WO2022075294A1 - 関節治療用細胞製剤の製造方法、関節治療用細胞製剤および間葉系幹細胞の培養方法 - Google Patents

関節治療用細胞製剤の製造方法、関節治療用細胞製剤および間葉系幹細胞の培養方法 Download PDF

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WO2022075294A1
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mesenchymal stem
stem cells
medium
joint treatment
cell
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健太郎 中村
雄一 芳野
淳史 稲田
宗 北橋
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富士フイルム株式会社
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    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell preparation for joint treatment and a method for culturing mesenchymal stem cells, which comprises culturing mesenchymal stem cells in a medium containing a predetermined component.
  • the present invention further relates to a cell preparation for joint treatment produced by the above method.
  • articular cartilage injury and meniscus injury are frequently seen as subjects of daily medical practice and are widely recognized as diseases with a large number of patients.
  • articular cartilage injury or meniscus injury occurs, it causes joint pain, reduced range of motion, knee effusion, and impaired movement.
  • Patients with traumatic articular cartilage or meniscus injuries are usually treated by an orthopedic surgeon.
  • Surgical treatment for cartilage and meniscus injuries aims to remove debris that further exacerbates the joint and restore the function of the affected joint.
  • cartilage and meniscal tissue are difficult to self-regenerate.
  • Non-Patent Document 1 it has been reported that mesenchymal stem cells derived from the synovial membrane have higher proliferative ability and cartilage forming ability than mesenchymal stem cells derived from various mesenchymal tissues such as bone marrow.
  • Patent Document 2 disclose a method for treating articular cartilage injury and meniscus injury using synovial membrane-derived mesenchymal stem cells.
  • karyotype abnormalities may occur in the cell culture process in stem cells including mesenchymal stem cells.
  • stem cells including mesenchymal stem cells.
  • self-serum when used for self-treatment, it is necessary to reduce the amount of serum because there is a limit to the amount of serum that can be collected.
  • the present invention is a method for producing a cell preparation for joint treatment and a mesenchymal system capable of improving the proliferation ratio of cells, reducing the required serum volume, and suppressing karyotype abnormalities in the culture process. It is an object to be solved to provide a method for culturing stem cells and a cell preparation for joint treatment produced by the above method.
  • the present inventor has found that the above problems can be solved by culturing mesenchymal stem cells in a medium containing an ascorbic acid derivative, alanyl glutamine and pyridoxine.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • ⁇ 1> A method for producing a cell preparation for joint treatment, which comprises culturing mesenchymal stem cells in a medium containing an ascorbic acid derivative, alanylglutamine and pyridoxine.
  • ⁇ 2> The method according to ⁇ 1>, wherein the mesenchymal stem cells are synovial membrane-derived mesenchymal stem cells.
  • ⁇ 3> The method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the mesenchymal stem cells are autologous.
  • ⁇ 4> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the medium contains allogeneic serum.
  • ⁇ 5> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the medium does not contain ascorbic acid.
  • ⁇ 6> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the medium contains any one or more of biotin and lipoic acid.
  • ⁇ 7> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the mesenchymal stem cells are cultured using a multi-layer flask having five or more layers.
  • ⁇ 8> Further comprising separating the suspension of the tissue containing the mesenchymal stem cells into two layers, an upper layer and a lower layer, and collecting the lower layer of the above two layers.
  • the mesenchymal stem cells are human mesenchymal stem cells, the number of chromosomes of the mesenchymal stem cells is 46, and the chromosome cariotyping is a pair of chromosomes 1 to 22 and XX or XY chromosomes.
  • the cell preparation for joint treatment according to any one of ⁇ 9> to ⁇ 11>.
  • a method for culturing mesenchymal stem cells which comprises collecting the lower layer of the above two layers and culturing the mesenchymal stem cells contained in the lower layer in a medium containing an ascorbic acid derivative, alanylglutamine and pyridoxine.
  • the mesenchymal stem cells are synovial membrane-derived mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cells are of autologous origin.
  • the medium contains allogeneic serum.
  • ⁇ 17> The method according to any one of ⁇ 13> to ⁇ 16>, wherein the medium does not contain ascorbic acid.
  • ⁇ 18> The method according to any one of ⁇ 13> to ⁇ 17>, wherein the medium contains any one or more of biotin and lipoic acid.
  • ⁇ 19> The method according to any one of ⁇ 13> to ⁇ 18>, wherein the mesenchymal stem cells are cultured using a multi-layer flask having five or more layers.
  • ⁇ 20> A cell preparation for joint treatment containing mesenchymal stem cells cultured by the method according to any one of ⁇ 13> to ⁇ 19>.
  • ⁇ 21> The cell preparation for joint treatment according to ⁇ 20>, which does not contain extracellular matrix or scaffold.
  • the mesenchymal stem cells are human mesenchymal stem cells, the number of chromosomes of the mesenchymal stem cells is 46, and the chromosome cariotyping is a pair of chromosomes 1 to 22 and XX or XY chromosomes.
  • ⁇ A> A step of transplanting a joint therapeutic cell preparation produced by the method of the present invention or mesenchymal stem cells cultured by the method of the present invention so as to cover the cartilage damaged part or the mesenchymal plate damaged part with the mesenchymal stem cells; And the step of regenerating cartilage tissue in situ at the cartilage injured or meniscus injured by differentiating mesenchymal stem cells into chondrocytes; How to treat joints, including.
  • the proliferation ratio when a sufficient amount of cells are produced from a tissue, the proliferation ratio can be improved, the required serum amount can be reduced, and karyotype abnormality can be suppressed in the culture process.
  • FIG. 1 shows the growth curve of mesenchymal stem cells when using type medium or medium A.
  • FIG. 2 shows karyotype analysis of mesenchymal stem cells when using type medium or medium A.
  • FIG. 2 shows karyotype analysis of mesenchymal stem cells when bFGF is added to a type medium or medium A is used.
  • FIG. 4 shows images of medial menisci of both knee joints removed from rats treated with rat synovial-derived mesenchymal stem cells (rSMSC) or PBS.
  • rSMSC synovial-derived mesenchymal stem cells
  • the present invention relates to a method for producing a cell preparation for joint treatment, which comprises culturing mesenchymal stem cells in a medium containing an ascorbic acid derivative, alanylglutamine and pyridoxin.
  • a method for producing a cell preparation for joint treatment which comprises culturing mesenchymal stem cells in a medium containing an ascorbic acid derivative, alanylglutamine and pyridoxin.
  • the method for producing a cell preparation for joint treatment according to the present invention is to culture mesenchymal stem cells in a medium containing an ascorbic acid derivative, alanylglutamine and pyridoxin, and to treat the joints using the mesenchymal stem cells cultured above. It may include producing a cell preparation for use.
  • the mesenchymal stem cell is a group of stem cells or precursor cells capable of differentiating into all or some of the mesenchymal cells such as osteoblasts, chondroblasts, lipoblasts, and muscle cells.
  • Mesenchymal stem cells are known to be present in bone marrow, synovium, periosteum, adipose tissue, and muscle tissue.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • TGF- ⁇ Transforming growth factor- ⁇
  • Mesenchymal stem cells can detect and confirm molecules characteristic of mesenchymal stem cells, such as enzymes, receptors, and low molecular weight compounds.
  • Examples of the molecule characteristic of mesenchymal stem cells include, but are not limited to, cell surface markers (positive markers) such as CD73, CD90, CD105, and CD166.
  • Examples of negative markers that are not expressed in mesenchymal stem cells include, but are not limited to, CD19, CD34, CD45, HLA-DR, CD11b, and CD14.
  • CD is an abbreviation for Crusters of differentiation
  • HLA-DR is an abbreviation for human leukocyte antigen-D-related.
  • the animal species from which the mesenchymal stem cells are derived is not particularly limited, and for example, rodents such as rats, mice, hamsters and guinea pigs, rabbits such as rabbits, hoofed eyes such as pigs, cows, goats and sheep, and dogs. , Cats such as cats, and cells such as humans, monkeys, red-tailed monkeys, marmosets, orangutans, and primates such as chimpanzees.
  • the mesenchymal stem cells are preferably human mesenchymal stem cells.
  • mesenchymal stem cells are not particularly limited, but is preferably derived from synovium, bone marrow, fat, dental pulp, fetus, or induced pluripotent stem cells.
  • the mesenchymal stem cells are more preferably synovial-derived mesenchymal stem cells or bone marrow-derived mesenchymal stem cells, and even more preferably synovial-derived mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cells may be either autologous or allogeneic, but are preferably autologous.
  • the mesenchymal stem cell may be a gene-modified cell or a non-gene-modified cell, but is preferably a non-gene-modified cell.
  • Mesenchymal stem cells can be collected from the above tissues by a conventional method.
  • the mesenchymal stem cells can be collected by separating the suspension of the tissue containing the mesenchymal stem cells into two layers, an upper layer and a lower layer, and by collecting the lower layer of the above two layers. .. Separation of a suspension of tissue containing mesenchymal stem cells into two layers, an upper layer and a lower layer, can be performed, for example, by centrifugation.
  • synovial tissue can be harvested from the unloaded portion of the joint under anesthesia.
  • the amount of synovial tissue collected can be determined in consideration of the type of donor or the amount of synovial-derived mesenchymal stem cells required. For example, 0.1 g to 10 g, preferably 0.1 g to 2.0 g, more preferably 0.1 g to 1.5 g, still more preferably 0.1 g to 1.0 g from synovial tissue to synovial-derived mesenchymal system.
  • Stem cells can be obtained.
  • the collected synovial tissue is shredded with scissors or the like as necessary, and then subjected to enzyme treatment.
  • the enzyme is not particularly limited as long as it is an enzyme containing a protease, but is preferably a mixed enzyme containing one or more collagenases and one or more neutral proteases.
  • a particularly preferred enzyme is liberase.
  • liberase MNP-S manufactured by Roche
  • the enzyme concentration in the enzyme treatment is preferably 0.01 mg / ml to 10 mg / ml, more preferably 0.1 mg / ml to 10 mg / ml, and even more preferably 0.5 mg / ml to 10 mg / ml.
  • the mass ratio of synovial tissue to the enzyme is preferably 1000: 1 to 10: 1, more preferably 500: 1 to 20: 1, and even more preferably 200: 1 to 40: 1.
  • the enzymatic reaction can be carried out at a temperature of preferably 15 ° C to 40 ° C, more preferably 20 ° C to 40 ° C.
  • the reaction time may be 30 minutes or more, preferably 2 hours or more, more preferably 2 hours 30 or more, still more preferably 3 hours or more.
  • the upper limit of the reaction time is not particularly limited, but is generally within 4 hours.
  • the enzyme-treated mixture contains synovial-derived mesenchymal stem cells.
  • the enzyme-treated mixture can be transferred to a centrifuge tube through a cell strainer and centrifuged to recover synovial-derived mesenchymal stem cells.
  • the medium used in the present invention preferably contains essential amino acids. That is, the medium preferably contains histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan and valine.
  • the concentration of essential amino acids in the medium is not particularly limited, but the concentration of each essential amino acid is preferably 0.003 mmol / L or more, more preferably 0.005 mmol / L or more, and 0.01 mmol / L or more. Is more preferable.
  • the upper limit is generally 5 mmol / L or less.
  • the total concentration of essential amino acids is preferably 0.5 mmol / L or more, more preferably 1 mmol / L or more, and even more preferably 1.5 mmol / L or more.
  • the upper limit is generally 15 mmol / L or less.
  • the medium preferably contains non-essential amino acids and the like.
  • the non-essential amino acid and the like have the meaning of defining non-essential amino acids and glutamines.
  • non-essential amino acids include one or more selected from the group consisting of glycine, alanine, arginine, aspartic acid, aspartic acid, cysteine, cystine, glutamines, glutamic acid, proline, serine and tyrosine.
  • each of these is 0.005 mmol / L (5 ⁇ mol / L) or more, and 0. It is preferably 01 mmol / L or more, and more preferably 0.05 mmol / L or more.
  • the upper limit is generally 3 mmol / L or less.
  • Preferred glutamines include alanyl glutamine.
  • the medium used in the present invention contains alanyl glutamine as an essential component.
  • the total concentration of non-essential amino acids other than alanyl glutamine is preferably 0.5 mmol / L or more, more preferably 1.5 mmol / L or more, and more preferably 2.5 mmol / L or more. More preferred.
  • the upper limit is generally 30 mmol / L or less.
  • the concentration of alanyl glutamine is preferably 0.5 mmol / L or more, more preferably 1.0 mmol / L or more, and even more preferably 1.5 mmol / L or more.
  • the upper limit is generally 10 mmol / L or less.
  • the medium is preferably glutamine-free. Not included here means that it is not substantially contained in relation to the effect of the present invention, and does not mean to exclude inevitably mixed substances. Examples that are not substantially included are usually less than 5 ⁇ 10-5 mmol / L, preferably 0 mmol / L.
  • Amino acid detection and measurement method may be a known method, and for example, amino acid quantification by high performance liquid chromatography (HPLC) and amino acid analysis method by ninhydrin method (for example, Clinical Chemistry (1997), Vol. 43, No. 8, p1421-1428) and the like.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • ninhydrin method for example, Clinical Chemistry (1997), Vol. 43, No. 8, p1421-1428
  • the amino acid described in the present specification may be any of L-form, D-form, and DL-form. Further, the amino acid may form a salt as well as a free form.
  • the salt form include acid addition salts and salts with bases.
  • the acid include inorganic acids such as hydrogen chloride, hydrogen bromide, sulfuric acid and phosphoric acid, and organic acids such as acetic acid, lactic acid, citric acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid and monomethylsulfuric acid.
  • Examples of the base forming such a salt include hydroxides or charcoal oxides of metals such as sodium, potassium and calcium, inorganic bases such as ammonia, ethylenediamine, propylenediamine, ethanolamine and monoalkylethanolamine. , Dialkylethanolamine, diethanolamine, triethanolamine and other organic bases.
  • the salt may be a hydrate (hydrous salt).
  • the medium contains pyridoxine.
  • the medium may contain biotin.
  • the medium may further contain at least one other vitamin, in addition to pyridoxine and biotin.
  • Other vitamins include vitamin B12, choline chloride, calcium pantothenate, folic acid, niacinamide, pyridoxals (excluding pyridoxine), riboflavin, thiamine hydrochloride and i-inositol.
  • pyridoxals include pyridoxals.
  • the above-mentioned pyridoxine, biotin, and at least one other vitamin may form a salt as well as a free form.
  • the salt form include acid addition salts and salts with bases. Specifically, the above-mentioned amino acids can be mentioned.
  • the concentration of pyridoxine, biotin and at least one other vitamin in the medium is preferably 0.00005 mmol / L or more, more preferably 0.0001 mmol / L or more, and 0.0002 mmol, respectively. It is more preferably / L or more.
  • the upper limit is generally 1 mmol / L or less.
  • the total concentration of vitamins in the medium is preferably 0.001 mmol / L or more, more preferably 0.005 mmol / L or more, and even more preferably 0.01 mmol / L or more.
  • the upper limit is generally 2 mmol / L or less.
  • the medium is preferably pyridoxal or pyridoxals (excluding pyridoxines). Not included here means that it is not substantially contained in relation to the effect of the present invention, and does not mean to exclude inevitably mixed substances. As an example substantially free of pyridoxal, it is usually less than 5 ⁇ 10-5 mmol / L, preferably 0 mmol / L.
  • the medium preferably contains at least one inorganic salt.
  • the inorganic salt is preferably one or more selected from the group consisting of calcium chloride, magnesium sulfate, potassium chloride, sodium hydrogen carbonate, sodium chloride and sodium dihydrogen phosphate.
  • the concentration of the inorganic salt is not particularly limited, but is preferably 10 mmol / L or more, more preferably 50 mmol / L or more, and further preferably 80 mmol / L or more in total.
  • the upper limit is generally 1,000 mmol / L or less.
  • the medium preferably contains at least one of saccharides and pyruvate.
  • saccharides include D-glucose.
  • pyruvate include sodium pyruvate.
  • the total concentration of the saccharide and pyruvate is preferably 0.1 mmol / L or more, more preferably 0.3 mmol / L or more, and further preferably 1 mmol / L or more.
  • the upper limit is generally 50 mmol / L or less.
  • the medium preferably contains lipoic acid.
  • the concentration of lipoic acid is preferably 5 ⁇ 10-5 mmol / L or more, more preferably 0.0001 mmol / L or more, and even more preferably 0.0005 mmol / L or more.
  • the upper limit is generally 0.005 mmol / L or less.
  • the medium used in the present invention contains an ascorbic acid derivative instead of ascorbic acid.
  • the ascorbic acid derivative include ascorbic acid-2-phosphate, ascorbic acid-2-phosphate ester trisodium, ascorbic acid-2-phosphate ester magnesium salt, and ascorbic acid-2-glycoside, and these groups.
  • One type may be selected from the above and used, or two or more types may be combined. It is preferable to use ascorbic acid-2-phosphate ester trisodium.
  • the medium used in the present invention preferably does not contain ascorbic acid.
  • the present invention it is important to include an ascorbic acid derivative instead of ascorbic acid. It is considered that the stability as a medium was improved by using an ascorbic acid derivative instead of the unstable ascorbic acid.
  • the total concentration of the ascorbic acid derivative is preferably 0.03 mmol / L or more, more preferably 0.1 mmol / L or more, and 0.14 mmol / L or more. It is more preferable to have.
  • the upper limit is preferably 5.0 mmol / L or less, more preferably 1.0 mmol / L or less, and further preferably 0.57 mmol / L or less.
  • the medium is preferably free of linoleic acid. Furthermore, the medium is preferably free of nucleic acids. Not included here means that it is not substantially contained in relation to the effect of the present invention, and does not mean to exclude inevitably mixed substances. As an example substantially free of ascorbic acid, it is usually less than 5 ⁇ 10-5 mmol / L, preferably 0 mmol / L. In the case of linoleic acid, it is usually less than 0.0015 mmol / L, preferably 0.001 mmol / L or less, more preferably 0.0005 mmol / L or less, still more preferably 0.0003 mmol / L or less.
  • nucleic acid it is usually less than 5 ⁇ 10-5 mmol / L, preferably 0 mmol / L.
  • Mesenchymal stem cells are differentiated into chondrocytes by culturing them in a chondrogenic medium supplemented with transforming growth factor ⁇ 3 (TGF- ⁇ 3), dexamethasone, and bone formation factor 2 (BMP-2), and in vitro. It is known that it is possible to produce cartilage tissue. Therefore, in order to prevent mesenchymal stem cells from differentiating into chondrocytes, the medium is preferably free of TGF- ⁇ 3, dexamethasone, and BMP-2.
  • TGF- ⁇ 3 transforming growth factor ⁇ 3
  • dexamethasone dexamethasone
  • BMP-2 bone formation factor 2
  • substantially free of TGF- ⁇ 3 it is usually less than 0.1 ng / mL, preferably 0 ng / mL.
  • dexamethasone it is usually less than 1.0 nmol / L, preferably 0 nmol / L.
  • BMP-2 it is usually less than 0.1 ng / mL, preferably 0 ng / mL.
  • the medium is preferably free of insulin, transferrin, selenous acid and BSA (bovine serum albumin). Not included here means that it is not substantially contained, and does not mean that those inevitably mixed are excluded. Insulin is usually not included as an example. It is less than 10 ng / mL, preferably 0 ng / mL. In the case of transferrin, it is usually less than 10 ng / mL, preferably 0 ng / mL. In the case of selenous acid, it is usually less than 0.01 ng / mL, preferably 0 ng / mL. In the case of BSA, it is usually less than 10 ⁇ g / mL, preferably 0 ⁇ g / mL.
  • BSA bovine serum albumin
  • the medium may contain phenol red.
  • concentration of phenol red is preferably 0.001 mmol / L or more, more preferably 0.005 mmol / L or more, and even more preferably 0.01 mmol / L or more.
  • the upper limit is generally 0.2 mmol / L or less.
  • the medium may be a medium containing serum or a medium not containing serum.
  • the lower limit of the amount of serum in the medium containing serum is preferably 2% by volume or more, more preferably 5% by volume or more, and further preferably 10% by volume or more.
  • the upper limit is generally 20% by volume or less.
  • serum examples include animal-derived serum, but human serum is preferable.
  • the serum may be allogeneic serum or heterologous serum, but is preferably allogeneic serum. That is, when producing mesenchymal stem cells from human tissue for the purpose of administration to humans, a medium containing human serum may be used. When allogeneic serum is used, it may be autologous serum or allogeneic atypical serum, but it is preferably autologous serum.
  • the medium may further contain an antibiotic.
  • the antibiotic include streptomycin, gentamicin (gentamicin sulfate and the like), penicillin, amphotericin B and the like.
  • the total concentration of the antibiotic is preferably 0.1 mg / L or more, more preferably 0.5 mg / L or more, and further preferably 10.0 mg / L or more.
  • the upper limit is generally 1000 mg / L or less.
  • the medium may contain known additives, if necessary, in addition to the above-mentioned components.
  • the additive include polyamines (for example, putrescine and the like), reducing agents (for example, 2-mercaptoethanol and the like), buffers (for example, HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethalphonic acid) and the like) and the like. Be done.
  • the incubator used for culturing mesenchymal stem cells is not particularly limited as long as it is capable of culturing mesenchymal stem cells, but is limited to a flask, a tissue culture flask, a dish, a petri dish, a tissue culture dish, and a multi-dish. , Microplates, microwell plates, multiplates, multiwell plates, microslides, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles.
  • mesenchymal stem cells may be preferably cultured using a multi-layer flask having 5 or more layers (for example, 5 to 10 layers).
  • a 10-cell stack polystyrene cell stack-10 chamber, manufactured by Corning
  • a flask provided with a vent cap can also be used.
  • the incubator may be cell-adhesive or non-cell-adhesive, and is appropriately selected according to the purpose.
  • the cell-adhesive incubator can be coated with any cell-supporting substrate such as extracellular matrix (ECM) for the purpose of improving the adhesion of the surface of the incubator to cells.
  • ECM extracellular matrix
  • the cell-supporting substrate can be any substance intended for adhesion of mesenchymal stem cells, such as Matrigel using ECM, collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, fibronectin, etc. Can be mentioned.
  • Culture conditions can be set as appropriate.
  • the culture temperature is not particularly limited, but may be about 30 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration can be about 1-10%, preferably about 2-5%.
  • the oxygen concentration can be 1-20%, preferably 1-10%.
  • the culture period of mesenchymal stem cells is preferably 5 days or more, 7 days or more, 10 days or more, and 10 to 100 days, 10 to 90 days, 10 to 80 days, 10 to 70 days, 10 to It may be 60 days, 10-50 days, 10-40 days, 10-30 days, 10-28 days, 10-21 days, or 10-14 days.
  • the culture period of synovial membrane-derived mesenchymal stem cells is preferably 5 days or longer, 7 days or longer, and 10 days or longer, preferably 10 to 100 days, 10 to 90 days, 10 to 80 days, and 10 to 70 days. It may be 10 to 60 days, 10 to 50 days, 10 to 40 days, 10 to 30 days, 10 to 28 days, 10 to 21 days, or 10 to 14 days.
  • mesenchymal stem cells have a decrease in in situ cartilage forming ability in inverse proportion to the number of passages of mesenchymal stem cells in vitro. Therefore, in order to prepare undifferentiated mesenchymal stem cells, the number of passages is preferably 10 or less, more preferably 5 passages or less, and the mesenchymal stem cells in the primary or first passage are used. It is more preferable to manufacture. It is also known that synovial-derived mesenchymal stem cells have a decrease in in-situ cartilage-forming ability in inverse proportion to the number of passages of synovial-derived mesenchymal stem cells in vitro. Therefore, in order to prepare undifferentiated synovial membrane-derived mesenchymal stem cells, the number of passages is preferably 10 or less, and more preferably 5 or less.
  • the present invention is based on the present invention. Separating a suspension of tissue containing mesenchymal stem cells into two layers, an upper layer and a lower layer, Collecting the lower layer of the above two layers and culturing the mesenchymal stem cells contained in the lower layer in a medium containing ascorbic acid-2-phosphate ester trisodium, alanylglutamine and pyridoxine,
  • the present invention relates to a method for culturing mesenchymal stem cells. Specific examples and preferred embodiments of the mesenchymal stem cells, the medium, and the culture method in the above-mentioned method for culturing mesenchymal stem cells according to the present invention are as described above in the present specification.
  • a cell preparation for joint treatment produced by the cell preparation for joint treatment according to the present invention is provided.
  • the present invention further provides a cell preparation for joint treatment containing mesenchymal stem cells cultured by the method for culturing mesenchymal stem cells according to the present invention.
  • the cell preparation for joint treatment does not contain extracellular matrix or scaffold.
  • extracellular matrix or scaffold examples include collagen, hyaluronic acid, alginic acid, polylactic acid, and polyglycolic acid.
  • the mesenchymal stem cells used as an active ingredient in a cell preparation for joint treatment are preferably cells that do not contain karyotype abnormalities.
  • the number of chromosomes of the mesenchymal stem cells is 46, and the chromosome cariotyping is a pair of chromosomes 1 to 22.
  • a cell that is an XX chromosome or an XY chromosome can be mentioned.
  • the ratio of normal cells not containing the above-mentioned karyotype abnormality is preferably higher than 90%, more preferably 91% or more. , More preferably 93% or more, further preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more, and most preferably 100%.
  • Joint treatment may include treatment of joint damage, damage or inflammation, including treatment of joint disease resulting from degeneration and / or inflammation of connective tissues such as cartilage, or non-inflammatory joint disease.
  • Joint treatments include, for example, meniscus injury, traumatic cartilage injury, transected osteochondritis, aseptic osteonecrosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis (eg, chronic rheumatoid arthritis), gout, reactive arthritis, etc.
  • Treatment of diseases selected from the group consisting of psoriatic arthritis, juvenile arthritis, inflammatory arthritis, and articular cartilage defects can be mentioned, but is not limited to these diseases.
  • the osteoarthritis may be a osteoarthritis of the knee in which the joint site is the knee, or the joint site may be an elbow joint, a finger joint, a hip joint, a shoulder joint, an ankle joint, or a cervical spine. It may be a combination of joint parts.
  • the cell preparation for joint treatment of the present invention is preferably a meniscus therapeutic agent or an osteoarthritis therapeutic agent.
  • the mesenchymal stem cells may be mixed with a pharmaceutically acceptable carrier by a conventional method to prepare a preparation suitable for administration to an individual.
  • a pharmaceutically acceptable carrier include distilled water for injection made isotonic by adding physiological saline, glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, prokine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • Agents, antioxidants and the like may be blended.
  • the present invention further relates to a method of treating a joint. More specifically, the present invention relates to meniscus injuries, traumatic cartilage injuries, transected osteochondritis, aseptic osteonecrosis, and osteoarthritis of the knee (eg, osteoarthritis of the knee in which the joint site is the knee).
  • Joint parts are elbow joint, finger joint, hip joint, shoulder joint, ankle joint, cervical spine, combination of multiple joint parts), rheumatoid arthritis (eg, chronic joint rheumatoid arthritis), gout, reactive arthritis, psoriatic arthritis, juvenile
  • the present invention relates to a method for treating a disease selected from the group consisting of arthritis, inflammatory arthritis, and articular cartilage defect.
  • the method for treating joints of the present invention The step of transplanting the joint therapeutic agent of the present invention so as to cover the cartilage damaged part or the mesenchymal stem cell with the mesenchymal stem cell; and by differentiating the mesenchymal stem cell into the chondrocyte, the cartilage damaged part or the meniscus is damaged.
  • the cartilage injured part or the meniscus injured part is covered with the mesenchymal stem cells.
  • Transplantation of mesenchymal stem cells can be performed by open surgery or arthroscopic surgery. In order to minimize the invasion, it is preferable to transplant mesenchymal stem cells under arthroscopy.
  • the cartilage damaged part or the meniscus damaged part may be covered with a suspension of mesenchymal stem cells or may be covered with a cell sheet of mesenchymal stem cells.
  • Mesenchymal stem cells have a high ability to adhere to cartilage injured areas and meniscus injured areas.
  • the minimally invasive procedure of the present invention is characterized by covering the cartilage injury site with mesenchymal stem cells, and the following steps: Hold the position so that the cartilage injury is facing upwards; Placing a cell sheet of mesenchymal stem cells, a suspension of mesenchymal stem cells, or a gel-like substance containing mesenchymal stem cells on the surface of the cartilage injury; To adhere mesenchymal stem cells to the surface of the cartilage injury site; including.
  • the minimally invasive procedure of the present invention is characterized by covering the injured part of the meniscus with mesenchymal stem cells, and the following steps: Hold the position so that the injured part of the meniscus faces down; Injecting a suspension of mesenchymal stem cells into the knee joint; and maintaining a specific time position to allow mesenchymal stem cells to adhere to the injured meniscus; including.
  • the transplanted mesenchymal stem cells are placed on the surface of the cartilage or meniscus tear for at least 10 minutes, preferably 15 minutes. , It is preferable to hold. To achieve this, position at least 10 for the purpose of turning the cartilage or meniscus tear upwards and retaining the mesenchymal stem cells in the upwardly oriented cartilage or meniscus tears. Hold for minutes, preferably 15 minutes.
  • the cartilage-damaged part and meniscus-damaged part with mesenchymal stem cells can be covered with a bone membrane to further strengthen the adhesion of the mesenchymal stem cells to the cartilage-damaged part or meniscus-damaged part.
  • Surgery is completed after holding mesenchymal stem cells on the surface of the cartilage injured or meniscal injured for at least 10 minutes.
  • the transplanted mesenchymal stem cells differentiate into chondrocytes at the cartilage damaged part and the meniscus damaged part, and regenerate the cartilage tissue in situ at the cartilage damaged part or the meniscus damaged part.
  • cartilage tissue regenerates according to the local microenvironment (nutrition supply, cytokine environment, etc.), so no external manipulation is required.
  • cartilage tissue is regenerated at the cartilage injured or meniscus injured to repair the injury and, in the case of cartilage injury, the bone region, cartilage and bone.
  • the border with the cartilage, the center of the cartilage, the surface area, and the area adjacent to the original cartilage are formed as the original cartilage tissue, or in the case of meniscus tear, the meniscus cartilage is formed.
  • Basic medium type Basic medium Thermo Fisher Scientific MEM alpha no nucleosides (model number: 12561)
  • Basic medium A A medium in which ascorbic acid, glutamine, and pyridoxal in the type medium are replaced with ascorbic acid-2-phosphate disodium, alanylglutamine, and pyridoxine, respectively.
  • Table 1 shows the medium composition of the type basal medium and basal medium A.
  • bFGF fiblast spray 250 (Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) dissolved in water for injection and prepared to 10 ⁇ g / mL
  • type medium + bFGF bFGF
  • bFGF is an abbreviation for basic fibroblast growth factor.
  • a tissue suspension of purchased human myeloid tissue (lots: B009, B012) is centrifuged at 1,000 rpm for 10 minutes to separate into two layers. The lower layer is collected and used. In this lower layer, plasma-removed material, type medium, medium A, or type medium + bFGF was added in an amount 10 times that before plasma removal, and seeded in a flask so as to be 0.20 mL / cm 2 . Culturing was carried out in an incubator at 37 ° C. and a 5% CO 2 atmosphere.
  • the medium was exchanged every 3 or 4 days, and the cells were cultured for 12 to 13 days after sowing, and then exfoliated with a 0.05% trypsin-EDTA solution (hereinafter, trypsin, Life Technologies model number: 25300). After exfoliation, trypsin was neutralized with an equal amount of medium and transferred to a separately prepared tube. The culture flask was further washed with an equal amount of medium, added to the above tube, and the remaining cells were collected. The tube was centrifuged at 200 xg for 5 minutes and the supernatant was removed. An appropriate amount of medium was added to the remaining pellets, and cell counting was performed using a hemocytometer.
  • trypsin-EDTA solution hereinafter, Life Technologies model number: 25300
  • the seeds were seeded in flasks so that the final concentration was 0.20 to 0.50 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , and cultured in an incubator at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere.
  • the cells were cultured for 3 or 4 days, and when 60% or more of the bottom surface of the flask was filled with cells, the passage was repeated in the same manner as described above.
  • the cells at the end of the 9th passage, and in the case of B012, the cells at the end of the 4th passage are centrifuged so that the final concentration is 10% (v / v) dimethyl sulfoxide (SIGMA-ALDRICH model number: D2650).
  • SIGMA-ALDRICH model number: D2650 dimethyl sulfoxide
  • FIG. 1 shows a comparison of growth curves represented by population doubling values.
  • the population doubling value (PDL) indicates the number of cell divisions and is calculated from the following formula.
  • a growth curve was created by calculating PDL for each passage and accumulating it. Calculation formula of PDL: (Log (number of recovered cells) -Log (number of seeded cells)) / Log2
  • Human bone marrow mesenchymal stem cells were obtained and cultured by the method described in [Experiment A].
  • the synovial tissue collected from the knee of a mini pig was shredded with scissors and immersed in 5.0 mL of liberase solution.
  • liberase solution 5.0 mg of Liberase MNP-S (manufactured by Roche) was dissolved in 5.0 mL of water for injection containing a final concentration of 20% fetal bovine serum (Nichirei Bioscience, model number: 174012). .. The enzymatic reaction was carried out at 37 ° C. for 3 hours.
  • the tissue digestive juice was separated into two layers through a cell strainer, and the lower layer was transferred to a 50 mL centrifuge tube and centrifuged at 400 g for 5 minutes. The supernatant was removed, and the obtained cell-concentrated suspension was suspended in the medium.
  • T-flask TPP cell culture flask 150 cm 2 filter cap model number: 90151
  • 10-cell stack Corning cell stack 10-chamber cell culture surface treatment model number: 3270
  • a cell suspension in which cells are suspended in the above-mentioned medium at a predetermined concentration is prepared so that the cell seeding density and the amount of the medium after seeding in the culture container become predetermined conditions, and the culture container according to (3).
  • the seeding density means the number of cells to be seeded per unit area of the culture surface
  • the medium amount means the medium volume per unit area of the culture surface.
  • the porcine synovial mesenchymal stem cells were cultured in a type medium supplemented with 20% (v / v) FBS (fetal bovine serum).
  • the cell seeding density was 1000, 1500 cells / cm 2 , the medium volume was 0.12 mL / cm 2 , and the culture vessel was a T-flask.
  • the cells were collected and the growth rate was calculated for each.
  • Table 2 shows the relative growth rate when the growth rate under the condition of a sowing density of 1000 seeds / cm 2 is 1.
  • Table 4 shows the relative growth rate when the growth rate under the condition of a seeding density of 1000 cells / cm 2 when the type medium to which FBS was added was set to 1.
  • medium A showed a high growth rate with respect to the type medium in the range of cell seeding density of 1000 to 1500 cells / cm 2 .
  • Test 2 Comparison of growth rates due to differences in medium volume 1 Human bone marrow mesenchymal stem cells were cultured using type medium and medium A.
  • Comparative Test 1 a medium in which 20% (v / v) of FBS was added to the type medium was used, and the medium amount was 0.12 mL / cm 2 .
  • comparative test 2 a medium in which 20% (v / v) of FBS was added to the type medium was used, and the medium amount was 0.24 mL / cm 2 .
  • Test 3 a medium in which 20% (v / v) of FBS was added to the medium A was used, and the medium amount was 0.12 mL / cm 2 .
  • Test 4 a medium in which 20% (v / v) of FBS was added to the medium A was used, and the medium amount was 0.24 mL / cm 2 .
  • the cells were collected and the proliferation rate was calculated on the 12th day after seeding under the conditions of Comparative Tests 1 and 2 and Tests 3 and 4.
  • Table 5 shows the relative growth rate when the growth rate of the comparative test 1 is 1. It was found that the growth rate was improved by increasing the amount of the culture medium in both the type medium and the medium A.
  • Test 3 Comparison of growth rates due to differences in medium volume 2 Pig synovial mesenchymal stem cells were cultured using type medium and medium A.
  • a medium in which 20% (v / v) of FBS was added to the type medium was used, and the medium amount was 0.12 mL / cm 2 .
  • a medium in which 20% (v / v) of FBS was added to the type medium was used, and the medium amount was 0.20 mL / cm 2 .
  • test 13 a medium in which 20% (v / v) of FBS was added to medium A was used, and the medium amount was 0.12 mL / cm 2 .
  • a medium in which 20% (v / v) of FBS was added to medium A was used, and the medium amount was 0.20 mL / cm 2 .
  • the cells were collected and the proliferation rate was calculated on the 12th day after seeding under the conditions of comparative tests 11 and 12 and tests 13 and 14.
  • Table 6 shows the relative growth rate when the growth rate of the comparative test 1 is 1. It was found that the growth rate was improved by increasing the amount of the culture medium in both the type medium and the medium A.
  • Test 4 Evaluation of proliferation rate without increasing serum usage
  • Pig synovial mesenchymal stem cells were cultured using type medium and medium A as basal medium.
  • a medium in which 20% (v / v) of FBS was added to the type medium was used, and the medium amount was 0.12 mL / cm 2 .
  • the comparative test 22 a medium in which 20% (v / v) of FBS was added to the medium A was used, and the medium amount was 0.12 mL / cm 2 .
  • the cells were collected and the proliferation rate was calculated on the 12th day after seeding under the conditions of Test 21, Comparative Test 22, and Test 23.
  • Table 7 shows the relative growth rate when the growth rate of test 21 is 1. In general, it is known that lowering the serum concentration lowers the growth rate. This is because serum concentration is believed to contribute most to cell proliferation. On the other hand, in Medium A, it was found that even if the amount of serum used was the same, the growth rate was unexpectedly improved by increasing the amount of basal medium and lowering the serum concentration.
  • Test 5 Effect of serum concentration on proliferation rate Human bone marrow mesenchymal stem cells were cultured using type medium and medium A.
  • a type medium supplemented with 20% (v / v) FBS was used, and the medium amount was 0.12 mL / cm 2 .
  • a type medium supplemented with 10% (v / v) FBS was used so that the total amount of FBS used for culturing was the same as that of the test 31, and the medium amount was 0.24 mL / cm 2 .
  • medium A supplemented with 10% (v / v) FBS was used so that the total amount of FBS used for culturing was the same as that of test 31, and the medium amount was 0.24 mL / cm 2 . bottom.
  • the type medium even if the amount of serum used is the same, the growth rate decreases when the serum concentration decreases, but when medium A is used as the basal medium, the amount of basal medium is increased and the serum concentration is decreased, so that the type medium can be used.
  • T-flask Effect of different culture vessels on proliferation rate
  • a type medium and a medium A to which 20% (v / v) of FBS was added were used, and the amount of the medium was 0.12 mL / cm 2 .
  • a type medium was used, and a T-flask and a 10-cell stack were used for culturing, respectively.
  • Table 7 shows the relative growth rate of the 10-cell stack when the growth rate of the T flask was 1.
  • type media was used, and T-flasks and 10-cell stacks were used for culturing, respectively.
  • the growth rate after culturing in each culture vessel for 12 days was evaluated, and the relative growth rate of the 10-cell stack when the growth property of the T flask was set to 1 is shown in Table 9. It was found that when the culture vessel was changed from the T flask to the 10-cell stack, the growth rate decreased in the type medium, whereas the growth rate increased in the medium A.
  • Test 7 Effect of cap morphology of culture vessel and presence / absence of forced aeration on proliferation rate
  • a type medium and a medium A to which 20% (v / v) of FBS was added were used, and the amount of the medium was 0.12 mL / cm 2 .
  • two caps of a 10-cell stack were compared with a standard filter cap and a change from a standard filter cap to a bent cap (transfer cap for Corning cell stack model number; 3281).
  • the medium A was changed to a vent cap, and the one in which gas was forcibly aerated from the vent cap on one side was compared.
  • the gas used for forced aeration was air containing 5% CO2, humidified to the same level as the incubator environment (relative humidity 100%) before introduction into the 10-cell stack, and the temperature was adjusted to 37 ° C.
  • the cells were collected by culturing for 12 days under each culture condition, and the proliferation rate was calculated.
  • Table 10 shows the relative growth rate when the growth result of the cells cultured in the T flask using the same amount of medium in the type medium was set to 1.
  • the relative growth rate results indicating that the culture cannot be continued are those that did not reach the culture for 12 days because it was confirmed that the cells did not grow in the process of the culture.
  • the growth rate was significantly improved by changing to a vent cap and forcibly ventilating the gas.
  • Test 7 Establishment of rat synovial-derived stem cells and meniscal regeneration effect This test shows the ability of rat synovial-derived mesenchymal stem cells to regenerate the meniscus in the rat body.
  • Six-week-old Lewis rats were used to establish synovial-derived mesenchymal stem cells.
  • Synovial tissue collected under isoflurane anesthesia was collected from Fetal Bovine Serum (Gibco Cat. # 10270) to a concentration of 20% and Antibiotic-Antimycotic (100X) to a concentration of 1% (Thermorphisher Scientific Cat. ) was added to the basal medium A to a concentration of 3.0 mg / mL, Collagenase V (Sigma Cat.
  • the cells were allowed to stand in an incubator at ° C for 5 minutes, the cells were collected as mesenchymal stem cells, and the number of cells was calculated with a living-dead cell autoanalyzer Vi-CELL (BECKMAN COOLTER, model number: 731050). The supernatant was discarded by centrifugation and replaced with COS-banker (Cat. # COS-CFM01 of Cosmo Bio Co., Ltd.) to prepare a frozen stock of cells.
  • COS-banker Cat. # COS-CFM01 of Cosmo Bio Co., Ltd.
  • a 10-week-old Lewis rat was used to create a meniscal injury model to evaluate the meniscal regeneration effect.
  • knee joint skin was incised under isoflurane anesthesia to expose the knee joint.
  • the medial joint capsule under the patella was exposed and a longitudinal incision was made with a scalpel to expose the cartilage in the distal femur.
  • the medial meniscus was detached from the synovium to expose the medial meniscus, and about two-thirds of the whole was excised.
  • the patellar tendon and synovium were sutured, and then the muscles were sutured.
  • rSMSC rat synovial membrane-derived mesenchymal stem cells
  • PBS group rat synovial membrane-derived mesenchymal stem cells
  • the mesenchymal stem cells to be administered were 20% Fetal Bovine Serum (Gibco Cat. # 10270), 1% Antibiotic-Antimycotic (100 ⁇ ) (Thermo Fisher scientific Cat. Sleeping using the contained basal medium A, culturing for 8 days, and collecting 5 ⁇ 10 6 cells were pierced into the knee joint from the suture site in the direction perpendicular to the knee joint using an injection needle. It was transplanted and the skin was sutured. After the operation, all rats were returned to their cages and allowed to exercise and eat and drink freely.
  • the area of the meniscus regeneration portion was measured by ImageJ (version 1.52).
  • the regenerated part of the meniscus was visually judged from the color tone and shape of the meniscus, and the area was calculated using Equation 1.
  • Meniscus reproduction area (mm 2 ) number of pixels in meniscus reproduction area / 1 mm Number of pixels per 2
  • the mean value, standard deviation and statistical analysis of the regenerated partial area of each group were all performed by Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corp.).
  • Student's T-Test was performed between the rSMSC group and the PBS group, and a significance level of less than 5% (P ⁇ 0.05) was regarded as having a difference.
  • Table 11 shows the values of the meniscal regeneration area of the rSMSC group and the PBS group.
  • the regenerated area of the meniscus in the PBS group was 1.1 mm 2
  • the regenerated area of the rSMSC group was 2.0 mm 2 , which was approximately twice as large as that of the meniscus, showing a statistically significant difference (P ⁇ 0.05). Indicated.

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Abstract

本発明は、細胞の増殖倍率を向上させることができ、必要な血清量を減少でき、かつ培養過程における核型異常を抑制させることができるような関節治療用細胞製剤の製造方法および間葉系幹細胞の培養方法、並びに上記方法により製造される関節治療用細胞製剤を提供することを課題とする。本発明によれば、アスコルビン酸－２－リン酸エステル三ナトリウム、アラニルグルタミンおよびピリドキシンを含む培地において間葉系幹細胞を培養することを含む、関節治療用細胞製剤の製造方法が提供される。

Description

関節治療用細胞製剤の製造方法、関節治療用細胞製剤および間葉系幹細胞の培養方法
　本発明は、所定の成分を含む培地において間葉系幹細胞を培養することを含む、関節治療用細胞製剤の製造方法並びに間葉系幹細胞の培養方法に関する。本発明はさらに、上記方法により製造される関節治療用細胞製剤に関する。
　整形外科領域において、関節軟骨損傷や半月板損傷は、日常的な診療行為の対象として頻繁に見られ、多数の患者がいる疾病として広く認識されている。関節軟骨損傷や半月板損傷が生じた場合、関節痛、可動域の減少、関節水腫、および運動障害などを生じる。外傷で生じた関節軟骨損傷や半月板損傷を有する患者は、通常は整形外科医の治療を受ける。軟骨損傷や半月板損傷に対する外科的治療は、関節をさらに悪化させる要因となる破片を取り除き、患部関節の機能を回復させることを目的としている。しかし、一般的に軟骨および半月板組織は自己再生が困難であることが知られている。
　一方、近年の再生医療技術の進歩により、軟骨や半月板を修復し得る細胞治療が盛んになっている。中でも、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）は、有用な細胞治療の細胞源として期待されている。間葉系幹細胞は種々の体組織から採取が可能であり、骨髄組織、脂肪組織、筋肉組織、滑膜組織、骨膜組織などから単離できることが報告されている。（非特許文献１）特に、滑膜由来間葉系幹細胞は、骨髄などのさまざまな間葉系組織由来の間葉系幹細胞に比べて高い増殖能および軟骨形成能を有することが報告されている（非特許文献２）。また、特許文献１および特許文献２には、滑膜由来間葉系幹細胞を用いて関節軟骨損傷や半月板損傷を治療する方法が開示されている。
Na Li,et al.,2020, Stem Cell Research ＆Therapy. 11:381 Sakaguchi, et al. , 2005, Arthritis Rheum. 52:2521-9
特許第５９２８９６１号公報 特許第５６５６１８３号公報
　間葉系幹細胞を含む幹細胞においては、細胞培養過程において核型異常が発生する場合があることが明らかになってきた。関節治療のための細胞移植においては、安全性を確保するためには、核型異常を低減することが必要である。また安全性の確保に加えて、治療効果を達成するためには、十分な細胞数を確保することも必要である。さらに、自家治療で自己血清を使用する場合には、採取可能な血清量に限界があるため、血清量を減らすことも必要である。
　本発明は、細胞の増殖倍率を向上させることができ、必要な血清量を減少でき、かつ培養過程における核型異常を抑制させることができるような関節治療用細胞製剤の製造方法および間葉系幹細胞の培養方法、並びに上記方法により製造される関節治療用細胞製剤を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、アスコルビン酸誘導体、アラニルグルタミンおよびピリドキシンを含む培地において間葉系幹細胞を培養することによって、上記の課題を解決できることを見出した。本発明は上記知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　アスコルビン酸誘導体、アラニルグルタミンおよびピリドキシンを含む培地において間葉系幹細胞を培養することを含む、関節治療用細胞製剤の製造方法。
＜２＞　上記間葉系幹細胞が、滑膜由来間葉系幹細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞　上記間葉系幹細胞が、自家由来である、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞　上記培地が、同種血清を含む、＜１＞から＜３＞のいずれか一に記載の方法。
＜５＞　上記培地が、アスコルビン酸を含まない、＜１＞から＜４＞のいずれか一に記載の方法。
＜６＞　上記培地が、ビオチンまたはリポ酸のいずれか一以上を含む、＜１＞から＜５＞のいずれか一に記載の方法。
＜７＞　５層以上の多層フラスコを用いて間葉系幹細胞を培養する、＜１＞から＜６＞のいずれか一に記載の方法。
＜８＞　間葉系幹細胞を含む組織の懸濁液を上層と下層の二層に分離させること、および上記二層のうちの下層を採取することをさらに含み、
アスコルビン酸誘導体、アラニルグルタミンおよびピリドキシンを含む培地において上記下層に含まれる間葉系幹細胞を培養する、＜１＞から＜７＞のいずれか一に記載の方法。
＜９＞　＜１＞から＜８＞のいずれか一に記載の方法により製造された、関節治療用細胞製剤。
＜１０＞　細胞外基質またはスキャホールドを含まない、＜９＞に記載の関節治療用細胞製剤。
＜１１＞　半月板治療剤または変形性関節症治療剤である、＜９＞または＜１０＞に記載の関節治療用細胞製剤。
＜１２＞　間葉系幹細胞がヒト間葉系幹細胞であり、間葉系幹細胞の染色体数が４６本であり、染色体のカリオタイピングが、一対の１番から２２番染色体と、ＸＸ染色体またはＸＹ染色体とである、＜９＞から＜１１＞の何れか一に記載の関節治療用細胞製剤。
＜１３＞　間葉系幹細胞を含む組織の懸濁液を上層と下層の二層に分離させること、
上記二層のうちの下層を採取すること、および
アスコルビン酸誘導体、アラニルグルタミンおよびピリドキシンを含む培地において上記下層に含まれる間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞の培養方法。
＜１４＞　上記間葉系幹細胞が、滑膜由来間葉系幹細胞である、＜１３＞に記載の方法。
＜１５＞　上記間葉系幹細胞が、自家由来である、＜１３＞または＜１４＞に記載の方法。
＜１６＞　上記培地が、同種血清を含む、＜１３＞から＜１５＞のいずれか一に記載の方法。
＜１７＞　上記培地が、アスコルビン酸を含まない、＜１３＞から＜１６＞のいずれか一に記載の方法。
＜１８＞　上記培地が、ビオチンまたはリポ酸のいずれか一以上を含む、＜１３＞から＜１７＞のいずれか一に記載の方法。
＜１９＞　５層以上の多層フラスコを用いて間葉系幹細胞を培養する、＜１３＞から＜１８＞のいずれか一に記載の方法。
＜２０＞　＜１３＞から＜１９＞のいずれか一に記載の方法により培養された間葉系幹細胞を含む、関節治療用細胞製剤。
＜２１＞　細胞外基質またはスキャホールドを含まない、＜２０＞に記載の関節治療用細胞製剤。
＜２２＞　半月板治療剤または変形性関節症治療剤である、＜２０＞または＜２１＞に記載の関節治療用細胞製剤。
＜２３＞　間葉系幹細胞がヒト間葉系幹細胞であり、間葉系幹細胞の染色体数が４６本であり、染色体のカリオタイピングが、一対の１番から２２番染色体と、ＸＸ染色体またはＸＹ染色体とである、＜２０＞から＜２２＞の何れか一に記載の関節治療用細胞製剤。
＜Ａ＞　軟骨損傷部または半月板損傷部を間葉系幹細胞により覆うように、本発明の方法により製造した関節治療用細胞製剤または本発明の方法により培養した間葉系幹細胞を移植する工程；および
　間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させることによって、軟骨損傷部または半月板損傷部でｉｎ　ｓｉｔｕで軟骨組織を再生させる工程；
を含む、関節の治療方法。
　本発明によれば、組織から十分な量の細胞を製造する際に、増殖倍率を向上させることができ、必要な血清量を減少でき、さらに培養過程で核型異常を抑制することができる。
図１は、タイプ培地または培地Ａを用いた場合における間葉系幹細胞の増殖曲線を示す。 図２は、タイプ培地または培地Ａを用いた場合における間葉系幹細胞の核型解析を示す。 図２は、タイプ培地にｂＦＧＦを添加した培地、または培地Ａを用いた場合における間葉系幹細胞の核型解析を示す。 図４は、ラット滑膜由来間葉幹細胞（ｒＳＭＳＣ）又はＰＢＳを投与したラットから摘出した両膝関節内側半月板の画像を示す。
　以下において、本発明の内容について詳細に説明する。なお、本明細書において「～」とはその前後に記載される数値を下限値および上限値として含む意味で使用される。
＜１＞　関節治療用細胞製剤の製造方法
　本発明は、アスコルビン酸誘導体、アラニルグルタミンおよびピリドキシンを含む培地において間葉系幹細胞を培養することを含む、関節治療用細胞製剤の製造方法に関する。上記した特定成分を含む培地において間葉系幹細胞を培養することによって、核型異常の発生が抑制されるにも関わらず、高い細胞増殖を得られること、すなわち、核型異常の発生の抑制と、高い細胞増殖とを両立できることは、従来の知見から予想できることではなく、全く予想外な結果である。
　本発明による関節治療用細胞製剤の製造方法は、アスコルビン酸誘導体、アラニルグルタミンおよびピリドキシンを含む培地において間葉系幹細胞を培養すること、および上記で培養された間葉系幹細胞を用いて関節治療用細胞製剤を製造すること、を含んでいてもよい。
＜間葉系幹細胞＞
　間葉系幹細胞とは、骨芽細胞、軟骨芽細胞、脂肪芽細胞、筋細胞等の間葉系の細胞の全てまたはそのうちの一部の細胞への分化が可能な幹細胞またはその前駆細胞の集団を広義に意味する。間葉系幹細胞は骨髄、滑膜、骨膜、脂肪組織、筋肉組織に存在することが知られている。間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化に関連して、ＢＭＰ（bone morphogenetic protein：骨形成タンパク質）あるいはＴＧＦ－β（Transforming growth factor－β：トランスフォーミング増殖因子－β）を培養液に添加することにより、未分化間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化が促進され、そして軟骨組織がｉｎ　ｖｉｔｒｏ条件下で再生できることが知られている。
　間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞に特徴的な分子、例えば酵素、レセプター、低分子化合物等を検出して確認することができる。間葉系幹細胞に特徴的な分子としては、細胞表面マーカー（ポジティブマーカー）であるＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、間葉系幹細胞には発現していないネガティブマーカーとしては、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、ＣＤは、Ｃｌｕｓｔｅｒｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎの略であり、ＨＬＡ－ＤＲは、ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ－Ｄ－ｒｅｌａｔｅｄの略である。これらのポジティブマーカーおよびネガティブマーカーを利用して、間葉系幹細胞であることを確認することができる。これらのマーカーの検出には免疫学的方法を利用できるが、各分子のｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。
　間葉系幹細胞が由来する動物種は特に限定されず、例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などの細胞であってもよい。
　間葉系幹細胞は、ヒト間葉系幹細胞であることが好ましい。
　間葉系幹細胞の由来は特に限定されないが、好ましくは、滑膜、骨髄、脂肪、歯髄、胎児由来に由来するものであるか、人工多能性幹細胞に由来するものである。間葉系幹細胞は、より好ましくは滑膜由来間葉系幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞であり、さらに好ましくは滑膜由来間葉系幹細胞である。
　間葉系幹細胞が、自家由来または他家由来のいずれでもよいが、好ましくは自家由来である。
　間葉系幹細胞は、遺伝子改変された細胞でもよいし、遺伝子改変されていない細胞でもよいが、好ましくは遺伝子改変されていない細胞である。
　間葉系幹細胞は、上記した組織から常法により採取することができる。好ましくは、間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞を含む組織の懸濁液を上層と下層の二層に分離させること、および上記二層のうちの下層を採取することによって採取することができる。間葉系幹細胞を含む組織の懸濁液を上層と下層の二層に分離させることは、例えば、遠心により行うことができる。
　一例として、滑膜由来間葉系幹細胞を、滑膜組織から採取する方法を説明する。
　滑膜組織は、麻酔下で関節の非荷重部分から採取することができる。滑膜組織の採取量は、ドナーの種類、または必要とされる滑膜由来間葉系幹細胞の量を考慮して決めることができる。例えば、０．１ｇ～１０ｇ、好ましくは０．１ｇ～２．０ｇ、より好ましくは０．１ｇ～１．５ｇ、さらに好ましくは０．１ｇ～１．０ｇの滑膜組織から滑膜由来間葉系幹細胞を得ることができる。採取した滑膜組織は、必要に応じてハサミ等で細断した後、酵素処理に供される。酵素としては、プロテアーゼを含む酵素であれば特に限定されないが、好ましくは、１種以上のコラゲナーゼと１種以上の中性プロテアーゼを含む混合酵素である。特に好ましい酵素は、リベラーゼである。リベラーゼとしては、例えば、リベラーゼＭＮＰ－Ｓ（ロシュ製）を使用することができるが、これはコラゲナーゼクラスＩとコラゲナーゼクラスＩＩと中性プロテアーゼ（サーモシリン）とを含む酵素である。酵素処理における酵素濃度は、好ましくは０．０１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌであり、さらに一層好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ～５．０ｍｇ／ｍｌであり、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ～２．０ｍｇ／ｍｌであり、最も好ましくは０．７ｍｇ／ｍｌ～２．０ｍｇ／ｍｌである。滑膜組織と酵素の質量比率は、好ましくは１０００：１～１０：１であり、より好ましくは５００：１～２０：１であり、さらに好ましくは２００：１～４０：１である。
　酵素反応は、好ましくは１５℃から４０℃、より好ましくは２０℃から４０℃の温度で行うことができる。反応時間は、３０分以上であればよく、好ましくは２時間以上であり、より好ましくは２時間３０以上であり、更に好ましくは３時間以上である。反応時間の上限は特に限定されないが、一般的には４時間以内である。酵素処理された混合物には、滑膜由来間葉系幹細胞が含まれている。酵素処理された混合物は、セルストレーナーを通して遠沈管に移し、遠心処理することにより滑膜由来間葉系幹細胞を回収することができる。
＜培地＞
　本発明で使用する培地は必須アミノ酸を含むことが好ましい。すなわち、培地は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびバリンを含むことが好ましい。培地における必須アミノ酸の濃度は特に限定されないが、各必須アミノ酸の濃度が、０．００３ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。
　必須アミノ酸は合計濃度としては、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。
　培地は非必須アミノ酸等を含むことが好ましい。ここで、非必須アミノ酸等とは非必須アミノ酸とグルタミン類とを規定する意味である。非必須アミノ酸等としては、グリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン類、グルタミン酸、プロリン、セリンおよびチロシンからなる群から選択される一以上のものが挙げられる。
　非必須アミノ酸等として、グリシン、アラニン、セリン、プロリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン類、または／およびグルタミン酸を含む場合、これらの各々は０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ（５μｍｏｌ／Ｌ）以上であり、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましい。上限値としては、３ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。グルタミン類として好ましくは、アラニルグルタミンが挙げられる。ただし、本発明で用いる培地は、アラニルグルタミンを必須成分として含有する。
　アラニルグルタミン以外の非必須アミノ酸等の合計濃度としては、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。
　アラニルグルタミンの濃度としては、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、１．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましい。上限値としては、１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。
　培地は、グルタミンを含まないことが好ましい。ここで含まないとは、本発明の効果との関係で実質的に含まれていないことを言い、不可避的に混入するものを排除する意味ではない。実質的に含まれない例としては、通常、５×１０－５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であり、好ましくは、０ｍｍｏｌ／Ｌである。
　アミノ酸の検出および測定方法は公知の方法によればよいが、例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によるアミノ酸の定量、ニンヒドリン法によるアミノ酸分析方法（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９７）,Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．８，ｐ１４２１－１４２８を参照）等により行うことができる。
　本明細書中に記載されるアミノ酸は、Ｌ－体、Ｄ－体、ＤＬ－体のいずれであってもよい。またアミノ酸は遊離体のみならず塩を形成していてもよい。塩の形態には酸付加塩や塩基との塩等を挙げることができる。酸としては、例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸またはモノメチル硫酸等の有機酸が挙げられる。また、そのような塩を形成する塩基としては、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム等の金属の水酸化物あるいは炭酸化物や、アンモニア等の無機塩基、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、エタノールアミン、モノアルキルエタノールアミン、ジアルキルエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機塩基が挙げられる。塩は水和物（含水塩）であってもよい。
　培地は、ピリドキシンを含む。
　培地は、ビオチンを含んでいてもよい。
　培地はさらに、ピリドキシンおよびビオチン以外に、少なくとも１種のその他のビタミン類を含んでいてもよい。その他のビタミン類としては、ビタミンＢ１２、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサール類（ピリドキシンを除く）、リボフラビン、チアミン塩酸塩およびｉ－イノシトールが挙げられる。ピリドキサール類としては、ピリドキサールが挙げられる。
　上記したピリドキシン、ビオチン、および少なくとも１種のその他のビタミン類は、遊離体のみならず塩を形成していてもよい。塩の形態には酸付加塩や塩基との塩等を挙げることができる。具体的には、アミノ酸について上記したものが挙げられる。
　培地における、ピリドキシン、ビオチンおよび少なくとも１種のその他のビタミン類の含有濃度は、各々が０．００００５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．０００１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、０．０００２ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、１ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。
　培地におけるビタミン類の含有濃度は、合計で、０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、２ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。
　培地は、ピリドキサールまたは、ピリドキサール類（ピリドキシンを除く）を含まないことが好ましい。ここで含まないとは、本発明の効果との関係で実質的に含まれていないことを言い、不可避的に混入するものを排除する意味ではない。実質的に含まれない例としては、ピリドキサールの場合、通常、５×１０－５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であり、好ましくは、０ｍｍｏｌ／Ｌである。
　培地は、少なくとも１種の無機塩を含むことが好ましい。無機塩は、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウムからなる群から選択される一以上であることが好ましい。無機塩の濃度は特に限定されないが、合計で、１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、８０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、１，０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。
　培地は、糖類およびピルビン酸塩のうちの少なくとも１種を含むことが好ましい。糖類としてはＤ－グルコースが挙げられる。ピルビン酸塩としては、ピルビン酸ナトリウムが挙げられる。糖類およびピルビン酸塩の濃度は、合計で、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。
　培地は、好ましくは、リポ酸を含む。リポ酸の濃度は、５×１０－５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．０００１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、０．０００５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。
　本発明で使用する培地は、アスコルビン酸に代えて、アスコルビン酸誘導体を含む。アスコルビン酸誘導体としては、アスコルビン酸－２－リン酸、アスコルビン酸－２－リン酸エステル三ナトリウム、アスコルビン酸－２－リン酸エステルマグネシウム塩、およびアスコルビン酸－２－グリコシドが挙げられ、これらの群から一種を選択して用いてもよいし、二種以上を組み合わせても良い。アスコルビン酸－２－リン酸エステル三ナトリウムを用いることが好ましい。
　本発明で使用する培地は、好ましくは、アスコルビン酸を含まない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明においては、アスコルビン酸に代えて、アスコルビン酸誘導体を含むことが重要である。これは、不安定なアスコルビン酸に代えアスコルビン酸誘導体を採用したことにより、培地としての安定性が向上したと考えられる。
　本発明の培地組成物において、アスコルビン酸誘導体の濃度は、合計で、０．０３ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、０．１４ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、５．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、１．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましく、０．５７ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることがさらに好ましい。
　培地はリノール酸を含まないことが好ましい。さらに、培地は核酸を含まないことが好ましい。
　ここで含まないとは、本発明の効果との関係で実質的に含まれていないことを言い、不可避的に混入するものを排除する意味ではない。実質的に含まれない例としては、アスコルビン酸の場合は、通常、５×１０－５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であり、好ましくは、０ｍｍｏｌ／Ｌである。リノール酸の場合は、通常、０．００１５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であり、好ましくは、０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは、０．０００５ｍｍｏｌ／Ｌ以下、更に好ましくは、０．０００３ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、特に好ましくは、０．０００１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、最も好ましくは、０ｍｍｏｌ／Ｌである。また、核酸の場合は、通常、５×１０－５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であり、好ましくは、０ｍｍｏｌ／Ｌである。
　間葉系幹細胞を、トランスフォーミング増殖因子β３（ＴＧＦ－β３）、デキサメタゾン、骨形成因子２（ＢＭＰ－２）を添加した軟骨形成培地中で培養することにより、軟骨細胞に分化し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで軟骨組織を作製することが可能であることが知られている。従って、間葉系幹細胞が軟骨細胞へ分化しないようにするためには、培地は、ＴＧＦ－β３、デキサメタゾン、およびＢＭＰ－２を含まないことが好ましい。
　ここで含まないとは、実質的に含まれていないことを言い、不可避的に混入するものを排除する意味ではない。実質的に含まれない例としては、ＴＧＦ－β３の場合は、通常、０．１ｎｇ／ｍＬ未満であり、好ましくは、０ｎｇ／ｍＬである。デキサメタゾンの場合は、通常、１．０ｎｍｏｌ／Ｌ未満であり、好ましくは、０ｎｍｏｌ／Ｌである。また、ＢＭＰ－２の場合は、通常、０．１ｎｇ／ｍＬ未満であり、好ましくは、０ｎｇ／ｍＬである。
　培地は、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含まないことが好ましい。
　ここで含まないとは、実質的に含まれていないことを言い、不可避的に混入するものを排除する意味ではない。実質的に含まれない例としては、インスリンの場合は、通常、　
１０ｎｇ／ｍＬ未満であり、好ましくは、０ｎｇ／ｍＬである。トランスフェリンの場合は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ未満であり、好ましくは、０ｎｇ／ｍＬである。亜セレン酸の場合は、通常、０．０１ｎｇ／ｍＬ未満であり、好ましくは、０ｎｇ／ｍＬである。ＢＳＡの場合は、通常、１０μｇ／ｍＬ未満であり、好ましくは、０μｇ／ｍＬである。
　培地は、フェノールレッドを含んでいてもよい。フェノールレッドの濃度は、０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。
　培地としては、血清を含む培地でもよいし、血清を含まない培地でもよい。血清を含有する培地における血清の量は、下限値としては、２体積％以上であることが好ましく、５体積％以上であることがより好ましく、１０体積％以上であることがさらに好ましい。上限値としては、２０体積％以下であることが一般的である。
　血清としては、動物由来の血清が挙げられるが、好ましくはヒト血清である。
　血清としては、同種血清でも異種血清でもよいが、好ましくは同種血清である。即ち、ヒトへの投与を目的として、ヒト組織から間葉系幹細胞を製造する場合には、ヒト血清を含む培地を使用してもよい。同種血清を使用する場合、自己血清でもよいし、同種異型の血清でもよいが、好ましくは自己血清である。
　培地は、さらに抗生物質を含んでいてもよい。抗生物質としては、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン（ゲンタマイシン硫酸塩など）、ペニシリン、アンホテリシンＢなどが挙げられる。抗生物質の濃度は、その合計濃度として、０．１ｍｇ／Ｌ以上であることが好ましく、０．５ｍｇ／Ｌ以上であることがより好ましく、１０．０ｍｇ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、１０００ｍｇ／Ｌ以下であることが一般的である。
　培地には、上述した成分以外に、必要により、公知の添加物を含むことができる。添加物としては、例えば、ポリアミン類（例えばプトレシン等）、還元剤（例えば２－メルカプトエタノール等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）等）等が挙げられる。
＜培養方法＞
　間葉系幹細胞の培養に用いられる培養器は、間葉系幹細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、およびローラーボトルが挙げられる。本発明において好ましくは、５層以上（例えば、５～１０層）の多層フラスコを用いて間葉系幹細胞を培養してもよい。５層以上の多層フラスコの一例としては、１０セルスタック（ポリスチレン製セルスタック-10 チャンバー、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を使用することができる。フラスコとしては、ベントキャップを設けたフラスコを使用することもできる。ベントキャップを設けたフラスコを使用し、ベントキャップからガスを強制的に通気しながら培養することによって、間葉系幹細胞の増殖率を著しく向上することができる。
　培養器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の任意の細胞支持用基質でコーティングされたものであり得る。細胞支持用基質は、間葉系幹細胞の接着を目的とする任意の物質であり得、ＥＣＭを用いたマトリゲル、あるいはコラーゲンやゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチン等が挙げられる。
　培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０～４０℃、好ましくは約３７℃であり得る。ＣＯ２濃度は、約１～１０％、好ましくは約２～５％であり得る。酸素濃度は、１～２０％、好ましくは１～１０％であり得る。
　間葉系幹細胞を未分化の状態で、そして良好なｉｎ　ｓｉｔｕ軟骨形成能を有する状態で増殖させるために、培養期間を調整することが好ましい。また、軟骨損傷部を覆い、そして患部を再生させるために十分な数の未分化な間葉系幹細胞を用意する必要性を考慮することが必要である。従って、間葉系幹細胞の培養期間は、５日間以上、７日間以上、１０日間以上であることが好ましく、１０～１００日間、１０～９０日間、１０～８０日間、１０～７０日間、１０～６０日間、１０～５０日間、１０～４０日間、１０～３０日間、１０～２８日間、１０～２１日間、または１０～１４日間であってもよい。間葉系幹細胞として滑膜由来間葉系幹細胞を使用する場合、滑膜由来間葉系幹細胞を未分化の状態で、そして良好なｉｎ　ｓｉｔｕ軟骨形成能を有する状態で増殖させるために、培養期間を調整することが好ましい。また、軟骨損傷部を覆い、そして患部を再生させるために十分な数の未分化な滑膜由来間葉系幹細胞を用意する必要性を考慮することが必要である。従って、滑膜由来間葉系幹細胞の培養期間は、５日間以上、７日間以上、１０日間以上であることが好ましく、１０～１００日間、１０～９０日間、１０～８０日間、１０～７０日間、１０～６０日間、１０～５０日間、１０～４０日間、１０～３０日間、１０～２８日間、１０～２１日間、または１０～１４日間であってもよい。
　間葉系幹細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの間葉系幹細胞の継代数と反比例して、ｉｎ　ｓｉｔｕ軟骨形成能が低下することも知られている。従って、未分化な間葉系幹細胞を調製するためには、１０継代以下であることが好ましく、５継代以下であることがより好ましく、初代あるいは第１継代での間葉系幹細胞を製造することがさらに好ましい。
　滑膜由来間葉系幹細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの滑膜由来間葉系幹細胞の継代数と反比例して、ｉｎ　ｓｉｔｕ軟骨形成能が低下することも知られている。従って、未分化の滑膜由来間葉系幹細胞を調製するためには、１０継代以下であることが好ましく、５継代以下であることがより好ましい。
＜２＞間葉系幹細胞の培養方法
　本発明は、
　間葉系幹細胞を含む組織の懸濁液を上層と下層の二層に分離させること、
　上記二層のうちの下層を採取すること、および
　アスコルビン酸－２－リン酸エステル三ナトリウム、アラニルグルタミンおよびピリドキシンを含む培地において上記下層に含まれる間葉系幹細胞を培養すること、
を含む、間葉系幹細胞の培養方法に関する。
　上記した本発明による間葉系幹細胞の培養方法における、間葉系幹細胞、培地、および培養方法の具体例、好ましい態様は、本明細書中に上記した通りである。
＜３＞　関節治療用細胞製剤
　本発明によれば、本発明による関節治療用細胞製剤により製造された関節治療用細胞製剤が提供される。本発明によればさらに、本発明による間葉系幹細胞の培養方法により培養された間葉系幹細胞を含む、関節治療用細胞製剤が提供される。
　本発明によれば、本発明の方法で得られる間葉系幹細胞を有効成分として含有する関節治療用細胞製剤を製造することができる。
　関節治療用細胞製剤は、細胞外基質またはスキャホールドを含まないことが好ましい。
　ここでいう細胞外基質またはスキャホールドとしては、コラーゲン、ヒアルロン酸、アルギン酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸を挙げることができる。
　関節治療用細胞製剤における有効成分として使用する間葉系幹細胞としては、核型異常を含まない細胞であることが好ましい。核型異常を含まない細胞としては、ヒト間葉系幹細胞である場合には、間葉系幹細胞の染色体数が４６本であり、染色体のカリオタイピングが、一対の１番から２２番染色体と、ＸＸ染色体またはＸＹ染色体とである細胞を挙げることができる。
　関節治療用細胞製剤における有効成分として使用する間葉系幹細胞としては、上記したような核型異常を含まない正常な細胞の比率が、好ましくは９０％より高く、より好ましくは９１％以上であり、より一層好ましくは９３％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、さらに一層好ましくは９８％以上であり、特に好ましくは９９％以上であり、最も好ましくは１００％である。
　関節治療としては、関節の損傷、損害または炎症を伴う疾患の治療を挙げることができ、軟骨等の結合組織の変性および／または炎症から起こる関節疾患、または非炎症性の関節疾患の治療を挙げることができる。関節治療としては、例えば、半月板損傷、外傷性軟骨損傷、離断性骨軟骨炎、無腐性骨壊死、変形性関節症、関節リウマチ（例えば、慢性関節リウマチ）、痛風、反応性関節炎、乾癖性関節炎、若年性関節炎、炎症性関節炎、関節軟骨欠損からなる群より選択される疾患の治療を挙げることができるが、これらの疾患に限定されるものではない。変形性関節症は、関節部位が膝である変形性膝関節症であってもよいし、関節部位が肘関節、指関節、股関節、肩関節、足関節、頚椎であってもよく、複数の関節部位の組み合わせでもよい。本発明の関節治療用細胞製剤は、半月板治療剤または変形性関節症治療剤であることが好ましい。
　関節治療用細胞製剤を製造する場合には、常法により、間葉系幹細胞を医薬的に許容される担体と混合するなどして、個体への投与に適した形態の製剤とすればよい。担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等）を加えて等張とした注射用蒸留水を挙げることができる。さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤等を配合してもよい。
［関節の治療方法］
　本発明はさらに、関節の治療方法に関する。より具体的には、本発明は、半月板損傷、外傷性軟骨損傷、離断性骨軟骨炎、無腐性骨壊死、変形性関節症（例えば、関節部位が膝である変形性膝関節症、関節部位が肘関節、指関節、股関節、肩関節、足関節、頚椎、複数の関節部位の組み合わせ）、関節リウマチ（例えば、慢性関節リウマチ）、痛風、反応性関節炎、乾癖性関節炎、若年性関節炎、炎症性関節炎、関節軟骨欠損からなる群より選択される疾患の治療方法に関する。
　本発明の関節の治療方法は、
　軟骨損傷部または半月板損傷部を間葉系幹細胞により覆うように、本発明の関節治療剤を移植する工程；および
　間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させることによって、軟骨損傷部または半月板損傷部でｉｎ　ｓｉｔｕで軟骨組織を再生させる工程；
を含む。
　本発明の関節治療剤を患者に移植する際、軟骨損傷部または半月板損傷部を効率的に治療するためには、軟骨損傷部または半月板損傷部あたり、１×１０６～１．０×１０１１個、２×１０６～１．０×１０１１個、５×１０６～１．０×１０１１個、１×１０７～１．０×１０１１個、２．０×１０７～１．０×１０１１個、２．５×１０７～１．０×１０１１個、３．０×１０７～１．０×１０１１個、４．０×１０７～１．０×１０１１個、１×１０６～１．０×１０１０個、２．５×１０７～１．０×１０１０個、１×１０６～１．０×１０９個、２．５×１０７～１．０×１０９個、１×１０６～１．０×１０８個、２．５×１０７～１．０×１０８個、または、２．０×１０７～１．０×１０８個の間葉系幹細胞、より好ましくは２．０×１０７～１．０×１０８個の間葉系幹細胞を適用することが好ましい。
　間葉系幹細胞を軟骨損傷部または半月板損傷部に移植することにより、軟骨損傷部または半月板損傷部は間葉系幹細胞で覆われる。間葉系幹細胞の移植は、観血的手術により、または関節鏡視下手術により行うことができる。侵襲を出来る限り小さくするために、関節鏡視下に間葉系幹細胞を移植することが好ましい。
　軟骨損傷部または半月板損傷部は、間葉系幹細胞の懸濁液で覆われても、間葉系幹細胞の細胞シートで覆われてもよい。間葉系幹細胞は、軟骨損傷部や半月板損傷部に接着する能力が高い。
　軟骨損傷の治療の場合、本発明の低侵襲性手技は、間葉系幹細胞により軟骨損傷部を覆うことを特徴としており、以下のステップ：
　軟骨損傷部を上方に向けるように体位を保持すること；
　間葉系幹細胞の細胞シート、間葉系幹細胞の懸濁液、または間葉系幹細胞を含むゲル状物質を軟骨損傷部の表面に静置すること；そして
　特定の時間体位を保持して、それにより間葉系幹細胞を軟骨損傷部の表面に接着させること；
を含む。
　半月板損傷の治療の場合、本発明の低侵襲性手技は、間葉系幹細胞により半月板損傷部を覆うことを特徴としており、以下のステップ：
　半月板損傷部が下向きになるように体位を保持すること；
　間葉系幹細胞の懸濁液を膝関節内に注射すること；そして
　特定の時間体位を保持して、間葉系幹細胞を半月板損傷部に接着させること；
を含む。
　軟骨損傷部あるいは半月板損傷部の表面に間葉系幹細胞を確実に接着させるために、移植した間葉系幹細胞を、軟骨損傷部あるいは半月板損傷部の表面に少なくとも１０分間、好ましくは１５分間、保持することが好ましい。これを実現するため、軟骨損傷部または半月板損傷部を上方に向けること、そして上方に向けた軟骨損傷部または半月板損傷部に間葉系幹細胞を保持することを目的として、体位を少なくとも１０分間、好ましくは１５分間保持する。
　間葉系幹細胞を伴う軟骨損傷部や半月板損傷部をさらに、間葉系幹細胞の軟骨損傷部または半月板損傷部への接着をより強固にするため、骨膜で覆うことができる。間葉系幹細胞を軟骨損傷部の表面や半月板損傷部の表面に少なくとも１０分間保持したのち手術は完了する。
　本発明において、移植した間葉系幹細胞は、軟骨損傷部や半月板損傷部で軟骨細胞に分化し、そして軟骨損傷部または半月板損傷部にてｉｎ　ｓｉｔｕで軟骨組織を再生する。
　間葉系幹細胞のｉｎ　ｓｉｔｕでの軟骨形成過程の間、局所微小環境（栄養供給およびサイトカイン環境など）に従って、軟骨組織が再生するため、外部からの操作は必要とされない。滑膜由来間葉系幹細胞のｉｎ　ｓｉｔｕ軟骨形成の結果、軟骨組織が軟骨損傷部または半月板損傷部にて再生されて、損傷を修復し、そして軟骨損傷の場合には骨領域、軟骨と骨との境界、軟骨中心部、表面領域、そしてもとの軟骨に隣接する領域がもとの軟骨組織として形成され、または半月板損傷の場合には半月板軟骨が形成される。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
［実験Ａ］
＜材料と方法＞
（１）細胞
　Ａｌｌｃｅｌｌｓ社より購入したヒト骨髄組織（Ｗｈｏｌｅ　Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ，　Ｆｒｅｓｈ，　１０ｍＬ、型番：ＡＬＬ－ＡＢＭ００１、ロット：Ｂ００９、Ｂ０１２）より単離した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を使用した。
（２）基礎培地
タイプ基礎培地：
　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社　ＭＥＭ　ａｌｐｈａ　ｎｏ　ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　（型番：１２５６１）
基礎培地Ａ：
　タイプ培地のアスコルビン酸、グルタミン、ピリドキサールをそれぞれ、アスコルビン酸－２－リン酸エステル三ナトリウム、アラニルグルタミン、ピリドキシンに置き換えた培地
　タイプ基礎培地および基礎培地Ａの培地組成を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
（３）間葉系幹細胞の培養
　間葉系幹細胞の培養には、（２）に記載のそれぞれの基礎培地に抗生物質としてゲンタマイシン硫酸塩（「高田製薬ゲンタシン注６０」）を２０μｇ／ｍＬ、および、牛胎児血清（ＳＡＦＣ社　型番：１２００７Ｃもしくは、Ｓｅｌｂｏｒｎｅ社　型番：ＦＢＳ－０４）を最終濃度１５％（ｖ／ｖ）になるように添加し、使用した。以下、それぞれをタイプ培地、培地Ａと称する。また、増殖能を向上させるために、上記タイプ培地にｂＦＧＦ（フィブラストスプレー２５０（科研製薬）を注射用水に溶解し、１０μｇ／ｍＬに調製したもの）を終濃度が１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、使用した。以下、タイプ培地＋ｂＦＧＦと称する。なお、ｂＦＧＦは、塩基性線維芽細胞成長因子（basic fibroblast growth factor)の略である。
　間葉系幹細胞の単離は、購入したヒト骨髄組織（ロット：Ｂ００９、Ｂ０１２）の組織懸濁液を１，０００ｒｐｍで１０分間遠心を行い、二層に分離する。そのうち下層を採取し使用する。この下層、血漿を除去したものに、タイプ培地、培地Ａ、もしくはタイプ培地＋ｂＦＧＦを血漿除去する前の１０倍量になるように加え、０．２０ｍＬ／ｃｍ２になるようにフラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下のインキュベータ内で培養を行った。３日または４日間ごとに培地交換を行い、播種から１２日～１３日間培養を行ったのち、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（以下、トリプシン、ライフテクノロジーズ　型番：２５３００）で剥離を行った。剥離後、等量の培地でトリプシンの中和を行い、別に用意したチューブに移した。培養フラスコをさらに等量の培地で洗いこみを行い、上記チューブに加え、残った細胞を回収した。チューブは２００×ｇで５分間遠心を行い、その上清を除去した。残ったペレットに適切な量の培地を加え、血球計算板を用いて、細胞カウントを行った。最終濃度が０．２０～０．５０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるようにフラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下のインキュベータ内で培養をした。３日もしくは４日間培養し、フラスコ底面の６０％以上を細胞が満たしたときに、上記と同様の操作で継代を繰り返した。Ｂ００９の場合は、９継代目終了時、Ｂ０１２の場合は４継代目終了時の細胞を遠心し、終濃度が１０％（ｖ／ｖ）　ジメチルスルホキシド（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ　型番：Ｄ２６５０）となるように、タイプ培地に混ぜた凍結液で　１００×１０４　ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるように調整し、核型解析評価用の細胞ストックを作製した。
（４）核型解析
　作製したそれぞれの細胞ストックは３７℃ウォーターバスにて解凍し、２００×ｇで５分間遠心し、凍結液を除去し、それぞれの培地を加え、０．３５～０．５０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるようにフラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下のインキュベータ内で培養を３日もしくは４日間行った。フラスコ底面の６０％以上を細胞が満たしたときに、トリプシンで剥離し、上記した方法で、回収した細胞を各培地に置き換え、０．２５～０．５０×１０４　ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるようにフラスコに播種し、３７℃、５％　ＣＯ２雰囲気下のインキュベータ内で培養を３日もしくは４日間行った。
　各培養フラスコに培地量の１/１００倍量のデメコルシン溶液（富士フイルム和光純薬社　型番０４５－１８７６１）を加え、３～４時間、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下のインキュベータ内に静置した。反応終了後、それぞれの細胞をトリプシンで剥離した。その後、Ｔｒａｎｓ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃｓ社の推奨方法にてカルノア固定を行い、Ｑ－ｂａｎｄ解析を依頼した。
＜結果＞
（１）タイプ培地または培地Ａによる、ＭＳＣの培養および核型解析の比較
　ロット：Ｂ００９のタイプ培地、および培地Ａで９継代したＭＳＣの凍結ストック（Ｐ１０）を解凍し、それぞれの培地で２継代培養を行い、Ｐ１２（１１継代したもの）の細胞の核型解析を行った。
　増殖能を比較した結果、培地Ａで培養したＭＳＣの増殖能はタイプ培地に比べ、有意に高いことを見出した。図１に集団倍加値で表した増殖曲線の比較を示す。集団倍加値（ＰＤＬ）は、細胞の分裂回数を示し、以下の計算式から算出する。継代ごとにＰＤＬを算出し、累積していくことで、増殖曲線を作成した。
ＰＤＬの計算式：　（Ｌｏｇ（回収細胞数）―Ｌｏｇ（播種細胞数））/Ｌｏｇ２
　また、核型解析を行ったところ、タイプ培地で培養したＭＳＣには核型異常が見られたが、培地Ａで培養したＭＳＣには異常は見つからなかった。表２および図２にその結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（２）タイプ培地＋ｂＦＧＦまたは培地Ａによる、ＭＳＣの培養および核型解析の比較
　ロット：Ｂ０１２のタイプ培地＋ｂＦＧＦ、および培地Ａで４継代したＭＳＣの凍結ストック（Ｐ５）を解凍し、それぞれの培地で２継代培養を行い、Ｐ７（６継代したもの）の細胞の核型解析を行った。
　増殖能を比較した結果、タイプ培地にｂＦＧＦを加えることにより、培地Ａと同等程度の増殖を示すことができた。そこで、タイプ培地＋ｂＦＧＦ、培地Ａの核型解析を行ったところ、培地Ａで培養したＭＳＣでは、核型異常は見つからなかったが、タイプ培地＋ｂＦＧＦで培養したＭＳＣでは、核型異常が見られた。表３および図３にその結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　上記の結果から、培地Ａを用いた培養法により、単独で非常に顕著な増殖向上と核型正常を両立できることが判明した。
［実験Ｂ］
（材料と方法）
（１）細胞
　実験にはヒト骨髄間葉系幹細胞、またはブタ滑膜間葉系幹細胞を用いた。
　ヒト骨髄間葉系幹細胞は、［実験Ａ］に記載の方法で取得、培養した。
　ブタ滑膜間葉系幹細胞は、ミニブタ（富士マイクラ社）の膝から採取した滑膜組織をハサミで細断し、リベラ―ゼ溶液５．０ｍＬに浸漬させた。尚、リベラ―ゼ溶液はリベラーゼＭＮＰ－Ｓ（ロシュ製）５．０ｍｇを、最終濃度２０％牛胎児血清（ニチレイバイオサイエンス社　型番：１７４０１２）を含む注射用水５．０ｍＬに溶解したものを用いた。酵素反応は３７℃で３時間反応させた。その後、組織消化液をセルストレーナーを通して二層に分離し、下層を、５０ｍＬ遠沈管に移して４００ｇで５分間遠心した。上清を除き、得られた細胞濃厚懸濁液を培地に懸濁した。
（２）基礎培地
　実施例として、［実験Ａ］に記載の培地（培地Ａ）を使用した。
　比較用として、αＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ社　型番：１２５６１－０５６）（タイプ培地）を使用した。
（３）培養容器
　培養容器はＴフラスコ（ＴＰＰ社　細胞培養フラスコ１５０ｃｍ２フィルターキャップ　型番：９０１５１）または、１０セルスタック（Ｃｏｒｎｉｎｇ社　セルスタック１０チャンバー　細胞培養表面処理　型番：３２７０）を使用した。
（４）滑膜間葉系幹細胞の培養
　滑膜間葉系幹細胞の培養には、（２）に記載のそれぞれの基礎培地に抗生物質としてＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Thermo社　型番：１５２４０-０６２）を１％（ｖ／ｖ）、および、ヒト骨髄間葉系幹細胞の培養においては自己血清を、ブタ滑膜間葉系幹細胞の培養においては牛胎児血清（ニチレイバイオサイエンス社　型番：１７４０１２）を、それぞれ最終濃度１０～２０％（ｖ／ｖ）になるように添加し、使用した。
　培養容器への播種後の細胞播種密度と培地量が所定の条件になるように、細胞を所定濃度で上記の培地に懸濁した細胞懸濁液を準備し、（３）に記載の培養容器に所定量を播種した。ここで播種密度とは培養面の単位面積当たりに播種する細胞数、培地量とは培養面の単位面積あたりの培地体積をいう。播種後の培養容器を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下のインキュベータ内に静置し、培養を行った。播種から所定の期間培養を行ったのち、培養容器から剥離回収し、細胞数を計測した。培養後の回収細胞数を播種細胞数で割ることで細胞の増殖率を算出した。
（結果）
（試験１）培地の違いによる増殖率の比較
　ブタ滑膜間葉系幹細胞を２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ（ウシ胎児血清）を添加したタイプ培地で培養した。細胞播種密度は１０００、１５００個/ｃｍ２とし、培地量は０．１２ｍＬ／ｃｍ２、培養容器はＴフラスコを使用した。播種後１２日目に細胞を回収してそれぞれ増殖率を算出した。播種密度１０００個/ｃｍ２の条件の増殖率を１とした時の相対増殖率を表２に示す。
　上記したＦＢＳを添加したタイプ培地の場合と同条件で、培地のみ培地Ａに変更して培養し、播種後１２日目の細胞を回収し、増殖率を算出した。ＦＢＳを添加したタイプ培地を使用した場合の播種密度１０００個/ｃｍ２の条件の増殖率を１とした時の相対増殖率を表４に示す。
　ブタ滑膜間葉系幹細胞の培養では、細胞播種密度１０００～１５００個/ｃｍ２の範囲においては、培地Ａはタイプ培地に対して高い増殖率を示すことがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（試験２）培地量の違いによる増殖率の比較１
　ヒト骨髄間葉系幹細胞をタイプ培地および培地Ａを使用して培養した。
　比較テスト１では、タイプ培地に２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加した培地を使用し、培地量を０．１２ｍＬ／ｃｍ２とした。
　比較テスト２では、タイプ培地に２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加した培地を使用し、培地量を０．２４ｍＬ／ｃｍ２とした。
　テスト３では、培地Ａに２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加した培地を使用し、培地量を０．１２ｍＬ／ｃｍ２とした。
　テスト４では、培地Ａに２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加した培地を使用し、培地量を０．２４ｍＬ／ｃｍ２とした。
　比較テスト１および２並びにテスト３および４の条件で播種後１２日目に細胞を回収して増殖率を算出した。比較テスト１の増殖率を１とした時の相対増殖率を表５に示す。
　タイプ培地でも、培地Ａでも、培養培地量を増加することによって、増殖率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
（試験３）培地量の違いによる増殖率の比較２
　ブタ滑膜間葉系幹細胞をタイプ培地および培地Ａを使用して培養した。
　比較テスト１１では、タイプ培地に２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加した培地を使用し、培地量を０．１２ｍＬ／ｃｍ２とした。
　比較テスト１２では、タイプ培地に２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加した培地を使用し、培地量を０．２０ｍＬ／ｃｍ２とした。
　テスト１３では、培地Ａに２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加した培地を使用し、培地量を０．１２ｍＬ／ｃｍ２とした。
　テスト１４では、培地Ａに２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加した培地を使用し、培地量を０．２０ｍＬ／ｃｍ２とした。
　比較テスト１１および１２並びにテスト１３および１４の条件で播種後１２日目に細胞を回収して増殖率を算出した。比較テスト１の増殖率を１とした時の相対増殖率を表６に示す。
　タイプ培地でも、培地Ａでも、培養培地量を増加することによって、増殖率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（試験４）血清使用量を増やさずに増殖率を評価
　ブタ滑膜間葉系幹細胞を、基礎培地にタイプ培地および培地Ａを使用して培養した。
　テスト２１では、タイプ培地に２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加した培地を使用し、培地量を０．１２ｍＬ／ｃｍ２とした。
　比較テスト２２では、培地Ａに２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加した培地を使用し、培地量を０．１２ｍＬ／ｃｍ２とした。
　テスト２３では、培養に使用するＦＢＳの総量がテスト２１と同量になるように、培地Ａに１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加した培地を使用し、培地量を０．２４ｍＬ／ｃｍ２とした。
　テスト２１、比較テスト２２、およびテスト２３の条件で播種後１２日目に細胞を回収して増殖率を算出した。テスト２１の増殖率を１とした時の相対増殖率を表７に示す。
　一般的には、血清濃度を下げると増殖率が下がることが知られている。それは、血清濃度が細胞増殖率に最も寄与すると考えられているからである。一方、培地Ａでは、使用する血清量が同じでも、基礎培地量を増やして血清濃度を低下させることで、予想外に増殖率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（試験５）血清濃度による増殖率への影響
　ヒト骨髄間葉系幹細胞をタイプ培地および培地Ａを使用して培養した。
　比較テスト３１では、２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加したタイプ培地を使用し、培地量を０．１２ｍＬ／ｃｍ２とした。
　比較テスト３２では、培養に使用するＦＢＳの総量がテスト３１と同量になるように、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加したタイプ培地を使用し、培地量を０．２４ｍＬ／ｃｍ２とした。
　テスト３３では、培養に使用するＦＢＳの総量がテスト３１と同量になるように、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加した培地Ａを使用し、培地量を０．２４ｍＬ／ｃｍ２とした。
　比較テスト３１および３２、並びにテスト３３の条件で１２日間培養した後の増殖率を評価し、テスト３１の増殖率を１とした時の相対増殖率を表８に示す。
　タイプ培地では、使用する血清量が同じでも、血清濃度が低下すると増殖率が低下するが、基礎培地に培地Ａを使用すると、基礎培地量を増やして血清濃度を低下させることで、タイプ培地に対して予想外に増殖率が向上することがわかった。タイプ培地で確認された血清濃度を下げると増殖率が低下することが、一般的な現象として理解されている事象である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
（試験６）培養容器の違いによる増殖率への影響
　ブタ滑膜間葉系幹細胞をＴフラスコ、および１０セルスタック（ポリスチレン製セルスタック-10 チャンバー、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いて培養した。培地はタイプ培地、および培地Ａにそれぞれ２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加したものを使用し、培地量は０．１２ｍＬ／ｃｍ２とした。
　比較テスト４１－１、４１－２では、タイプ培地を使用し、Ｔフラスコと１０セルスタックをそれぞれ使用して培養した。それぞれの培養容器で１２日間培養した後の増殖率を評価し、Ｔフラスコの増殖率を１とした時の１０セルスタックの相対増殖率を表７に示す。
　テスト４２－１、４２－２では、タイプ培地を使用し、Ｔフラスコと１０セルスタックをそれぞれ使用して培養した。
　それぞれの培養容器で１２日間培養した後の増殖率を評価し、Ｔフラスコの増殖性を１とした時の１０セルスタックの相対増殖率を表９に示す。
　培養容器をＴフラスコから１０セルスタックに変更すると、タイプ培地では増殖率が低下するのに対して、培地Ａでは増殖率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
（試験７）培養容器のキャップの形態及び強制通気の有無による増殖率への影響
　ブタ滑膜間葉系幹細胞を１０セルスタックで培養した。培地はタイプ培地、および培地Ａにそれぞれ２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加したものを使用し、培地量は０．１２ｍＬ／ｃｍ２とした。それぞれの培地で、１０セルスタックのキャップ２個を、標準フィルターキャップと、標準フィルターキャップからベントキャップ（Ｃｏｒｎｉｎｇ　セルスタック用トランスファーキャップ　型番；３２８１）に変更したものとで比較した。また、培地Ａにおいてはベントキャップに変更し、さらに片側のベントキャップからガスを強制的に通気したものを比較した。強制通気に使用したガスは、５％ＣＯ２を含む空気で、１０セルスタックに導入前にインキュベータ環境と同等に加湿（相対湿度１００％）し、３７℃に温調したものを使用した。
　それぞれの培養条件で１２日間培養して細胞を回収し、増殖率を算出した。タイプ培地で同量の培地量を用いてＴフラスコで培養した細胞の増殖結果を１とした時の、相対増殖率を表１０に示す。なお、表内の相対増殖率結果で培養継続不可と記載したものは、培養の過程で細胞が増殖しないことを確認したために、１２日間の培養に至らなかったものである。
　１０セルスタックのキャップを標準フィルターキャップからベントキャップに変更してタイプ培地で培養すると、著しく増殖が低下して、所定期間の培養の継続が不可であった。一方、培地Ａを使用すると、標準フィルターキャップからベントキャップに変更しても増殖率の低下はタイプ培地よりも抑制でき、培養の継続が可能であった。さらにベントキャップに変更して強制的にガスを通気すると、増殖率が著しく向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
（試験７）ラット滑膜由来幹細胞の樹立と半月板再生効果
　本試験は、ラット滑膜由来間葉幹細胞のラット体内での半月板再生能を示すものである。
　滑膜由来間葉幹細胞の樹立に、６週齢のＬｅｗｉｓラットを用いた。イソフルラン麻酔下にて採取した滑膜組織は、濃度２０％となるようにＦｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（Ｇｉｂｃｏ　Ｃａｔ．＃１０２７０）また濃度１％となるようにＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃａｔ．＃１５２４００６２）を加えた基礎培地Ａに対して３．０ｍｇ／ｍＬとなるようにＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　Ｖ（Ｓｉｇｍａ　Ｃａｔ．＃Ｃ９２６３）を添加し、３７℃にて２時間反応させた。冷却した培地を添加して反応を止め、４０μｍのセルストレーナーに通し、残渣組織を除去した。回収した細胞を７５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃ．，型番：３５３１３６）に播種し、ＣＯ２濃度５％、３７℃で６日間培養した。６日間培養後、フラスコ内の培地を破棄しＰＢＳ（リン酸緩生理食塩水）で２回洗浄したのち、５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃａｔ．＃１２６０４１３）を添加し、３７℃のインキュベーターで５分間静置、細胞を間葉幹細胞として回収し生死細胞オートアナライザーＶｉ－ＣＥＬＬ（ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ，型番：７３１０５０）にて細胞数を算出した。遠心により上清を破棄、ＣＯＳ－ｂａｎｋｅｒ（コスモ・バイオ株式会社　Ｃａｔ．＃　ＣＯＳ－ＣＦＭ０１）に置換し、細胞の凍結のストックを作製した。
　半月板再生効果を評価するための半月板損傷モデルの作製に１０週齢のＬｅｗｉｓラットを用いた。半月板損傷および間葉幹細胞を移植する方法は、イソフルラン麻酔下にて膝関節部皮膚を切開し、膝関節を露出させた。膝蓋下の内側関節包を露出させ、縦方向にメスで切開し大腿骨遠位部の軟骨を露出させた。内側半月板を滑膜より剥離し、内側半月板を露出させ、全体の約２／３を切除した。膝蓋腱と滑膜を縫合し、その後筋肉を縫合した。半月板損傷処置の後、ラット滑膜由来間葉幹細胞（ｒＳＭＳＣ）群および対照としてＰＢＳ群の２群に分けた。ｒＳＭＳＣ群では投与する間葉幹細胞は滑膜より樹立・凍結した細胞を２０％Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（Ｇｉｂｃｏ　Ｃａｔ．＃１０２７０）、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×）（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃａｔ．＃　１５２４００６２）を含んだ基礎培地Ａを用いて起眠、８日間培養し、回収した細胞数５×１０６ｃｅｌｌｓを注射針を用いて、縫合部位から膝関節と垂直方向に針を穿刺し、膝関節内に移植し皮膚を縫合した。術後、すべてのラットをケージに戻し、運動、および飲食を自由にさせた。
　動物は処置３週後に剖検を行った。動物はイソフルラン麻酔下で下大動脈切断により放血を行い、安楽死させた。その後、膝関節を外して半月板を露出させ、内側半月板を摘出し、写真撮影した。摘出した両膝関節内側半月板の画像を図４に示す。残存する半月板との色調および形状の違いから再生部分を画像から特定し、点線で囲った。ＰＢＳ群では半月板が中節部までの形状を有する者が半数を占めていたが、ｒＳＭＳＣ群では前節部まで半月板が再生している例が多数見られることから、ｒＳＭＳＣ移植による半月板再生効果が見て取れる。
　ｒＳＭＳＣ群およびＰＢＳ群で半月板再生効果を定量比較するために、半月板再生部分（点線内）の面積をＩｍａｇｅ　Ｊ（ｖｅｒｓｉｏｎ　１．５２）にて計測した。半月板再生部分を半月板の色調および形状から目視判断し、式１を用いて面積を算出した。
式１：
半月板再生部分面積（ｍｍ２）＝半月板再生部分エリアのピクセル数／１ｍｍ２当たりのピクセル数
　各群の再生部分面積の平均値、標準偏差および統計学的解析はすべてＭｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ　２００７（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｃｏｒｐ．）にて行った。統計学的解析はｒＳＭＳＣ群およびＰＢＳ群間にてＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　Ｔ－Ｔｅｓｔを実施し、有意水準５％未満（Ｐ＜０．０５）を差分ありとした。
　ｒＳＭＳＣ群およびＰＢＳ群の半月板再生部面積の値を表１１に示す。ＰＢＳ群の半月板再生部分面積は１．１ｍｍ２に対して、ｒＳＭＳＣ群では２．０ｍｍ２とおよそ２倍の再生面積を有しており、統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014

Claims (23)

  1. アスコルビン酸誘導体、アラニルグルタミンおよびピリドキシンを含む培地において間葉系幹細胞を培養することを含む、関節治療用細胞製剤の製造方法。
  2. 前記間葉系幹細胞が、滑膜由来間葉系幹細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記間葉系幹細胞が、自家由来である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記培地が、同種血清を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記培地が、アスコルビン酸を含まない、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記培地が、ビオチンまたはリポ酸のいずれか一以上を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ５層以上の多層フラスコを用いて間葉系幹細胞を培養する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 間葉系幹細胞を含む組織の懸濁液を上層と下層の二層に分離させること、および前記二層のうちの下層を採取することをさらに含み、
    アスコルビン酸誘導体、アラニルグルタミンおよびピリドキシンを含む培地において前記下層に含まれる間葉系幹細胞を培養する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 請求項１から８のいずれか一項に記載の方法により製造された、関節治療用細胞製剤。
  10. 細胞外基質またはスキャホールドを含まない、請求項９に記載の関節治療用細胞製剤。
  11. 半月板治療剤または変形性関節症治療剤である、請求項９または１０に記載の関節治療用細胞製剤。
  12. 間葉系幹細胞がヒト間葉系幹細胞であり、間葉系幹細胞の染色体数が４６本であり、染色体のカリオタイピングが、一対の１番から２２番染色体と、ＸＸ染色体またはＸＹ染色体とである、請求項９から１１の何れか一項に記載の関節治療用細胞製剤。
  13. 間葉系幹細胞を含む組織の懸濁液を上層と下層の二層に分離させること、
    前記二層のうちの下層を採取すること、および
    アスコルビン酸誘導体、アラニルグルタミンおよびピリドキシンを含む培地において前記下層に含まれる間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞の培養方法。
  14. 前記間葉系幹細胞が、滑膜由来間葉系幹細胞である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記間葉系幹細胞が、自家由来である、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 前記培地が、同種血清を含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記培地が、アスコルビン酸を含まない、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記培地が、ビオチンまたはリポ酸のいずれか一以上を含む、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. ５層以上の多層フラスコを用いて間葉系幹細胞を培養する、請求項１３から１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 請求項１３から１９のいずれか一項に記載の方法により培養された間葉系幹細胞を含む、関節治療用細胞製剤。
  21. 細胞外基質またはスキャホールドを含まない、請求項２０に記載の関節治療用細胞製剤。
  22. 半月板治療剤または変形性関節症治療剤である、請求項２０または２１に記載の関節治療用細胞製剤。
  23. 間葉系幹細胞がヒト間葉系幹細胞であり、間葉系幹細胞の染色体数が４６本であり、染色体のカリオタイピングが、一対の１番から２２番染色体と、ＸＸ染色体またはＸＹ染色体とである、請求項２０から２２の何れか一項に記載の関節治療用細胞製剤。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4177340A4 (en) * 2020-07-03 2024-01-03 FUJIFILM Corporation METHOD FOR PRODUCING MESENCHYMAL STEM CELLS DERIVED FROM SYNOVIAL MEMBRANE AND METHOD FOR PRODUCING CELL PREPARATION FOR JOINT TREATMENT AGENT

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014525262A (ja) * 2011-08-31 2014-09-29 セウォン セロンテック カンパニー リミテッド 間葉系幹細胞の基本培養培地の調製方法、間葉系幹細胞の基本培養培地及びこれを利用して培養分化した細胞治療剤
JP5656183B2 (ja) 2006-08-22 2015-01-21 国立大学法人 東京医科歯科大学 滑膜由来間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）の軟骨・半月板再生への応用
WO2018131673A1 (ja) * 2017-01-13 2018-07-19 公立大学法人首都大学東京 新規組織再生材料およびその製造方法
WO2018164228A1 (ja) * 2017-03-08 2018-09-13 ロート製薬株式会社 Ｒｏｒ１陽性の間葉系幹細胞を含有する、線維症を伴う疾患の予防又は処置のための医薬組成物、及びその調製方法、並びにｒｏｒ１陽性の間葉系幹細胞を用いる線維症を伴う疾患の予防又は処置方法
JP2019506888A (ja) * 2016-03-01 2019-03-14 オックスフォード ユニヴァーシティ イノヴェーション リミテッド カーゴを搭載した足場の相間移動
WO2019208688A1 (ja) * 2018-04-25 2019-10-31 北海道公立大学法人札幌医科大学 生体移植用細胞シート及びその製造方法
JP2020011915A (ja) * 2018-07-17 2020-01-23 株式会社 バイオミメティクスシンパシーズ エイコサノイド産生促進剤

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5928961B2 (ja) 1977-04-22 1984-07-17 松下電器産業株式会社 厚膜バリスタ
JP4385076B2 (ja) * 2006-01-13 2009-12-16 独立行政法人科学技術振興機構 動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤、キット及びこれらの利用
US10507266B2 (en) * 2013-08-01 2019-12-17 Two Cells Co., Ltd. Cartilage-damage treatment agent and method for producing same

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5656183B2 (ja) 2006-08-22 2015-01-21 国立大学法人 東京医科歯科大学 滑膜由来間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）の軟骨・半月板再生への応用
JP5928961B2 (ja) 2006-08-22 2016-06-01 国立大学法人 東京医科歯科大学 滑膜由来間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）の軟骨・半月板再生への応用
JP2014525262A (ja) * 2011-08-31 2014-09-29 セウォン セロンテック カンパニー リミテッド 間葉系幹細胞の基本培養培地の調製方法、間葉系幹細胞の基本培養培地及びこれを利用して培養分化した細胞治療剤
JP2019506888A (ja) * 2016-03-01 2019-03-14 オックスフォード ユニヴァーシティ イノヴェーション リミテッド カーゴを搭載した足場の相間移動
WO2018131673A1 (ja) * 2017-01-13 2018-07-19 公立大学法人首都大学東京 新規組織再生材料およびその製造方法
WO2018164228A1 (ja) * 2017-03-08 2018-09-13 ロート製薬株式会社 Ｒｏｒ１陽性の間葉系幹細胞を含有する、線維症を伴う疾患の予防又は処置のための医薬組成物、及びその調製方法、並びにｒｏｒ１陽性の間葉系幹細胞を用いる線維症を伴う疾患の予防又は処置方法
WO2019208688A1 (ja) * 2018-04-25 2019-10-31 北海道公立大学法人札幌医科大学 生体移植用細胞シート及びその製造方法
JP2020011915A (ja) * 2018-07-17 2020-01-23 株式会社 バイオミメティクスシンパシーズ エイコサノイド産生促進剤

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHOI, K.M. ; SEO, Y.K. ; YOON, H.H. ; SONG, K.Y. ; KWON, S.Y. ; LEE, H.S. ; PARK, J.K.: "Effect of ascorbic acid on bone marrow-derived mesenchymal stem cell proliferation and differentiation", JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, vol. 105, no. 6, 1 June 2008 (2008-06-01), NL , pages 586 - 594, XP022939139, ISSN: 1389-1723, DOI: 10.1263/jbb.105.586 *
CLINICAL CHEMISTRY, vol. 43, no. 8, 1997, pages 1421 - 1428
HAYASHI JOICHIRO, YOSHIDA SHINYA, OCHIAI YUKIHIKO, YASUI AYAKO, SHINYA HISAYASU, ISHII MAKIKO, ONISHI HIDETOMO, SAKURAI HIROSHI, S: "Isolation of Mesenchymal Stem Cell from Gnathic Bone Marrow by a Closed System Device Using Nonwoven Fabric Filter", JOURNAL OF MEIKAI DENTAL MEDICINE, vol. 44, no. 1, 1 January 2015 (2015-01-01), pages 17 - 26, XP055920218 *
NA LI ET AL., STEM CELL RESEARCH & THERAPY, vol. 11, 2020, pages 381
SAKAGUCHI ET AL., ARTHRITIS RHEUM, vol. 52, 2005, pages 2521 - 9
See also references of EP4227405A4

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4177340A4 (en) * 2020-07-03 2024-01-03 FUJIFILM Corporation METHOD FOR PRODUCING MESENCHYMAL STEM CELLS DERIVED FROM SYNOVIAL MEMBRANE AND METHOD FOR PRODUCING CELL PREPARATION FOR JOINT TREATMENT AGENT

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