WO2022173328A1 - Пептидный толерогенный компаунд - Google Patents
Пептидный толерогенный компаунд Download PDFInfo
- Publication number
- WO2022173328A1 WO2022173328A1 PCT/RU2022/000036 RU2022000036W WO2022173328A1 WO 2022173328 A1 WO2022173328 A1 WO 2022173328A1 RU 2022000036 W RU2022000036 W RU 2022000036W WO 2022173328 A1 WO2022173328 A1 WO 2022173328A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- inflammatory
- peptides
- drug
- amount
- cells
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 103
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 72
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 51
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims abstract description 41
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 claims abstract description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 34
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 claims abstract description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 25
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 24
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 claims abstract description 23
- 239000006210 lotion Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 17
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 14
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 claims abstract description 12
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 51
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 49
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 48
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 30
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 29
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 18
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 16
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 15
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 claims description 14
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 claims description 14
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims description 14
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 13
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 10
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 9
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 8
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 6
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 claims description 6
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims description 6
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 claims description 5
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 claims description 5
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 4
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000002086 displacement chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 claims description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 3
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000007234 antiinflammatory process Effects 0.000 claims description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 claims description 2
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 27
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 23
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 abstract description 9
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 abstract description 2
- 235000011132 calcium sulphate Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000001175 calcium sulphate Substances 0.000 abstract 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 21
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 21
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 17
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 11
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 10
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 10
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 9
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 7
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 7
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 7
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 6
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 5
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 4
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 4
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 4
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 4
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N doxycycline monohydrate Chemical compound O.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H](N(C)C)[C@@H]1[C@H]2O XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 4
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- -1 peptides Chemical class 0.000 description 4
- 230000001185 psoriatic effect Effects 0.000 description 4
- 230000037384 skin absorption Effects 0.000 description 4
- 231100000274 skin absorption Toxicity 0.000 description 4
- 230000037317 transdermal delivery Effects 0.000 description 4
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 4
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 4
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 4
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 3
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 3
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 3
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 3
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 3
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 102100040061 Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 2
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 210000001624 hip Anatomy 0.000 description 2
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 208000018879 impaired coordination Diseases 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 2
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008718 systemic inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 238000013271 transdermal drug delivery Methods 0.000 description 2
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 2
- 230000002034 xenobiotic effect Effects 0.000 description 2
- SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N (-)-Nicotine Chemical compound CN1CCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 229930000680 A04AD01 - Scopolamine Natural products 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053555 Arthritis bacterial Diseases 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 241000498849 Chlamydiales Species 0.000 description 1
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000000655 Distemper Diseases 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003155 Eudragit® RL 100 Polymers 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 description 1
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 208000012895 Gastric disease Diseases 0.000 description 1
- 108010092726 Gelatinol Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010019708 Hepatic steatosis Diseases 0.000 description 1
- 206010020112 Hirsutism Diseases 0.000 description 1
- 101000635938 Homo sapiens Transforming growth factor beta-1 proprotein Proteins 0.000 description 1
- STECJAGHUSJQJN-GAUPFVANSA-N Hyoscine Natural products C1([C@H](CO)C(=O)OC2C[C@@H]3N([C@H](C2)[C@@H]2[C@H]3O2)C)=CC=CC=C1 STECJAGHUSJQJN-GAUPFVANSA-N 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- STECJAGHUSJQJN-UHFFFAOYSA-N N-Methyl-scopolamin Natural products C1C(C2C3O2)N(C)C3CC1OC(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 STECJAGHUSJQJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 208000028017 Psychotic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 206010042674 Swelling Diseases 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010044279 T-activin Proteins 0.000 description 1
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 102100030742 Transforming growth factor beta-1 proprotein Human genes 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 1
- 210000004404 adrenal cortex Anatomy 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940124346 antiarthritic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940124347 antiarthritic drug Drugs 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003435 antirheumatic agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 208000037979 autoimmune inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 208000014058 canine distemper Diseases 0.000 description 1
- 230000001451 cardiotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- PUXBGTOOZJQSKH-UHFFFAOYSA-N carprofen Chemical compound C1=C(Cl)C=C2C3=CC=C(C(C(O)=O)C)C=C3NC2=C1 PUXBGTOOZJQSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 102000009854 cortexin Human genes 0.000 description 1
- 108010034906 cortexin Proteins 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000008343 cutaneous dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- ZJJXGWJIGJFDTL-UHFFFAOYSA-N glipizide Chemical compound C1=NC(C)=CN=C1C(=O)NCCC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(=O)NC2CCCCC2)C=C1 ZJJXGWJIGJFDTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001381 glipizide Drugs 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001680 ibuprofen Drugs 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000403 immunocorrecting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Substances N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940012215 ketofen Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000001690 micro-dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 208000013465 muscle pain Diseases 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007908 nanoemulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 229960002715 nicotine Drugs 0.000 description 1
- SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N nicotine Natural products CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000554 physical therapy Methods 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 108010054819 polyerga neu Proteins 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 238000011886 postmortem examination Methods 0.000 description 1
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 238000001055 reflectance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229940099315 rimadyl Drugs 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 229960002646 scopolamine Drugs 0.000 description 1
- STECJAGHUSJQJN-FWXGHANASA-N scopolamine Chemical compound C1([C@@H](CO)C(=O)O[C@H]2C[C@@H]3N([C@H](C2)[C@@H]2[C@H]3O2)C)=CC=CC=C1 STECJAGHUSJQJN-FWXGHANASA-N 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000036301 sexual development Effects 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 208000018556 stomach disease Diseases 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/26—Lymph; Lymph nodes; Thymus; Spleen; Splenocytes; Thymocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
Definitions
- the proposed invention relates to biotechnology, namely, to the production of an anti-inflammatory agent based on a biologically active peptide fraction from the spleen of mammals.
- the drug in the form of a water-alcohol lotion can be used in medicine and veterinary medicine as an anti-inflammatory agent to prevent the development of inflammation in autoimmune and inflammatory diseases.
- TNF-alpha tumor necrosis factor
- Non-hormonal anti-inflammatory drugs - NSAIDs such as aspirin, ibuprofen, paracetamol and others have moderate side effects, mainly affect the gastrointestinal tract (NSAID-gastropathy), but are of little effectiveness. When applied externally, they can cause irritation of the skin in the form of redness, swelling, rashes or itching; with prolonged use - systemic adverse reactions.
- Cytostatics such as methotrexate and others, also have a strong specific effect and severe irreversible side effects with long-term use.
- Monoclonal antibodies to anti-inflammatory cytokines and/or their receptors have a strong specific effect, but are extremely expensive and eventually lose their effectiveness due to the appearance of secondary antibodies in the patient's body.
- transdermal drug delivery theoretically allows the drug to be administered in an accessible non-invasive way. Due to its ease of use and self-administration, transdermal delivery should be characterized by a rate-controlled release of the drug, unique for such a desirable method.
- Substances that can be delivered transdermally namely nicotine, corticosteroids, scopolamine and others, are small and hydrophobic molecules. Bypassing natural barriers in order to allow drug penetration is a wished step towards successful transdermal delivery. Therefore, attempts to advance in this direction continue constantly, namely, transdermal delivery technologies are being developed: using nanoemulsion, using transferosomes, using nanoparticles, using the glipizide matrix of ethylcellulose/polyvinylpyrrolidone and Eudragit RL-100/Eudragita RS-100, using iontophoresis , using electroporation.
- the proposed invention solves the technical problem of the lack of an effective peptide anti-inflammatory agent in the form of a transdermal preparation, which can be obtained in a simple way suitable for mass production.
- the technical task is to develop a composition of a therapeutically effective peptide anti-inflammatory agent with minimization of side effects, suitable for community use, as well as a method for its preparation.
- the active substance or molecular compound must be of natural origin. This is the cheapest and unlimited source of raw materials, which is important for mass production.
- synthetic compounds such as peptides, do not take into account the necessary natural requirements, such as glycosylation, phosphorylation, branching, formation of ring forms, synergistic action in the complex (compound). The latter statement is justified by the fact that synthetic substances have not yet been created that stably cure autoimmune and inflammatory diseases.
- the dosage form must be non-invasive for the possibility of out-of-hospital individual use.
- the oral form was excluded due to the inevitable degradation of biomolecules in the gastrointestinal tract. Taking into account the need for preclinical studies, the candidate dosage form was reduced exclusively to transdermal (cutaneous), because. the rectal and sublingual forms are difficult to test in animals.
- TNF-alpha - TNFa pro-inflammatory cytokine - tumor necrosis factor
- the drug according to the invention provides not only an anti-inflammatory effect, but also exhibits a tolerogenic effect - it initiates a specific tolerance of T-regulatory cells to the body's own antigens, which determines its effectiveness in the treatment of autoimmune inflammatory diseases;
- GM-CSF + M-CSF cytokines which are used in the classical method of Treg induction and can be present in peptide fractions from the spleen with a molecular weight of more than 12 kDa, namely about 30 kDa for GM-CSF and about 60 kDa for M-CSF, but are absent in the proposed preparation based on the fraction of peptides from the spleen with a molecular weight of not more than 12 kDa;
- composition of the proposed drug also includes 96% ethanol in the amount of 40% by weight and water - the rest, at pH 7.4 ⁇ 0.2.
- the inflammatory response may be associated with psoriatic arthritis, including that caused by artificial constitutive synthesis of tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha), or activation of pro-inflammatory cytokines, including that caused by bacterial endotoxin (LPS), or rheumatoid arthritis, in including spontaneous rheumatoid arthritis, or a systemic inflammatory response.
- TNF-alpha tumor necrosis factor alpha
- LPS bacterial endotoxin
- rheumatoid arthritis in including spontaneous rheumatoid arthritis, or a systemic inflammatory response.
- Fig.2A The development of psoriatic arthritis in genetically modified ihTNFtg mice with the tumor necrosis factor gene - TNFa (TNFa), the synthesis of which in the mouse body is induced by doxycycline (Dox) when administered orally, where
- mice are administered daily:
- PASI Psoriasis Area and Severity Index - psoriasis severity index.
- SFP Swelling (Fore Paws) - front paw edema index.
- PTK peptides do not directly activate CD4+ T cells.
- Figure 2C shows the result for the most adequate porcine spleen peptide variant, which was further taken as the basis for the development of a technology for the production of an anti-inflammatory drug (see Example 3). Similar data were obtained using bovine spleen.
- the proposed method allows you to clearly limit the molecular weight of the target peptides from above at a level of 10 to 12 kDa, but not higher than 12 kDa, without the use of toxic explosive acetone and expensive low-performance ultrafiltration methods and chromatography, which are used in prior technologies.
- Zinc in this case plays a dual role - as a differential precipitant and a necessary cofactor for regulatory peptides.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Противовоспалительный препарат на основе пептидов селезенки млекопитающих представлен в форме накожного водно-спиртового лосьона системного противовоспалительного действия, содержащего фракцию очищенных пептидов селезенки млекопитающих с молекулярной массой не более 12 кДа в количестве 1-5 мас. % к общей массе композиции, 96% этанол в количестве 40 мас. %, хлористый натрий в количестве до 0,5 мас. %, хлористый цинк в количестве до 0,05 мас. %, сульфат кальция в количестве до 0,2 мас. %, вода - остальное, при pH 7,4+0,2. Техническим результатом является достижение системного толерогенного противовоспалительного терапевтического действия без проявления нежелательных побочных эффектов: аллергических реакций и подавления адаптивного иммунитета.
Description
ПЕПТИДНЫЙ ТОЛЕРОГЕННЫЙ КОМПАУНД
Предложенное изобретение относится к биотехнологии, а именно, к получению противовоспалительного средства на основе биологически активной пептидной фракции из селезенки млекопитающих. Препарат в форме водно-спиртового лосьона может быть использован в медицине и ветеринарии в качестве противовоспалительного средства для предупреждения развития воспаления при аутоиммунных и воспалительных заболеваниях.
Разработан способ получения уникального состава противовоспалительного препарата, обладающего следующими характеристиками:
Лекарственная форма: водно-спиртовой раствор очищенных пептидов селезенки млекопитающих в диапазоне молекулярных масс до 12 кДа с концентрацией не менее 1% (лосьон) для накожного применения. Лечебный лосьон получают по оригинальной технологии, допускающей неограниченное масштабирование за счет исключения критических процессно-аппаратных приемов, а именно - ацетона, хроматографии, диализа, лиофилизации и ультрафильтрации. Эффективность поглощения пептидов интактной кожи человека около 60% в присутствии 40%-го этанола впервые продемонстрирована in vivo с помощью хроматографического анализа остаточного материала на коже.
Физиологическое действие: очищенные пептиды не более 12 кДа из селезенки млекопитающих в присутствии этанола проникают сквозь кератиновый слой кожи 10-15 мкм, достигают следующего базального слоя с расположенными в нем клетками Лангерганса (первичная биологическая мишень) и направляют дифференцировку клеток Лангерганса по толерогенному способу, которые далее мигрируют в лимфоузлы и инициируют специфическую толерантность Т-регуляторных клеток к собственным антигенам организма, что обеспечивает проявление противовоспалительного эффекта.
Физиологическое действие пептидов селезенки впервые расшифровано с помощью генно-модифицированной модели мышей in vivo с принудительной экспрессией фактора некроза опухолей (ФНО-альфа) и в опытах со смешанными культурами дендритных клеток, Т-лимфоцитов и незрелых (naive) моноцитов in vitro.
При накожной аппликации предложенного препарата пептиды селезенки запускают системный терапевтический процесс с достижением толерогенного противовоспалительного действия, что продемонстрировано in vivo на млекопитающих с ревматоидным артритом (собаки) и псориатическим артритом (мыши).
Предшествующий уровень техники
Известные противовоспалительные средства
Противовоспалительные и иммуносупрессивные средства, такие как глюкокортикостероиды, НГТВП, цитостатики и специфические противовоспалительные моноклональные антитела являются симптоматическими средствами, т.е. они не излечивают заболевание, но только смягчают его проявление.
Длительное применение всех описанных лекарственных средств сопровождается побочными явлениями, которые со временем становятся часто более угрожающими, чем сами заболевания. В последнее время надежду подают противовоспалительные моноклональные антитела, но и они имеют серьезные побочные явления, нарастающие со временем - аллергические реакции, гриппоподобный синдром (повышение температуры, недомогание, боли в мышцах), тошнота, диарея и другие диспептические нарушения, уменьшение количества клеток крови — тромбоцитов, лейкоцитов, эритроцитов, а также кардиотоксическое действие. К тому же высокая стоимость препаратов моноклональных антител делает их практически недоступными для массового использования.
Негормональные противовоспалительные препараты - НПВП, такие как аспирин, ибупрофен, парацетамол и другие обладают умеренными побочными явлениями, в основном поражают ЖКТ (НПВС-гастропатия), но слабой эффективностью. При наружном применении могут вызывать раздражение кожных покровов в виде покраснения, отека, высыпаний или зуда; при длительном применении — системные побочные реакции.
Глюкокортикостероидные препараты - природные гормоны надпочечников или синтетические аналоги противовоспалительных гормонов, такие как кортизол, гидрокортизон, преднизолон, дексаметазон и другие имеют сильное противовоспалительное действие, но подавляют иммунитет и обладают тяжелыми, зачастую необратимыми побочными явлениями при длительном приеме. Системные побочные эффекты при приеме глюкокортикостероидов проявляются со стороны центральной нервной системы (психозы, депрессия, повышенная нервная возбудимость и другие), со стороны сердечно-сосудистой системы (тромбоэмболии, повышение артериального давления, миокардиодистрофия и другие), со стороны репродуктивной системы (гирсутизм, задержка полового развития и другие), со стороны пищеварительной системы (жировая дистрофия печени, панкреатит, кровотечения из ЖКТ, стероидные язвы кишечника и желудка), со стороны эндокринной системы (сахарный диабет, синдром
Кушинга, ожирение, атрофия коры надпочечников вследствие угнетения ее функции) и других систем организма. Также во время терапии глюкокортикостероидными препаратами наблюдаются обострения инфекционно-воспалительных процессов хронической формы.
Цитостатики, например, метотрексат и другие, также обладают сильным специфическим действием и тяжелыми необратимыми побочными явлениями при длительном приеме.
Моноклональные антитела к противовоспалительным цитокинам и/или к их рецепторам, как уже было отмечено выше, обладают сильным специфическим действием, но чрезвычайно дороги и со временем теряют эффективность из-за появления вторичных антител в организме пациента.
Наиболее перспективным источником действующего начала для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний ранее была определена селезенка млекопитающих.
Известен инъекционный препарат "Спленопид", получаемый в виде ультрафильтрата экстракта селезенки свиньи на мембране с отсечкой 50 кДа, с помощью которого удавалось излечивать ряд аутоиммунных и воспалительных заболеваний. (Патент RU 2152219 С1)
Известен также патент RU 2033796 С 1 , где белково-пептидный компаунд селезенки КРС в диапазоне 10-140 кДа использовали для лечения чумы плотоядных.
Однако, оба препарата имеют 4 критических недостатка:
(1) В диапазоне до 50 кДа и, тем более, до 140 кДа присутствуют практически все известные эффекторы (цитокины, хемокины, интерфероны) как провоспалительной, так и противовоспалительной природы. По этой причине такие препараты в принципе не могут быть однозначно охарактеризованы и не могут быть причислены к категории лекарственных средств, несмотря на заявленный положительный физиологический эффект.
(2) Оба препарата являются чрезвычайно грязными по своему составу и, кроме потенциальных эффекторных молекул, содержат более 80% балластных компонентов белковой, полинуклеотидной, полисахаридной и иной природы.
(3) Их инъекционное использование недопустимо не только из-за превалирования балласта, но также по той причине, что биополимеры из ксенобиотических органов и тканей свыше 20-30 кДа обладают иммуногенностью для человека, что чревато выработкой аутоиммунных антител (например, для минимизации появления вторичных
аутоиммунных антител терапевтические моноклональные антитела специально "гуманизируют"). Авторы обоих патентов не испытывали трансдермальную форму, но с описанным составом трансдермальная форма также опасна возникновением аутоиммунного дерматита после многократного применения.
(4) Оба препарата никоим образом не изучены на молекулярно-клеточном уровне, до сих пор не были известны их биологические мишени.
Более того, в патентной и научно-медицинской литературе авторами не обнаружено ни одного примера, где была бы определена первичная биологическая мишень и расшифрован механизм действия селезеночных и других природных низкомолекулярных пептидов с молекулярным весом меньше 10-12 кДа. Это касается всех известных коммерческих пептидных препаратов из природных источников (Кортексин, Polyerga, Спленопид, Сампрост, Тималин, Тактивин, Пиналекс и др.).
Также не обнаружено противовоспалительных средств на основе пептидов селезенки системного противовоспалительного действия в трансдермальной (накожной) лекарственной форме.
Трансдермальная доставка лекарственных веществ
Казалось бы, трансдермальная доставка лекарств теоретически позволяет вводить препарат доступным неинвазивным путем. Благодаря простоте применения и самостоятельному введению, трансдермальная доставка должна характеризоваться контролируемым по скорости высвобождением препарата, уникальным для такого желательного способа.
Однако, несмотря на впечатляющую широту исследований в данной области, рынок терапевтических средств системного действия с использованием пассивного неинвазивного трансдермального переноса до сих пор является минорным.
Вещества, которые могут быть доставлены трансдермально, а именно - никотин, кортикостероиды, скополамин и другие вещества представляют собой небольшие и гидрофобные молекулы. Обход естественных препятствий для того, чтобы обеспечить проникновение лекарства, является заветным шагом к успешной трансдермальной доставке. Поэтому попытки продвинуться в этом направлении продолжаются постоянно, а именно, разрабатываются технологии трансдермальной доставки: с использованием наноэмульсии, с использованием трансферосом, с использованием наночастиц, с использованием глипизидного матрикса этилцеллюлозы/поливинилпирролидона и Эудрагита RL-100/Эудрагита RS-100, с использованием ионофореза, с использованием электропорации .
Существует способ, где в составе накожных средств указан этанол в концентрации от 0.01 до 60%, но в данном способе рассматриваются только низкомолекулярные вещества до 0.5-0.6 кДа и нет упоминания о пептидах. (US Patent Application 20100040702, 2010).
В целом, несмотря на многочисленные попытки, до настоящего времени в реальной практике не существует способов пассивной глубокой доставки пептидов до слоя васкуляризации.
Единственным эффективным методом чрезкожного введения белковых гормонов и пептидов обладает техника с использованием пластырей с растворимыми микроиглами. Технология нацелена на внебольничное применение, но она выходит за рамки темы неинвазивного пассивного трансдермального введения и является высокотехнологичным развитием инъекционных методов.
Биодоступность и биологическая мишень
Представляется не совсем логичным, что изобретатели трансдермальных способов доставки активных белков и пептидов не ставили перед собой задачу выявления первичной биологической мишени, т.е. эффекторной клетки. Вероятной причиной является тот факт, что под понятием "биодоступность", как правило, понимается способность трансдермального лекарственного препарата достигать капилляров системного кровотока, хотя в некоторых случаях это не является необходимым и достаточным требованием.
Анатомически кожа состоит из трех основных слоев. Самой внешней частью и первой линией защиты от проникновения чужеродных веществ является роговой слой. Этот слой, в основном, состоит из мертвых клеток (кератиноцитов), имеет толщину примерно 10-15 мкм и окружен липидным внеклеточным матриксом. Под роговым слоем находится жизнеспособный эпидермис (суммарно базальный и шиповатый слой), толщина которого составляет примерно 50-100 мкм. Вместе взятые эти три слоя называют полным эпидермисом. Под полным эпидермисом находится первый слой васкуляризации, присутствующий в слое, известном как дерма. Это волокнистый слой, толщиной приблизительно 1-2 мм, состоящий из капиллярных слоев, которые являются местом введения препарата в циркуляцию, если препарат способен их достичь. Однако, многократно экспериментально доказано, что кожа не пропускает глубже базального слоя молекулы, превышающие 500 Да, особенно это касается молекул гидрофильной природы.
Авторы предложенного изобретения поставили задачу выяснить - существуют ли в верхних слоях кожи эффекторные клетки, на которые можно воздействовать в
терапевтическом смысле. В коже непосредственно под кератиновым слоем, т.е. в базальном и шиповатом слоях, находятся дендритные клетки (клетки Лангерганса). Важнейшим моментом является то, что клетки Лангерганса не существуют как постоянный эпидермальный класс дендритных клеток. Они мигрируют в эпидермис и обратно в лимфатические узлы, куда транспортируют «захваченные» чужеродные агенты, например, антигены, и представляют их лимфоцитам.
Именно клетки Лангерганса принимают участие в индукции иммунной толерантности к собственным антигенам кожи, которые высвобождаются при травмах и воспалительных процессах, связывая в единую функциональную систему два органа - кожу и лимфоузлы.
На основании анализа указанных данных авторы настоящего изобретения сделали вывод о том, что, если под термином "био доступность" понимать способность лекарственного вещества достигать биологической мишени, т.е. эффекторной клетки, то среди всех пептидных кандидатов на роль трансдермального противовоспалительного средства с пассивным переносом логично заранее выбирать те, которые напрямую взаимодействуют с клетками Лангерганса.
Методы оценки поглощения пептидов интактной кожей in vivo
Известные методы оценки эффективности трансдермальной доставки in vitro (более корректно - оценки эффективности кожной абсорбции) позволяют контролировать экспериментальные переменные с помощью простейших протоколов. Предполагается, что оценки in vitro являются важными инструментами для разработки и скрининга рецептур, предсказывающих кожную абсорбцию in vivo. Однако, распространение результатов данного подхода, в т.ч. с использованием модификаций ячейки Франца, на эффективность переноса пептидов через нетравмированную кожу in vivo является спорным.
Для лучшей количественной оценки проникновения веществ внутрь кожи in vivo используют методы, практически недоступные для рутинного анализа, а именно: ослабленная инфракрасная спектроскопия полного отражения с Фурье-преобразованием и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) как модификация флуоресцентной микроскопии.
Обзор методов оценки поглощения лекарств кожей in vivo показывает, что это самая методически сложная проблема. При этом используются неоправданно экзотические, в т.ч. микротравмирующие процедуры типа кожного микродиализа,
зачищающей липкой ленты, термического воздействия и др. В итоге возникла необходимость разработки собственного оригинального корректного способа оценки.
Получение пептидных препаратов из природных источников
Известны способы получения пептидных лекарственных препаратов, косметических средств и биологически активных добавок из органов и тканей млекопитающих, например: Патент SU 1077089, Патент SU 1112606, Патент SU 1218521, Патент SU 1522485, Патент SU 944191, Патент RU 2104702, Патент CN 1557465А.
Общими признаками известных способов получения пептидных препаратов является использование значительного объема ацетона и/или ультрафильтрации и/или хроматографии и/или лиофилизации, что неприемлемо для массового производства в необходимом диапазоне терапевтических курсов, миллионы и более доз препарата.
В качестве ближайшего аналога предлагается противовоспалительный препарат «Спленопид» (Патент RU 2152219). Препарат предназначен для в/м введения и представляет собой пептидную фракцию из селезенки КРС или свиней с молекулярной массой 0,4-50 кДа в форме лиофилизата с желатинолем и гентамицином, терапевтический эффект которого показан на грызунах и человеке. «Спленопид» обладает выраженным иммунокоррегирующим действием при различных патологиях, связанных с нарушением функций иммунной системы, стимулирует метаболическую и функциональную активность лейкоцитов периферической крови, способствует выведению аутоиммунных комплексов из организма при системной красной волчанке, что связано с повышением активности фагоцитирующих клеток и снижением воспалительной реакции.
Как уже было отмечено выше, «Спленопид» обладает рядом недостатков, из которых выделяются по меньшей мере два наиболее существенных:
- из-за наличия в составе препарата неопределенной смеси биополимеров в диапазоне до 50 кДа, включающей эффекторы как провоспалительной, так и противовоспалительной природы, такой препарат в принципе не может быть однозначно охарактеризован, что не позволяет причислить его к категории лекарственных средств;
- из-за наличия в составе препарата, помимо потенциальных эффекторных молекул, более 80% балластных компонентов белковой, полинуклеотидной, полисахаридной и иной природы из ксенобиотических органов и тканей свыше 20 кДа, многократное инъекционное использование недопустимо, поскольку чревато выработкой аутоиммунных антител.
Предложенное изобретение решает техническую проблему отсутствия эффективного пептидного противовоспалительного средства в форме трансдермального препарата, который может быть получен простым способом, пригодным для массового производства.
Техническая задача состоит в разработке состава терапевтически эффективного пептидного противовоспалительного средства с минимизацией побочных эффектов, пригодного для внебольничного применения, а также способа его получения.
Раскрытие сущности изобретения
Авторы предложенного изобретения поставили задачу найти биологически активное вещество или молекулярный компаунд, пригодный к стабильному излечению аутоиммунных и воспалительных состояний без побочных явлений, свойственных глюкокортикостероидам, НПВП, цитостатикам и специфическим противовоспалительным моноклональным антителам.
При этом заранее руководствовались следующими 4-мя ограничениями:
1. Активное вещество или молекулярный компаунд должны быть природного происхождения. Это наиболее дешевый и неограниченный источник сырья, что важно для массового производства. Кроме того, синтетические соединения, например пептиды, не учитывают необходимые природные требования, такие как гликозилирование, фосфорилирование, ветвление, образование кольцевых форм, синергидное действие в комплексе (компаунде). Последнее утверждение оправдано тем фактом, что до сих пор не созданы синтетические вещества, стабильно излечивающие аутоиммунные и воспалительные заболевания.
2. В случае пептидов, их молекулярная масса не должна превышать 20 кДа во избежание аутоиммунизации.
3. Лекарственная форма должна быть неинвазивной для возможности внебольничного индивидуального применения. Пероральная форма была исключена из-за неизбежной деградации биомолекул в ЖКТ. Учитывая необходимость доклинических исследований, кандидатную лекарственную форму свели исключительно к трансдермальной (накожной), т.к. ректальную и сублингвальную формы весьма проблематично испытывать на животных.
4. Способ получения вещества или молекулярного компаунда должен быть стандартизуемым, экономным, экологически приемлемым и неограниченно масштабируемым ввиду чрезвычайно широкой потребности в желаемом препарате.
В процессе реализации данных задач получен продукт с заданными целевыми свойствами, а также разработана эффективная технология способа его получения и применения.
Технический результат предложенного изобретения состоит в:
- достижении противовоспалительного терапевтического эффекта на фоне перманентной принудительной суперэкспрессии наиболее мощного провоспалительного цитокина - фактора некроза опухолей (ФНО-альфа - TNFa), т.е. препарат по изобретению обеспечивает не только противовоспалительный эффект, но и проявляет толерогенное действие - инициирует специфическую толерантность Т-регуляторных клеток к собственным антигенам организма, что обуславливает его эффективность в терапии аутоиммунных воспалительных заболеваний;
- более эффективной стимуляции незрелых (naive) моноцитов к выработке Treg, по сравнению с цитокинами GM-CSF + M-CSF, которые используются в классической методике индуцирования Treg и могут присутствовать в пептидных фракциях из селезенки с молекулярной массой более 12 кДа, а именно около 30 кДа для GM-CSF и около 60 кДа для M-CSF, но отсутствуют в предложенном препарате на основе фракции пептидов из селезенки с молекулярной массой не более 12 кДа;
- достижении системного противовоспалительного терапевтического действия при использовании препарата в форме водно-спиртового лосьона при нанесении его на кожу, что вызывает снижение концентрации провоспалительных цитокинов TNFa, IL-lb и IL-2 в крови;
- предупреждении развития псориатического и ревматоидного артрита с эффективностью около 70% за счет системного толерогенного противовоспалительного терапевтического действия; возможности достижения толерогенного противовоспалительного терапевтического эффекта в пригодной для возможности внебольничного индивидуального применения форме;
- возможности достижения системного толерогенного противовоспалительного терапевтического действия без проявления нежелательных побочных эффектов - аллергических реакций и подавления адаптивного иммунитета.
Указанный технический результат достигается за счет разработки авторами настоящего изобретения уникального состава и лечебной формы противовоспалительного препарата.
Предложен противовоспалительный препарат на основе пептидов селезенки млекопитающих, представленный в форме композиции накожного водно-спиртового лосьона системного противовоспалительного действия, содержащий фракцию очищенных пептидов селезенки млекопитающих с молекулярной массой не более 12 кДа. При этом рабочий диапазон представлен фракцией пептидов с молекулярной массой в диапазоне от приблизительно 0,4 кДа до 12 кДа.
Фракция очищенных пептидов селезенки млекопитающих с молекулярной массой не более 12 кДа представлена в препарате с концентрацией не менее 1 %, что обеспечивает эффективное количество активного начала, а именно, 1 5 мае % к общей массе композиции.
В состав предложенного препарата также входит 96% этанол в количестве 40 мае % и вода - остальное, при pH 7.4±0.2.
Кроме этого, в составе предложенного препарата могут присутствовать хлористый натрий в количестве 0 - 0,5 мае %, хлористый цинк в количестве 0 - 0,05 мае % и сульфат кальция в количестве 0 - 0,2 мае %.
В наиболее предпочтительном воплощении предложен противовоспалительный препарат на основе пептидов селезенки млекопитающих, представленный в форме композиции накожного водно-спиртового лосьона системного противовоспалительного действия, содержащий фракцию очищенных пептидов селезенки млекопитающих с молекулярной массой не более 12 кДа в количестве 1 5 мае % к общей массе композиции, 96% этанол в количестве 40 мае %, хлористый натрий в количестве до 0,5 мае %, хлористый цинк в количестве до 0,05 мае %, сульфат кальция в количестве до 0,2 мае %, вода - остальное, при pH 7.4±0.2.
Предложенный препарат нормализует баланс воспалительных и противовоспалительных реакций, который определяют по нормализации in vivo уровня цитокинов ФНО-альфа, IL-1-бета и IL-2, в том числе, при воспалительной ЛПС- провокации.
Кроме этого, предложенный препарат предупреждает развитие аутоиммунных или воспалительных заболеваний, включая псориатический и ревматоидный артрит, что позволяет его использовать в профилактике, терапии или для уменьшения тяжести симптомов указанных заболеваний как у человека, так и у животных.
Соответственно, предложенный водно-спиртовой лосьон может быть представлен в виде препарата, композиции или средства для фармацевтического или ветеринарного применения.
Указанный технический результат достигается за счет разработки авторами настоящего изобретения эффективной технологии получения противовоспалительного препарата.
Предложенный способ получения противовоспалительного препарата предусматривает последовательное проведение следующих этапов: смешивания измельченной до состояния фарша селезенки млекопитающего с 0,1% раствором хлористого цинка в соотношении 2 массовых частей раствора на 1 массовую часть фарша, фиксации крупномолекулярной фракции путем закисления полученного гомогената при интенсивном перемешивании до значения pH 3,0±0,2 с помощью 5 М раствора соляной кислоты, экстракции пептидов доведением pH гомогената до значения pH 8,0±0,2 с помощью 5 М раствора гидроксида натрия, получения осветленного экстракта с помощью замораживания-экссудации или проточного центрифугирования, преципитации крупномолекулярного балласта путем добавления в экстракт 5 М раствора серной кислоты до значения pH 2,5±0,2 с отсечкой балласта при помощи нутч- фильтра и получения кислого фильтрата, преципитации сульфата путем нейтрализации фильтрата 30%-й водной взвесью гидроксида кальция до значения pH 7,4±0,2 с отсечкой преципитата при помощи нутч- фильтра и получения нейтрального фильтрата, преципитации остаточного балласта и частичного обессоливания путем внесения в фильтрат расчетного объема 96%-го этанола до содержания 40 мае % с отсечкой остаточного белково-солевого осадка при помощи нутч-фильтра и получения композиции накожного водно-спиртового лосьона системного противовоспалительного действия, содержащего фракцию очищенных пептидов селезенки млекопитающих с молекулярной массой не более 12 кДа в количестве 1 5 мае % к общей массе композиции, 96% этанол в количестве 40 мае %, хлористый натрий в количестве до 0,5 мае %, хлористый цинк в количестве до 0,05 мае %, сульфат кальция в количестве до 0,2 мае % , вода - остальное, при pH 7.4±0.2.
При этом определение границы отсечки молекулярной массы пептидов осуществляют с помощью вытеснительной хроматографии и с помощью SDS- электрофореза в градиентном полиакриламидном геле.
Для получения препарата используют селезенку млекопитающих, предпочтительно КРС или свиньи.
Указанный технический результат достигается за счет разработки авторами настоящего изобретения эффективной технологии применения противовоспалительного препарата.
Предложенный способ подавления воспалительной реакции включает нанесение на кожу пациента эффективного количества противовоспалительного пептидного препарата.
Эффективное количество предложенного препарата обеспечивается, например, введением в дозе не менее 2 мг/кг веса при ежедневном, еженедельном применении, а также раз в 2 недели и ежемесячно. Курс лечения составляет от одного до нескольких месяцев, предпочтительно три, шесть или девять месяцев. Наиболее предпочтительным является доза 2 мг/кг веса при ежедневном применении.
При этом пептиды в составе предложенного препарата без проникновения в системный кровоток воздействуют на внутрикожные дендритные клетки, направляя их на толерогенный путь дифференцировки с последующей передачей толерогенного сигнала Т- регуляторным лимфоцитам (Treg).
При этом воспалительная реакция может быть ассоциирована с псориатическим артритом, в том числе, вызванным искусственным конститутивным синтезом фактора некроза опухоли альфа (ФНО-альфа), или активацией провоспалительных цитокинов, в том числе, вызванной бактериальным эндотоксином (ЛПС), или ревматоидным артритом, в том числе, спонтанным ревматоидным артритом, или системной воспалительной реакцией.
Используемый в способе подавления воспалительной реакции противовоспалительный препарат может быть получен вышеописанным способом получения.
Также предложено применение противовоспалительного препарата в терапии воспалительного заболевания, выбранного из хронического воспалительного заболевания, синдрома системного воспалительного ответа (реакции) или аутоиммунного заболевания, а именно, из псориатического артрита или ревматоидного артрита.
Используемый в терапии воспалительного заболевания противовоспалительный препарат может быть получен вышеописанным способом получения.
Краткое описание чертежей:
Фиг.1. Эффективность поглощения пептидов селезенки свиньи интактной человеческой кожей (анализ смывов).
Колонка: HW-50 1x25 см
Подвижная фаза: Моноэтаноламин 2%, лимонная кислота 10 мМ, pH 10.3
Обозначения испытуемых образцов:
0 Исходный образец пептидов < 12 кДа, 20 мкг
1 Остаток пептидов на коже после смыва с помощью физраствора
2 Остаток после смыва с помощью 15%-ого ДМСО
3 Остаток после смыва с помощью 3%-го Tween-80
4 Остаток после смыва с помощью 40%-го этанола
5 Остаток после смыва с помощью 40%-го этанола + 5% ДМСО
(диметилсульфоксид)
Фиг.2А. Развитие псориатического артрита у генно-модифицированных мышей ihTNFtg с геном фактора некроза опухолей - ФНОа (TNFa), синтез которого в организме мыши индуцируется доксициклином (Dox) при пероральном введении, где
PsA - псориатический артрит ctr - контрольная мышь (здоровая)
Dox - результат активации TNFa с помощью Доксициклина
Фиг.2В. Демонстрация аппликации накожной формы испытуемых пептидных образцов.
Фиг.2С. Восстановление физиологических параметров in vivo под действием испытуемых фракций пептидов.
Одновременно с индукцией ФНО-альфа (TNF-a), начиная с нулевого дня, мышам ежедневно вводят:
- · - физраствор (плацебо);
- ш - испытуемые пептиды внутрибрюшинно в виде растворенного в физрастворе ацетонового преципитата в дозировке 2.0 мг/кг веса в день.
- D - испытуемые пептиды накожно в виде лосьона с 40% этанола в дозировке 2.0 мг/кг веса в день, как показано на Фиг.2В;
Каждые 7 дней до 21 дня наблюдают четыре стандартных параметра:
WG - Weight Gain - индекс прибавки веса.
PASI - Psoriasis Area and Severity Index - индекс тяжести поражения псориазом.
SFP - Swelling (Fore Paws) - индекс отека передних лап.
GS - Grip Strength - индекс силы хватания передними лапами.
Фиг. ЗА. Определение границы отсечки молекулярной массы пептидов ПТК (РТС) и суммарной концентрации пептидов образца ПТК с помощью аналитической вытеснительной хроматографии.
Колонка: HW-50 1x25 см
Подвижная фаза: Моноэтаноламин 2%, лимонная кислота 10 мМ, pH 10.3
Обозначения образцов и стандартных белков:
1 - BSA (бычий сывороточный альбумин) 69 кДа (40 мкл, 10 мг/мл)
2 - Цитохром С 12 кДа
3 - Образец серийного ПТК (40 мкл)
4 - Контрольный образец пептидного экстракта после ультрафильтрации на мембране 10 кДа
5 - Инсулин 5.7 кДа
Фиг.ЗВ. Определение границы отсечки молекулярной массы и контроль чистоты препарата ПТК (РТС) с помощью SDS- электрофореза в градиентном полиакриламидном геле 10-18% по методу Laemmli [52]. Показано полное отсутствие белковых компонентов с молекулярной массой свыше 12 кДа.
Фиг.4. Пептиды ПТК (РТС) не активируют CD4+ Т-клетки напрямую.
CD4+ Т-клетки, селективно выделенные из селезенки мышей С57В1/6, стимулируют in vitro в течение 5 дней различными количествами пептидов ПТК (РТС).
После инкубации клетки анализируют методом проточной цитометрии на пролиферативную активность (левая панель) или экспрессию ядерных белков Foxp3 или Tbet, которые характерны для активированных супрессорных Treg или иммуногенных ТЫ -клеток.
Экспрессия Foxp3 и Tbet показана только для клеток, стимулированных 5000 мкг/мл пептидов ПТК (РТС).
Фиг.5 ПТК (РТС)-активированные DCs индуцируют дифференцировку клеток Foxp3+ Treg
(А) Клетки костного мозга мышей С57В1/6 дифференцируют в DCs путем стимуляции с помощью GM-CSF + IL-6 в течение 6 дней. После удаления цитокинов, DCs активируют пептидами ПТК (РТС) или указанными цитокинами в течение дополнительных 24 ч. Затем DCs культивируют совместно с CD4+ клетками мышей
C57B1/6 в течение 5 дней. Т-клетки анализируют на пролиферацию и на часть клеток Foxp3+ и Tbet+.
(В) Репрезентативные изображения, иллюстрирующие стратегию стробирования, включая элементы FMO-контроля (flourescence minus one), для количественной оценки параметров, показанных в (А).
Показаны средние значения ± SEM пяти повторных экспериментов. Статистический анализ проводят с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA с последующим множественным сравнением Tukey's для анализа значимости между формами кривых с течением времени. Показаны достоверные различия между кривыми для ПТК (РТС) и GM-CSF+IL-4 (*Р < 0,05 и **Р < 0,01).
Фиг.6. Класс дендритных клеток (DCs) является основной биологической мишенью пептидов ПТК (РТС).
(A) Клетки, полученные из костного мозга, дифференцируют в DCs с помощью GM-CSF + IL-4 (10 нг/мл обоих) в течение 6 дней. После удаления цитокинов, зрелые DCs активируют пептидами ПТК (РТС) или указанными цитокинами в течение дополнительных 24 ч и анализируют методом проточной цитометрии. Показаны средние значения ± SEM пяти повторных экспериментов. Статистический анализ проводят с помощью однофакторного дисперсного анализа ANOVA с последующим множественным Tukey-сравнением. Показаны только значения, относящиеся к DCs, обработанными пептидами ПТК (РТС) (*Р < 0,05, **Р < 0,01 и ***Р < 0,001).
(B) Репрезентативные изображения, иллюстрирующие стратегию стробирования, включая элементы FMO-контроля (flourescence minus one), для количественной оценки параметров, показанных в (А).
Фиг.7. ПТК (РТС)-опосредованная индукция Treg зависит от взаимодействия DCs с рецепторами PD-1 и CTLA4 CD4+ Т-клеток
(А) Клетки костного мозга мышей С57В1/6 стимулируют с помощью GM-CSF + IL- 4 (по 10 нг/мл каждого) в течение 6 дней для получения зрелых DCs. После удаления цитокинов DCs активируют с помощью ПТК (РТС) еще в течение 48 ч. Сенсибилизированные DCs дважды промывают безцитокиновой средой и инкубируют с сингенными С04+-клетками селезенки в соотношении 1:5 и в присутствии специфических моноклональных антител (monAbs) (по 20 мкг/мл) в течение 5 дней. Клетки собирают и анализируют на указанные параметры методом проточной цитометрии.
Средним значениям анализируемых параметров в клетках, инкубированных с контролем IgG, присваивают значение 1. Показаны средние значения ± SEM из четырех повторных экспериментов.
Статистический анализ проводят с помощью однофакторного дисперсного анализа ANOVA с последующим множественным Tukey-сравнением. (*Р < 0,05, **Р < 0,01 и ***Р < 0,001).
(В) Репрезентативные изображения, подчеркивающие стратегию стробирования, включая элементы управления FMO, для количественной оценки параметров, показанных в (А).
Фиг.8. Воздействие ПТК (накожная аппликация) в дозировке 2.0 мг/кг веса в день на концентрацию in vivo провоспалительных цитокинов TNFa (ФНО-альфа), IL-lb, IL-2 после ЛПС-провокации.
Фиг.9. Воздействие ПТК (накожная аппликация) в дозировке 2.0 мг/кг веса в день в тесте на противовоспалительную активность in vivo. В качестве плацебо используют физраствор. Показано постмортальное микроскопическое исследование поперечного среза кожи в районах псориатической деформации. Контроль - здоровая мышь.
Фиг.10. Суставы собаки, подверженные артриту.
Примеры осуществления изобретения
Пример 1 Подбор состава накожной лекарственной формы
Биологическая мишень противовоспалительных пептидов была определена в несколько этапов, которой оказались дендритные клетки, представленные в коже клетками Лангерганса (см. далее Пример 4), что определило достаточность оценки кожной абсорбции (несмываемости образца с поверхности кожи). Для того, чтобы пептиды количественно достигали клеток Лангерганса, необходимо, чтобы они могли преодолеть, по крайней мере, тонкий кератиновый слой 10-15 мкм. Расчет на то, что пептиды, которые впитываются в кожу, способны проникнуть сквозь кератиновый слой и достигнуть клеток Лангерганса, в дальнейшем был подтвержден явным неожиданным физиологическим эффектом (см. далее Примеры 2, 6, 7, 8).
Для демонстрации эффекта готовят концентрированный образец пептидов селезенки свиньи или КРС, полученный микрометодом, который далее используют для определения источников действующего начала (см. далее Пример 2), а именно: гомогенизируют образец селезенки в 2-х объемах 0,1%-го хлористого цинка, доводят pH гомогената с помощью 10%-го раствора аммиака до значения 8.0±0.2, замораживают при
температуре — 20°C, оттаивают на сетке, в полученный экстракт (экссудат) вносят 1,5 объема ацетона (обессоливание и удаление крупномолекулярного балласта выше 12 кДа), фильтруют на бумажном фильтре, в фильтрат вносят 2 объема ацетона, осадок собирают на бумажном фильтре, промывают ацетоном, сушат и растворяют в 0,9%-м растворе хлористого натрии (физраствор), фильтруют через шприцевую насадку 0,2 мкм, разводят до необходимой концентрации.
Исходя из данной постановки задачи, был разработан состав раствора, который наилучшим образом способствует пассивному поглощению макромолекул нетравмированной кожей. Испытывали неионные детергенты, этанол, диметилсульфоксид и их комбинации. Эффективность абсорбции пептидов in vivo измеряли путем хроматографического определения остаточного количества и состава пептидов на интактной человеческой коже после пассивного впитывания образца. Неожиданным образом таким оптимальным растворителем оказался водный раствор, содержащий 40 мае % этанола. Эффективность поглощения кожей пептидов менее 12 кДа составила около 60% без заметной дискриминации по молекулярным массам (Фиг.1).
В эксперименте в качестве исходного контрольного образца используют обессоленный образец пептидов в диапазоне до 12 кДа с концентрацией 40 мг/мл, полученный из суммарного экстракта по вышеописанной методике с дробной ацетоновой очисткой. Для составления испытуемых образцов исходный образец разводят в физрастворе с добавлением компонентов, указанных на диаграмме.
На чистую интактную человеческую кожу in vivo наносят по 10 мкл образцов с суммарным количеством пептидов по 20 мкг. После самопроизвольного впитывания и высыхания образца, остаток пептидов смывают с кожи дважды каждый раз по 30 мкл подвижной фазы (2% моноэтаноламин, 0,01 М цитрат, pH 10.3), отбирают микродозатором и собирают в микропробирку. Смывы анализируют с помощью вытеснительной аналитической хроматографии.
Выбор аналитической хроматографии определен двумя причинами, а именно:
(а) высокая чувствительность и воспроизводимость,
(б) возможность оценки дискриминации абсорбции в зависимости от молекулярной массы пептидов.
Результат: Наиболее эффективным оказался 40%-й этанол (образец N° 4), в т.ч. с добавлением ДМСО до 5% (образец N° 5). При этом дискриминация по молекулярной массе неожиданным образом отсутствовала. Таким образом, лекарственная форма была выбрана как спирт-содержащая композиция, конкретно - водно-спиртовой лосьон.
Пример 2. Определение природного источника лекарственного начала для оптимизации технологии его получения
Первоначальным объектом исследования были выбраны именно пептиды. Для этого были известны косвенные данные. Впоследствии выбор оправдался.
Несмотря на то, что ранее было показано, что противовоспалительными свойствами обладает ультрафильтрат селезенки до 50 кДа, исследование необходимо было провести заново, т.к. в силу опасности развития побочных эффектов, в первую очередь аутоиммунизации, отсечка в 50 кДа совершенно недостаточна, и необходимо было точно определить источник действующего начала, и он был выявлен в безопасном диапазоне до 12 кДа.
В первой серии опытов используют пептиды из плазмы крови и различных органов и тканей свиньи (всего 4 источника), полученные из суммарного экстракта по методике с дробной ацетоновой очисткой, описанной в Примере 1.
Из полученных фракций формировали образцы пептидов в двух вариантах:
(а) накожный вариант с суммарной концентрацией 6 мг/мл в 40%-м этаноле,
(б) инъекционный внутрибрюшинный вариант с концентрацией 1 мг/мл в физиологическом растворе.
Для тестирования фракций, обладающих наилучшим лечебным действием против искусственного псориатического артрита, использовали генно-модифицированных мышей ihTNFtg , несущих дополнительный ген фактора некроза опухоли (ФНО-альфа - TNF-a), главного провоспалительного цитокина. Ген содержит промотор, активируемый доксициклином (Dox), который мыши получают с питьевой водой. При активации промотора TNF-a у мышей развивается тяжелый псориатический артрит (Фиг.2А). Данных мышей используют как специфическую чувствительную модель при выборе фракций, обладающих системным лечебным действием в трансдермальной лечебной форме.
Одновременно с индукцией ФНО-альфа (TNF-a), начиная с нулевого дня, мышам ежедневно вводят:
- · - физраствор (плацебо);
- п - испытуемые пептиды внутрибрюшинно в виде растворенного в физрастворе ацетонового преципитата в дозировке 2.0 мг/кг веса в день (на мышь 30 г инъекция 60 мкл в концентрации пептидов 1 мг/мл);
- D - испытуемые пептиды накожно в виде лосьона с 40% этанола с дозировкой 2.0
мг/кг веса в день, как показано на Фиг.2В (на мышь 30 г кожное нанесение 2x5 мкл в концентрации 6 мг/мл);
Каждые 7 дней до 21 дня наблюдают четыре стандартных параметра:
WG - Weight Gain - индекс прибавки веса.
PASI - Psoriasis Area and Severity Index - индекс тяжести поражения псориазом.
SFP - Swelling Fore Paws - индекс отека передних лап.
GS - Grip Strength - индекс силы хватания передними лапами.
На Фиг.2С показан результат для наиболее адекватного варианта пептидов из селезенки свиньи, который далее был принят за основу при разработке технологии получения противовоспалительного препарата (см. Пример 3). Аналогичные данные были получены при использовании селезенки КРС.
Результаты:
В данной серии опытов были определены наиболее богатые источники (органы и ткани), содержащие лечебное начало. Поскольку лечебной активностью обладали экстракты не единственного органа и ткани млекопитающих (КРС и свинья), был сделан вывод о вездесущности в организме противовоспалительных регуляторных пептидов, но для наилучшей стандартизации последующего промышленного получения пептидного компаунда была выбрана селезенка, наиболее богатая пептидным компаундом с противовоспалительным действием.
При накожном и внутрибрюшинном введении пептиды селезенки одинаково эффективно восстанавливают физиологические параметры, преодолевая псориатический артрит, вызываемый постоянным воздействием суперэкспресии ФНО-альфа (TNF-a). При этом важно отметить, что внутрибрюшинное введение принципиально отличается от внутривенного или внутримышечного, т.к. введенные пептиды не попадают непосредственно в системный кровоток, а воздействуют на клетки стенки кишечника.
Дополнительно выявлено системное общеорганизменное действие пептидов, когда нанесение пептидов на локальную область ушей или внутрибрюшинно заставляет нормализоваться дистальные области организма - суставы и кожу. Показан однозначный терапевтический эффект пептидов селезенки на фоне перманентной принудительной суперэкспрессии наиболее мощного провоспалительного цитокина - фактора некроза опухолей (ФНО-альфа - TNFa), что говорит о том, что пептидный компаунд имеет не только противовоспалительный эффект, но действует на уровне более глубокой
нормализации иммунитета, т.е. имеет толерогенное действие. Это далее было подтверждено в опытах in vitro (см. Фиг.4-7). На этом основании он получил условное наименование "Пептидного Толерогенного Компаунда" - ПТК (Peptide Tolerogenic Compound - PTC).
С помощью тест-модели генетически модифицированных мышей, несущих дополнительный ген фактора некроза опухоли (ФНО-альфа - TNF-a), отработана оптимальная технология получения ПТК (см. Пример 3).
Измельчают сырье (селезенку КРС или свиней) на мясорубке, смешивают с 0,1 %-м раствором хлористого цинка в соотношении 2 массовых частей раствора на 1 массовую часть фарша, полученный гомогенат при интенсивном перемешивании закисляют до значения 3.0±0.2 с помощью 5 М раствора соляной кислоты для фиксации крупномолекулярной фракции, экстрагируют пептиды доведением pH гомогената до значения 8.0±0.2 с помощью 5 М раствора гидроксида натрия, получают осветленный экстракт с помощью замораживания-экссудации или проточного центрифугирования (используются стандартные методики осветления пептидных экстрактов, известные, например, из [1], [2], [50]), добавляют 5 М раствор серной кислоты до значения pH 2.5±0.2 (вторая фиксация крупномолекулярного балласта), получают кислый фильтрат с помощью нутч-фильтра, нейтрализуют фильтрат 30%-й водной взвесью гидроксида кальция до значения pH 7.4±0.2 (осаждение сульфата), получают нейтральный фильтрат с помощью нутч-фильтра, вносят в фильтрат равный объем 96%-го этанола (финишное осаждение крупномолекулярного балласта и обессоливание) с получением расчетного содержания этанола 40,1 мае % (рассчитано с учетом плотности 96%-го этанола 0.806 и уменьшения результирующего объема водно-спиртовой смеси с коэффициентом 0.964 [55]), получают фильтрат с помощью нутч-фильтра (готовый ПТК в форме лосьона).
Определение границы отсечки молекулярной массы пептидов ПТК (РТС) и суммарной концентрации образца пептидов осуществляют с помощью аналитической вытеснительной хроматографии (Фиг.ЗА).
Корректное определение суммарной концентрации пептидов в ПТК осуществляют путем сравнения интеграла кривой "1" (образцовый раствор BSA с концентрацией 10 мг/мл) и интеграла кривой "3" (образец ПТК равного объема с BSA). В представленном случае (Фиг.ЗА) суммарная концентрация пептидов в полученном образце ПТК составляет — 15 мг/мл — 1,5%.
Определение границы отсечки молекулярной массы и контроль чистоты препарата ПТК (РТС) осуществляют с помощью SDS- электрофореза в градиентном полиакриламидном геле 10-18% по методу Laemmli (Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970; 227(5259), 680- 685) (Фиг.ЗВ). Показано полное отсутствие белковых компонентов с молекулярной массой свыше 12 кДа.
Предложенный способ получения препарата низкомолекулярных пептидов имеет следующие преимущества:
- Способ исключает критические аппаратные и процессные ограничения, а именно: ацетоновое осаждение, диализ, хроматографию, лиофилизацию, ультрафильтрацию. Благодаря этому он обеспечивает максимально экономичное и неограниченное промышленное масштабирование.
- С помощью эмпирически подобранного сочетания концентраций кислот, хлористого цинка, гидроксида кальция и этанола предложенный способ позволяет четко ограничивать сверху молекулярную массу целевых пептидов на уровне от 10 до 12 кДа, но не выше 12 кДа, без применения токсичного взрывоопасного ацетона и дорогостоящих низкопроизводительных методов ультрафильтрации и хроматографии, которые используются в предшествующих технологиях. Цинк в данном случае играет двойную роль - как дифференциальный осадитель и необходимый кофактор регуляторных пептидов.
- Благодаря сочетанию серной кислоты и гидроксида кальция в качестве осадителя сульфата, и этанола в качестве вторичного осадителя, содержание солей в конечном продукте не превышает 0,05% хлористого цинка, 0,2% сульфата кальция (максимальная растворимость [53]), 0,5% хлористого натрия при pH 7.4±0.2 без использования процедуры диализа и/или обессоливания на колонках. Это определяет физиологически комфортный состав готового лосьона для накожного применения.
Таблица 1. Состав предложенного водно-спиртового лосьона, полученного предложенным способом
Все последующие эксперименты проводят с использованием стандартных серийных образцов ПТК (РСТ) в качестве унифицированного источника пептидов для соблюдения воспроизводимости результатов.
Для экспериментов in vitro пептиды осаждают из ПТК с помощью двухступенчатой ацетоновой процедуры. Вначале к раствору ПТК добавляют 1 объем ацетона для осаждения остаточных солей и фильтруют. В фильтрат вносят 2 объема ацетона для получения пептидного преципитата, преципитат промывают ацетоном, собирают на бумажном фильтре и высушивают под стерильным ламинарным потоком воздуха. Высушенный преципитат растворяют в физиологическом растворе, приводят штоковый раствор к концентрации 10 мг/мл, стерилизуют с помощью шприцевой фильтровальной насадки с мембраной 0,2 мкм, расфасовывают и замораживают мелкими порциями.
Пример 4. Определение биологической мишени ПТК in vitro
Для определения влияния пептидов ПТК (РСТ) непосредственно на Т-клетки, С04+клетки выделяют из селезенки мышей C57BL/6 с помощью технологии MACS (технология магнитного разделение клеточных популяций на основе поверхностных антигенов) и стимулируют in vitro в течение 5 дней различными количествами пептидов ПТК.
Поскольку дифференцировка и/или активация лимфоцитов обычно связана с интенсивной пролиферацией, С04+клетки предварительно метят флуорохромом CFSE, а степень пролиферации клеток (количественно определяют как долю клеток CFSE10), и количество Foxp3 - или Tbet-позитивных клеток анализируют методом проточной
цитометрии. Foxp3 и Tbet являются основными транскрипционными факторами, которые инициируют и поддерживают развитие линий Treg и ТЫ из незрелых (naive) клеток- предшественников Th, соответственно. Их обычно используют в качестве маркеров противовоспалительных Treg и воспалительных Т -клеточных сублиний.
Результат (Фиг.4): Стимуляция CD4+ клеток с помощью ПТК не влияет на пролиферацию Т-клеток или их дифференцировку в подтипы Treg или ТЫ.
Для полной активации CD4+ Т-клеткам обычно требуется вовлечение Т-клеточного рецептора и ко-стимулирующих молекул, которые обычно обеспечиваются взаимодействием с антигенпрезентирующими клетками, такими как дендритные клетки (DCs). В этих условиях Т-клетки начинают пролиферировать и, в зависимости от цитокиновой среды, дифференцироваться в специфическое подмножество Т-хелперов.
Таким образом, на следующем этапе анализируют, могут ли пептиды ПТК стимулировать Т-клетки опосредованно через активацию DCs. Для этого клетки костного мозга, выделенные от мышей С57В1/6/с, дифференцируют в зрелые DCs путем стимуляции GM-CSF+IL-4, а затем активируют в течение 2 дней с помощью пептидов ПТК или IL-10, TGFp и GM-CSF+IL-4, т.е. известными толерогенными и иммуногенными триггерами активации дендритных клеток (DCs). Затем DCs в течение 5 дней культивируют совместно с незрелыми (naive) CD4+ клетками, выделенными из селезенки мышей С57В1/6, в так называемом MLR-анализе (смешанная реакция лимфоцитов), а количество пролиферирующих и Foxp3 - и Tbet-позитивных клеток определяют методом проточной цитометрии.
Когда DCs активируют с помощью пептидов ПТК, они способствуют значительно более высокой пролиферации CD4+ Т-клеток, чем любые другие использованные стимулы. Более того, количество Foxp3+ толерогенных Treg-клеток, образованных ПТК- активированными дендритными клетками DCs, такое же высокое, как и у DCs, активированных IL-10 или TGFp, и значительно выше, чем у DCs, активированных иммуногенной комбинацией GM-CSF + IL-4. Напротив, количество Tbet-позитивных иммуногенных клеток остается самым низким при совместном культивировании CD4+ клеток с ПТК-активированными DCs и значительно отличается от количества Tbet+ CD4+ клеток, индуцированных дендритными клетками DCs, активированными суммой цитокинов GM-CSF + IL-4.
Результат (Фиг.5): Пептиды ПТК стимулируют Т-клетки опосредованно, через активацию дендритных клеток (DCs). Пептиды ПТК непосредственно влияют на DCs и дифференцируют их в толерогенные клетки, которые, в свою очередь, способствуют
поляризации незрелых (naive) CD4+ Т-клеток в толерогенные Foxp3+ Treg-клетки.
Пример 5. Расшифровка каскада толерогенной активации in vitro
В данном примере исследуют, действительно ли пептиды ПТК непосредственно стимулируют DCs. Для этого клетки костного мозга инкубируют с цитокинами GM-CSF + IL-4 в течение 6 дней для получения зрелых DCs. После отмывания цитокинов клетки стимулируют с помощью ПТК (РСТ), толерогенными (IL-10, TGFP) или иммуногенными (GM-CSF + IL-4) цитокинами еще в течение 24 ч, a CD11с+/МНСП+дендритные клетки DCs анализируют методом проточной цитометрии.
По сравнению с GM-CSF + IL-4, пептиды ПТК (РТС) оказываются только слабыми индукторами CD80 - лиганда, как правило, интенсивно экспрессируемого иммуногенными DCs, и, таким образом, фенотип Т-клеток, стимулированных ПТК, скорее напоминает фенотип, полученный после стимуляции толерогенным IL-10 и фактором роста TGFB.
При индукции CD86 пептиды ПТК (РТС) столь же эффективны, как GM-CSF + IL- 4, но несколько менее эффективны, чем TGF . Напротив, количество клеток, экспрессирующих типичные толерогенные маркеры, такие как поверхностные лиганды PD-L1 и CD205, но не внутриклеточные IDO, было значительно увеличено при стимуляции DCs пептидами ПТК (РТС) по сравнению со стимуляцией GM-CSF + IL-4. Из проанализированных толерогенных маркеров рецептор CD205 был наиболее сильно индуцирован пептидами ПТК (РТС). Ни IL-10, ни TORb не могут так сильно активировать этот маркер. По своей способности стимулировать внутриклеточный белок IDO или поверхностный рецептор CD86 пептиды ПТК (РТС) были промежуточными по сравнению с IL-10 и TGFp.
Результат (Фиг.6): Пептиды ПТК (РТС) действительно стимулируют зрелые DCs к толерогенной дифференцировке и механизм активации DCs пептидами ПТК принципиально отличается от механизма активации IL-10 или TORb.
Остается вопрос, будет ли блокирование PD-1 - PD-L1/2 и/или CTLA4 - CD80/86 взаимодействий между DCs и Т-клетками, которые, как известно, важны для DCs- опосредованной дифференцировки Treg-клеток, предотвращать ПТК-опосредованную толерогенную активность DCs.
Для ответа на этот вопрос, полученные из костного мозга, созревшие под действием GM-CSF + IL-4 и DCs, активированные пептидами ПТК, совместно культивируют с сингенными незрелыми (naive) CD4+ Т-клетками в присутствии или
отсутствии функционально блокирующих анти-PD-l и/или анти-С1ЪА4 моноклональных антител (monAbs).
В то время как количество пролиферирующих Т-клеток несколько увеличено в присутствии антител по сравнению с контролем IgG, доля Foxp3+ Treg значительно снижена в присутствии анти-PD-l monAb и, в меньшей степени, анти-СТТА4 шопАЬ.
Кроме того, наличие обоих функционально-блокирующих антител обеспечивает наиболее сильный эффект, предполагая аддитивное действие.
Этот эффект наблюдают как в пролиферирующих, так и в непролиферирующих клетках, но он более выражен в покоящихся CD4+ клетках. Экспрессия иммуногенного транскрипционного фактора Tbet показывает противоположный результат. Количество Tbet+клеток увеличивается в присутствии функционально блокирующих анти-PD-l и анти-СТЬА4 антител, причем эффект наблюдают только у пролиферирующих CD4+ Т- клеток.
Результат (Фиг.7): Пептиды ПТК (РТС) в первую очередь нацелены на DCs и индуцируют экспрессию лигандов, таких как PD-L1 или CD86. Активированные DCs, в свою очередь, преобразуют незрелые (naive) CD4+ клетки в толерогенные Treg посредством прямых взаимодействий PD-1 PD-L1/2 и/или CTLA4 CD80/86.
Пример 6. Воздействие ПТК (накожная аппликация) на концентрацию in vivo провоспалительных цитокинов.
Используют беспородных белых мышей, которым вводят ЛПС (липополисахарид - пироген) в сочетании с накожным введением ПТК в дозировке 2.0 мг/кг веса (как на Фиг.2В). Измеряют концентрацию цитокинов в плазме крови.
Влияние пептидов ПТК на концентрацию цитокинов in vivo продемонстрировано на Фиг.8. Измеряют концентрацию в плазме крови следующих цитокинов: TNFa (ФНО- альфа), IL-lb, IL-2.
Результат: При ежедневных аппликациях ПТК в течение месяца в форме водно- спиртового лосьона в дозировке 2,0 мг/кг веса концентрация в крови провоспалительных цитокинов TNFa, IL-lb и IL-2 достоверно снижается по сравнению с плацебо. Ни у одного из животных не было зарегистрировано аллергии в месте нанесения препарата, а также развития системной аллергической реакции на препарат.
Пример 7. Проведение патологоанатомического исследования для демонстрации эффекта ПТК в тесте на противовоспалительную активность in vivo
Для данного эксперимента также используют генно-модифицированных мышей ihTNFtg с принудительной суперпродукцией фактора некроза опухолей - ФНО (TNFa), вследствие чего у мышей развивается выраженный псориатический артрит (см. Фиг.2А).
Одновременно с индукцией ФНО-альфа (TNF-a), начиная с нулевого дня, мышам ежедневно наносят физраствор (в качестве плацебо) или пептиды ПТК накожно на безволосную часть ушей, как показано на Фиг.2В, в дозировке 2,0 мг/кг веса в день. Через 10 дней постмортально проводят микроскопическое исследование поперечного среза кожи в дистальных районах псориатической деформации (Фиг.9).
Результат: При воздействии ПТК в форме накожного лосьона в дозировке 2,0 мг/кг веса в день артритно-псориатическая деформация подавляется с эффективностью около 70%. В дополнительном контрольном опыте без индукции TNF-a ни у одного из 5 животных не было зарегистрировано аллергии в месте нанесения препарата, а также развития системной аллергической реакции на препарат.
Пример 8. Лечение ревматоидного артрита у крупных млекопитающих.
Девять испытуемых собак различных пород и беспородных в возрасте от 4 до 8 лет и весом от 12 до 25 кг были предоставлены для лечения их владельцами. Перед применением ПТК состояние животных было задокументировано ветеринарными врачами, у которых они находились на регулярном лечении. У всех животных артрит не был следствием травмирования. Также были исключены гнойный артрит и хламидийный артрит.
До применения пептидов все девять собак лечили от 1,5 до 3 лет либо безуспешно, либо с временным терапевтическим эффектом с помощью физиотерапии и известными противоартритными средствами (Стоп-артрит, Артрогликан, Лошадиная сила, Кетофен, Римадил, Хондартрон, Хондроитин Комплекс, Хондролон, Румалон). Кортикостероидные препараты испытуемым собакам ранее не назначали.
Для чистоты эксперимента все противоартритные препараты перед началом применения ПТК были отменены.
В силу специфики поведения животных, нанесение лосьона ПТК осуществляли только на тазобедренную область и в область позвоночника во избежание интенсивного слизывания (Фиг.10). Аппликацию осуществляли следующим образом: на суставы наносили лосьон ПТК в концентрации от 1% до 5% одноразовой полиэтиленовой пипеткой под шерсть непосредственно на кожу в объеме 0,5- 1,5 мл в каждую точку (не
менее 3 точек) и прижимали полиэтиленовой пленкой на 3 минуты. Этого времени по опыту достаточно для развития терапевтического эффекта. Благодаря наличию в лекарственной форме 40%-го этанола лосьон ПТК легко распространяется по коже под шерстью. При нанесении раствора ПТК каждый раз соблюдали дозировку не менее 2 мг/кг веса, исходя из концентрации пептидов и веса животного. Препарат применяли ежедневно, еженедельно, раз в 2 недели и ежемесячно.
Собакам N°N° 1,2,3 (наиболее легкая группа) проведен 3-месячный курс с последующим наблюдением в течение 6-9 месяцев после завершения лечения (еженедельное применение).
Собакам N°N 4, 5, 6, 7 проведен 6-месячный курс с последующим наблюдением в течение 3-6 месяцев после завершения лечения (N°N°4,5 с нанесением раз в 2 недели, N°N°6,7 - ежемесячно).
Собакам -N°N° 8,9 (первоначально слабо отвечающие на лечение) проведен 9- месячный курс с последующим наблюдением в течение 3 месяцев после завершения лечения (первый квартал - еженедельное применение, в середине курса (второй квартал) - ежедневно, в конце (третий квартал) - раз в неделю).
Результаты приведены в Таблице 2.
Обозначения:
«+» - недостаточный терапевтический эффект, сохранялись боли в суставах при прощупывании суставов;
«++» - удовлетворительный терапевтический эффект, при прощупывании суставов болевых реакций не наблюдалось, но при движении наблюдалось некоторое ограничение подвижности или нарушение координации;
«+++» - максимальный терапевтический эффект, не наблюдалось болевых реакций при прощупывании суставов и заметных ограничений подвижности или нарушений координации при движении;
«Н/Д» - нет данных.
Важно также, что в течение всего наблюдаемого периода в течение лечения и в последующий период побочные явления не наблюдались. Животные после излечивания проявляли здоровое активное поведение, температура и стул были в норме. Не было отмечено грибковых, вирусных и бактериальных инфекций, что свидетельствует в пользу того, что пептиды не проявляли иммуносупрессорного воздействия. Ни у одного из животных не было зарегистрировано аллергии в месте нанесения препарата, а также развития системной аллергической реакции на препарат.
Обращает на себя внимание то, что воздействие пептидов только на бедра и позвоночник приводит к явному терапевтическому эффекту и в остальных больных суставах, хотя в дистальных суставах лечебный эффект достигался с 1-1,5 месячной задержкой, что подтверждает факт системного общеорганизменного действия накожной лекарственной формы ПТК.
Claims
1. Противовоспалительный препарат на основе пептидов селезенки млекопитающих, отличающийся тем, что препарат представлен в форме композиции накожного водно-спиртового лосьона системного противовоспалительного действия, содержащий фракцию очищенных пептидов селезенки млекопитающих с молекулярной массой не более 12 кДа в количестве 1 5 мае % к общей массе композиции, 96% этанол в количестве 40 мае %, хлористый натрий в количестве до 0,5 мае %, хлористый цинк в количестве до 0,05 мае %, сульфат кальция в количестве до 0,2 мае % , вода - остальное, при pH 7.4±0.2.
2. Противовоспалительный препарат по п.1, отличающийся тем, что препарат нормализует баланс воспалительных и противовоспалительных реакций, который определяют по нормализации in vivo уровня цитокинов ФНО-альфа, IL-1-бета и IL-2.
3. Противовоспалительный препарат по любому из пп.1-2, отличающийся тем, что препарат предупреждает развитие псориатического артрита или ревматоидного артрита.
4. Способ получения противовоспалительного препарата по любому из пп.1-3, предусматривающий последовательное проведение следующих этапов: смешивания измельченной до состояния фарша селезенки млекопитающего с 0,1% раствором хлористого цинка в соотношении 2 массовых частей раствора на 1 массовую часть фарша, фиксации крупномолекулярной фракции путем закисления полученного гомогената при интенсивном перемешивании до значения pH 3,0±0.2 с помощью 5 М раствора соляной кислоты, экстракции пептидов доведением pH гомогената до значения pH 8,0±0,2 с помощью 5 М раствора гидроксида натрия, получения осветленного экстракта с помощью замораживания-экссудации или проточного центрифугирования, преципитации крупномолекулярного балласта путем добавления в экстракт 5 М раствора серной кислоты до значения pH 2,5±0,2 с отсечкой балласта при помощи нутч- фильтра и получения кислого фильтрата, преципитации сульфата путем нейтрализации фильтрата 30%-й водной взвесью гидроксида кальция до значения pH 7,4±0,2 с отсечкой балласта при помощи нутч- фильтра и получением нейтрального фильтрата,
преципитации остаточного балласта и частичного обессоливания путем внесения в фильтрат расчетного объема 96%-го этанола до 40 мае % с отсечкой остаточного белково- солевого осадка при помощи нутч-фильтра и получения композиции накожного водно- спиртового лосьона системного противовоспалительного действия, содержащего фракцию очищенных пептидов селезенки млекопитающих с молекулярной массой не более 12 кДа в концентрации 1 -^ 5 мае % к общей массе композиции, 96% этанол в количестве 40 мае %, хлористый натрий в количестве до 0,5 мае %, хлористый цинк в количестве до 0,05 мае %, сульфат кальция в количестве до 0,2 мае % , вода - остальное, при pH 7.4±0.2.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что определение границы отсечки молекулярной массы пептидов осуществляют с помощью вытеснительной хроматографии и с помощью SDS-электрофореза в градиентном полиакриламидном геле.
6. Способ по любому из пп.4-5, отличающийся тем, что для получения препарата используют селезенку КРС или свиньи.
7. Способ подавления воспалительной реакции, включающий нанесение на кожу пациента эффективного количества противовоспалительного пептидного препарата по любому из пп.1-3.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что пептиды в составе противовоспалительного препарата без проникновения в системный кровоток воздействуют на внутрикожные дендритные клетки, направляя их на толерогенный путь дифференцировки с последующей передачей толерогенного сигнала Т-регуляторным лимфоцитам.
9. Способ по п.7, отличающийся тем, что воспалительная реакция ассоциирована с псориатическим артритом или ревматоидным артритом.
10. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанный препарат применяют в дозе 2 мг/кг веса при ежедневном нанесении.
11. Способ по любому из пп.7-10, отличающийся тем, что указанный препарат получен способом по любому из п.п.4-6.
12. Применение противовоспалительного препарата по любому из п.п.1-3 в терапии воспалительного заболевания.
13. Применение по п.12, отличающееся тем, что воспалительное заболевание выбрано из хронического воспалительного заболевания или аутоиммунного заболевания.
14. Применение по п.12, отличающееся тем, что воспалительным заболеванием является псориатический артрит или ревматоидный артрит.
15. Применение по п.12, отличающееся тем, что препарат применяют в дозе 2 мг/кг веса при ежедневном нанесении на кожу пациента.
16. Применение по п.12, отличающееся тем, что пептиды в составе противовоспалительного препарата без проникновения в системный кровоток воздействуют на внутрикожные дендритные клетки, направляя их на толерогенный путь дифференцировки с последующей передачей толеро генного сигнала Т-регуляторным лимфоцитам.
17. Применение по любому из пп.12-16, отличающееся тем, что указанный препарат получен способом по любому из п.п.4-6.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2021103158A RU2766340C1 (ru) | 2021-02-10 | 2021-02-10 | Пептидный толерогенный компаунд |
RU2021103158 | 2021-02-10 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2022173328A1 true WO2022173328A1 (ru) | 2022-08-18 |
Family
ID=80736508
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/RU2022/000036 WO2022173328A1 (ru) | 2021-02-10 | 2022-02-10 | Пептидный толерогенный компаунд |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2766340C1 (ru) |
WO (1) | WO2022173328A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115624614A (zh) * | 2022-12-08 | 2023-01-20 | 北京第一生物科技开发有限公司 | 牛脾肽粉在预防或治疗抑郁症中的用途 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3633651A1 (de) * | 1986-10-03 | 1988-04-14 | Alfred Dr Dick | Verwendung von fraktionen aus thymus- und milzextrakten zur behandlung der psoriasis |
CN102125517A (zh) * | 2011-02-12 | 2011-07-20 | 成都师创生物医药科技有限公司 | 低浓度的囊泡型磷脂凝胶作为小分子肽类药物缓释载体的应用 |
RU2496786C2 (ru) * | 2008-05-27 | 2013-10-27 | Джензим Корпорейшн | Пептидные аналоги альфа-меланоцитстимулирующего гормона |
CN106110292A (zh) * | 2016-08-22 | 2016-11-16 | 刘传文 | 一种用于超声科防辐射的中西药组合物及制备方法 |
CN106166291A (zh) * | 2016-08-05 | 2016-11-30 | 吉林丰生制药有限公司 | 脾多肽提高klrk1或lck治疗免疫抑制的医药用途 |
EA032439B9 (ru) * | 2013-01-30 | 2019-08-30 | Борис Горинштейн | Композиции и способы для лечения поверхностных ран |
EA033742B1 (ru) * | 2013-04-26 | 2019-11-21 | Suppremol Gmbh | ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА ДЛЯ ПОДКОЖНОГО ВВЕДЕНИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ РАСТВОРИМЫЙ Fc-РЕЦЕПТОР, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЛЕКАРСТВЕННУЮ ФОРМУ, И ПРИМЕНЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2152219C1 (ru) * | 1998-04-08 | 2000-07-10 | Научно-Исследовательский Институт Трансплантологии И Искусственных Органов | Пептиды, обладающие иммуностимулирующей активностью, способ их получения, лекарственный препарат на их основе спленопид и его применение |
-
2021
- 2021-02-10 RU RU2021103158A patent/RU2766340C1/ru active
-
2022
- 2022-02-10 WO PCT/RU2022/000036 patent/WO2022173328A1/ru active Application Filing
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3633651A1 (de) * | 1986-10-03 | 1988-04-14 | Alfred Dr Dick | Verwendung von fraktionen aus thymus- und milzextrakten zur behandlung der psoriasis |
RU2496786C2 (ru) * | 2008-05-27 | 2013-10-27 | Джензим Корпорейшн | Пептидные аналоги альфа-меланоцитстимулирующего гормона |
CN102125517A (zh) * | 2011-02-12 | 2011-07-20 | 成都师创生物医药科技有限公司 | 低浓度的囊泡型磷脂凝胶作为小分子肽类药物缓释载体的应用 |
EA032439B9 (ru) * | 2013-01-30 | 2019-08-30 | Борис Горинштейн | Композиции и способы для лечения поверхностных ран |
EA033742B1 (ru) * | 2013-04-26 | 2019-11-21 | Suppremol Gmbh | ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА ДЛЯ ПОДКОЖНОГО ВВЕДЕНИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ РАСТВОРИМЫЙ Fc-РЕЦЕПТОР, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЛЕКАРСТВЕННУЮ ФОРМУ, И ПРИМЕНЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ |
CN106166291A (zh) * | 2016-08-05 | 2016-11-30 | 吉林丰生制药有限公司 | 脾多肽提高klrk1或lck治疗免疫抑制的医药用途 |
CN106110292A (zh) * | 2016-08-22 | 2016-11-16 | 刘传文 | 一种用于超声科防辐射的中西药组合物及制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
E. G. KUZNETSOVA , V. A. RYZHIKOVA , L. A. SALOMATINA , V. I. SEVASTYANOV: "TRANSDERMAL DRUG DELIVERY AND METHODS TO ENHANCE IT", VESTNIK TRANSPLANTOLOGII I ISKUSSTVENNYKH ORGANOV, vol. 8, no. 2, 30 November 2015 (2015-11-30), pages 152 - 162, XP009540599, ISSN: 1995-1191, DOI: 10.15825/1995-1191-2016-2-152-162 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115624614A (zh) * | 2022-12-08 | 2023-01-20 | 北京第一生物科技开发有限公司 | 牛脾肽粉在预防或治疗抑郁症中的用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2766340C1 (ru) | 2022-03-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Dunn | Psychoneuroimmunology, stress and infection | |
DE60029304T2 (de) | Aktivierung von regulatorischen t zellen durch ein alpha-melanocyten stimulierendes hormon | |
JPH10509955A (ja) | 二次性免疫不全症の治療法 | |
JP2001519815A (ja) | アレルゲン誘発性障害の治療におけるラクトフェリンの使用 | |
JP4708511B2 (ja) | 胆汁由来免疫調節組成物 | |
US4250084A (en) | Purified thymic hormone (THF), its preparation and pharmaceutical compositions containing it | |
AU2022202889B2 (en) | Use of cell membrane-bound signaling factors | |
JPH11501634A (ja) | 免疫系異常治療用の胆汁からの免疫調節組成物 | |
WO2022173328A1 (ru) | Пептидный толерогенный компаунд | |
US20080279957A1 (en) | Immunomodulating compositions from bile | |
Asadova | Morphofunctional changes of the thymus under the influence of various environmental factors | |
EP2227246B1 (de) | Behandlung von fibrosen und lebererkrankungen | |
JPS6219525A (ja) | 植物起源の生物活性物質の製造法および同物質含有組成物 | |
DE69838324T2 (de) | Ph-sensitive liposomen und andere typen immunomodulatoren enthaltender gekapselter impfstoffe sowie herstellungs- und anwendungsverfahren dafür | |
RU2790158C1 (ru) | Способ получения противовоспалительного препарата на основе пептидов селезенки млекопитающих, препарат, полученный данным способом, и его применение | |
DE69712907T2 (de) | Immunogene tlp-zusammensetzung | |
KR100922675B1 (ko) | 면역아쥬반트 | |
CN113056281B (zh) | 用于治疗牛皮癣的药物及其生产方法 | |
WO1999064066A1 (fr) | Agents induisant une tolerance immunitaire et contenant de la keratine dure ou une substance ressemblant a la keratine | |
US6551623B1 (en) | Immunomodulating compositions from bile | |
Yamasaki et al. | A morphological and ultrastructural investigation of normal mouse brain tissue after intracerebral injection of tumor necrosis factor | |
Baadsgaard | Immunologic mechanisms of contact dermatitis | |
DE19643093C2 (de) | Verwendung von FasL oder mit FasL transfizierten CD4·+·/FasL·-·/TH1-Zellinien oder von FasL in Kombination mit einem oder mehreren Cytokin(en) zur Bekämpfung von TH1/TH2-Krankheiten | |
AU2009101279A4 (en) | Medicinal formulation containing selected cytokines | |
Landeck et al. | Identifying the active pharmaceutical ingredient from a mixture of fumaric acid esters for the treatment of psoriasis: hints from in vitro investigations |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 22753052 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 22753052 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 22753052 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |