETH-20, STEARETH-20 ISODECIL NEOPENTANOATO, FENOXIETANOL, METIL PARABENO, PROPIL PARABENO, ETIL PARABENO, DIMETICONA, FRAGRÂNCIA, HEXIL CINAMAL, BUTILFENIL METILPROPIONAL, CITRONELOL, ALFA ISOMETIL IONONA, HIDROXI-ISOEXIL 3-CICLOEXENO

CARBOXALDEÍDO

[00163] Ingrediente ativo: AQUA/ÁGUA, ÁLCOOL CETÍLICO, GLICERIL ESTEARATO, PEG-75 ESTEARATO, CETETH-20, STEARETH-20 ISODECIL NEOPENTANOATO, EXTRATO DE PHAEODACTYLUM TRICORNUTUM, FENOXIETANOL, METIL

PARABENO, PROPIL PARABENO, ETIL PARABENO, DIMETICONA, FRAGRÂNCIA, HEXIL CINAMAL, BUTILFENIL METILPROPIONAL, CITRONELOL, ALFA ISOMETIL IONONA, HIDROXI-ISOEXIL 3-

CICLOEXENO CARBOXALDEÍDO Painel de Teste

[00164] Um estudo clínico duplo cego e controlado por placebo foi rea- lizado em 20 voluntários (média de idade: 46 ± 9 anos) casando-se os cri- térios de inclusão e de exclusão (Critérios de inclusão: mulheres com idade entre 30 e 60 anos de idade. Critérios de exclusão: grávidas ou amamen- tadoras; problemas dermatológicos e/ou uma alergia a produtos cosméti- cos; sob tratamento médico potencialmente capaz de influenciar os parâ- metros medidos). Elas foram informadas dos possíveis efeitos adversos de uso do produto e das condições técnicas em que a avaliação foi realizada. Elas voluntariamente assinaram o formulário de consentimento que estava escrito de acordo com a Declaração de Helsinki e a lei de 20 de dezembro de 1988 do Code de la Santé Publique.

[00165] A atividade calmante foi medida no antebraço depois de indu- ção de irritação por emplastro a 10% de SLS. Nessa condição, o creme contendo 3% de extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico ou pla- cebo foi aplicado duas vezes diariamente, e o parâmetro a* foi seguido depois de 7 dias de tratamento. Método Cromamétrico

[00166] A medição de intensidade de cor da pele foi realizada por colo- rimetria usando-se um cromâmetro (Chromatique CM 2600d TM MINOLTA, França).

[00167] Medições de cor foram feitas com os seguintes parâmetros:

[00168] Campo de visão padrão de 2° como definido pela CIE em 1931

[00169] Iluminante D65 correspondente à luz do dia

[00170] Área de medição de 8 mm

[00171] Espaços de cor usados L* a* b* e L* C* h*

[00172] Método SCI (especular incluído), permitindo livre da condição de superfície.

[00173] A dimensão vertical L* determina o brilho (ou luminância) de zero (preto) a 100 (branco).

[00174] O parâmetro a* determina uma gama de 600 níveis sobre o eixo vermelho (+299 valores positivos) → verde (-300 valores negativos) atra- vés de cinza (0).

[00175] O parâmetro b* determina uma gama de 600 níveis sobre o eixo amarelo (+299 valores positivos) → blue (-300 valores negativos) através de cinza (0).

[00176] Três medições sucessivas foram realizadas em três lugares di- ferentes bem marcados sobre cada voluntário. Uma janela de controle pos- sibilitou reposição dos dispositivos sobre a área de interesse. Os parâme- tros L*, a*, b* foram gravados com o uso de um software. Medições foram feitas rigorosamente sobre a mesma área.

[00177] Somente o parâmetro a* foi analisado durante este estudo. Resultados

[00178] Neste estudo, 3 voluntários foram excluídos devido a uma rea- ção excessiva ao emplastro de SLS e 2 outros voluntários devido à ausên- cia de indução de irritação pelo emplastro de SLS. Em consequência disso, a análise estatística foi feita em n=15 voluntários que apresentavam uma pele sensível.

[00179] A atividade calmante foi avaliada depois de 7 dias de irritação na pele induzida por SLS. O parâmetro a* foi medido a fim de se analisar a vermelhidão da pele ligada à irritação.

[00180] Os resultados são apresentados na tabela seguinte:

Controle 3% de Phaeodactylum Placebo tricornutum D0 (Média ± DP) 5,72 ± 1,09 5,92 ± 1,27 5,77 ± 0,99 D7 (Média ± DP) 7,41 ± 2,80 7,04 ± 1,63 7,89 ± 2,57 beta D0 -> D7 (%) 30%* 19%* 37%** : valor p < 0,05 ; ** : valor p < 0,01

[00181] Foi observado que o emplastro de SLS a 10% induziu uma irri- tação a pele, como observado pelo drástico aumento do parâmetro a*. Esse efeito foi observado em todas as condições incluindo controle, pla- cebo e extrato a 3% de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico.

[00182] Depois de 7 dias de aplicação de creme contendo 3% extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico, uma significativa diminuição do parâmetro a* versus D0 foi observada. O placebo mostrou resultados in- versos, com um aumento significativo do parâmetro a*.

[00183] Os resultados confirmaram que o extrato de Phaeodactylum tri- cornutum hidrofílico a 3% reduziu uma redução significativa de vermelhi- dão de pele e, assim, um significativo efeito calmante. Os resultados foram significativos com relação ao placebo com -18%. Exemplo 12: Teste de picada usando-se capsaicina (estudo clínico) Composições Testadas (INCI)

[00184] Placebo: AQUA/ÁGUA, ÁLCOOL CETÍLICO, GLICERIL ESTEARATO, PEG-75 ESTEARATO, CETETH-20, STEARETH-20 ISODECIL NEOPENTANOATO, FENOXIETANOL, METIL PARABENO, PROPIL PARABENO, ETIL PARABENO, DIMETICONA, FRAGRÂNCIA, HEXIL CINAMAL, BUTILFENIL METILPROPIONAL, CITRONELOL, ALFA ISOMETIL IONONA, HIDROXI-ISOEXIL 3-CICLOEXENO

CARBOXALDEÍDO

[00185] Ingrediente ativo: AQUA/ÁGUA, ÁLCOOL CETÍLICO, GLICERIL ESTEARATO, PEG-75 ESTEARATO, CETETH-20, EXTRATO de STEARETH-20 ISODECIL NEOPENTANOATO, PHAEODACTYLUM TRICORNUTUM, FENOXIETANOL, METIL PARABENO, PROPIL PARABENO, ETIL PARABENO, DIMETICONA, FRAGRÂNCIA, HEXIL CINAMAL, BUTILFENIL METILPROPIONAL, CITRONELOL, ALFA ISOMETIL IONONA, HIDROXI-ISOEXIL 3-CICLOEXENO

CARBOXALDEÍDO Painel de Teste

[00186] Um estudo clínico controlado por placebo e duplo cego foi rea- lizado em dois grupos de 20 voluntárias cada um (média de idade: 39 ± 2 anos) casando-se os critérios de inclusão e de exclusão (Critérios de inclu- são: 18-50 de idade; pele sensível com base no teste de sensibilidade de capsaicina. Critérios de exclusão: grávidas ou amamentando; problemas dermatológicos e/ou uma alergia a produtos cosméticos; sob tratamento médico potencialmente capaz de influenciar os parâmetros medidos). Elas foram informadas dos possíveis efeitos adversos de usar o produto e das condições técnicas em que a avaliação é realizada. Elas voluntariamente assinaram o formulário de consentimento que estava escrito de acordo com Declaração de Helsinki e a lei de 20 de dezembro de 1988 do Code de la Santé Publique.

[00187] Os voluntários foram selecionados de acordo com sua sensibi- lidade a capsaicina. Eles aplicam duas vezes diariamente um creme (pla- cebo ou contendo 3% de extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico) for 28 dias. Teste de Stinging usando-se capsaicina

[00188] A concentração em capsaicina (em solução hidro-alcoólica) per- mite avaliar a sensibilidade cutânea.

[00189] Concentrações usadas: C1 = 0,316 ppm; C2 = 1 ppm; C3 = 3,16 ppm; C4 = 10 ppm; C5 = 31,6 ppm.

[00190] No D0, o teste foi realizado com as concentrações de C1 a C3 de capsaicina. Se nenhuma sensação fosse relatada pelo indivíduo depois da concentração de C3, elas não foram incluídas no estudo.

[00191] No D31, o teste foi realizado com as concentrações de C1 a C5 de capsaicina. Se nenhuma sensação fosse relatada pelo indivíduo depois da concentração C5, a última concentração foi considerada como o limiar de detecção para o indivíduo.

[00192] O teste de capsaicina foi conduzido de acordo com o seguinte método:

[00193] 1o estágio: As áreas de teste (pregas nasolabiais foram limpos usando-se almofadas de algodão impregnadas com uma solução hidro-al- coólica a 10% (solução de veículo) foram usadas cinco vezes sobre ambas as áreas de teste. Os indivíduos foram excluídos a partir do estudo se eles relatassem qualquer sensação de desconforto neste estágio do teste. Se não, eles continuaram o teste.

[00194] 2o estágio: 2 minutos depois do primeiro estágio, aplicação de face dividida simultânea da solução de veículo sobre dobras nasolabiais, com cotonetes (10 vezes). Os indivíduos foram excluídos a partir do estudo se eles relatassem qualquer sensação de desconforto neste estágio do teste. Se não, eles continuaram o teste.

[00195] 3o estágio: 2 minutos depois do 2o estágio, uma aplicação de face dividida simultânea duplo cega do veículo e da solução de capsaicina a concentração C1 foi realizado sobre dobras nasolabiais com cotonetes (10 times). Os lados de aplicação da capsaicina e das soluções de controle foram escolhidos aleatoriamente.

[00196] Aos indivíduos foram perguntados relatar, durante os três minu- tos após a aplicação, qualquer nova sensação ou qualquer diferença entre as áreas de teste, afirmando precisamente o lado, a natureza (ardor, quei- madura, coceira, outros) e a intensidade usando-se a seguinte escala: 0: nenhuma sensação 1: duvidoso, quase perceptível 2: levemente perceptível 3: moderamente perceptível 4: fortemente perceptível 5: doloroso

[00197] O teste foi parado assim que o indivíduo relatou uma sensação duradoura de mais do que 30 segundos ao lado da aplicação de capsai- cina, e a última concentração testada foi considerada como o limiar de de- tecção para o indivíduo.

[00198] Na ausência de qualquer sensação ou no caso de qualquer sen- sação (independentemente de sua intensidade e duração) no lado do veí- culo ou qualquer sensação de menos do que 30 segundos ao lado de cap- saicina, o teste foi continuado, usando-se a próxima dose mais alta de so- lução de capsaicina e assim por diante, no aumento de ordem de concen- tração de capsaicina, até o lado de capsaicina foi detectado pelo indivíduo. Um atraso de três minutos foi relatado antes de começar a próxima con- centração mais alta (mesma aplicação e método de testagem). Resultados

[00199] A reatividade de pele foi analisada na dobra nasolabial usando- se sensibilidade da pele ao teste de capsaicina. O impacto do extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico a 3% versus placebo depois de 28 dias de aplicação duas vezes diariamente foi analisada.

[00200] Um aperfeiçoamento importante de reatividade da pele a cap- saicina depois de 28 dias de aplicação de creme contendo o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico a 3% (+55% ***) foi observado, en- quanto o placebo mostrou um aumento significativo de 28% *. Também, o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico evidenciou uma diferença significativa com relação a placebo, como mostrado na tabela abaixo. Um melhoramento da reatividade de pele foi observado em 75% de voluntários.

Placebo 3% de Phaeodactylum tricornutum D0 (Média ± DP) 2,2 ± 0,2 2,0 ± 0,2 D28 (Média ± DP) 2,8 ± 0,2 3,1 ± 0,2  D0 -> D28 (%) 28%* 55%*** : valor p < 0.05 ; ** : valor p < 0.01 ; *** : valor p < 0.001 Exemplo 13: Proteção de composição da microbiata da pele (estudo clínico) Composições Testadas (INCI)

[00201] Placebo: AQUA/ÁGUA, ÁLCOOL CETÍLICO, GLICERIL ESTEARATO, PEG-75 ESTEARATO, CETETH-20, STEARETH-20 ISODECIL NEOPENTANOATO, FENOXIETANOL, METIL PARABENO, PROPIL PARABENO, ETIL PARABENO, DIMETICONA, FRAGRÂNCIA, HEXIL CINAMAL, BUTILFENIL METILPROPIONAL, CITRONELOL, ALFA ISOMETIL IONONA, HIDROXI-ISOEXIL 3-CICLOEXENO

CARBOXALDEÍDO

[00202] Ingrediente ativo: AQUA/ÁGUA, ÁLCOOL CETÍLICO, GLICERIL ESTEARATO, PEG-75 ESTEARATO, CETETH-20, STEARETH-20 ISODECIL NEOPENTANOATO, EXTRATO DE PHAEODACTYLUM TRICORNUTUM, FENOXIETANOL, METIL

PARABENO, PROPIL PARABENO, ETIL PARABENO, DIMETICONA, FRAGRÂNCIA, HEXIL CINAMAL, BUTILFENIL METILPROPIONAL, CITRONELOL, ALFA ISOMETIL IONONA, HIDROXI-ISOEXIL 3-

CICLOEXENO CARBOXALDEÍDO Painel de Teste

[00203] Um estudo controlado com placebo e duplo cego foi realizado em 41 voluntários (idade média de 39 anos de idade) tendo pele sensível. Eles são divididos em dois grupos que cada um aplicado duas vezes diari- amente a cream (placebo ou contendo 3% de extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico) a sua por 28 dias.

[00204] Um estudo clínico do microbioma (16S rRNA) foi realizado por esfregar as bochechas do voluntário, extrair e sequenciar o gene 16S rRNA (região V3V4 – emparelhada – tecnologia de sequência final) de todos os voluntários, a D0 e D28. 11,3 bilhões de bases de DNA foram analisados para comparar a composição da população de microflora durante um tempo sob as duas condições. Resultados

[00205] Verificou-se que cream contendo o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico protege a diversidade de microbiota da pele, um fator chave que pode ser ligado a várias condições de pele inflamatória quando impactado: Nenhuma modificação significativa de diversidade foi obser- vada para o ingrediente ativo no D28 na medição de índice de Shannon (ingrediente ativo: -6,5% com valor p = 0,216), enquanto a diversidade drasticamente diminuiu para o placebo (-12,8% com a valor p < 0,05).

[00206] Adicionalmente, o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidro- fílico demonstrou aperfeiçoar a composição de microbiota, estabilização de Propionibacterium (não conhecido como Cutibacterium) (ingrediente ativo: +3,0%; vs, placebo: +15,5% com a valor p < 0,1) e diminuição significativa de populações de Corynebacterium (ingrediente ativo: -32,4% com a valor p < 0,01; vs, placebo: -25,2% com a valor p < 0,1), ambos os quais tendo sido ligados às características pró-inflamatórias.

[00207] Assim, o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico age sobre a microbiota da pele para proteger e melhorar sua composição, ree- quilibrando seu equilíbrio das condições de pele sensível a pele normal. Exemplo 14: Análise de extratos Phaeodactylum tricornutum hidrofílico e lipofílico

[00208] O extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico da presente invenção demonstrou ter a seguinte composição: Alanina, ácido láctico, prolina, glutamina, glicina betaína, asparagina: 26,5% em peso Glicerol, uridina, adenosina, guanosina: 16,0% em peso Ácido cisteinólico: 10,3% em peso 2,3-di-hidroxipropano-1-sulfonato: 9,3% em peso Tumidina: 6,6% em peso Gliceril sulfoquinovosídeo: 5,4% em peso Ácidos graxos livres e lipídeos de betaína: 4,3% em peso Componentes não identificados: 21,6% em peso

[00209] Em contrário a isso, a extrato de Phaeodactylum tricornutum li- pofílico tem a seguinte composição: Ácidos graxos livres (dos quais 26% em peso de ácido eicosapentaenoico = EPA): 96,2% em peso Monoglicerídeos: 3,3% em peso Diglicerídeos: 0,2% em peso Triglicerídeos: 0,2% em peso

[00210] O extrato de Phaeodactylum tricornutum lipofílico acima é dilu-

ído em Mygliol 812 para se obter Megassane® (4,8% de extrato de Phaeo- dactylum tricornutum lipofílico, 96,3% de Mygliol 812, e 0,2% de alfa-toco- ferol). Exemplo 15: Comparação de propriedades anti-inflamatórias usando IL-8

[00211] As propriedades anti-inflamatóras de extratos de Phaeodac- tylum tricornutum lipofílico e hidrofílico foram compradas por quantificação de IL-8 nas amostras de pele ex vivo. Materiais e Métodos

[00212] Explantes de pele de ser humano foram obtidas a partir de ci- rurgia de abdominoplastia em uma doadora feminina (51 anos) e foram mantidas em cultura com meio de sobrevivência (Biopredic MIL217C) de um dia para o outro a 37°C em uma atmosfera úmida na presença de 5% de CO2.

[00213] A seguir dois produtos foram testadas:

[00214] 0,03% (v/v) de extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico (matéria seca) diluído em PBS (solução salina tamponada por fosfato); e

[00215] 0,03% (v/v) de extrato de Phaeodactylum tricornutum lipofílico em Miglyol 812 N (Safic Alcan).

[00216] Os explantes de pele foram pré-incubados com qualquer um dos dois produtos e foram deixados não tratados por 24 horas a 37°C em uma incubadora de CO2 em atmosfera úmida na presença de um meio de sobrevivência.

[00217] A superfície dos explantes de pele foi então lavada duas vezes com 200 μL de PBS e a indução a inflamação foi iniciada por aplicação tópica de 10 μL de SLS a 1% (p/v) por uma hora a 37°C. Os explantes de pele foram então novamente lavados duas vezes com 200 μL de PBS e foram incubados por 2 h a 37°C.

[00218] O meio de sobrevivência foi removido e foi trocado pelo meio de HBSS (solução de sal equilibrado de Hanks, Gibco), seguido por irradi- ação UVB a 2 J/cm² para a segunda etapa de indução a inflamação. Depois da exposição a UV, o meio foi eliminado e foi trocado por meio de sobrevi- vência e o produto respectivo foi novamente topicamente aplicado a 0,03% (p/v) por 24 horas a 37°C em uma atmosfera úmida em uma incubadora de CO2.

[00219] Depois de 24 horas, os sobrenadantes foram coletados e pro- dução de IL-8 foi quantificada usando-se o ensaio de ELISA de acordo com a instrução do fabricante (Sistema IL-8 D8000C R&D). Resultados

[00220] Foi primeiramente confirmado que o tratamento com exposição a SLS e UVB induziu uma reação de inflamação significativa como obser- vado pela liberação de IL-8, uma citocina pró-inflamatória, que aumentou por + 95% em comparação com a condição não tratada (controle negativo).

[00221] A aplicação tópica do extrato de Phaeodactylum tricornutum hi- drofílico significativamente reduziu a produção de IL-8 por -26%, embora o extrato de Phaeodactylum tricornutum lipofílico ainda levou a um outro au- mento. Os resultados são mostrados na seguinte tabela: IL-8 Média (ng/ml) Não tratado 2'305 ± 210 1% de Nenhum produto 48'010 ± 1'970 tratamento Extrato de Phaeodactylum tri- 35'350 ± 5'670 SLS + 2 J/cm² cornutum hidrofílico de irradiação Extrato de Phaeodactylum tri- 63'230 ± 3'460 UVB cornutum lipofílico

[00222] Os resultados claramente mostraram que apenas o extrato de

Phaeodactylum tricornutum hidrofílico da presente invenção tem uma ativi- dade anti-inflamatória como observado pela redução da liberação de IL-8 sob condições inflamatórias, enquanto o extrato de Phaeodactylum tricor- nutum lipofílico do estado na técnica não faz.

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES

1. Método não terapêutico de melhoramento de um humor do indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de apli- cação da composição cosmética compreendendo um extrato de Phaeo- dactylum tricornutum hidrofílico à pele do indivíduo.

2. Método não terapêutico de tratamento de pele sensível, ca- racterizado pelo fato de que compreende uma etapa de aplicação da com- posição cosmética compreendendo um extrato de Phaeodactylum tricornu- tum hidrofílico à pele.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é para a redução de vermelhidão em pele sensível.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é para acalmar pele sensível.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é para redução de inflamação na pele sensível.

6. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é para melhorar a composição de microbiota em pele sensível.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a composição cosmética compreen- dendo o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico é aplicada a pele facial.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico é um extrato aquoso de Phaeodactylum tricornutum.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a composição cosmética compreende 0,1 a 10% v/v do extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico, mais de preferência de 0,5 a 5% v/v, e com a maior preferência de 1 a 3% v/v.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a composição cosmética anteriormente compreende um excipiente cosmeticamente aceitável.

11. Uso de um extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico, caracterizado pelo fato de que é para o melhoramento de um humor do indivíduo.

12. Uso de um extrato de Phaeodactylum tricornutum hidrofílico, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento de pele sensível.