WO2022168615A1 - 培養装置およびその利用 - Google Patents

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WO2022168615A1
WO2022168615A1 PCT/JP2022/001928 JP2022001928W WO2022168615A1 WO 2022168615 A1 WO2022168615 A1 WO 2022168615A1 JP 2022001928 W JP2022001928 W JP 2022001928W WO 2022168615 A1 WO2022168615 A1 WO 2022168615A1
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WO
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culture
liquid level
height
foam layer
liquid
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PCT/JP2022/001928
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尊史 猪狩
隆久 加藤
優 平野
Original Assignee
株式会社カネカ
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Publication date
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Priority to US18/263,063 priority patent/US20240084339A1/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/04—Apparatus for enzymology or microbiology with gas introduction means
    • C12M1/06—Apparatus for enzymology or microbiology with gas introduction means with agitator, e.g. impeller
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/02—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of foam
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/44—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of volume or liquid level

Definitions

  • the present invention relates to a culture device and its use.
  • Patent Document 1 discloses a differential pressure type level meter for detecting the liquid surface level in a liquid tank having a liquid reservoir, and a differential pressure level meter for detecting the foam surface level. and a capacitive level switch.
  • Patent Document 2 a pressure type liquid level detection sensor is provided below the liquid level and an optical length measurement type liquid level sensor is provided above the liquid level for the foam layer generated on the liquid level of the foaming liquid in the tank. Then, a foam layer detection device is described which detects a foam layer by a combination of these.
  • an object of the present invention is to provide a culture apparatus that can accurately detect the air-liquid interface of the culture solution in the culture tank.
  • the present inventors have found that by combining a liquid level sensor and at least two pressure sensors installed in the liquid phase, the gas-liquid interface of the culture solution in the culture tank can be detected. It was found for the first time that it can be accurately detected. In addition, it was found for the first time that by using a culture apparatus equipped with the above sensor, it is possible to suppress entrapment of air bubbles in the culture solution, and the production amount per batch can be improved, leading to the completion of the present invention. rice field.
  • one aspect of the present invention is a liquid level sensor that detects the height of the foam layer from the bottom of the culture tank to the top of the foam layer, and a pressure that detects the liquid level from the bottom of the culture tank to the gas-liquid interface. and a sensor, wherein at least two pressure sensors are installed under the gas-liquid interface.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a culture device, according to an embodiment of the present invention.
  • a culture apparatus includes a liquid level sensor for detecting the foam layer height from the bottom of the culture tank to the top of the foam layer, and and a pressure sensor for detecting the height of the liquid surface from the bottom to the gas-liquid interface, wherein at least two pressure sensors are installed below the gas-liquid interface.
  • the present inventors have made intensive studies on a culture apparatus capable of accurately controlling the foam/liquid surface with the aim of improving the production efficiency of culture, and as a result, have succeeded in obtaining the following findings: - By combining a liquid surface sensor and at least two pressure sensors installed in the liquid phase in the culture apparatus, the air-liquid interface of the culture solution in the culture tank can be accurately detected. ⁇ By combining a liquid level sensor and at least two pressure sensors installed in the liquid phase in the culture apparatus, the air-liquid interface of the culture solution can be accurately detected even when the liquid density changes during the culture. - By using the above-described culture apparatus, it is possible to suppress entrapment of air bubbles in the culture solution, and improve the production amount per batch.
  • a culture device equipped with such a unique combination and arrangement of sensors has never existed before, and is an extremely superior technology.
  • the configuration of this manufacturing method will be described in detail below.
  • the culture apparatus includes a liquid level sensor that detects the height of the foam layer from the bottom of the culture tank to the top of the foam layer, and a pressure sensor that detects the height of the liquid level from the bottom of the culture tank to the gas-liquid interface. At least two pressure sensors are installed under the gas-liquid interface.
  • the main culture device will be explained in detail using FIG. Note that the main culture apparatus is not limited to the one shown in FIG. In the following, a case where at least two pressure sensors are installed under the gas-liquid interface will be described as an example, but the present invention is not limited to this, and three or more pressure sensors are installed. may be When three or more pressure sensors are installed in this manner, at least two pressure sensors should be installed under the gas-liquid interface.
  • the main culture apparatus 101 includes a pressure sensor (differential pressure type liquid level sensor) composed of an upper pressure sensor 2 and a lower pressure sensor 3, and a liquid level sensor 4.
  • the culture tank 1 is filled with a culture solution.
  • the upper pressure sensor 2 and the lower pressure sensor 3 are installed below the gas-liquid interface 9 of the culture tank 1 .
  • Air is constantly supplied from the air supply pipe 6 , and the supplied air is dispersed in the culture medium by the stirrer 5 .
  • the air dispersed in the culture medium is then discharged from the exhaust line 7 .
  • a carbon source is introduced from the carbon source introduction line 8 .
  • the liquid level height 31 is detected by the pressure sensor (differential pressure type liquid level sensor).
  • the liquid level height 31 intends the distance from the bottom of the culture tank 1 to the air-liquid interface 9 .
  • the two pressure sensors (the upper pressure sensor 2 and the lower pressure sensor 3) are positioned below the gas-liquid interface 9, so that the pressures detected by the pressure sensors differ.
  • the liquid level height 31 can be detected based on the pressure difference.
  • the liquid level is calculated based on the pressure difference, the liquid level 31 can be detected even when the density of the culture solution changes during the culture.
  • the foam layer height 32 is detected by the liquid level sensor 4 .
  • the foam layer height 32 is the sum of the liquid level height 31 and the foam layer 10 . That is, the foam layer height of 32 means the distance from the bottom of the culture tank 1 to the top of the foam layer 10 .
  • the formation amount of the foam layer 10 is predicted by comparing the liquid level height 31 measured by the pressure sensor (differential pressure type liquid level sensor) and the foam layer height 32 measured by the liquid level sensor 4. can do. For example, the closer the value of the liquid level height 31 measured by the pressure sensor (differential pressure type liquid level sensor)/the foam layer height 32 measured by the liquid level sensor 4 is to 1, the smaller the amount of foam layer 10 formed.
  • the foam layer 10 is formed as the value of the liquid level height 31 measured by the pressure sensor (differential pressure type liquid level sensor) / the foam layer height 32 measured by the liquid level sensor 4 becomes smaller than 1. It can be determined that the amount is large. In such a formation amount of the foam layer 10 (for example, the value of the liquid level height 31 measured by the pressure sensor (differential pressure type liquid level sensor) / the foam layer height 32 measured by the liquid level sensor 4) The culture efficiency can be improved by appropriately changing the culture conditions accordingly.
  • the liquid level sensor 4 in the main culture apparatus 101 is not particularly limited as long as it can detect the foam layer height 32 from the bottom of the culture tank 1 to the top of the foam layer 10.
  • a type level meter, a microwave radar type level meter, a capacitance type level meter, and the like are included.
  • the liquid level sensor is preferably a laser liquid level gauge because it can be measured in a non-contact manner and is inexpensive.
  • the pressure sensors 2 and 3 in the main culture apparatus 101 are not particularly limited as long as they can detect the liquid level height 31 from the bottom of the culture tank 1 to the air-liquid interface 9.
  • a differential pressure level sensor DP cell
  • Two pressure sensors may be installed at the locations of the pressure sensors 2 and 3 to measure the differential pressure.
  • the value of the liquid level height 31 measured by the pressure sensors 2 and 3/the foam layer height 32 measured by the liquid level sensor 4 is within a certain range. It is preferable to have an adjustment mechanism that adjusts the culture conditions as follows.
  • the adjustment mechanism adjusts the culture conditions so that the numerical value of the liquid level height 31 measured by the pressure sensor/foam layer height 32 measured by the liquid level sensor 4 is 0.85 to 0.99. It is more preferable to adjust the culture conditions so that it will be 0.85 to 0.95, and it is even more preferable to adjust the culture conditions so that it will be 0.85 to 0.92. If the numerical value is adjusted to be 0.99 or less, the foam layer 10 is present, so that the gas holdup rate, which will be described later, does not become too high. If the numerical value is adjusted to 0.85 or more, culture efficiency is improved.
  • the liquid level height 31 can be measured by, for example, a differential pressure sensor such as a DP cell.
  • the differential pressure sensor uses the pressure difference detected by the two pressure sensors 2 and 3 to measure the liquid level 31 .
  • the liquid level height 31 can be calculated by summing the distance 22 from the gas-liquid interface 9 to the lower pressure sensor 3 and the distance 23 from the lower pressure sensor 3 to the bottom of the culture tank 1 .
  • a distance 22 from the gas-liquid interface 9 to the lower pressure sensor 3 can be obtained by the following formula (1).
  • L1 indicates the pressure from the gas-liquid interface 9 to the upper pressure sensor 2.
  • L2 indicates the distance 22 from the gas-liquid interface 9 to the lower pressure sensor 3 .
  • L2-L1 is not particularly limited as long as it is a distance that causes a difference in pressure detected by each pressure sensor as described above.
  • the mechanism for adjusting the culture conditions in the main culture apparatus 101 is, for example, a mechanism that can adjust at least one of the addition rate of the carbon source, the stirring power of the culture solution, the bubbling conditions, the shape of the stirring blade, and the like. That is, the adjustment mechanism adjusts the formation amount of the foam layer 10 by controlling the addition rate of the carbon source, the stirring power of the culture solution, the bubbling conditions, the shape of the stirring blade, etc., and measured by the pressure sensors 2 and 3.
  • the liquid level height 31/the foam layer height 32 measured by the liquid level sensor 4 can be adjusted within an appropriate range.
  • the adjustment of the culture conditions by the adjustment mechanism is performed simply and efficiently by the liquid level height 31 measured by the pressure sensors 2 and 3/the foam layer height measured by the liquid level sensor 4. From the viewpoint of varying 32, it is preferable to perform at least one selected from the group consisting of the addition rate of the carbon source, the stirring power of the culture solution, and the bubbling conditions.
  • addition rate of the carbon source is, for example, 2.0 to 3.8 [1/hr]. Yes, preferably 2.5 to 3.75 [1/hr], more preferably 3.0 to 3.7 [1/hr].
  • the liquid level height 31 measured by the pressure sensors 2 and 3/the foam layer height 32 measured by the liquid level sensor 4 can be adjusted within an appropriate range, resulting in , the output per batch can be increased.
  • a mechanism for adjusting the rate of addition of the carbon source may be, for example, the carbon source input line 8 in FIG.
  • the carbon source is not particularly limited, but from the viewpoint of dispersibility in the culture solution, it is preferably a carbon source that has surface activity.
  • Carbon sources having surface activity include, for example, lipids derived from vegetable oils, glycerin, polyhydric alcohols and the like. Among them, lipids derived from vegetable oils are preferable from the viewpoint of fungal assimilation.
  • Examples of the vegetable oil include, but are not limited to, palm oil, olive oil, corn oil, canola oil, coconut oil, soybean oil, wheat malt oil, jojoba oil, sunflower oil, sesame, peanut, cottonseed, safflower, soybean, Rapeseeds, almonds, beech nuts, cashews, hazelnuts, macadamia, mongongo nuts, pecans, pine nuts, pistachios, walnuts, grapefruit seeds, lemons, oranges, bitter melons, gourds, buffalo squash, butternut seeds, egushi seeds, squash Seed, Watermelon Seed, Acai, Black Seed, Black Currant Seed, Borage Seed, Evening Primrose, Flaxseed, Eucalyptus, Amaranth, Apricot, Apple Seed, Argan, Avocado, Babassu, Coriander Seed, Grape Seed, Mustard, Poppy Seed, Rice Bran, Castor Sesame , or combinations thereof.
  • palm oil is preferable from the viewpoint of
  • the stirring power per unit volume of the culture solution is, for example, 1.5 to 4.0 kw/m 3 , preferably 1.5 to 3.5 kw/m 3 , more preferably 2.0 to 3.0 kw/m3.
  • the stirring power of the culture solution is within the above range, the liquid level height 31 measured by the pressure sensors 2 and 3/the foam layer height 32 measured by the liquid level sensor 4 can be adjusted to an appropriate range, and as a result, , the output per batch can be increased.
  • the mechanism for adjusting the stirring power of the culture solution can be, for example, the stirrer 5 in FIG.
  • the amount of foam layer 10 formed increases as the amount of bubbling increases, and the amount of foam layer 10 formed decreases as the amount of bubbling decreases.
  • Bubbling conditions are, for example, 0.2 to 2.0 vvm, preferably 0.4 to 1.5 vvm, more preferably 0.6 to 1.2 vvm.
  • the bubbling conditions are within the above range, the liquid level height 31 measured by the pressure sensors 2 and 3/the foam layer height 32 measured by the liquid level sensor 4 can be adjusted to an appropriate range, and as a result, one batch can be obtained. You can increase your production output.
  • the bubbling condition adjustment mechanism can be, for example, the air supply pipe 6 in FIG.
  • culture in the main culture apparatus 101 is aerated and stirred. Due to the aeration and agitation, the culture solution entraps air, resulting in gas holdup.
  • gas holdup ratio means the ratio of the volume of bubbles to the total volume of the culture solution in which gas holdup is occurring. If the gas holdup rate is large, the volume of the culture tank cannot be used effectively, resulting in a decrease in culture efficiency. On the other hand, even when the gas holdup ratio is low, the efficiency of culture decreases because air is less likely to dissolve in the culture solution. Therefore, it is preferable to control the gas holdup rate within a certain range.
  • the gas holdup ratio ( ⁇ ) is, for example, 0.20 to 0.32, preferably 0.23 to 0.30, more preferably 0.26 to 0.29. If the gas hold-up rate is 0.20 or more, air is easily dissolved in the culture solution, and if it is 0.32, the volume of the culture tank 1 can be effectively used, so the productivity per batch is high. can.
  • the gas holdup rate ⁇ is defined by the following equation (2).
  • V f indicates the volume of the culture solution when gas holdup occurs
  • V 0 indicates the amount of the culture solution introduced into the culture tank 1 .
  • the gas holdup rate is controlled by the air supply pipe 6 in FIG.
  • the volume of the culture tank 1 provided in the main culture apparatus 101 and the height of the culture tank 1/the diameter of the culture tank 1 are not particularly limited, and the difference is only in the pressure detected by the upper pressure sensor 2 and the lower pressure sensor 3.
  • the size may be such that the pressure sensors 2 and 3 can be installed at a distance of .
  • the volume of the culture tank 1 of the main culture apparatus 101 is, for example, 0.4 to 350 m 3 , preferably 1 to 330 m 3 , more preferably 2 to 300 m 3 .
  • the height of the culture tank 1/the diameter of the culture tank 1 of the main culture apparatus 101 is, for example, 1.5 to 3.0, preferably 1.7 to 2.7. Yes, more preferably 1.9 to 2.5.
  • the volume of the culture tank 1 of the main culture apparatus 101 is 0.4 to 350 m 3 and the height of the culture tank 1/diameter of the culture tank 1 is 1.5 to 3.0. is preferably
  • the culture tank 1 of the main culture apparatus 101 is not particularly limited, but from the viewpoint of increasing the capacity, it is preferably a SUS (stainless steel) container.
  • microorganisms are not particularly limited, but include, for example, microorganisms that can produce environmentally friendly biodegradable plastics that have little adverse effect on ecosystems.
  • microorganisms that produce PHA which is produced by using plant-derived natural organic acids and fats and oils as a carbon source and accumulates in cells as an energy storage substance.
  • the PHA is a general term for polymers having 3-hydroxyalkanoic acid as a monomer unit.
  • the 3-hydroxyalkanoic acid constituting PHA is not particularly limited, but examples include 3-hydroxypropionate, 3-hydroxybutyrate, 3-hydroxyvalerate, 3-hydroxyhexanoate, and 3-hydroxyheptanoate. , and 3-hydroxyoctanoate.
  • the PHA may be a homopolymer having one kind of 3-hydroxyalkanoic acid as a monomer unit, or a copolymer having two or more kinds of 3-hydroxyalkanoic acids as monomer units.
  • copolymer examples include a copolymer of 3-hydroxybutyrate (3HB) and other 3-hydroxyalkanoic acid, and a copolymer of 3-hydroxyalkanoic acid containing at least 3-hydroxyhexanoate (3HH) as a monomer unit.
  • a copolymer etc. are mentioned.
  • Specific examples of the PHA include poly(3-hydroxybutyrate) (PHB), poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) (PHBH), and poly(3-hydroxybutyrate).
  • microorganism used for the production of PHA is not particularly limited as long as it has the ability to produce PHAs.
  • Microorganisms isolated from nature, microorganisms deposited with strain depositories (e.g., IFO, ATCC, etc.), or genetically engineered microorganisms such as mutants and transformants that can be prepared from them can be used.
  • the genus Capiliavidus such as Cupriavidus necator
  • the genus Alcaligenes such as Alcaligenes latas
  • Pseudomonas putida Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa aeruginosa
  • Pseudomonas resinovorans Pseudomonas oleovorans, etc.
  • Azotobacter genus Nocardia
  • Aeromonas caviae Aeromonas genus such as Aeromonas hydrophila
  • Ralstonia genus Wautersia genus
  • Wautersia genus .
  • microorganisms In addition to the above-mentioned microorganisms, etc., it is also possible to use biological cells that have been modified to artificially produce PHA by introducing PHA synthase genes, etc. using genetic engineering techniques.
  • PHA synthase genes etc.
  • genetic engineering techniques for example, in addition to microorganisms belonging to the above genus Capiliavidus, Alcaligenes, Pseudomonas, Bacillus, Azotobacter, Nocardia, Aeromonas, Ralstonia, Wautersia, Comamonas, etc., Escherichia ( Gram-negative bacteria such as the genus Escherichia, Gram-positive bacteria such as the genus Bacillus, yeasts such as the genus Saccharomyces, the genus Yarrowia, the genus Candida, etc. It is possible to obtain biological cells that have been artificially modified to produce PHA.
  • Microorganisms can be cultured by the same method as the normal culture method for each microorganism.
  • PHA can be recovered using a well-known method. For example, it can be carried out by the following method. After the culture is completed, the cells are separated from the culture solution using a centrifuge or the like, washed with distilled water, methanol, or the like, and dried. A solution containing PHA is extracted from the dried cells using an organic solvent such as chloroform. Cell components are removed from the PHA-containing solution by filtration or the like, and a poor solvent such as methanol or hexane is added to the filtrate to precipitate PHA. Furthermore, the supernatant is removed by filtration and centrifugation and dried to recover PHA.
  • the poor solvent means a solvent with low solubility for the product.
  • the culture solution used for culturing the microorganism is not particularly limited, and any known culture solution can be used.
  • a culture method (hereinafter referred to as "main culture method") characterized by culturing microorganisms using a main culture apparatus. Since the main culture method uses the main culture apparatus, it is possible to accurately detect the air-liquid interface of the culture solution in the culture tank, suppress the inclusion of air bubbles in the culture solution, and improve productivity. .
  • the culture method preferably includes the following steps (a) to (b).
  • step (a) the liquid level height and foam layer height are measured according to [2. culture apparatus]. Further, in the step (b), the adjustment of the liquid level height measured by the pressure sensor/the foam layer height measured by the liquid level sensor is performed according to the above [2. culture apparatus].
  • the culture method preferably further includes the following step (c).
  • step (c) the volume of the culture tank can be effectively used, and the productivity per batch can be increased.
  • the present production method includes the step of culturing microorganisms using the main culture apparatus or the main culture method as one step. Since this manufacturing method uses the main culture apparatus or the main culture method, it is possible to accurately detect the air-liquid interface of the culture solution in the culture tank, suppress the entrainment of air bubbles in the culture solution, and improve productivity. can be enhanced.
  • the production method includes the above [3. culture method] or steps (a) to (c).
  • the microorganism in one embodiment of the present invention, it is preferable to culture the microorganism in a culture medium containing a carbon source having surfactant action. This has the advantage of increasing the productivity of polyhydroxyalkanoic acid.
  • the weight of PHA/volume of culture tank in this production method is preferably 290 g/L or more, more preferably 300 g/L or more.
  • the PHA weight/volume of the culture tank is an index showing the productivity of the target substance.
  • the production method preferably includes the following optional steps in addition to the step of culturing microorganisms. - A step of inactivating the microorganism - A step of crushing the inactivated microorganism - A step of separating and concentrating PHA from the crushed liquid - A step of drying the concentrated PHA aqueous suspension , by any known method.
  • one embodiment of the present invention is as follows.
  • a liquid level sensor that detects the foam layer height from the bottom of the culture tank to the top of the foam layer, and a pressure sensor that detects the liquid level from the bottom of the culture tank to the gas-liquid interface,
  • the culture apparatus wherein at least two pressure sensors are installed under the air-liquid interface.
  • ⁇ 2> Equipped with an adjustment mechanism that adjusts culture conditions so that the liquid level height measured by the pressure sensor/foam layer height measured by the liquid level sensor is 0.85 to 0.99, ⁇ 1>.
  • the mechanism for adjusting the culture conditions is a mechanism capable of adjusting at least one selected from the group consisting of the rate of addition of the carbon source, the stirring power of the culture solution, and the bubbling conditions.
  • the culture device according to . ⁇ 5> A culture method, wherein the microorganism is cultured using the culture apparatus according to ⁇ 1>.
  • ⁇ 6> (a) A step of measuring the liquid level height and the foam layer height using the culture apparatus according to ⁇ 1>, and (b) the liquid level height measured by the pressure sensor / the liquid adjusting the culture conditions so that the height of the foam layer measured by the surface sensor is 0.85 to 0.99;
  • ⁇ 7> The culture method according to ⁇ 6>, wherein the adjustment of the culture conditions is at least one selected from the group consisting of the rate of addition of the carbon source, the stirring power of the culture solution, and the bubbling conditions.
  • ⁇ 8> The culture method according to ⁇ 7>, wherein the addition rate of the carbon source is 2.0 to 3.8 [1/hr].
  • ⁇ 12> The process of culturing microorganisms using the culturing apparatus according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, or the culturing method according to any one of ⁇ 5> to ⁇ 11> as one process, A method for producing a hydroxyalkanoic acid.
  • ⁇ 13> The method for producing a polyhydroxyalkanoic acid according to ⁇ 12>, wherein the microorganism is cultured in a culture solution containing a carbon source having surface activity.
  • ⁇ 14> The method for producing a polyhydroxyalkanoic acid according to ⁇ 13>, wherein the carbon source is a lipid derived from vegetable oil.
  • the liquid level height was measured (calculated) with a liquid level differential pressure gauge. Briefly, the liquid level height was measured (calculated) using the pressure difference detected by two pressure sensors of the liquid level differential pressure gauge.
  • the distance (L2) from the gas-liquid interface to the lower pressure sensor was determined by the following formula (1).
  • KNK-631 strain (see Japanese Patent Laid-Open No. 2013-009627 and International Publication No. 2016/114128) was used for culture production, seed culture followed by pre-culture was performed, and the cells were collected.
  • the composition of the seed culture medium is 1 w/v% Meat-extract, 1 w/v% Bacto-Tryptone, 0.2 w/v% Yeast-extract, 0.9 w/v% Na 2 HPO 4 ⁇ 12H. 2 O, and 0.15 w/v % KH 2 PO 4 with a pH of 6.8.
  • ⁇ Pre-culture medium> The composition of the pre - culture medium is 1.1 w/v% Na2HPO4-12H2O , 0.19 w/v% KH2PO4 , 1.29 w/v% ( NH4 ) 2SO4 , 0 .1 w/v% MgSO4.7H2O , 0.5 v/v% trace metal salt solution (0.1N hydrochloric acid, 1.6 w/v% FeCl3.6H2O , 1 w/v% Dissolve CaCl2.2H2O , 0.02 w/v% CoCl2.6H2O , 0.016 w/v% CuSO4.5H2O , 0.012 w / v % NiCl2.6H2O solution).
  • palm oil was added all at once at a concentration of 10 g/L.
  • the composition of the main culture medium is 0.385 w/v% Na2HPO4-12H2O , 0.067 w/v% KH2PO4 , 0.291 w/v% ( NH4 ) 2SO4 , 0 .1 w/v% MgSO4.7H2O , 0.5 v/v% trace metal salt solution (1.6 w/v% FeCl3.6H2O , 1 w/v% CaCl2.2H2O , 0.02 w/v% CoCl2.6H2O , 0.016 w/v% CuSO4.5H2O , 0.012 w / v % NiCl2.6H2O . solution) and 0.05 w/v% BIOSPUREX200K (antifoaming agent: manufactured by Cognis Japan).
  • seed culture First, a glycerol stock of the KNK-631 strain was inoculated into a seed medium and cultured at 30° C. for 24 hours to obtain a seed culture.
  • pre-culture 1.0 v/v % of the obtained seed culture was inoculated into a container containing a preculture medium. It was cultured for 24 hours while controlling the culture temperature at 30°C and pH 6.5. A 14% ammonium hydroxide aqueous solution was used for pH control.
  • Example 1 As the culture tank, a SUS culture tank having a tank volume of 5.0 m 3 and a height of the culture tank/diameter of the culture tank of 2.5 was used. A liquid level differential pressure gauge (DP cell, manufactured by Yokogawa Electric Corporation) was installed as a pressure sensor in the culture tank, and the distance between the upper pressure sensor and the lower pressure sensor was 88 cm. In addition, a radio wave type liquid level sensor (manufactured by Endress+Hauser) was installed as a liquid level sensor in the upper part of the culture tank. The pre-culture solution obtained in Production Example was inoculated into a culture tank containing a main culture medium so as to have a concentration of 5.0 v/v %.
  • DP cell manufactured by Yokogawa Electric Corporation
  • the culture conditions were controlled such that the culture temperature was 34° C., the stirring power was 2.5 kw/m 3 , the aeration rate/initial liquid volume was 0.8 vvm, and the pH was 6.5.
  • a 14% ammonium hydroxide aqueous solution was used for pH control. Palm oil as a carbon source was added so that the rate of addition/volume of culture tank was 3.69 ⁇ 10 ⁇ 3 [1/hr].
  • the volume detected by the liquid level differential pressure gauge / the volume of the culture tank i.e., the liquid level height
  • the volume detected by the radio wave type liquid level sensor / the volume of the culture tank i.e., foam layer height
  • liquid level height/foam layer height was 0.91
  • the gas holdup rate was 0.27.
  • the final culture solution volume/volume of the culture tank detected by the differential pressure gauge at the end of the culture was 0.87.
  • the PHA weight/fermentor volume produced in the culture was 303 g/L.
  • the final volume of the culture solution detected by the differential pressure gauge/the volume of the culture tank at the end of the culture was 1.00.
  • the PHA weight/fermenter volume produced in the culture was 288 g/L.
  • the air-liquid interface of the culture solution in the culture tank can be accurately detected, it can be suitably used in culture equipment for microorganisms and other fields.

Abstract

本発明は、培養槽内における培養液の気液界面を正確に検知し得る培養装置を提供することを目的とする。培養槽の底部から泡沫層上部までの泡沫層高さを検知する液面センサと、前記培養槽の底部から気液界面までの液面高さを検知する圧力センサと、を備え、前記圧力センサは前記気液界面下に、少なくとも２つ設置されている、培養装置を提供することにより、上記課題を解決する。

Description

培養装置およびその利用
　本発明は、培養装置およびその利用に関する。
　脂肪酸類を基質としたポリヒドロキシアルカン酸（以下、「ＰＨＡ」と称する場合がある。）流加培養では、培養液中に気泡を大量に抱き込む恐れがある。気泡を大量に抱き込むと、見掛け上の培養液体積が上がるため、培養槽の容積を有効に使用できず、生産量が下がる。また、泡液一体化してしまうと酸素移動速度の低下により、生産性の低下を招く。そのため、液中に気泡が抱き込まれているかどうかを検知する必要がある。
　気泡抱き込みを検知するための装置として、例えば、特許文献１には、液溜部を有する液体タンク内の、液面レベルを検知するための差圧式レベル計と、泡沫面レベルを検知するための静電容量式レベルスイッチとを備える、泡立ち現象検知装置が記載されている。
　また、特許文献２には、タンク内の発泡性液の液面に発生する泡沫層に対して、液面下に圧力式液面検知センサ、液面上に光測長式液位センサを設けて、これらの組み合わせにより泡沫層を検知する泡沫層検知装置が記載されている。
特開２００４－０１２２２６号公報 実開平７－００３７０３号公報
　しかし、特許文献１および２の装置では、培養槽内の液相に設置する圧力センサが１つしかないため、培養中に液密度が変化すると、正確な泡／液面管理が困難となる場合があり、改善の余地がある。
　そこで、本発明の目的は、培養槽内における培養液の気液界面を正確に検知し得る培養装置を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、液面センサと、液相に設置した少なくとも２つの圧力センサと、を組み合わせることで、培養槽内における培養液の気液界面を正確に検知し得ることを初めて見出した。また、上記センサを備える培養装置を用いることにより、培養液への気泡抱き込みを抑制することを可能とし、１バッチ当たりの生産量を改善し得ることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
　したがって、本発明の一態様は、培養槽の底部から泡沫層上部までの泡沫層高さを検知する液面センサと、前記培養槽の底部から気液界面までの液面高さを検知する圧力センサと、を備え、前記圧力センサは前記気液界面下に、少なくとも２つ設置されている、培養装置である。
　本発明の一態様によれば、培養槽内における培養液の気液界面を正確に検知し得る培養装置を提供することができる。
本発明の一実施形態に係る、培養装置の概略図である。
　本発明の実施の一形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。
　〔１．本発明の概要〕
　本発明の一実施形態に係る培養装置（以下、「本培養装置」と称する。）は、培養槽の底部から泡沫層上部までの泡沫層高さを検知する液面センサと、前記培養槽の底部から気液界面までの液面高さを検知する圧力センサと、を備え、前記圧力センサは前記気液界面下に、少なくとも２つ設置されている、培養装置である。
　ビール製造等において用いられる液面センサ等での泡面管理では、本発明者らが検討した結果、泡液一体化した状態と泡面との区別ができないとの問題があることがわかった。例えば、特許文献１および２の技術では、培養槽内の液相に設置する圧力センサが１つしかないため、培養中に液密度が変化すると、正確な泡／液面管理が困難となる場合があることがわかった。
　そこで、本発明者らは、培養の生産効率を向上させることを目的として、泡／液面の管理を正確に行い得る培養装置について鋭意検討した結果、以下の知見を得ることに成功した：
・培養装置において、液面センサと、液相に設置した少なくとも２つの圧力センサと、を組み合わせることで、培養槽内における培養液の気液界面を正確に検知できる。
・培養装置において、液面センサと、液相に設置した少なくとも２つの圧力センサと、を組み合わせることで、培養中に液密度が変化する場合でも、培養液の気液界面を正確に検知できる。
・上記培養装置を用いることにより、培養液への気泡抱き込みを抑制することを可能とし、１バッチ当たりの生産量を改善し得る。
　このような特徴的なセンサの組み合わせ、および配置を備える培養装置は、従来にはなかったものであり、極めて優れた技術である。以下、本製造方法の構成について詳説する。
　〔２．培養装置〕
　（培養装置）
　本培養装置は、培養槽の底部から泡沫層上部までの泡沫層高さを検知する液面センサと、前記培養槽の底部から気液界面までの液面高さを検知する圧力センサと、を備え、前記圧力センサは前記気液界面下に、少なくとも２つ設置されていることを特徴とする。本培養装置は、上記構成を備えることにより、培養槽内における培養液の気液界面を正確に検知できる。また、培養中に液密度が変化する場合でも、培養液の気液界面の検知が可能となり、培養液への気泡抱き込みを抑制することができる。
　本培養装置について、図１を用いて詳説する。なお、本培養装置は、図１に示されたものに限定されない。また、以下では、圧力センサが気液界面下に少なくとも２つ設置されている場合を例に挙げて説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、圧力センサは３つ以上設置されていてもよい。このように圧力センサが３つ以上設置される場合、少なくとも２つの圧力センサが気液界面下に設置されていればよい。
　図１に示すように、本培養装置１０１は、上部圧力センサ２および下部圧力センサ３から構成される圧力センサ（差圧式液面センサ）と、液面センサ４と、を備えている。培養槽１には、培養液が充填されている。上部圧力センサ２および下部圧力センサ３は、培養槽１の気液界面９よりも下方に設置されている。空気供給管６から定常的に空気が供給され、供給された空気は、撹拌機５により培養液中に分散される。前記培養液に分散した空気は、その後、排気ライン７から排出される。また、炭素源投入ライン８より、炭素源が投入される。培養条件として、炭素源の添加速度等を変化させることで、培養液中への気泡の抱き込み量が変化し、気液界面９の高さ、および泡沫層１０の形成量が変化する。
　ここで、液面高さ３１は、前記圧力センサ（差圧式液面センサ）により検知される。液面高さ３１は、培養槽１の底部から気液界面９までの距離を意図する。具体的には、２つの圧力センサ（上部圧力センサ２および下部圧力センサ３）が気液界面９よりも下方に位置することにより、各圧力センサが検知した圧力に差が生じる。その結果、当該圧力差に基づいて、液面高さ３１を検知することが可能となる。また、前記圧力差に基づいて液面高さを算出するため、培養中に培養液の密度が変化した場合でも、液面高さ３１を検知できる。
　また、泡沫層高さ３２は、液面センサ４により検知される。泡沫層高さ３２は、液面高さ３１と泡沫層１０とを足した高さである。すなわち、泡沫層高３２さは、培養槽１の底部から泡沫層１０上部までの距離を意図する。ここで、前記圧力センサ（差圧式液面センサ）により測定した液面高さ３１と、前記液面センサ４により測定した泡沫層高さ３２を比較することにより、泡沫層１０の形成量を予測することができる。例えば、前記圧力センサ（差圧式液面センサ）により測定した液面高さ３１／前記液面センサ４により測定した泡沫層高さ３２の値が１に近づくほど、泡沫層１０の形成量が少ないと判定でき、前記圧力センサ（差圧式液面センサ）により測定した液面高さ３１／前記液面センサ４により測定した泡沫層高さ３２の値が１より小さくなる程、泡沫層１０の形成量が多いと判定できる。このような、泡沫層１０の形成量（例えば、前記圧力センサ（差圧式液面センサ）により測定した液面高さ３１／前記液面センサ４により測定した泡沫層高さ３２、の値）に応じて培養条件を適宜変更することにより、培養効率を向上させることができる。
　本培養装置１０１における液面センサ４としては、培養槽１の底部から泡沫層１０上部までの泡沫層高さ３２を検知できるものであれば特に限定されないが、例えば、レーザー液面計、超音波式レベル計、マイクロ波レーダー式レベル計、静電容量式レベル計等が挙げられる。液面センサは、非接触で測定可能であり、かつ、安価であるとの観点から、好ましくは、レーザー液面計である。
　本培養装置１０１における圧力センサ２・３としては、培養槽１の底部から気液界面９までの液面高さ３１を検知できるものであれば特に限定されないが、例えば、差圧式レベルセンサ（ＤＰセル）等が挙げられる。２つの圧力センサを圧力センサ２・３の箇所に設置し差圧を測定してもよい。
　（液面高さ／泡沫層高さ）
　本発明の一実施形態において、本培養装置１０１は、前記圧力センサ２・３により測定した液面高さ３１／前記液面センサ４により測定した泡沫層高さ３２の数値が一定の範囲となるように培養条件を調整する調整機構を備えることが好ましい。前記調整機構により、前記圧力センサにより測定した液面高さ３１／前記液面センサ４により測定した泡沫層高さ３２の数値が、０．８５～０．９９となるように培養条件を調整することが好ましく、０．８５～０．９５となるように培養条件を調整することがより好ましく、０．８５～０．９２となるように培養条件を調整することがさらに好ましい。前記数値が０．９９以下となるように調整されていれば、泡沫層１０が存在するため、後述するガスホールドアップ率が高くなりすぎない。前記数値が０．８５以上となるように調整されていれば、培養効率が向上する。
　液面高さ３１は、例えば、ＤＰセル等の差圧式圧力センサによって測定することができる。差圧式圧力センサは、２つの圧力センサ２・３が検知する圧力の差を利用して、液面高さ３１を測定する。液面高さ３１は、気液界面９から下部圧力センサ３までの距離２２と、下部圧力センサ３から培養槽１底部までの距離２３と、を合計することによって算出できる。気液界面９から下部圧力センサ３までの距離２２は、下記式（１）によって求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　上記式（１）中、Ｐ１は、上部圧力センサ２によって検知される圧力を示し、Ｐ２は、下部圧力センサ３によって検知される圧力を示し、Ｌ１は、気液界面９から上部圧力セン２までの距離２１を示し、Ｌ２は、気液界面９から下部圧力センサ３までの距離２２を示す。なお、Ｌ２－Ｌ１は、上述した通り各圧力センサが検知する圧力に差が生じる距離であれば特に限定されない。
　（培養条件の調整機構）
　本培養装置１０１における培養条件の調整機構は、例えば、炭素源の添加速度、培養液の撹拌動力、バブリング条件、攪拌翼形状等のうち、少なくとも一つを調整可能な機構である。すなわち、前記調整機構は、炭素源の添加速度、培養液の撹拌動力、バブリング条件、攪拌翼形状等を制御することにより、泡沫層１０の形成量を調整し、圧力センサ２・３により測定した液面高さ３１／前記液面センサ４により測定した泡沫層高さ３２を適当な範囲に調整できる。
　本発明の一実施形態において、前記調整機構による培養条件の調整は、簡便かつ効率的に、圧力センサ２・３により測定した液面高さ３１／前記液面センサ４により測定した泡沫層高さ３２を変動させる観点から、炭素源の添加速度、培養液の撹拌動力、およびバブリング条件からなる群より選択される少なくとも一つにより行われることが好ましい。
　前記調整機構による培養条件の調整が、炭素源の添加速度により行われる場合、炭素源の添加速度を上昇させると泡沫層１０の形成量は増加し、添加速度を低下させると泡沫層１０の形成量は減少する。培養槽容積（Ｌ）に対する炭素源の添加速度（Ｌ／ｈｒ）（以下、「添加速度／培養槽の容積」とも称する。）は、例えば、２．０～３．８［１／ｈｒ］であり、好ましくは、２．５～３．７５［１／ｈｒ］であり、より好ましくは、３．０～３．７［１／ｈｒ］である。炭素源の添加速度が上記の範囲であると、圧力センサ２・３により測定した液面高さ３１／前記液面センサ４により測定した泡沫層高さ３２を適当な範囲に調整でき、結果として、１バッチ当たりの生産量を上げることができる。炭素源の添加速度の調整機構は、例えば、図１の炭素源投入ライン８であり得る。
　炭素源としては、特に限定されないが、培養液への分散性の観点から、界面活性作用を有する炭素源であることが好ましい。界面活性作用を有する炭素源としては、例えば、植物油に由来する脂質類、グリセリン、多価アルコール等が挙げられる。中でも、菌体資化性の観点から、植物油に由来する脂質類が好ましい。前記植物油としては、特に限定されないが、例えば、パーム油、オリーブ油、コーン油、キャノーラ油、ココナッツ油、ダイズ油、小麦麦芽油、ホホバ油、ヒマワリ油、ゴマ、ピーナッツ、綿実、ベニバナ、ダイズ、ナタネ、アーモンド、ブナの実、カシュー、ヘーゼルナッツ、マカダミア、モンゴンゴナッツ、ペカン、マツの実、ピスタチオ、クルミ、グレープフルーツ種子、レモン、オレンジ、ニガウリ、ヒョウタン、バッファローカボチャ、バターナッツ種子、エグシ種子、カボチャ種子、スイカ種子、アサイー、ブラックシード、クロフサスグリ種子、ボリジ種子、マツヨイグサ、亜麻仁、ユーカリ、アマランス、アプリコット、リンゴ種子、アルガン、アボカド、ババス、コリアンダー種子、ブドウ種子、マスタード、ケシの実、米糠、トウゴマ、またはこれらの組合せ等が挙げられる。中でも、入手容易性の観点から、パーム油であることが好ましい。
　前記調整機構による培養条件の調整が、培養液の撹拌動力により行われる場合、培養液の撹拌動力を上昇させると泡沫層１０の形成量は増加し、撹拌動力を低下させると泡沫層１０の形成量は減少する。培養液の単位体積当たりの撹拌動力は、例えば、１．５～４．０ｋｗ／ｍ３であり、好ましくは、１．５～３．５ｋｗ／ｍ３であり、より好ましくは、２．０～３．０ｋｗ／ｍ３である。培養液の撹拌動力が上記の範囲であると、圧力センサ２・３により測定した液面高さ３１／前記液面センサ４により測定した泡沫層高さ３２を適当な範囲に調整でき、結果として、１バッチ当たりの生産量を上げることができる。培養液の撹拌動力の調整機構は、例えば、図１の撹拌機５であり得る。
　前記調整機構による培養条件の調整が、バブリング条件により行われる場合、バブリング量を上昇させると泡沫層１０の形成量は増加し、バブリング量を低下させると泡沫層１０の形成量は減少する。バブリング条件は、例えば、０．２～２．０ｖｖｍであり、好ましくは、０．４～１．５ｖｖｍであり、より好ましくは、０．６～１．２ｖｖｍである。バブリング条件が上記の範囲であると、圧力センサ２・３により測定した液面高さ３１／前記液面センサ４により測定した泡沫層高さ３２を適当な範囲に調整でき、結果として、１バッチ当たりの生産量を上げることができる。バブリング条件の調整機構は、例えば、図１の空気供給管６であり得る。
　（ガスホールドアップ率）
　本発明の一実施形態において、本培養装置１０１における培養では、通気攪拌を行う。当該通気撹拌により、培養液が空気を抱き込み、ガスホールドアップが生じる。
　本明細書において、「ガスホールドアップ率」とは、ガスホールドアップが生じている培養液の体積全体に対する、気泡の体積の割合を意図する。ガスホールドアップ率が大きいと、培養槽の容積を有効に使用できず、培養効率が低下する。一方でガスホールドアップ率が低い場合でも、培養液中に空気が溶けにくいため、培養効率が低下する。よって、ガスホールドアップ率は、一定の範囲に制御することが好ましい。
　本発明の一実施形態において、ガスホールドアップ率(ε)は、例えば、０．２０～０．３２であり、好ましくは、０．２３～０．３０であり、より好ましくは、０．２６～０．２９である。ガスホールドアップ率が０．２０以上であれば、培養液中に空気が溶けやすくなり、０．３２であれば、培養槽１の容積を有効利用できるために、１バッチあたりの生産性を高くできる。ここで、ガスホールドアップ率εは、下記式（２）によって定義される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　上記式（２）中、Ｖｆはガスホールドアップ発生時の培養液の体積を示し、Ｖ０は培養槽１への培養液投入量を示す。
　なお、ガスホールドアップ率は、図１の空気供給管６により制御される。
　（その他）
　本培養装置１０１が備える培養槽１の容積、および培養槽１の高さ／培養槽１の直径は特に限定されず、上部圧力センサ２および下部圧力センサ３によって検知される圧力に差がでるだけの距離に圧力センサ２・３を設置できる大きさであればよい。
　本培養装置１０１の培養槽１の容積は、例えば、０．４～３５０ｍ３であり、好ましくは、１～３３０ｍ３であり、より好ましくは、２～３００ｍ３である。
　本発明の一実施形態において、本培養装置１０１の培養槽１の高さ／培養槽１の直径は、例えば、１．５～３．０であり、好ましくは、１．７～２．７であり、より好ましくは、１．９～２．５である。
　本発明の一実施形態において、本培養装置１０１の培養槽１の容積が０．４～３５０ｍ３であり、かつ、培養槽１の高さ／培養槽１の直径が１．５～３．０であることが好ましい。
　本培養装置１０１の培養槽１としては、特に限定されないが、容量を大きくできる観点から、ＳＵＳ（ステンレス鋼）製容器であることが好ましい。
　（微生物）
　上述した本培養装置１０１によって、培養液中の泡沫層１０、およびガスホールドアップ率を調整し、培養液中で微生物を培養することができる。
　前記微生物としては、特に限定されないが、例えば、生態系への悪影響がほとんどない環境調和型の生分解性プラスチックを生産することができる微生物等が挙げられる。中でも、微生物によって植物由来の天然の有機酸や油脂を炭素源として生産され、細胞内にエネルギー蓄積物質として蓄積されるＰＨＡを生産する微生物が好ましい。
　前記ＰＨＡは、３－ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとする重合体の総称である。ＰＨＡを構成する３－ヒドロキシアルカン酸としては特に限定されないが、例えば、３－ヒドロキシプロピオネート、３－ヒドロキシブチレート、３－ヒドロキシバレレート、３－ヒドロキシヘキサノエート、３－ヒドロキシヘプタノエート、及び３－ヒドロキシオクタノエート等が挙げられる。前記ＰＨＡは、１種の３－ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとする単独重合体であってもよく、２種以上の３－ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとする共重合体であってもよい。前記共重合体としては、３－ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）と他の３－ヒドロキシアルカン酸との共重合体、少なくとも３－ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）をモノマーユニットとして含む３－ヒドロキシアルカン酸の共重合体等が挙げられる。前記ＰＨＡとしては、具体的には、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシヘキサノエート）（ＰＨＢＨ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシバレレート－コ－３－ヒドロキシヘキサノエート）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシヘキサノエート）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－４－ヒドロキシブチレート）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシオクタノエート）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシオクタデカノエート）等が、工業的に生産が容易である点から、好ましい。
　前記ＰＨＡの生産に用いる微生物としては、ＰＨＡ類生産能を有する微生物であれば特に限定されない。天然から単離された微生物、菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている微生物、又はそれらから調製し得る変異体や形質転換体等の遺伝子操作された微生物等を使用できる。
　具体的には、カピリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）等のカピリアビダス属；アルカリゲネス・ラタス（Alcaligenes latas）等のアルカリゲネス属；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonasfluorescens）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・レジノボランス（Pseudomonas resinovorans）、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）等のシュードモナス属；バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）等のバチルス属；アゾトバクター属；ノカルディア属；アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）等のアエロモナス属；ラルストニア（Ralstonia）属；ワウテルシア（Wautersia）属；コマモナス（Comamonas）属等が挙げられる（Microbiological Reviews, 54(4), 450-472 (1990)）。
　上述した微生物等の他にも、遺伝子工学的な手法を用いて、ＰＨＡ合成酵素遺伝子等を導入することにより、人為的にＰＨＡを生産させる改変を施した生物細胞を用いることもできる。例えば、上記カピリアビダス属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、バチルス属、アゾトバクター属、ノカルディア属、アエロモナス属、ラルストニア属、ワウテルシア（Wautersia）属、コマモナス（Comamonas）属等に属する微生物のほかにも、エシェリキア（Escherichia）属等のグラム陰性の細菌、バチルス（Bacillus）属等のグラム陽性の細菌、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ヤロウィア（Yarrowia）属、キャンディダ（Candida）属等の酵母類等を好適に用いて人為的にＰＨＡを生産させる改変を施した生物細胞を得ることができる。
　微生物の培養においては、各微生物の通常の培養方法と同様の方法によって培養することができる。
　前記培養方法で培養した微生物からは、周知の方法を用いてＰＨＡを回収することができる。例えば、次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水及びメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを含む溶液を抽出する。このＰＨＡを含んだ溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノール、またはヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過、および遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収する。なお、貧溶媒とは生成物に対して溶解度の小さい溶媒のことをいう。
　前記微生物の培養に使用される培養液は、特に限定されず、公知の培養液を使用することができる。
　〔３．培養方法〕
　本発明の一実施形態において、本培養装置を用いて微生物を培養することを特徴とする、培養方法（以下、「本培養方法」と称する。）を提供する。本培養方法は、本培養装置を用いるため、培養槽内における培養液の気液界面を正確に検知することができ、培養液への気泡抱き込みを抑制して、生産性を高めることができる。
　本発明の一実施形態において、本培養方法は、下記の工程（ａ）～（ｂ）を含むことが好ましい。
・工程（ａ）：本培養装置を用いて、前記液面高さおよび泡沫層高さを測定する工程
・工程（ｂ）：前記圧力センサにより測定した液面高さ／前記液面センサにより測定した泡沫層高さが、０．８５～０．９９となるように培養条件を調整する工程
　本実施形態では、本培養装置を用いて測定した液面高さおよび泡沫層高さに基づき、前記液面高さおよび泡沫層高さが一定の範囲となるように、培養条件を調整する。
　工程（ａ）において、液面高さおよび泡沫層高さの測定は、上記〔２．培養装置〕に記載した方法で行われる。また、工程（ｂ）において、前記圧力センサにより測定した液面高さ／前記液面センサにより測定した泡沫層高さの調整は、上記〔２．培養装置〕に記載した方法で行われる。
　本発明の一実施形態において、本培養方法は、さらに、以下の工程（ｃ）を含むことが好ましい。
・工程（ｃ）：培養液中のガスホールドアップ率を０．２０～０．３２に制御する工程
工程（ｃ）により、培養槽の容積を有効利用でき、１バッチあたりの生産性を高くできる。
　なお、本培養方法において、「微生物」、「培養条件の調整」、「培養槽容積」、「培養槽の高さ／培養槽の直径」等については、上記〔２．培養装置〕に記載したものが援用される。
　〔４．ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法〕
　本発明の一実施形態において、本培養装置を用いて微生物を培養する工程、または本培養方法を一工程として含む、ＰＨＡの製造方法（以下、「本製造方法」と称する。）を提供する。本製造方法は、本培養装置または本培養方法を用いるため、培養槽内における培養液の気液界面を正確に検知することができ、培養液への気泡抱き込みを抑制して、生産性を高めることができる。
　本発明の一実施形態において、本製造方法は、上記〔３．培養方法〕に記載した工程（ａ）～（ｂ）または工程（ａ）～（ｃ）の工程を含み得る。
　本発明の一実施形態において、前記微生物を、界面活性作用を有する炭素源を含む培養液中で培養することが好ましい。これにより、ポリヒドロキシアルカン酸の生産性が高まるとの利点を有する。
　本発明の一実施形態において、本製造方法におけるＰＨＡ重量／培養槽の容積は、２９０ｇ／Ｌ以上であることが好ましく、３００ｇ／Ｌ以上であることがより好ましい。なお、ＰＨＡ重量／培養槽の容積は、目的物質の生産性を示す指標である。
　本発明の一実施形態において、本製造方法は、微生物を培養する工程の他に、それに続く、以下の任意の工程を含んでいることが好ましい。
・前記微生物を不活化する工程
・前記不活化した微生物を破砕する工程
・前記破砕した破砕液から、ＰＨＡを分離、濃縮する工程
・濃縮したＰＨＡ水性懸濁液を乾燥する工程
　前記の各工程は、公知である任意の方法により行われる。
　なお、本製造方法において、「微生物」、「ＰＨＡ」、「培養」、「炭素源」、「界面活性作用を有する炭素源」等については、上記〔２．培養装置〕に記載したものが援用される。
　本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　すなわち、本発明の一実施形態は、以下である。
＜１＞培養槽の底部から泡沫層上部までの泡沫層高さを検知する液面センサと、前記培養槽の底部から気液界面までの液面高さを検知する圧力センサと、を備え、
　前記圧力センサは前記気液界面下に、少なくとも２つ設置されている、培養装置。
＜２＞前記圧力センサにより測定した液面高さ／前記液面センサにより測定した泡沫層高さが、０．８５～０．９９となるように培養条件を調整する調整機構を備えた、＜１＞に記載の培養装置。
＜３＞前記培養条件の調整機構が、炭素源の添加速度、培養液の撹拌動力、およびバブリング条件からなる群より選択される少なくとも一つを調整可能な機構である、＜２＞に記載の培養装置。
＜４＞前記培養槽の容積が０．４～３５０ｍ３であり、かつ、培養槽の高さ／培養槽の直径が１．５～３．０である、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の培養装置。
＜５＞＜１＞に記載の培養装置を用いて微生物を培養することを特徴とする、培養方法。
＜６＞（ａ）＜１＞に記載の培養装置を用いて、前記液面高さおよび泡沫層高さを測定する工程、および
　（ｂ）前記圧力センサにより測定した液面高さ／前記液面センサにより測定した泡沫層高さが、０．８５～０．９９となるように培養条件を調整する工程、
を含む、＜５＞に記載の培養方法。
＜７＞前記培養条件の調整が、炭素源の添加速度、培養液の撹拌動力、およびバブリング条件からなる群より選択される少なくとも一つである、＜６＞に記載の培養方法。
＜８＞前記炭素源の添加速度が、２．０～３．８［１／ｈｒ］である、＜７＞に記載の培養方法。
＜９＞前記培養液の単位体積当たりの撹拌動力が、１．５～４．０ｋｗ／ｍ３である、＜７＞に記載の培養方法。
＜１０＞前記バブリング条件が、０．２～２．０ｖｖｍである、＜７＞に記載の培養方法。
＜１１＞さらに、（ｃ）培養液中のガスホールドアップ率を０．２０～０．３２に制御する工程を含む、＜５＞～＜１０＞のいずれかに記載の培養方法。
＜１２＞＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の培養装置を用いて微生物を培養する工程、または＜５＞～＜１１＞のいずれかに記載の培養方法を一工程として含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
＜１３＞前記微生物を、界面活性作用を有する炭素源を含む培養液中で培養する、＜１２＞に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
＜１４＞前記炭素源が、植物油に由来する脂質類である、＜１３＞に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
　以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　〔測定および評価方法〕
　実施例および比較例における測定および評価を、以下の方法で行った。
　（液面高さの測定）
　液面高さは、液面差圧計により測定（算出）した。簡潔には、液面高さは、液面差圧計の２つの圧力センサが検知する圧力差を利用して測定（算出）した。気液界面から下部圧力センサまでの距離（Ｌ２）は、下記式（１）により求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　（式中、Ｐ１は、上部圧力センサによって検知される圧力を示し、Ｐ２は、下部圧力センサによって検知される圧力を示し、Ｌ１は、気液界面から上部圧力センサまでの距離を示し、Ｌ２は、気液界面から下部圧力センサまでの距離を示す。）
　（培養液密度）
　培養液密度は、液面差圧計により測定した液面高さ（培養槽内の液体の体積）を、培養槽内に投入した培養液の重量によって除することによって算出した。
　〔製造例１〕
　培養生産にはＫＮＫ－６３１株（特開２０１３－００９６２７号公報および国際公開２０１６／１１４１２８号を参照）を用い、種母培養、続いて前培養を行い、菌体を回収した。
　（培地）
　種母培養、前培養、および後述する本培養には、それぞれ以下の培地を使用した。
　＜種母培養培地＞
　種母培養培地の組成は、１ｗ／ｖ％のＭｅａｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％のＢａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％のＹｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％のＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、および０．１５ｗ／ｖ％のＫＨ２ＰＯ４とし、ｐＨを６．８とした。
　＜前培養培地＞
　前培養培地の組成は、１．１ｗ／ｖ％のＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％のＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％の（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％の微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に、１．６ｗ／ｖ％のＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％のＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％のＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％のＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶解させた溶液）とした。炭素源としては、パーム油を１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。
　＜本培養培地＞
　本培養培地の組成は、０．３８５ｗ／ｖ％のＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％のＫＨ２ＰＯ４、０．２９１ｗ／ｖ％の（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％の微量金属塩溶液（０．１Ｎの塩酸に、１．６ｗ／ｖ％のＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％のＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％のＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％のＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶解させた溶液）、および０．０５ｗ／ｖ％のＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。
　（種母培養）
　まず、ＫＮＫ－６３１株のグリセロールストックを種母培地に接種して、３０℃で２４時間培養し、種母培養液を得た。
　（前培養）
　得られた前記種母培養液を、前培養培地を入れた容器に１．０ｖ／ｖ％接種した。培養温度３０℃、ｐＨ６．５でコントロールしながら、２４時間培養した。ｐＨコントロールには、１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
　〔実施例１〕
　培養槽として、槽容積５．０ｍ３、培養槽の高さ／培養槽の直径が２．５のＳＵＳ製培養槽を用いた。培養槽には圧力センサとして、液面差圧計（ＤＰセル、横河電機社製）を設置し、上部圧力センサと、下部圧力センサとの距離は８８ｃｍとした。また、培養槽上部に、液面センサとして、電波式液面センサ（エンドレスハウザー社製）を設置した。製造例において得られた前培養液を、本培養培地を入れた培養槽に５．０ｖ／ｖ％の濃度となるように接種した。培養条件は、培養温度３４℃、攪拌動力２．５ｋｗ／ｍ３、通気量／初発液容量を０．８ｖｖｍとし、ｐＨは６．５となるようにコントロールした。ｐＨコントロールには、１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源であるパーム油を、添加速度／培養槽の容積が３．６９×１０－３［１／ｈｒ］となるように添加した。
　４０時間後の、液面差圧計が検知した体積／培養槽の容積（すなわち、液面高さ）は０．８１を示し、電波式液面センサが検知した体積／培養槽の容積（すなわち、泡沫層高さ）は０．８９を示した（液面高さ／泡沫層高さは０．９１）。すなわち、培養液面上部に泡沫層が発生しており、液面差圧計により液面を、電波式液面センサにより泡沫層表面を検知できていることが分かった。また、ガスホールドアップ率は、０．２７となった。
　４８時間以上培養し、培養終了時の、液面差圧計により検知された最終培養液体積／培養槽の容積は０．８７となった。当該培養で生産された、ＰＨＡ重量／培養槽の容積は、３０３ｇ／Ｌであった。
　〔比較例１〕
　炭素源であるパーム油を、添加速度／培養槽の容積が３．８４×１０－３［１／ｈｒ］となるように添加したこと以外は、実施例１と同様にして、培養を行った。４０時間後の、液面差圧計が検知した体積／培養槽の容積（すなわち、液面高さ）は０．８２を示し、電波式液面センサが検知した体積／培養槽の容積（すなわち、泡沫層高さ）も０．８２を示した（液面高さ／泡沫層高さは１．００）。すなわち、培養液上部に泡沫層は形成されておらず、培養液に気泡が完全に抱き込まれていることが分かった。また、ガスホールドアップ率は、０．３３となった。
　４８時間以上培養し、培養終了時の、液面差圧計により検知された最終培養液体積／培養槽の容積は１．００となった。当該培養で生産された、ＰＨＡ重量／培養槽の容積は、２８８ｇ／Ｌであった。
　〔結果〕
　上記より、培養液の液上部の泡沫層高さを検知する液面センサと、前記培養液の気液界面を検知する圧力センサと、を備え、前記圧力センサは前記培養液の気液界面下に２つ設置されている、培養装置を用いることにより、気液界面を正確に検知できることが分かった。
　また、実施例と比較例を比して、炭素源添加速度を抑えることにより、培養液のガスホールドアップを抑制できることが分かった。その結果、培養槽の体積を有効に活用でき、１バッチあたりのＰＨＡ生産量を上げることができた。
　また、表１に示すように、実施例および比較例のいずれにおいても、培養槽内の培養液の密度が変化しても、培養液の気液界面の検知が可能であることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明によれば、培養槽内における培養液の気液界面を正確に検知できることから、微生物等の培養装置、その他の分野において、好適に利用することができる。
　１　培養槽
　２　上部圧力センサ
　３　下部圧力センサ
　４　液面センサ
　５　撹拌機
　６　空気供給管
　７　排気ライン
　８　炭素源投入ライン
　９　気液界面
　１０　泡沫層
　２１　気液界面から上部圧力センサまでの距離
　２２　気液界面から下部圧力センサまでの距離
　２３　下部圧力センサから培養槽底部までの距離
　３１　液面高さ
　３２　泡沫層高さ
　１０１　培養装置

 

Claims (14)

  1. 　培養槽の底部から泡沫層上部までの泡沫層高さを検知する液面センサと、前記培養槽の底部から気液界面までの液面高さを検知する圧力センサと、を備え、
    　前記圧力センサは前記気液界面下に、少なくとも２つ設置されている、培養装置。
  2. 　前記圧力センサにより測定した液面高さ／前記液面センサにより測定した泡沫層高さが、０．８５～０．９９となるように培養条件を調整する調整機構を備えた、請求項１に記載の培養装置。
  3. 　前記培養条件の調整機構が、炭素源の添加速度、培養液の撹拌動力、およびバブリング条件からなる群より選択される少なくとも一つを調整可能な機構である、請求項２に記載の培養装置。
  4. 　前記培養槽の容積が０．４～３５０ｍ３であり、かつ、培養槽の高さ／培養槽の直径が１．５～３．０である、請求項１～３のいずれか１項に記載の培養装置。
  5. 　請求項１に記載の培養装置を用いて微生物を培養することを特徴とする、培養方法。
  6. 　（ａ）請求項１に記載の培養装置を用いて、前記液面高さおよび泡沫層高さを測定する工程、および
    　（ｂ）前記圧力センサにより測定した液面高さ／前記液面センサにより測定した泡沫層高さが、０．８５～０．９９となるように培養条件を調整する工程、
    を含む、請求項５に記載の培養方法。
  7. 　前記培養条件の調整が、炭素源の添加速度、培養液の撹拌動力、およびバブリング条件からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項６に記載の培養方法。
  8. 　前記炭素源の添加速度が、２．０～３．８［１／ｈｒ］である、請求項７に記載の培養方法。
  9. 　前記培養液の単位体積当たりの撹拌動力が、１．５～４．０ｋｗ／ｍ３である、請求項７に記載の培養方法。
  10. 　前記バブリング条件が、０．２～２．０ｖｖｍである、請求項７に記載の培養方法。
  11. 　さらに、（ｃ）培養液中のガスホールドアップ率を０．２０～０．３２に制御する工程を含む、請求項５～１０のいずれか１項に記載の培養方法。
  12. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の培養装置を用いて微生物を培養する工程、または請求項５～１１のいずれか１項に記載の培養方法を一工程として含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  13. 　前記微生物を、界面活性作用を有する炭素源を含む培養液中で培養する、請求項１２に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  14. 　前記炭素源が、植物油に由来する脂質類である、請求項１３に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
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