WO2022115980A1 - 吲哚菁绿的精制方法 - Google Patents
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- C09B67/0096—Purification; Precipitation; Filtration
Definitions
- Fluorescence imaging is an imaging technique based on injecting fluorescently labeled drugs or other substances into animals or humans and detecting the location of the fluorescent labels. It has a unique position in modern medicine, mainly as other methods (eg, MRI, PET, Complementary imaging techniques such as SPECT, ultrasound echography, radiography or X-tomography) have important research value and application value in life science and biomedical research.
- MRI magnetic resonance imaging
- PET PET
- Complementary imaging techniques such as SPECT, ultrasound echography, radiography or X-tomography
- indocyanine green (chemical name: 2-[7-[1,3-dihydro-1,1-dimethyl-3-(4-sulfobutyl)-2H-benzo[ e]Indole-2-ylidene]-1,3,5-heptatrien-1-yl]-1,1-dimethyl-3-(4-sulfobutyl)-1H-benzo[ e]
- Indole inner salt, sodium salt (1:1) as a class of near-infrared dyes, is widely used clinically due to its excellent fluorescence penetration, good imaging and better stability.
- the inventor cannot obtain a product with a sodium iodide content of less than 5%.
- Sodium iodide cannot be effectively removed by using acetone alone as a solvent, so that pharmaceutical grade indocyanine green cannot be obtained.
- the method in this document can only obtain crude indocyanine green.
- the object of the present invention is to provide a kind of high yield that can efficiently remove inorganic salt impurities while obtaining The purification method of indocyanine green.
- a first aspect of the present application provides a method for purifying indocyanine green, the purification method comprising the steps of: dissolving crude indocyanine green in a good solvent at a temperature of 0°C to 80°C Then, the poor solvent was slowly added dropwise thereto, stirred, fully crystallized, and filtered.
- the good solvent can be selected from at least one of methanol, ethanol and isopropanol; and the poor solvent can be selected from acetone, methyl tert-butyl ether, n-heptane, At least one of ethyl acetate, acetonitrile and dichloromethane.
- the crystals can be washed with the same poor solvent after filtration, and dried to obtain the final product.
- the content of sodium iodide in the product may even be below 2.5%; and the content of triethylamine in the product may even be below 0.2%.
- the purification method of the present invention can efficiently remove inorganic salts including sodium iodide, and stably obtain indocyanine green products that meet the standards of pharmaceutical injection preparations with high yield.
- the inventors further found that there is a certain amount of indocyanine green triethylamine salt in the indocyanine green raw material synthesized by the existing method, and this salt has not been reported before.
- the method of the invention can effectively remove the salt while removing the sodium iodide, thereby further reducing the inorganic salt impurities in the product, and improving the quality of the medicine and the safety of injection.
- the method of the present invention is more preferably carried out at room temperature, the operation is simple, and it is a method more suitable for industrial purification.
- Fig. 1 is the H NMR spectrum of the crude indocyanine green product obtained in Preparation Example.
- references herein to "crude indocyanine green” refer to unrefined indocyanine green triethylamine salt obtained by sodium iodide displacing triethylamine in indocyanine green triethylamine salt Mixtures with indocyanine green containing impurities mainly sodium iodide and indocyanine green triethylamine salt, wherein the sodium iodide content is greater than 3.5%, especially greater than 5% as specified in the pharmacopoeia, and/or triethylamine The amine content is greater than 0.5%, especially greater than 2% of the crude product.
- references herein to "medicinal"/"injection” indocyanine green, or “medicinal”/"injection” indocyanine green products refer to Chinese Pharmacopoeia products that can be injected into animals or humans for fluorescence Imaging detected indocyanine green in which the active ingredient is 2-[7-[1,3-dihydro-1,1-dimethyl-3-(4-sulfobutyl)-2H-benzo[e ]Indole-2-ylidene]-1,3,5-heptatrien-1-yl]-1,1-dimethyl-3-(4-sulfobutyl)-1H-benzo[e ] Indole inner salt and sodium salt (1:1).
- the inventors of the present application found that although the known method for removing sodium iodide can effectively remove sodium iodide, the yield of indocyanine green is greatly reduced. In response to this phenomenon, the inventors of the present invention have made intensive studies, and have proposed the purification method of the present invention.
- the present invention does not adopt a conventional extraction method, but selects a specific solvent combination to remove inorganic impurities through a method of recrystallization. This method not only removes inorganic salt impurities such as sodium iodide more efficiently, but also has a high yield.
- the impurities usually contained not only include sodium iodide and a small amount of free triethylamine, but also contain a certain amount of indocyanine green triethylamine salt as an impurity (see The following structural formula), which can contribute up to about 5% of triethylamine, has a certain safety hazard, so it is necessary to remove the triethylamine salt.
- the method of the present invention can surprisingly simultaneously remove sodium iodide and triethylamine salts from the crude indocyanine green product with high efficiency, thereby obtaining indocyanine green for injection with further improved quality. Moreover, the method significantly improves the final yield of the product, is simple to operate, and is suitable for industrial production.
- indocyanine green is dissolved in a good solvent at a temperature of 0-80° C., and then the poor solvent is slowly added dropwise thereto, followed by stirring and filtration.
- the good solvent is methanol, ethanol and/or isopropanol.
- Poor solvents are acetone, methyl tert-butyl ether, n-heptane, ethyl acetate, acetonitrile and/or dichloromethane.
- the good solvent and the poor solvent can be combined in any manner. That is, one or more of the good solvents can be selected, and one or more of the same poor solvents can be selected.
- the preferred good solvent is methanol.
- Preferred poor solvents are acetone, methyl tert-butyl ether and/or ethyl acetate.
- the purification method of the present invention can be carried out in a wide temperature range, but is preferably carried out at 20 to 40°C, more preferably at ambient temperature. This can further reduce energy consumption, and even achieve better impurity removal and higher yields than under heating.
- the method of the present invention may also include the step of adding a small amount of seed crystals after the poor solvent is added dropwise to accelerate the crystallization. For example, after adding a small amount of seed crystals, it can be stirred for more than 1 hour to complete the crystallization. Said seed crystals are obtained according to the above-described method of the present invention.
- the content of sodium iodide and triethylamine was determined by the following titration method:
- Purity calculation method The relevant impurity content is calculated at different wavelengths according to the respective correction factors to obtain the purity data of the indocyanine green product.
- the light blue solid obtained is 2,3,3-trimethyl-1-(4-sulfobutyl)-4,5-benzindole betaine, wherein 2,3,3-trimethyl -4,5-benzoindolebenzene and xylene were added in a ratio of 1:0.8 by weight.
- the purity of indocyanine green in the crude product was determined to be 98.63% by the above-mentioned HPLC method.
- the content of sodium iodide in the crude product prepared according to the method of Example 1 in the patent document CN104130178A is 7.20%, and the total amount of triethylamine reaches 5.60%, which is the same as the product obtained in Example 1 reported in this document.
- a sodium iodide content of 1.0% and a related substance content of 1.5% are a far cry. This shows that the method in this document can only obtain the crude indocyanine green product, but cannot obtain the injection product that meets the requirements of the Pharmacopoeia.
- Indocyanine green triethylamine salt is similar to indocyanine green sodium salt in structure and related physical and chemical properties, and it is not easy to remove.
- the gas phase method cannot detect the salt-forming triethylamine in the product, and the titration method is used to detect the triethylamine.
- the residue is high, far exceeding the 0.5% limit requirement for triethylamine in pharmaceuticals in ICH Q3C (ie, ICH "Q3C (R7) Impurities: Residual Solvents Guidelines”), which seriously affects product quality.
- Examples 11-14 take methanol and acetone solvent combination as an example to investigate the effect of solvent dosage ratio on the removal effect of sodium iodide and indocyanine green acid triethylamine salt.
- the above product obtained by refining according to the method of the present invention and the former foreign agent product are measured by the above test method wherein sodium iodide and triethylamine content and contrast, as shown in the following table 4 shown.
- the residual amounts of sodium iodide and triethylamine are far lower than the standard of the pharmacopoeia, and are obviously better than the original preparation product.
- the yield of the indocyanine green prepared by the patented method is obviously improved compared with the known purification method, the operation process is simple, and it is suitable for industrial production.
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Abstract
提供一种吲哚菁绿的精制方法。所述方法包括如下步骤：在0℃～80℃的温度下，将吲哚菁绿粗品溶解在良溶剂中，然后向其中缓慢滴加不良溶剂，进行搅拌，充分析晶后过滤。该方法能够以高收率得到有效去除无机及有机杂质的药用吲哚菁绿产品。
Description
本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及一种作为药用吲哚菁绿的精制方法。
荧光成像是一种基于将带荧光标记的药物或者其他物质注入动物或人并且检测荧光标记定位的成像技术，其在近代医疗中具有独特的地位，主要是作为其他方法(例如，MRI、PET、SPECT、超声回波描技术、放射摄影术或X-断层摄影术)的互补成像技术，在生命科学和生物医学研究中具有重要的研究价值和应用价值。在荧光成像中，吲哚菁绿(化学名：2-[7-[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(4-磺酸丁基)-2H-苯并[e]吲哚-2-亚基]-1,3,5-庚三烯-1-基]-1,1-二甲基-3-(4-磺酸丁基)-1H-苯并[e]吲哚内盐，钠盐(1:1))作为一类近红外染料，以其优异的荧光穿透力、良好的显像性以及较佳的稳定性正在临床上广泛使用。
作为吲哚菁绿的制备方法，专利文献CN104130178公开了一种吲哚菁绿的合成方法，其中最后一步在甲醇中用碘化钠置换吲哚菁绿三乙胺盐中的三乙胺，然后蒸干甲醇，加入丙酮，回流并过滤，得到吲哚菁绿。据该文献称，可获得碘化钠为1.0％的药用吲哚菁绿。然而，周知碘化钠在丙酮中的溶解度有限，且按照文献方法处理，碘化钠会包裹在产品中，不能有效去除。本发明人按该文献的方法无法获得碘化钠含量低于5％产品。仅用丙酮作为溶剂无法有效去除碘化钠，从而无法获得达到药用级别的吲哚菁绿。该文献中的方法仅能获得吲哚菁绿粗品。
另外，专利文献US2009069573和WO2017093889记载了采用有机溶 剂在水中萃取来去除吲哚菁绿中所含的碘化钠等杂质的方法。但是，吲哚菁绿在水中有较好溶解性，上述萃取的方法会严重影响产品的收率，不适合工业化生产，参见说明书中的比较例6。
发明内容
发明所要解决的课题
针对上述现有技术中存在的吲哚菁绿不能达到药用级别、纯化过程中收率低的技术问题，本发明的目的在于提供一种能够在高效去除无机盐杂质的同时以高收率获得吲哚菁绿的精制方法。
用于解决技术课题的技术手段
针对上述技术问题，本申请的第一方面提供一种吲哚菁绿的精制方法，所述精制方法包括如下步骤：在0℃～80℃的温度下，将吲哚菁绿粗品溶解在良溶剂中，然后向其中缓慢滴加不良溶剂，进行搅拌，充分析晶后过滤。
根据本发明的一种实施方式，所述良溶剂可选自甲醇、乙醇和异丙醇中的至少一种；且所述不良溶剂可选自丙酮、甲基叔丁基醚、正庚烷、乙酸乙酯、乙腈和二氯甲烷中的至少一种。
根据本发明的较具体的实施方式，所述不良溶剂可选自丙酮、甲基叔丁基醚和乙酸乙酯中的至少一种。
根据本发明的一种实施方式，所述吲哚菁绿粗品、良溶剂和不良溶剂的质量体积比可为1:1～16:1～78。
根据本发明的较具体的实施方式，所述吲哚菁绿粗品、良溶剂和不良溶剂的质量体积比可为1:5～10:10～20。
根据本发明的精制方法，可在20～40℃的温度下进行上述步骤。
根据本发明的另一种实施方式，在滴加不良溶剂后，可加入少量吲哚菁绿晶种，再进行搅拌，并同样在充分析晶后过滤。
根据本发明的精制方法，可在过滤后用相同的不良溶剂洗涤晶体，并 干燥以获得最终产品。
本申请的第二方面提供一种药用吲哚菁绿产品，所述产品中碘化钠的含量在3.5％以下；且所述产品中三乙胺的含量在0.5％以下。
更具体地，所述产品中碘化钠的含量甚至可在2.5％以下；且所述产品中三乙胺的含量甚至可在0.2％以下。
本申请的第三方面提供一种药用吲哚菁绿产品，其中所述产品通过上述的吲哚菁绿的精制方法得到。
发明效果
通过本发明的纯化方法能够高效去除包括碘化钠在内的无机盐，并以高收率稳定地得到符合药用注射制剂标准的吲哚菁绿产品。本发明人进一步发现按现有方法合成的吲哚菁绿原料中存在一定量的吲哚菁绿三乙胺盐，而该盐此前还未见报道。通过本发明的方法，在去除碘化钠的同时可有效去除该盐，从而进一步降低了产品中的无机盐杂质，提高了药品的质量及注射安全性。此外，本发明的方法更优选地在室温下进行，操作简单，是更适于工业化精制的方法。
图1是制备例中获得的吲哚菁绿粗品的H NMR图谱；和
图2是通过本发明实施例3的精制方法得到的吲哚菁绿的H NMR图谱。
除非另外指明，本文中提及的“％”或“百分含量”指重量百分含量。
除非另外指明，本文中提及的“吲哚菁绿粗品”是指通过碘化钠置换吲哚菁绿三乙胺盐中的三乙胺获得的未经精制的吲哚菁绿三乙胺盐和吲哚菁绿的混合物，含有以碘化钠和吲哚菁绿三乙胺盐为主的杂质，其中碘化 钠含量大于3.5％，尤其大于药典中规定的5％，和/或三乙胺的含量大于0.5％，尤其大于2％的粗品。本文中提及的“吲哚菁绿粗品”的来源可以通过任何已知方法制备得到，尤其通过专利申请公开No.：CN104130178A中公开的方法制备得到，也可以是市售的吲哚菁绿原料。
本文中提及的“药用”/“注射用”吲哚菁绿，或者“药用”/“注射用”吲哚菁绿产品是指符合中国药典规定，可用于注入动物或人体内进行荧光成像检测的吲哚菁绿，其中活性成分为2-[7-[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(4-磺酸丁基)-2H-苯并[e]吲哚-2-亚基]-1,3,5-庚三烯-1-基]-1,1-二甲基-3-(4-磺酸丁基)-1H-苯并[e]吲哚内盐和钠盐(1:1)。
吲哚菁绿是注射类的诊断试剂，因此对其中杂质含量的要求较高。在该产品的制备过程中所使用的碘化钠容易引起致敏性反应，中国药典要求吲哚菁绿中碘化钠含量为不超过5％。对于药用吲哚菁绿的制备，碘化钠的残留有严格的限制。因此，吲哚菁绿中的碘化钠含量低是吲哚菁绿产品安全性的核心竞争力之一。
本申请发明人发现，已知的除去碘化钠的方法虽然能够有效地去除碘化钠，但是吲哚菁绿的收率却大幅降低。针对这一现象，本发明人进行了潜心研究，从而提出了本发明的精制方法。本发明没有采用常规的萃取方法，而是选择特定的溶剂组合通过重结晶的方法去除无机杂质。该方法不仅更为有效地去除了诸如碘化钠的无机盐杂质，而且具有高收率。
此外，本发明人在针对吲哚菁绿粗品进行分析时发现，在该粗品中，还含有一种类似吲哚菁绿结构的物质。经过H NMR分析确认该物质为吲哚菁绿酸三乙胺盐，是吲哚菁绿的制备工艺中的一个中间体。也就是说，在精制前的吲哚菁绿粗品中，通常含有的杂质不但包括碘化钠和少量游离的三乙胺，还含有一定含量的作为杂质的吲哚菁绿三乙胺盐(参见以下结构式)，其可贡献达约5％的三乙胺，存在一定的安全隐患，因而有必要除去 该三乙胺盐。
吲哚菁绿存在两个磺酸根基团，因此较容易结合易阳离子化的三乙胺而成盐。在已报道的文献中，并未提及该杂质，也没有文献提出除去该杂质的方法。由于吲哚菁绿三乙胺盐与吲哚菁绿钠盐相似的结构，因而具有相似的溶解性，因此用有机溶剂从水中萃取的已知精制方法无法有效去除该杂质。
而且，吲哚菁绿酸三乙胺盐中的三乙胺无法通过常规的气相色谱方法检测出，因而常规的产品检验往往忽略该杂质的存在。
本申请发明人发现本发明的方法令人吃惊地能够从吲哚菁绿粗品中同时高效除去碘化钠和三乙胺盐，从而获得质量进一步提升的注射用吲哚菁绿。并且，该方法显著提高产品的最终收率，操作简单，适于工业化生产。
本发明的方法是在温度0～80℃将吲哚菁绿溶解在良溶剂中，然后向其中缓慢滴加不良溶剂，进行搅拌、过滤。
根据本发明的方法，良溶剂为甲醇、乙醇和/或异丙醇。不良溶剂为丙酮、甲基叔丁基醚、正庚烷、乙酸乙酯、乙腈和/或二氯甲烷。良溶剂和不良溶剂可以任意方式组合。即，良溶剂可以选择其中的一种或多种，同样的不良溶剂也可以选择其中的一种或多种。其中优选的良溶剂为甲醇。优选的不良溶剂为丙酮、甲基叔丁基醚和/或乙酸乙酯。
较优选的组合方式为甲醇、乙醇和/或异丙醇作为良溶剂，丙酮、甲基叔丁基醚和/或乙酸乙酯作为不良溶剂的组合。其中最优选的组合为甲醇-丙酮、甲醇-乙酸乙酯、甲醇-甲基叔丁基醚、乙醇-丙酮、乙醇-甲基叔丁基 醚、异丙醇-丙酮和异丙醇-乙酸乙酯。
良溶剂和不良溶剂之间，以及它们与吲哚菁绿粗品之间需以适当的比例配合使用，否则或者达不到理想的杂质去除效果，或者造成收率下降到工业化生产不可接受的程度。根据本发明，吲哚菁绿粗品、良溶剂和不良溶剂的质量体积比(wt/v/v：g:ml:ml)为1:1～16:1～78。在该比例范围内，可以获得满足注射制剂要求且收率在70％以上的效果。
优选地，吲哚菁绿粗品、良溶剂和不良溶剂的质量体积比(wt/v/v：g:ml:ml)为1：5～10：10～20。在该优选的比例范围内，可以获得碘化钠残留量低于3.0％，甚至低于2.5％，三乙胺残留量低于0.2％甚至低于0.15％的有益效果，同时收率保持在80％，甚至85％以上。
本发明的精制方法可在较宽的温度范围内进行，但优选20～40℃，更优选在环境温度下进行。这样可将能耗进一步降低，而且甚至可获得优于在加热条件下的杂质去除和高收率的效果。
本文提及的环境温度是指20～28℃，最常见的环境温度是室温(即大约25℃)。
根据另一实施方式，本发明的方法也可以包括在滴加不良溶剂后，加入少量晶种的步骤，以加快析晶。例如可在加入少量晶种后搅拌1小时以上，以便析晶完全。所述晶种为按照本发明的上述方法获得的。
通过本发明的方法能够以高收率得到的杂质含量更低的吲哚菁绿药用产品。
下面，将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在无需作出创造性劳动的前提下所获得的所有变体，都属于本发明要求保护的范围。
碘化钠和三乙胺(包括游离形式的三乙胺以及以吲哚菁绿酸三乙胺盐 形式存在的三乙胺)的含量通过如下滴定方法检测：
碘化钠滴定方法
取样品约0.1g，精密称定，加水100ml溶解后，加硝酸1ml，摇匀，照电位滴定法(通则0701)，用硝酸银滴定液(0.01mol/L)滴定。每1ml硝酸银滴定液(0.01mol/L)相当于1.499mg的NaI。按干燥品计算，含碘化钠不得过5.0％。
三乙胺滴定方法
取样品，精密称定，置装有水的分液漏斗中，振摇使溶解，加入一定浓度的氢氧化钠溶液，混匀。量取三氯甲烷进行萃取，待分层后收集下层溶液，精密量取该溶液，加入乙醇水溶液中，用一定浓度盐酸滴定液滴定，根据盐酸滴定液的消耗体积，计算样品中三乙胺的的含量。
吲哚菁绿纯度检测方法
吲哚菁绿粗品和精制品纯度通过HPLC检测，加校正因子计算得到。具体方法为：
HPLC色谱仪：安捷伦1260型高效液相色谱仪
色谱柱：Waters C18 5μm，4.6×250mm
以磷酸盐缓冲液(pH8.0)为流动相A，以磷酸盐缓冲液(pH8.0)-有机相(30:70)为流动相B，进行梯度洗脱。
纯度计算方法：相关杂质含量在不同波长下按照各自的校正因子进行计算，得到吲哚菁绿产品的纯度数据。
制备例：吲哚菁绿粗品制备
本发明按照专利文献CN104130178A公开的方法(即其中的实施例1的方法)制备得到吲哚菁绿粗品，该文献全文通过引用并入本申请。
具体地，首先合成2,3,3-三甲基-1-(4-磺基丁基)-4,5-苯并吲哚内铵盐：将2,3,3-三甲基-4,5-苯并吲哚苯和1,4-丁基磺酸钠内酯按照重量比为1:1.6 的比例混合，在二甲苯的存在下140℃回流3小时，冷却至50℃再加入二甲苯6倍体积的丙酮，55℃回流半小时，冷却到20℃，过滤干燥。得到浅蓝色固体为2,3,3-三甲基-1-(4-磺基丁基)-4,5-苯并吲哚内铵盐，其中按2,3,3-三甲基-4,5-苯并吲哚苯与二甲苯重量比为1:0.8的比例加入二甲苯。
接着合成2-[6-(N-乙苯胺基)-1,3,5-己三烯-1-基]-3,3-二甲基-1-(4-磺基丁基)-4,5-苯并吲哚内铵盐：将上一步骤中获得的2,3,3-三甲基-1-(4-磺基丁基)-4,5-苯并吲哚内铵盐与2-戊烯二醛二缩苯胺盐酸盐按1:0.9的重量比混合，在乙酸酐的存在下在140℃回流5分钟进行缩合，然后冷却到0℃后，过滤，用丙酮洗涤滤饼，获得蓝黑色固体为2-[6-(N-乙苯胺基)-1,3,5-己三烯-1-基]-3,3-二甲基-1-(4-磺基丁基)-4,5-苯并吲哚内铵盐，其中按照2,3,3-三甲基-1-(4-磺基丁基)-4,5-苯并吲哚内铵盐的5倍重量加入乙酸酐。
最后合成吲哚菁绿：将以上两步分别获得的2,3,3-三甲基-1-(4-磺基丁基)-4,5-苯并吲哚内铵盐与2-[6-(N-乙苯胺基)-1,3,5-己三烯-1-基]-3,3-二甲基-1-(4-磺基丁基)-4,5-苯并吲哚内铵盐按照1:1.3的重量比混合，在无水乙醇(基于2,3,3-三甲基-1-(4-磺基丁基)-4,5-苯并吲哚内铵盐的8倍重量)中在搅拌下加入无水乙醇重量的3％的三乙胺，在回流温度下反应15分钟，之后冷却到20℃，加入无水乙醇体积1.37倍的乙醚进行萃取，倾出上清液，重复萃取三次，将残留物用甲醇溶解，在68下回流5分钟，过滤，收集滤液，向滤液中滴加碘化钠甲醇溶液(将55g无水碘化钠溶于1000mL甲醇中制备，滴加量为溶解残留物的甲醇体积的1/3)，待反应完成后蒸出甲醇，然后加入无水乙醇体积18倍体积的丙酮洗脱碘化钠，回流并趁热过滤，干燥后获得吲哚菁绿粗品。
获得的粗品用于进一步进行以下各比较例和实施例的精制。
对该粗品测定H NMR(BRUKER 400M核磁共振波谱仪)，获得的谱图如图1所示。由图1可以看出：在化学位移约1.2ppm和3.1ppm处的两 组峰是三乙胺结构中甲基和亚甲基上氢产生的，证明粗品中含有三乙胺。此外2.1ppm处对应残留的丙酮。
此外，按照以上方法测定所获得的产品中碘化钠、三乙胺的含量，如下表1所示。
用上述HPLC的方法测定该粗品中吲哚菁绿的纯度为98.63％。
本发明所用其他试剂和原料均市售可得。以下将通过比较例和实施例来进一步说明本发明的方法及其优点。本领域技术人员应知，以下实施例仅用于说明本发明，而非限制其保护范围。以下各比较例和实施例所获得的产品分别采用上述方法测定其中的碘化钠和三乙胺的含量。
比较例1：
将上述吲哚菁绿粗品2.01g加入12ml丙酮中，在20-30℃下搅拌3h，过滤，滤饼用2ml丙酮淋洗，干燥，得到1.89g吲哚菁绿产品1。
比较例2：
将吲哚菁绿粗品2.02g加入12ml丙酮中，搅拌均匀后，加入0.4g纯化水，继续搅拌3h，过滤，滤饼用2ml丙酮淋洗，干燥，得到1.78g吲哚菁绿产品2。
比较例3：
将吲哚菁绿粗品2.02g加入12ml丙酮中，搅拌均匀后，加入1.2g纯化水，搅拌3h，过滤，滤饼用2ml丙酮淋洗，干燥，得到1.25g吲哚菁绿产品3。
吲哚菁绿粗品、吲哚菁绿产品1～3相关检测数据如下表1所示。
表1
| 批次 | 残留碘化钠 | 残留三乙胺 | 收率 |
| 粗品(制备例) | 7.20％ | 5.60％ | N/A |
| 产品1(比较例1) | 6.96％ | 4.32％ | 94.03％ |
| 产品2(比较例2) | 6.18％ | 4.26％ | 88.12％ |
| 产品3(比较例3) | 4.61％ | 3.06％ | 61.88％ |
根据上述实验结果可知，与专利文献CN104130178A中报道的可获得碘化钠含量为1.0％的吲哚菁绿产品不同，本发明人通过以上实验发现丙酮对碘化钠和吲哚菁绿三乙胺盐的去除效果不是十分显著。以上结果实际上与碘化钠在丙酮中的低溶解性是一致的，采用丙酮这种亲水性较低的有机溶剂不利于碘化钠的去除。本发明人进一步尝试在丙酮中加入水混合打浆的精制方法，除杂的效果也没有明显改善，而且增加加入的水量，反而造成收率明显下降。
具体地，按照专利文献CN104130178A中实施例1的方法制备得到的粗品中碘化钠的含量为7.20％，，三乙胺的总量达5.60％，与该文献中报道的实施例1获得的产品中碘化钠含量为1.0％以及有关物质含量为1.5％相去甚远。这说明该文献中的方法仅能获得吲哚菁绿粗品，而并不能获得符合药典要求的注射剂用产品。
比较例1中对上述制备得到的粗品进一步采用丙酮打浆进行精制，对碘化钠和吲哚菁绿三乙胺盐去除效果仍均较差。比较例2中采用纯化水和丙酮混合体系打浆，对碘化钠去除效果有限，一次精制能够降低约1％左右，对吲哚菁绿三乙胺盐的去除没有显著改善。比较例3中增加纯化水比例，收率明显降低20％以上，而纯化效果的改善并不显著。
吲哚菁绿三乙胺盐与吲哚菁绿钠盐结构和相关理化性质相似，不易去除，采用气相方法不能够检测出产品中成盐的三乙胺，采用滴定的方法检测三乙胺的残留较高，远超过ICH Q3C(即，ICH《Q3C(R7)杂质:残留溶剂的指导原则》)中对于三乙胺在药品要求的0.5％的限度要求，严重影响产品质量。
实施例1：
将吲哚菁绿粗品2.02g加入14ml甲醇中，在室温下搅拌溶解后，加入40ml乙酸乙酯，加毕，搅拌2h，过滤，滤饼用2ml乙酸乙酯淋洗，干燥， 得到1.76g吲哚菁绿产品4。
实施例2：
将吲哚菁绿粗品2.02g加入17ml乙醇中，在室温下搅拌溶解后，加入20ml正庚烷，加毕，搅拌2h，过滤，滤饼用2ml正庚烷淋洗，干燥，得到1.68g吲哚菁绿产品5。
实施例3：
将吲哚菁绿粗品2.00g加入15ml甲醇中，在室温下搅拌溶解后，加入20ml丙酮，加毕，搅拌2h，过滤，滤饼用2ml丙酮淋洗，干燥，得到1.82g吲哚菁绿产品6。
取少量产品测定其H NMR，结果如图2所示。从图2可以看出：经过精制，在化学位移约1.2ppm和3.1ppm处的两组峰消失，三乙胺基本去除。
此外根据上述HLPC方法测定本实施例获得的吲哚菁绿产品6中吲哚菁绿的纯度为99.78％。
实施例4：
将吲哚菁绿粗品2.00g加入20ml异丙醇中，在室温下搅拌溶解后，加入35ml乙腈，加毕，搅拌2h，过滤，滤饼用2ml乙腈淋洗，干燥，得到1.64g吲哚菁绿产品7。
实施例5：
将吲哚菁绿粗品2.00g加入10ml甲醇中，在室温下搅拌溶解后，加入30ml二氯甲烷，加毕，搅拌2h，过滤，滤饼用2ml二氯甲烷淋洗，干燥，得到1.62g吲哚菁绿产品8。
实施例6：
将吲哚菁绿粗品2.03g加入10ml甲醇中，在50℃下搅拌溶解后，加入30ml甲基叔丁基醚，加毕，搅拌2h，过滤，滤饼用2ml甲基叔丁基醚淋洗，干燥，得到1.66g吲哚菁绿产品9。
实施例7：
将吲哚菁绿粗品2.00g加入17ml乙醇中，在室温下搅拌溶解后，加入30ml丙酮，加毕，搅拌2h，过滤，滤饼用2ml丙酮淋洗，干燥，得到1.78g吲哚菁绿产品10。
实施例8：
将吲哚菁绿粗品2.00g加入12ml乙醇中，在50℃下搅拌溶解后，加入30ml甲基叔丁基醚，加毕，搅拌2h，过滤，滤饼用2ml甲基叔丁基醚淋洗，干燥，得到1.76g吲哚菁绿产品11。
实施例9：
将吲哚菁绿粗品2.01g加入20ml异丙醇中，在室温下搅拌溶解后，加入30ml丙酮，加毕，搅拌2h，过滤，滤饼用2ml丙酮淋洗，干燥，得到1.75g吲哚菁绿产品12。
实施例10：
将吲哚菁绿粗品2.00g加入12ml异丙醇中，在50℃下搅拌溶解后，加入30ml乙酸乙酯，加毕，搅拌2h，过滤，滤饼用2ml乙酸乙酯淋洗，干燥，得到1.80g吲哚菁绿产品13。
比较例4：
将吲哚菁绿粗品2.00g加入10ml二甲基亚砜中，室温搅拌溶解后，加入14ml丙酮，加毕，降至20-30℃搅拌2h，过滤，滤饼用2ml丙酮淋洗，干燥，得到1.45g吲哚菁绿产品14。
比较例5：
将吲哚菁绿粗品2.01g加入14ml甲醇中，室温搅拌溶解后，加入14ml N-甲基吡咯烷酮，加毕，降至20℃～30℃搅拌2h，过滤，滤饼用2ml N-甲基吡咯烷酮淋洗，干燥，得到1.30g吲哚菁绿产品15。
表2不同溶剂组合对碘化钠和吲哚菁绿酸三乙胺盐的去除效果
| 批次 | 残留碘化钠 | 残留三乙胺 | 收率 |
| 粗品(制备例) | 7.20％ | 5.60％ | N/A |
| 产品4(实施例1) | 2.10％ | 0.10％ | 87.13％ |
| 产品5(实施例2) | 2.46％ | 0.20％ | 83.17％ |
| 产品6(实施例3) | 1.62％ | 0.08％ | 91.00％ |
| 产品7(实施例4) | 2.20％ | 0.18％ | 82.00％ |
| 产品8(实施例5) | 2.52％ | 0.17％ | 81.00％ |
| 产品9(实施例6) | 2.16％ | 0.14％ | 81.77％ |
| 产品10(实施例7) | 1.60％ | 0.06％ | 89.00％ |
| 产品11(实施例8) | 1.64％ | 0.08％ | 88.00％ |
| 产品12(实施例9) | 1.57％ | 0.07％ | 87.06％ |
| 产品13(实施例10) | 1.47％ | 0.06％ | 90.00％ |
| 产品14(比较例4) | 5.10％ | 2.76％ | 72.50％ |
| 产品15(比较例5) | 4.80％ | 0.92％ | 64.68％ |
上述数据表明，通过使用特定的良溶剂(甲醇)和不良溶剂(乙酸乙酯、正庚烷、丙酮、乙腈、二氯甲烷、甲基叔丁基醚)进行重结晶，能够以高收率获得高纯度的吲哚菁绿。
以下，实施例11-14以甲醇和丙酮溶剂组合为例，考察溶剂用量比对碘化钠和吲哚菁绿酸三乙胺盐的去除效果影响。
实施例11：
将吲哚菁绿粗品2.03g加入10ml甲醇中，在室温下搅拌溶解后，加入20ml丙酮，加毕，搅拌2h，过滤，滤饼用2ml丙酮淋洗，干燥，得到1.84g吲哚菁绿产品16。
实施例12：
将吲哚菁绿粗品2.00g加入20ml甲醇中，在室温下搅拌溶解后，加入50ml丙酮，加毕，搅拌2h，过滤，滤饼用2ml丙酮淋洗，干燥，得到1.70g吲哚菁绿产品17。
实施例13：
将吲哚菁绿粗品2.00g加入32ml甲醇中，在室温下搅拌溶解后，加入 150ml丙酮，加毕，搅拌2h，过滤，滤饼用2ml丙酮淋洗，干燥，得到1.50g吲哚菁绿产品18。
实施例14：
将吲哚菁绿粗品2.00g加入4ml甲醇中，在室温下搅拌未完全溶解，加入12ml丙酮，加毕，搅拌2h，过滤，滤饼用2ml丙酮淋洗，干燥，得到1.86g吲哚菁绿产品19。
表3溶剂用量比对碘化钠和吲哚菁绿酸三乙胺盐的去除效果影响
| 批次 | 碘化钠 | 三乙胺 | 收率 |
| 粗品(制备例) | 7.20％ | 5.60％ | N/A |
| 产品16(实施例11) | 1.50％ | 0.09％ | 90.64％ |
| 产品17(实施例12) | 1.35％ | 0.06％ | 85.00％ |
| 产品18(实施例13) | 1.32％ | 0.07％ | 75.00％ |
| 产品19(实施例14) | 3.10％ | 0.87％ | 93.00％ |
根据上述不同溶剂组合的实验结果，按照本专利的溶剂量比范围，如实施例11-14，均可以以较高的收率得到高质量的吲哚菁绿产品。溶剂量少于本专利优选范围，如实施例14，碘化钠和三乙胺残留量明显升高，但仍能够符合药典要求。
比较例6：
按照专利文献US2009069573中公开的方法，将吲哚菁绿粗品2.01g加入20ml纯化水中，然后用二氯甲烷20ml萃取3次，合并有机相，有机相蒸干，得到1.13克吲哚菁绿产品20。经测试，其中碘化钠含量3.89％，残留三乙胺含量1.15％，收率56.22％。
按照专利文献US2009069573公开的方法，采用萃取的方式对碘化钠和吲哚菁绿酸三乙胺盐有一定的去除效果，但是收率太低(56.22％)，且碘化钠和残留吲哚菁绿三乙胺盐的去除效率与本发明的方法相比仍明显较差。
测试例
将以上按照本发明的方法进行精制获得的产品与国外原研制剂产品 (第一三共株式会社，批号：QHB0132))按以上测试方法测定其中碘化钠和三乙胺含量并对比，如下表4所示。
表4本发明方法获得的产品与原研制剂杂质含量对比表
| 碘化钠* | 三乙胺** | |
| 标准要求 | ≤5.0％ | ≤0.5％ |
| 原研制剂 | 3.84％ | 0.20％ |
| 实施例1～14制备的产品 | 1.32％～2.52％ | 0.04％～0.20％ |
*根据中国药典(2020)；**根据ICH关于药物杂质的指导原则。
按照本发明的精制方法得到的吲哚菁绿产品，其中碘化钠和三乙胺残留量均远低于药典标准，且明显优于原研制剂产品。同时本专利方法制备得到的吲哚菁绿较已知的精制方法收率明显提高，操作工艺简单，适合工业化生产。
Claims (10)
- 一种吲哚菁绿的精制方法，其特征在于，包括如下步骤：在0℃～80℃的温度下，将吲哚菁绿粗品溶解在良溶剂中，然后向其中缓慢滴加不良溶剂，进行搅拌，充分析晶后过滤。
- 根据权利要求1所述的吲哚菁绿的精制方法，其特征在于，所述良溶剂选自甲醇、乙醇和异丙醇中的至少一种；且所述不良溶剂选自丙酮、甲基叔丁基醚、正庚烷、乙酸乙酯、乙腈和二氯甲烷中的至少一种。
- 根据权利要求2所述的吲哚菁绿的精制方法，其特征在于，所述不良溶剂选自丙酮、甲基叔丁基醚和乙酸乙酯中的至少一种。
- 根据权利要求1～3中任一项所述的吲哚菁绿的精制方法，其特征在于，吲哚菁绿粗品、良溶剂和不良溶剂的质量体积比为1:1～16:1～78。
- 根据权利要求4所述的吲哚菁绿的精制方法，其特征在于，吲哚菁绿粗品、良溶剂和不良溶剂的质量体积比为1:5～10:10～20。
- 根据权利要求1所述的吲哚菁绿的精制方法，其特征在于，所述温度为20～40℃。
- 根据权利要求2或3所述的吲哚菁绿的精制方法，其特征在于，滴加不良溶剂后，加入少量吲哚菁绿晶种，再进行搅拌。
- 一种药用吲哚菁绿产品，其特征在于，所述产品中碘化钠的含量在3.5％以下；且所述产品中三乙胺的含量在0.5％以下。
- 根据权利要求8所述的药用吲哚菁绿产品，其特征在于，所述产品中碘化钠的含量在2.5％以下；且所述产品中三乙胺的含量在0.2％以下。
- 一种药用吲哚菁绿产品，其中所述产品通过权利要求1～7中任一项所述的吲哚菁绿的精制方法得到。
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