WO2022169239A1 - 알츠하이머병 치료를 위한 nlrp3 인플라마좀 소분자 억제제 - Google Patents

알츠하이머병 치료를 위한 nlrp3 인플라마좀 소분자 억제제 Download PDF

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WO2022169239A1
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nlrp3
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최상돈
하세브무하마드
나시르자배드
펄자나야스민
서지연
허재경
신호철
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아주대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a small molecule compound having a function of inhibiting NLRP3 inflammasome activity, and more particularly, to a small molecule compound represented by Formula 1, a composition for inhibiting NLRP3 inflammasome activity comprising the same, and NLRP3 inflamma It relates to a composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases related to moth.
  • the inflammasome is a multiprotein complex of the innate immune system that detects pathogens through pattern recognition receptors and is responsible for the activation of the inflammatory response (MR de Zoete, et al., Cold Spring Harb Perspect Biol 6, a016287 (2014)) ).
  • Key components of the inflammasome are nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptors (NLRs), melanoma 2 (AIM2)-like receptors, and pyrine receptors. (pyrin receptors) and enzyme components (caspase 1).
  • ASC apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain
  • ASC apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain
  • NLRP3 nucleotide-binding oligomerization domain [NOD]-like receptor family, pyrin domain-containing 3
  • caspase 1 activation results in caspase 1 activation followed by maturation and secretion of the proinflammatory cytokines IL-1 ⁇ and IL-18 (K. Schroder, J. Tschopp, Cell 140, 821-832 (2010)) ).
  • Caspase 1 activation can also mediate cell death either directly (via a process known as pyroptosis) or indirectly (via apoptosis) (V. Sagulenko et al. , Cell Death ). Differ 20, 1149-1160 (2013)).
  • noncanonical NLRP3 inflammasome is also an area of development of interest. The latter type is formed by caspase 11 in mice.
  • NLRP3 inflammasome activation can also be implemented through several cellular mechanisms and cytoskeletal signatures.
  • NIMA-associated kinase 7 (NEK7) was identified as a novel regulator of the NLRP3 inflammasome, a protein involved in cell cycle progression. When NEK7 interacts with the leucine-rich repeat (LRR) domain of NLRP3, it activates the NLRP3 inflammasome independent of kinase activity (Y. He, et al.
  • NLRP3 is a metabolic disorder (obesity, gout, type 2 diabetes mellitus and atherosclerosis) and neurodegenerative diseases (Alzheimer's) disease (AD), traumatic brain injury, multiple sclerosis and Parkinson's disease), including autoimmune and autoinflammatory diseases (T) Strowig, et al., Nature 481, 278-286 (2012)).
  • biotherapeutics including the antibodies canakinumab, anakinra, and rilonacept, target the inflammasome products IL-1 ⁇ IL-1RA and IL-18 for the treatment of NLRP3-related diseases.
  • biotherapeutics including the antibodies canakinumab, anakinra, and rilonacept
  • target the inflammasome products IL-1 ⁇ IL-1RA and IL-18 for the treatment of NLRP3-related diseases CA Dinarello, JW van der Meer, Semin Immunol 25, 469-484 (2013).
  • small molecule inhibitors of the NLRP3 inflammasome have been reported, including glyburide, parthenolide, Bay11-708, auranofin, CRID3 and beta hydroxybutyric acid ( ⁇ BHB), but among these inhibitors, Some are non-specific and have limited efficacy (E. Isakov, P. Weisman-Shomer, M.
  • MCC950 was recently identified as a highly selective NLRP3 inflammasome inhibitor that blocks canonical and non-canonical NLRP3 inflammasomes at nanomolar concentrations (RC Coll et al. , Nat Med 21, 248-255 (2015)).
  • NIC7 NLRP3 inhibitory compound 7
  • NIC7w potent derivative NIC7w thereof
  • An object of the present invention is to provide a small molecule compound having a function of inhibiting NLRP3 inflammasome activity.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for inhibiting NLRP3 inflammasome activity comprising the small molecule compound.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating NLRP3 inflammasome-related inflammatory diseases comprising the small molecule compound.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating NLRP3 inflammasome-related inflammatory diseases, comprising administering the small molecule compound.
  • Another object of the present invention is to provide a use of the small molecule compound for the prevention or treatment of NLRP3 inflammasome-related inflammatory diseases.
  • Another object of the present invention is to provide the use of the small molecule compound for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of NLRP3 inflammasome-related inflammatory diseases.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving NLRP3 inflammasome-related inflammatory diseases, including the small molecule compound.
  • the present invention provides a compound represented by the following formula (1), an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • R 1 and R 2 are the same as or different from each other, and each independently a hydrogen atom, a halogen atom, a substituted or unsubstituted hydrocarbon group, a substituted or unsubstituted heterogeneous group, a substituted or unsubstituted carbon It is characterized in that it is selected from a carbocyclic group, a substituted or unsubstituted heterocyclic group, a substituted or unsubstituted aromatic group, and a substituted or unsubstituted heteroaromatic group.
  • the present invention also provides a composition for inhibiting NLRP3 inflammasome activity comprising the small molecule compound.
  • the present invention also provides a composition for preventing or treating NLRP3 inflammasome-related inflammatory diseases comprising the small molecule compound.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating NLRP3 inflammasome-related inflammatory diseases comprising administering the small molecule compound.
  • the present invention also provides the use of said small molecule compound for the prophylaxis or treatment of NLRP3 inflammasome-associated inflammatory diseases.
  • the present invention also provides the use of the small molecule compound for the manufacture of a medicament for the prophylaxis or treatment of NLRP3 inflammasome-associated inflammatory diseases.
  • the present invention also provides a food composition for preventing or improving NLRP3 inflammasome-related inflammatory diseases comprising the small molecule compound.
  • FIG. 1 is an overall summary schematic diagram of a virtual screening workflow for identification of a basic lead substance.
  • the number in the box indicates the number of ligands passed to the next step.
  • Subsequent pharmacophore screening ligands were input materials for independent rigid and induced-fit docking.
  • Figure 2 shows the two sites of NLRP3 considered for molecular docking
  • Figure 2 (a) shows the site I (HD2 domain and LRR) of NLRP3 corresponding to the NEK7 binding site of NLRP3
  • Figure 2 (b) shows the NACHT domain of NLRP3 and site II corresponding to the ADP binding site.
  • LRR is shown in cyan, HD2 in brown, HD1 in green, winged helix domain (WHD) in purple, and NBD in blue, with the binding sites detailed on the right side of each panel.
  • Figure 3 shows the functional screening of NLRP3 inhibitors
  • Figure 3 (a, b) is a graph showing the toxicity of the compound to PMA-differentiated THP-1 cells after treatment for 24 hours at the indicated concentrations by performing the MTT assay.
  • Figure 3 (c) is a graph evaluating the inhibition of NLRP3 by a non-toxic compound by confirming the secretion level of IL-1 ⁇ .
  • PMA-differentiated THP-1 cells were primed with LPS (10 ng/mL) for 4 hours and then the indicated concentrations was treated with the compound for 1 hour, cells were treated with nigericin (10 ⁇ M) for 1 hour to activate NLRP3, and the supernatant was collected using ELISA to check the cytokine level.
  • the data presented are the averages of three independent experiments (each experiment was performed in two replicates), and statistical analysis was performed using a two-tailed paired Student's t- test (* P ⁇ 0.05).
  • Figure 4 shows the cytotoxicity of the NIC7 derivative
  • Figure 4 (a, b) is a graph showing the toxicity of the compound to PMA-differentiated THP-1 cells after treatment for 24 hours at the indicated concentration by performing the MTT assay to be.
  • the data presented are the averages of three independent experiments (each experiment was performed in two replicates), and statistical analysis was performed using a two-tailed paired Student's t- test (* P ⁇ 0.05).
  • FIG. 5 is a diagram showing the functional screening of NIC7 derivatives.
  • Figure 5 (ac) is the result of evaluating the inhibition of NLRP3 by a non-toxic compound by confirming the secretion level of IL-1 ⁇
  • PMA-differentiated THP-1 cells were primed with LPS (10 ng / mL) for 4 hours, and then the indicated The concentration was treated with the compound for 1 hour.
  • Cells were treated with nigericin (10 ⁇ M) for 1 hour to activate NLRP3, and the supernatant was collected using ELISA to check cytokine levels. Data shown are the average of 3 independent experiments (each experiment was performed in 2 replicates), and statistical analysis was performed using a two-tailed paired Student's t- test (* P ⁇ 0.05).
  • Figure 5 (d) is the result of evaluating the inhibition of the NLRP3 signaling pathway by NIC7w (10 ⁇ M), NIC7 (10 ⁇ M) or MCC950 (1 ⁇ M) by western blotting, PMA-differentiated THP-1 cells After the same treatment as described above and total protein extraction, immunoblotting was performed with primary antibodies specific for IL-1 ⁇ caspase 1, NLRP3 and ⁇ . ⁇ served as an internal control.
  • FIG. 6 is a diagram showing the recovery from cognitive impairment in the AD model, AD model was generated by injection of A ⁇ 1-42 (black arrow) on day 7, NIC7 (100 nmol / g), donepezil (donepezil) ( 1 mg/kg) or DMSO as vehicle (vehicle, 1%) was intraperitoneally administered on day 0 (red arrow) for 3 days/week.
  • Figure 6(d) shows the body weight of each group, which was evaluated at the indicated time points. Statistical analysis was performed using two-tailed paired Student's t- test (* P ⁇ 0.05).
  • NIC7 is a two-dimensional structure of the initial active ligand, and the two-dimensional structure of the initial active ligand was confirmed in cell-based analysis. NIC7 was identified as a preliminary active substance (hit) with the ability to inhibit NLRP3.
  • NIC7w is a two-dimensional structure of the NIC7 active derivative, and the two-dimensional structure of the NIC7 active derivative was confirmed in cell-based analysis. Among all derivatives, NIC7w was found to be the most potent NLRP3 inhibitor.
  • Fig. 9(a) shows the LRR binding mode of NIC7 and NLRP3 of HD2, and an enlarged view of the detailed interaction with 5 ⁇ residues around the ligand is shown on the right.
  • Figure 9(b) shows the binding of NIC7w to HD2 and LRR of NLRP3, and on the right is an enlarged view of the detailed interaction that occurs within 5 ⁇ of the ligand.
  • LRR is shown in cyan, HD2 in brown, HD1 in green, WHD in purple, and NBD in blue, and ligands are presented as stick models. Hydrogen bonds are indicated by dotted lines, and numbers indicate distances in angstroms ( ⁇ ).
  • NIC7 NLRP3 inflammasome
  • NIC7 induced significant inhibition of NLRP3 inflammasome, caspase 1 and IL-1 ⁇ . confirmed that Through subsequent evaluation of structural derivatives with modifications around the major scaffold of NIC7, an analog (designated NIC7w) was identified in a dose-dependent manner with the NLRP3 inflammasome, caspase 1 and IL-1 ⁇ secretion was confirmed to be more potent and significantly inhibited than that of NIC7.
  • cryo-EM structure of NLRP3 was used because the crystal structure of human NLRP3 has not yet been resolved.
  • site I corresponding to HD2 and LRR of NLRP3 and overlapping with NEK7-binding sites
  • site II corresponding to the NACHT domain of NLRP3.
  • site I corresponding to HD2 and LRR of NLRP3 and overlapping with NEK7-binding sites
  • site II corresponding to the NACHT domain of NLRP3
  • NIC7 NLRP3 inflammasome
  • NIC7w potent analogue
  • the present invention relates to a compound represented by the following formula (1), an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • R 1 and R 2 are the same as or different from each other, and each independently a hydrogen atom, a halogen atom, a substituted or unsubstituted hydrocarbon group, a substituted or unsubstituted heterogeneous group, a substituted or unsubstituted carbon It is characterized in that it is selected from a carbocyclic group, a substituted or unsubstituted heterocyclic group, a substituted or unsubstituted aromatic group, and a substituted or unsubstituted heteroaromatic group.
  • the compounds of the present invention may exist as tautomers, and although only one tautomeric structure can be depicted, it is meant that both tautomeric forms are included within the scope of the present invention.
  • reference to a particular element such as hydrogen or H, is meant to include all isotopes of that element, where appropriate.
  • halogen or halo
  • fluorine F
  • chlorine Cl
  • bromine Br
  • iodine I
  • hydrocarbon group means 1 to 25 carbon atoms, preferably 1 to 12 carbon atoms, more preferably 1 to 10 carbon atoms, most preferably 1 refers to a chain of from 5 to 8 carbon atoms.
  • the hydrocarbon group may have a linear or branched chain structure. Typical hydrocarbon groups have one or two branches, usually one branch. In general, hydrocarbon groups are saturated.
  • the unsaturated hydrocarbon group may have one or more double bonds, one or more triple bonds, or a combination thereof. Typical unsaturated hydrocarbon groups have one or two double bonds or one triple bond; More typically the unsaturated hydrocarbon group has one double bond.
  • alkyl group is used alone or within other terms such as “haloalkyl group” and “alkylamino group,” for example, from 1 to about 20 carbon atoms, or in certain embodiments from 1 to It encompasses linear or branched carbon radicals having about 12 carbon atoms.
  • examples of such groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, iso-amyl, hexyl, and the like.
  • haloalkyl group includes groups in which any one or more of the alkyl carbon atoms are substituted with halo as defined above.
  • polyhaloalkyl groups including monohaloalkyl, dihaloalkyl and perhaloalkyl are included.
  • a monohaloalkyl group may have an iodo, bromo, chloro or fluoro atom in the group.
  • Dihalo and polyhaloalkyl groups may have two or more of the same halo atom or a combination of different halo groups.
  • haloalkyl groups are fluoromethyl, difluoromethyl, trifluoromethyl, chloromethyl, dichloromethyl, trichloromethyl, pentafluoroethyl, heptafluoropropyl, difluorochloromethyl, dichlorofluoromethyl , difluoroethyl, difluoropropyl, dichloroethyl and dichloropropyl.
  • hydroxyalkyl group includes, but is not limited to, linear or branched alkyl groups having, for example, from 1 to about 10 carbon atoms, any of which is substituted with one or more hydroxyl groups.
  • hydroxyl groups can be Examples of such groups include hydroxymethyl, hydroxyethyl, hydroxypropyl, hydroxybutyl and hydroxyhexyl.
  • alkoxy group includes, but is not limited to, linear or branched oxy-comprising groups each having, for example, an alkyl moiety of from 1 to about 10 carbon atoms. Examples of such groups include methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy and tert-butoxy. In certain embodiments, the low molecular weight alkoxy group has 1 to 3 carbon atoms.
  • An “alkoxy” group is further substituted with one or more halo atoms such as fluoro, chloro or bromo to provide a “haloalkoxy” group. Examples of such groups include fluoromethoxy, chloromethoxy, trifluoromethoxy, trifluoroethoxy, fluoroethoxy and fluoropropoxy.
  • arylalkyl group includes aryl-substituted alkyl groups.
  • the arylalkyl group may be a “low molecular weight arylalkyl” group having an aryl group attached to an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, examples of which include benzyl, diphenylmethyl and phenyl. contains ethyl.
  • aryl may be further substituted with halo, alkyl, alkoxy, haloalkyl and haloalkoxy.
  • heterogeneous group means a saturated or unsaturated chain of carbon atoms and non-hydrogen member atoms comprising at least one heteroatom.
  • Heterogeneous groups generally have from 1 to 25 member atoms.
  • the chain comprises from 1 to 12 member atoms, from 1 to 10, more preferably from 1 to 8 member atoms.
  • the chain may be linear or branched.
  • a typical branched heterogeneous group has one or two branches, more usually one branch.
  • heterogeneous groups are saturated.
  • An unsaturated heterogroup may have one or more double bonds, one or more triple bonds, or both. Typical unsaturated heterogroups have one or two double bonds or one triple bond.
  • Carbocyclic group means a saturated or unsaturated carbocyclic hydrocarbon ring. Carbocyclic groups are not aromatic. A carbocyclic group is a monocyclic or polycyclic ring. Multiple carbocyclic groups may be fused, spiro or bridged ring systems. A single carbocyclic group may contain from 4 to 10 carbon atoms, typically from 4 to 7 carbon atoms, and more typically from 5 to 6 carbon atoms in the ring. Bicyclic carbocyclic groups may contain from 8 to 12 carbon atoms, typically from 9 to 10 carbon atoms, in the ring.
  • heterocyclic group refers to a saturated or unsaturated ring structure containing carbon atoms and one or more heteroatoms in the ring. Heterocyclic groups are not aromatic. Heterocyclic groups are monocyclic or polycyclic. Multiple heterocyclic groups may be fused, spiro or bridged ring systems. A single heterocyclic group has 4 to 10 member atoms (i.e., including carbon atoms and at least 1 heteroatom) in the ring, typically 4 to 7, and more typically 5 to 6 member atoms. may include Bicyclic heterocyclic groups may contain 8 to 18 member atoms, typically 9 or 10 member atoms, in the ring.
  • heterocyclic groups include heterocyclyl, azetidinyl, pyrrolidinyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydro-thienyl, pyrazolidinyl, imidazolidinyl, oxazolidinyl, isoxazolidinyl, thiazolyl Dinyl, piperidinyl, tetrahydropyranyl, tetrahydrothiopyranyl, piperazinyl, morpholinyl, thiomorpholinyl, 1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl, azepanyl, diazepa nyl, homopiperazinyl, oxazepanil, dihydroindolyl, dihydrofuryl, dihydroimidazolinyl, dihydrooxazolyl, tetrahydropyridinyl, dihydropyranyl, dihydrobenzofuranyl,
  • aromatic group refers to an aromatic group having one or more rings, wherein the rings may be attached or fused together in a hanging manner.
  • the aromatic group is 1, 2 or 3 rings.
  • Monocyclic aromatic groups may contain 4 to 10 carbon atoms, typically 4 to 7 carbon atoms, more typically 4 to 6 carbon atoms, in the ring.
  • Typical polycyclic aromatic groups have two or three rings.
  • a polycyclic aromatic group having two rings generally has 8 to 12 carbon atoms, preferably 8 to 10 carbon atoms, in the ring.
  • aromatic groups include, but are not limited to, phenyl, naphthyl, tetrahydronaphthyl, indanyl, biphenyl, phenanthryl, anthryl, or acenaphthyl.
  • heteroatom means an atom other than carbon.
  • the heteroatoms are selected from the group consisting of sulfur, phosphorus, nitrogen and oxygen atoms. Groups containing more than one heteroatom may contain other heteroatoms.
  • heteroaryl group refers to an aromatic group having one or more rings, wherein the rings may be attached or fused together in a hanging manner, wherein the aromatic group comprises has one or more heteroatoms.
  • a monocyclic heteroaromatic group may contain 4 to 10 member atoms, typically 4 to 7 member atoms, more typically 4 to 6 member atoms in the ring.
  • Common polycyclic heteroaromatic groups have 2 or 3 rings.
  • Multicyclic aromatic groups having two rings have generally 8 to 12 member atoms, more typically 8 to 10 member atoms, in the ring.
  • Examples of monocyclic heteroaryl include thiazolyl, oxazolyl, thiophenyl, furanyl, pyrrolyl, imidazolyl, isoxazolyl, isothiazolyl, pyrazolyl, triazolyl, triazinyl, thiadiazolyl, tetrazolyl , oxadiazolyl, pyridinyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl and similar groups, but is not limited thereto.
  • bicyclic heteroaryl examples include indolyl, azaindolyl, indolinyl, benzothiophenyl, benzofuranyl, benzimidazolyl, benzooxazolyl, benzisoxazolyl, benzthiazolyl, benzthiadiazolyl, benztria zolyl, quinolinyl, isoquinolinyl, purinyl, furopyridinyl and similar groups.
  • R 1 is a hydrogen atom or methyl
  • R 2 is a substituted or unsubstituted aromatic group, an alkyl group, an arylalkyl group, or a heterocycloalkyl group.
  • R 1 and R 2 may be characterized as a substituent selected from the following group, but is not limited thereto.
  • R 1 a hydrogen atom or methyl
  • the compound represented by Formula 1 may be a compound represented by any one of Formulas selected from the group consisting of Formulas 1-1 to 1-12 below.
  • the compound of Formula 1-1 is named NIC7 (NLRP3 inhibitory compound 7; NLRP3 inhibitory compound 7), and the compounds of Formulas 1-2 to 1-12, which are derivatives of NIC7, are NIC7a, NIC7d, and NIC7e, respectively. , NIC7f, NIC7j, NIC7k, NIC7l, NIC7m, NIC7p, NIC7r, NIC7w (Table 1).
  • the compound according to the present invention may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and as the salt, an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid is useful.
  • Inorganic acids and organic acids can be used as free acids, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc. can be used as inorganic acids, and citric acid, acetic acid, lactic acid, maleic acid, fumaric acid, gluconic acid, and methanesulfonate as organic acids
  • Phonic acid, glycolic acid, succinic acid, tartaric acid, 4-toluenesulfonic acid, galacturonic acid, embonic acid, glutamic acid, aspartic acid and the like can be used.
  • the compound according to the present invention includes not only pharmaceutically acceptable salts, but also all salts, isomers, hydrates and solvates that can be prepared by conventional methods.
  • the compound according to the present invention may be prepared in a crystalline form or an amorphous form, and when the compound of Formula 1 is prepared in a crystalline form, it may optionally be hydrated or solvated.
  • the compound represented by Formula 1 exhibits an effect of inhibiting NLRP3 inflammasome activity by inhibiting the expression of IL-1 ⁇ and caspase 1, which are key components of NLRP3 inflammasome signaling.
  • the present invention relates to a composition for inhibiting NLRP3 inflammasome activity, comprising the compound represented by Formula 1, an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compound represented by Formula 1 may be a compound represented by any one of the formulas selected from the group consisting of Formulas 1-1 to 1-12, but is not limited thereto. .
  • the term “inhibition” refers to a phenomenon in which biological activity or signal activity is reduced due to deficiency, dissonance, or many other causes, and partially or completely blocks, reduces, prevents, or activates the activity of NLRP3. delay, inactivation, or downregulation.
  • the term “inhibitor” refers to a molecule that partially or completely inhibits the effect of another molecule, such as a receptor or intracellular mediator, by any mechanism.
  • the NLRP3 inflammasome inhibitory composition is used in the same sense as the NLRP3 inflammasome inhibitor.
  • the inhibition of the inflammasome activity means a modification in vivo that causes a decrease in the inflammasome activation of a target cell, etc., for the purpose of the present invention, the inhibition of the inflammasome production, cytokines caused by the inflamasome inhibition of production or inhibition of ASC oligomer formation.
  • the composition according to the present invention may inhibit inflammasome activity through inhibition of ASC polymer formation, which corresponds to the stage prior to inflammasome generation, but is not limited thereto.
  • NLRP3 inflammasome is one of the key components of the innate immune system and is associated with inflammatory responses through IL-1 ⁇ IL-18 and caspase 1 in AD pathogenesis (M. Saresella et al. , Mol Neurodegener ). 11, 23 (2016)). Activation of the NLRP3 inflammasome is triggered by three major signals: mitochondrial reactive oxygen species generation, potassium efflux, and cathepsin release after lysosomal destabilization. (L. Gao et al. , Inflamm Res 66, 17-24 (2017)). Once activated, the NLRP3 inflammasome forms a molecular platform to activate caspase 1.
  • NLRP3 inflammasome a major source of NLRP3 inflammasome expression and have been reported as the major cell type in the brain responsible for IL-1 ⁇ and IL-18 secretion (A. Gustin et al. , PLoS One 10, e0130624 (2015) )). Therefore, targeting the NLRP3 inflammasome is a viable strategy for the treatment of Alzheimer's disease and is the subject of intensive research.
  • the compound represented by Formula 1 inhibited the expression of IL-1 ⁇ and caspase 1, which are key components of NLRP3 inflammasome signaling, and improved the cognitive behavior of mice in the AD mouse model.
  • it can be usefully used as a composition for preventing or treating NLRP3 inflammasome-related inflammatory diseases including AD.
  • the present invention relates to a composition for preventing or treating NLRP3 inflammasome-related inflammatory diseases, comprising the compound represented by Formula 1, an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof will be.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating NLRP3 inflammasome-related inflammatory diseases, comprising administering a compound represented by Formula 1, an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention relates to the use of the compound represented by Formula 1, an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the prevention or treatment of NLRP3 inflammasome-related inflammatory diseases.
  • the present invention relates to the use of a compound represented by Formula 1, an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of NLRP3 inflammasome-related inflammatory diseases.
  • the NLRP3 inflammasome-related inflammatory disease is an abnormal disease that occurs when the inflammasome is abnormally and excessively activated, and is preferably a metabolic disease, a neuroinflammatory disease or an auto-inflammatory disease. , but is not limited thereto.
  • the metabolic disease is a generic term for diseases caused by metabolic disorders in vivo, preferably obesity, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, arteriosclerosis, type 2 diabetes mellitus, nonalcoholic fatty liver (NAFLD) or It may be characterized as non-alcoholic steatohepatitis (NASH), and more preferably, it may be characterized as type 2 diabetes or arteriosclerosis, but is not limited thereto.
  • diseases caused by metabolic disorders in vivo preferably obesity, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, arteriosclerosis, type 2 diabetes mellitus, nonalcoholic fatty liver (NAFLD) or It may be characterized as non-alcoholic steatohepatitis (NASH), and more preferably, it may be characterized as type 2 diabetes or arteriosclerosis, but is not limited thereto.
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • the neuroinflammatory disease refers to a disease caused by damage to nerve tissue by an inflammatory response.
  • it may be characterized as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Lou Gehrig's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, diffuse Lewy body disease, leukoencephalitis, temporal lobe epilepsy or inflammatory spinal cord injury, and more
  • it may be Alzheimer's disease, but is not limited thereto.
  • Alzheimer's disease has been reported as an important mechanism of inflammasome activation of microglia, and caspase-1 and IL, which are cytokines generated by the inflammasome in the microglia in animal models of Alzheimer's disease, also The amount of -1 is increased (Emily L. Goldberg and Vishwa Deep Dixit, Immunol Rev. 2015 May;265(1):63-74).
  • the auto-inflammatory disease is a group of diseases in which systemic inflammation is frequently repeated in a state in which autoantibodies or antigen-specific T cells are not found, unlike autoimmune diseases.
  • Muckle-Wells syndrome Preferably Muckle-Wells syndrome (MWS), adult-type delayed autoimmune diabetes (LADA), familial cold autoinflammatory syndrome (FCAS), cryopyrin-associated cyclic syndrome (CAPS), neonatal-onset
  • Certain forms of juvenile arthritis such as multisystem inflammatory syndrome (NOMID), chronic infantile neurocutaneous joint (CINCA) syndrome, familial Mediterranean fever (FMF), systemic onset juvenile idiopathic arthritis (SJIA), certain forms of arthritis, such as systemic onset juvenile idiopathic rheumatoid arthritis It can be characterized as, but not limited to, a form of juvenile rheumatoid arthritis or a specific form of adult rheumatoid arthritis.
  • prevention refers to any act of inhibiting or delaying NLRP3 inflammasome-related inflammatory diseases by administration of a pharmaceutical composition comprising the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof. it means.
  • treatment means that the symptoms of NLRP3 inflammasome-related inflammatory disease are improved or cured by administration of a pharmaceutical composition comprising the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof. means any action.
  • composition for preventing or treating NLRP3 inflammasome-related inflammatory disease comprises a pharmaceutically effective amount of the compound represented by Formula 1 alone, or contains one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • the pharmaceutically effective amount refers to an amount sufficient to prevent, improve, and treat the symptoms of NLRP3 inflammasome-related inflammatory disease.
  • the “pharmaceutically acceptable” refers to a composition that is physiologically acceptable and does not normally cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders, dizziness, or similar reactions when administered to humans.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • fillers, anti-agglomeration agents, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • carrier means a substance that facilitates the addition of a compound into a cell or tissue.
  • liquid is defined as a substance that is diluted in water to dissolve the compound as well as to stabilize the biologically active form of the compound.
  • composition of the present invention may include one or more known active ingredients having a therapeutic effect on NLRP3 inflammasome-related inflammatory diseases together with the compound represented by Formula 1 above.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal other than a human.
  • Formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.
  • composition of the present invention may be administered via several routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular, and the dosage of the active ingredient depends on several factors such as the route of administration, the patient's age, sex, body weight, and the severity of the patient. It may be appropriately selected according to the present invention, and the composition according to the present invention may be administered in combination with a known compound having an effect of preventing, ameliorating, or treating the symptoms of NLRP3 inflammasome-related inflammatory disease.
  • the present invention relates to a food composition for the prevention or improvement of NLRP3 inflammasome-related inflammatory diseases, comprising the compound represented by Formula 1, an isomer thereof, or a salt thereof.
  • improvement may include, without limitation, any action in which the symptoms of metabolic disease, neuroinflammatory disease or auto-inflammatory disease are improved or beneficially changed using the food composition of the present invention.
  • the food composition may be preferably a health functional food, and may be a food additive.
  • the health functional food or food additive is preferably a powder, granule, tablet, capsule or beverage, but is not limited thereto.
  • the compound of Formula 1 according to the present invention may be added as it is or may be used together with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • Examples of foods to which the compound of Formula 1 according to the present invention can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, There are beverages, teas, drinks, alcoholic beverages, and vitamin complexes, and includes all foods in the ordinary sense.
  • the food composition of the present invention may be a beverage composition.
  • the beverage composition may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients, like conventional beverages.
  • the above-mentioned natural carbohydrates are monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • natural sweeteners such as taumatine and stevia extract, synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame, and the like can be used.
  • the compound of Formula 1 according to the present invention various herbal extracts, food supplement additives, or natural carbohydrates may be contained as additional ingredients.
  • food supplement additives may be additionally added, and food supplement additives include conventional food supplement additives in the art, for example, flavoring agents, flavoring agents, coloring agents, fillers, stabilizers, and the like.
  • Examples of the natural carbohydrate include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; disaccharides such as maltose, sucrose and the like; and polysaccharides such as conventional sugars such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents tacrine, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic and natural flavoring agents, coloring agents and thickeners (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its salts, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like.
  • it may contain the pulp for the production of natural fruit juices and fruit juice beverages and vegetable beverages. These components may be used independently or in combination.
  • the proportion of these additives is not very important, but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • Example 1-1 Cell lines and reagents
  • THP-1 cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) and 1% penicillin/streptomycin solution (Gibco). grew up Differentiation into macrophages was performed by treatment with 80 nM PMA for 24-48 hours. Cells were cultured at 5% CO 2 and 37° C. in a humidified incubator (Thermo Fisher Scientific, Inc.). LPS (Escherichia coli 0111: B4) and PMA were purchased from Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). Nigericin was obtained from InvivoGen (San Diego, CA, USA).
  • FBS fetal bovine serum
  • PMA penicillin/streptomycin solution
  • Example 1-2 Cell viability analysis
  • THP-1 10 5 /well; 24 h cells were differentiated overnight with PMA (80 nM) in 96-well plates (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) and various concentrations of test compounds was treated for 24 hours. After that, the medium was replaced with 100 ⁇ L well MTT solution (10%) and the cells were incubated at 37° C. for 3 hours. This solution was replaced with 100 ⁇ L/well dimethyl sulfoxide (DMSO) and the plate was further incubated at 37° C. for 30 minutes. Plates were read at a wavelength of 540 nm in a microplate reader (Molecular Devices, Silicon Valley, California).
  • THP-1 cells (10 5 /well) were differentiated with PMA (80 nM, 48 h) in 96-well plates (BD Biosciences). Differentiated macrophages were primed with LPS (10 ng/mL) for 4 hours. Thereafter, cells were treated with the compound in serum-free medium for 1 hour followed by activation of NLRP3 by nigericin for an additional hour. Supernatants were collected and assayed for inhibition of human IL-1 ⁇ secretion using a Human IL-1 ⁇ Uncoated ELISA Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc.). The absorbance of the plate was read using a microplate spectrophotometer system (Molecular Devices).
  • Cytoplasmic proteins were extracted using NE-PERTM Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific, Inc.) and total protein concentration was determined using BCA Assay Kit (Bicinchoninic Acid Assay Kit) (Sigma-Aldrich Co.). did. Proteins were separated by SDS-PAGE and transferred to a membrane using a Mini-PROTEAN Tetra Cell and a Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
  • Membrane was blocked with skim milk (5%) for 1 h, followed by NLRP3, IL-1 ⁇ , mature IL-1 ⁇ (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA), caspase 1 and ⁇ -actin (Santa Cruz Biotechnology Inc.). ., Dallas, TX, USA) was subjected to immunoblotting overnight at 4 °C with an antibody. After washing with PBS supplemented with 0.1% Tween 20, the membrane was washed with peroxidase-conjugated anti-rabbit or anti-mouse IgG antibody for 2 h at room temperature. (1:1000). Visualized protein bands were detected on a ChemiDocTM Touch Imaging System (Bio-Rad Laboratories) using SuperSignal West Pico ECL solution (Thermo Fisher Scientific, Inc.).
  • NIC7 and NIC7w were prepared at a concentration of 10 mM in DMSO and diluted to a concentration of 100 ⁇ M with 100% methanol as a working solution. These NIC7 and NIC7w solutions were diluted with potassium phosphate buffer (pH 7.4) to a concentration of 1 ⁇ M, and then each solution was incubated with 0.5 mg/mL liver microsomes (human) at 37° C. for 5 minutes. The reaction was started by adding a NADPH generating system (3.3 mM glucose-6-phosphate (G6P), 1.3 mM ⁇ + , 3.3 mM MgCl 2 and 0.4 U/mL glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD)) at 37°C.
  • G6P glucose-6-phosphate
  • G6PD glucose-6-phosphate dehydrogenase
  • NIC7 and NIC7w were prepared at a concentration of 10 mM in DMSO and dissolved in methanol at a concentration of 1 mM.
  • the final concentration of organic solvent (methanol) for cocktail culture in all experiments was set to 1.0% (v/v).
  • the concentrations of all substrates in the culture mixture are listed in Table 2.
  • CYP450 enzymes were used to evaluate the effects of NIC7, NIC7w and MCC950.
  • the relevant substrates along with the concentrations used and the metabolites produced are listed in the table above.
  • NIC7 and NIC7w were used at 10 ⁇ M, and pooled human liver microsomes were assayed at 0.25 mg/mL concentration.
  • the substrate cocktail solution was incubated with microsomes at 37°C for 5 min.
  • the reaction was started by adding a NADPH generating system (as described in Examples 1-5) at 37° C. and 1300 rpm.
  • the reaction was stopped at 10 min by addition of cold acetonitrile containing carbamazepine as an internal standard at 20 ng/mL. After vortexing and centrifugation, the supernatant was analyzed by LC-MS/MS. All microsomal incubations were performed in triplicate.
  • Example 1-7 LC-MS/MS (Liquid Chromatograph-Tandem Mass Spectrometer) analysis
  • acetonitrile containing 20 ng/mL internal standard was added to a 50 ⁇ L aliquot of each biological sample. After vortexing and centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes, 10 ⁇ L of the supernatant was analyzed by LC-MS/MS.
  • a reverse phase C 18 column (BEH C 18 , 2.1 mm ⁇ 100 mm id, 1.7 ⁇ m; Waters, Ireland) in the LC system was maintained at 4°C.
  • the composition of the mobile phase was changed from 80% of 0.1% formic acid in water for 3 minutes to 80% of 0.1% formic acid in acetonitrile for 3 minutes, then 0.1% formic acid in water 80% for 3.1 minutes, 0.5 mL/min for 5 min.
  • Changes in spatial cognitive behavior were assessed using a Y-maze apparatus in which three horizontal identical arms (35 cm long ⁇ 15 cm high ⁇ 5 cm wide) were arranged symmetrically at 120° to each other. Assessments were performed in the Y-maze test 7 days after A ⁇ injection. After introduction into the Y-maze, each animal was allowed to move freely for 2 minutes and then measured for 5 minutes. Subjects showed a tendency to enter different arms than they had previously visited. The arm input and number of triads were recorded to calculate the rate of rotation. An item is defined as the presence of all four limbs within a particular maze arm.
  • the new object recognition test was performed in an open field box containing two identical objects. Animals were initially accustomed to this same object for 2 minutes, after which one of the objects was replaced with a new object and read for 5 minutes. The time spent on the same object (tA) and the time spent on a new object (tB) were calculated, and the recognition index ratio was calculated using the formula (t B /(t A + t B )) ⁇ 100.
  • FP bit-packed MACCS structure key
  • FP bit-packed MACCS structure key
  • each molecule is represented by a bit vector that codes for the presence or absence of a structural feature, where a specific bit position is assigned to each feature.
  • MOE in-house support vector language (SVL) scripts were used to identify chemical structures with at least 60-75% similarity to a selected set of NLRP3 antagonists (Table 4).
  • the ligands were tested for fingerprint-based similarity searches and pharmacophore generation for multiple structural compound libraries.
  • TC similarity metric
  • a and B are both fingerprints, and “#” indicates the number of features in each fingerprint.
  • the resulting ligands were stored in a separate library for further screening.
  • Example 1-12 In silico (computer programming in virtual experiment) Preparation of protein structure
  • the cryo-EM structure of human NLRP3 [PDB ID: 6NPY] (H. Sharif et al. , Nature 570, 338-343 (2019)) was complexed with NEK7 and searched in the PDB. Unnecessary ligands including water present in the structure were removed. The structure was protonated at pH 7.0 and the energy was minimized through the Amber10: EHT force field until a root mean square gradient of 0.01 was reached.
  • Site I Q636, E637, E638, E743, and D748 corresponded to HD2 and LRR of NLRP3
  • site II I149, E150, L162, R165, Y166, A225, A226, G227, I228, G229, K230, T231)
  • Docking was performed using the triangle matcher placement method and the London dG scoring function.
  • Ligand poses were re-recorded using the MMFF94x force field and GBVI/WSA dG scoring function. Residues of NLRP3 remained immobilized and the ligand remained flexible during docking calculations. At least 15 different docking poses of each ligand were stored and ranked according to the binding affinity S-score. Each docking round was repeated with an induced-fit docking method, in which both the ligand and receptor side chains were able to adjust their conformation to obtain an optimal fit. For experimental validation of NLRP3 antagonistic activity, the 19 matched ligands with the highest scores in both rigid and induced-fit docking rounds were selected.
  • NIC7 A structural derivative of the initial lead, NIC7, was retrieved from the MolPort database.
  • ligands characterized by structural similarity of 85-95% to the parent scaffold, NIC7 were considered.
  • About 100 ligands were downloaded as SDF files and converted to PDB format in MOE software. Energy was minimized using the same protocol used to wash the ligand and prepare the initial screening library mentioned above.
  • Derivatives were docked and ranked according to the binding score of NLRP3 to site I and site II using the same docking parameters as described in Examples 1-14.
  • the top-scoring 25 ligands that fit best in the pocket and show the maximum interaction were selected for experimental validation of antagonistic activity.
  • NIC7(N-(5-(3-(3-acetylphenyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide) derivatives NIC7a to NIC7y are as follows:
  • NIC7a 4-methyl-N-(5-(3-phenethylureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide (4-methyl-N-(5-(3-phenethylureido) benzo[ d ]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide)
  • the NMR data are as follows:
  • NIC7b to NIC7y were synthesized with reference to the synthesis process of NIC7a.
  • NIC7b N-(5-(3-(4-ethoxyphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide (N-(5-(3-(4-ethoxyphenyl) ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide)
  • NIC7c ethyl ((2-((4-methylphenyl)sulfonamido)benzo[ d ]thiazol-5-yl)carbamoyl)glycinate (ethyl ((2-((4-methylphenyl)sulfonamido) benzo[ d ]thiazol-5-yl)carbamoyl)glycinate)
  • NIC7d methyl 3-(3-(2-((4-methoxyphenyl)sulfonamido)benzo[ d ]thiazol-5-yl)ureido)benzoate (methyl 3-(3-(2) -((4-methylphenyl)sulfonamido)benzo[ d ]thiazol-5-yl)ureido)benzoate)
  • NIC7e N-(5-(3-(3-methoxybenzyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide (N-(5-(3-( 3-methoxybenzyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
  • NIC7f N-(5-(3-(2-methoxyphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide (N-(5-(3-( 2-methoxyphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
  • NIC7g N-(5-(3-(3,4-dimethoxyphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide (N-(5-(3) -(3,4-dimethoxyphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
  • NIC7h N-(5-(3-(5-chloro-2-methoxyphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide (N-(5-(3-( 5-chloro-2-methoxyphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide)
  • NIC7i N-(5-(3-(2,5-dimethoxyphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide (N-(5-(3-(2, 5-dimethoxyphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide)
  • NIC7j methyl 3-(3-(2-(phenylsulfonamido)benzo[ d ]thiazol-5-yl)ureido)benzoate (methyl 3-(3-(2-(phenylsulfonamido)benzo[ d ]thiazol-5-yl)ureido)benzoate)
  • NIC7k 4-methyl-N-(5-(3-(4-methylbenzyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide (4-methyl-N-(5-( 3-(4-methylbenzyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide)
  • NIC71 N-(5-(3-(benzo[ d ][1,3]dioxol-5-yl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide (N-(5-(3-(benzo[ d ][1,3]dioxol-5-yl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
  • NIC7m N-(5-(3-(2-methoxy-5-methylphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide (N-(5-( 3-(2-methoxy-5-methylphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
  • NIC7n N-(5-(3-(3,5-dimethoxyphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide (N-(5-(3) -(3,5-dimethoxyphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
  • NIC7o N-(5-(3-(3-chloro-4-fluorophenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide (N-(5- (3-(3-chloro-4-fluorophenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
  • NIC7p 4-methyl-N-(5-(3-(p-tolyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide (4-methyl-N-(5-(3) -(p-tolyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide)
  • NIC7q N-(5-(2-methoxyethyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide (N-(5-(3-(2-methoxyethyl) )ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
  • NIC7r N-(5-(3-(2,4-dimethoxyphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide (N-(5-(3) -(2,4-dimethoxyphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
  • NIC7s N-(5-(3-(2,5-dimethoxyphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide (N-(5-(3) -(2,5-dimethoxyphenyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
  • NIC7t N-(5-(3-(3-methoxyphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide (N-(5-(3-( 3-methoxyphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
  • NIC7v N-(5-(3-(4-fluorobenzyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide (N-(5-(3-(4-fluorobenzyl) ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide)
  • NIC7w N-(5-(3-benzylureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide (N-(5-(3-benzylureido)benzo[ d ]thiazol -2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
  • NIC7x N-(5-(3-(3,4-dimethoxyphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide (N-(5-(3-(3, 4-dimethoxyphenyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide)
  • NIC7y N-(5-(3-(3-ethoxypropyl)ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide (N-(5-(3-(3-ethoxypropyl) ureido)benzo[ d ]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide)
  • MTT (1-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan) assay.
  • Human monocyte cells THP-1
  • PMA phorbol 12-myristate 13-acetate
  • NIC1-NIC19 10 or 50 ⁇ M of the compound to be screened
  • NIC1, NIC2, NIC6, NIC14, and NIC17 showed significant toxicity at high concentrations ( FIGS. 3A and 3B ).
  • the remaining compounds were tested for functional activity in terms of inhibition of interleukin-1 ⁇ secretion by NLRP3.
  • THP-1 cells were primed by activating the Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling pathway with the ligand lipopolysaccharide (LPS), and after compound treatment with MCC950 as a positive control, nigericin ( nigericin) activated NLRP3.
  • TLR4 Toll-like receptor 4
  • LPS ligand lipopolysaccharide
  • NIC7 showed the highest efficacy (Fig. 3c). Therefore, NIC7 was evaluated as a suitable lead compound for further optimization to enhance the inhibitory efficacy on NLRP3.
  • NIC7 a primary precursor, on the NLRP3 signaling pathway.
  • MolPort database https://www.molport.com/shop/index
  • NIC7a-NIC7y The top 25 derivatives (designated “NIC7a-NIC7y”) that scored higher than NIC7 and showed maximal interaction within 4.5 ⁇ were selected and tested for their NLRP3 blocking function by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • NLRP3 has been reported to be associated with various hippocampal neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease (RH Pirzada, et al., Genes (Basel) 11 (2020)).
  • NIC7 an NLRP3 inflammasome inhibitor.
  • the Y-maze test for AD mouse model was used to investigate spatial working memory and total arm entries were used to calculate the rate of spontaneous alternation.
  • FIGS. 6a and 6b Considering the involvement of the hippocampus in cognitive memory in addition to spatial working memory (NJ Broadbent, et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 14515-14520 (2004)), a novel object recognition test was also performed. Similar to the above results, better recognition index rates were confirmed in NIC7 and donepezil-treated mice than in vehicle-treated or untreated mice ( FIG. 6c ).
  • Metabolic stability assays determine the temporal intrinsic clearance of test compounds by incubation with microsomes or hepatocytes (LE Chovan, et al., Rapid Commun Mass Spectrom 18, 3105-3112 (2004)). . In the case of NIC7w, the amount of drug remaining after 30 minutes of metabolism increased by 29.8% more than that of NIC7, improving metabolic stability (Table 5).
  • cytochrome P450 inhibition assay is used to assess inhibition of cytochrome P450 enzymes to determine drug interactions (SA Testino, Jr., G. Patonay, J Pharm Biomed Anal 30, 1459-1467 (2003) )).
  • NIC7 and NIC7w in five enzymes of the P450 system including CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 and CYP3A4, were tested with the relevant substrates and concentrations listed in Table 2 above.
  • the pharmacological properties of both compounds were verified by confirming that both NIC7 and NIC7w act mainly on the CYP2C9 enzyme and have little effect on other types of CYP enzymes (Table 5).
  • Example 6 Combined mode of NIC7 and NIC7w
  • NIC7 The initial lead material, NIC7, and its chemical derivatives, contained sulfonamide and urea moieties (Fig. 7), indicating important functional groups commonly found in NLRP3 inflammasome inhibitors and antidiabetic drugs.
  • NIC7w the most effective of all derivatives, contains a 1-benzyl group with a urea group attached to the 3-benzothiazol-5-yl moiety (Fig. 8), which can ensure a stronger inhibitory activity against the NLRP3 inflammasome.
  • Fig. 8 3-benzothiazol-5-yl moiety
  • NIC7 The interaction of NIC7 showed that the central benzothiazole moiety was stabilized by the charged amino acid residues R697, E637, E638 and D646 (Fig. 9a). It was found that the nitrogen atom of the urea group forms a hydrogen bond with the carboxyl side chain of E695. Furthermore, methylbenzenesulfonamide is bound by hydrophobic residues L699 and G696 and polar residues H698. Acetylphenyl groups are inside the buried surface of the hydrophobic residues L628, L632, F648, M685 and P649. In addition, several other charged, polar and non-polar moieties can stabilize ligands through van der Waals and salt bridge interactions.
  • a benzothiazole moiety in NIC7w was found to form charged contacts with E695 and R697 and electrostatic interactions with H698, P707 and S721.
  • Methylbenzenesulfonamide moieties are stacked between the charged residues E637, E638, E695, D639 and R697 ( FIG. 9B ).
  • a hydrogen bond is formed between the oxygen atom of the sulfonamide group and the amino group of E638.
  • the benzyl and urea groups interact closely with K694, N720, E743, R772 and W774 and may provide more stability.
  • residues L632, Q636, M645, E693, H722 and D745 were found within a 5 ⁇ radius around NIC7w to support stability through electrostatic and van der Waals interactions.
  • NLRP3 inflammasome inhibitory small molecule has not been successful as a therapeutic agent for the treatment of Alzheimer's disease in human clinical trials.
  • the NLRP3 inflammasome inhibitory compound NIC7 C 23 H 20 N 4 O 4 S 2
  • its derivative NIC7w C 22 H 2 0N 4 O 3 S 2

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Abstract

본 발명에서는 NLRP3 인플라마좀을 억제하는 새로운 소분자 억제제인 NLRP3 억제 화합물 7(NIC7) 및 강력한 유도체 NIC7w가 확인되었다. 구체적으로, 이들은 NLRP3 신호전달 경로의 주요 구성요소, 즉 IL-1β 및 카스파제 1을 억제하였으며, AD의 마우스 모델에서 마우스의 인지 행동의 개선을 나타냈다. 전반적으로, NIC7 및 NIC7w가 알츠하이머병에서 NLRP3 인플라마좀 억제에 관한 잠재적인 치료제임을 시사한다.

Description

알츠하이머병 치료를 위한 NLRP3 인플라마좀 소분자 억제제
본 발명은 NLRP3 인플라마좀(inflammasome) 활성을 억제하는 기능이 있는 소분자 화합물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 화학식 1로 표시되는 소분자 화합물과 이를 포함하는 NLRP3 인플라마좀 활성 억제용 조성물 및 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
인플라마좀(inflammasome)은 패턴 인식 수용체를 통해 병원체를 탐지하는 선천성 면역계의 다중 단백질 복합체이며 염증 반응의 활성화를 담당한다(M. R. de Zoete, et al., Cold Spring Harb Perspect Biol 6, a016287 (2014)). 인플라마좀의 핵심 구성요소는 뉴클레오타이드 결합 올리고머화 도메인 유사 수용체(nucleotide-binding oligomerization domain(NOD)-like receptors; NLRs)이며, 흑색종 2 유사 수용체(melanoma 2 (AIM2)-like receptors), 피린 수용체(pyrin receptors) 및 효소 성분(카스파제 1(caspase 1))에는 없다. 이러한 구성요소 외에도 대부분의 인플라마좀에는 ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain)라는 어댑터 단백질이 포함되어 있다(H. Guo, et al., Nat Med 21, 677-687 (2015)). 현재까지 NLR 피린 도메인 함유(NLRP1, NLRP2, NLRP3, NLRP6, NLRP7 및 NLRP12), NLR 계열 CARD 도메인 함유 단백질 4(NLR family CARD domain-containing protein 4; NLRC4), 인터페론 유도성 단백질 16(Interferon-inducible protein 16; IFI16)과 같은 여러 유형이 보고되었다(M. Lamkanfi, V. M. Dixit, Cell 157, 1013-1022 (2014)).
가장 널리 연구된 인플라마좀 유형인 NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain [NOD]-like receptor family, pyrin domain-containing 3)는 중추 신경계의 여러 복잡한 질병과 관련이 있다(K. Zhou, et al., J Immunol Res 2016, 9238290 (2016)). NLRP3 스캐폴드(scaffold)의 핵심 구성요소는 CARD(ASC)와 전구체 효소 프로카스파제(pro-caspase 1)로 구성된다. 위험 자극을 감지하면 NLRP3는 ASC에 결합하고 시스테인 프로테아제 카스파제 1(cysteine protease caspase 1)과 상호작용하여 인플라마좀을 조립한다. 이것은 카스파제 1 활성화를 초래하고, 이어서 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokines) IL-1β및 IL-18의 성숙 및 분비를 초래한다(K. Schroder, J. Tschopp, Cell 140, 821-832 (2010)). 또한 카스파제 1 활성화는 직접(파이롭토시스(pyroptosis)로 알려진 과정을 통해) 또는 간접적으로(아포토시스(apoptosis)를 통해) 세포의 사멸을 매개할 수 있다(V. Sagulenko et al., Cell Death Differ 20, 1149-1160 (2013)). 표준 NLRP3 인플라마좀 외에, 비표준(noncanonical) NLRP3 인플라마좀도 관심 개발 분야이다. 후자의 유형은 쥐에서 카스파제 11에 의해 형성된다. 그럼에도 불구하고 인간은 카스파제 11을 발현하지 않으며, 최근 연구 결과에 따르면 인간 세포에서 이들의 오소로그(orthologs)는 유사한 역할을 하는 카스파제 4와 카스파제 5라는 것이 밝혀졌다(J. Shi et al., Nature 514, 187-192 (2014)). NLRP3 인플라마좀 활성화는 여러 세포 메커니즘과 세포 골격 시그니처(cytoskeletal signatures)를 통해 구현될 수도 있다. 최근 연구에서는 NIMA 관련 키나아제 7(NEK7)이 세포주기 진행에 관여하는 단백질인 NLRP3 인플라마좀의 새로운 조절 자로 확인되었다. NEK7이 NLRP3의 류신이 풍부한 반복(leucine-rich repeat; LRR) 도메인과 상호작용하면 키나아제 활성과 관계없이 NLRP3 인플라마좀을 활성화한다(Y. He, et al.. Nature 530, 354-357 (2016)). 최근 개발은 다양한 인플라마좀이 활성화되고 질병의 시작 또는 진행에 관여하는 분자 메커니즘에 대한 지식을 크게 향상 시켰다. 또한, NLRP3는 대사 장애(metabolic disorders; 비만(obesity), 통풍(gout), 제2형 당뇨병(type 2 diabetes mellitus) 및 죽상동맥경화증(atherosclerosis)) 및 신경 퇴행성 질환(neurodegenerative diseases; 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury), 다발성 경화증(multiple sclerosis) 및 파킨슨 병(Parkinson's disease))을 포함한 여러 자가면역(autoimmune) 및 자가염증 질환(autoinflammatory diseases)에 영향을 준다(T. Strowig, et al., Nature 481, 278-286 (2012)).
AD의 발달에 NLRP3 인플라마좀의 관여는 카스파제 1 및 NLRP3 결핍과 함께 만성 아밀로이드-β(Aβ침착을 보이는 형질 전환(APP/PS1) 마우스에서 입증되었다. 이 마우스는 Aβ분비 감소와 인지 기능 장애(cognitive dysfunction) 및 신경염증(neuroinflammation)을 특징으로 한다. 카스파제 1의 발현은 알츠하이머병 환자의 뇌에서도 보고되었는데, 이는 인간의 인플라마좀 활성화와 알츠하이머병 사이의 상관관계를 나타낸다(M. T. Heneka et al., Nature 493, 674-678 (2013)). 따라서 이러한 연구는 NLRP3 인플라마좀이 신경염증 및 AD 치료를 위한 잠재적인 치료 표적임을 보여주었다.
항체 카나키누맙(canakinumab), 아나킨라(anakinra), 릴로나셉트(rilonacept)를 포함한 여러 생물학적 치료제는 NLRP3 관련 질병의 치료를 위해 인플라마좀 제품 IL-1βIL-1RA 및 IL-18을 표적으로 한다(C. A. Dinarello, J. W. van der Meer, Semin Immunol 25, 469-484 (2013)). 글리부라이드(Glyburide), 파테놀라이드(parthenolide), Bay11-708, 오라노핀(auranofin), CRID3 및 베타 하이드록시부티르산(βBHB)를 포함한 NLRP3 인플라마좀의 여러 소분자 억제제가 보고되었지만, 이러한 억제제 중 일부는 비특이적이고 제한된 효능을 가지고 있다(E. Isakov, P. Weisman-Shomer, M. Benhar, Biochim Biophys Acta 1840, 3153-3161 (2014)). 또한 MCC950은 최근 나노 몰 농도에서 표준 및 비정규 NLRP3 인플라마좀을 차단하는 고도로 선택적인 NLRP3 인플라마좀 억제제로 확인되었다(R. C. Coll et al., Nat Med 21, 248-255 (2015)). 또 다른 연구에서는 소분자 NLRP3 억제제인 JC-124를 확인하고 트랜스제닉 마우스(TgCRND8)의 AD 관련 결핍에 대해 테스트하였다(J. Yin et al., Mol Neurobiol 55, 1977-1987 (2018)). 종합적으로, 이러한 데이터는 AD에 대한 잠재적인 치료법으로 NLRP3 인플라마좀 억제제의 개발을 시사한다.
이에, 본 발명자들은 새로운 NLRP3 인플라마좀 억제제를 개발하고자 예의 노력한 결과, NLRP3 억제 화합물 7(NLRP3 inhibitory compound 7; NIC7)로 정의된 소분자 제제 및 이의 강력한 유도체 NIC7w를 확인하였다. 또한, in vitro 실험을 통해 NIC7과 NIC7w 모두 NLRP3 인플라마좀을 억제하고 카스파제 1과 IL-1β의 발현을 방지하는 것을 확인하였으며, AD의 마우스 모델에서 NIC7의 in vivo 활성 및 마우스의 인지 행동의 상당한 개선을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 NLRP3 인플라마좀(inflammasome) 활성을 억제하는 기능이 있는 소분자 화합물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 소분자 화합물을 포함하는 NLRP3 인플라마좀 활성 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 소분자 화합물을 포함하는 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 소분자 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 소분자 화합물의 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 소분자 화합물의 사용을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 소분자 화합물을 포함하는 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000001
상기 화학식 1에서 R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐원자, 치환 또는 비치환 탄화수소(hydrocarbon) 그룹, 치환 또는 비치환 이종(heterogeneous) 그룹, 치환 또는 비치환 탄소고리(carbocyclic) 그룹, 치환 또는 비치환 헤테로고리(heterocyclic) 그룹, 치환 또는 비치환 방향족(aromatic) 그룹 및 치환 또는 비치환 헤테로방향족(heteroaromatic) 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 소분자 화합물을 포함하는 NLRP3 인플라마좀 활성 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 소분자 화합물을 포함하는 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 소분자 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 소분자 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 소분자 화합물의 사용을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 소분자 화합물을 포함하는 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
도 1은 기본 선도물질 동정을 위한 가상 스크리닝 워크 플로우의 전체 요약 모식도이다. 박스에 기재된 숫자는 다음 단계로 넘어간 리간드의 수를 나타낸다. 후속 약물단(pharmacophore) 스크리닝 리간드는 독립적인 고정 및 유도 맞춤(rigid and induced-fit) 도킹에 대한 투입 물질이었다.
도 2는 분자 도킹을 위해 고려된 NLRP3의 두 사이트를 나타낸 것으로, 도 2(a)는 NLRP3의 NEK7 결합 부위에 해당하는 NLRP3의 사이트 I(HD2 도메인 및 LRR)을 나타낸 것이며, 도 2(b)는 NLRP3의 NACHT 도메인 및 ADP 결합 부위에 해당하는 사이트 II를 나타낸 것이다. LRR은 청록색, HD2는 갈색, HD1은 녹색, 날개달린 나선 도메인(WHD)은 자주색, NBD는 파란색으로 나타냈으며, 각 패널의 오른쪽에 결합 부위를 자세히 나타냈다.
도 3은 NLRP3 억제제의 기능적 스크리닝을 나타낸 것으로, 도 3(a, b)는 MTT 분석을 수행하여 표시된 농도에서 24시간 동안 처리한 후 PMA-분화 THP-1 세포에 대한 화합물의 독성을 나타낸 그래프이다. 도 3(c)는 IL-1β의 분비 수준을 확인하여 무독성 화합물에 의한 NLRP3 억제를 평가한 그래프로, PMA-분화 THP-1 세포를 LPS(10ng/mL)로 4시간 동안 프라이밍한 다음 표시된 농도에서 1시간 동안 화합물로 처리하였으며, 세포를 니제리신(nigericin)(10μM)으로 1시간 처리하여 NLRP3를 활성화하고, ELISA를 이용하여 상층액을 수집하여 사이토카인 수준을 확인하였다. 제시된 데이터는 3회 독립적인 실험(각 실험은 2번 반복 수행됨)의 평균이며, 통계 분석은 two-tailed paired Student's t-test(*P < 0.05)를 사용하여 수행되었다.
도 4는 NIC7 유도체의 세포독성을 나타낸 것으로, 도 4(a, b)는 MTT 분석을 수행하여 표시된 농도에서 24시간 동안 처리한 후, PMA-분화 THP-1 세포에 대한 화합물의 독성을 나타낸 그래프이다. 제시된 데이터는 3회 독립적인 실험(각 실험은 2번 반복 수행됨)의 평균이며, 통계 분석은 two-tailed paired Student's t-test(*P < 0.05)를 사용하여 수행되었다.
도 5는 NIC7 유도체의 기능적 스크리닝을 나타낸 도면이다.
도 5(a-c)는 IL-1β의 분비 수준을 확인하여 무독성 화합물에 의한 NLRP3 억제를 평가한 결과로, PMA-분화 THP-1 세포를 LPS(10ng/mL)로 4시간 동안 프라이밍한 다음, 표시된 농도에서 1시간 동안 화합물로 처리했다. 세포를 니제리신(nigericin)(10μM)으로 1시간 처리하여 NLRP3를 활성화하고, ELISA를 이용하여 상층액을 수집하여 사이토카인 수준을 확인하였다. 표시된 데이터는 3회 독립적인 실험(각 실험은 2번 반복 수행됨)의 평균이며, 통계 분석은 two-tailed paired Student's t-test(*P < 0.05)를 사용하여 수행되었다. 도 5(d)는 NIC7w(10μM), NIC7(10μM) 또는 MCC950(1μM)에 의한 NLRP3 신호 전달 경로의 억제를 웨스턴 블롯팅(western blotting)으로 평가한 결과로, PMA-분화 THP-1 세포를 상기 기재한 바와 동일하게 처리하고 총 단백질을 추출한 다음, IL-1β카스파제 1, NLRP3 및 β에 특이적인 1차 항체로 면역블롯팅(immunoblotting)하였다. β은 내부 통제(internal control) 역할을 했다.
도 6은 AD 모델에서 인지 장애로부터의 회복을 나타낸 도면으로, AD 모델은 day 7에 Aβ1-42(검정색 화살표)를 주입하여 생성시켰으며, NIC7(100nmol/g), 도네페질(donepezil)(1mg/kg) 또는 DMSO를 비히클(vehicle, 1%)로 day 0(빨간색 화살표)에 3일/주 동안 복강 내 투여하였다.
도 6(a, b)에서, 공간 작업 기억은 각 그룹의 Y-미로 테스트(n = 6)에서 자발적 교대 속도(spontaneous alternation rate) (도 6a) 및 총 팔 항목(total arm entries) (도 6b) 측면에서 평가되었다. 도 6(c)는 인식 기억을 나타낸 것으로, 새로운 물체 인식 테스트를 사용하여 평가하였으며, 데이터는 각 그룹에 대한 인식률로 표시된다. 도 6(d)는 각 그룹의 체중을 나타낸 것으로, 표시된 시점에서 평가되었다. two-tailed paired Student's t-test(*P < 0.05)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다.
도 7은 초기 활성 리간드의 2차원 구조이며, 초기 활성 리간드의 2차원 구조는 세포 기반 분석에서 확인되었다. NIC7은 NLRP3 억제 능력을 가진 예비 유효물질(hit)로 확인되었다.
도 8은 NIC7 활성 유도체의 2차원 구조이며, NIC7 활성 유도체의 2차원 구조는 세포 기반 분석에서 확인되었다. 모든 유도체 중에서 NIC7w가 가장 강력한 NLRP3 억제제인 것으로 확인되었다.
도 9는 NIC7 또는 NIC7w와 NLRP3의 상호작용을 나타낸 것이다.
도 9(a)는 HD2의 NIC7 및 NLRP3의 LRR 바인딩 모드를 나타낸 것이며, 리간드 주변의 5Å잔기와의 자세한 상호작용에 대한 확대보기가 오른쪽에 표시된다. 도 9(b)는 NIC7w와 NLRP3의 HD2 및 LRR의 결합을 나타낸 것으로, 오른쪽에는 리간드의 5Å내에서 발생하는 자세한 상호작용의 확대보기가 제공된다. LRR은 청록색, HD2는 갈색, HD1은 녹색, WHD는 자주색, NBD는 파란색으로 표시되었으며, 리간드는 스틱 모델로 제공된다. 수소 결합은 점선으로 표시되며, 숫자는 옹스트롬(Å단위의 거리를 나타낸다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, NLRP3 인플라마좀의 소분자 억제제(NIC7)가 AD 모델에서 마우스의 인지 행동을 크게 향상 시킨다는 in vitro 및 in vivo 증거를 모두 제공한다. NLRP3 인플라마좀의 활성화 및 후속적인 카스파제 1 및 IL-1β의 분비도 NIC7 투여에 의해 약화되었다.
본 발명자들은, 인실리코(in silico) 가상 스크리닝을 통해 대규모 다중 구조 화학 라이브러리를 사용하여 NLRP3 인플라마좀의 특정 작은 분자 억제제를 동정하는 것을 목표로 했다. 세포 기반 바이오어세이(cell-based bioassay)에서 고득점 가상 유효물질(hits) 세트에 대한 실험적 검증을 통해, NIC7이라 명명한 화합물이 NLRP3 인플라마좀, 카스파제 1 및 IL-1β의 큰 억제를 유발하는 것을 확인하였다. NIC7의 주요 스캐폴드(scaffold) 주변에 변형이 있는 구조적 유도체에 대한 후속 평가를 통해, 아날로그(analog)(NIC7w로 명명)가 용량 의존적 방식(dose-dependent manner)으로 NLRP3 인플라마좀, 카스파제 1 및 IL-1β분비를 NIC7보다 더 강력하고 현저하게 억제하는 것을 확인하였다.
최근에는 NLRP3 인플라마좀을 직접 또는 간접적으로 표적으로 삼는 MCC950, VX-765, JC-124 및 PLX3397과 같은 여러 약리학적 제제가 개발되었다(R. Kuwar et al., J Neuroinflammation 16, 81 (2019)). 그럼에도 불구하고, 특정 억제제는 소분자 조절제(small-molecule modulator)에 결합된 NLRP3의 결정 구조를 이용할 수 없다는 점에 의해 제한된다. 컴퓨터 약물 발견 원리는 수용체에 대한 결합 부위의 정확한 결정에 크게 의존하며, 이는 도킹 결과의 해석을 어렵게 만든다. 상동성 모델링(homology modeling)이나 정량적 구조-활동 관계 모델링(quantitative structure-activity relationship modeling)과 같은 대안적 접근 방식이 존재하지만 이러한 접근 방식의 정확성은 여전히 논의되고 있다(G. Sliwoski, et al., Pharmacol Rev 66, 334-395 (2014)).
본 발명의 실시예에서는, 인간 NLRP3의 결정 구조가 아직 해결되지 않았기 때문에 NLRP3의 cryo-EM 구조를 사용하였다. 구조 기반 가상 스크리닝의 경우, 사이트 I(NLRP3의 HD2 및 LRR에 해당하고 NEK7-결합 사이트와 겹침) 및 사이트 II(NLRP3의 NACHT 도메인에 해당)의 두 가지 별개의 리간드 결합 사이트를 정의하였다. 참고로 초기 유효물질 NIC7과 강력한 아날로그 NIC7w는 모두 사이트 I이 바인딩 포켓으로 정의된 도킹 라운드에 속한다. cryo-EM 구조에서 HD2 도메인과 그 주변 잔기는 NLRP3에서 중요한 결합 영역으로 보고 되었다(H. Sharif et al., Nature 570, 338-343 (2019)). 이러한 사실을 고려할 때, NLRP3의 사이트 I에 NIC7 또는 NIC7w를 결합하는 것은 매우 합리적인 것을 시사한다.
본 발명의 실시예에서는, 컴퓨터 약물 발견 접근법을 통해 NLRP3 인플라마좀의 특정 억제제(NIC7)와 그 강력한 유사체(NIC7w)를 동정하였다. In vitro 실험은 NIC7과 NIC7w가 모두 카스파제 1과 IL-1β의 발현을 방지한다는 것을 보여주었다. 또한, AD 모델에서 NIC7의 in vivo 활성을 실험하였으며, Y-미로 테스트에서 마우스의 공간 작업 기억을 조사하고, 새로운 물체 인식 테스트를 수행하였으며, 체중을 분석했다. NIC7 및 NIC7w의 대사 안정성 (및 시토크롬 P450 억제)을 확인하여 양성 대조군 화합물과 비교하여 더 나은 반감기와 안정성을 나타내는 것을 확인하였다.
전반적으로, 상기 결과들은 AD 모델에서 마우스의 인지 행동을 개선하는 NIC7의 능력을 보여준다. 이는 NIC7 및 NIC7w가 향후 임상 시험을 위한 유망한 약물 후보로 사용될 수 있음을 시사한다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000002
상기 화학식 1에서 R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐원자, 치환 또는 비치환 탄화수소(hydrocarbon) 그룹, 치환 또는 비치환 이종(heterogeneous) 그룹, 치환 또는 비치환 탄소고리(carbocyclic) 그룹, 치환 또는 비치환 헤테로고리(heterocyclic) 그룹, 치환 또는 비치환 방향족(aromatic) 그룹 및 치환 또는 비치환 헤테로방향족(heteroaromatic) 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 화합물은 토토머로 존재할 수 있고, 비록 하나의 토토머 구조만이 묘사될 수 있지만, 두 토토머 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것을 의미한다.
일반적으로 수소 또는 H와 같은 특정 원소에 대한 언급은, 적절하다면, 해당 원소의 모든 동위원소를 포함하는 것을 의미한다.
용어 "할로겐(또는 할로(halo))"의 구체적인 예로는 플루오린(F), 클로린(Cl), 브로민(Br) 및 아이오딘(I)을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "탄화수소(hydrocarbon) 그룹"은 1개 내지 25개의 탄소 원자, 바람직하게는 1개 내지 12개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 1개 내지 10개의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 1개 내지 8개의 탄소 원자의 사슬을 의미한다. 탄화수소 그룹은 선형 또는 분지형 사슬 구조를 가질 수 있다. 전형적인 탄화수소 그룹은 하나 또는 두 개의 분지, 일반적으로 하나의 분지를 가지고 있다. 일반적으로 탄화수소 그룹은 포화이다. 불포화 탄화수소 그룹은 하나 이상의 이중결합, 하나 이상의 삼중결합 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. 전형적인 불포화 탄화수소 그룹은 1개 또는 2개의 이중결합 또는 1개의 삼중결합을 가지며; 보다 전형적으로 불포화 탄화수소 그룹은 하나의 이중결합을 갖는다.
"불포화"라는 용어가 임의의 그룹과 함께 사용되는 경우, 그룹은 완전히 불포화되거나 부분적으로 불포화될 수 있다. 그러나, 용어 "불포화"가 본원에 정의된 특정 그룹과 함께 사용되는 경우, 용어는 그 특정 그룹의 제한을 유지한다. 예를 들면, 본원에 정의된 "탄소고리 그룹"의 제한에 기초한 불포화 "탄소고리 그룹"은 방향족 그룹을 포함하지 않는다.
용어 "알킬 그룹"이 단독으로 또는 "할로알킬 그룹" 및 "알킬아미노 그룹"과 같은 다른 용어 내에서 사용되는 경우, 예를 들어 1개 내지 약 20개의 탄소 원자, 또는 특정 실시양태에서는 1개 내지 약 12개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 탄소 라디칼을 포괄한다. 이러한 그룹의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소-아밀, 헥실 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "할로알킬 그룹"은 알킬 탄소 원자 중 임의의 하나 이상이 상기 정의된 할로로 치환된 그룹을 포함한다. 구체적으로, 모노할로알킬, 디할로알킬 및 퍼할로알킬을 포함하는 폴리할로알킬 그룹이 포함된다. 예를 들면, 모노할로알킬 그룹은 그룹 내에 아이오도, 브로모, 클로로 또는 플루오로 원자를 가질 수 있다. 디할로 및 폴리할로알킬 그룹은 2개 이상의 동일한 할로 원자 또는 상이한 할로 그룹의 조합을 가질 수 있다. 할로알킬 그룹의 예는 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 클로로메틸, 디클로로메틸, 트리클로로메틸, 펜타플루오로에틸, 헵타플루오로프로필, 디플루오로클로로메틸, 디클로로플루오로메틸, 디플루오로에틸, 디플루오로프로필, 디클로로에틸 및 디클로로프로필을 포함한다.
용어 "하이드록시알킬 그룹"은 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 1개 내지 약 10개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 그룹을 포함하며, 이들 중 어느 하나는 하나 이상의 하이드록실 그룹으로 치환될 수 있다. 이러한 그룹의 예는 하이드록시메틸, 하이드록시에틸, 하이드록시프로필, 하이드록시부틸 및 하이드록시헥실을 포함한다.
용어 "알콕시 그룹"은 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 1개 내지 약 10개의 탄소 원자의 알킬 부분을 각각 갖는 선형 또는 분지형 옥시-포함 그룹을 포함한다. 이러한 그룹의 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시 및 tert-부톡시를 포함한다. 특정 실시양태에서, 저분자량 알콕시 그룹은 1개 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다. "알콕시" 그룹은 추가로 플루오로, 클로로 또는 브로모와 같은 하나 이상의 할로 원자로 치환되어 "할로알콕시" 그룹을 제공한다. 이러한 그룹의 예는 플루오로메톡시, 클로로메톡시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로에톡시, 플루오로에톡시 및 플루오로프로폭시를 포함한다.
용어 "아릴알킬 그룹"은 아릴-치환된 알킬 그룹을 포함한다. 일 실시예에서, 아릴알킬 그룹은 1개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹에 부착된 아릴 그룹을 갖는 "저분자량 아릴알킬" 그룹일 수 있으며, 이러한 그룹의 예는 벤질, 디페닐메틸 및 페닐에틸을 포함한다. 상기 아릴알킬에서 아릴은 추가로 할로, 알킬, 알콕시, 할로알킬 및 할로알콕시로 치환될 수 있다.
용어 "이종(heterogeneous) 그룹"은 탄소 원자 및 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하는 비-수소 구성원 원자의 포화 또는 불포화 사슬을 의미한다. 이종 그룹은 일반적으로 1개 내지 25개의 구성원 원자를 가지고 있다. 바람직하게는, 사슬은 1개 내지 12개의 구성원 원자, 1개 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1개 내지 8개의 구성원 원자를 포함한다. 사슬은 선형 또는 분지형일 수 있다. 전형적인 분지형 이종 그룹은 하나 또는 두 개의 분지, 더 일반적으로 하나의 분지를 가지고 있다. 일반적으로 이종 그룹은 포화이다. 불포화 이종 그룹은 하나 이상의 이중결합, 하나 이상의 삼중결합 또는 둘 다를 가질 수 있다. 전형적인 불포화 이종 그룹은 하나 또는 두 개의 이중결합 또는 하나의 삼중결합을 가지고 있다.
용어 "탄소고리(carbocyclic) 그룹"은 포화 또는 불포화 탄소고리 탄화수소 고리를 의미한다. 탄소고리 그룹은 방향족이 아니다. 탄소고리 그룹은 단일고리 또는 다중고리이다. 다중 탄소고리 그룹은 융합, 스피로 또는 브리지 고리 시스템일 수 있다. 단일 탄소고리 그룹은 고리에 4개 내지 10개의 탄소 원자, 일반적으로 4개 내지 7개의 탄소 원자, 보다 일반적으로는 5개 내지 6 개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 바이사이클릭 탄소고리 그룹은 고리에 8개 내지 12개의 탄소 원자, 일반적으로 9개 내지 10개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
용어 "헤테로고리(heterocyclic) 그룹"은 고리에 탄소 원자 및 1개 이상의 헤테로원자를 포함하는 포화 또는 불포화 고리 구조를 의미한다. 헤테로고리 그룹은 방향족이 아니다. 헤테로고리 그룹은 단일고리 또는 다중고리이다. 다중 헤테로고리 그룹은 융합, 스피로 또는 브리지 고리 시스템일 수 있다. 단일 헤테로고리 그룹은 고리에 4개 내지 10개의 구성원 원자(즉, 탄소 원자 및 적어도 1개의 헤테로원자를 포함), 전형적으로 4개 내지 7개, 및 보다 전형적으로는 5개 내지 6개의 구성원 원자를 포함할 수 있다. 바이사이클릭 헤테로고리 그룹은 고리에 8개 내지 18개의 구성원 원자, 전형적으로 9개 또는 10개의 구성원 원자를 포함할 수 있다. 헤테로고리 그룹의 예로는, 헤테로사이클릴은 아제티디닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로-티에닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리디닐, 옥사졸리디닐, 아이소옥사졸리디닐, 티아졸리디닐, 피페리디닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로티오피라닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 1,1-다이옥소-티오모르폴린-4-일, 아제파닐, 다이아제파닐, 호모피페라지닐, 옥사제파닐, 디하이드로인돌릴, 디하이드로푸릴, 디하이드로이미다졸리닐, 디하이드로옥사졸릴, 테트라하이드로피리디닐, 디하이드로피라닐, 디하이드로벤조퓨라닐, 벤조디옥솔릴, 또는 벤조디옥사닐을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "방향족(aromatic) 그룹" 또는 "아릴(aryl) 그룹"은 하나 이상의 고리를 갖는 방향족 그룹을 의미하며, 여기서 상기 고리는 매달린 방식으로 함께 부착되거나 융합될 수 있다. 일 실시예에서, 방향족 그룹은 1개, 2개 또는 3개의 고리이다. 단일고리 방향족 그룹은 고리에 4개 내지 10개의 탄소 원자, 일반적으로 4개 내지 7개의 탄소 원자, 더욱 일반적으로 4개 내지 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 전형적인 다중고리 방향족 그룹은 2개 또는 3개의 고리를 가지고 있다. 2개의 고리를 갖는 다중고리 방향족 그룹은 고리에 일반적으로 8개 내지 12개의 탄소 원자, 바람직하게는 8개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다. 방향족 그룹의 예는 페닐, 나프틸, 테트라하이드로나프틸, 인다닐, 바이페닐, 페난트릴, 안트릴 또는 아세나프틸을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "헤테로원자"는 탄소 이외의 원자를 의미한다. 일반적으로 헤테로원자는 황, 인, 질소 및 산소 원자로 구성된 군에서 선택된다. 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 그룹은 다른 헤테로원자를 포함할 수 있다.
용어 "헤테로방향족(heteroaromatic) 그룹" 또는 "헤테로아릴(heteroaryl) 그룹"은 하나 이상의 고리를 갖는 방향족 그룹을 의미하며, 여기서 상기 고리는 매달린 방식으로 함께 부착되거나 융합될 수 있고, 여기서 상기 방향족 그룹은 하나 이상의 헤테로원자를 갖는다. 단일고리 헤테로방향족 그룹은 고리에 4개 내지 10개의 구성원 원자, 일반적으로 4개 내지 7개의 구성원 원자, 더욱 일반적으로 4개 내지 6개의 구성원 원자를 포함할 수 있다. 일반적인 다중고리 헤테로방향족 그룹은 2개 또는 3개의 고리를 갖는다. 2개의 고리를 갖는 다중고리 방향족 그룹은 고리에 일반적으로 8개 내지 12개의 구성원 원자, 보다 일반적으로 8개 내지 10개의 구성원 원자를 갖는다. 모노사이클릭 헤테로아릴의 예로는 티아졸릴, 옥사졸릴, 티오페닐, 퓨라닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 이소옥사졸릴, 이소티아졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 트리아지닐, 티아디아졸릴, 테트라졸릴, 옥사디아졸릴, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐 및 이와 유사한 그룹을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비사이클릭 헤테로아릴의 예로는 인돌릴, 아자인돌릴, 인돌리닐, 벤조티오페닐, 벤조퓨라닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조옥사졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤즈티아졸릴, 벤즈티아디아졸릴, 벤즈트리아졸릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퓨리닐, 퓨로피리디닐 및 이와 유사한 그룹을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는, 상기 R1은 수소원자 또는 메틸이고, 상기 R2는 치환 또는 비치환 방향족 그룹, 알킬 그룹, 아릴알킬 그룹 또는 헤테로사이클로알킬 그룹인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 R1 및 R2는 하기의 군에서 선택되는 치환기인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
R1: 수소원자 또는 메틸; 및
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본 발명에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 1-1 내지 화학식 1-12로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 화학식으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 할 수 있다.
[화학식 1-1]
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[화학식 1-2]
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[화학식 1-3]
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[화학식 1-4]
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[화학식 1-5]
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[화학식 1-6]
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[화학식 1-7]
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[화학식 1-8]
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[화학식 1-9]
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[화학식 1-10]
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[화학식 1-11]
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[화학식 1-12]
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본 명세서에서, 상기 화학식 1-1의 화합물은 NIC7(NLRP3 inhibitory compound 7; NLRP3 억제 화합물 7)로 명명되었으며, NIC7의 유도체들인 화학식 1-2 내지 화학식 1-12의 화합물은 각각 NIC7a, NIC7d, NIC7e, NIC7f, NIC7j, NIC7k, NIC7l, NIC7m, NIC7p, NIC7r, NIC7w로 명명되었다(표 1).
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본 발명에 따른 상기 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 아세트산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화합물은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 이성질체, 수화물 및 용매화물을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 상기 화합물은 결정 형태 또는 비결정 형태로 제조될 수 있으며, 화학식 1의 화합물이 결정 형태로 제조될 경우, 임의로 수화되거나 용매화될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 화학식 1로 표시되는 화합물은 NLRP3 인플라마좀 신호전달의 핵심 구성요소인 IL-1β 및 카스파제 1의 발현을 억제하여 NLRP3 인플라마좀 활성을 억제하는 효과를 나타냈다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 NLRP3 인플라마좀(inflammasome) 활성 억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 상기 화학식 1-1 내지 화학식 1-12로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 화학식으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, “억제”는 결핍, 부조화, 그 밖의 많은 원인에 의하여 생물 활동이나 신호 활성이 저하되는 현상을 말하며, NLRP3의 활성을 부분적으로 또는 완전히 블로킹하거나, 감소시키거나, 방지하거나, 활성화를 지연시키거나, 불활성화 시키거나 또는 하향조절하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 “억제제”는 임의의 메커니즘에 의하여, 수용체 또는 세포 내 매개체와 같은 다른 분자의 영향을 부분적으로 또는 완전히 저해하는 분자를 의미한다. 본 명세서에서, NLRP3 인플라마좀 억제용 조성물은 NLRP3 인플라마좀 억제제와 동일한 의미로 사용된다. 본 발명에서 상기 인플라마좀 활성 억제는 목적하는 세포 등의 인플라마좀 활성화의 저하를 야기하는 생체 내 변형을 의미하며, 본 발명의 목적상 상기 인플라마좀 생성 억제, 인플라마좀으로 인한 사이토카인 생성 억제 또는 ASC 중합체(oligomer) 형성 억제일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 조성물은 인플라마좀 생성 전 단계에 해당하는 ASC 중합체 형성 억제를 통한 인플라마좀 활성을 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
여러 연구에 따르면, NLRP3 인플라마좀은 선천성 면역계의 핵심 구성요소 중 하나이며, AD 발병에서 IL-1βIL-18 및 카스파제 1을 통한 염증 반응과 관련이 있다(M. Saresella et al., Mol Neurodegener 11, 23 (2016)). NLRP3 인플라마좀의 활성화는 미토콘드리아 활성 산소 종 생성(mitochondrial reactive oxygen species generation), 칼륨 유출(potassium efflux) 및 리소좀 불안정화(lysosomal destabilization) 후 카텝신 방출(cathepsin release)의 세 가지 주요 신호에 의해 촉발된다(L. Gao et al., Inflamm Res 66, 17-24 (2017)). 일단 활성화되면, NLRP3 인플라마좀은 분자 플랫폼을 형성하여 카스파제 1을 활성화한다. 이는 하류 IL-1β및 IL-18의 성숙과 활성화에 기여하고 파이롭토시스(pyroptosis)를 유도하며, 궁극적으로 염증 반응(inflammatory responses)을 증폭시킨다(H. D. Liu et al., Neurochem Res 38, 2072-2083 (2013)). 또한 AD 환자의 유전자 발현 분석은 NLRP3, ASC, 카스파제 1, IL-1β및 IL-18의 더 높은 발현을 보여주었다. 미세교세(microglia)는 NLRP3 인플라마좀 발현의 주요 공급원이며, IL-1β및 IL-18 분비를 담당하는 뇌의 주요 세포 유형으로 보고되었다(A. Gustin et al., PLoS One 10, e0130624 (2015)). 따라서 NLRP3 인플라마좀을 표적으로 하는 것은 알츠하이머병 치료를 위한 실행 가능한 전략이며 집중적인 연구의 주제이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 화학식 1로 표시되는 화합물은 NLRP3 인플라마좀 신호전달의 핵심 구성요소인 IL-1β및 카스파제 1의 발현을 억제하였으며, AD 마우스 모델에서 마우스의 인지 행동 개선을 나타냈으므로, AD를 포함한 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 NLRP3 인플라마좀(inflammasome) 관련 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 사용에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환이란, 인플라마좀이 비정상적으로 과도하게 활성화된 경우 발생하는 이상 질환으로, 바람직하게는 대사성 질환, 신경 염증성 질환 또는 자가 염증성 질환인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 대사성 질환은 생체 내 물질대사 장애에 의해서 발생하는 질환을 총칭하는 것으로, 바람직하게는 비만, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 동맥경화증, 제2형 당뇨병, 비알코올성지방간(NAFLD) 또는 비알코올성 지방간염(NASH)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 제2형 당뇨병 또는 동맥경화증인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
최근 연구 결과에 따르면, 비만 환자의 지방세포에서 NLRP3 단백질 발현 증가가 확인되었으며, 비만 지방세포에서 합성되는 세라마이드(cerimide)가 NLRP3 인플라마좀을 활성화시킬 뿐만 아니라, NLRP3 유전자 결핍 쥐에서 인플라마좀 활성 부재시 제2형 당뇨병 발병이 현저하게 감소하는 것이 밝혀졌다(Ryan W. Grant and Vishwa D. Dixit, Front Immunol. 2013; 4: 50). 또한, 고지혈증 환자에서 혈관에 염증이 발생할 때 높은 동맥경화 발생률이 보고되었고, 염증세포는 콜레스테롤 크리스털을 인지하여 NLRP3 인플라마좀의 형성 및 합성을 유도하여 혈관의 염증 반응을 증가시키는 것이 밝혀졌다(Peter Duewell, et al., Nature. 2010 Apr 29;464(7293):1357-61). 따라서, NLRP3 인플라마좀이 상기 대사성 질환의 유도 및/또는 촉진에 매우 중요한 역할을 한다.
본 발명에 있어서, 상기 신경 염증성 질환은 염증 반응에 의해 신경 조직의 손상으로 초래된 질환을 의미한다. 바람직하게는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌틴턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 미만성 루이소체병, 백색질뇌염, 측두엽간질 또는 염증성 척수손상인 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 알츠하이머병일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 알츠하이머병은 미세아교세포(microglia)의 인플라마좀 활성화가 중요한 메커니즘으로 보고되어 있으며, 알츠하이머병의 동물모델에서도 상기 미세아교세포에서 인플라마좀으로 인해 발생되는 사이토카인인 카스파제-1 및 IL-1의 양이 증가된다(Emily L. Goldberg and Vishwa Deep Dixit, Immunol Rev. 2015 May;265(1):63-74).
본 발명에 있어서, 상기 자가 염증성 질환(auto-inflammatory disease)은 자가 면역 질환(autoimmune disease)과 달리 자가 항체나 항원 특이 T 세포가 발견되지 않는 상태에서 전신 염증이 자주 반복되는 양상을 보이는 질환 군으로 분류되고, 주로 선천성 면역의 조절 장애로 일어나는 것을 특징으로 한다(journal of Rheumatic Disease Vol. 21. No. 5. May 2018). 바람직하게는 머클-웰스 증후군(Muckle-Wells syndrome; MWS), 성인형 지연성 자가면역 당뇨병(LADA), 가족성 한랭 자가염증성 증후군(FCAS), 크라이오피린 관련 주기적 증후군(CAPS), 신생아-발병 다기관 염증성 증후군(NOMID), 만성 영아 신경 피부 관절(CINCA) 증후군, 가족성 지중해열(FMF), 전신 발병 소아 특발성 관절염(SJIA)과 같은 특정 형태의 소아 관절염, 전신 발병 소아 특발성 류마티스 관절염과 같은 특정 형태의 소아 류마티스 관절염 또는 특정 형태의 성인 류마티스 관절염인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 “예방”은, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물의 투여로 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 “치료”는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물의 투여로 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
상기 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
용어 “담체(carrier)”란 세포 또는 조직 내로 화합물의 부가를 용이하게 하는 물질을 의미한다.
용어 “희석제(diluent)”란 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키는 물에서 희석되는 물질로 정의된다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 함께 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 인간을 제외한 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 조성물은 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 또는 이의 염을 포함하는 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
용어 “개선”은 본 발명의 식품 조성물을 이용하여 대사성 질환, 신경 염증성 질환 또는 자가 염증성 질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위라면 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 바람직하게는 건강기능성 식품일 수 있으며, 식품 첨가제일 수 있다. 상기 건강기능성 식품 또는 식품 첨가제는 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식품은 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 조성물은 음료 조성물일 수 있다. 상기 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에서 포함할 수 있는 필수 성분으로서 상기 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물과 여러 가지 생약 추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 식품보조첨가제를 추가로 첨가할 수도 있는바 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품보조첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 재료 및 방법
실시예 1-1: 세포주 및 시약
THP-1 세포는 10% 소 태아 혈청(FBS) (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin) 용액(Gibco)이 보충된 RPMI 1640 배지에서 성장되었다. 대식세포로의 분화는 24-48시간 동안 80nM PMA로 처리하여 수행되었다. 세포는 가습 배양기(Thermo Fisher Scientific, Inc.)에서 5% CO2 및 37℃에서 배양되었다. LPS(Escherichia coli 0111: B4) 및 PMA는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 니제리신(Nigericin)은 인비보젠(InvivoGen) (San Diego, CA, USA)에서 입수하였다.
실시예 1-2: 세포 생존률(Cell viability) 분석
세포 생존률은 비색 MTT 분석(Sigma-Aldrich Co.)을 사용하여 계산되었다. THP-1(105/well; 24 시간) 세포를 96-웰 플레이트(96-well plate) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에서 PMA(80 nM)로 밤새 분화하고 다양한 농도의 테스트 화합물로 24시간 동안 처리하였다. 그 후 배지를 100μL well MTT 용액(10%)으로 교체하고 세포를 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 이 용액을 100μL/well 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide; DMSO)로 교체하고 플레이트를 37℃에서 30분 동안 추가로 배양하였다. 플레이트는 마이크로 플레이트 판독기(microplate reader) (Molecular Devices, Silicon Valley, California)에서 540nm의 파장에서 판독되었다.
실시예 1-3: 효소결합면역흡착검사(ELISA)
THP-1 세포 (105/well)는 96-웰 플레이트(96-well plate) (BD Biosciences)에서 PMA(80nM, 48시간)로 분화되었다. 분화된 대식세포를 LPS(10ng/mL)로 4시간 동안 프라이밍(prime)하였다. 그 후, 세포를 무 혈청 배지에서 1시간 동안 화합물로 처리한 후 추가 1시간 동안 니제리신(nigericin)에 의해 NLRP3를 활성화시켰다. 인간 IL-1β이 코팅되지 않은 ELISA 키트(Human IL-1β Uncoated ELISA Kit) (Thermo Fisher Scientific, Inc.)를 사용하여 상등액을 수집하고, 인간 IL-1β 분비 억제를 분석하였다. 마이크로 플레이트 분광 광도계 시스템(microplate spectrophotometer system) (Molecular Devices)을 사용하여 플레이트의 흡광도를 판독하였다.
실시예 1-4: 웨스턴 블랏(Western Blot) 분석
NE-PER™ 핵 및 세포질 추출 시약(Thermo Fisher Scientific, Inc.)을 사용하여 세포질 단백질을 추출하고, BCA Assay Kit(Bicinchoninic Acid Assay Kit) (Sigma-Aldrich Co.)를 사용하여 총 단백질 농도를 측정하였다. 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, Mini-PROTEAN Tetra Cell 및 Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell System(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 사용하여 멤브레인(membrane)으로 옮겼다. 멤브레인을 탈지유(5%)로 1시간 동안 차단하고, NLRP3, IL-1β, 성숙 IL-1β(Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA), 카스파제 1 및 β-액틴(Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA)에 대한 항체로 4℃에서 밤새 면역 블롯팅(Immunoblotting) 하였다. 0.1%의 Tween 20이 보충된 PBS로 세척한 후, 멤브레인을 실온에서 2시간 동안 퍼옥시다제-접합 항-토끼(peroxidase-conjugated anti-rabbit) 또는 항-마우스 IgG 항체(anti-mouse IgG antibody) (1:1000)로 처리하였다. SuperSignal West Pico ECL solution(Thermo Fisher Scientific, Inc.)을 사용하여 ChemiDoc™ Touch Imaging System(Bio-Rad Laboratories)에서 시각화된 단백질 밴드를 감지하였다.
실시예 1-5: 미세소체 안정성(Microsomal Stability)
NIC7 및 NIC7w의 스톡(Stock) 용액은 DMSO에 10mM 농도로 준비하고 작업 용액으로 100% 메탄올로 100μM 농도로 희석하였다. 이러한 NIC7 및 NIC7w 용액을 인산 칼륨 완충액(potassium phosphate buffer) (pH 7.4)으로 1μM 농도로 희석한 다음, 각 용액을 0.5mg/mL 간 미세소체(인간)와 함께 37℃에서 5분 동안 배양하였다. 반응은 NADPH 생성 시스템(3.3mM 포도당-6-포스페이트(G6P), 1.3mM β+, 3.3mM MgCl2 및 0.4U/mL 포도당-6-포스페이트 탈수소효소(G6PD))을 37℃에서 추가하여 시작되었다. 20ng/mL의 내부 표준 물질로 카르바마제핀(carbamazepine)을 포함하는 차가운 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용하여 0분 및 30분에서 반응을 중지시켰다. 볼텍싱(vortexing) 및 원심분리 후, 상층액은 액체 크로마토그래피 및 탠덤 질량 분석법(liquid chromatography with tandem mass spectrometry)(LC-MS /MS)으로 분석되었다. 모든 미세소체(microsome) 분석은 2번 반복 수행되었다.
실시예 1-6: 사이토크롬 P450(Cytochrome P450) 억제
5개의 주요 P450 프로브 기질의 대사에 대한 NIC7 및 NIC7w의 억제 효과는 약간 수정한 이전에 보고된 방법(S. Seino, Diabetologia 55, 2096-2108 (2012))을 사용하여 평가하였다. 기질 칵테일(phenacetin O-deethylase, tolbutamide 4-hydroxylase, mephenytoin 4-hydroxylase, dextromethorphan O-demethylase 및 midazolam 1'-hydroxylase)은 5가지 주요 P450 효소인 CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 및 CYP2D6가 각각 사용되었다. NIC7 및 NIC7w는 DMSO에 10mM 농도로 준비하고 메탄올에 1mM 농도로 용해시켰다. 모든 실험에서 칵테일 배양을 위한 유기 용매(메탄올)의 최종 농도는 1.0%(v/v)로 설정되었다. 배양 혼합물의 모든 기질의 농도는 표 2에 나열되어 있다.
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000019
5개의 CYP450 효소를 사용하여 NIC7, NIC7w 및 MCC950의 효과를 평가하였다. 사용된 농도 및 생성된 대사산물과 함께 관련 기질을 상기 표에 기재하였다.
NIC7 및 NIC7w는 모두 10μM에서 사용되었으며, 풀링된(pooled) 인간 간 미세소체(microsome)는 0.25mg/mL 농도에서 분석되었다. 기질 칵테일 용액을 37℃에서 5분 동안 미세소체와 함께 배양하였다. 반응은 37℃ 및 1300rpm에서 NADPH 생성 시스템(실시예 1-5에 기재된 바와 동일)을 추가하여 시작되었다. 20ng/mL의 내부 표준 물질로 카르바마제핀(carbamazepine)을 함유하는 차가운 아세토니트릴(acetonitrile)을 첨가하여 10분에 반응을 중단시켰다. 볼텍싱 및 원심분리 후, 상층액을 LC-MS/MS로 분석하였다. 모든 미세소체 인큐베이션(incubations)은 3번 반복 수행되었다.
실시예 1-7: LC-MS/MS(Liquid Chromatograph-Tandem Mass Spectrometer) 분석
샘플 준비 후, 20ng/mL 내부 표준을 포함하는 0.1mL 아세토니트릴(acetonitrile)을 각 생물학적 샘플의 50μL 분취량(aliquot)에 첨가하였다. 12,000rpm에서 10분간 볼텍싱(vortexing) 및 원심분리한 후, 10μL의 상층액을 LC-MS/MS로 분석하였다.
LC 시스템에서 역상 C18 컬럼(BEH C18, 2.1mm x 100mm i.d., 1.7μm; Waters, Ireland)은 4℃에서 유지되었다. 이동상의 조성을 3분 동안 수중 0.1% 포름산(formic acid) 80%에서 아세토니트릴(acetonitrile) 중 0.1% 포름산 80%로 3분 동안 변경한 후, 3.1분 동안 수중 0.1% 포름산 80%로 전환하고, 0.5mL/min에서 5분 동안 유지되었다. 분석물은 전기 분무 이온화를 위한 터보 이온 스프레이 인터페이스(turbo ion spray interface)가 장착된 API5500 triple quadrupole mass spectrometer MS(AB Sciex, Foster City, CA)에서 모니터링되었고, 50L/min의 분무 가스 흐름, 5.5kV 및 500℃에서의 양이온 모드, 50L/min의 터보 이온 스프레이 가스 흐름, 20L/min의 커튼 가스 흐름, 5.5kV의 링 전압, 및 5Torr의 충돌 가스(질소) 압력에서 작동되었다. NIC7, NIC7w 및 내부 표준의 질량 전이는 다중 반응 모니터링 모드에서 각각 m/z 481.1→충돌 에너지 45eV), 453.1→및 236.9→이었다.
실시예 1-8: AD 모델(AD Model)
6주령 수컷 C57BL/6 마우스(19~22g)를 이용하였으며, 케이지 당 5마리로 사육장에서 사육하였다. AD 모델을 만들기 위해 실험 동물은 이소플루란(isoflurane)을 흡입시킨 다음, 다음 26-게이지(26-gauge) 바늘이 있는 해밀턴 마이크로실린지(Hamilton microsyringe)를 사용하여 Aβ1-42(5 μL)를 주입하였다. AD 모델 마우스에서는 실험 절차 전 2일 동안 20분/마우스로 훈련시킨 후 Y-미로 테스트 및 새로운 물체 인식 테스트(인지 평가용)를 수행하였다. 행동 평가는 Aβ1-42 주입 7일 후에 실시되었다. 동물은 AD, NIC7 처리, 비히클(DMSO) 처리, 도네페질(donepezil) 처리(양성 대조군) 및 정상(무 질병) 그룹으로 세분화되었다. 인지 평가는 주입 후 7일, 14일, 21일 및 28일에 수행되었다.
실시예 1-9: 행동 분석
공간인지 행동의 변화는 3개의 수평 동일한 팔(길이 35cm × 높이 15cm × 폭 5cm)이 서로 120°로 대칭적으로 배열된 Y-미로 장치를 사용하여 평가되었다. Aβ 주입 7일 후 Y-미로 테스트에서 평가를 수행하였다. Y-미로에 도입 후, 각 동물을 2분 동안 자유롭게 움직이게 한 후 5분 동안 측정하였다. 실험 대상은 이전에 방문한 것과는 다른 팔에 들어가는 경향을 보였다. 교대 비율을 계산하기 위해 팔 입력 및 트라이어드의 수를 기록하였다. 항목은 특정 미로 팔 내에 네 개의 팔다리가 모두 존재하는 것으로 정의된다.
새로운 물체 인식 테스트는 두 개의 동일한 물체를 포함하는 열린 필드 상자에서 수행되었다. 동물들은 처음에 이 동일한 물체에 2분 동안 익숙해졌고, 그 이후에 물체 중 하나는 새로운 물체로 대체되었고 5분 동안 읽었다. 동일한 물체에 소요된 시간(tA)과 새로운 물체에 소요된 시간(tB)을 계산하고, 인식 지수 비율은 (tB/(tA + tB)) × 100 공식을 통해 계산하였다.
실시예 1-10: 가상 스크리닝 라이브러리(Virtual Screening Library) 준비
화학 라이브러리는 ZINC 데이터베이스(druglike 및 leadlike)와 다양한 상용 공급 업체(표 3)에서 다운로드 되었다(J. J. Irwin, et al., J Chem Inf Model 52, 1757-1768 (2012)).
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000020
화학 구조는 MOE(Molecular Operating Environment) 소프트웨어(M. O. E. (MOE) (Molecular Operating Environment, 2019.01; Chemical Computing Group ULC, 1010 Sherbooke St. West, Suite #910, Montreal, QC, Canada, H3A 2R7, 2020)에서 중복 항목, 분리된 그룹, 염 및 무기 금속 이온의 제거를 고려하여 "세척" 절차를 거쳤다. 반응성 그룹이 있는 구조는 제거되어 라이브러리에서 가장 큰 조각을 유지하였다. 명시적인 수소 원자를 추가하고, 강염기 양성자화 및 pH 7.0에서 강산 탈양성자화에 의해 다시 평형화시켰다. 분자 내 결합은 합리적인 길이로 조정되었고, 각 구조에 대해 최대 10개의 토토머 상태(tautomeric states)가 나열되었다(각 리간드에 대해 가장 적절한 토토머(tautomer)). 리간드에 대한 부분 전하를 계산하고, 0.01의 제곱 평균 제곱 구배(root mean square gradient)에 도달할 때까지 Merck 분자력 장 (molecular force field) MMFF94x를 사용하여 에너지 최소화를 수행하였다.
실시예 1-11: 분자 지문(Molecular Fingerprint)-기반 구조 유사성
스크리닝 라이브러리의 모든 분자에 대해 비트 패킹된(bit-packed) MACCS 구조 키(FP: BIT MACCS) 체계를 사용하여 지문을 결정하였다. 이 기술에서 각 분자는 구조적 특징의 존재 또는 부재를 코딩하는 비트 벡터(bit vector)로 표현되며, 여기서 특정 비트 위치가 각 특징에 할당된다. MOE 사내(in-house) 지원 벡터 언어(support vector language; SVL) 스크립트를 사용하여 선택한 NLRP3 길항제 세트와 최소 60~75% 유사성을 갖는 화학 구조를 동정하였다(표 4).
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000021
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000022
상기 리간드들은 다중 구조적 화합물 라이브러리에 대한 지문 기반 유사성 검색 및 약물단(pharmacophore) 생성에 대해 테스트되었다.
검색은 유사성 메트릭(similarity metric)(TC)을 사용하여 수행되었다. TC는 각 리간드의 공통 특징을 총계와 비교하여 두(A 및 B) 지문 간의 유사성을 측정한다. 유사성 메트릭은 다음 공식을 기반으로 한다:
#AB/(#A + #B - #AB)
여기서 A와 B는 모두 지문이고 “#”은 각 지문의 특징 수를 나타낸다. 생성된 리간드는 추가 스크리닝을 위해 별도의 라이브러리에 저장되었다.
실시예 1-12: In silico(가상실험에서의 컴퓨터 프로그래밍) 단백질 구조의 준비
인간 NLRP3 [PDB ID: 6NPY] (H. Sharif et al., Nature 570, 338-343 (2019))의 cryo-EM 구조를 NEK7과 복합하여 PDB에서 검색하였다. 구조에 존재하는 물을 포함한 불필요한 리간드가 제거되었다. 구조는 pH 7.0에서 양성자화되었고, 에너지는 0.01의 제곱 평균 제곱 구배(root mean square gradient)에 도달할 때까지 Amber10: EHT 역장(force field)을 통해 최소화되었다.
실시예 1-13: 약물단(Pharmacophore) 생성 및 스크리닝
NLRP3 사이트 I 또는 사이트 II와의 최고 순위 상호 작용에 기초하여 각 리간드에 대해 다양한 약물단 모델이 생성되었다. 평면 극성 하전 소수성 체계(planar-polar-charged-hydrophobic scheme)를 사용하여 중요한 리간드 그룹 주위에 약물단 기능이 할당되었다. 다음으로, 리간드 기반 가상 스크리닝을 수행하여 각 리간드에 적용되는 필수 약물단 제약 조건을 충족하는 구조를 확인하였다. 결과 유효물질(hits)은 단일 라이브러리로 결합되고 분자 도킹을 통해 구조 기반 가상 스크리닝을 실시하였다.
실시예 1-14: 구조 기반 가상 스크리닝(Structure-Based Virtual Screening)
약물단(pharmacophore) 스크리닝으로 인한 화합물 라이브러리의 가상 스크리닝은 NLRP3의 사이트 I 및 사이트 II 모두에서 개별적으로 수행되었다. 사이트 I(Q636, E637, E638, E743 및 D748)은 NLRP3의 HD2 및 LRR에 해당하는 반면, 사이트 II(I149, E150, L162, R165, Y166, A225, A226, G227, I228, G229, K230, T231, I232, R235, H258, R260, R349, F371, Y379, P410, L411, W414, F506, V510, I519 및 H520)는 NLRP3의 NACHT 도메인에 해당한다. 도킹은 삼각형 매처 배치 방법(the triangle matcher placement method)과 London dG 스코어링 기능(scoring function)을 사용하여 수행되었다. 리간드 포즈(ligand poses)는 MMFF94x 역장(force field) 및 GBVI/WSA dG 스코어링 기능을 사용하여 재기록되었다. NLRP3의 잔류물은 고정된 상태로 유지되었으며, 리간드는 도킹 계산 중에 유연성을 유지하였다. 각 리간드의 15개 이상의 서로 다른 도킹 포즈를 저장하고, 결합 친화성 S-점수에 따라 순위를 매겼다. 각 도킹 라운드는 유도 맞춤(induced-fit) 도킹 방법으로 반복되었으며, 여기서 리간드와 수용체 측쇄 모두 최적 맞춤을 얻기 위해 형태를 조정할 수 있었다. NLRP3 길항 활성(antagonistic activity)의 실험적 검증을 위해 고정 및 유도 맞춤(rigid and induced-fit) 도킹 라운드 모두에서 최고 점수를 받은 19개의 일치 리간드를 선택하였다.
실시예 1-15: 초기 선도물질(lead)의 강력한 유도체 동정
초기 선도물질(lead)인 NIC7의 구조적 유도체는 MolPort 데이터베이스에서 검색되었다. 추가 분석을 위해 모 스캐폴드(parent scaffold)인 NIC7과 85-95%의 구조적 유사성을 특징으로 하는 리간드가 고려되었다. 약 100개의 리간드가 SDF 파일로 다운로드 되고, MOE 소프트웨어에서 PDB 형식으로 변환되었다. 리간드를 세척하고 위에서 언급한 초기 스크리닝 라이브러리를 준비하는 데 사용된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 에너지를 최소화하였다. 유도체는 실시예 1-14에 기재된 것과 동일한 도킹 매개 변수를 사용하여 NLRP3의 사이트 I 및 사이트 II에 대한 결합 점수에 따라 도킹되고 순위가 매겨졌다. 주머니에 가장 잘 맞고 최대 상호 작용을 보이는 최고 점수 25 리간드는 길항 활성의 실험적 검증을 위해 선택되었다.
실시예 1-16: 통계 분석
제시된 데이터는 3번의 독립적인 실험(각 실험은 2번 반복 수행됨)의 평균이며, 통계 분석은 two-tailed paired Student's t-test(P < 0.05)를 사용하여 수행되었다.
실시예 2: NIC7 유도체 합성 및 물리화학적 특성 확인
NIC7(N-(5-(3-(3-acetylphenyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)의 유도체 NIC7a 내지 NIC7y의 합성 과정 및 물리화학적 특성은 다음과 같다:
1) NIC7a: 4-메틸-N-(5-(3-펜에틸유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)벤젠설폰아미드 (4-methyl-N-(5-(3-phenethylureido)benzo[d]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000023
2-아미노-5-니트로벤조티아졸 500 mg (2.56 mmol)을 디클로로메탄 20 mL에 녹인 후, 4-메틸벤젠설포닐클로라이드 586 mg (3.07 mmol), 4-(디메틸아미노)피리딘 156 mg (1.28 mmol) 및 트리에틸아민 857 μL (6.15 mmol)을 첨가하고 상온에서 18시간 교반시킨다. 반응이 종결되면 디클로로메탄으로 희석한 유기층을 포화 소금물로 3회 세척한 후, 무수황산나트륨을 이용하여 건조하고 용매를 감압농축한다. 컬럼크로마토그래피를 이용하여 689 mg (수율 77%)의 화합물을 얻을 수 있다.
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000024
4-메틸-N-(5-니트로벤조[d]티아졸-2-일)벤젠설폰아미드 686 mg (1.97 mmol)을 메탄올 20 mL에 용해 후, palladium on carbon 69 mg을 가한다. 수소기체를 가하며 (1기압) 상온에서 24시간 교반한다. 반응이 종결되면 palladium on carbon을 celite를 이용하여 여과하고 용매를 농축하여 573 mg (수율 91%)의 화합물을 얻을 수 있다.
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000025
N-(5-아미노벤조[d]티아졸-2-일)-4-메틸벤젠설폰아미드 573 mg (1.79 mmol)을 테트라히드로퓨란 15 mL에 용해하고, 2-펜에틸아민 248 μL (1.97mmol)와 카보디이미다졸 320 mg (1.97 mmol)을 가하고 반응혼합물을 4시간 동안 환류교반한다. 반응이 종결되면 에틸아세테이트로 희석하고, 1N 염산 수용액과 포화 소금물로 세척한다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조하고 용매를 감압농축한다. 컬럼크로마토그래피를 이용하여 화합물 778 mg (수율 93%)을 얻을 수 있었다.
NMR 데이터는 다음과 같다:
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.89 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 7.63 (m, 3H), 7.47 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.30 (m, 4H), 7.21 (m, 3H), 6.97 (d, J = 1.6Hz, 1H), 6.07 (s, 1H), 3.31 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.78 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.41 (s, 3H).
NIC7b 내지 NIC7y는 NIC7a의 합성과정을 참고하여 합성하였다.
2) NIC7b: N-(5-(3-(4-에톡시페닐)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-(4-ethoxyphenyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000026
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ13.0 (s, 1H), 8.64 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.86 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 8.80 (s, 1H), 7.56 (m, 3H), 7.30 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.04 (d, J=7.2 Hz, 1H), 6.79 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.01 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.38 (t J = 7.2 Hz, 3H)
3) NIC7c: 에틸 ((2-((4-메틸페닐)설폰아미도)벤조[d]티아졸-5-일)카바모일)글라이시네이트 (ethyl ((2-((4-methylphenyl)sulfonamido)benzo[d]thiazol-5-yl)carbamoyl)glycinate)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000027
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.47 (s, 1H), 8.95 (s, 1H), 7.72 (m 2H), 7.50 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.01 (m, 1H), 6.42 (m, 1H), 4.17 (q, J=7.6 Hz, 2H), 3.88 (s, 2H), 2.39 (s, 3H), 1.28 (t, J = 7.6 Hz, 3H)
4) NIC7d: 메틸 3-(3-(2-((4-메톡시페닐)설폰아미도)벤조[d]티아졸-5-일)유레이도)벤조에이트 (methyl 3-(3-(2-((4-methylphenyl)sulfonamido)benzo[d]thiazol-5-yl)ureido)benzoate)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000028
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.94 (s, 1H), 8.74 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 8.15 (s, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.73 (s, J = 7.2 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.45 (m, 4H), 7.07 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 3.89 (s, 3H), 2.40 (s, 3H)
5) NIC7e: N-(5-(3-(3-메톡시벤질)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)-4-메틸벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-(3-methoxybenzyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000029
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.90 (s, 1H), 8.71 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.72 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.22 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.86 (m, 2H), 6.77 (m, 1H), 6.53 (m, 1H), 4.29 (s, 2H), 3.75 (s, 3H), 2.38 (s, 3H)
6) NIC7f: N-(5-(3-(2-메톡시페닐)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)-4-메틸벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-(2-methoxyphenyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000030
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.94 (s, 1H), 9.47 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 8.13 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.73 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.04 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 6.90 (m, 2H), 3.90 (s, 3H), 2.39 (s, 3H)
7) NIC7g: N-(5-(3-(3,4-디메톡시페닐)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)-4-메틸벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-(3,4-dimethoxyphenyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000031
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.90 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.75 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.22 (s, 1H), 7.04 (m, 1H), 6.81 (s, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.74 (s, 3H), 2.40 (s, 3H)
8) NIC7h: N-(5-(3-(5-클로로-2-메톡시페닐)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-(5-chloro-2-methoxyphenyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000032
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ13.01 (s, 1H), 9.53 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.86 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.80 (s, 1H), 7.57 (m, 4H), 7.05 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 6.94 (m, 2H), 3.80 (s, 3H)
9) NIC7i: N-(5-(3-(2,5-디메톡시페닐)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-(2,5-dimethoxyphenyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000033
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.98 (s, 1H), 9.50 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.85 (m, 3H), 7.56 (m, 4H), 7.04 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 6.45 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.72 (s, 3H)
10) NIC7j: 메틸 3-(3-(2-(페닐설폰아미도)벤조[d]티아졸-5-일)유레이도)벤조에이트 (methyl 3-(3-(2-(phenylsulfonamido)benzo[d]thiazol-5-yl)ureido)benzoate)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000034
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ13.01 (s, 1H), 8.84 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 8.16 (s, 1H), 7.85 (m, 4H), 7.57 (m, 5H), 7.38 (t, d = 7.6 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H)
11) NIC7k: 4-메틸-N-(5-(3-(4-메틸벤질)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)벤젠설폰아미드 (4-methyl-N-(5-(3-(4-methylbenzyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000035
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.91(s, 1H), 8.69 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.74 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 7.14 (m, 4H), 6.99 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 6.48 (m, 1H), 4.25 (s, 2H), 2.40 (s, 3H), 2.31 (2, 3H)
12) NIC7l: N-(5-(3-(벤조[d][1,3]다이옥솔-5-일)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)-4-메틸벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000036
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.95 (s, 1H), 8.76 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.74 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 7.18 (s, 1H), 7.03 (m, 1H), 6.74 (m, 2H), 5.95 (s, 2H), 2.40 (s, 3H)
13) NIC7m: N-(5-(3-(2-메톡시-5-메틸페닐)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)-4-메틸벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-(2-methoxy-5-methylphenyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000037
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.98 (s, 1H), 9.45 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.81 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.04 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 6.71 (m, 1H), 3.88 (s, 3H), 2.40 (s, 3H), 2.28 (s, 3H)
14) NIC7n: N-(5-(3-(3,5-디메톡시페닐)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)-4-메틸벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-(3,5-dimethoxyphenyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000038
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.92 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.74 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.56 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.04 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.64 (s, 2H), 6.10 (s, 1H), 3.77 (s, 6H), 2.40 (s, 3H)
15) NIC7o: N-(5-(3-(3-클로로-4-플루오로페닐)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)-4-메틸벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-(3-chloro-4-fluorophenyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000039
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.97 (s, 1H), 8.89 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 7.74 (m, 4H), 7.56 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.27 (m, 1H), 7.22 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.07 (dd, J = 7.2, 1.6 Hz, 1H), 2.40 (s, 3H)
16) NIC7p: 4-메틸-N-(5-(3-(p-톨일)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)벤젠설폰아미드 (4-methyl-N-(5-(3-(p-tolyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000040
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ 12.95 (s, 1H), 8.77 (s, 1H), 8.43 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.74 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.32 (m, 4H), 7.05 (m, 3H), 2.40 (s, 3H), 2.29 (s, 3H)
17) NIC7q: N-(5-(2-메톡시에틸)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)-4-메틸벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-(2-methoxyethyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000041
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.86 (s, 1H), 8.67 (s, 1H), 7.73 (m, 3H), 7.47 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 6.96 (m, 1H), 6.15 (m, 1H), 3.42 (m, 2H), 3.31 (s, 3H), 3.24 (m, 2H), 2.38 (s, 3H)
18) NIC7r: N-(5-(3-(2,4-디메톡시페닐)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)-4-메틸벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-(2,4-dimethoxyphenyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000042
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.91 (s, 1H), (9.32 (s, 1H), 7.89 (m, 2H), 7.80 (s, 1H), 7.73 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.53 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.03 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.58 (s, 1H), 6.42 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 2.40 (s, 3H)
19) NIC7s: N-(5-(3-(2,5-디메톡시페닐)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)-4-메틸벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-(2,5-dimethoxyphenyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000043
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.91 (s, 1H), 9.48 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.83 (m, 1H), 7.73 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.56 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.04 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 2.39 (s, 3H)
20) NIC7t: N-(5-(3-(3-메톡시페닐)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)-4-메틸벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-(3-methoxyphenyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000044
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.90 (s. 1H), 8.84 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.73 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.15 (m, 2H), 7.04 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 2.40 (s, 3H)
21) NIC7u: N-(5-(3-(4-에톡시페닐)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)-4-메틸벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-(4-ethoxyphenyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000045
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.91 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.73 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.32 (m, 4H), 7.04 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 3.98 (q, J = 8.4 Hz, 2H), 2.40 (s, 3H), 1.32 (t, J = 8.4 Hz, 3H)
22) NIC7v: N-(5-(3-(4-플루오로벤질)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-(4-fluorobenzyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000046
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.91 (s, 1H), 8.74 (s, 1H), 7.83 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.54 (m, 4H), 7.32 (m, 2H), 7.08 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 7.01 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.56 (m, 1H), 4.28 (m, 2H)
23) NIC7w: N-(5-(3-벤질유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)-4-메틸벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-benzylureido)benzo[d]thiazol-2-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000047
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.99 (s, 1H), 8.82 (s, 1H), 7.72 (m, 3H), 7.62 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.33 (m, 7H), 7.05 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.66 (m, 1H), 4.28 (m, 2H), 2.40 (s, 3H)
24) NIC7x: N-(5-(3-(3,4-디메톡시페닐)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-(3,4-dimethoxyphenyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000048
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.97 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 7.86 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.82 (s, 1H), 7.56 (m, 4H), 7.21 (s, 1H), 7.04 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 6.80 (s, 2H), 3.78 (s, 3H), 3.73 (s, 3H)
25) NIC7y: N-(5-(3-(3-에톡시프로필)유레이도)벤조[d]티아졸-2-일)벤젠설폰아미드 (N-(5-(3-(3-ethoxypropyl)ureido)benzo[d]thiazol-2-yl)benzenesulfonamide)
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000049
1H NMR (400 MHz, DMSOd6) δ12.95 (s, 1H), 8.61 (s, 1H), 7.84 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.73 (s, 1H), 7.54 (m, 4H), 6.95 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 3.44 (q, J = 8.0 Hz, 2H), 3.15 (m, 4H), 1.68 (m, 2H), 1.17 (t, J = 8.0 Hz, 3H)
실시예 3: 항-NLRP3 선도물질(lead)로서 NIC7 동정
현재까지, 소분자 리간드에 결합된 NLRP3의 실험적 결정 구조는 PDB(Protein Data Bank)에서 이용 가능하지 않다. NLRP3의 새로운 소분자 억제제(NIC7)의 동정은 NLRP3-NEK7 복합체(PDB ID: 6NPY)의 극저온 전자 현미경(EM) 구조를 사용하는 인 실리코(in silico) 접근법(H. Sharif et al., Nature 570, 338-343 (2019))과 2,800만 개가 넘는 상용 화합물의 다기능 라이브러리(표 3 및 도 1)를 통해 수행되었다.
약물과 유사한 물리 화학적 특성을 갖는 화합물은 참조 분자로 선택된 NLRP3 억제제를 사용하여 지문 기반 유사성 메트릭(fingerprint-based similarity metric)(Tanimoto 계수; TC)을 사용하여 분리되었다(표 4). 367,328 리간드의 결과 세트는 NLRP3와 잘 정의된 분자간 상호작용을 갖는 참조 리간드의 약물단 모델을 통해 스크리닝되었다. 다음으로, 70,040개의 리간드 세트를 NLRP3의 사이트 I 및 II에서 구조 기반 가상 스크리닝을 수행했다. 도킹된 리간드 포즈는 MMFF94x 역장-기반 결합 자유 에너지(force field-based binding free energy)(GBVI/WSA dG) 점수에 의해 순위가 매겨졌다. NLRP3의 사이트 I 및 사이트 II 포켓(도 2)에 잠재적인 적합 여부에 대해 상위 ~ 200개의 가상 유효물질(hits)을 면밀히 육안 검사한 후, 최고 점수를 받은 19개의 일치 리간드("NIC1-NIC19"로 명명)는 억제 활성을 평가하기 위해 실험적으로 검증되었다.
선택된 화합물의 길항 활성을 연구하기 전에 MTT(1-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan) 분석을 이용하여 세포 생존률을 평가했다. 인간 단핵구 세포(THP-1)를 24시간 동안 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)로 처리하여 대식세포로 분화시킨 다음, 스크리닝할 화합물(NIC1-NIC19) 10 또는 50μM로 추가 24시간 동안 처리했다. 19개 화합물 중 NIC1, NIC2, NIC6, NIC14, NIC17은 고농도에서 유의한 독성을 나타냈다(도 3a 및 3b). 나머지 화합물은 NLRP3에 의한 인터루킨-1ββ분비 억제 측면에서 기능적 활성에 대해 테스트되었다. 이를 위해, 리간드 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)로 TLR4(Toll-like receptor 4) 신호전달 경로를 활성화시켜 PMA-분화 THP-1 세포를 프라이밍하고, 양성 대조군인 MCC950과 함께 화합물 처리 후 니제리신(nigericin)으로 NLRP3를 활성화시켰다. 테스트한 모든 화합물 중에서 NIC7이 가장 높은 효능을 나타냈다(도 3c). 따라서 NIC7을 NLRP3에 대한 억제 효능을 향상시키기 위한 추가 최적화에 있어서 적절한 선도물질 화합물로 평가하였다.
실시예 4: NLRP3에 대해 증가된 효능을 나타내는 NIC7w
구조적 변형을 통해, NLRP3 신호전달 경로에 대한 1차 선도물질인 NIC7의 억제 효과를 개선시키고자 했다. 본 발명자들은, MolPort 데이터베이스(https://www.molport.com/shop/index)에서 상업적으로 이용 가능한 NIC7 유도체를 검색했고, 다양한 작용기가 부착된 NIC7 주요한 스캐폴드(scaffold)와 구조적으로 유사한 100개의 유망한 구별된 유도체를 확인하였다. 유도체들(derivatives)은 먼저 NIC7의 도킹된 포즈를 템플릿으로 이용하여 NLRP3의 사이트 I 및 사이트 II에 계산적으로 도킹되고 결합 친화도 점수에 따라 순위가 매겨졌다. NIC7 보다 점수가 높고 4.5Å 이내에서 최대 상호작용을 보이는 상위 25개 유도체(“NIC7a-NIC7y”로 명명)를 선택하여 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)을 통해 NLRP3 차단 기능을 테스트했다.
모든 유도체는 상기 언급한 농도(10 및 50 μM)에서 THP-1 대식세포에 대한 독성에 대해 먼저 평가되었다. 어떤 분자도 사용된 최고 농도에서 세포에 유의한 독성을 나타내지 않았다(도 4a 및 4b). 따라서 모든 화합물을 스크리닝하여 NLRP3에 대한 억제 가능성을 결정하였다. 상기 기재된 바와 동일한 과정에 따라, ELISA를 이용하여 인간 IL-1β의 분비 수준을 분석하였다. NIC7w는 화합물의 가장 높은 농도에서 가장 강력한 억제를 나타냈다(도 5c). 웨스턴 블롯(western blot) 분석을 사용하여 NLRP3 신호전달 경로의 억제를 추가로 분석하기 위해, NIC7 및 MCC950(대조군)과 함께 NIC7w를 선택하였다. 본 발명자들은, NLRP3 신호전달 경로의 주요 구성요소, 즉 IL-1β 및 카스파제 1의 억제에 주목했다(도 5d).
실시예 5: NIC7의 AD 모델에서의 기억 손상 방지 효과 확인
NLRP3는 알츠하이머병을 포함한 다양한 해마 신경퇴행성 질환(hippocampal neurodegenerative diseases)과 관련이 있는 것으로 보고되었다(R. H. Pirzada, et al., Genes (Basel) 11 (2020)).
본 발명자들은, NLRP3 인플라마좀 억제제인 NIC7에 의한 기억 감소 회복을 평가하였다. 이와 관련하여, AD 마우스 모델에 대한 Y-미로 테스트를 사용하여 공간 작업 기억을 조사하고 총 팔 항목(total arm entries)을 사용하여 자발적 교대 속도를 계산하였다. 그 결과, 비히클 처리 및 비처리 마우스와 비교할 때, NIC7 처리 마우스가 도네페질 처리(donepezil-treated) 마우스와 마찬가지로 새로운 팔에서 더 많은 시간을 보냈다는 것을 확인하였다(도 6a, 6b). 공간 작업 기억 외에 인식 기억에 해마가 관여하는 것을 고려하여(N. J. Broadbent, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101, 14515-14520 (2004)), 새로운 물체 인식 테스트도 수행하였다. 상기 결과와 유사하게, 비히클 처리 또는 비처리 마우스보다 NIC7 및 도네페질 처리 마우스에서 더 나은 인식 지수율(recognition index rates)을 확인하였다(도 6c).
또한, 모든 그룹에서 체중을 분석한 결과, 비처리 마우스와 비교할 때, NIC7 처리 마우스에서 현저하게 향상된 체중(정상 마우스와 거의 동일)을 확인하였다(도 6d). 전반적으로 이러한 결과는 AD 모델에서 마우스의 인지 행동을 개선하는 NIC7의 능력을 의미한다. 또한 NIC7, NIC7w 및 MCC950의 대사 안정성(및 시토크롬 P450 억제)을 확인하였다. 미세소체(microsome) 안정성 및 CYP450 억제 평가를 위해, MCC950, NIC7 및 NIC7w를 간 미세소체(microsome)와 별도로 배양하고 생성물을 LC-MS/MS로 분석하였다.
대사 안정성 분석은 미세소체(microsome) 또는 간세포와 함께 배양하여 테스트 화합물의 시간적 고유 배출량(temporal intrinsic clearance)을 결정한다(L. E. Chovan, et al., Rapid Commun Mass Spectrom 18, 3105-3112 (2004)). NIC7w의 경우, 대사 30분 이후에 남아있는 약물의 량이 NIC7보다 29.8% 더 증가하여 대사 안정성이 개선되었다(표 5).
Figure PCTKR2022001620-appb-img-000050
이와 유사하게, 사이토크롬 P450 억제 분석은 사이토크롬 P450 효소의 억제를 평가하여 약물 상호 작용을 결정하는 데 사용된다(S. A. Testino, Jr., G. Patonay, J Pharm Biomed Anal 30, 1459-1467 (2003)). CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 및 CYP3A4를 포함한 P450 시스템의 5가지 효소에서 NIC7 및 NIC7w를 상기 표 2에 나열된 관련 기질 및 농도와 함께 테스트하였다. NIC7과 NIC7w 모두 CYP2C9 효소에 주로 작용하고 다른 종류의 CYP 효소에는 거의 작용하지 않는 것을 확인함으로써 두 화합물의 약물성을 검증하였다(표 5).
실시예 6: NIC7와 NIC7w의 결합 모드
초기 선도물질인 NIC7과 이의 화학적 유도체에는 설폰아미드(sulfonamide)와 우레아 모이어티(urea moieties)가 포함되어 있으며(도 7), 이들은 NLRP3 인플라마좀 억제제와 항 당뇨병 약물에서 흔히 발견되는 중요한 작용기를 의미한다(S. Seino, Diabetologia 55, 2096-2108 (2012)). 모든 유도체 중 가장 효과적인 NIC7w는 3-benzothiazol-5-yl 부분에 부착된 우레아 그룹과 함께 1-benzyl 그룹을 포함하며(도 8), 이는 NLRP3 인플라마좀에 대해 더 강력한 억제 활성을 보장할 수 있다. 인 실리코(in silico) 분자 도킹은 NIC7 및 NIC7w가 NLRP3의 나선 도메인 2(helical domain 2; HD2)를 차지하여 유사한 결합 부위를 보여준다. 강력한 리간드 주변의 5Å잔기에 대한 면밀한 분석은 분자간 상호작용이 NLRP3의 LRR 및 HD2의 유사하고 구별되는 아미노산을 포함한다는 것을 보여주었다(도 9).
NIC7의 상호 작용은 중앙 벤조티아졸 모이어티(benzothiazole moiety)가 하전된 아미노산 잔기인 R697, E637, E638 및 D646에 의해 안정화됨을 보여주었다(도 9a). 우레아 그룹의 질소 원자는 E695의 카르복실기 측쇄와 수소 결합을 형성하는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 메틸벤젠설폰아미드(methylbenzenesulfonamide)는 소수성 잔기 L699 및 G696 및 극성 잔기 H698에 의해 결합된다. 아세틸페닐 그룹은 소수성 잔기 L628, L632, F648, M685 및 P649의 묻힌 표면 내부에 있다. 또한, 몇 가지 다른 하전, 극성 및 비극성 잔기는 반데르발스(van der Waals) 및 염 다리(salt bridge) 상호작용을 통해 리간드를 안정화할 수 있다.
NIC7w에서 벤조티아졸 모이어티(benzothiazole moiety)는 E695 및 R697과 하전된 접촉을 형성하고 H698, P707 및 S721과 정전기적 상호작용을 형성하는 것으로 밝혀졌다. 메틸벤젠설폰아미드 모이어티는 하전된 잔기 E637, E638, E695, D639 및 R697 사이에 쌓인다(도 9b). 수소 결합은 술폰아미드 그룹의 산소 원자와 E638의 아미노 그룹 사이에 형성된다. 벤질 및 우레아 그룹은 K694, N720, E743, R772 및 W774와 밀접한 상호작용을 하며 더 많은 안정성을 제공할 수 있다. 또한 잔기 L632, Q636, M645, E693, H722 및 D745는 NIC7w 주변의 5Å반경 내에서 발견되어 정전기 및 반데르발스 상호작용을 통해 안정성을 지원한다.
NLRP3 인플라마좀의 조절 장애는 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 제2형 당뇨병 및 크라이오피린 관련 주기적 증후군(cryopyrin-associated periodic syndrome; CAPS)과 같은 복잡한 질병과 관련이 있다. 그럼에도 불구하고, 아직까지 경구용 NLRP3 인플라마좀 억제 소분자는 인간 임상에서 알츠하이머병 치료를 위한 치료제로서 성공적이지 못했다. 본 발명에서는, NLRP3 인플라마좀 억제 화합물인 NIC7(C23H20N4O4S2) 및 그 유도체 NIC7w(C22H20N4O3S2)를 확인하였다. 이들은 NLRP3 인플라마좀 신호전달의 핵심 구성요소인 IL-1β및 카스파제 1을 억제하였으며, AD 마우스 모델에서 마우스의 인지 행동 개선을 나타냈다. 결과적으로, 이러한 in vivo 데이터들은 소분자 NLRP3 인플라마좀 억제제가 AD에 대한 효과적인 치료제임을 시사한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022001620-appb-img-000051
    상기 화학식 1에서 R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐원자, 치환 또는 비치환 탄화수소(hydrocarbon) 그룹, 치환 또는 비치환 이종(heterogeneous) 그룹, 치환 또는 비치환 탄소고리(carbocyclic) 그룹, 치환 또는 비치환 헤테로고리(heterocyclic) 그룹, 치환 또는 비치환 방향족(aromatic) 그룹 및 치환 또는 비치환 헤테로방향족(heteroaromatic) 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 함.
  2. 제1항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 하기의 군에서 선택되는 치환기인 것을 특징으로 하는 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    R1: 수소원자 또는 메틸; 및
    Figure PCTKR2022001620-appb-img-000052
  3. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 1-1 내지 화학식 1-12로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 화학식으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 1-1]
    Figure PCTKR2022001620-appb-img-000053
    [화학식 1-2]
    Figure PCTKR2022001620-appb-img-000054
    [화학식 1-3]
    Figure PCTKR2022001620-appb-img-000055
    [화학식 1-4]
    Figure PCTKR2022001620-appb-img-000056
    [화학식 1-5]
    Figure PCTKR2022001620-appb-img-000057
    [화학식 1-6]
    Figure PCTKR2022001620-appb-img-000058
    [화학식 1-7]
    Figure PCTKR2022001620-appb-img-000059
    [화학식 1-8]
    Figure PCTKR2022001620-appb-img-000060
    [화학식 1-9]
    Figure PCTKR2022001620-appb-img-000061
    [화학식 1-10]
    Figure PCTKR2022001620-appb-img-000062
    [화학식 1-11]
    Figure PCTKR2022001620-appb-img-000063
    [화학식 1-12]
    Figure PCTKR2022001620-appb-img-000064
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 NLRP3 인플라마좀(inflammasome) 활성 억제제.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 NLRP3 인플라마좀(inflammasome) 관련 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 NLRP3 인플라마좀 관련 염증성 질환은 대사성 질환, 신경 염증성 질환 또는 자가 염증성 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 대사성 질환은 비만, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 동맥경화증, 제2형 당뇨병, 비알코올성지방간(NAFLD) 또는 비알코올성 지방간염(NASH)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 신경 염증성 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌틴턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 미만성 루이소체병, 백색질뇌염, 측두엽간질 또는 염증성 척수손상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 자가 염증성 질환은 머클-웰스 증후군(Muckle-Wells syndrome; MWS), 성인형 지연성 자가면역 당뇨병(LADA), 가족성 한랭 자가염증성 증후군(FCAS), 크라이오피린 관련 주기적 증후군(CAPS), 신생아-발병 다기관 염증성 증후군(NOMID), 만성 영아 신경 피부 관절(CINCA) 증후군, 가족성 지중해열(FMF), 전신 발병 소아 특발성 관절염(SJIA), 전신 발병 소아 특발성 류마티스 관절염 또는 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 염을 포함하는 NLRP3 인플라마좀(inflammasome) 관련 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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