FR2928652A1 - Composition pour l'alimentation humaine et/ou animale,ses utilisations,levures - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une composition comprenant une levure Saccharomyces cerevisiae et/ou des dérivés de levure présentant un intérêt particulier comme probiotique et/ou alicament et/ou nutraceutique et/ou ingrédients fonctionnels et /ou cosméceutique et/ou principe actif pharmaceutique.Elle concerne également son utilisation dans l'alimentation humaine et/ou animale ou pour le traitement ou la prévention de pathologies inflammatoires.
Description
1 COMPOSITION POUR L'ALIMENTATION HUMAINE ET/OU ANIMALE, SES UTILISATIONS, LEVURES La présente invention se rapporte aux domaines de la nutrition et de la santé humaine et/ou animale et, concerne plus particulièrement une nouvelle levure utile pour le confort du tractus digestif et/ou pour la prévention et/ou le traitement des désordres du tractus digestif humain ou animal.
De nombreux microorganismes ont déjà été décrits dans la littérature pour leurs applications bénéfiques chez l'homme sur le tractus digestif et pour leur intérêt nutritionnel, comme décrit, par exemple, dans WO 2006/021965. Ces microorganismes sont communément désignés alors par le terme probiotique qui correspond à des microorganismes vivants capables d'apporter à l'hôte un bénéfice sur la santé lorsqu'ils sont administrés en quantité suffisante(Joint FAO/WHO Expert Cunsultation Probiotics in food, FAO Food and nutrition paper Nr85, ISBN 92-5-105513-0). Les bénéfices résultant de l'administration par voie orale des microorganismes dépendent très largement de la souche de microorganisme utilisée, mais aussi de sa forme d'administration. Au sein d'une même espèce, selon les souches employées, les effets observés sont en effet très fluctuants, parfois bénéfiques, parfois négatifs ou neutre comme par exemple au sein de l'espèce Escherichia colt où on peut trouver à la fois des souches pathogènes (types entéro-toxinogènes ou entéro-hémorragiques par exemple) et des souches bénéfiques comme la souche Nissle 1917 (M. de Vrese ; P.R.
Marteau. Probiotics and Prebiotics: Effects on Diarrhea. 2007, J. Nutr., 137(3 Suppl. 2), 803S-811S). Il est ainsi actuellement impossible de prédire pour une souche donnée si un bénéfice en terme de santé humaine peut être escompté de l'administration de cette souche, ni même de prévoir la nature de son éventuel bénéfice ou son intensité. Un certain nombre de souches de microorganismes, notamment parmi les levures et les bactéries lactiques, ont déjà été identifiés pour certains effets bénéfiques sur le tractus gastro-intestinal. Néanmoins, l'obtention d'une action bénéfique complète sur le tractus gastro-intestinal nécessite souvent l'administration concomitante de plusieurs souches de nature différente (I. Goktepe ; V.K. Juneja ; M. Ahmedna (eds). 2 Probiotics in Food Safety and Human Health. 2006, CRC Taylor & Francis, ISBN 1-57444-514-6). En outre, il a été observé que bon nombre de microorganisme, en particulier les bactéries lactiques, ont une action pro-inflammatoire. Cet effet pro-inflammatoire peut s'avérer particulièrement néfaste et non souhaitable, par exemple dans les maladies auto-immunes ou de déficiences immunitaires. Certaines fractions de levures et/ou dérivés de levures ont été décrits pour leurs effets bénéfiques sur le tractus digestif. Ainsi, les mannoprotéines dérivés de levures ont été décrites pour leur effet inhibiteur de l'adhésion des pathogènes. De même les parois de levures ont été décrites pour leur effet fibre. Cependant, il existe de nombreuses souches de levures Saccharomyces cerevisiae et, elles ne présentent pas toutes des effets bénéfiques ou les mêmes effets. En outre, selon les souches utilisées et les formes de levure administrées, les 15 effets peuvent être également très variables.
Aussi il subsiste le besoin de pouvoir disposer de nouvelles souches de microorganismes pouvant exercer un effet bénéfique sur la santé, de manière préventive et /ou curative sur des pathologies ou dysfonctionnements précis ou non, ou sur l'état de 20 santé général tant physique que psychique.
L'invention a donc pour objet une composition qui comprend de la levure vivante Saccharomyces cerevisiae obtenue à partir de la souche Saccharomyces cerevisiae déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes 25 sous le n° CNCM I-3856 et/ou celle obtenue à partir de la souche Saccharomyces cerevisiae var. boulardii déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3799, et/ou au moins un dérivé de levure Saccharomyces cerevisiae choisi parmi les extraits de levure, les dérivés de parois, les glucanes pariétaux, les mannoprotéines pariétales, les fractions lipidiques de levure, les 30 fractions d'acides nucléiques de levure (ARN, ADN), et leurs mélanges.
Par probiotique, on entend désigner des microorganismes vivants qui, lorsqu'ils sont intégrés en quantité suffisante, exercent un effet positif sur la santé, le confort et le bien-être au-delà des effets nutritionnels traditionnels. 3 Par alicament ou nutraceutique ou aliment fonctionnel ou cosméceutique, on entend un aliment qui contient des ingrédients ayant des effets bénéfiques pour la santé ou capables d'améliorer les fonctions physiologiques. Cette composition présente les avantages suivants : - une capacité, en particulier dans ses formes sèches, à résister et survivre au passage de la barrière gastrique, ce qui permet d'optimiser ses effets sur le tractus gastro-intestinal; 10 - une action anti-inflammatoire; - une absence d'effet pro-inflammatoire ou un très faible effet; - une capacité à réduire les douleurs intestinales, et enfin - une capacité à empêcher et à réduire l'adhésion et la colonisation par des bactéries pathogènes et/ou à caractère invasif du tractus gastro-intestinal, en particulier 15 de l'intestin grêle et du colon. Une telle nouvelle souche présentant cette combinaison de caractéristiques n'a encore jamais été décrite ou identifiée. Elle présente donc un intérêt exceptionnel.
Un autre objet de l'invention est une utilisation de la composition précédente, 20 destinée à l'homme et/ou l'animal, en tant que probiotique et/ou alicament et/ou nutraceutique et/ou ingrédients fonctionnels et/ou cosméceutique et/ou principe actif pharmaceutique.
Un troisième objet de l'invention se rapporte à une levure vivante 25 Saccharomyces cerevisiae notamment celle obtenue à partir de la souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM 1-3856.
Un quatrième objet de l'invention concerne une levure vivante Saccharomyces 30 cerevisiae var. boulardii notamment celle obtenue à partir de la souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3799.
Un cinquième objet de l'invention se rapporte à une levure vivante Saccharomyces cerevisiae notamment celle obtenue à partir de la souche déposée5 4 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3856 pour son utilisation en tant que médicament.
Un sixième objet de l'invention concerne une levure vivante Saccharomyces cerevisiae var. boulardii notamment celle obtenue à partir de la souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3799 pour son utilisation en tant que médicament.
Un septième objet de l'invention se rapporte à une utilisation non thérapeutique de la levure vivante Saccharomyces cerevisiae obtenue à partir de souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3856 et/ou celle obtenue à partir de la souche Saccharomyces cerevisiae var. boulardii déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3799, et/ou au moins un dérivé de levure choisi parmi les extraits de levure, les dérivés de parois, les glucanes pariétaux, les mannoprotéines pariétales, les fractions lipidiques de levure, les fractions d'acides nucléiques de levure (ARN, ADN), et leurs mélanges, pour la préparation de compositions alimentaires destinées à améliorer le confort gastro-intestinal et/ou améliorer le bien être gastro-intestinal.
Un huitième objet de l'invention concerne une utilisation de la levure vivante Saccharomyces cerevisiae obtenue à partir de souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3856 et/ou celle obtenue à partir de la souche Saccharomyces cerevisiae var. boulardii déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3799, et/ou au moins un dérivé de levure choisi parmi les extraits de levure, les dérivés de parois, les glucanes pariétaux, les mannoprotéines pariétales, les fractions lipidiques de levure, les fractions d'acides nucléiques de levure (ARN, ADN), et leurs mélanges ou d'une composition en comprenant pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des désordres intestinaux, des troubles fonctionnels intestinaux ou des maladies gastro-intestinales.
Enfin un neuvième objet de l'invention concerne une utilisation de la levure vivante Saccharomyces cerevisiae obtenue à partir de souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3856 et/ou celle obtenue à partir de la souche Saccharomyces cerevisiae var. boulardii déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3799, et/ou au moins un dérivé de levure choisi parmi les extraits de levure, les dérivés de parois, les glucanes pariétaux, les mannoprotéines pariétales, les fractions lipidiques 5 de levure, les fractions d'acides nucléiques de levure (AR N, ADN) et leurs mélanges, ou d'une composition pharmaceutique en comprenant pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des pathologies ou troubles de l'intestin signalés par un état d'hyperalgésie.
Un dernier objet de l'invention est un kit comprenant la levure vivante Saccharomyces cerevisiae notamment celle obtenue à partir de souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3856 et/ou celle obtenue à partir de la souche Saccharomyces cerevisiae var. boulardii déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3799, et/ou au moins un dérivé de levure choisi parmi les extraits de levure, les dérivés de parois, les glucanes pariétaux, les mannoprotéines pariétales, les fractions lipidiques de levure, les fractions d'acides nucléiques de levure (ARN, ADN), et leurs mélanges dans une forme adaptée à une administration orale.
La souche selon l'invention est une souche de levure de l'espèce Saccharomyces cerevisiae. Cette souche a été déposée par la Demanderesse sous le Traité de Budapest auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (Institut Pasteur Paris) sous le n°CNCM I-3856.
Dans un but de concision, elle sera appelée ScProl .
La souche peut, par ailleurs, être la souche Saccharomyces cerevisiae var. boulardii déposée également par la Demanderesse sous le Traité de Budapest auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (Institut Pasteur Paris) sous le n°CNCM I-3799. Dans un but de concision, elle sera dénommée SCB 1 .
Enfin, dans un dernier but de concision, le dérivé de levure Saccharomyces cerevisiae choisi parmi les extraits de levure, les dérivés de parois, les glucanes 6 pariétaux, les mannoprotéines pariétales, les fractions lipidiques de levure, les fractions d'acides nucléiques de levure (ARN, ADN), et leurs mélanges, sera dénommé dérivé .
Ces souches ont été identifiées par la Demanderesse pour leurs nombreux avantages et notamment sa capacité à induire des effets bénéfiques sur le tractus digestif humain, en particulier l'intestin grêle et le colon mais aussi sur l'organisme en général. En effet, il a été observé que, de manière surprenante, la levure ScProl et/ou SCB1 et/ou dérivé est capable d'induire une action anti-inflammatoire, contrairement à bon nombre de souches de levure, et ce, sans effet pro-inflammatoire En effet, la levure ScPro 1 et/ou SCB1 et/ou dérivé provoque l'augmentation de la sécrétion de l'interleukine IL-10 impliquée dans les signaux anti-inflammatoires. En outre, à la différence des actions des bactéries probiotiques de type lactobacilles, la levure ScProl et/ou SCB1 et/ou dérivé n'induit pas la synthèse de cytokine pro- inflammatoire IL-12. De même, la production des cytokines pro-inflammatoires TNFa et d'IFNy est nettement plus faible par rapport aux probiotiques bactériens. Des tests ont par ailleurs permis de démontrer l'effet anti-inflammatoire in vivo de cette levure ScProl, notamment une diminution de moitié de l'inflammation du gros intestin et une réduction d'un tiers de la nécrose intestinale.
En outre, la levure ScProl et/ou SCB1 et/ou dérivé, dans ses formes sèches, est capable de franchir la barrière gastrique sans aucun impact négatif sur sa survie ou son intégrité et cette levure ne s'implante pas dans un environnement colique.
La Demanderesse a démontré, pour la première fois et de manière particulièrement surprenante, que la levure ScProl et/ou SCB1 et/ou dérivé est capable d'augmenter la résistance à la douleur, notamment sur un modèle in vivo de rat. En plus de ces effets bénéfiques, cette levure ScProl et/ou SCB1 et/ou dérivé est capable d'inhiber la colonisation et/ou l'invasion au niveau de l'intestin de microorganismes pathogènes et/ou à caractère invasif. L'administration de cette levure entraîne une diminution des entérobactéries au niveau du côlon et de la flore intestinale résistante aux antibiotiques. En particulier, elle a montré une capacité prophylactique et thérapeutique à l'encontre de la colonisation intestinale par Candida albicans et des inflammations 7 provoquées et entretenues par ce pathogène. Par ailleurs, cette levure présente un effet inhibiteur sur le pouvoir d'adhésion et d'invasion de souches pathogènes et/ou à caractère invasif de pathotypes d'Escherichia coli isolés de biopsies iléales de patients atteints par la maladie de Crohn.
Selon la présente invention, cette levure ScProl et/ou SCB1 et/ou dérivé peut être administrée sous une forme vivante, de préférence par voie orale. Par forme vivante ou vivante , on entend, selon l'invention, une levure dont le métabolisme est actif ou réactivable ou capable de se multiplier. Il s'agit 10 notamment de la levure vivante sous forme sèche ou sous forme fraîche. Typiquement, la levure sous forme fraîche se présente sous forme de levure pressée ou émiettée. Elle peut également se présenter sous forme de levure en suspension en phase aqueuse et on parle alors de levure liquide. Dans ce cas, la levure sera de préférence encapsulée. Les procédés d'encapsulation et les diverses types de 15 capsules sont bien connus de l'homme du métier. Parmi les formes de levure vivante sèche, on peut citer la levure pouvant se présenter sous la forme sèche instantanée ou sèche active. On entend par levure sèche, toute levure ayant un taux de matière sèche supérieur à 90%. La levure sèche instantanée est principalement destinée aux industriels et 20 artisans de la boulangerie. D'autres applications et débouchés sont possibles sur la base des référentiels alimentaires (pharmacie, fermentation alcoolique). La particularité de cette levure sèche est de ne pas nécessiter de réhydratation avant d'être incorporée à la farine. Elle provient de la déshydratation de la levure par l'action d'un gradient d'air 25 chaud qui permet de transformer un produit pâteux (levure pressée) en de fins vermicelles secs tout en conservant le pouvoir fermentatif de celui-ci. Le produit doit ensuite, pour rester stable, être conditionné en absence d'oxygène. La levure sèche active est une levure de vivante, séchée à basse température, afin de lui conserver son pouvoir fermentatif et lui assurer une conservation très longue. 30 Elle se présente sous forme de sphérules. Cette levure provient de la déshydratation de la levure par l'action conjointe de la chaleur et d'une activité mécanique qui permettent de transformer la levure sous forme pâteuse en un produit sec en ménageant sa viabilité. 8 Les levures sèches actives sélectionnées sont obtenues par extrusion et séchage en lit fluidisé de la biomasse (cellules vivantes de levure). Cette levure sèche active, c'est-à-dire levure sèche ayant une teneur élevée en cellules vivantes de levure, se présente sous forme de granules avec généralement un diamètre de 0,2 à 0,5 mm et une teneur en H2O de 4 à 6% en masse. Ces formes sèches présentent l'avantage de procurer une meilleure gastrorésistance et optimisent les effets bénéfiques de la levure selon l'invention. Selon l'invention, la levure de boulangerie sera préférentiellement sous la forme d'une levure sèche active.
Il est généralement reconnu que les cytokines pro-inflammatoires stimulent les mécanismes inflammatoires qui peuvent alors être responsables de bon nombre de problèmes cliniques, en particulier dans les cas de maladies auto-immunes ou de déficiences immunitaires.
Ainsi, la levure selon la présente invention peut servir à prévenir et/ou traiter les maladies ou les troubles inflammatoires de l'intestin, qu'ils soient chroniques ou aigus, éventuellement associés à des diarrhées ou constipations ou non. Dans un premier mode de réalisation, les troubles et maladies sont associés ou non à des diarrhées.
Dans un second mode de réalisation, les troubles et maladies ne sont pas associés à des diarrhées. Notamment, la levure ScPro 1 et/ou SCB 1 et/ou dérivé peut être utile pour la prévention ou le traitement des colites qui se caractérisent essentiellement par une inflammation du colon. En particulier, cette levure est bien adaptée à la prévention et/ou au traitement des Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin (MICI), notamment la colite ulcéreuse, la rectocolite hémorragique, la maladie céliaque ou la maladie de Crohn. Ces maladies se caractérisent notamment par une réponse immunitaire exacerbée dans laquelle sont impliquées de multiples cascades inflammatoires. Ainsi, dans le cadre de la prévention ou du traitement de ces maladies par un probiotique et/ou un alicament et/ou un aliment fonctionnel et/ou un nutraceutique et/ou un cosméceutique, il est important que les effets pro-inflammatoires soient les plus faibles possibles. La levure ScPro 1 et/ou SCB 1 et/ou dérivé selon l'invention est donc tout particulièrement adaptée à ces utilisations. Cette levure possède plusieurs avantages supplémentaires.
Le premier est qu'elle possède la capacité d'augmenter la résistance à la douleur. Le deuxième, notamment pour la maladie de Crohn, est que cette levure est notamment capable d'inhiber le pouvoir d'adhésion et d'invasion des souches pathogènes et/ou à caractère invasif de E. coli provenant de patients souffrant de cette maladie. La réponse inflammatoire peut être notamment due à l'invasion de tous microorganismes pathogènes.
Ainsi, la levure ScProl et/ou SCB1 et/ou dérivé selon l'invention montre une 10 bonne efficacité pour prévenir ou traiter la colonisation des intestins par des microorganismes pathogènes et/ou à caractère invasif procaryotes, en particulier des bactéries, ou eucaryotes, en particulier des champignons. Par ailleurs, la levure ScProl et/ou SCBI et/ou dérivé permettant d'augmenter la résistance à la douleur, elle présente également un intérêt dans le traitement préventif ou 15 curatif de pathologies ou de troubles des intestins caractérisés par un état d'hyperalgésie. Ces pathologies ou troubles peuvent être notamment des troubles fonctionnels intestinaux, des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), ou des intolérances alimentaires (allergies, conditionnements, etc ) caractérisées par une douleur viscérale chronique. 20 Elle est particulièrement adaptée au traitement préventif ou curatif des hyperalgésies et en particulier du syndrome de l'intestin irritable (SII) quelque soit sa forme (constipation, diarrhée ou une combinaison des deux), mais également de douleurs viscérales chroniques n'entrant pas dans le cadre du SII, telles que les douleurs abdominales fonctionnelles sans trouble de l'élimination fécale (FAPS : Functional 25 Abdominal Pain) et les douleurs liées aux intolérances alimentaires et à la maladie coeliaque.
La levure ScProl et/ou SCB1 et/ou dérivé ou toute composition la comprenant, peut donc être utilisable de manière préventive chez des sujets présentant des 30 prédispositions ou une sensibilité à ce type de désordres ou de maladies, ou de manière curative, par exemple lors de crises ou sur des périodes plus longues. Les compositions et méthodes de l'invention peuvent réduire la souffrance des sujets, d'atténuer les symptômes ou la cause de ces désordres.5 10 La conjonction des effets de cette levure et/ou dérivé selon l'invention sur la douleur, l'inflammation et les microorganismes pathogènes et/ou à caractère invasif provoquent de manière certaine cette amélioration du bien-être, de la santé et/ou du confort du tractus gastro-intestinal humain ou animal.
De manière préférentielle, la levure ScPro 1 et/ou SCB1 et/ou dérivé est utilisée dans les applications thérapeutiques ou non thérapeutiques en une dose journalière comprise entre 10' et 1010 UFC (Unités Formant Colonie), et de préférence entre 108 et 1o9 UFC.
Dans le cas où la levure et/ou dérivé est sous une forme vivante mais non revivifiable, la dose journalière utile dans les applications thérapeutiques ou non thérapeutiques sera de préférence comprise entre 1 mg et 10 g, de préférence entre 10 mg et 1 g. La dose efficace journalière peut être administrée en une, deux, trois ou quatre fois.
La levure et /ou dérivé selon l'invention ou les compositions la comprenant sont de préférence administrées par voie orale. Elle peut l'être par quantité thérapeutiquement efficace, ce qui signifie qu'au moins un des symptômes est diminué ou supprimé.
La levure ScPro 1 et/ou SCB 1 et/ou dérivé peut être incluse dans une composition alimentaire humaine ou animale et/ou administrée avec des excipients ou véhicules appropriés à l'administration orale. La composition destinée à l'alimentation humaine peut être un liquide, une pâte ou un solide. Notamment, la composition peut être un produit laitier tel que du fromage, du beurre, un yaourt ou une crème, un produit à base de fruit comme un jus de fruit, une compote ou une pâte de fruit, une boisson, ou un aliment solide, par exemple un snack, un biscuit, ou autre. Ainsi, la composition comprend la levure ScProl et/ou SCB1 et/ou dérivé et les composants de l'aliment ou de la boisson. La levure ScProl et/ou SCB1 et/ou dérivé peut aussi être incluse dans une composition pharmaceutique. La composition pharmaceutique est adaptée à une administration orale. Elle comprend donc la levure ScProl et/ou SCB1 et/ou dérivé ainsi qu'un support classique adéquat choisi parmi les excipients autorisés pour la fabrication de préparation pharmaceutique. Elle peut être formulée sous forme liquide, 11 comme un sirop ou une ampoule, ou sous forme de comprimés, de gélules, de sachets, de capsules ou de poudre et autres formes galéniques appropriées. La levure ScProl et/ou SCBI et/ou dérivé peut en outre être administrée avec d'autres probiotiques et/ou d'autres ingrédients fonctionnels, en particulier bactéries probiotiques notamment pour une action préventive encore plus complète. On pourra citer à titre d'exemple les bactéries lactiques des genres Lactobacillus, Bifidobacterium, Pediococcus, Propionibacterium, ou Leuconostoc. La levure ScPro 1 et/ou SCB 1 et/ou dérivé peut également être administrée avec d'autres principes actifs tels que des antibiotiques, des analgésiques, des anti- diarrhéiques, des laxatifs, et leurs mélanges.
La présente invention va maintenant être illustrée à l'aide des exemples et des figures qui suivent, qui sont donnés à titre d'illustration, ne sont nullement limitatifs, et dans lesquelles : - la figure 1 représente le suivi de la survie de la levure ScPro 1 dans un système digestif artificiel simulant le côlon humain, selon l'exemple 2, - la figure 2 représente les effets de la levure ScProl sur la microflore colique, selon l'exemple 2, 20 - les figures 3 et 4 représentent l'évolution du nombre de cellules de Candida albicans dans des selles de souris pour les expérimentations 1 et 2 de l'exemple 5 correspondant aux modèles prophylactique (figure 3) et curatif (figure 4), - la figure 5 représente le pourcentage d'adhésion résiduelle des cellules d'Escherichia coli AIEC LF82 aux cellules épithéliales intestinales humaines en 25 fonction de la quantité de levure ScPro 1 avec pré-incubation ; les cellules de levure ont été incubées avec les cellules épithéliales intestinales pendant une heure. L'infection des cellules avec la souche AIEC LF82 a été effectuée en présence de la levure ScPro 1, selon l'exemple 6, - la figure 6 représente le pourcentage d'adhésion résiduelle des cellules 30 d'Escherichia coli AIEC LF82 aux cellules épithéliales intestinales humaines en fonction de la quantité de levure ScProl avec co-incubation ; les cellules de levure et les cellules d 'Escherichia coli ont été incubées simultanément avec les cellules épithéliales intestinales pendant une heure selon l'exemple 6,15 12 - la figure 7 représente l'estimation de l'intensité de l'inflammation des intestins de souris selon le score macroscopique de Wallace après administration des levures ScProl et SCB1, selon l'exemple 4, - la figure 8 représente l'estimation de l'intensité de l'inflammation de 5 l'épithélium intestinal d'intestin de souris selon le score histologique d'Ameho après administration des levures ScProl et SCB1, selon l'exemple 4, - la figure 9 représente l'estimation de l'intensité de l'inflammation des intestins de souris selon le score macroscopique de Wallace après administration des levures ScProl et SCBI prises seule ou en combinaison, selon l'exemple 4, 10 la figure 10 représente l'estimation de l'intensité de l'inflammation de l'épithélium intestinal de souris selon le score histologique d'Ameho après administration des levures ScProl et SCB1, prises seules ou en combinaison, selon l'exemple 4, - la figure 11 représente le niveau d'expression d'ARNm du gène codant 15 pour la protéine IL-10 une heure, et trois heures après de la mise en contact des levures ou dérivés selon l'invention avec les cellules épithéliales intestinales humaines selon l'exemple 7, - la figure 12 représente le niveau d'expression d'ARNm du gène codant pour le récepteur nucléaire PPARa une heure après, et trois heures après la mise en 20 contact des levures ou dérivés selon l'invention avec les cellules épithéliales intestinales humaines selon l'exemple 7, - la figure 13 représente la modulation de l'expression d'ARNm du gène codant pour la protéine IL-10 après une heure, et après trois heures après la mise en contact des dérivés de levure selon l'invention avec les cellules épithéliales intestinales 25 humaines selon l'exemple 7, - la figure 14 représente l'expression du gène codant pour la protéine IL-10 dans des cellules épithéliales intestinales de souris après administration de la levure et/ou dérivé selon l'invention (exemple 4), -la figure 15 représente l'expression du gène codant pour le récepteur 30 nucléaire PPARa dans des cellules épithéliales intestinales de souris après administration de levure et/ou dérivé selon l'invention (exemple 4), et - la figure 16 représente l'évaluation du seuil de douleur dans un modèle murin de distension colorectale après l'administration de levure et/ou dérivé selon l'invention (exemple 9), 13 - la figure 17 montre les quantités de cytokine IL-10 sécrétées, mesurées en pg/ml, par les cellules intestinales de biopsies de patients atteint ou non de la maladie de Crohn après leur mise en contact avec des levures et/ou dérivés selon l'invention (exemple 8), la figure 18 montre les quantités de cytokine TNF-a sécrétées, mesurées en pg/ml, par les cellules intestinales de biopsies de patients atteint ou non de la maladie de Crohn après leur mise en contact avec des levures et/ou dérivés selon l'invention (exemple 8), -la figure 19 montre le résultat de l'essai de détermination de la capacité 10 de liaison de pili de type 1 sur des fractions mannoprotéiques (EL 05 et EL 06) de levure ScProl, - la figure 20 A montre les résultats d'inhibition de l'adhésion de bactéries AIEC avec le récepteur CEACAM6 exprimé à la surface de cellules épithéliales intestinales (exemple 6), et 15 - la figure 20 B montre les résultats de l'invasion de l'adhésion de bactéries AIEC avec le récepteur CEACAM6 exprimé à la surface de cellules épithéliales intestinales (exemple 6).
20 EXEMPLES :
EXEMPLE 1 : Survie de la levure ScProl et/ou SCB1 dans un environnement digestif artificiel simulant l'intestin humain Etude du devenir de la levure ScPro 1 et /ou SCB1 au cours du transit 25 gastro-intestinal Les levures ScProl et SCB1 ont été testées et étudiées in vivo dans un environnement digestif artificiel simulant la digestion humaine et notamment par l'étude de la survie des levures testées viables au cours du transit gastro-intestinal. Deux échantillons de la forme levure sèche active ScProl et deux échantillons 30 de la forme levure sèche active SCB1 ont été testés. Les deux échantillons se différencient par le temps de stockage à température ambiante sous vide: soit vieillissement inférieur à 6 mois soit vieillissement de 2 ans. 14 • Conditions expérimentales : Les digestions ont été réalisées dans le système dénommé TIM1 (estomac + intestin grêle), suivant des conditions expérimentales établies à partir de données issues de la littérature et reproduisant la digestion d'un aliment liquide (eau) chez l'homme adulte sain à jeun, avec élimination des produits de digestion par dialyse et absorption. Chaque digestion a été conduite sur 5 heures. Toutes les digestions ont été réalisées dans les mêmes conditions opératoires générales à savoir : Température . La température a été de 37°C. Paramètres de vidange gastrique : La vidange gastrique suit la loi définie par 10 Elashoff et al. (1982) énoncée comme suit : où F représente la fraction de repas délivrée, t le temps, T le temps de demi-vidange de l'aliment et b un paramètre décrivant l'allure de la courbe. Les paramètres sont T=l5min;b=1. 15 Paramètres de vidange iléale : La vidange iléale suit la loi d'Elashoff modifiée (introduction d'un paramètre d permettant le ralentissement de la vidange en fin de digestion, Frä = F + d * t3). Les paramètres sont : T = 150 min ; b = 2,4 ; d = -10 (cf Figure 2). Consignes de pH : 20 Estomac (min/pH) : 0/6,0 ; 10/3,2 ; 20/2,4 ; 40/1,8 ; 60/1,6 ; 90/1,5 ; 300/1,5 Duodénum : 6,4 Jéjunum : 6,9 Iléum : 7,2 Sécrétions gastriques : 25 HC1 Pepsine Lipase Sécrétions intestinales : NaHCO3 dans les trois parties de l'intestin grêle 30 Extrait de bile dans le duodénum Extrait pancréatique dans le duodénum
Dialyse/Absorption : F=1-2 (t/T)b 15 L'élimination des "petites" molécules du chyme intestinal a été réalisée à deux niveaux du TIM1 (le jéjunum et l'iléon) à l'aide d'hémodialyseurs. La dialyse du chyme intestinal a été réalisée en continue contre une solution saline dont la composition était proche de celle du plasma sanguin. Les dialysats ont été collectés dans des sacs de 5 dialyse.
Des prélèvements ont été réalisés au cours de la digestion à différents niveaux du tractus afin de suivre la survie des levures testées. Les dénombrements de levures ont été réalisés conformément aux 10 méthodologies microbiologiques classiques et ont été effectués sur les prélèvements pratiqués, dans l'estomac à 10, 20, 30 et 45 min, dans les sorties iléales cumulées sur des périodes d'une heure, et dans le résidu final. La méthode de dénombrement était la suivante : Chaque prélèvement a subi rapidement une dilution sériée au dixième dans de 15 l'eau physiologique (NaCl 8,5 g/l) stérile. Puis 0,1 ml de chaque dilution a été déposé puis étalé en surface d'un milieu gélosé réparti en boîte de Pétri (deux boîtes par dilution). Les boîtes sont incubées 48 h à 35°C avant de procéder à la numération des "Unités Formant Colonies" (UFC). Le résultat des numérations a été exprimé en UFC/ml (données brutes) et en 20 pourcentage de cellules de levures vivantes par rapport au nombre de levures initialement introduites, afin de déterminer les taux de survie des levures dans l'estomac et en sortie de l'intestin grêle. Le tableau suivant résume les taux de survie théoriques (si viabilité de 100%) et réels obtenus pour chaque souche aux niveaux de l'estomac, de l'ensemble des sorties 25 iléales après 5 h de digestion, et de l'ensemble du système après 5 h de digestion.
Résultats : Produits Levures Sortie Sortie Survie digérés introduites en estomac à iléale à T=5h globale à UFC T=45min T=5h Scprol 3.51010 89% 100% 106% loti Scprol 2.0 101ü 88% 95% 106% lot2 SCB1 1 1.5101- 83% 76% 81% SCB1 2 1.5 101ù 85% 69% 76% 16 • Conclusion Ces résultats démontrent bien une excellente survie gastro-intestinale pour les 5 levures ScProl et SCB1. EXEMPLE 2 : Survie de la levure ScProl dans un environnement digestif artificiel simulant l'intestin humain Etude de la survie des levures ScProl pendant la fermentation colique et de 10 leur influence sur la microflore intestinale La levure ScProl de forme sèche active a été testée et étudiée in vitro dans un environnement digestif artificiel simulant la digestion humaine et notamment par l'étude du devenir et de l'impact environnemental de levures testées viables durant la 15 fermentation colique. La fermentation colique s'apparente à une fermentation continue avec des apports séquencés de milieu pour le maintien de la flore. Ce milieu renferme principalement des composés glucidiques complexes et non digérés dans la partie haute du tractus digestif (amidon, pectine, cellulose...), des composés protidiques plus ou 20 moins hydrolysés et de la mucine. Du milieu colique est retiré du fermenteur également de façon séquencée. Le milieu est parcouru par un système de dialyse qui permet l'élimination continue des produits solubles de fermentation. Le dialysat est collecté pour analyse des acides gras à chaînes courtes (AGCC). 25 Le milieu est maintenu en anaérobiose créée par les propres gaz de fermentation et il présente un potentiel d'oxydo-réduction inférieur à -300 mV. Enfin le pH est régulé avec un point de consigne de 6. Chaque digestion a comporté : une période de stabilisation de la flore de 2-3 jours après ensemencement du côlon, une période de traitement (au moins 3 jours) avec 30 au moins un ajout quotidien de produit, et une période d'arrêt du traitement de 3 jours. A chaque expérience, les paramètres suivant ont été suivis et/ou enregistrés : - la viabilité des levures, - l'évolution de différentes populations bactériennes aérobie et anaérobie, - l'évolution des principaux produits de fermentation (AGCC et gaz), 17 - la détection d'activités enzymatiques standards, et - la température, le pH et le potentiel d'oxydo-réduction La fermentation a été réalisée dans un flacon à pénicilline de 60 ml, fermé par un septum serti, sur 30 ml de milieu colique (milieu de culture plus flore fécale fraîche). 5 L'échantillon de levure a été ajouté aux 30 ml de milieu. Le milieu colique était constitué d'une part d'une suspension microbienne issue de selles fraîches dans un tampon phosphate et d'autre part d'un aliment type, également utilisé pour la culture de la flore colique dans le côlon artificiel. Après mélange du milieu colique avec le produit à tester, le flacon a été bouché 10 et serti. Toutes ces manipulations ont été réalisées dans une hotte anaérobie (mélange de gaz, sans oxygène). Les flacons ont été placés en incubateur rotatif (37°C - 200 rpm) pendant 24 h. Pour chaque produit, le test a été dupliqué. Par ailleurs, 4 flacons témoins (sans 15 produit) ont été préparés dans les mêmes conditions. Deux flacons ont été traités immédiatement (temps initial) et deux flacons ont été incubés comme les flacons tests. Les fermentations ont été arrêtées à 24 h et les flacons ont alors été traités.
Production de gaz fermentaires : Le volume de gaz produit par fermentation a 20 été déterminé à l'aide d'un système de Mariotte (principe de la mesure du déplacement d'eau chassée par le gaz sous pression contenu dans le flacon à pénicilline). Une analyse des gaz présents dans le flacon a alors été réalisée par CPG (H2, CO2, CH4, 02).
Production d'acides gras à chaînes courtes : Un premier prélèvement du 25 contenu colique a été effectué. Il a été soit congelé, soit directement traité afin de déterminer les concentrations en AGCC (acides gras volatiles à courtes chaînes) du surnageant de culture. Cette analyse a été réalisée par CPG. Les métabolites recherchés ont été les acides : acétique, propionique, butyrique, isobutyrique, valérique, isovalérique, caproïque, isocaproïque et heptanoïque. 30 Analyse microbiologique : Un deuxième prélèvement du contenu colique a été effectué et traité immédiatement (dilution sériée au dixième dans un milieu de dilution réduit) afin de dénombrer : la flore anaérobie totale, la flore aéro-anaérobie facultative et la flore fongique.
Les résultats concernant la survie de la levure ScProl sont représentés sur la figure 1. Sur cette figure, chaque flèche verticale indique l'administration de levure ScProl.
Il a été constaté que la levure ScProl montre une bonne survie au 3ème jour après l'administration et une forte mortalité entre le 4eme et le 7eme jour lors période d'administration. Ceci montre que cette levure ne s'implante pas dans un environnement colique. Les résultats de l'analyse microbiologique sont représentés sur la figure 2. Ils montrent la diminution des entérobactéries en présence de la levure ScPro 1 avec une remontée après l'arrêt de l'administration de la levure. Lors de l'administration de la levure ScProl, il a également été constaté que la flore résistante aux antibiotiques (chloramphénicol, gentamycin) diminue significativement. Les résultats concernant l'effet de la levure ScProl sur la production d'acides gras volatils à courtes chaînes (AGCC) sont résumés dans le tableau ci-dessous (exprimés en mM dans le milieu colique). Avant Pendant Après traitement traitement traitement Acétate 71,4 57,6 60,6 2,3 4,2 0,7 Propionate 22,8 26,5 35,7 0,6 4,2 1,1 Butyrate 35,0 36,5 26,6 1,6 2,2 4,2 Iso- 3,2 3,3 3,4 Butyrate 0,3 0,2 0,1 Iso- 5,6 5,2 5,3 Valérate 0,5 0,2 0,0 Valérate 8,0 7,8 9,1 0,6 1,4 0,9 Iso- 0,1 0,0 0,0 Caproate 0,1 0,0 0,0 Caproate 9,0 7,3 5,7 1,1 0,3 0,7 Heptanoate 0,2 0,0 0,0 0,2 0,1 0,0 Total 155,3 144,1 146,4 2,7 6,8 3,4 Durant le traitement, il a été constaté une diminution de l'acétate, en partie au profit du propionate, ce qui suggère une diminution de l'activité de la microflore acétogène.
Parmi les autres paramètres suivis, il n'a pas été observé d'effet notoire du traitement sur / La production de gaz (en quantité et en proportion); / Les concentrations en sucres totaux et simples (stables dans le temps); et / Les activités enzymatiques.
EXEMPLE 3 : Etude de l'influence de la levure ScProl, SCB1 sur l'induction de la production de cytokines On a étudié l'influence des levures vivantes ScPro 1 et SCB1 sur l'induction de la production de cytokines sur des cellules périphériques mononucléaires sanguines humaines (PBMC). Les levures ScPro 1 et SCB 1 ont été testées dans leur forme sèche instantanée et sèche active sur la plan de leur capacité à induire la production des cytokines IL-10, IL-20 12, TNFa, TNFy chez les PBMC humaines.
Pré , aration des cellules éri chéri ues mononucléaires sari_nes humaines Du sang humain frais, obtenu à partir de sujets en bonne santé au Centre de Transfusion, a été dilué 2 fois avec du PBS-Ca (GIBCO) et purifié sur un gradient 25 Ficoll (GIBCO). Après centrifugation à 400 x g pendant 30 minutes à 20°C, les cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) formaient une couche circulaire dans le sérum. Les PBMC ont été soigneusement aspirées, mises en suspension dans un volume final de 50 ml utilisant du PBS-Ca et lavées 3 fois dans la même solution tampon avec des étapes de centrifugation de 10 minutes à 20°C à 350 x g. Les PBMC 30 ont ensuite été remises en suspension en utilisant un milieu RPMI complet (GIBCO), enrichi avec 10 % w/v de sérum de veau foetal (inactivé à 56°C pendant 30 minutes), 1 % w/v de L-glutamine (GIBCO) et de la gentamycine (150 g/ml) (GIBCO). Les PBMC ont été dénombrées au microscope, ajustées à une concentration de 2x106 cellules / ml et réparties (dans 1 ml de la solution aliquote) sur des boites de culture 35 cellulaires de 24 puits (Corning, Inc.).
Préparations microbiologiques Des cultures réalisées sur la nuit de Lactobacillus, Lactococcus et de Escherichia coli (souches de contrôles) ont été lavées 2 fois avec un tampon PBS à pH 7.2, avant d'être remises en suspension dans du PBS à une concentration de 2.109 UFC/ml. La concentration de levure utilisée dans les premières expérimentations était de 2.108 ufc/ml. Pour une étude de comparaison de dose initiale, des dilutions sérielles de 10 en 10 pouvaient être faites pour comparer les effets de 2.10' UFC/ml, 2 x 108 UFC/ml et 2.109 UFC/ml.
Incubation des cellules périphériques mononucléaires sanguines humaines 10 l de ces suspensions de travail ont été transférées dans les puits des boites contenant les PBMC, qui ont été mises à incuber à 37°C dans un mélange gazeux composé de 5 % de CO2 et 95 % d'air atmosphérique. Après 24 heures d'incubation, le surnageant a été aspiré, centrifugé à 2 000 t/min (modèle Eppendorf), retiré et conservé à -20°C. Le contrôle se compose de bactéries à Gram positif (Lactobacillus et Lactococcus), une bactérie à Gram négatif (Escherichia coli) et tampon sans levure.
Quantification des cytokines Les niveaux d'expression des cytokines ont été déterminés par ELISA. Les plaques ELISA ont été tapissées d'un anticorps (pendant une nuit) et l'anticorps a été saturé avec du PBS / BSA 1% (serum albumine bovine). Un étalonnage a été préparé avec des concentrations connues de cytokines, avec un seuil de détection de 15,62 à 2000 pg/ml (incubation sur la nuit). La recherche et la quantification d'anti-cytokine ont été réalisées par mesure de l'activité streptavidine avec le substrat TMB (tétraméthylbenzidine, Pharmingen2). Les kits Pharmingen du commerce ont été utilisés en conformité avec la description du fabriquant. Quatre cytokines ont été choisies : 3 pro-inflammatoires (TNFa, IFNy, IL-12) et une anti-inflammatoire (IL-10).
Résultats Les réponses des 4 cytokines sur 5 donneurs distincts ont été évaluées au ratio 1/1, levures/ PBMC.
Les résultats des dosage des 4 cytokines sécrétées dans le surnageant de culture sont résumés dans le tableau A ci-dessous. Les données sont exprimées comme la valeur moyenne (Moy) issues des dosages des 5 donneurs. Le tableau donne également la valeur (Sem) de l'erreur standard sur la moyenne. IL-10 IFN ^ (pg/ml) TNF ^ IL-12 (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) Moy Sem Moy Sem Moy ' Sem Moy Sem Témoin négatif 0 0 50 0 50 0 0 0 E. coli 2474 839 57376 29591 11185 3875 15 15 Lactococcus lactis 111, 43 136103 62706 25362 9818 1101, 543 Bifidobacterium 1072 355 33780 27164 14517 5601 22 20 longum Lactobacilus 435 259 85543 46838 18369 6857 529 343 acidophilus SCB1 569 291 27807 19231 6492 2698 14 10 ScProl 442 292 15218 9304 3643 1847 8 5 Tableau A
Il a été observé : 1) Pour les levures ScProl et SCB1, la production de quantités très faibles, voire indétectables, d'IL-12 induite par les PBMCs, contrairement aux bactéries de référence. 2) Des niveaux substantiels d'IL-10 à la fois pour les levures vivantes laissant apparaître que SCB 1 présente un meilleur résultat que ScPro 1. 3) En ce qui concerne l'IFNy et le TNFa, les quantités sécrétées sous l'action des levures ScProl et SCB1 sont nettement plus faibles comparativement avec les différentes bactéries probiotiques testées.
Conclusions : 20 - Il apparaît clairement que Les levures ScProl et SCB1 en présence de PBMC n'induisent pas la cytokine pro-inflammatoire IL-12, contrairement à ce qui est classiquement observé avec les lactobacilles probiotiques. - Les levures ScProl et SCB1 en présence de PBMC induisent des niveaux substantiels d'IL-10 (anti-inflammatoire). 10 15 - Les quantités sécrétées d'IFN-y et de TNF-a par les PBMC en présence des levures ScProl ou SCB1 sont nettement plus faibles qu'avec les bactéries probiotiques. Exemple 4 : Evaluation de l'effet protecteur des levures ScProl et SCB1 vis-à-vis de la colite sur un modèle chimio-induit (TNBS) de souris
Le modèle animal proposé est couramment utilisé et a été adapté pour mesurer 10 les effets anti-inflammatoires des levures. Des souris Balb/c âgées de 6 semaines ont été utilisées au cours de cet essai. Les souris ont été acclimatées aux conditions du laboratoire une semaine avant l'expérimentation, avec eau et nourriture fournies ad libitum. Chaque échantillon a été testé sur un groupe de 10 souris. Les colites ont été induites par un cycle de distribution 15 d'eau de boisson ad libitum contenant 5% (w/v-1) de TNBS pendant 7 jours. Les levures ont été administrées oralement par gavage une fois par jour, 3 jours avant le début de l'induction de la colite par le TNBS et pendant la durée du traitement au TNBS (7 jours).
20 En plus des deux groupes testés, on a eu recours à un groupe témoin (contrôle négatif) pour lequel on n'a utilisé qu'une solution physiologique.
Les paramètres testés sont les suivants à l'issue des traitements : û L'évaluation macroscopique de l'inflammation intestinale (Score de 25 Wallace). Le colon de chaque souris a été examiné sous un microscope à dissection (agrandissement, x5) pour évaluer les lésions macroscopiques selon le système de score de Wallace qui va de 0 à 10 en fonction de critères d'évaluation révélateurs de la sévérité de l'inflammation tels que l'hyperémie, l'épaisseur des parois du colon et l'étendue des ulcérations. 30 L'évaluation histologique de l'inflammation (Score d'Ameho). Une section du colon prélevée exactement à 2 cm du canal anal a été utilisée pour réaliser l'évaluation histologique selon le score d'Ameho qui va de 0 à 6 selon le degré d'infiltration de l'inflammation, la présence d'érosion, d'ulcérations ou de nécroses et la5 profondeur ainsi que l'extension en surface des lésions. La quantification des dégradations et des lésions intestinales a été effectuée par 2 opérateurs indépendants. La quantification des l'expression des gènes codant pour IL-10 et PPARa Pour ce faire, l'ARN total a été isolé des tissus coloniques au moyen du kit RNeasy (Macherey Nagel, Hoerdt, France) selon les instructions du fabricant. La quantification de l'ARN messager a été effectuée en utilisant un spectrophotomètre. Après un traitement à 37°C pendant 30 minutes avec 20-50 unités de DNase I RNasefree (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA), des primers oligo-DT (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA) ont été employés pour synthétiser les ADN circulaires simple brin. Les ARN messagers ont été quantifiés avec le SYBR green Master Mix (Applera, Courtaboeuf, France) et avec des oligonucléotides humains spécifiques pour études in vitro (voir tableau B ci-dessous), au moyen de l'appareil GeneAmp Abiprism 700 (Applera, Courtaboeuf, France). Des contrôles calibrés et non calibrés ont été inclus dans chaque essai. Chaque échantillon a été mesuré trois fois. L'intensité de la couleur du SYBR vert a été analysée avec le logiciel Abiprism 7000 SDS (Applera, Courtaboeuf, France). Tous les résultats seront normalisés par rapport au gène codant pour la B-actine. Gènes Séquences d'amorces nucléotidiques B-actin F: 5'-AAgTCCCTCACCCTCCCAAAAg -3' R : 5'- AAgCAATgCTgTCACCTTCCC-3' _ PPARa F: 5'-ACgATgCTgTCCTCCTTgATg -3' R: 5'- gTgTgATAAAgCCATTGCCgT -3' IL-10 F: 5'-CAgTCAgCCAgACCCACAT-3' R: 5' -gCTCCACTgCCTTgCTTT-3' Tableau B Les levures ScProl et SCB1 ont été testées dans le modèle préventif standard 25 décrit ci-dessus. Un suivi pondéral des animaux avant l'induction de la colite a montré que les préparations de levure administrées aux souris ont été très bien tolérées. L'inflammation intestinale, estimée par le score de Wallace, a été réduite de 60% avec les levures ScProl (sèche active, 1 mg/jour) et SCB1 comparé au contrôle positif. La levure SCB1 a également induit une réduction de l'inflammation. De même,20 la nécrose intestinale, estimée par le score Ameho a été réduite d'un tiers avec la levure ScProl (sèche instantanée, 1 mg ou 100 g/jour) comparé au contrôle positif.
Les levures ScProl et SCB1, administrées seules ou ensemble, ont augmentés le niveau d'expression des gènes codant pour l'interleukine anti-inflammatoire IL-10 et le récepteur nucléaire PPARa
Les figures 7 à 10 illustrent bien les excellentes valeurs de scores macroscopiques de Wallace et Ameho des levures ScPro 1 et SCB1 à des dosages journaliers différents.
Sur les figures 7 et 8, on a représenté, respectivement, le score macroscopique de Wallace et le score histologique d'Amého des levures ScProl et SCB1 sous forme sèche instantanée, dosée quotidiennement à 10 g et 1 mg.
Les chiffres de chaque colonne du graphe des figures 7 et 8 représentent les éléments suivants: 1 représente le TNBS seul, 2 représente TNBS + ScPro 1 (1 mg), 3 représente TNBS + ScProl (100 g), 4 représente TNBS + SCB1 (1 mg), 5 représente TNBS +SCB1 (100 g). On peut noter que la levure ScProl sèche instantanée, dosée à 100 g/jour, réduit de manière significative les lésions aux niveaux macroscopique et histologique.
Sur les figures 9 et 10, on a représenté, respectivement, le score macroscopique de Wallace et le score histologique d'Amého des levures ScProl et SCB1, prise seules et en combinaison, sous forme sèche instantanée ou sèche active, dosée quotidiennement à 100 g et 1 mg. Les figures 14 et 15 montrent, respectivement, le niveau d'expression des gènes 30 codant pour l'interleukine anti-inflammatoire, et pour le récepteur nucléaire PPARa au niveau des cellules intestinales. Les chiffres de chaque colonne du graphe des figures 9, 10, 14 et 15 représentent les éléments suivants: 1 représente le TNBS seul, 2 représente TNBS + ScPro 1 sèche instantanée (100 g), 3 représente TNBS + ScProl sèche active (100 g), 4 représente TNBS + SCB1 sèche active (100 g), représente TNBS +ScProl sèche active (1 mg), 5 6 représente TNBS + ScProl sèche active (100 g), 7 représente TNBS + ScProl sèche active (100 g) + SCB1 (100 g).
Conclusions : On peut noter que ScPro 1 sous forme sèche active induit significativement les lésions au niveau macroscopique, et qu'un effet anti-inflammatoire synergique existe par la combinaison de ScProl et SCB1, tant au niveau macroscopique qu'au niveau histologique.
ScPro 1 et SCB1 ont augmenté respectivement par 2,9 et 3,1 le niveau d'expression du gène codant pour l'interleukine anti-inflammatoire IL-10 à des doses de 100 g. La combinaison ScProl + SCB1 (histogramme n°7) multiplie par 2,7 ce niveau d'expression (figure 14).
ScProl et SCB1 ont augmenté respectivement par 1,5 et 1,6 le niveau d'expression du gène codant pour le récepteur nucléaire PPARa à des doses de 100 g. La combinaison ScProl + SCB1 (histogramme n°7) multiplie par 1,7 ce niveau d'expression (figure 15).
EXEMPLE 5: Etude de l'influence des levures ScProl et SCB1 sur la 25 colonisation au niveau de l'intestin de Candida albicans dans un modèle murin d'inflammation chimio-induite
L'étude vise à déterminer les effets de l'administration des levures ScProl et SCB1 de type probiotique sur la colonisation intestinale de la levure pathogène Candida 30 albicans et son effet potentialisation de l'inflammation dans un modèle murin de colite chimio-induite. Les levures testées sont sous forme sèche instantanée. • Conditions expérimentales : Les souris femelles de souche Balb/C sont âgées de 4 à 6 semaines. A partir de JO jusqu'à J14, les animaux ont reçu du DSS (Dextran Sodium Sulfate) à 1,5% dans l'eau de boisson, pour chimio-induction de l'inflammation.
Trois expérimentations ont été réalisées.
Dans la première, à J-5, les souris ont été gavées par canule avec 5.107 cellules de levures ScProl dans 200 l de PBS (tampon phosphate). Cette opération a été renouvelée tous les jours pendant 19 jours. A JO, les souris ont été gavées par canule avec 5x107 cellules de levure de la souche de C. albicans SC5314 dans 200 l de PBS.
Dans la deuxième, à JO, les souris ont été gavées par canule avec 5x107 cellules de levures de la souche de C. albicans SC5314 dans 200 l de PBS. 4 jours après un lot de souris a fait l'objet d'un gavage par 5x107 cellules de levure ScProl dans 200 l de PBS. Cette opération a été renouvelée tous les jours pendant 14 jours.
Dans la troisième, à JO, les souris ont été gavées par canule avec 5.10' cellules de levure de la souche de C. albicans SC5314 dans 200 gl de PBS. Une heure après un lot de souris a fait l'objet d'un gavage par 5. 107 cellules de levure ScProl dans 200 l de PBS. Cette dernière opération a été renouvelée tous les jours pendant 14 jours. Les animaux (issus des expérimentations 1, 2 et 3) ont été suivis quotidiennement en ce qui concerne les points suivants : - la consistance des selles, le saignement anal, leur masse corporelle (score clinique), - des rétrocultures de 1 mg de selles homogénéisées dans 1 ml de PBS dont 10 l ont été ensemencés sur milieu Candi-select ; après 24h de culture à 37°C les UFC de C. albicans (colorées en bleu) et de S. cerevisiae (colorées en vert) ont été dénombrées, - les animaux ont été sacrifiés à l'issue des essais. Le sang a été prélevé immédiatement par ponction cardiaque, décanté à température ambiante, le sérum a été récupéré par centrifugation et stocké à -80°C ; le colon a été prélevé et réparti en 4 sections dont 3 ont été congelées et 1 a été placée dans le fixateur (PFA à 4%) pour étude histologique. • Résultats : Comme on peut le voir sur la figure 3, dans la première expérimentation (test d'effet prophylactique), on a observé dans ce modèle de colite chimio-induite que l'administration de DSS augmente significativement la colonisation des muqeuses intestinales par C. albicans à partir du J4 (DSS+Ca). De manière très intéressante, on voit que l'administration de la levure probiotique ScProl durant 19 jours réduit significativement la colonisation de C. albicans induite par DSS.
Comme le montre la figure 4, dans la deuxième expérimentation (test de traitement), on a observé que l'administration de la levure probiotique ScProl ou SCB1 réduit la colonisation induite par DSS. De plus, les effets de la levure ScProl sont visibles même après l'arrêt du traitement par le DSS à J14.
• Conclusion : Il en ressort que l'administration de la levure ScProl ou de la levure SCB1 réduit significativement la colonisation de C. albicans, et ce à la fois en condition prophylactique et en condition de traitement. Il est à noter que cet effet protecteur perdure même à l'arrêt du traitement.
EXEMPLE 6 : Etude de l'effet inhibiteur de la Levure ScProl ou SCB1 ou dérivés sur le pouvoir d'adhésion et d'invasion de souches pathogènes de E. coli isolées de biopsies iléales de patients atteints de la Maladie de Crohn
L'influence des levures vivantes ScProl et SCB 1 a été étudiée pour ses effets inhibiteurs sur le pouvoir d'adhésion et d'invasion de souches pathogènes de E. coli isolées de biopsies iléales de patients atteints de la maladie de Crohn. Des souches de E. coli dénommées AIEC pour Adherent-Invasive E. coli isolées de biopsies iléales de patients atteints de maladie de Crohn (MC) sont capables d'adhérer et d'envahir les cellules épithéliales intestinales.
La souche de E. coli LF82, isolée d'une lésion iléale chronique chez un patient atteint de maladie de Crohn, possède toutes les caractéristiques d'un pathogène bactérien invasif. La caractérisation d'un phénotype d'adhésion-invasion de la souche LF82 et l'absence de déterminants génétiques d'invasion déjà décrits chez E. coli, Shigella et Salmonella a conduit à définir l'existence d'un nouveau groupe pathogène 28 de E. col/ pouvant être associé à la maladie de Crohn, désigné AIEC. Après phagocytose par des macrophages murins ou humains, la souche AIEC LF82 survit et se multiplie dans une large vacuole, tout en préservant l'intégrité de la cellule hôte. Suite à l'infection, les macrophages sécrètent un taux important de TNFa. La prévalence des souches AIEC est de 36,4% au niveau des lésions iléales de patients atteints de MC. Le processus d'adhésion d'une bactérie à des cellules eucaryotes résulte d'une interaction spécifique entre un ligand présent à la surface de la bactérie, appelé adhésine, et un récepteur de nature protéique, glycoprotéique ou glycolipidique exprimé à la surface de la cellule épithéliale de l'hôte. En ce qui concerne les bactéries, il a été montré que l'adhésine FimH des pili de type 1 est impliquée dans l'adhésion des bactéries AIEC aux cellules épithéliales intestinales. L'adhésine bactérienne FimH reconnaît le récepteur entérocytaire CEACAM6 (dénommé également CD66c ou NCA) qui est une glycoprotéine riche en résidus mannose et anormalement surexprimée au niveau iléal chez 90% des patients atteints de MC.
Conditions expérimentales : La souche AIEC LF82 caractérisée pour son pouvoir d'adhésion et d'invasion de cellules épithéliales intestinales en culture a été utilisée comme souche prototype. Cette étude a été étendue à 10 souches AIEC isolées de patients atteints de MC afin de confirmer les résultats obtenus avec la souche AIEC LF82. La souche d'E. coli DAEC (Diffuse Adherent Escherichia Coli) C1845, qui adhère aux cellules épithéliales via un mécanisme indépendant de mannose (adhesines Afa/Dr) est utilisé comme contrôle négatif.
Essais d'agglutination Avec les levures ScProl et SCB1 vivantes, des essais d'agglutination quantitatifs ont été réalisés soit en présence des bactéries AIEC, soit en présence d'extraits purifiés de pili de type 1 préparés à partir de la souche AIEC LF82 selon le protocole décrit dans Boudeau et coll. (2001 Mol Microbiol. 39:1272-84). Un index d'agglutination a été déterminé à l'aide d'une concentration fixe de levure et des concentrations variables de bactéries ou de pili de type 1 purifiés. Dans le cas des fractions de levure de type mannoprotéique pour lesquelles on n'observe pas d'agglutination, une détermination de la capacité de liaison de pili de type 1 a été réalisée par technique ELISA.
Ces essais sont usuellement pratiqués en microplaques. Les fractions de levures sont fixées sur une microplaque. Diverses dilutions de pili de type 1 purifiés sont mises en contact avec les fractions de levures. Après lavages, les pili de type 1 sont révélés à l'aide d'anticorps anti-pili de type 1 obtenus chez le lapin (Boudeau et coll. 2001).
Après lavages, des anticorps secondaires couplés à la peroxydase sont utilisés. La quantification est réalisée à l'aide du substrat de la peroxydase (H202) et d'un chromogène (tetraméthylbenzidine) et lecture de la microplaque à la densité optique de 450 nanomètres.
Etude de l'inhibition de l'interaction des bactéries AIEC avec le récepteur CEACAM6 exprimée à la surface de cellules épithéliales intestinales par la levure ScProl ou SCB1 - Cellules épithéliales intestinales humaines Des lignées cellulaires épithéliales intestinales T84, Caco-2 et HT29 exprimant le récepteur CEACAM6 (Flow Laboratories) ont été utilisées. Ces cellules ont été utilisées après 2 jours de culture pour mimer les cellules non différenciées présentes au fond des cryptes, et après 15 jours de culture pour mimer les cellules différenciées retrouvées au sommet des villosités. Les cellules Caco-2 et HT29 ont été cultivées sous 5% de CO2 à 37°C dans du milieu Dulbecco modifié (Seromed) additionné de 2% de sérum de veau foetal (SVF) décomplémenté par la chaleur (Seromed). Pour les cellules T84, le milieu de base a été le DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) additionné de 50% de Ham-F12 (Life Technology) et de 10% SVF. A chaque milieu ont été ajoutés 1% d'acides aminés non essentiels (Life Technology), 1% glutamine (Life Technology), 200 U/1 pénicilline, 50 mg/1 streptomycine, 0,25 mg/1 amphotéricine B et 1% du mélange vitaminé X-100 pour milieu MEM (Minimum Essential Medium) (Life Technology).
- Cellules épithéliales transfectées exprimant CEACAM6. Des cellules HeLa ont été transfectées par le vecteur plasmidique recombinant H3033 contenant l'ADNc codant CEACAM6 ou par le vecteur seul pCEP4. Ces cellules ont été cultivées sous 5% de CO2 à 37°C dans du milieu RPMI additionné de 10% SVF, 1% d'acides aminés non essentiels, 1% glutamine et de Généticine (50 gg/ml). - Vérification de l'expression de CEACAM6. Des marquages immunocytochimiques ont été réalisés sur chaque lot de cellules en culture pour vérifier la présence et estimer la quantité de CEACAM6 exprimée. Les cellules ont été cultivées sur des lamelles en verre stériles. Le tapis cellulaire a été lavé au PBS, puis fixé par du paraformaldéhyde 3% pH 7,4 pendant 10 minutes à température ambiante. Les cellules ont été incubées avec l'anticorps monoclonal anti-CEACAM6 (clone 9A7, Genovac) dilué au 1/100 dans du PBS-5% sérum de cheval, dans une atmosphère humide pendant une heure. Après lavage au PBS, les cellules ont été mises en contact avec un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome (FITC-anti- souris, Zymed) dilué au 1/500 dans du PBS-5% sérum de cheval, pendant 1 heure en atmosphère humide. Les lamelles de verre ont été fixées sur lame au Moewiol, puis visualisées avec un microscope à fluorescence.
- Protocoles d'adhésion et d'invasion.
Les cellules épithéliales ont été cultivées en plaques 24 puits pour culture cellulaire (Polylabo) à raison de : - 4 x 105 cellules par puits pendant 24 heures pour les cellules HeLa, - 2 x 105 cellules/puits pendant 48 heures pour les cellules Caco-2, HT29 et T84 non différenciées, - 5 x 104 cellules/puits pendant 15 jours pour les cellules Caco-2, HT29 et T84 différenciées. Avant infection, les tapis cellulaires ont été lavés 2 fois en PBS. Les cellules ont été infectées avec la souche AIEC LF82 avec une multiplicité d'infection de 10 et de 100 bactéries par cellules en milieu de culture cellulaire sans antibiotique. Pour les expériences d'adhésion, après 3 heures d'infection à 37°C sous 5% CO2, les tapis cellulaires ont été lavés 3 fois en PBS et les bactéries ont été dénombrées. La détermination du nombre total de bactéries associées aux cellules épithéliales (nombre de bactéries adhérentes et invasives) a été réalisée par addition de Triton X-100 à 1% (Sigma) pour lyser les cellules eucaryotes. Des dilutions ont été effectuées et ensemencées sur gélose Mueller-Hinton pour déterminer le nombre d'unités formant colonies. Le protocole de mesure d'invasion de cellules épithéliales intestinales par des bactéries a utilisé le test de protection à la gentamicine, antibiotique bactéricide pour les bactéries extracellulaires mais non actif sur les bactéries intracellulaires. Une étape g/ml en milieu de supplémentaire de traitement à la gentamicine à raison de 100 g/ml en milieu de culture cellulaire pendant une heure a été réalisée après les 3 heures d'infection initiale. - Pouvoir inhibiteur des levures et des fractions de levure sur l'adhésion et l'invasion de la souche AIEC LF82. -Protocole 1 : modèle de co-incubation La souche de référence AIEC LF82 (à différentes multiplicités d'infection à définir lors de tests préliminaires) a été incubée simultanément avec la levure ScProl (à différentes multiplicités d'infection) pendant des temps variant de 1h à 4h avec les cellules épithéliales. Les niveaux d'adhésion et d'invasion de la souche AIEC LF82 seule ou en présence de la levure ont été quantifiés.
Protocole 2 : modèle de pré-incubation La souche AIEC LF82 a été pré-incubée avec la levure ScProl (à différentes multiplicités d'infection) pendant des temps variant de 1h à 4h. Les bactéries pré-traitées ont été mises en contact avec les cellules en cultures à multiplicités d'infection de 10 ou de 100 bactéries par cellule pendant des temps d'infection variant de 1h à 4h. Les niveaux d'adhésion et d'invasion de la souche AIEC ont été analysés après 1h, 2h, 3h, et 4h d'infection.
Les niveaux d'adhésion et d'invasion de la souche AIEC LF82 ont été analysés comparativement à des cellules infectées par la souche AIEC LF82 n'ayant subit aucun traitement par les levures ou dérivés de levure.
Tous les résultats seront exprimés selon le rapport R : R = Nombre de bactéries adhérentes ou invasives en présence de la levure ScPro1 / Nombre de bactéries adhérentes ou invasives sans traitement.
- Contrôle d'absence de cytotoxicité cellulaire.
L'absence de cytotoxicité cellulaire induite par les différentes doses de levure a été testée par dosage de lactate déshydrogénase (LDH) dans le milieu d'incubation levures/cellules ou FDL/cellules (Glasser et coll, 2001).
Résultats : Essais d'agglutination avec LF82 Les titres d'agglutination obtenus avec LF82 en présence de la levure ScProl ou SCB 1 en culture (= forme fraîche) ou sous forme sèche (séchage sèche instantanée ou 5 lyophilisé) sont résumés sur le tableau suivant qui est le résultat de 3 à 5 manipulations indépendantes : Titre d'agglutination Levure Forme Moyenne Titre Titre mini mai culture 1/7 1/3 1/12 ScProl fraiche ù sèche 1/58 1/20 1/96 ScProl instantanée Sèche 1 /43 1 /24 1 /64 ScProl lyophilisée Culture 1/28 1/12 1/40 SCB1 fraîche Sèche 1/16 1/12 1/20 SCB1 instantanée sèche 1/19 1/16 1 /24 SCB1 lyophilisée De manière absolue, de bons résultats d'agglutination avec LF82 sont obtenus 10 avec la levure sèche ScProl sèche instantanée et SCB1 sèche instantanée. Pour ces levures, on a montré l'importance de l'impact favorable du procédé et notamment du procédé de séchage sur son potentiel d'agglutination.
Essais d'agglutination avec les pili purifiés 15 Les titres d'agglutination obtenus avec les pili purifiés en présence de la levure ScPro 1 en culture (= forme fraîche) ou sous forme sèche instantanée et de la levure SCB 1 (sèche) sont résumés sur le tableau suivant : 20 Titre d'agglutination Levure Forme_ exp 1 exp 2 exp 3 SeProl frais ù 1/300 1/300 1/400 levure pressée ScProl Sèche 1/600 1/600 1/300 instantanée SCBI sèche 1/300 1/300 , 1/200 lyophilisée Cette expérience confirme qu'une interaction pili - levure est bien nécessaire pour l'agglutination. Les pili ayant pour propriété de reconnaître des structures mannose, ce sont ces dernières qui sont reconnues sur les levures et qui participent au phénomène d'agglutination observé. Les meilleurs résultats sont obtenus avec la levure ScProl sèche instantanée. Résultat de l'essais de détermination de la capacité de liaison de pili de type 1_ sur des fractions mannoprotéiques de levure ScProl La figure 19 montre clairement que les pili de type 1 purifiés à partir de la souche AIEC LF82 se fixent spécifiquement sur les mannoprotéines de levure. On remarque que la méthode de préparation (thermique ou enzymatique) de ces mannoprotéines (EL05 et EL06) influe un peu sur la constante d'affinité des pili.
Résultats d'inhibition de l'interaction de bactéries AIEC avec le récepteur 15 CEACAM6 exprimé à la surface de cellules épithéliales Préincubation : La figure 5 montre qu'à l'aide du protocole décrit ci-dessus, les résultats ont montré que la levure ScProl est capable d'inhiber l'adhésion et l'invasion de cellules epithéliales humaines (HT29) par des E. coli AIEC (LF82) de manière dose dépendante. 20 Co-incubation : La figure 6 montre que la levure ScProl est capable pour les concentrations les plus fortes de protéger les cellules de l'infection bactérienne. Dans les conditions du test et aux doses testées, une protection de 80% est observée au maximum. 25 Résultats d'inhibition de l'interaction de bactéries AIEC avec le récepteur CEACAM6 exprimé à la surface de cellules épithéliales Co-incubation : Les figures 20A et 20B montrent, dans les conditions expérimentales ci-dessus, qu'une fraction mannoprotéique de ScProl est capable d'inhiber l'adhésion et l'invasion de cellules epithéliales humaines (HT29) par des E. coli AIEC (LF82) de manière dose dépendante.
Conclusion : Il ressort de cette étude que : - Les levures ScProl et SCB1, en particulier sous forme sèche instantanée, présentent un fort pouvoir d'agglutination de la souche LF82. - Les levures ScProl et SCB1 sont capables d'inhiber in vitro l'adhésion et l'invasion de cellules épithéliales humaines (HT29) par des E. coli de manière dose dépendante. -Les mannoprotéines sont capables d'inhiber in vitro l'adhésion et l'invasion de cellules épithéliales humaines (HT29) par des E. coli de manière dose dépendante. - In vitro, la levure ScPro 1 est capable à de fortes concentrations de protéger partiellement, à environ 80% les cellules de l'infection bactérienne.
EXEMPLE 7 : Etude du rôle régulateur des levures ScProl, SCB1 et des dérivés de levure sur l'expression des gènes codant pour IL-10 et PPARa chez des cellules épithéliales intestinales humaines cultivées in vitro
On a étudié le caractère probiotique des levures ScProl et SCB1, prises seule ou en combinaison, et/ou de fractions de levure, et leur faculté d'inhiber le déclenchement des inflammations par interaction avec certains récepteurs intestinaux.
Essais in vitro On a notamment étudié les effets de la levure et des dérivés de levure selon l'invention sur différents récepteurs de cellules épithéliales intestinales par une analyse in vitro sur deux lignées cellulaires de cancer du côlon CaCo-2 (ATCC HTB-37) et HT-29 (ATCC HTB-38).
Pour cela, on a effectué une analyse transcriptionnelle par extraction de l'ARN, selon la méthode suivante. Les cellules sont lysées dans du Trizol. Sur la fraction soluble, on réalise ensuite une étape de désoxyribonucléase en ajoutant 2041l d'une solution contenant 10 U d'inhibiteur de ribonucléase et 10U de désoxyribonucléase. g d'ARN ont été rétrotranscrits en présence de 200 U de transcriptase inverse, de dithiotréitol, d'oligo-dT15 et de désoxyribonucléotides. Les ADNc sont amplifiés par la technique connue de réaction en chaîne de polymérisation (PCR Polymerase Chain Reaction en anglais) en même temps qu'un 10 compétiteur en utilisant des amorces sens et anti-sens spécifiques, notamment des gènes suivants : IL-10 et PPARa. Après 40 cycles d'amplification, réalisés en présence de 1,25 U d'Ampli Taq Gold 5000 et migration des différents échantillons sur gel d'agarose 3%, l'intensité des bandes est déterminée par un analyseur d'image.
Les résultats sont exprimés en nombre de molécules d'ARNm pour 105 molécules d'un étalon interne : la B-actine.
Les résultats, rassemblés sur la figure 11, et comprennent les valeurs d'expression d'ARNm une heure après (sous la référence A), et 3 heures après (sous la référence B) la mise en contact des levures ou dérivés avec les cellules épithéliales intestinales du gène codant pour la protéine anti-inflammatoire IL-10. Sur cette figure 11, les références suivantes désignent les levures/dérivés de levure expérimentés, qui ont montré un niveau d'expression précoce supérieur à 4 fois le signal de référence : 3 désigne une levure Saccharomyces cerevisiae, 5 désigne la levure ScProl de l'invention, 6 désigne un extrait de levure Saccharomyces cerevisiae, et 12 désigne une fraction d'ARN de levure Saccharomyces cerevisiae.
Ces résultats montrent bien que la levure et les dérivés de levure Saccharomyces cerevisiae, selon l'invention, induisent l'expression de manière précoce, après une heure, du gène codant pour la cytokine anti-inflammatoire IL-10.
En effet, par rapport au témoin non traité, l'expression en ARNm pour la levure et les dérivés selon l'invention est supérieure à 4 sur l'axe des ordonnées, valeur qui correspond déjà à un excellent signal d'expression précoce.
D'autres résultats sont rassemblés sur la figure 13. Cette figure montre la modulation, en fonction des quantités de dérivés de levure apportées, de l'expression de l'ARNm du gène codant pour la protéine IL-10. Sur cette figure 13, l'expression a été mesurée après une heure (1h) et après trois heures (3h). On peut voir, l'expression des levures et extraits de levure Saccharomyces cerevisiae selon l'invention, désignés par les références suivantes : 5 désigne la levure ScProl selon l'invention, 6 désigne un extrait de levure Saccharomyces cerevisiae, 8 désigne un B-glucane pariétal de Saccharomyces cerevisiae, 9 désigne une mannoprotéine pariétale de levure Saccharomyces cerevisiae, 11 désigne une fraction d'ADN de levure Saccharomyces cerevisiae, et 12 désigne une fraction d'ARN de levure Saccharomyces cerevisiae. L'expression a été mesurée avec des concentrations en levure et /ou dérivé différentes. Plus la couleur des colonnes sur la figure 13 est foncée, plus la concentration en levure /dérivé est élevée.
Les résultats de cette figure 13 montrent que les extraits de levure Saccharomyces cerevisiae selon l'invention induisent de façon précoce les ARNm de la cytokine anti-inflammatoire (IL-10).
Les résultats rassemblés sur la figure 12 comprennent les valeurs d'expression d'ARNm une heure après (sous la référence A), et 3 heures après (sous la référence B) la mise au contact des levures ou dérivés avec les cellules épithéliales intestinales, du gène codant pour le récepteur nucléaire PPARa.
Sur cette figure 12, les références suivantes désignent les levures/dérivés de levure expérimentés, qui ont montré un niveau d'expression tardive supérieur à 3 fois le signal de référence : 30 37 1 désigne la levure Saccharomyces cerevisiae ScProl selon l'invention sous une forme sèche active, 4 désigne une levure Saccharomyces cerevisiae, désigne la levure Saccharomyces cerevisiae ScProl selon l'invention sous une 5 forme sèche active, 8 désigne une fraction de parois de levure Saccharomyces cerevisiae, 9 désigne une fraction de B-glucanes pariétaux de levure Saccharomyces cerevisiae, désigne une fraction de mannoprotéines pariétales de levure Saccharomyces 10 cerevisiae, 11 désigne une fraction d'ADN de levure Saccharomyces cerevisiae, et 12 désigne une fraction d'ARN de levure Saccharomyces cerevisiae.
Ces résultats montrent bien que la levure et les dérivés de levure Saccharomyces cerevisiae, selon l'invention, induisent l'expression de manière tardive, après trois heures, du gène codant pour le récepteur nucléaire PPARa. En effet, l'expression en ARNm pour la levure et les dérivés selon l'invention est supérieure à 3 sur l'axe des ordonnées, valeur qui correspond déjà à un excellent signal d'expression tardive.
EXEMPLE 8 : Etude ex vivo du rôle régulateur des levures et des dérivés de levure sur l'expression des gènes codant pour IL-10 et TNF-a chez des cellules épithéliales intestinales humaines isolées de biopsies de patients atteints de la maladie de Crohn L'influence des levures et /ou dérivés de levure sur la sécrétion des cytokines IL-10 (anti-inflammatoire) et TNF-a (pro-inflammatoire) a été étudié ex-vivo sur des biopsies de patients atteints de la maladie de Crohn ou non.
30 Des biopsies intestinales ont été prélevées sur des patients atteints de la maladie de Crohn ou non, puis placées 24h dans du milieu HBSS-CMF supplémenté en pénicilline et en streptomycine, à 37°C dans une atmosphère contenant 5 % de CO2. Après lavage, les biopsies ont été mises en contact avec les levures ou les dérivés de levure pendant 4 heures dans du milieu RPMI 1640. Le surnageant a été récupéré pour25 analyse par ELISA. Les biopsies ont été ensuite lysées pour permettre une extraction soit d'ARNm soit de protéines totales.
La confirmation de la sécrétion des cytokines a été réalisée par analyse immunologique des surnageants de cultures de cellules et des protéines extraites par ELISA. Les protéines dénaturées pendant 5 minutes à 95°C dans un tampon de dépôt (vol/vol ; 75 mM Tris pH 6,8 ; 5 % glycérol ; 0,25 % bleu de bromophénol; 2 % SDS, 5% B-mercaptoéthanol ont été déposées (50 .tg) et résolues sur un gel de polyacrylamide à 10 %. Après migration, les protéines ont été transférées sur une membrane de PVDF (Hybond-P, Amersham Pharmacia Biotech, Orsay, France) par électrotransfert semi-sec (Hoefer TE77, Amersham Pharmacia Biotech, Orsay, France) pendant 1 heure à 16 V. PPARa et IL-10 ont été révélés grâce à des antiséra polyclonaux de lapin anti-PPARa humain et anti-IL-10 humains dilués au 1/500e et quantifiés par chimiluminescence (E.C.L Amersham Pharmacia Biotech, Orsay, France) sur un film Biomax-MR (Kodak) à l'aide du logiciel Gel Analyst (CLARA VISION, Paris, France).
Les figures 17 et 18 montrent les résultats obtenus pour respectivement IL-10 et TNF-a L'axe des ordonnées indique les quantités de cytokines mesurées en pg/ml.
Chaque point correspond à la mesure d'une biopsie sur un patient atteint de la maladie de Crohn en phase aigue (rond noir), sur un patient en rémission de maladie de Crohn (rond gris) et sur des patients sains (rond blanc). Une barre indique la moyenne des mesures.
Dans ces figures : - 1 désigne la levure Saccharomyces cerevisiae ScProl selon l'invention sous une forme sèche active, - 3 désigne une levure Saccharomyces cerevisiae, - 8 désigne une fraction de parois de levure Saccharomyces cerevisiae, - 11 désigne une fraction d'ADN de levure Saccharomyces cerevisiae, et - 12 désigne une fraction d'ARN de levure Saccharomyces cerevisiae.
Sur la figure 17, la levure ScProl selon l'invention multiplie par 2 la sécrétion de la cytokine anti-inflammatoire IL-10 par les cellules épithéliales des patients atteints de la maladie de Crohn ou en rémission par rapport aux patients sains et au témoin négatif (-) correspondant aux mesures effectuées en présence d'eau physiologique seule.
La figure 18 montre que la levure ScProl selon l'invention n'entraîne pas d'augmentation de la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire TNF-a par les cellules intestinales isolées de biopsies de patients atteints de la maladie de Crohn ou en rémission. ScProl, ni aucune des autres levures ou dérivés de levure testés n'induisent aucune sécrétion de TNF-a.
EXEMPLE 9 : Etude in vivo des propriétés analgésiques des levures et des dérivés de levure dans un modèle murin de dissension colorectale
L'évaluation de l'aptitude des souches de levures vivantes selon l'invention ou leurs dérivés, isolément ou en association, à moduler la perception de la douleur viscérale chez des rats sains a été entreprise avec le modèle de la distension colorectale (Rousseau, C. et al,. Nat. Med., 2007, 13(1): p. 35-37). Les douleurs abdominales sont un symptôme majeur du syndrome du colon irritable (IBS) qui affecte 20 % de la population. Des données expérimentales et cliniques suggèrent que des modifications de la flore intestinale pourraient être à l'origine de la variabilité des symptômes observés lors des troubles digestifs fonctionnels.
Modèle expérimental de la dissension colorectale Des rats males Sprague Dawley (Charles River, l'Arbresle, France) pesant 175- 200 g ont été utilisés au cours de ces essais. Les rats ont été acclimatés aux conditions du laboratoire une semaine avant l'expérimentation et maintenus à raison de cinq animaux par cage, avec eau et nourriture ad libitum. Tous les essais ont été menés selon les recommandations du Committee for Research and Ethical Issues de l'International Association for the Study of Pain (Zimmermann, M., Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animais. Pain, 1983, 16(2): p. 109-110). De grandes précautions ont été prises en qui concerne les conditions de vie afin d'éviter ou de minimiser l'inconfort des animaux.
La nociception des animaux a été estimée en mesurant la pression intracolonique nécessaire pour induire une réponse comportementale. Cette pression est générée par distension colorectale au moyen du gonflement d'un ballon introduit dans le colon. La réponse comportementale est caractérisée par une élévation de la partie arrière du corps de l'animal et une contraction abdominale clairement visible correspondant à de sévères contractions. Les rats ont été anesthésiés avec un anesthésiant volatile (2 % isoflurane) et le ballon (préparé selon la procédure décrite par Bourdu et al, 2005) a été inséré par voie intrarectale de manière la moins invasive possible, à 7 cm de l'anus. Le cathéter a été attaché à la base de la queue par ruban adhésif. Après 5 minutes, les rats ont été placés au milieu d'une boite en Plexiglas et le cathéter a été connecté à un barostat électronique (Distender Series IIRTM, G & J Electronics). Une pression croissante a été appliquée continuellement jusqu'au déclenchement du réflexe de douleur ou que la pression limite de 80 mm de mercure a été atteinte.
Chaque série expérimentale comporte 10 animaux. Les animaux traités ont reçu en gavage gastrique, une fois par jour pendant 15 jours, 100 gg de levures probiotiques selon l'invention. Les animaux témoins ont reçu de la carboxymethylcellulose (CMC Sigma) selon le même protocole. Les levures ont été suspendues dans une solution à 0,5 % de CMC. L'hypersensibilité colonique a été mesurée 14 jours après le début du traitement par voie orale.
La figure 16 indique les pressions mesurées en mm de mercure, obtenues en fonction de l'administration orale quotidienne pendant 15 jours de 100 g de levure ScProl (CNCM I-3856), 100 g de levure SBC1 (CNCM I-3799) ou de 100 g de chacune des deux levures en prise simultanée. Le contrôle correspond aux rats n'ayant reçu qu'une solution de CMC.
Sur cette figure 16, on voit que les levures ScProl et SCB1, selon l'invention, montrent un effet anti-douleur avec des seuils de perception de la douleur augmentés de respectivement 34 % et 41 % par rapport au témoin de contrôle. Une augmentation du seuil de perception de la douleur de 53 % a été observée avec la combinaison des deux levures ScProl et SBC1. ti
Claims (22)
1. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend de la levure vivante Saccharomyces cerevisiae choisie parmi celle obtenue à partir de la souche Saccharomyces cerevisiae déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3856, et/ou celle obtenue à partir de la souche Saccharomyces cerevisiae var. boulardii déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3799, et/ou au moins un dérivé de levure Saccharomyces cerevisiae choisi parmi les extraits de levure, les dérivés de parois, les glucanes pariétaux, les mannoprotéines pariétales, les fractions lipidiques de levure, les fractions d'acides nucléiques de levure (ARN, ADN), et leurs mélanges.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la levure vivante est sous forme sèche ou fraîche.
3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que la levure vivante est sous forme sèche instantanée ou sèche active.
4. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la levure et/ou dérivé de levure est présente sous une forme revivifiable à une dose journalière comprise entre 10' et 1010 UFC, et de préférence entre 108 et 109 UFC.
5. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la levure et/ou dérivé de levure est présente sans une forme revivifiable à une dose journalière comprise entrel mg et 10 g, et de préférence entre 1 mg et 1g.
6. Utilisation de la composition selon l'une des revendications précédentes, pour la préparation d'un probiotique et/ou d'un alicament et/ou d'un nutraceutique et/ou d'ingrédients fonctionnels et /ou d'un cosméceutique et/ou d'un principe actif pharmaceutique, destiné à l'homme et /ou l'animal.
7. Levure vivante Saccharomyces cerevisiae obtenue à partir de la souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3856.
8. Levure vivante Saccharomyces var. boulardii obtenue à partir de la souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3799.
9. Levure vivante Saccharomyces cerevisiae obtenue à partir de la souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3856 pour son utilisation en tant que médicament.
10. Levure vivante Saccharomyces cerevisiae var. boulardii obtenue à partir de la souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3799 pour son utilisation en tant que médicament.
11. Levure vivante selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisée en ce qu'elle est sous forme sèche ou fraîche.
12. Levure vivante selon, la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est sous forme sèche instantanée ou sèche active.
13. Utilisation non thérapeutique de la levure vivante Saccharomyces cerevisiae choisie parmi celle obtenue à partir de souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3856 et/ou celle obtenue à partir de la souche Saccharomyces cerevisiae var. boulardii déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3799, et/ou d'au moins un dérivé de levure choisi parmi les extraits de levure, les dérivés de parois, les glucanes pariétaux, les mannoprotéines pariétales, les fractions lipidiques de levure, les fractions d'acides nucléiques de levure (ARN, ADN), et leurs mélanges, pour la préparation de compositions alimentaires destinées à améliorer le confort gastro-intestinal et/ou améliorer le bien être gastro-intestinal.
14. Utilisation de la levure vivante Saccharomyces cerevisiae choisie parmi celle obtenue à partir de souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I- 3856 et/ou celle obtenue à partir de la souche Saccharomyces cerevisiae var. boulardii déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3799, et/ou d'au moins un dérivé de levure choisi parmi les extraits de levure, les dérivés de parois, les glucanes pariétaux, les mannoprotéines pariétales, les fractions lipidiques de levure, les fractions d'acides nucléiques de levure (ARN, ADN), et leurs mélanges ou d'une composition en comprenant pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des désordres intestinaux, des troubles fonctionnels intestinaux ou des maladies gastro-intestinales.
15. Utilisation selon la revendication 14, dans laquelle les désordres ou maladies gastro-intestinales sont des maladies ou troubles inflammatoires de l'intestin, en particulier des colites et des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, et des pathologies ou troubles des intestins caractérisés par les désordres ou maladies gastro-intestinales dues à la colonisation des intestins par des microorganismes pathogènes et/ou à caractère invasif eucaryotes ou procaryotes.
16. Utilisation selon l'une des revendications 14 ou 15, dans laquelle les désordres ou maladies gastro-intestinales sont des maladies inflammatoires chroniques intestinales telles que la colite ulcéreuse, la maladie céliaque ou la maladie de Crohn.
17. Utilisation selon l'une des revendications 14 ou 15, dans laquelle les désordres ou maladies gastro-intestinales sont des pathologies ou troubles gastro-intestinales dues à la colonisation des intestins par des microorganismes pathogènes et/ou à caractère invasif eucaryotes ou procaryotes.
18. Utilisation de la levure vivante Saccharomyces cerevisiae choisie parmi celle obtenue à partir de souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I- 3856 et/ou celle obtenue à partir de la souche Saccharomyces cerevisiae var. boulardii déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n° CNCM I-3799 et/ou d'au moins un dérivé de levure choisi parmi les extraits de levure, les dérivés de parois, les glucanes pariétaux, les mannoprotéines pariétales, les fractions lipidiques de levure, les fractions d'acides nucléiques de levure (ARN, ADN), et leurs mélanges, ou d'une composition pharmaceutique en comprenant pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des pathologies ou troubles de l'intestin signalés par un état d'hyperalgésie.
19. Utilisation selon l'une des revendications 13 à 18, dans laquelle la levure vivante est sous forme sèche ou fraîche
20. Utilisation selon la revendication 19 dans laquelle la levure vivante et/ou dérivé de levure est sous forme sèche instantanée ou sèche active.
21. Utilisation selon l'une des revendications 13 à 18 de la levure et/ou dérivé de levure dans une forme revivifiable à un dose journalière comprise entre 10' et 1010 UFC, et de préférence entre 108 et 109 UFC.
22. Utilisation selon l'une des revendications 13 à 18 de la levure dans une forme revivifiable à un dose journalière comprise entre entrel mg et 10 g, et de préférence entre 1 mg et 1 g.
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