WO2022195212A1 - Inhibiteurs glycosidiques de levure - Google Patents

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WO2022195212A1
WO2022195212A1 PCT/FR2022/050459 FR2022050459W WO2022195212A1 WO 2022195212 A1 WO2022195212 A1 WO 2022195212A1 FR 2022050459 W FR2022050459 W FR 2022050459W WO 2022195212 A1 WO2022195212 A1 WO 2022195212A1
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yeast
cncm
composition
fraction
glucans
Prior art date
Application number
PCT/FR2022/050459
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English (en)
Inventor
Nathalie BALLET
Pascal Vandekerckove
Yann GUERARDEL
Shin-Yi YU
Adeline Sivignon
Nicolas Barnich
Original Assignee
Lesaffre Et Compagnie
Université Clermont Auvergne
Universite De Lille
Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs -
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    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A61K36/062—Ascomycota
    • A61K36/064—Saccharomycetales, e.g. baker's yeast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/716—Glucans
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present disclosure relates to a process for obtaining a composition of parietal yeast polysaccharides and to its use for the treatment of gastrointestinal pathologies or for the preparation of food supplements aimed at improving intestinal comfort.
  • microorganisms have already been described in the literature for their beneficial applications in humans on the digestive tract and for their nutritional interest, as described, for example, in WO 2006/021965. These microorganisms are then commonly designated by the term probiotic which corresponds to live microorganisms capable of providing the host with a health benefit when administered in adequate quantities (Joint FAO/WHO Expert Consultation Probiotics in food, FAO Food and nutrition paper Nr85, ISBN 92-5-105513 -0).
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • yeasts for treating pathologies associated with enterobacteriaceae
  • the prior application FR 2 928 652 teaches that the yeast strain S. cerevisiae (CNCM I-3856, ScProl) is of therapeutic and prophylactic interest for the treatment of gastrointestinal pathologies associated with pathogenic microorganisms by limiting in particular colonization and / or the intestinal invasion of these microorganisms.
  • the administration of this yeast leads to a decrease in enterobacteriaceae in the colon.
  • yeast parietal glucans have thus been used to enhance or prime the immune response in humans and animals with normal or diminished immunological function (G. Hetland. Curr. Med. Chem. - Anti-infective Agents 2003, 2: 135; PJ Rice, BE Lockhart, LA Barker, EL Adams, HE Ensley, DL Williams. Int. Immunopharmacol. 2004, 33:829).
  • Application WO 2009/103884 teaches more particularly that yeast parietal beta-glucans (in particular the CNCM I-3856 strain) limit intestinal inflammation.
  • corticosteroids are used less and less. It is therefore essential on the one hand to develop and improve existing prophylactic treatments, making it possible to improve intestinal comfort in healthy subjects, and on the other hand to prevent the development of pathologies in subjects at risk and on the other hand to develop effective therapies that are better tolerated for patients suffering from gastrointestinal pathologies such as IBD.
  • a composition of yeast polysaccharides comprising ⁇ -glucans and/or ⁇ -glucans and/or mannans is proposed, characterized in that the said yeast polysaccharides are extracted from yeast cell walls.
  • ⁇ -glucans are ⁇ (1,6)-glucans.
  • the composition further includes mannans and ⁇ -glucans.
  • the present application proposes a composition comprising from 5 to 25%, in particular from 10 to 20%, of ⁇ -glucans; from 30 to 50%, in particular from 35 to 45%, of ⁇ -glucans (in particular from ⁇ 6-glucans; and from 30 to 55%, in particular from 40 to 50%, of mannans.
  • the yeasts are chosen from yeasts of the genus Saccharomyces. They can thus be chosen from the group comprising the strains deposited with the National Collection of Microorganism Culture under the numbers CNCM I-3799, CNCM I-3856, CNCM I-4407, CNCM I-4563, CNCM 1-4812, CNCM I-4978, CNCM 1-5128, CNCM 1-5129, CNCM I-5268, and CNCM I-5269 and the strain deposited with the Collection of industrial yeasts DBVPG 6763.
  • a process for obtaining a composition of yeast comprising: a) at least one step of fractionating (typically by hot incubation) of a parietal composition of yeast(s) and recovery (extraction) of an insoluble fraction (called “insoluble fraction a”); and b) at least one step of extracting a soluble fraction (called "soluble fraction b") from the insoluble fraction a), said fraction containing ⁇ -glucans (in particular ⁇ 6-glucans), preferably also mannans and generally ⁇ -glucans - this step typically comprises at least one step of incubating the soluble fraction a) in a weak acid solution, and recovering (extraction) of a soluble fraction ("soluble fraction b”).
  • the method includes a preliminary step for obtaining an insoluble parietal fraction of yeast(s).
  • the method preferably comprises a step a1) of incubating the insoluble fraction a) in a strong base solution, after which the fraction insoluble fraction (called insoluble fraction a1) is recovered.
  • the fraction (or composition) incubated in the weak acid solution of step b) described above is then the “insoluble fraction a1”.
  • the present disclosure also relates to a composition of yeast polysaccharides comprising ⁇ -glucans, mannans and ⁇ -glucans as described in the present application, in particular as obtained according to the process described here, for its use in the treatment and/or prevention of gastrointestinal pathologies.
  • the present invention finally relates to a non-therapeutic use of a composition as defined in the present disclosure, and in particular obtained according to the process described here, for the preparation of a food composition intended to improve gastrointestinal comfort. intestinal and/or to improve and maintain the homeostasis of the intestinal microbiota.
  • FIG. 1 Diagrams illustrating the different protocols implemented.
  • the top diagram (A) illustrates the extraction of the different fractions of yeast polysaccharides from whole yeast or yeast cell walls.
  • the bottom diagram (B) corresponds to the process of the invention in which the various yeast polysaccharide fractions are extracted from yeast cell walls.
  • Fig. 2 Diagram of the preincubation protocol on T84 and Caco-2 intestinal epithelial cells.
  • the fractions extracted from yeasts are first incubated with the AIEC bacteria then added to the cultures of intestinal epithelial cells organized in epithelium.
  • the residual adhesion level of the AIEC LF82 bacterial strain is then estimated for decreasing concentrations of yeast fractions (1; 0.5; 0.25; 0.1 mg/mL).
  • FIG. 3 Residual adhesion levels (percentages) of the AIEC LF82 strain to T84 cells (preincubation protocol) in the presence of "soluble fraction a” (also called Fehling mannans because of the phospho-peptidomannan extraction protocol) (fraction 1, also called soluble fraction a”), or “soluble fraction b” (fraction 3) obtained from the whole yeast strain CNCM I-3856 (means ⁇ wk; ** : p ⁇ 0.01, * ** : p ⁇ 0.001, t-test).
  • soluble fraction a also called Fehling mannans because of the phospho-peptidomannan extraction protocol
  • FIG. 6 Residual adhesion levels (percentages) of AIEC LF82 strain to T84 cells (preincubation protocol) in the presence of "soluble fraction b" (fraction 3) obtained from CNCM I-3856 yeast cell walls or from leave of CNCM I-5268 yeast cell walls (means ⁇ sem; * :p ⁇ 0.05; ** :p ⁇ 0.01; *** :p ⁇ 0.001; t test).
  • FIG. 7 Residual adhesion levels (percentages) of AIEC LF82 cells to T84 cells (preincubation protocol) in the presence of "soluble fraction b" (fraction 3), ⁇ -glucans (fraction 5), or ⁇ 6-glucans (fraction 4) from CNCM I-5268 yeast cell walls (means ⁇ wk; * : p ⁇ 0.05; *** : p ⁇ 0.001; t test).
  • FIG. 8 Residual adhesion levels (percentages) of the AIEC LF82 strain to TC7/Caco-2 (preincubation protocol) in the presence of the "soluble fraction a" (fraction 1) obtained from the whole yeast strain CNCM I -3856 or yeast strain LV04, or "soluble fraction b" (fraction 3) obtained from whole yeast strain CNCM I-3856, or from yeast cell walls CNCM I-5268 (means ⁇ wk; ** :p ⁇ 0.01, *** :p ⁇ 0.001, t-test).
  • FIG. 9 Levels of residual invasion (percentages) of TC7/Caco-2 cells by the bacterial strain AIEC LF82 (preincubation protocol) in the presence of the "soluble fraction b" (fraction 3) from yeast cell walls CNCM I- 5268.
  • FIG. 10 Graph representing the protocol for administration of yeast fractions (FL: yeast fraction) in vivo in mice (murine model of colonization by AIEC). The yeast fractions are administered at a dose of 5 mg/mouse orally. Fractions tested: "soluble a" (fraction 1), obtained from the whole yeast strain CNCM I-3856 or "soluble b” (fraction 3), obtained from the whole yeast strain CNCM I-3856, or from CNCM I-5268 yeast cell walls.
  • Fig. 11 Estimate of the number of AIEC LF82 bacteria in the faeces of mice 2 or 3 days after infection of the animals depending on the fraction of yeast administered. The results are given in number of AIEC bacteria/g of faeces (box and whiskers, min. to max.) (FP: parietal fraction).
  • FIG. 12 Quantification of AIEC LF82 bacteria associated with the intestinal mucosa of mice treated or not, with yeast fractions, 4 days after infection. The results are given in number of AIEC bacteria/g of tissue (box and whiskers, min to max) (FP: parietal fraction).
  • a temperature of about 100°C should be understood as a temperature between 80 and 120°C, in particular between 85 and 115°C, in particular between 90°C and 110°C and preferably between 95°C and 105°C.
  • the inventors of the present application have developed a new process, making it possible to obtain a composition of parietal fragments of yeast, the effectiveness of which, in particular on the inhibition of adhesion and bacterial invasion, in particular of adherent and invasive E coli bacteria (AIEC), is significantly increased compared with whole yeasts or the derivatives described in the prior art.
  • AIEC adherent and invasive E coli bacteria
  • compositions of yeast polysaccharides extracted from parietal fragments of yeast exhibits an activity which inhibits adhesion and bacterial invasion which is much greater than compositions of yeast polysaccharides, the said polysaccharides of which are obtained from whole yeasts.
  • compositions of yeast polysaccharide(s) according to the invention containing in particular ⁇ 1,6-glucans, and optionally mannans and ⁇ -glucans also exhibit a higher activity than the mannan fractions previously described.
  • the present disclosure relates to a composition of yeast parietal polysaccharides comprising ⁇ -glucans.
  • the ⁇ -glucans comprise ⁇ (1,6)-glucans (also called ⁇ 6-glucans below, in particular in the examples).
  • said composition further comprises mannans and/or ⁇ -glucans.
  • a yeast cell is schematically composed of an envelope, also called shell or wall, and a content.
  • envelope also called shell or wall
  • wall qualifying the polysaccharides or the yeast fragments described here are thus used synonymously.
  • the term “parietal polysaccharides” thus means the polysaccharides constituting the wall (or the bark) of the yeast.
  • yeast Three main groups of polysaccharides form the wall of yeast, in particular of Saccharomyces cerevisiae yeast: mannose polymers (or mannans), representing approximately 40% of the dry mass of the yeast wall, glucose polymers ( ⁇ - glucan and ⁇ -glucan), accounting for about 60% of the dry mass of the cell wall, and N-acetylglucosamine (chitin) polymers, accounting for about 2% of the dry mass of the cell wall.
  • mannose polymers or mannans
  • glucose polymers ⁇ - glucan and ⁇ -glucan
  • chitin N-acetylglucosamine
  • Glucans are polysaccharides composed of glucose monomers which may or may not be branched. They can be separated into different subtypes depending on the mode of glucose binding.
  • ⁇ -glucans are polymers of glucose monomers mainly linked together by ⁇ (1-4) bonds.
  • Yeast ⁇ -glucans are polysaccharides composed of glucose monomers and can be divided into two subtypes depending on the mode of glucose binding: long chains of approximately 1500 units of ⁇ -1,3-glucose which represent approximately 85% of yeast ⁇ -glucans, and the short chains of approximately 150 b-1,6-glucose units which represent approximately 15% of yeast ⁇ -glucans (Klis, F., Mol, P., Hellingwerf, K. and Brui, S. (2002) "Dynamic of cell wall structure in Saccharomyces cerevisiae", FEMS Microbiology Reviews 26, 239-256).
  • the short b-1,6-glucan chains are involved in covalent bonds with ⁇ -1,3-glucan, mannoproteins and chitin. These cross-links may also contribute to the modular structure of the cell wall (Kollar, R et al. (1995) “Architecture of the yeast cell wall. b-(1,6)-glucan interconnects mannoprotein, b-(1,3 )-glucan, and chitin.” Journal of Biological Chemistry 270, 17762-17775).
  • Mannans are polymers or oligomers of mannoses associated via an N-glycan type core.
  • yeast Saccharomyces cerevisiae mannans are polymers of a1,6 mannoses branched at a1,2 with terminal a1,3 (see in particular Sendid et al., Med Sci (Paris). 2009; 25(5):473 -482).
  • a fraction enriched in mannans according to the present application comprises at least 30% of mannans, in particular at least 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% mannans.
  • ⁇ 6-glucan fraction is meant a fraction enriched in ⁇ -1,6-glucan polysaccharides.
  • a fraction comprises at least 30% of b-1,6-glucans, in particular at least 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% , 90%, 95%, 99% b-1,6-glucan polymers.
  • ⁇ 3-glucan fraction is meant a fraction enriched in ⁇ 1,3-glucans.
  • a fraction comprises at least 30% of b-1,3-polymers glucan, in particular at least at least 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% of b-1 polymers ,3-glucan.
  • a-glucan fraction (or glycogen) is understood to mean a fraction enriched in a1,4 a1,6 glucans.
  • a fraction comprises at least 60% of a1,4 a1,6 glucan polymers, in particular at least 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% of a1,4 polymers -a1,6 glucans.
  • the yeast polysaccharide compositions described in the prior art and typically obtained from whole yeast typically comprise from 60 to 80% ⁇ -glucans, conventionally from 65 to 75% ⁇ -glucans, from 5 to 25% ⁇ -glucans, typically 10 to 20% ⁇ -glucans and 5 to 25% mannans, typically 10 to 20% mannans.
  • compositions obtained from parietal fraction(s) of yeast(s) are enriched in b-glucans, typically in b6 glucans, and preferably also in mannans.
  • compositions obtained from a parietal fraction of yeast(s) comprise heterogeneous polymers associated by strong, non-dissociable and typically covalent bonds, composed of alpha-glucans , beta-glucans (in particular beta-6 glucans), and mannans, as described above.
  • the yeast polysaccharide compositions of the invention typically comprise at least 30% of ⁇ -glucans, in particular from 30 to 50% of ⁇ -glucans, preferably from 35 to 45% of ⁇ -glucans, in particular of b(1,6)-glucans.
  • the yeast polysaccharide compositions of the present disclosure further comprise mannans.
  • the compositions of the present application are enriched in mannans and can comprise from 30 to 55% of mannans, in particular from 40 to 50% of mannans.
  • compositions of yeast polysaccharides according to the present disclosure comprise ⁇ -glucans, in particular from 5 to 25%, in particular from 10 to 20% of ⁇ -glucans.
  • said compositions comprise the following proportions of polysaccharides:
  • ⁇ -glucans from 30 to 50% of ⁇ -glucans, preferably from 35 to 45% of ⁇ -glucans, in particular of b(1,6)-glucans
  • the yeast walls (or shells) used in the present application may be derived from one or more types of yeast.
  • Yeasts are unicellular eukaryotic microorganisms belonging to the kingdom of fungi.
  • Yeasts particularly suitable for the implementation of the present disclosure are in particular yeasts of the Saccharomyces genus. These yeasts constitute a taxonomic genus of ascomycetes which do not form mycelium and include several species used in the food industry as fermentation agents.
  • the yeasts belonging to the genus Saccharomyces can be chosen from food yeasts such as S. cerevisiae, S. uvarum, S. bayanus or S. pasteurianus.
  • the yeast is a strain of the species Saccharomyces cerevisiae (brewery, or distillery, or bakery yeast, S. cerevisiae var. boulardii).
  • Saccharomyces cerevisiae yeast strains deposited with the National Collection of Microorganism Cultures under the numbers CNCM I-3799, CNCM I-3856, CNCM I-4407, CNCM I-4563, CNCM 1-4812, CNCM I-4978, CNCM I-5128, CNCM I-5129, CNCM I-5268, and CNCM I-5269 are particularly well suited to the present disclosure.
  • compositions of the present disclosure can be obtained from one or more yeasts of different strains, or of different species.
  • compositions of the present disclosure are typically obtained from preparations of yeast walls or yeast wall fragments separated from the cellular contents (cytoplasm), in particular by extraction of parietal polysaccharides from yeast wall fragments. .
  • the methods for obtaining yeast walls or yeast wall fragments are well known in the technical field of the present disclosure. In this regard, we can consult the reference work (“Yeast Technology”, 2nd edition, 1991, G Reed and TW Nagodawawithana, published by Van Nostrand Reinhold, New York, ISBN 0-444-31892-8).
  • yeast wall fragments or yeast cell wall fragments can be obtained by chemical (solvents, acids, bases), physical (sonication, high pressure), enzymatic (typically use of proteases and nucleases) or autolysis (endogenous enzymes) of the yeast cells followed by separation of the soluble and insoluble parts, for example by physical means such as centrifugation and recovery of the insoluble fraction (or part).
  • the centrifugation of the biomass of lysed yeast cells makes it possible to obtain a supernatant and a centrifugation pellet.
  • the supernatant consists mainly of free amino acids and peptides resulting from the degradation of proteins and nucleotides resulting from the degradation of nucleic acids (RNA, DNA).
  • the centrifugation pellet contains the intact or partially degraded yeast walls in the form of yeast cells emptied of their contents.
  • Yeast autolysis is a hydrolysis of the cell content of the yeast by its own enzymes. It is typically obtained by placing a suspension of yeast cells under certain physical medium conditions and/or in contact with activators causing apoptosis of the yeast cells and the release of its enzymes into the cell body. Hydrolysis of cell contents produces soluble compounds.
  • the insoluble fraction recovered after the separation step constitutes the product called cell walls, or walls of yeast and comprises the cytoskeleton of the yeasts and the membranes and components not solubilized by autolysis or heterolysis. This insoluble fraction is often recovered in the form of an aqueous suspension (or composition) of yeast cell wall.
  • the yeast cell walls can be in liquid form (15-20% dry matter), in dry form (more than 85% dry matter) or in pasty form (25 to 85% dry matter).
  • Yeast hulls are preferably presented in dry form.
  • CNCM I-5268 yeast cell wall fragments are exemplified in the compositions and/or methods described herein.
  • the present disclosure also relates to a process for obtaining a composition of parietal polysaccharides from yeast(s) as described above.
  • said method comprises in particular:
  • said method comprises a preliminary step, consisting in recovering a parietal fraction of yeast(s).
  • this step is typically carried out by obtaining an insoluble fraction from a hydrolyzate (in particular an autolysate) of yeast(s), as described previously.
  • This step aims in particular to eliminate all or part (at least 60%, in particular at least 75%, in particular at least 80%, at least 85%, at least 90% and more particularly at least 95%) of the compounds, not associated, or weakly associated with the wall (see in this regard the method for obtaining a yeast parietal fraction described previously).
  • Step a) of hot extraction can be carried out by hot incubation of the yeast parietal fragments (s) in a solution, typically buffered at neutral pH, at a temperature above 75°C, in particular between 80 and 180°C, in particular between 90 and 150°C, in particular between 95 and 145°C. Typically at a temperature of about 120°C.
  • neutral pH is meant a pH of approximately 7, in particular a pH of between 6 and 8.
  • the hot incubation is typically maintained for a period of at least 30 minutes, in particular at least 1 h, typically between 1 h and 4 h, or between 1 h and 3 h. Preferably, the incubation is maintained for approximately 1.5 hours.
  • the buffered solution is typically a solution based on citrate buffer (approximately 20 mM) or any other equivalent buffer solution in the field.
  • the soluble and insoluble fractions are separated, typically by centrifugation, and the insoluble fraction (insoluble a) is recovered.
  • the centrifugation can be carried out at a speed of 4000 to 6000 rpm, preferably approximately 5000 rpm for a duration of at least 20 min, in particular between 20 min and 40 min, preferably approximately 30 minutes. This step can be repeated between 2 and 4 times, preferably 2 times.
  • the soluble fraction, recovered at the end of this hot hydrolysis step typically comprises phospho-peptidomannans, not strongly associated (typically associated non-covalently) with parietal polysaccharides.
  • the method preferably comprises a step a1) of extraction in a strong base solution of an insoluble fraction, typically a step of incubation of the insoluble fraction obtained at the end of step a) (known as "insoluble fraction a") in a strong base solution, after which the insoluble fraction (called “insoluble fraction a1" is recovered.
  • insoluble fraction a1 the fraction (or composition) incubated in the solution weak acid of step b) described above is then the “insoluble fraction a1”.
  • Step a1), of extraction in a strong base solution typically comprises a step of incubating the insoluble fraction a) in a strong base solution.
  • the strong base solution is typically a solution of sodium hydroxide (NaOH) or any other equivalent, preferably concentrated to about 1 N.
  • Incubation in the strong base solution is typically carried out at room temperature, preferably between 16 and 24°C, especially at about 20°C. It is ideally carried out with stirring for a period of at least 16 hours, typically between 4 p.m. and 32 p.m. and preferably 24 hours.
  • the soluble and insoluble fractions are then separated, typically by centrifugation, and the insoluble fraction a1) is recovered.
  • the centrifugation can be carried out at a speed of 5000 to 8000 rpm, preferably approximately 7000 rpm for a duration of at least 20 min, in particular between 20 min and 40 min, preferably approximately 30 minutes. Steps hot incubation followed by centrifugation. The inventors believe that this step makes it possible to eliminate residual phospho-peptidomannans.
  • Step b) of extraction in a weak acid solution typically comprises a step of incubation of the "insoluble fraction a" or "a1" (if the intermediate extraction step in a strong base has implemented) in a weak acid solution.
  • the weak acid solution is typically a solution of acetic acid or any other equivalent, preferably concentrated to around 0.5 N.
  • Incubation in the weak acid solution is typically carried out at a temperature of at least 70° C, in particular between 75 and 130, in particular between 75 and 115°C, in particular at about 90°C. It is ideally carried out, preferably with stirring, for a period of at least 1 hour, typically between 2 and 4 hours and preferably 3 hours.
  • the soluble and insoluble fractions are then separated, preferably by centrifugation, and the soluble fraction (called soluble fraction b) is recovered.
  • the centrifugation can be carried out at a speed of 4000 to 6000 rpm, preferably approximately 5000 rpm for a duration of at least 20 min, in particular between 20 min and 40 min, preferably approximately 30 minutes. This step must be repeated at least twice, in particular at least 3 times, 4 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, in particular between 3 and 8 times.
  • centrifugation steps of the method of the present application are carried out at room temperature, preferably between 16 and 24°C, in particular at around 20°C.
  • the “soluble b” fraction obtained according to the protocol described here is a fraction enriched in ⁇ -glucans, in particular in b-6 glucans and preferably also in mannans (as defined previously). Such a fraction also typically contains ⁇ -glucans.
  • the process of the invention makes it possible to obtain a composition in particular as described previously, and having the advantageous effects as claimed here.
  • a fraction of ⁇ 3-glucan ie., typically enriched in beta-3 glucans as described above
  • the insoluble fraction also called “insoluble fraction b”
  • this step b) can be repeated at least twice, in particular at least 3 times, 4 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, in particular between 3 and 8 times.
  • a fraction enriched with ⁇ 6-glucans can be obtained from the soluble fraction obtained at the end of step (b) (“soluble fraction b”).
  • soluble fraction b an isolated fraction of ⁇ 6-glucans can for example be obtained by enzymatic treatment, typically with an amyloglucosidase (for example from Aspergillus niger).
  • the soluble fraction obtained at the end of step (b) (“soluble fraction b”) can be treated with an iodine solution (as illustrated in the examples).
  • Incubation in the iodine solution is typically carried out at room temperature (preferably between 16 and 24°C, in particular at approximately 20°C) (it is ideally carried out with stirring for a period of at least 15 min, typically between 20 and 45 min, and preferably 30 min).
  • the soluble and insoluble fractions are then separated, typically by centrifugation, and the soluble fraction (also called “soluble fraction c”) recovered.
  • the centrifugation can be carried out at a speed of 4000 to 6000 rpm, preferably approximately 5000 rpm for a duration of at least 20 min, in particular between 20 min and 40 min, preferably approximately 30 minutes.
  • ethanol solution can then be added to the supernatant and the solution centrifuged under the same conditions as before).
  • a concentrated solution of strong acid typically a hydrochloric acid solution concentrated to at least 2N, preferably to approximately 3N
  • This second method makes it possible to recover isolated ⁇ 6-glucan and ⁇ -glucan enriched fractions (see also the methods described in the results).
  • the data obtained by the inventors have shown that the "soluble b" fraction, obtained from yeast cell walls, very significantly inhibits the adhesion of pathogenic bacteria of the type AIEC, with the consequence of a significant reduction in the invasion of AIEC bacteria (adherent invasive E. coli) in the intestinal tissues and therefore in their infectivity.
  • AIEC have also been shown to adhere to intestinal cells by binding to a mannose-rich glycoprotein known as CEACAM6.
  • CEACAM6 mannose-rich glycoprotein
  • transgenic mice expressing the human CEACAM6 protein become very susceptible to AIEC infections whereas this pathotype is generally not very virulent against rodents. Treatment of mice infected with yeast strains or identified yeast derivatives reduced the colonization of the digestive tract by AIEC bacteria, thus validating the in vitro data.
  • the “soluble fraction b”, as described here, comprises alpha (1-4) and (1-6) glucosidic units as well as mannosidic units which seem important for the presentation or the 3D conformation of the binding structures, so that such a fraction makes it possible to effectively inhibit the adhesion of bacteria to the intestinal wall.
  • compositions having an advantageous activity as described here, and/or obtained according to the method of the present disclosure as a medicament.
  • a composition as described here is particularly suitable for the treatment or prevention of gastrointestinal pathologies or diseases.
  • Said composition is typically a composition obtained from yeast cell walls, preferably of the genus Saccharomyces and enriched in b glucans (in particular b6 glucans) and advantageously also in mannans.
  • said composition comprises at least 30% ⁇ -glucans and advantageously at least 30% mannans.
  • treatment are defined as the administration of a composition as described herein to a patient in need thereof, for the purpose of curing, relieving , to remedy, ameliorate, and/or affect disease, and/or any symptoms of disease, including gastrointestinal disease, bowel disorder, or functional bowel disorder.
  • treating means the reduction or alleviation of at least one undesirable clinical symptom associated with the disease, for example pain, inflammation, diarrhea, nausea or vomiting, loss appetite, or fatigue.
  • prevent or "prevention” as used herein are defined as the administration of a composition as described herein to a patient in need thereof, for the purpose of preventing the onset of disease or at least one of his symptoms and/or to reduce the severity of at least one of his symptoms.
  • compositions of the invention can be used in clinical nutrition for the treatment or prevention of the pathologies described herein.
  • patient is typically meant a mammal and in particular a human being.
  • the patient may be in remission and the administration of a composition according to the present application may aim to avoid or limit relapses, in particular to reduce the severity of at least one of the symptoms of the disease or of the functional disorder in case of relapse.
  • the composition of the invention is intended for veterinary use, typically for animal health.
  • the patient is a non-human mammal, typically chosen from domestic or companion animals (such as cats or dogs) or livestock (ruminants, pigs, goats, sheep, horses, donkeys, etc. ).
  • the gastrointestinal pathologies covered by the present application may or may not be chronic, possibly associated, or not, with diarrhea or constipation. They typically include functional bowel disorders, infectious bowel disease, colorectal cancer and/or chronic inflammatory bowel disease.
  • Functional bowel disorders include in particular irritable bowel syndrome, functional abdominal distension, functional constipation, functional diarrhea, and any other unspecified functional bowel disorder (see in particular P. de Saussure & D Bertolini; Rev Med Switzerland 2006; volume 2.31649, “Functional intestinal disorders: contributions and limits of evidence-based medicine”.
  • Infectious intestinal diseases typically include gastroenteritis, food poisoning and/or diarrhoea, of viral, bacterial or parasitic origin.
  • Inflammatory bowel disease (IBD) typically includes Crohn's disease and ulcerative colitis.
  • compositions of the present application are particularly useful for combating gastrointestinal colonization by pathogenic microorganisms, reducing adhesion to the intestinal mucosa, or even reinforcing the barrier function of the intestine against pathogenic microorganisms.
  • Tests for inhibiting the adhesion of pathogenic microorganisms on intestinal epithelial cultures such as the T84 line, or on enterocytes obtained from intestinal biopsies of patients, with or without preincubation with the composition tested are in particular described in the results of the present application as well as in application WO 2009/103884 and the article by Sivignon et al. (IBD, 2015, vol 21 (2):276-286).
  • infectious gastrointestinal pathologies but also IBD and colorectal cancer are generally associated with the presence of pathogenic microorganisms and/or an imbalance of the intestinal microbiota (dysbiosis) linked to the invasive nature of a specific pathogenic microorganism (see Rahmouni O, Dubuquoy L, Desreumaux P, Neut C. “Enteric microflora in inflammatory bowel disease patients”. Med Sci (Paris). 2016 Nov;32(11):968-973; Kaper J. B., Nataro J. P. , Mobley H.L.
  • compositions described here are particularly useful for reducing the adhesion and invasion of the gastric and/or intestinal mucous membranes and the associated inflammation, in particular for the pathologies listed above.
  • the target pathogenic microorganisms of the compositions described here are typically intestinal pathogens, typically bacterial species of the Enterobacteriaceae family (such as Salmonella spp., Klebsiella spp., Serratia spp. or Escherichia coli (E. coli), bacteria of the Clostridioides difficile species or even yeasts of the Candida albicans species, advantageously bacteria whose adhesion to cells involves the adhesin FimH of type 1 pili.E. coli bacteria associated with the colonic mucosa (mucosa associated E. coli) are preferably targeted, and in particular E. coli bacteria of the AIEC type (E coli), ETEC (enterotoxigenic E.
  • Ectal cancer or at risk of developing for colorectal cancer.
  • the present application also relates to the non-therapeutic use of a composition as described above in the form of a functional food, a food supplement or a functional food aimed at improving or maintaining intestinal comfort, and/ or to improve the intestinal flora (typically by limiting intestinal colonization by pathogenic commensal bacteria).
  • improving or maintaining intestinal comfort is meant in particular limiting or preventing intestinal bloating, limiting or preventing aerophagia, and/or regulating transit in humans or animals.
  • a composition according to the present application may comprise, in addition to the active fraction extracted from yeast cell walls (consisting of the parietal polysaccharide fraction as described above and preferably obtained according to the process described), any excipient, support and / or adjuvant conventionally used in the pharmaceutical field, or for the formulation of a food supplement, nutraceutical, or functional food, and which is chemically compatible with said active fraction (ie ⁇ -glucans, mannans and ⁇ -glucans parietal yeast, in particular the “soluble fraction b” illustrated as an example).
  • a composition of the invention may comprise constituents chosen from vitamins, trace elements, amino acids, and other additives intended for food and/or animal or human health.
  • a food which contains ingredients having beneficial effects for health or capable of improving physiological functions, in particular for the present, digestive well-being.
  • Food supplement means a foodstuff intended to supplement the normal diet, in accordance with Directive 2002/46/EC.
  • a food supplement constitutes a concentrated source of nutrients or other substances having a nutritional or physiological effect, when taken alone or in combination, in small quantities.
  • foodstuffs intended for particular nutrition we mean a food with a particular nutritional objective, intended for a well-defined population group, such as infants, young children, athletes.
  • Physiologically acceptable adjuvants, vehicles and excipients are typically described in the "Handbook of Pharmaceutical Excipients", second edition, American Pharmaceutical Association, 1994.
  • Carriers, excipients, and adjuvants conventionally used include, but are not limited to, saline solutions, solvents, dispersing media, coatings, preservatives, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents, and absorption-delaying agents.
  • composition can be used as a medicament or as an active ingredient, or else in the context of a non-therapeutic use as, typically, a food supplement.
  • the formulation and the dosage of the active fraction are then adapted to the chosen use.
  • composition in the context of a therapeutic use, can be formulated for oral or enteral administration.
  • the composition of the food according to the present invention may be in different galenic forms, such as the liquid form or in the form of a capsule, dragee, pill, powder, suppository, or any other galenic formulation.
  • the food composition according to the present invention can be presented in a large number of food and drink forms, for example juices or milk-based preparations.
  • step 3 at least 5 times until 5L of supernatant has been collected (consisting mainly of glycogen and bq-Glucans, also called “soluble fraction b”). Neutralize the supernatant with a solution of NaOH, concentrated by water evaporator. Then dialyze (MWCO 3500) against water at 4°C, overnight. The fraction obtained constitutes the soluble fraction b). Analysis of this fraction demonstrates that it comprises b-6 glucans, ⁇ -glucans (glycogen) and mannans strongly bound (ie not dissociated by the hot extraction step) to the glucan polymers.
  • CNCM I-3856 live yeast Saccharomyces cerevisiae deposited under the number CNCM I-3856;
  • Adhesion test The tests were carried out on T84 or Caco-2/TC7 cells seeded at 1.5x10 5 cells/well in a 48-well plate and incubated for 48 hours at 37°C in an atmosphere containing 5% of C02.
  • the AIEC LF82 bacteria at 1.2 ⁇ 10 7 CFU/mL were incubated for 1 hour, on a Stuart® orbital shaker at room temperature, with increasing concentrations of the yeast sample (ratio 1:1).
  • the cells were infected with the bacteria/yeast extract mixture for 3 hours at 37° C. in an atmosphere containing 5% C02. Cells were infected at a multiplicity of infection of 10 bacteria/cell.
  • Mean adhesion rates (from at least 3 independent experiments) were expressed as percent residual adhesion, which is the ratio of bacterial adhesion in the presence of yeast to adhesion in l absence of yeast is considered 100%.
  • the error bars correspond to the standard error of the mean or SEM.
  • Invasion test the protocol is identical to that of the adhesion test, however after the 3 hour incubation period, the cells are incubated for 1 hour with gentamycin (100 ⁇ g/mL), so as to eliminate the extracellular bacteria and counting only invasive bacteria.
  • the “soluble a” fraction (phospho-peptidomannan) obtained from whole CNCM I-3856 yeasts significantly inhibits the adhesion of AIEC bacteria to T84 epithelial cells.
  • the “soluble b” fraction derived from this same whole yeast also exhibits a significant inhibitory activity on the adhesion of AIEC bacteria.
  • FIG. 4 shows that the phosphorylated ⁇ 3-glucan fraction, derived from whole CNCM I-3856 yeast also significantly, although more moderately, inhibits the adhesion of AIEC bacteria to T84 epithelial cells.
  • FIG. 5 illustrates the comparison of the inhibitory activities on the adhesion of AIEC bacteria to T84 epithelial cells, of “soluble b” fractions obtained either from whole yeasts (CNCM I-3856), or from fraction parietal of this same yeast. Although both exhibit significant inhibitory activity, the fraction obtained from the parietal fraction exhibits greater activity than that obtained from whole yeast (residual adhesions at a dose of 1 mg/mL is 17% and 42 % respectively). These different activities are correlated with different compositions of the “soluble b” fraction.
  • FIG. 6 illustrates the comparison of the inhibitory activities on the adhesion of AIEC bacteria to T84 epithelial cells, of the soluble fractions b) obtained from two yeast parietal fractions: CNCM I-5268 or CNCM I-3856. A very significant inhibitory activity is observed for these two fractions. The percentages of residual adhesion for equal doses being of the same order, this result strongly suggests that the increase in inhibitory activity is not directly linked to the strain used (CNCM I-5268 vs. CNCM I-3856 ) but rather to the process of obtaining.
  • the soluble fractions b) obtained from parietal yeast fractions exhibit an inhibitory activity, on the adhesion of AIEC bacteria to epithelial cells, which is much greater than that observed for the soluble fractions b) obtained from whole yeasts.
  • FIG. 7 illustrates the residual adhesion of AIEC LF82 bacteria to T84 epithelial cells, in the presence of soluble fractions b), glycogen or bq-glucans, obtained from parietal fractions of CNCM I-5268 yeasts.
  • the results show that the bq-glucans are less effective than the soluble fraction b) and that the glycogen fraction has an intermediate activity.
  • the soluble fraction b) is the most effective fraction.
  • Figure 8 shows the residual adhesion (in percentage) of AIEC LF82 bacteria to TC7/Caco-2 cells in the presence of mannan fractions (growinging mannans) obtained from whole yeast (CNCM I-3856, or LV04), soluble b) obtained from whole CNCM I-3856 yeast or from the parietal fraction of CNCM I-5268 yeast.
  • FIG. 9 illustrates results showing a strong inhibition of the invasion of TC7/Caco-2 cells by AIEC LF82 bacteria pre-incubated with increasing doses of the soluble fraction b) obtained from parietal fractions of yeasts CNCM I-5268.
  • the colonization of the intestinal tract by the AIEC LF82 strain was carried out in CEABAC10 transgenic mice expressing the human protein CEACAM6, acting as a receptor for AIEC bacteria in the context of Crohn's disease.
  • the yeast fractions were administered orally once a day from day -7 to day 0 and twice a day (5 hours apart) from day 1 to day 3.
  • the fractions were solubilized in PBS at a concentration of 25 mg/ml (every day) and an amount of 0.2 ml/mouse was administered by gavage (5 mg/mouse).
  • mice received 0.5% DSS in water of drink.
  • the mice were treated po with streptomycin (5 mg/mouse).
  • LB culture medium Lia Bertani
  • AIEC LF82 bacteria strain was inoculated (to 1/100th) with the AIEC LF82 bacteria strain and incubated at 37° C. with stirring until the exponential growth phase. After centrifugation, the bacteria were concentrated at 2.5 ⁇ 10 10 bacteria/mL. A quantity of 0.2 ml_ was then administered by gavage to the mice, ie 5 ⁇ 10 9 bacteria/ml.
  • mice were monitored for 4 days following the infection. Feces were collected on days 1, 2, 3 and 4 after infection to assess bacterial colonization.
  • mice were euthanized on the fourth day after the infection and the intestine was removed to evaluate the bacterial colonization associated with the mucosa (ileum+colon).
  • Figure 11 shows the estimate of the number of bacteria in the faeces of mice 2 and 3 days post-infection, depending on the fraction of yeast administered. The results show that the quantity of bacteria in the faeces is reduced by 25 in response to the treatment with the soluble fraction b) obtained from parietal fraction of yeast CNCM I-5268 compared to the untreated group, which confirms the excellent properties anti-adhesive properties of this fraction demonstrated in vitro in a pre-clinical model.
  • FIG. 12 shows the quantification of the AIEC LF82 bacteria associated with the intestinal mucosa in mice treated or not with the yeast fractions, 4 days after infection.
  • the results indicate the absence of bacteria in 100% mice treated with the soluble fraction b) obtained from parietal fraction of yeast CNCM 1-5268, thus corroborating the results obtained in the faeces.

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Abstract

La présente demande se rapporte à une composition de polysaccharides de levure comprenant des β(1,6)-glucanes, de préférence également des mannanes et des α-glucanes, caractérisée en ce que lesdits polysaccharides de levures sont extraits de fragments pariétaux de levures. Typiquement, les β-glucanes sont des β(1,6)- glucanes. Elle se rapporte également à un procédé d'obtention d'une telle composition comprenant au moins une étape de fractionnement d'une composition pariétale de levure(s) et d'extraction d'une fraction insoluble, et au moins une étape d'extraction d'une fraction soluble à partir de la fraction insoluble obtenue à l'étape a). La présente demande se rapporte enfin à une composition à visée thérapeutique, humaine ou vétérinaire, pour le traitement des pathologies gastro-intestinales associées à des microorganismes pathogènes ainsi qu'à son utilisation non thérapeutique pour l'amélioration du confort intestinal.

Description

Description
Titre : Inhibiteurs glycosidiques de levure
Domaine technique
[0001] La présente divulgation se rapporte à un procédé d'obtention d'une composition de polysaccharides pariétaux de levures et à son utilisation pour le traitement de pathologies gastrointestinales ou pour la préparation de compléments alimentaires visant à améliorer le confort intestinal.
Technique antérieure
[0002] Un déséquilibre du microbiote en espèces bactériennes pro-inflammatoires et anti-inflammatoires, tout comme la prédominance de certaines familles de bactéries (Entérobactéries, Fusobactéries), ou la raréfaction d'autres espèces ( Clostridies , Faecalibacterium) ont été décrits chez des personnes atteintes de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (M ICI). Des souches spécialisées de Escherichia coli ( E . coli) sont également responsables de diarrhées, de toxi- infections alimentaires, d'infections urinaires, de septicémies et de méningites (Kaper J.B., Nataro J. P., Mobley H.L. — Pathogenic Escherichia coli, Nature Review Microbiology, 2004, 2, 123-140). En outre, de nombreuses études soutiennent maintenant le concept selon lequel le microbiote intestinal serait un facteur environnemental majeur pouvant moduler le risque de cancer colorectal. Ainsi, des bactéries commensales du microbiote pourraient être directement pro-oncogènes. C'est le cas par exemple, de certaines souches de E. coli produisant in vivo dans la lumière intestinale, une génotoxine dénommée colibactine, qui induit des dommages à l'ADN des entérocytes similaires à ceux induits par une irradiation de rayons ionisants gamma (Cuevas-Ramos G et al., « Escherichia coli induces DNA damage in vivo and triggers genomic instability in mammalian cells ». PNAS. U S A, 2010, 107, 11537-11542).
[0003] De nombreux microorganismes ont déjà été décrits dans la littérature pour leurs applications bénéfiques chez l'homme sur le tractus digestif et pour leur intérêt nutritionnel, comme décrit, par exemple, dans WO 2006/021965. Ces microorganismes sont communément désignés alors par le terme probiotique qui correspond à des microorganismes vivants capables d'apporter à l'hôte un bénéfice sur la santé lorsqu'ils sont administrés en quantité adéquate (Joint FAO/WHO Expert Consultation Probiotics in food, FAO Food and nutrition paper Nr85, ISBN 92-5-105513-0).
[0004] Plus particulièrement, l'utilisation de levures Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) pour traiter les pathologies associées aux entérobactéries est connue. Ainsi, la demande antérieure FR 2 928 652 enseigne que la souche de levure S. cerevisiae (CNCM I-3856, ScProl) présente un intérêt thérapeutique et prophylactique pour le traitement de pathologies gastro-intestinales associées aux microorganismes pathogènes en limitant notamment la colonisation et/ou l'invasion intestinale de ces microorganismes. En particulier, l'administration de cette levure entraîne une diminution des entérobactéries au niveau du colon. Les résultats montrent que les fractions riches en mannoprotéines extraites de souches de levure (ScProl et/ou SCB1 ) sont capables d'inhiber in vitro l'adhésion et l'invasion de cellules épithéliales humaines par des souches de E. coli associées à la Maladie de Crohn, une des principales MICI (souches AIEC, Adhèrent Invasive E. Coli). L'étude de Sivignon et al. (Inflamm Bowel Dis. 2015; 21 (2):276-286) enseigne également que des composés pariétaux issus de la souche CNCM I-3856 diminuent la colonisation intestinale par les bactéries AIEC ainsi que les symptômes de colites associés dans un modèle murin mimant la maladie de Crohn. La conséquence de l'inhibition de l'adhésion des AIEC sur la paroi intestinale est une diminution importante de l'invasion des AIEC dans les tissus intestinaux et donc de leur pouvoir infectieux.
[0005] Ces dernières années, une attention croissante a été accordée aux glucanes isolés de la paroi cellulaire des levures. Les glucanes pariétaux de levures ont ainsi été utilisés pour renforcer ou amorcer la réponse immunitaire chez les humains et les animaux dont la fonction immunologique est normale ou diminuée (G. Hetland. Curr. Med. Chem. - Anti-infective Agents 2003, 2:135; P.J. Rice, B.E. Lockhart, L.A. Barker, E.L. Adams, H.E. Ensley, D.L. Williams. Int. Immunopharmacol. 2004, 33:829). La demande WO 2009/103884 enseigne plus particulièrement, que les béta-glucanes pariétaux de levure (notamment la souche CNCM I-3856) limitent l'inflammation intestinale. Jawahara et al., (PLoS One 2012; 7(7):e40648) divulgue en outre, que les fractions béta-glucanes de levures S. cerevisiae (notamment la souche LYSC 318.2) sont capables d'inhiber l'action pathogène de Candida albicans. Enfin, Pengkumsri et al., (Food Sci Technol, Campinas 2017, 31 (1 ): 124- 130) divulgue que les fractions béta-glucanes ont des propriétés d'immuno- modulation qui pourraient être utiles dans le traitement des colites humaines.
[0006] Il n'existe toujours pas actuellement, à la connaissance des inventeurs, de traitement curatif satisfaisant des MICI. La chirurgie, avec exérèse des parties lésées de l'intestin grêle, est parfois envisagée, mais il s'agit une opération handicapante dont les récidives sont fréquentes. On traite ainsi généralement uniquement les symptômes, tels que l'inflammation (par le biais d'anti- inflammatoires stéroïdiens ou non et d'anticorps dirigés contre des cytokines inflammatoires) et la douleur chronique (par le biais typiquement d'analgésiques tels que les cannabinoïdes). Chez les patients dont la maladie est évolutive, les médecins instaurent rapidement un traitement immunomodulateur, pour stopper les crises, éviter l'apparition de nouvelles lésions et prévenir les risques d'évolution tumorale liés aux états inflammatoires chroniques. Néanmoins ces traitements impliquent également des effets secondaires importants à moyen et long terme. Ainsi les corticoïdes sont de moins en moins utilisés. Il est donc essentiel d'une part de développer et de perfectionner les traitements prophylactiques existants, permettant d'améliorer le confort intestinal chez les sujets sains, et d'autre part de prévenir le développement de pathologies chez des sujets à risque et d'autre part développer des thérapies efficaces mieux tolérées pour les patients souffrant de pathologies gastro-intestinales comme les MICI.
[0007] Il reste donc important de poursuivre l'effort d'innovation pour identifier de nouvelles solutions ayant une efficacité augmentée sur l'amélioration de la condition de vie des patients souffrant de pathologies gastro-intestinales notamment les pathologies impliquant des agents infectieux. En particulier, il serait tout à fait pertinent d'identifier de nouveaux ingrédients actifs ou compositions dont l'efficacité en termes d'action anti-adhésion et/ou anti-invasive est supérieure. Résumé
[0008] Il est proposé une composition de polysaccharides de levure comprenant des β-glucanes et/ou des α-glucanes et/ou des mannanes, caractérisée en ce que lesdits polysaccharides de levures sont extraits de parois de levures. Typiquement, les β-glucanes sont des β(1,6)-glucanes . Dans certains modes de réalisation, la composition comprend en outre des mannanes et des α-glucanes. En particulier la présente demande propose une composition comprenant de 5 à 25 %, notamment de 10 à 20 %, d'α-glucanes ; de 30 à 50 %, notamment de 35 à 45 %, de β-glucanes (en particulier de β6-glucanes ; et de 30 à 55 %, notamment de 40 à 50 %, de mannannes. Typiquement, les levures sont choisies parmi les levures du genre Saccharomyces. Elles peuvent ainsi être choisies parmi le groupe comprenant les souches déposées auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes sous les numéros CNCM I-3799, CNCM I-3856, CNCM I-4407, CNCM I-4563, CNCM 1-4812, CNCM I-4978, CNCM 1-5128, CNCM 1-5129, CNCM I-5268, et CNCM I-5269 et la souche déposée auprès de la Collection des levures industrielles DBVPG 6763.
[0009] Selon un autre aspect, il est proposé un procédé d'obtention d'une composition de levure comprenant : a) au moins une étape de fractionnement (typiquement par incubation à chaud) d'une composition pariétale de levure(s) et de récupération (extraction) d'une fraction insoluble (appelée « fraction insoluble a ») ; et b) au moins une étape d'extraction d'une fraction soluble (appelée « fraction soluble b ») à partir de la fraction insoluble a), ladite fraction contenant des β-glucanes (en particulier des β6-glucanes), de préférence également des mannanes et généralement des α-glucanes - cette étape comprend typiquement au moins une étape d'incubation de la fraction soluble a) dans une solution d'acide faible, et de récupération (extraction) d'une fraction soluble (« fraction soluble b »).
[0010] Typiquement, le procédé comporte une étape préliminaire d'obtention d'une fraction pariétale insoluble de levure(s).
[0011] Le procédé comprend de préférence une étape a1) d'incubation de la fraction insoluble a) dans une solution de base forte, à l'issue de laquelle la fraction insoluble (appelée fraction insoluble a1) est récupérée. Lorsque cette étape intermédiaire est mise en œuvre, la fraction (ou composition) incubée dans la solution d'acide faible de l'étape b) décrite ci-dessus est alors la « fraction insoluble a1 ».
[0012] La présente divulgation se rapporte également à une composition de polysaccharides de levure comprenant des β-glucanes, des mannanes et des a- glucanes telle que décrite dans la présente demande, notamment telle qu'obtenue selon le procédé ici décrit, pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention des pathologies gastro-intestinales.
[0013] La présente invention se rapporte enfin à une utilisation non thérapeutique d'une composition telle que définie dans la présente divulgation, et notamment obtenue selon le procédé ici décrit, pour la préparation d'une composition alimentaire destinée à améliorer le confort gastro-intestinal et/ou à améliorer et maintenir l'homéostasie du microbiote intestinal.
[0014] Les caractéristiques exposées dans les paragraphes suivants peuvent, optionnellement, être mises en œuvre. Elles peuvent être mises en œuvre indépendamment les unes des autres ou en combinaison les unes avec les autres.
Brève description des dessins
[0015] D'autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l'analyse des dessins annexés, sur lesquels :
Fig. 1
[0016] [Fig. 1] : Schémas illustrant les différents protocoles mis en œuvre. Le schéma du haut (A) illustre l'extraction des différentes fractions de polysaccharides de levure à partir de levure entière ou d'écorces de levures. Le schéma du bas (B) correspond au procédé de l'invention dans laquelle les différentes fractions polysaccharidiques de levure sont extraites à partir d'écorces de levures.
Fig. 2 [0017] [Fig. 2] Schéma du protocole de préincubation sur cellules épithéliales intestinales T84 et Caco-2. Les fractions extraites de levures sont incubées dans un premier temps avec les bactéries AIEC puis ajoutées aux cultures de cellules épithéliales intestinales organisées en épithélium. Le niveau d'adhésion résiduelle de la souche bactérienne AIEC LF82 est ensuite estimé pour des concentrations décroissantes de fractions de levure (1 ; 0,5 ; 0,25 ; 0,1 mg/mL).
Fig. 3
[0018] [Fig. 3] Niveaux d'adhésion résiduelle (pourcentages) de la souche AIEC LF82 aux cellules T84 (protocole de préincubation) en présence de « fraction soluble a » (appelée également Fehling mannanes en raison du protocole d'extraction des phospho-peptidomannanes) (fraction 1, aussi nommée fraction soluble a »), ou de la « fraction soluble b » (fraction 3) obtenus à partir de la souche de levure entière CNCM I-3856 (moyennes ± sem; **:p<0,01, ***:p<0,001, test t).
Fig. 4 [0019] [Fig. 4] Niveaux d'adhésion résiduelle (pourcentages) de la souche AIEC
LF82 aux cellules T84 (protocole de préincubation) en présence de β3-glucanes- phosphate (fraction 6) obtenue à partir de la souche de levure entière CNCM I-3856 (moyennes ± sem; **:p<0,01 , test t).
Fig. 5 [0020] [Fig. 5] Niveaux d'adhésion résiduelle (pourcentages) de la souche AIEC
LF82 aux cellules T84 (protocole de préincubation) en présence de la « fraction soluble b » (fraction 3) obtenue à partir de la souche de levure entière CNCM I-3856 ou à partir d'écorces de levure CNCM I-3856 - (moyennes ± sem; * :p<0,05 ;**:p<0,01 ; ***:p<0,001 ; test t). Fig. 6
[0021] [Fig. 6] Niveaux d'adhésion résiduelle (pourcentages) de la souche AIEC LF82 aux cellules T84 (protocole de préincubation) en présence de la « fraction soluble b » (fraction 3) obtenue à partir d'écorces de levure CNCM I-3856 ou à partir d'écorces de levure CNCM I-5268 (moyennes ± sem; * :p<0,05 ;**:p<0,01 ; ***:p<0,001 ; test t).
Fig. 7
[0022] [Fig. 7] Niveaux d'adhésion résiduelle (pourcentages) des cellules AIEC LF82 aux cellules T84 (protocole de préincubation) en présence de la « fraction soluble b » (fraction 3), α-glucanes (fraction 5), ou β6-glucanes (fraction 4) provenant d'écorces de levure CNCM I-5268 (moyennes ± sem; *:p<0,05 ; ***:p<0,001 ; test t).
Fig. 8
[0023] [Fig. 8] Niveaux d'adhésion résiduelle (pourcentages) de la souche AIEC LF82 aux TC7/Caco-2 (protocole de préincubation) en présence de la « fraction soluble a » (fraction 1 ) obtenue à partir de la souche de levure entière CNCM I-3856 ou de la souche de levure LV04, ou de la « fraction soluble b » (fraction 3) obtenue à partir de la souche de levure entière CNCM I-3856, ou à partir d'écorces de levure CNCM I-5268 (moyennes ± sem. ; **:p<0,01 , ***:p<0,001 , test t).
Fig. 9
[0024] [Fig. 9] Niveaux d'invasion résiduelle (pourcentages) des cellules TC7/Caco- 2 par la souche bactérienne AIEC LF82 (protocole de préincubation) en présence de la « fraction soluble b » (fraction 3) provenant d'écorces de levure CNCM I-5268.
Fig. 10
[0025] [Fig. 10] Graphique représentant le protocole d'administration des fractions de levure (FL : fraction de levure) in vivo chez la souris (modèle murin de colonisation par les AIEC). L'administration des fractions de levures est réalisée à la dose de 5mg/souris par voie orale. Fractions testées : « soluble a » (fraction 1 ), obtenue à partir de la souche de levure entière CNCM I-3856 ou « soluble b » (fraction 3), obtenue à partir de la souche de levure entière CNCM I-3856, ou à partir d'écorces de levure CNCM I-5268.
Fig. 11 [0026] [Fig. 11] Estimation du nombre de bactéries AIEC LF82 dans les fèces de souris 2 ou 3 jours après infection des animaux en fonction de la fraction de levure administrée. Les résultats sont donnés en nombre de bactéries AIEC/g de fèces (box and whiskers, min. to max.) (FP : fraction pariétale).
Fig. 12
[0027] [Fig. 12] Quantification des bactéries AIEC LF82 associées à la muqueuse intestinale de souris traitées ou non, avec les fractions de levures, 4 jours après l'infection. Les résultats sont donnés en nombre de bactéries AIEC/g de tissus (box and whiskers, min to max) (FP : fraction pariétale).
Description des modes de réalisation
[0028] Les dessins et la description ci-après contiennent, pour l'essentiel, des éléments de caractère certain. Ils pourront donc non seulement servir à mieux faire comprendre la présente divulgation, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant.
[0029] Par « environ », il est entendu dans la présente demande une variation de 20 %, notamment de 15 %, de 10 % ou de 5 % par rapport à la valeur numérique indiquée. À titre d'exemple, l'expression « une température d'environ 100 °C » doit être entendue comme une température comprise entre 80 et 120 °C, notamment entre 85 et 115 °C, notamment entre 90°C et 110 °C et de préférence entre 95 °C et 105°C.
[0030] Les inventeurs de la présente demande ont mis au point un procédé nouveau, permettant d'obtenir une composition de fragments pariétaux de levure, dont l'efficacité, notamment sur l'inhibition de l'adhésion et de l'invasion bactérienne, en particulier des bactéries E coli adhérentes et invasives (AIEC), est significativement augmentée par rapport aux levures entières ou aux dérivés décrits dans l'art antérieur.
[0031] Plus particulièrement, les inventeurs ont mis en évidence de façon totalement surprenante, qu'une composition de polysaccharides de levure extraits à partir de fragments pariétaux de levure (également appelés écorces ou parois de levure) présente une activité inhibitrice de l'adhésion et de l'invasion bactérienne très supérieure à des compositions de polysaccharides de levures, dont lesdits polysaccharides sont obtenus à partir de levures entières. De façon surprenante également, les compositions de polysaccharides de levure(s) selon l'invention contenant notamment des β1 ,6-glucanes, et éventuellement des mannanes et des α-glucanes présentent également une activité supérieure aux fractions mannanes précédemment décrites. Ce résultat est inattendu, dans la mesure où il était considéré, que les structures mannosidiques exposées par des glycoprotéines exprimées à la surface des entérocytes étaient exclusivement responsables de l'attachement aux cellules bactériennes via des structures fimbriales (FimH) exposées à la surface des pili de type 1 (Barnich et al. JCI, 2007).
[0032] Ainsi la présente divulgation porte sur une composition de polysaccharides pariétaux de levure comprenant des β-glucanes. Typiquement, les β-glucanes comprennent des β(1 ,6)-glucanes (également appelés β6-glucanes ci-après, notamment dans les exemples). Typiquement ladite composition comprend en outre des mannanes et/ ou des α-glucanes.
[0033] Une cellule de levure est schématiquement composée d'une enveloppe, également dénommée écorce ou paroi et d'un contenu. Dans la présente demande, les termes « pariétaux », « écorce » ou « paroi » qualifiant les polysaccharides ou les fragments de levure ici décrits sont ainsi utilisés de façon synonyme. On entend ainsi par « polysaccharides pariétaux » les polysaccharides constituants de la paroi (ou l'écorce) de la levure.
[0034] Trois groupes principaux de polysaccharides forment la paroi de levure, notamment de levure Saccharomyces cerevisiae : les polymères de mannose (ou mannanes), représentant environ 40% de la masse sèche de la paroi de levure, les polymères de glucose (β-glucane et α-glucane), représentant environ 60% de la masse sèche de la paroi cellulaire et les polymères de N-acétylglucosamine (chitine), représentant environ 2% de la masse sèche de la paroi cellulaire.
[0035] Les glucanes sont des polysaccharides composés de monomères de glucose qui peuvent être ramifiés ou non. Ils peuvent être séparés en différents sous-types selon le mode de liaison du glucose. Les α-glucanes sont des polymères de monomères de glucoses principalement liés entre eux par des liaisons a (1-4).
[0036] Les β-glucanes de levure sont des polysaccharides composés de monomères de glucose et peuvent être divisés en deux sous-types selon le mode de liaison du glucose : les chaînes longues d'environ 1500 unités de β-1,3-glucose qui représentent environ 85% des β-glucanes de levure, et les chaînes courtes d'environ 150 unités b-1 ,6-glucose qui représentent environ 15% des β-glucanes de levure (Klis, F., Mol, P., Hellingwerf, K. and Brui, S. (2002) « Dynamic of cell wall structure in Saccharomyces cerevisiae ». FEMS Microbiology Reviews 26, 239- 256).
[0037] Les chaînes courtes de b-1 ,6-glucanes sont impliquées dans des liaisons covalentes avec le β-1,3-glucane, les mannoprotéines et la chitine. Ces liaisons transversales peuvent également contribuer à la structure modulaire de la paroi cellulaire (Kollar, R et al. (1995) “Architecture of the yeast cell wall. b-(1,6)-glucan interconnects mannoprotein, b-(1 ,3)-glucan, and chitin”. Journal of Biological Chemistry 270, 17762-17775).
[0038] Les mannanes sont des polymères ou des oligomères de mannoses associés via un noyau de type N-glycanes. En particulier, les mannanes de levure Saccharomyces cerevisiae sont des polymères de mannoses a1,6 branchés en a1 ,2 avec des a1 ,3 terminaux (voir notamment Sendid et al., Med Sci (Paris). 2009; 25(5):473-482). Une fraction enrichie en mannanes selon la présente demande comprend au moins 30 % de mannanes, notamment au moins 35 %, 40%, 50%, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % de mannanes.
[0039] On entend par fraction β6-glucane une fraction enrichie en polysaccharides β-1,6-glucane. Typiquement une telle fraction comprend au moins 30 % de b-1 ,6- glucanes, notamment au moins 35 %, 40%, 50%, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % de polymères b-1 ,6-glucanes.
[0040] On entend par fraction β3-glucane une fraction enrichie en β 1,3-glucanes. Typiquement une telle fraction comprend au moins 30 % de polymères b-1,3- glucane, notamment au moins au moins 35 %, 40%, 50%, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % de polymères b-1 ,3-glucane.
[0041] On entend par fraction a-glucane (ou glycogène) une fraction enrichie en a1 ,4 a1 ,6 glucanes. Typiquement une telle fraction comprend au moins 60 % de polymères a1 ,4 a1 ,6 glucanes, notamment au moins 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % de polymères a1 ,4-a1 ,6 glucanes.
[0042] Les compositions de polysaccharides de levures décrites dans l'art antérieurs et typiquement obtenues à partir de levures entières comprennent typiquement de 60 à 80 % d'α-glucanes, classiquement de 65 à 75 % d'α-glucanes, de 5 à 25 % de β-glucanes, classiquement de 10 à 20 % de β-glucanes et de 5 à 25 % de mannanes, classiquement de 10 à 20 % de mannanes.
[0043] Les inventeurs ont montré que les compositions de polysaccharides obtenues à partir de fraction(s) pariétale(s) de levure(s) sont enrichies en b- glucanes, typiquement en b6 glucanes, et de préférence également en mannanes. Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs estiment que les compositions obtenues à partir d'une fraction pariétale de levure(s) comprennent des polymères hétérogènes associés par les liaisons fortes, non dissociables et typiquement covalentes, composés d'alpha-glucanes, de beta-glucanes (en particulier de beta-6 glucanes), et de mannanes, tels que décrits ci-dessus.
[0044] Ainsi, les compositions de polysaccharides de levures de l'invention comprennent typiquement au moins 30 % de β-glucanes, notamment de 30 à 50 % de β-glucanes, de préférence de 35 à 45 % de β-glucanes, en particulier de b(1 ,6)- glucanes.
[0045] De préférence, les compositions de polysaccharides de levures de la présente divulgation comprennent en outre des mannanes. Typiquement, les compositions de la présente demande sont enrichies en mannanes et peuvent comprendre de 30 à 55 % de mannanes, notamment de 40 à 50 % de mannanes.
[0046] De préférence, les compositions de polysaccharides de levures selon la présente divulgation comprennent des α-glucanes, notamment de 5 à 25 %, notamment de 10 à 20 % d'α-glucanes. [0047] Dans certains modes de réalisation, lesdites compositions comprennent les proportions suivantes de polysaccharides :
- de 5 à 25 % d'α-glucanes, de préférence de 10 à 20 % d'α-glucanes,
- de 30 à 50 % de β-glucanes, de préférence de 35 à 45 % de β-glucanes, en particulier de b(1 ,6)-glucanes
- de 30 à 55 % de mannanes, de préférence de 40 à 50 % de mannanes.
[0048] Les parois (ou écorces) de levures mises en œuvre dans la présente demande peuvent être issues d'un ou plusieurs types de levure. Les levures sont des micro-organismes eucaryotes unicellulaires appartenant au règne des champignons. Des levures particulièrement adaptées à la mise en œuvre de la présente divulgation sont notamment les levures du genre Saccharomyces. Ces levures constituent un genre taxonomique d'ascomycètes ne formant pas de mycélium et comprenant plusieurs espèces utilisées dans l'industrie alimentaire comme agents de fermentation. Classiquement, les levures appartenant au genre Saccharomyces peuvent être choisies parmi les levures alimentaires comme S. cerevisiae, S. uvarum, S. bayanus ou S. pasteurianus. De préférence la levure est une souche de l'espèce Saccharomyces cerevisiae (levures de brasserie, ou de distillerie, ou de boulangerie, S. cerevisiae var. boulardii ). A titre d'exemple, les souches de levure Saccharomyces cerevisiae déposées auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous les numéros CNCM I-3799, CNCM I-3856, CNCM I-4407, CNCM I-4563, CNCM 1-4812, CNCM I-4978, CNCM 1-5128, CNCM 1-5129, CNCM I-5268, et CNCM I-5269, sont particulièrement bien adaptées à la présente divulgation.
[0049] Les compositions de la présente divulgation peuvent être obtenues à partir d'une ou plusieurs levures de souches différentes, ou d'espèces différentes.
[0050] Les compositions de la présente divulgation sont typiquement obtenues à partir de préparations de parois de levures ou de fragments de parois de levure séparés du contenu cellulaire (cytoplasme), en particulier par extraction des polysaccharides pariétaux à partir de fragments de paroi de levures. Les procédés d'obtention de parois de levure ou de fragments de parois de levure sont très connus dans le domaine technique de la présente divulgation. On pourra à ce titre consulter l'ouvrage de référence (« Yeast Technology », 2ème édition, 1991 , G Reed et T.W. Nagodawawithana, publié par Van Nostrand Reinhold, New York, ISBN 0-444- 31892-8).
[0051] Brièvement, les fragments de parois de levure ou fragments d'écorce de levure peuvent être obtenus par lyse chimique (solvants, acides, bases), physique (sonication, haute pression), enzymatique (typiquement emploi de protéases et nucléases) ou autolyse (enzymes endogènes) des cellules de levure suivie d'une séparation des parties soluble et insoluble, par exemple par des moyens physiques comme la centrifugation et de la récupération de la fraction (ou partie) insoluble. Typiquement, la centrifugation de la biomasse de cellules de levure lysées permet d'obtenir un surnageant et un culot de centrifugation. Le surnageant est constitué principalement d'acides aminés libres et de peptides issus de la dégradation des protéines et de nucléotides issus de la dégradation des acides nucléiques (ARN, ADN). Le culot de centrifugation contient les parois de levures intactes ou partiellement dégradées sous forme de cellules de levure vidées de leur contenu.
[0052] L'autolyse des levures est une hydrolyse du contenu cellulaire de la levure par ses propres enzymes. Elle est typiquement obtenue en plaçant une suspension de cellules de levures dans certaines conditions physiques de milieu et/ou en contact avec des activateurs provoquant l'apoptose des cellules de levure et la libération de ses enzymes dans le corps cellulaire. L'hydrolyse du contenu cellulaire produit des composés solubles. La fraction insoluble récupérée après l'étape de séparation constitue le produit dénommé écorces, ou parois de levure et comprend le cytosquelette des levures et les membranes et composants non solubilisés par l'autolyse ou l'hétérolyse. Cette fraction insoluble est souvent récupérée sous forme d'une suspension aqueuse (ou composition) d'écorce de levures.
[0053] Les écorces de levure peuvent se présenter sous forme liquide (15-20% de matière sèche), sous forme sèche (plus de 85% de matière sèche) ou sous forme pâteuse (25 à 85% de matière sèche). Les écorces de levure sont de préférence présentées sous forme sèche. Dans certains modes de réalisation, on utilise à titre d'exemple dans les compositions et/ou les procédé ici décrits des fragments pariétaux de levure CNCM I-5268. [0054] Pour la mise en œuvre de l'invention ici décrite, on peut utiliser des parois, ou écorces de levure(s) ou toute composition en contenant provenant d'un même type de levure ou des levures de types (souches) différents ou d'espèces différentes.
[0055] La présente divulgation se rapporte également à un procédé d'obtention d'une composition de polysaccharides pariétaux de levure(s) telle que décrite précédemment. De façon préférée, ledit procédé comprend notamment :
(a) au moins une étape de fractionnement d'une composition d'écorces de levures et de récupération d'une fraction insoluble, en particulier, au moins une étape d'extraction à chaud, à partir d'une composition d'écorces de levure(s) d'une fraction insoluble (également appelée « fraction insoluble a » dans les exemples de la présente demande) , et
(b) au moins une étape d'extraction dans une solution d'acide faible, typiquement une étape d'incubation de la « fraction insoluble a » dans une solution d'acide faible, à l'issue de laquelle la fraction soluble (appelée « fraction soluble b ») est récupérée.
[0056] Typiquement, ledit procédé comprend une étape préliminaire, consistant à récupérer une fraction pariétale de levure(s). En pratique, cette étape est typiquement réalisée par l'obtention d'une fraction insoluble à partir d'un hydrolysat (notamment d'un autolysat) de levure(s), telle que décrite précédemment. Cette étape vise notamment à éliminer tout ou partie (au moins 60 %, notamment au moins 75 %, notamment au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 % et plus particulièrement au moins 95 %) des composés, non associés, ou faiblement associés à la paroi (voir à ce titre la méthode d'obtention d'une fraction pariétale de levure décrite précédemment).
[0057] L'étape a) d'extraction à chaud, (ou d'hydrolyse à chaud) peut être réalisée par une incubation à chaud des fragments pariétaux de levure(s) dans une solution, typiquement tamponnée à pH neutre, à une température supérieure à 75°C, notamment comprise entre 80 et 180 °C, notamment entre 90 et 150 °C, notamment entre 95 et 145 °C. Typiquement à une température d'environ 120 °C. Par pH neutre on entend un pH d'environ 7, notamment un pH compris entre 6 et 8. L'incubation à chaud est typiquement maintenue pendant une durée d'au moins 30 minutes, notamment au moins 1 h, typiquement entre 1 h et 4h, ou entre 1 h et 3h. De préférence, l'incubation est maintenue environ 1 ,5h. La solution tamponnée est typiquement une solution à base de tampon citrate (environ 20 mM) ou tout autre solution tampon équivalente dans le domaine. Après incubation, les fractions soluble et insolubles sont séparées, typiquement par centrifugation, et la fraction insoluble (insoluble a) est récupérée. Typiquement la centrifugation peut être effectuée à une vitesse de 4000 à 6000 rpm, de préférence environ 5000 rpm pour une durée d'au moins 20 min, notamment entre 20 min et 40 min, de préférence environ 30 minutes. Cette étape peut être répétée entre 2 et 4 fois, de préférence 2 fois. La fraction soluble, récupérée à l'issue de cette étape d'hydrolyse à chaud comprend typiquement les phospho-peptidomannanes, non associés de façon forte (typiquement associés de façon non-covalente) aux polysaccharides pariétaux.
[0058] Le procédé comprend de préférence une étape a1 ) d'extraction dans une solution de base forte d'une fraction insoluble, typiquement une étape d'incubation de la fraction insoluble obtenue à l'issue de l'étape a) (dite « fraction insoluble a ») dans une solution de base forte, à l'issue de laquelle la fraction insoluble (appelée « fraction insoluble a1 » est récupérée. Lorsque cette étape intermédiaire est mise en œuvre la fraction (ou composition) incubée dans la solution d'acide faible de l'étape b) décrite ci-dessus est alors la « fraction insoluble a1 ».
[0059] L'étape a1), d'extraction dans une solution de base forte comprend typiquement une étape d'incubation de la fraction insoluble a) dans une solution de base forte. La solution de base forte est typiquement une solution d'hydroxyde de sodium (NaOH) ou tout autre équivalent, de préférence concentrée à environ 1 N. L'incubation dans la solution de base forte est typiquement réalisée à température ambiante, soit de préférence entre 16 et 24 °C, en particulier à environ 20 °C. Elle est idéalement réalisée sous agitation pour une durée d'au moins 16h, typiquement entre 16h et 32h et de préférence 24h. Les fractions soluble et insolubles sont ensuite séparée, typiquement par centrifugation, et la fraction insoluble a1) est récupérée. Typiquement la centrifugation peut être effectuée à une vitesse de 5000 à 8000 rpm, de préférence environ 7000 rpm pour une durée d'au moins 20 min, notamment entre 20 min et 40 min, de préférence environ 30 minutes. Les étapes d'incubation à chaud suivie de la centrifugation. Les inventeurs estiment que cette étape permet d'éliminer des phospho-peptidomannanes résiduels.
[0060] L'étape b) d'extraction dans une solution d'acide faible comprend typiquement une étape d'incubation de la « fraction insoluble a » ou « a1 » (si l'étape intermédiaire d'extraction dans une base forte a été mise en œuvre) dans une solution d'acide faible. La solution d'acide faible est typiquement une solution d'acide acétique ou tout autre équivalent, de préférence concentrée à environ 0,5 N. L'incubation dans la solution d'acide faible est typiquement réalisée à température d'au moins 70 °C, notamment comprise entre 75 et 130, en particulier entre 75 et 115 °C, en particulier à environ 90 °C. Elle est idéalement réalisée, de préférence sous agitation, pour une durée d'au moins 1 h, typiquement entre 2h et 4h et de préférence 3h. Les fractions soluble et insoluble sont ensuite séparées, de préférence par centrifugation et la fraction soluble (appelée fraction soluble b) est récupérée. Typiquement la centrifugation peut être effectuée à une vitesse de 4000 à 6000 rpm, de préférence environ 5000 rpm pour une durée d'au moins 20 min, notamment entre 20 min et 40 min, de préférence environ 30 minutes. Cette étape être répétée au moins 2 fois, notamment au moins 3 fois, 4 fois, 5 fois, 6 fois, 7 fois, 8 fois, en particulier entre 3 et 8 fois.
[0061] Typiquement les étapes de centrifugation du procédé de la présente demande sont réalisées à température ambiante, soit de préférence entre 16 et 24 °C, en particulier à environ 20 °C.
[0062] Typiquement la fraction « soluble b » obtenue selon le protocole ici décrit est une fraction enrichie en β-glucanes, notamment en b-6 glucanes et de préférence également en mannanes (tel que défini précédemment). Une telle fraction contient également typiquement des α-glucanes. Ainsi, le procédé de l'invention permet d'obtenir une composition notamment telle que décrite précédemment, et présentant les effets avantageux tels que revendiqués ici.
[0063] Il est à noter qu'une fraction de β3-glucane (i.e.., typiquement enrichie en beta-3 glucanes telles que décrite précédemment) peut être obtenue à partir de fragments pariétaux (écorces) de levure selon la présente divulgation, lorsque la fraction insoluble (également appelée « fraction insoluble b ») est récupérée à l'issue de l'étape (b). De façon similaire cette étape b) peut être répétée au moins 2 fois, notamment au moins 3 fois, 4 fois, 5 fois, 6 fois, 7 fois, 8 fois, en particulier entre 3 et 8 fois.
[0064] Dans certains modes de réalisation, une fraction enrichie de β6-glucanes (contenant de préférence au moins 60 %, notamment au moins 65, 70%, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % de b6 glucanes) peut être obtenue à partir de la fraction soluble obtenue à l'issue de l'étape (b) (« fraction soluble b »). Ainsi, une fraction isolée de β6-glucanes peut par exemple être obtenue par traitement enzymatique typiquement avec une amyloglucosidase (par exemple d’Aspergillus niger). De façon préférée cependant, la fraction soluble obtenue à l'issue de l'étape (b) (« fraction soluble b ») peut être traitée avec une solution iodée (comme illustré dans les exemples). L'incubation dans la solution iodée est typiquement réalisée à température ambiante (de préférence entre 16 et 24 °C, en particulier à environ 20 °C) (elle est idéalement réalisée sous agitation pour une durée d'au moins 15 min, typiquement entre 20 et 45 min, et de préférence 30 min). Après traitement avec la solution iodée, les fractions solubles et insolubles sont ensuite séparées, typiquement par centrifugation, et la fraction soluble (également appelée « fraction soluble c ») récupérée. Typiquement la centrifugation peut être effectuée à une vitesse de 4000 à 6000 rpm, de préférence environ 5000 rpm pour une durée d'au moins 20 min, notamment entre 20 min et 40 min, de préférence environ 30 minutes. Une solution d'éthanol peut ensuite être ajoutée au surnagent et la solution centrifugée dans les mêmes conditions que précédemment). Au culot est ajoutée une solution concentrée d'acide fort (typiquement une solution d'acide chlorhydrique concentrée à au moins 2N, de préférence à environ 3N), de façon à dissocier les complexes β6-glucane et α-glucane puis précipitée (classiquement avec de l'éthanol ou tout équivalent). Cette seconde méthode permet de récupérer isolément des fractions β6-glucane et a-glucane enrichies (voir également les procédés décrits dans les résultats).
[0065] Comme indiqué précédemment, les données obtenues par les inventeurs ont mis en évidence que la fraction « soluble b », obtenues à partir d'écorces de levure inhibe très significativement l'adhésion des bactéries pathogènes de type AIEC, avec comme conséquence une diminution importante de l'invasion des bactéries AIEC (adhèrent invasive E. coli ) dans les tissus intestinaux et donc de leur pouvoir infectieux. Il a été montré également que les AIEC adhérent aux cellules intestinales en se fixant sur une glycoprotéine riche en mannose connu sous le nom de CEACAM6. Ainsi, des souris transgéniques exprimant la protéine CEACAM6 humaine deviennent très sensibles aux infections à AIEC alors que ce pathotype est généralement peu virulent vis-à-vis des rongeurs. Le traitement des souris infectées avec les souches de levures ou les dérivés de levures identifiés, a permis de diminuer la colonisation du tube digestif par les bactéries AIEC, validant ainsi les données in vitro.
[0066] Sans vouloir être tenu par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que la « fraction soluble b », telle que décrite ici comporte des motifs glucosidiques alpha (1-4) et (1-6) ainsi que des motifs mannosidiques qui semblent importants pour la présentation ou la conformation 3D des structures ligantes, de sorte qu'une telle fraction permet d'inhiber efficacement l'adhésion des bactéries sur la paroi intestinale.
[0067] La présente demande se rapporte ainsi à l'utilisation d'une composition présentant une activité avantageuse, telle que décrite ici, et/ou obtenue selon le procédé de la présente divulgation en tant que médicament. En particulier, une composition telle que décrite ici est particulièrement adaptée au traitement ou à la prévention des pathologies ou maladies gastro-intestinales. Ladite composition est typiquement une composition obtenue à partir d'écorces de levure, de préférence du genre Saccharomyces et enrichie en b glucanes (notamment b6 glucanes) et avantageusement également en mannanes. De préférence ladite composition comprend au moins 30 % de β-glucanes et avantageusement au moins 30 % de mannanes.
[0068] Les termes "traitement", ou "traiter" tel qu'ils sont utilisés ici, sont définis comme l'administration d'une composition telle que décrite ici à un patient en ayant besoin, dans le but de guérir, de soulager, de remédier, d'améliorer, et/ou d'affecter la maladie, et/ou tout symptôme de la maladie, notamment une maladie gastrointestinale, un désordre intestinal, ou un trouble fonctionnel intestinal. En particulier, les termes "traiter" ou "traitement" désignent la réduction ou le soulagement d'au moins un symptôme clinique indésirable associé à la maladie, à titre d'exemple la douleur, l'inflammation, les diarrhées, les nausées ou vomissements, la perte d'appétit, ou la fatigue. Les termes « prévenir » ou « prévention » tel qu'utilisés ici sont définis comme l'administration d'une composition telle que décrite ici à un patient en ayant besoin, dans le but d'empêcher l'apparition d'une maladie ou de l'un au moins de ses symptômes et/ou de réduire la gravité de l'un au moins de ses symptômes.
[0069] Dans certains modes de réalisation, les compositions de l'invention peuvent être utilisées en nutrition clinique pour le traitement ou la prévention des pathologies décrites ici.
[0070] Par patient on entend typiquement un mammifère et notamment un être humain. Dans certains cas, le patient peut être en rémission et l'administration d'une composition selon la présente demande peut viser à éviter ou limiter les rechutes, notamment réduire la gravité de l'un au moins des symptômes de la maladie ou du trouble fonctionnel en cas de rechute.
[0071] Dans certains modes de réalisation la composition de l'invention est destinée à un usage vétérinaire, typiquement pour la santé animale. Dans de tels modes de réalisation le patient est un mammifère non humain, typiquement choisi parmi les animaux domestiques ou de compagnie (comme le chat ou le chien) ou d'élevage (ruminants, porcs, chèvres, moutons, chevaux, ânes, etc.).
[0072] Les pathologies gastro-intestinales visées par la présente demande peuvent être chroniques ou non, éventuellement associées, ou non, à des diarrhées ou constipations. Elles comprennent typiquement les troubles fonctionnels intestinaux, les maladies intestinales infectieuses, le cancer colorectal et/ou les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.
[0073] Les troubles fonctionnels de l'intestin comprennent notamment le syndrome de l'intestin irritable, la distension abdominale fonctionnelle, la constipation fonctionnelle, la diarrhée fonctionnelle, et tout autre trouble fonctionnel intestinal non spécifié (voir notamment P. de Saussure & D Bertolini ; Rev Med Suisse 2006 ; volume 2.31649, « Troubles fonctionnels intestinaux : apports et limites de la médecine basée sur les preuves »). Les maladies intestinales infectieuses comprennent typiquement les gastroentérites, les toxi-infections alimentaires et/ou les diarrhées, d'origine virale, bactérienne ou parasitaire. Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) incluent typiquement la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique.
[0074] Les compositions de la présente demande sont particulièrement utiles pour lutter contre la colonisation gastro-intestinale par des microorganismes pathogènes, réduire l'adhésion à la muqueuse intestinale, voire renforcer la fonction de barrière de l'intestin vis-à-vis des microorganismes pathogènes. Des tests d'inhibition de l'adhésion de microorganismes pathogènes sur des cultures épithéliales intestinales comme la lignée T84, ou sur des entérocytes obtenus à partir de biopsies intestinales de patients, avec ou sans préincubation avec la composition testée sont notamment décrits dans les résultats de la présente demande ainsi que dans la demande WO 2009/103884 et l'article de Sivignon et al. (IBD, 2015, vol 21 (2) :276-286).
[0075] Comme indiqué précédemment, les pathologies gastro-intestinales infectieuses, mais également les MICI et le cancer colorectal sont généralement associés à la présence de microorganismes pathogènes et/ou à un déséquilibre du microbiote intestinal (dysbiose) lié au caractère invasif d'un microorganisme pathogène spécifique (voir Rahmouni O, Dubuquoy L, Desreumaux P, Neut C. “Enteric microflora in inflammatory bowel disease patients”. Med Sci (Paris). 2016 Nov;32(11):968-973 ; Kaper J. B., Nataro J. P., Mobley H.L. — Pathogenic Escherichia coli), Cuevas-Ramos G et al., « Escherichia coli induces DNA damage in vivo and triggers genomic instability in mammalian cells ». PNAS. U S A, 2010, 107, 11537-11542).
[0076] De façon générale, il a été montré dans la présente demande que les compositions ici décrites sont particulièrement utiles pour diminuer l'adhésion et l'invasion des muqueuses gastriques et/ou intestinales et l'inflammation associées, en particulier pour les pathologies listées ci-dessus.
[0077] Les microorganismes pathogènes cibles des compositions ici décrites sont typiquement des pathogènes intestinaux, typiquement des espèces bactériennes de la famille des Enterobacteriaceae (comme Salmonella spp., Klebsiella spp., Serratia spp. ou Escherichia coli ( E . coli), des bactéries de l'espèce Clostridioides difficile ou encore des levures de l'espèce Candida albicans, avantageusement des bactéries dont l'adhésion aux cellules fait intervenir l'adhésine FimH des pili de type 1 . De préférence sont visées les bactéries E. coli associées à la muqueuse coliques (mucosa associated E. coli) et notamment les bactéries E. coli de type AIEC (E. coli adhérents-invasifs), ETEC (E. coli entérotoxigéniques), EIEC (E. coli entéroinvasives), EPEC (E. coli entéropathogènes), EHEC (E. coli entérohémorragiques), EAEC (E. coli entéroaggrégatives), DAEC (E. coli à adhésion diffuse), UPEC (E. coli uropathogènes). Dans certains modes de réalisation, les bactéries E. coli productrices de colibactine sont d'intérêt particulier, notamment chez des patients souffrants d'un cancer colorectal, ayant souffert d'un cancer colorectal, ou à risque de développer un cancer colorectal.
[0078] La présente demande concerne également l'utilisation non thérapeutique d'une composition telle que précédemment décrite sous forme d'un alicament, d'un complément alimentaire ou d'un aliment fonctionnel visant à améliorer ou maintenir le confort intestinal, et/ou à améliorer la flore intestinale (typiquement en limitant la colonisation intestinale par des bactéries commensales pathogènes). Par améliorer ou maintenir le confort intestinal on entend notamment limiter ou prévenir les ballonnements intestinaux, limiter ou prévenir l'aérophagie, et/ou régulariser le transit chez l'homme ou l'animal.
[0079] Une composition selon la présente demande peut comprendre, outre la fraction active extraite d'écorces de levures (constituée par la fraction de polysaccharides pariétaux telle que décrite plus haut et de préférence obtenue selon le procédé décrit), tout excipient, support et/ou adjuvant classiquement utilisé dans le domaine pharmaceutique, ou pour la formulation d'un complément alimentaire, alicament, ou aliment fonctionnel, et qui soit chimiquement compatible avec ladite fraction active (i.e. les β-glucanes, les mannanes et α-glucanes pariétaux de levure, notamment la « fraction soluble b » illustrée en exemple). Par exemple, une composition de l'invention peut comprendre des constituants choisis parmi les vitamines, les oligoéléments, les acides aminés, et autres additifs destinés à l'alimentation et/ou la santé animale ou humaine.
[0080] Par alicament ou nutraceutique ou aliment fonctionnel, on entend un aliment qui contient des ingrédients ayant des effets bénéfiques pour la santé ou capables d'améliorer les fonctions physiologiques en particulier pour la présente, le bien-être digestif. Par complément alimentaire, on entend une denrée alimentaire ayant pour but de compléter le régime alimentaire normal, conformément à la Directive 2002/46/CE. Un complément alimentaire constitue une source concentrée de nutriments ou d'autres substances ayant un effet nutritionnel ou physiologique, lorsqu'ils sont pris seuls ou en combinaison, en de faibles quantités. Par denrées alimentaires destinées à une alimentation particulière, on entend un aliment ayant un objectif nutritionnel particulier, destiné à un groupe de population bien défini, tel que les nourrissons, les enfants en bas âge, les sportifs.
[0081] Des adjuvants, véhicules et excipients physiologiquement acceptables sont typiquement décrits dans le "Handbook of Pharmaceutical Excipients", deuxième édition, American Pharmaceutical Association, 1994. Pour formuler une composition pharmaceutique selon la présente invention, l'homme du métier se pourra également avantageusement se référer à la dernière édition de la Pharmacopée européenne ou de la Pharmacopée américaine (USP). Les supports, excipients et adjuvants classiquement utilisés incluent de façon non limitative les solutions salines, les solvants, les milieux de dispersion, les revêtements, les conservateurs, les agents antibactériens et antifongiques, les agents isotoniques et les agents retardant l'absorption.
[0082] La composition peut être utilisée en tant que médicament ou en tant que principe actif, ou bien dans le cadre d'une utilisation non thérapeutique en tant, typiquement, que complément alimentaire. La formulation et le dosage de la fraction active sont alors adaptés à l'utilisation choisie.
Dans le cadre d'une utilisation thérapeutique, la composition peut être formulée pour une administration par voie orale ou entérale.
Dans le cadre d'une composition pharmaceutique ou d'un complément alimentaire, la composition de l'aliment selon la présente invention peut se présenter sous différentes formes galéniques, telles que la forme liquide ou sous forme de capsule, dragée, pilule, poudre, suppositoire, ou toute autre formulation galénique. En tant qu'aliment fonctionnel, la composition des aliments selon la présente invention peut se présenter sous une grande pluralité de formes d'aliments et de boissons, par exemple des jus ou des préparations à base de lait.
Exemples
[0083] Matériels et Méthodes
[0084] Procédé d'extraction des phospho-peptidomannanes « fraction soluble a » par liqueur de Fehling :
1 . 50 g de levure ont été mis en suspension dans 300 ml_ de tampon citrate 0,02 M (pH 7), stérilisés à l'autoclave à 121 °C, 90 min.
2. Centrifuger à 5000 tours/minute à 4°C, 30 min. Récupérer le surnageant.
3. Mettre le culot en suspension dans 300 ml_ de tampon au citrate 0,02 M, autoclaver à 121 °C, 90 min, encore une fois. Puis, centrifuger à nouveau pour séparer le surnageant et le culot.
4. Combiner les deux surnageants ensemble (X ml_).
5. Mettre le même volume de solution de Fehling (X ml_) dans le surnageant, remuer à 4°C, pendant la nuit entière. Des précipités se forment. Le complexe phospho- peptidomannane-cuivre est gris-bleu. Recueillir le précipité par centrifugation à 5000 tours/minute, 4°C, pendant 30 minutes.
6. Ajouter 100 mL de HCl 3N aux précipités, puis agiter à 4°C jusqu'à dissolution des précipités. Le complexe de cuivre est décomposé, et la solution devient verte.
7. Ajouter 300 mL d'éthanol pour précipiter les phospho-peptidomannanes, remuer à 4°C, pendant la nuit entière. Recueillir le précipité (couleur blanche) par centrifugation à 5000 tours/minute, 4°C, pendant 30 minutes.
8. Les précipités de phospho-peptidomannanes sont dissous dans 50 mL d'eau. Dialyser (MWCO 3500) contre l'eau pendant la nuit entière à 4°C. Ensuite, sécher et lyophiliser les Mannanes dialysés. [0085] Préparation de la solution de Fehling (mélanger les tampons A et B fraîchement utilisés)
Tampon A
1 . 35 g de Cuivre (II) sulfate. 5H2O est dissous dans 300 ml_ de H2O
2. Ajouter 5 ml_ d'acide sulfurique 2 N
3. Ajouter de l'eau à 500 mL Tampon B (Corrosif)
1 . 77 g d'hydroxyde de sodium + 175 g de tartrate de sodium et de potassium 2. Ajouter H2O à 500 mL.
[0086] Reference: Method for Fingerprinting Yeast Cell Wall Mannan (1969) Journal of Bacteriology, v.100, p1175.
[0087] Obtention de la « fraction soluble b » : séparation des b1,3 Glucanes et b1 ,6 Glucanes (avec Glycogène i.e. a-glucanes) par une solution d'acide acétique diluée à chaud :
1 . Récupérer le culot obtenu à partir de 50 g de levures entières ou d'une fraction pariétale de levure(s) (fraction insoluble après extraction au tampon citrate chaud, également appelée « fraction insoluble a ») dans 1 L d'une solution de NaOH 1 N, puis agiter à température ambiante pendant 24 heures, pour éliminer les résidus de phospho-peptidomannanes.
2. Recueillir le culot (fraction insoluble a1 ) après centrifugation à 7000 tours/minute à 4°C pendant 30 minutes. Laver le culot par 1 L d'eau, Centrifuger à nouveau et conservez le culot.
3. Extraire le culot par 800 mL d'acide acétique 0,5 N, agiter à une température de 90°C pendant 3h. Attendre le refroidissement puis centrifuger à 7000 tr/min à 4°C, pendant 20 min. Conserver le surnageant et le culot. Le pellet est extrait à nouveau par 800 mL d'acide acétique 0,5 N, sous agitation à 90°C pendant 3h, suivi d'une nouvelle centrifugation.
4. Répéter l'étape 3 au moins 5 fois jusqu'à ce que 5L de surnageant aient été recueillis (constitué principalement par du glycogène et des bq-Glucanes, également appelé « fraction soluble b »). Neutraliser le surnageant par une solution de NaOH, concentré par évaporateur d'eau. Dialyser ensuite (MWCO 3500) contre de l'eau à 4°C, pendant la nuit entière. La fraction obtenue constitue la fraction soluble b). L'analyse de cette fraction démontre qu'elle comporte des b-6 glucanes, des α-glucanes (glycogène) et des mannanes fortement liés (i.e. non dissociés par l'étape d'extraction à chaud) aux polymères glucaniques.
5. Dialyser le culot (constitué principalement de b3 Glucane) contre de l'eau à 4°C, pendant la nuit entière.
6. Lyophiliser les échantillons dialysés.
[0088] Références :
1 . The structure of b(1->3)-D-glucan from yeast cell walls (1973) Biochem J, v.135, p19.
2. Refinement of the structures of cell-wall glucan of Schizosaccharomyces pombe by Chemical modification and NMR spectroscopy (2004) Carbohydrate Res., v.339, p2255.
[0089] Séparation du glycogène et des β6-glucanes
1 . Une quantité de 500 mg de d'une composition de « fraction soluble b » est ajoutée dans 50 mL d'une solution de travail. Agiter, puis laisser reposer à température ambiante 30 minutes. Des granules rouge-brun se forment (précipités Glycogène- iode).
2. Centrifuger à 5000 rpm, pendant 30 min, à température ambiante. Conserver le surnageant et les granulés. Ajouter 50 mL de solution de travail au surnageant, puis 100 mL d'éthanol, agiter à température ambiante pendant 30 min.
3. Centrifuger à nouveau. Rassembler les granulés (culot 1 , principalement du Glycogène) en une seule fraction. Ajouter 600 mL supplémentaires d'éthanol dans le surnageant, remuer, à température ambiante, pendant 30 minutes. Des granulés jaune-clair se forment.
4. Centrifuger pour recueillir les granulés (culot 2, principalement du b6- glucane).
5. Pour dissocier l'iode du Glycogène, ajouter 100 mL de HCl 3N au culot 1 , remuer jusqu'à ce que le culot 1 soit dissous (solution brune). Ajouter ensuite 300 mL d'éthanol, et remuer pendant 30 min, à température ambiante. Il se forme alors des granulés noir-violet. Centrifuger et conserver le culot. Ajoutez ensuite 100 mL supplémentaire de HCl 3N pour dissoudre la pastille. Ajouter à nouveau 300 mL d'éthanol, et remuer pendant 30 min, à température ambiante de sorte que des boulettes blanches se forment. Centrifuger et conserver les granulés (culot 3, Glycogène).
6. Redissoudre les culots 2 et 3 dans 50 ml_ d'eau, respectivement. Ensuite dialyser contre de l'eau, 4°C, pendant la nuit entière.
7. Lyophiliser les échantillons dialysés.
[0090] Préparation de la solution de travail (iodée) :
1 . 4,35 g d'iode et 43,5 g d'iodure de potassium dans 166,5 mL d'eau 2. Ajouter 10,5 mL d'une solution saturée de CaCl2.
[0091] Reference: Méthodologies of tissue préservation and analysis of the glycogen content of the Broiler chicken liver (2007) Poultry Science, v.86, p.2653.
[0092] Levures utilisées :
CNCM I-3856 : levures vivantes Saccharomyces cerevisiae déposée sous le numéro CNCM I-3856;
LV04 levures entières de distillerie Saccharomyces cerevisiae (collection interne Lesaffre)
Fraction pariétale (écorces) de levure CNCM i-3856 (FP i-3856)
Fraction pariétale (écorces) de levure CNCM I-5268 (FP I-5268).
[0093] Fractions testées, obtenues à partir de compositions de levure(s) entière(s) ou d'écorces (fraction pariétale) de levure(s) : soluble b) β6-glucanes glycogène β3-glucanes phosphates phospho-peptidomannanes (aussi appelée Fehling phospho- peptidomannanes ou « mannanes »). [0094] Protocoles de préincubation (voir figure 2) :
Test d'adhésion : Les essais ont été réalisés sur des cellules T84 ou Caco-2/TC7 ensemencées à 1 ,5x105 cellules / puits dans une plaque de 48 puits et incubées pendant 48 heures à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de C02. Les bactéries AIEC LF82 à 1 ,2x107 CFU / mL ont été incubées pendant 1 heure, sur un agitateur orbital Stuart® à température ambiante, avec des concentrations croissantes de l'échantillon de levure (rapport 1 :1). Après 48 heures de culture, les cellules ont été infectées par le mélange bactéries/extrait de levure pendant 3 h à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de C02. Les cellules ont été infectées à une multiplicité d'infections de 10 bactéries / cellule. Les taux d'adhésion moyens (provenant d'au moins 3 expériences indépendantes) ont été exprimés sous la forme d'un pourcentage d'adhérence résiduelle, qui est le rapport entre l'adhésion bactérienne en présence de levure et l'adhésion en l'absence de levure est considérée à 100 %. Les barres d'erreur correspondent à l'erreur standard à la moyenne ou SEM.
Test d'invasion : le protocole est identique à celui du test d'adhésion, en revanche après la période d'incubation de 3h, les cellules sont incubées 1 h avec de la gentamycine (100 μg/mL), de façon à éliminer les bactéries extracellulaires et à ne compter que les bactéries invasives.
[0095] Résultats :
[0096] Initialement, toutes les fractions ont été testées dans un protocole d'adhésion sur cellules T84. Des tests complémentaires ont ensuite été effectués sur les cellules Caco-2/TC7 et dans un protocole d'invasion.
[0097] Comme illustré dans la figure 3, la fraction « soluble a » (phospho- peptidomannane) issue de levures entières CNCM I-3856 inhibe significativement l'adhésion des bactéries AIEC aux cellules épithéliales T84. De façon surprenante cependant, la fraction « soluble b » issue de cette même levure entière présente également une activité inhibitrice significative de l'adhésion des bactéries AIEC. [0098] La figure 4 montre que la fraction β3-glucanes phosphorylés, issue de levures entières CNCM I-3856 inhibe également significativement, bien que plus modérément, l'adhésion des bactéries AIEC aux cellules épithéliales T84.
[0099] La figure 5 illustre la comparaison des activités inhibitrices sur l'adhésion des bactéries AIEC aux cellules épithéliales T84, des fractions « solubles b » obtenues, soit à partir de levures entières (CNCM I-3856), soit à partir de fraction pariétale de cette même levure. Bien que toutes deux présentent une activité inhibitrice significative, la fraction obtenue à partir de la fraction pariétale présente une activité supérieure à celle obtenue à partir de la levure entière (adhésions résiduelles à la dose d'1 mg/mL est de 17% et 42 % respectivement). Ces activités différentes sont corrélées à des compositions différentes de la fraction « soluble b ».
[0100] Afin de vérifier si le résultat obtenu n'était pas lié à une quelconque activité cytotoxique de l'échantillon, un test de cytotoxicité a été mené avec des doses croissantes de la fraction soluble b). Aucun effet cytotoxique n'a été constaté.
[0101] La figure 6 illustre la comparaison des activités inhibitrices sur l'adhésion des bactéries AIEC aux cellules épithéliales T84, des fractions solubles b) obtenues à partir de deux fractions pariétales de levures : CNCM I-5268 ou CNCM I-3856. Une activité inhibitrice très significative est observée pour ces deux fractions. Les pourcentages d'adhésion résiduelle pour des doses égales étant du même ordre, ce résultat suggère très fortement que l'augmentation de l'activité inhibitrice n'est pas directement liée à la souche employée (CNCM I-5268 vs. CNCM I-3856) mais plutôt au procédé d'obtention. Autrement dit, les fractions solubles b) obtenues à partir de fractions pariétales de levures présentent une activité inhibitrice, sur l'adhésion des bactéries AIEC aux cellules épithéliales, fortement supérieure à celle observée pour les fractions solubles b) obtenues à partir de levures entières.
[0102] La figure 7 illustre l'adhésion résiduelle des bactéries AIEC LF82 aux cellules épithéliales T84, en présence de fractions soluble b), glycogène ou bq-glucanes, obtenues à partir de fractions pariétales de levures CNCM I-5268. Les résultats montrent que les bq-glucanes sont moins efficaces que la fraction soluble b) et que la fraction glycogène présente une activité intermédiaire. La fraction soluble b) est la fraction la plus efficace. [0103] La figure 8 montre l'adhésion résiduelle (en pourcentage) des bactéries AIEC LF82 sur les cellules TC7/Caco-2 en présence des fractions de mannanes (fehling mannanes) obtenues à partir de levures entières (CNCM I-3856, ou LV04), solubles b) obtenues à partir de levures entières CNCM I-3856 ou de la fraction pariétale de levure CNCM I-5268. Ces nouveaux résultats confirment les résultats obtenus précédemment avec les cellules T84, à savoir que la fraction soluble b) obtenue à partir d'une fraction pariétale de levure présente l'activité inhibitrice la plus importance.
[0104] La figure 9 illustre des résultats montrant une forte inhibition de l'invasion des cellules TC7/Caco-2 par des bactéries AIEC LF82 pré-incubées avec des doses croissantes de la fraction soluble b) obtenue à partir de fractions pariétales de levures CNCM I-5268.
[0105] Etudes in vivo de l'activité des fractions de levure chez des souris transgéniques CEABAC10 infectées avec la souche de bactéries AIEC LF82.
[0106] La colonisation du tractus intestinal par la souche AIEC LF82 a été réalisée chez des souris transgéniques CEABAC10 exprimant la protéine humaine CEACAM6, agissant en tant que récepteur des bactéries AIEC dans la cadre de la maladie de Crohn.
[0107] Il a été montré précédemment (Sivignon et al. IBD, 2015) que les extraits de levure S. cerevisiae CNCM I-3856 diminuaient la colonisation du colon par la bactérie AIEC LF82 entraînant ainsi une diminution des signes de colite.
[0108] Des résultats préliminaires ont désormais été obtenus avec les nouvelles fractions testées in vitro.
[0109] Le protocole mis en œuvre est illustré en figure 10.
[0110] Brièvement, les fractions de levures ont été administrées oralement une fois par jour du jour -7 au jour 0 et deux fois par jour (à 5 heures d'intervalle) du jour 1 au jour 3. Les fractions ont été solubilisées dans du PBS à une concentration de 25 mg/mL (chaque jour) et une quantité de 0,2mL/souris a été administrée par gavage (5 mg/souris). Du jour -3 au jour +4, les souris ont reçu du DSS 0,5% dans de l'eau de boisson. Au jour -1 , les souris ont été traitées p.o. avec de la streptomycine (5 mg/souris).
[0111] Parallèlement, du milieu de culture LB (Luria Bertani) a été inoculé (au 1/100è) avec la souche de bactéries AIEC LF82 et incubé à 37°C sous agitation jusqu'à la phase exponentielle de croissance. Après centrifugation, les bactéries ont été concentrées à 2,5x1010 bactéries/mL. Une quantité de 0,2 ml_ a ensuite été administrée par gavage aux souris, soit 5x109 bactéries/mL.
[0112] Le poids des souris et les signes de colite ont été suivis les 4 jours suivant l'infection. Les fèces ont été collectées aux jours 1 , 2, 3 et 4 après l'infection pour évaluer la colonisation bactérienne.
[0113] Les souris ont été euthanasiées au quatrième jour après l'infection et l'intestin a été prélevé pour évaluer la colonisation bactérienne associée à la muqueuse (iléon + côlon).
Les fractions testées sont les suivantes :
A : Lot non-traité (n=10) ;
B : Fraction soluble a) de levure entière CNCM I-3856 (n=8);
C : Fraction soluble b) de levure entière CNCM I-3856 (n=8) ;
D : Fraction soluble b) obtenue à partir de fraction pariétale de levure CNCM I-5268 (n=8).
[0114] La figure 11 montre l'estimation du nombre de bactéries dans les fèces de souris 2 et 3 jours post-infection, en fonction de la fraction de levure administrée. Les résultats montrent que la quantité de bactéries dans les fèces est diminuée par 25 en réponse au traitement par la fraction soluble b) obtenue à partir de fraction pariétale de levure CNCM I-5268 par rapport au groupe non traité, ce qui confirme les excellentes propriétés anti-adhésives de cette fraction mises en évidence in vitro en modèle pré-clinique.
[0115] La figure 12 montre la quantification des bactéries AIEC LF82 associées à la muqueuse intestinale chez les souris traitées ou non avec les fractions de levure, 4 jours après infection. Les résultats indiquent l'absence de bactéries chez 100% des souris traitées avec la fraction soluble b) obtenue à partir de fraction pariétale de levure CNCM 1-5268, corroborant ainsi les résultats obtenus dans les fèces.
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(Cette feuille ne fait pas partie de la demande internationale ni ne compte comme une feuille de ceiie-ci)
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RÉSERVÉ À L'OFFICE RÉCEPTEUR
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RÉSERVÉ AU BUREAU INTERNATIONAL
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Claims

Revendications
[Revendication 1] Composition de polysaccharides de levure comprenant des β(1 ,6)-glucanes, caractérisée en ce que lesdits polysaccharides de levures sont extraits de fragments pariétaux de levures.
[Revendication 2] Composition selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la levure est choisie parmi les levures du genre Saccharomyces.
[Revendication 3] Composition selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la levure est choisie parmi les levures de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, notamment obtenue à partir de l'une quelconque des souches déposées auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes sous les numéros CNCM I-3799, CNCM I-3856, CNCM I-4407, CNCM I-4563, CNCM 1-4812, CNCM I-4978, CNCM 1-5128, CNCM 1-5129, CNCM I-5268, CNCM I-5269.
[Revendication 4] Composition de polysaccharides de levure obtenue selon l'un des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle comprend :
- 5 à 25 %, notamment 10 à 20 %, d'α-glucanes,
- 30 à 50 %, notamment, 35 à 45 % de β-glucanes, et
- 30 à 55 %, notamment 40 à 50 % de mannanes.
[Revendication 5] Procédé d'obtention d'une composition de levure selon l'une des revendications 1 à 3 comprenant : a) au moins une étape de fractionnement d'une composition pariétale de levure(s) à l'issue de laquelle une fraction insoluble est récupérée, et b) au moins une étape d'extraction dans une solution d'acide faible d'une fraction soluble à partir de la fraction insoluble obtenue à l'étape a).
[Revendication 6] Composition selon l'une des revendications 1 à 4, ou obtenue selon le procédé de la revendication 5, pour son utilisation en tant que médicament.
[Revendication 7] Composition selon l'une des revendications 1 à 4, ou obtenue selon le procédé de la revendication 5, pour le traitement des pathologies gastro- intestinales associées à des microorganismes pathogènes.
[Revendication 8] Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce que la composition est à usage vétérinaire. [Revendication 9] Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8, caractérisée en ce que les microorganismes pathogènes sont des bactéries Escherichia coli associées à la muqueuse intestinale (mucosa- associated E coli). [Revendication 10] Utilisation non thérapeutique d'une composition telle que définie dans l'une des revendications 1 à 4, ou obtenue selon le procédé de la revendication 5, pour la préparation d'une composition alimentaire destinée à améliorer le confort gastro-intestinal et/ou à améliorer la flore intestinale chez l'homme ou l'animal.
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