WO2022054857A1 - アストロサイト様細胞の製造方法 - Google Patents

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WO2022054857A1
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astrocyte
pluripotent stem
sox9
factor
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充 石川
栄之 岡野
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Jsr株式会社
学校法人慶應義塾
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing astrocyte-like cells. More specifically, the present invention relates to a method for producing astrocyte-like cells, a co-culture of astrocyte-like cells, astrocyte-like cells and nerve-like cells, and the use of a medium for producing astrocyte-like cells.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2020-152180 filed in Japan on September 10, 2020, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • brain organoids prepared from pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem cells (iPS) cells are mainly composed of neural cells and neural stem cells, and are sufficiently mature glia cells (astrocytes, oligodendrocytes). , Microglia, etc.) It is known that it does not contain.
  • iPS induced pluripotent stem cells
  • Glial cells are responsible for the survival and function expression of nerve cells such as nutritional supply to nerve cells, and it has become clear that the role of glial cells as well as nerve cells is important for the function expression of the brain. ing. Therefore, there is a demand for a technique for producing glial cells in vitro.
  • Non-Patent Document 1 describes that human pluripotent stem cells were overexpressed with the SRY-Box Transcription Factor 9 (SOX9) gene and the nucleus factor IB (NFIB) gene to induce differentiation of astrocyte-like cells. Has been done.
  • SOX9 SRY-Box Transcription Factor 9
  • NFIB nucleus factor IB
  • Non-Patent Document 2 describes that human pluripotent stem cells were overexpressed with the natural factor IA (NFIA) gene, or the SOX9 gene and the NFIA gene to induce differentiation of astrocyte-like cells. There is.
  • NFIA natural factor IA
  • An object of the present invention is to provide a technique for efficiently producing astrocyte-like cells in vitro.
  • a method for producing an astrosite-like cell which comprises a step (B) of culturing the human pluripotent stem cell whose factor is upwardly controlled, and as a result, the human pluripotent stem cell differentiates into an astrosite-like cell.
  • step (B) The method for producing astrosite-like cells according to [1], wherein in the step (B), the human pluripotent stem cells are cultured in a pluripotent stem cell culture medium or a nerve cell culture medium.
  • step (A) The astrocyte-like cell according to [1] or [2], wherein the step (A) is carried out by introducing a vector containing a nucleic acid encoding the transcription factor into the human pluripotent stem cell. Manufacturing method.
  • step (A) a tetracycline antibiotic is added or removed from the medium of the human pluripotent stem cell into which a vector containing a nucleic acid encoding the transcription factor has been introduced under the control of the tetracycline response factor.
  • [6] The method for producing an astrocyte-like cell according to any one of [3] to [5], wherein the vector is a transposon vector. [7] Any of [1] to [6], wherein in the step (B), the abundance of SOX9, NFIA and NFIB in the human pluripotent stem cells is 1: 1: 1 in terms of molar ratio.
  • the method for producing astrocyte-like cells according to. [8] The method for producing an astrocyte-like cell according to any one of [1] to [7], wherein the human pluripotent stem cell is a human induced pluripotent stem cell. [9] Astrocyte-like cells produced by the production method according to any one of [1] to [8].
  • [10] A co-culture of astrocyte-like cells and nerve-like cells according to [9].
  • a method for producing astrosites which comprises a step (B) of culturing the human pluripotent stem cells whose factors are upwardly controlled, and as a result, the human pluripotent stem cells differentiate into astrosites.
  • [P2] The method for producing astrosite according to [P1], wherein in the step (B), the human pluripotent stem cells are cultured in a medium for culturing pluripotent stem cells or a medium for culturing nerve cells.
  • [P3] The method according to [P1] or [P2], wherein the step (A) is carried out by introducing a vector containing a nucleic acid consisting of a base sequence encoding the transcription factor into the human pluripotent stem cells. How to make astrocytes.
  • a tetracycline antibiotic was added to the medium of the human pluripotent stem cell into which a vector containing a nucleic acid having a base sequence encoding the transcription factor was introduced under the control of the tetracycline response factor.
  • [P8] The method for producing astrocytes according to any one of [P1] to [P7], wherein the human pluripotent stem cell is a human induced pluripotent stem cell.
  • [P10] A co-culture of astrocytes and nerve cells according to [P9].
  • [P11] A human pluripotent stem cell for astrocyte production into which a nucleic acid consisting of a base sequence encoding a transcription factor including SOX9, NFIA and NFIB has been introduced.
  • [P12] The human pluripotent stem cell for astrocyte production according to [P11], wherein a nucleic acid consisting of a base sequence encoding the transcription factor is introduced under the control of a tetracycline response factor.
  • astrocyte-like cells can be efficiently produced in vitro.
  • the present invention comprises a step (A) of upregulating a transcription factor containing SOX9, NFIA and NFIB in a human pluripotent stem cell, and the human pluripotent stem cell in which the transcription factor is upregulated.
  • a method for producing astrosite-like cells which comprises the step (B) of differentiating the human pluripotent stem cells into astrosite-like cells.
  • astrocyte-like cells mean cells functionally and morphologically equivalent to astrocytes in a living body, and can also be referred to as astrocytes. Astrocyte-like cells express the astrocyte markers described below.
  • astrocyte-like cells can be efficiently produced in a short period of time. For example, 5 days after the start of upregulation of transcription factors, cells showing astrocyte-characteristic morphology can be obtained by microscopic observation.
  • the high efficiency of differentiation into astrocytes means that the expression level of the astrocyte marker is higher than that of the control.
  • the astrocyte marker include Glial Fiberly Acidic Protein (GFAP), S100 Calcium Binding Protein B (S100 ⁇ ) and the like.
  • cells that do not upwardly control any of SOX9, NFIA, and NFIB can be mentioned.
  • cells in which only one of SOX9, NFIA, and NFIB is upwardly controlled cells in which only SOX9 and NFIA are upwardly controlled, cells in which only SOX9 and NFIB are upwardly controlled, and only NFIA and NFIB are upwardly controlled.
  • Controlled cells and the like can be mentioned.
  • the astrocytes obtained by the method of the present embodiment in which SOX9, NFIA and NFIB are upwardly controlled as compared with the case where only SOX9 and NFIB are upwardly controlled are the expression levels of astrocytes. Is about 4 to 7 times higher.
  • step (A) transcription factors including SOX9, NFIA and NFIB in human pluripotent stem cells are upregulated.
  • upward control means increasing the abundance in the cell.
  • Upregulating SOX9, NFIA and NFIB may mean, for example, introducing SOX9, NFIA and NFIB into cells in the form of proteins.
  • SOX9, NFIA and NFIB may be introduced intracellularly in the form of mRNA.
  • the expression vectors of the SOX9 gene, the NFIA gene and the NFIB gene may be introduced into the cell.
  • SOX9, NFIA and NFIB may be upwardly controlled by preparing cells into which an expression vector capable of controlling the expression of the SOX9 gene, the NFIA gene and the NFIB gene has been introduced and inducing the expression thereof.
  • the protein, mRNA, and expression vector can be introduced by a method usually used as needed, and examples thereof include electroporation, lipofection, and microinjection.
  • the expression vector may be a plasmid vector, a transposon vector, a viral vector, or a combination thereof.
  • the transposon vector may be one that can be completely removed from the cells if necessary.
  • Examples of such a transposon vector include PiggyBac vector and the like.
  • virus vector examples include a retro virus vector, a lentivirus vector, an adeno-associated virus vector, an adenovirus vector, and the like.
  • the expression vector is a viral vector, it can be introduced by infecting cells.
  • Examples of the expression vector whose expression can be controlled include those whose expression can be controlled in response to an external stimulus.
  • Such an expression vector comprises at least a promoter capable of inducing the expression of a downstream gene in response to an external stimulus and at least the SOX9 gene, the NFIA gene and the NFIB gene whose expression is regulated by the promoter.
  • the promoter is not particularly limited as long as it can control the expression of downstream genes in response to an external stimulus.
  • the external stimulus is the presence or absence of a tetracycline antibiotic, tetracycline is used.
  • Promoters with a response factor (TRE) can be mentioned.
  • step (A) adds or removes a tetracycline antibiotic to the medium of the human pluripotent stem cell into which a vector containing the SOX9 gene, NFIA gene and NFIB gene has been introduced under the control of a tetracycline response factor. It will be done by.
  • the complex of the tetracycline antibiotic and the reverse tetracycline-controlled transactivator binds to the TRE. It can induce the expression of downstream genes.
  • the tetracycline-regulated transactivator binds to TRE to induce downstream gene expression.
  • Tet-Off system the tetracycline-regulated transactivator binds to TRE to induce downstream gene expression.
  • the tetracycline antibiotic and tTA form a complex and cannot bind to TRE, so that the expression of the downstream gene is suppressed.
  • tetracycline antibiotic examples include tetracycline derivatives such as tetracycline and doxycycline.
  • concentration of doxycycline added to the medium can be 0.1 to 10 ⁇ g / mL, more preferably 1 to 2 ⁇ g / mL.
  • a promoter capable of inducing the expression of a downstream gene by binding the ecdysteroid to the ecdysone receptor-retinoid receptor complex can be mentioned.
  • ecdysteroids include ecdysone, mristolone A, ponasteron A and the like.
  • the expression of the downstream gene can be induced by the binding of FKCsA to the Gal4 DNA binding domain fused to FKBP12 and the VP16 activator domain complex fused to cyclophilin. Promoters are mentioned.
  • the expression vector may contain an enhancer, a silencer, a drug selection marker, an origin of replication, etc., if necessary.
  • the drug selection marker include hygromycin resistance gene, puromycin resistance gene, neomycin resistance gene and the like.
  • the NCBI accession number of the SOX9 protein is NP_000337.1 or the like.
  • the NCBI accession number of the cDNA of SOX9 is NM_000346.4 etc.
  • the NCBI accession numbers of the NFIA protein are NP_005586.1, NP_001128145.1, NP_001138984.1.
  • the NCBI accession numbers of the NFIA cDNA are NM_001134673.4, NM_0011455511.2, NM_001145512.2.
  • the NCBI accession numbers of the NFIB protein are NP_0013556409.1, NP_0013556387.1, NP_001356397.1, and the like.
  • the NCBI accession numbers of the NFIB cDNA are NM_001190737.2, NM_001190738.1, NM_00128287.1 and the like.
  • SOX9, NFIA and NFIB may have mutations as long as they have the activity to induce differentiation of human pluripotent stem cells into astrocyte-like cells.
  • SOX9, NFIA, and NFIB have mutations, they preferably have 80% or more sequence identity, preferably 90% or more sequence identity to the protein or cDNA identified by the NCBI accession number described above. It is more preferable, and it is further preferable to have 95% or more sequence identity.
  • sequence identity of the amino acid sequence is a value indicating the ratio of the target amino acid sequence (target amino acid sequence) to the reference amino acid sequence (reference amino acid sequence).
  • pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and the like.
  • the pluripotent stem cell may be a cell derived from a healthy person or a cell derived from a neurological disease patient.
  • astrocyte-like cells are produced from pluripotent stem cells derived from a neurological disease patient, the obtained astrocyte-like cells can be used as a model for neurological disease. Such astrocyte-like cells are useful for elucidating the mechanism of neurological diseases.
  • the vector for forcibly expressing the SOX9 gene, the NFIA gene and the NFIB gene, or the vector capable of inducing the expression of the SOX9 gene, the NFIA gene and the NFIB gene contains a nucleic acid having a base sequence represented by the following formula (1). You may be. F 1 -S 1 -F 2 -S 2 -F 3 ... (1)
  • F 1 , F 2 and F 3 represent the base sequence encoding SOX9, the base sequence encoding NFIA and the base sequence encoding NFIB in no particular order, and S 1 and S 2 are separators. Represents a base sequence.
  • F 1 , F 2 , and F 3 may be base sequences encoding SOX9, NFIA, and NFIB, respectively, may be base sequences encoding SOX9, NFIB, and NFIA, and may be base sequences encoding SOX9, NFIB, and NFIA, respectively. It may be a base sequence encoding SOX9, a base sequence encoding NFIA, SOX9, NFIB, a base sequence encoding NFIB, SOX9, NFIA, or a base sequence encoding NFIB, NFIA.
  • SOX9 may be a base sequence encoding.
  • the separator base sequence is a base sequence that enables bicistronic expression, and examples thereof include an internal ribosome entry site (IRES) sequence and a 2A sequence.
  • IRS internal ribosome entry site
  • the 2A sequence include a T2A sequence derived from Tosea asigne, a P2A sequence derived from Porcine teschovirus, an F2A sequence derived from foot-and-mouth disease virus, an Equine rhinitis A virus-derived E2 sequence and the like.
  • the 2A sequence is also referred to as a self-cleaving peptide sequence.
  • Bicistronic expression means expressing two or more proteins from a single mRNA.
  • the expression levels of SOX9, NFIA and NFIB are 1: 1: 1 in molar ratio.
  • bicistronic expression is carried out by a method of introducing SOX9, NFIA and NFIB into cells in the same molar amount, a method of introducing expression vectors expressing SOX9, NFIA and NFIB individually into cells by the same copy, and the like. It is possible to adjust the expression levels of SOX9, NFIA and NFIB to a molar ratio of 1: 1: 1 without performing the above procedure.
  • step (B) human pluripotent stem cells in which SOX9, NFIA, and NFIB are upwardly controlled are cultured.
  • human pluripotent stem cells differentiate into astrocyte-like cells. Since astrocytes are a type of glial cells, it is conceivable to use a glial cell culture medium as the medium in step (B).
  • the inventors have performed the step (B) using a pluripotent stem cell culture medium or a nerve cell culture medium, rather than using a glial cell culture medium. Also revealed that the expression level of astrocyte markers is high. That is, by performing the step (B) using a pluripotent stem cell culture medium or a nerve cell culture medium, astrocyte-like cells can be efficiently produced.
  • Examples of the medium for culturing pluripotent stem cells include a medium usually used for culturing iPS cells, ES cells, and the like. More specifically, for example, Stem Fit (AK02N) (Ajinomoto Co., Inc.), Stem Fit (AK03) (Ajinomoto Co., Inc.), Cellartis DEF-CS 500 (Takara Bio Inc.), mTeRR1 (Stem Cell Technologies Inc.), mTeSR-E8 (Stem Cell Technologies Inc.) Stem Cell Technologies, Inc.), Essential 8 (Thermo Fisher Scientific, Inc.) and the like.
  • Additives may be added to the pluripotent stem cell culture medium. Examples of the additive include basic fibroblast growth factor (Fibroblast Growth Factor2, FGF2) and the like.
  • Examples of the medium for culturing nerve cells include a medium usually used for culturing nerve cells. More specifically, for example, KBM Natural Stem (Corgin Bio), Neurobasal Medium (Thermo Fisher Scientific), Neurobasal Plus Medium (Thermo Fisher Scientific), Brain Phys (Stem Cell Technologies), etc. Be done. Additives may be added to the medium for culturing nerve cells.
  • Additives include B27 supplement (Thermofisher Scientific), B27 Plus supplement (Thermofisher Scientific), N2 supplement (Thermofisher Scientific), SM1 supplement (Veritas), brain-derived neurotrophic Factors (BDNF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), neurotrophin 3 (NT3), dibutyryl cyclic AMP (dbcAMP) and the like can be mentioned.
  • B27 supplement Thermofisher Scientific
  • B27 Plus supplement Thermofisher Scientific
  • N2 supplement Thermofisher Scientific
  • SM1 supplement Veritas
  • BDNF brain-derived neurotrophic Factors
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • NT3 neurotrophin 3
  • dbcAMP dibutyryl cyclic AMP
  • the production method of the present embodiment may have a step of differentiating human pluripotent stem cells into neural stem cells, or does not have a step of differentiating human pluripotent stem cells into neural stem cells, and is human pluripotent.
  • Pluripotent stem cells may be directly induced to differentiate into astrosite-like cells.
  • the production method of the present embodiment includes a step of differentiating human pluripotent stem cells into neural stem cells, first, the human pluripotent stem cells are induced to differentiate into neural stem cells, and then in the cells induced to differentiate into neural stem cells.
  • a method usually performed can be appropriately adopted.
  • a method of culturing human pluripotent stem cells in the presence of Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2), Rho-associated protein kinase (ROCK) signal transduction pathway inhibitor, Leukemia Inhibitory Factor (LIF) can be mentioned.
  • ROCK signal transduction pathway inhibitor examples include Y-27632 (CAS number: 129830-38-2), Derivative / HA1077 (CAS number: 105628-07-7), H-1152 (CAS number: 871543-07-). 6), Wf-536 (CAS No .: 539857-64-2), derivatives thereof and the like can be mentioned.
  • the final concentration of the ROCK signaling pathway inhibitor in the medium is usually 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, It is preferably 5 ⁇ M to 50 ⁇ M, more preferably 10 ⁇ M to 30 ⁇ M.
  • the present invention provides astrocyte-like cells produced by the production method described above. Since the astrocyte-like cells of the present embodiment can be efficiently produced in vitro, they can be suitably used for basic research, elucidation of nervous system diseases, and the like.
  • the exogenous SOX9 gene, NFIA gene, and NFIB gene may be introduced into the genome. Further, the SOX9 gene, the NFIA gene, and the NFIB gene may be linked via a separator base sequence.
  • the invention provides a co-culture of astrocyte-like cells and nerve-like cells described above.
  • the nerve-like cell means a cell functionally and morphologically equivalent to a nerve cell in a living body, and can also be referred to as a nerve cell.
  • Nerve-like cells express neuronal markers such as microtubule-associated protein2 (MAP2), synapsin 1 (SYN1), ⁇ III-tubulin (TUBB3).
  • MAP2 microtubule-associated protein2
  • SYN1 synapsin 1
  • TUBB3 ⁇ III-tubulin
  • brain organoids prepared from pluripotent stem cells are mainly composed of neural cells and neural stem cells, and do not contain fully mature glial cells.
  • a large amount of prepared astrocyte-like cells and nerve-like cells can be co-cultured, and the function of the nerve cells can be analyzed in a state close to that in the living body.
  • the invention is selected from a medium comprising basic fibroblast growth factor or a group consisting of brain-derived neurotrophic factor, glial cell line-derived neurotrophic factor, neurotrophin 3 and dibutyryl cyclic AMP.
  • a medium containing at least one factor for the production of astrocyte-like cells As described above, the use of this embodiment can efficiently produce astrocyte-like cells in vitro.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating an outline of the experiment.
  • a reverse tetracycline-regulated transactivating factor (rtTA3G, Vector Builder) was introduced into human iPS cells (1210B2 strain) using a transposon vector (PiggyBac vector, Vector Builder), and a gene-transferred strain was introduced by drug selection. Obtained.
  • a hygromycin resistance gene was used as a drug selection marker for rtTA3G.
  • IVS internal ribosome entry site
  • the SOX9 gene, NFIB gene, and NFIA gene were introduced into a cell line that stably expresses rtTA3G under the control of a tetracycline response factor, and the gene-introduced strain was selected by drug selection.
  • Got A puromycin resistance gene was used as a drug selection marker.
  • a T2A sequence was introduced between the SOX9 gene, the NFIB gene and the NFIA gene, and these genes were expressed bicistronically.
  • a base sequence encoding a FLAG tag was added to the SOX9 gene.
  • the SOX9 gene and NFIB gene were introduced into a cell line that stably expresses rtTA3G using a lentiviral vector (Vector Builder) under the control of a tetracycline response factor, and the gene was introduced by drug selection. Got a stock. A puromycin resistance gene was used as a drug selection marker. A T2A sequence was introduced between the SOX9 gene and the NFIB gene, and these genes were expressed bicistronically. In addition, a base sequence encoding a FLAG tag was added to the SOX9 gene.
  • a pluripotent stem cell culture medium product name "Stem Fit (AK02N)", Ajinomoto Co., Inc.
  • the cells were dissociated and seeded on a new plate coated with Matrigel to induce differentiation into astrocyte-like cells.
  • doxycycline was added to the medium to induce the expression of the SOX9 gene, the NFIB gene and the NFIA gene, or the SOX9 gene and the NFIB gene.
  • a pluripotent stem cell culture medium, a glia cell culture medium, and a nerve cell culture medium were used and compared.
  • a basic medium (trade name "Stem Fit (AK02N) A solution", Ajinomoto Co., Inc.), a trade name “Stem Fit (AK02N) B solution” (Ajinomoto Co., Inc.) and a trade name “Stem” A medium supplemented with “Fit (AK02N) C solution” (Ajinomoto Co., Inc.) was used.
  • a basic medium (trade name "KBM Natural Stem", Kojin Bio Co., Ltd.), 2% B27 supplement (Thermofisher Scientific), 1% Glutamax (Thermofisher Scientific), Add 1% non-essential amino acid (NEAA) (Fujifilm Wako Pure Drug), 20 ng / mL fibroblast growth factor (FGF), 10 ng / mL epidermal growth factor (EGF), 10 ng / mL neurotrophin 3 (NT3) The medium was used.
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • NT3 neurotrophin 3
  • a basic medium (trade name "Neurobasal PlusMedium", Thermo Fisher Scientific), 2% B27 supplement (Thermo Fisher Scientific), 1% Glutamax (Thermo Fisher Scientific) ), 1% CultureOne supplement (Thermo Fisher Scientific), 200 ⁇ M ascorbic acid, 20 ng / mL brain-derived neurotrophic factor (BDNF), 20 ng / mL glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), 20 ng / mL neurotro A medium supplemented with fin 3 (NT3) and 100 ⁇ M dibutyryl cyclic AMP (dbcAMP) was used.
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • GDNF ng / mL glial cell line-derived neurotrophic factor
  • dbcAMP dibutyryl cyclic AMP
  • Example 2 (Microscopic observation of astrocyte-like cells) The cells induced to differentiate into astrocyte-like cells in Experimental Example 1 were observed under a microscope. 2 (a) and 2 (b) are photographs showing the results of microscopic observation of cells cultured for 5 days in the presence or absence of doxycycline in Experimental Example 1. This is a typical result of using a medium for culturing nerve cells as a medium.
  • the scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIG. 2 (a) is a photograph of cells cultured in the absence of doxycycline
  • FIG. 2 (b) is a photograph of cells cultured in the presence of doxycycline.
  • the photograph on the right is an enlarged photograph of the area surrounded by the square in the photograph on the left.
  • Example 3 (Examination by immunochemical staining) The cells induced to differentiate into astrocyte-like cells in Experimental Example 1 were fixed and immunochemically stained. 3 (a) to 3 (e) are fluorescence micrographs showing the results of paraformaldehyde-fixed cells cultured for 20 days in the presence of doxycycline and immunochemical staining. This is a typical result of using a medium for culturing nerve cells as a medium. The scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIG. 3A is the result of staining the nucleus with Hoechst 33342.
  • FIG. 3 (b) shows the results of staining the astrocyte marker GFAP with an anti-GFAP antibody.
  • FIG. 3 (c) shows the results of staining the FLAG tag with an anti-FLAG antibody.
  • FIG. 3 (d) is a photograph in which FIGS. 3 (b) and 3 (c) are combined.
  • FIG. 3 (e) is an enlarged photograph of the area surrounded by the square in FIG. 3 (d). As a result, the expression of GFAP was confirmed, and it was clarified that it was differentiated into astrocytes.
  • Example 4 (Investigation by quantitative RT-PCR)
  • the mRNA of the astrocyte marker in each cell cultured for 20 days in the presence of doxycycline was quantified by quantitative RT-PCR.
  • GFAP and S100 ⁇ were examined as astrocyte markers.
  • As the medium cells using a medium for culturing nerve cells were used.
  • FIGS. 4 (a) and 4 (b) are graphs showing the results of quantitative RT-PCR.
  • FIG. 4 (a) is the result of GFAP
  • FIG. 4 (b) is the result of S100 ⁇ .
  • "(-)” shows the results of cells in which the expression of the SOX9 gene and the NFIB gene was induced
  • "NFIA” showed the expression of the SOX9 gene, the NFIA gene and the NFIB gene.
  • the results of the cells are shown.
  • the vertical axis shows the expression level of mRNA, and is shown as a relative value with the result of cells in which the expression of SOX9 gene and NFIB gene is induced as 1.
  • the cells in which the expression of the SOX9 gene, the NFIA gene and the NFIB gene was induced had a GFAP expression level of 4 times or more and the expression level of S100 ⁇ about 4 times as much as that of the cells in which the expression of the SOX9 gene and the NFIB gene was induced. It became clear that it was 7 times.
  • Example 5 (Examination of medium)
  • the mRNA of the astrocyte marker in each cell in which the expression of the SOX9 gene, the NFIA gene and the NFIB gene was induced was quantified by quantitative RT-PCR after culturing in the presence of doxicycline for 20 days.
  • GFAP and S100 ⁇ were examined as astrocyte markers.
  • As the medium a pluripotent stem cell culture medium, a glia cell culture medium, and a nerve cell culture medium were used.
  • FIGS. 5 (a) and 5 (b) are graphs showing the results of quantitative RT-PCR.
  • FIG. 5 (a) is the result of GFAP
  • FIG. 5 (b) is the result of S100 ⁇ .
  • PSC medium is the result of using a pluripotent stem cell culture medium
  • Gliaal medium is the result of using a glial cell culture medium
  • Neuronal medium is the result of using a medium for culturing nerve cells.
  • the vertical axis shows the expression level of mRNA, and the result of using the pluripotent stem cell culture medium is shown as a relative value of 1.
  • astrocyte markers As a result, the expression level of astrocyte markers is higher when cultured in a pluripotent stem cell culture medium or a nerve cell culture medium than in a glial cell culture medium which is originally considered to be suitable for astrocyte culture. It became clear.
  • astrocyte-like cells can be efficiently produced in vitro.

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Abstract

ヒト多能性幹細胞中の、ＳＲＹ－Ｂｏｘ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　９（ＳＯＸ９）、ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ＩＡ（ＮＦＩＡ）及びｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ＩＢ（ＮＦＩＢ）を含む転写因子を上方制御する工程（Ａ）と、前記転写因子が上方制御された前記ヒト多能性幹細胞を培養し、その結果、前記ヒト多能性幹細胞がアストロサイト様細胞に分化する工程（Ｂ）を含む、アストロサイト様細胞の製造方法。

Description

アストロサイト様細胞の製造方法
　本発明は、アストロサイト様細胞の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、アストロサイト様細胞の製造方法、アストロサイト様細胞、アストロサイト様細胞及び神経様細胞の共培養物、並びにアストロサイト様細胞の製造のための培地の使用に関する。本願は、２０２０年９月１０日に、日本に出願された特願２０２０－１５２１８０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　基礎研究や神経系疾患の解明等に神経系組織を利用する需要がある。しかしながら、マウスやラット等の実験動物の神経系組織を用いて得られた実験結果はヒトへの外挿性が問題になる場合があり、ヒトの神経系組織を使用することには制限がある。このため、インビトロでヒトの神経系組織を形成し利用することが検討されている。
　しかしながら、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞等の多能性幹細胞から作製した脳オルガノイドは、主に神経細胞や神経幹細胞で構成されており、十分に成熟したグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア等）を含んでいないことが知られている。
　グリア細胞は、神経細胞への栄養補給等、神経細胞の生存と機能発現を担っており、脳の機能発現には、神経細胞だけでなくグリア細胞の役割が重要であることが明らかになってきている。このため、インビトロでグリア細胞を作製する技術が求められている。
　例えば、非特許文献１には、ヒト多能性幹細胞に、ＳＲＹ－Ｂｏｘ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　９（ＳＯＸ９）遺伝子及びｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒＩＢ（ＮＦＩＢ）遺伝子を過剰発現させて、アストロサイト様細胞を分化誘導したことが記載されている。
　また、非特許文献２には、ヒト多能性幹細胞に、ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ＩＡ（ＮＦＩＡ）遺伝子、又は、ＳＯＸ９遺伝子及びＮＦＩＡ遺伝子を過剰発現させて、アストロサイト様細胞を分化誘導したことが記載されている。
Canals I., et al., Rapid and efficient induction of functional astrocytes from human pluripotent stem cells, Nat Methods., 693-696, 2018. Li X., et al., Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells, Stem Cell Reports, 998-1008, 2018.
　本発明は、アストロサイト様細胞をインビトロで効率よく製造する技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］ヒト多能性幹細胞中の、ＳＲＹ－Ｂｏｘ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　９（ＳＯＸ９）、ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ＩＡ（ＮＦＩＡ）及びｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ＩＢ（ＮＦＩＢ）を含む転写因子を上方制御する工程（Ａ）と、前記転写因子が上方制御された前記ヒト多能性幹細胞を培養し、その結果、前記ヒト多能性幹細胞がアストロサイト様細胞に分化する工程（Ｂ）を含む、アストロサイト様細胞の製造方法。
［２］前記工程（Ｂ）において、前記ヒト多能性幹細胞を、多能性幹細胞培養用培地又は神経細胞培養用培地中で培養する、［１］に記載のアストロサイト様細胞の製造方法。
［３］前記工程（Ａ）が、前記転写因子をコードする核酸を含むベクターを、前記ヒト多能性幹細胞に導入することにより行われる、［１］又は［２］に記載のアストロサイト様細胞の製造方法。
［４］前記工程（Ａ）が、テトラサイクリン応答因子の制御下に前記転写因子をコードする核酸を含むベクターが導入された前記ヒト多能性幹細胞の培地に、テトラサイクリン系抗生物質を添加又は除去することにより行われる、［１］又は［２］に記載のアストロサイト様細胞の製造方法。
［５］前記ベクターが、下記式（１）で表される塩基配列からなる核酸を含む、［３］又は［４］に記載のアストロサイト様細胞の製造方法。
　Ｆ１－Ｓ１－Ｆ２－Ｓ２－Ｆ３　…（１）
［式（１）中、Ｆ１、Ｆ２及びＦ３は、順不同で、ＳＯＸ９をコードする塩基配列、ＮＦＩＡをコードする塩基配列及びＮＦＩＢをコードする塩基配列を表し、Ｓ１及びＳ２は、セパレーター塩基配列を表す。］
［６］前記ベクターが、トランスポゾンベクターである、［３］～［５］のいずれかに記載のアストロサイト様細胞の製造方法。
［７］前記工程（Ｂ）において、前記ヒト多能性幹細胞中の、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢの存在量が、モル比で１：１：１である、［１］～［６］のいずれかに記載のアストロサイト様細胞の製造方法。
［８］前記ヒト多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、［１］～［７］のいずれかに記載のアストロサイト様細胞の製造方法。
［９］［１］～［８］のいずれかに記載の製造方法により製造された、アストロサイト様細胞。
［１０］［９］に記載のアストロサイト様細胞及び神経様細胞の共培養物。
［１１］塩基性繊維芽細胞増殖因子を含む培地、又は、脳由来神経栄養因子、グリア細胞株由来神経栄養因子、ニューロトロフィン３及びジブチリル環状ＡＭＰからなる群より選択される少なくとも１つの因子を含有する培地の、アストロサイト様細胞の製造のための使用。
　本発明は以下の態様を含むものであるということもできる。
［Ｐ１］ヒト多能性幹細胞中の、ＳＲＹ－Ｂｏｘ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　９（ＳＯＸ９）、ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ＩＡ（ＮＦＩＡ）及びｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ＩＢ（ＮＦＩＢ）を含む転写因子を上方制御する工程（Ａ）と、前記転写因子が上方制御された前記ヒト多能性幹細胞を培養し、その結果、前記ヒト多能性幹細胞がアストロサイトに分化する工程（Ｂ）を含む、アストロサイトの製造方法。
［Ｐ２］前記工程（Ｂ）において、前記ヒト多能性幹細胞を、多能性幹細胞培養用培地又は神経細胞培養用培地中で培養する、［Ｐ１］に記載のアストロサイトの製造方法。
［Ｐ３］前記工程（Ａ）が、前記転写因子をコードする塩基配列からなる核酸を含むベクターを、前記ヒト多能性幹細胞に導入することにより行われる、［Ｐ１］又は［Ｐ２］に記載のアストロサイトの製造方法。
［Ｐ４］前記工程（Ａ）が、テトラサイクリン応答因子の制御下に前記転写因子をコードする塩基配列からなる核酸を含むベクターが導入された前記ヒト多能性幹細胞の培地に、テトラサイクリン系抗生物質を添加又は除去することにより行われる、［Ｐ１］又は［Ｐ２］に記載のアストロサイトの製造方法。
［Ｐ５］前記ベクターが、下記式（Ｐ１）で表される塩基配列からなる核酸を含む、［Ｐ３］又は［Ｐ４］に記載のアストロサイトの製造方法。
　Ｆ１－Ｓ１－Ｆ２－Ｓ２－Ｆ３　…（Ｐ１）
［式（１）中、Ｆ１、Ｆ２及びＦ３は、順不同で、ＳＯＸ９をコードする塩基配列、ＮＦＩＡをコードする塩基配列及びＮＦＩＢをコードする塩基配列を表し、Ｓ１及びＳ２は、セパレーター塩基配列を表す。］
［Ｐ６］前記ベクターが、トランスポゾンベクターである、［Ｐ３］～［Ｐ５］のいずれかに記載のアストロサイトの製造方法。
［Ｐ７］前記工程（Ｂ）において、前記ヒト多能性幹細胞中の、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢの存在量が、モル比で１：１：１である、［Ｐ１］～［Ｐ６］のいずれかに記載のアストロサイトの製造方法。
［Ｐ８］前記ヒト多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、［Ｐ１］～［Ｐ７］のいずれかに記載のアストロサイトの製造方法。
［Ｐ９］［Ｐ１］～［Ｐ８］のいずれかに記載の製造方法により製造された、アストロサイト。
［Ｐ１０］［Ｐ９］に記載のアストロサイト及び神経細胞の共培養物。
［Ｐ１１］ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢを含む転写因子をコードする塩基配列からなる核酸が導入された、アストロサイト製造用ヒト多能性幹細胞。
［Ｐ１２］前記転写因子をコードする塩基配列からなる核酸がテトラサイクリン応答因子の制御下に導入された、［Ｐ１１］に記載のアストロサイト製造用ヒト多能性幹細胞。
　本発明によれば、アストロサイト様細胞をインビトロで効率よく製造することができる。
実験例１の概要を説明する図である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例２の結果を示す顕微鏡写真である。 （ａ）～（ｅ）は、実験例３の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例４における定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例５における定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。
［アストロサイト様細胞の製造方法］
　１実施形態において、本発明は、ヒト多能性幹細胞中の、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢを含む転写因子を上方制御する工程（Ａ）と、前記転写因子が上方制御された前記ヒト多能性幹細胞を培養し、その結果、前記ヒト多能性幹細胞がアストロサイト様細胞に分化する工程（Ｂ）を含む、アストロサイト様細胞の製造方法を提供する。
　本明細書において、アストロサイト様細胞とは、生体内のアストロサイトと機能的及び形態的に同等の細胞を意味し、アストロサイトといいかえることもできる。アストロサイト様細胞は、後述するアストロサイトマーカーを発現する。
　実施例において後述するように、本実施形態の製造方法によれば、短期間に効率よくアストロサイト様細胞を製造することができる。例えば、転写因子の上方制御の開始から５日後には、顕微鏡観察でアストロサイトに特徴的な形態を示す細胞を得ることができる。
　また、アストロサイトへの分化効率が高いとは、アストロサイトマーカーの発現量が対照と比較して高いことを意味する。アストロサイトマーカーとしては、例えば、Ｇｌｉａｌ　Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　Ａｃｉｄｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）、Ｓ１００　Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂ（Ｓ１００β）等が挙げられる。
　対照としては、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢのいずれかを上方制御していない細胞が挙げられる。具体的には、例えば、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢのいずれか１つのみを上方制御した細胞、ＳＯＸ９及びＮＦＩＡのみを上方制御した細胞、ＳＯＸ９及びＮＦＩＢのみを上方制御した細胞、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢのみを上方制御した細胞等が挙げられる。実施例において後述するように、ＳＯＸ９及びＮＦＩＢのみを上方制御した場合と比較して、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢを上方制御する本実施形態の方法により得られたアストロサイトは、アストロサイトマーカーの発現量が約４～７倍高い。
　工程（Ａ）において、ヒト多能性幹細胞中の、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢを含む転写因子を上方制御する。ここで、上方制御するとは、細胞内における存在量を増加させることを意味する。ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢを上方制御するとは、例えば、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢをタンパク質の形態で細胞内に導入することであってもよい。あるいは、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢをｍＲＮＡの形態で細胞内に導入することであってもよい。あるいは、ＳＯＸ９遺伝子、ＮＦＩＡ遺伝子及びＮＦＩＢ遺伝子の発現ベクターを細胞内に導入することであってもよい。あるいは、ＳＯＸ９遺伝子、ＮＦＩＡ遺伝子及びＮＦＩＢ遺伝子の発現を制御可能な発現ベクターを導入した細胞を準備し、その発現を誘導することにより、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢを上方制御してもよい。
　タンパク質、ｍＲＮＡ、発現ベクターの導入は、必要に応じて通常行われる方法により行うことができ、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション等が挙げられる。
　発現ベクターは、プラスミドベクターであってもよく、トランスポゾンベクターであってもよく、ウイルスベクターであってもよく、これらを併用してもよい。
　トランスポゾンベクターは、必要に応じて細胞から完全に除去することができるものであってもよい。このようなトランスポゾンベクターとしては、例えばＰｉｇｇｙＢａｃベクター等が挙げられる。
　ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター等が挙げられる。発現ベクターがウイルスベクターである場合には、細胞に感染させることにより導入することができる。
　発現を制御可能な発現ベクターとしては、外的刺激の応答に応じて発現を制御できるものが挙げられる。このような発現ベクターは、外的刺激に応答して下流の遺伝子の発現を誘導できるプロモーターと、当該プロモーターによって発現が制御される、ＳＯＸ９遺伝子、ＮＦＩＡ遺伝子及びＮＦＩＢ遺伝子を少なくとも含む。
　プロモーターとしては、外的刺激に応答して下流の遺伝子の発現を制御できるものであれば特に制限されず、例えば、外的刺激がテトラサイクリン系抗生物質の存在又は非存在である場合には、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）を有するプロモーターが挙げられる。
　この場合、工程（Ａ）が、テトラサイクリン応答因子の制御下にＳＯＸ９遺伝子、ＮＦＩＡ遺伝子及びＮＦＩＢ遺伝子を含むベクターが導入された前記ヒト多能性幹細胞の培地に、テトラサイクリン系抗生物質を添加又は除去することにより行われることになる。
　外的刺激がテトラサイクリン系抗生物質の存在である場合（Ｔｅｔ－Ｏｎシステム）には、テトラサイクリン系抗生物質とリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）との複合体がＴＲＥに結合することにより、下流の遺伝子の発現を誘導することができる。
　一方、外的刺激がテトラサイクリン系抗生物質の非存在である場合（Ｔｅｔ－Ｏｆｆシステム）には、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）がＴＲＥに結合することによって、下流の遺伝子の発現を誘導することができる。この場合、テトラサイクリン系抗生物質の存在下では、テトラサイクリン系抗生物質とｔＴＡとが複合体を形成し、ＴＲＥに結合できなくなることにより下流の遺伝子の発現が抑制される。
　テトラサイクリン系抗生物質としては、テトラサイクリン、ドキシサイクリン等のテトラサイクリン誘導体が挙げられる。テトラサイクリン系抗生物質としてドキシサイクリンを使用する場合、培地へのドキシサイクリンの添加濃度は、０．１～１０μｇ／ｍＬであることができ、１～２μｇ／ｍＬがより好ましい。
　また、外的刺激がエクジステロイドの存在である場合には、エクジステロイドと、エクジソン受容体－レチノイド受容体複合体との結合によって、下流の遺伝子の発現を誘導できるプロモーターが挙げられる。エクジステロイドとしては、エクジソン、ムリステロンＡ、ポナステロンＡ等が挙げられる。
　また、外的刺激がＦＫＣｓＡの存在である場合には、ＦＫＣｓＡと、ＦＫＢＰ１２に融合したＧａｌ４　ＤＮＡ結合ドメイン－シクロフィリンに融合したＶＰ１６アクチベータードメイン複合体との結合によって、下流の遺伝子の発現を誘導できるプロモーターが挙げられる。
　発現ベクターは、必要に応じて、エンハンサー、サイレンサー、薬剤選択マーカー、複製起点等を含んでいてもよい。薬剤選択マーカーとしては、例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
　ＳＯＸ９タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿０００３３７．１等である。ＳＯＸ９のｃＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿０００３４６．４等である。ＮＦＩＡタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００５５８６．１、ＮＰ＿００１１２８１４５．１、ＮＰ＿００１１３８９８４．１等である。ＮＦＩＡのｃＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１１３４６７３．４、ＮＭ＿００１１４５５１１．２、ＮＭ＿００１１４５５１２．２等である。ＮＦＩＢタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００１３５６４０９．１、ＮＰ＿００１３５６３８７．１、ＮＰ＿００１３５６３９７．１等である。ＮＦＩＢのｃＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１１９０７３７．２、ＮＭ＿００１１９０７３８．１、ＮＭ＿００１２８２７８７．１等である。
　ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢは、ヒト多能性幹細胞をアストロサイト様細胞に分化誘導させる活性を有する限り変異を有していてもよい。ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢが変異を有する場合、上述したＮＣＢＩアクセッション番号により特定されるタンパク質又はｃＤＮＡに対して、８０％以上の配列同一性を有することが好ましく、９０％以上の配列同一性を有することがより好ましく、９５％以上の配列同一性を有することが更に好ましい。
　ここで、アミノ酸配列の配列同一性は、対象のアミノ酸配列（対象アミノ酸配列）が、基準となるアミノ酸配列（基準アミノ酸配列）に対して一致している割合を示す値である。基準アミノ酸配列に対する、対象アミノ酸配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列をアラインメントする。ここで、各アミノ酸配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列において、一致したアミノ酸の数を算出し、下記式（Ｆ１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
　配列同一性（％）＝一致したアミノ酸の数／対象アミノ酸配列の総アミノ酸数×１００　…（Ｆ１）
　同様に、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の数を算出し、下記式（Ｆ２）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
　配列同一性（％）＝一致した塩基の数／対象塩基配列の総塩基数×１００　…（Ｆ２）
　本実施形態の製造方法において、多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。また、多能性幹細胞は、健常人由来の細胞であってもよく、神経疾患患者由来の細胞であってもよい。神経疾患患者由来の多能性幹細胞からアストロサイト様細胞を製造した場合、得られたアストロサイト様細胞を神経疾患のモデルとして用いることができる。このようなアストロサイト様細胞は、神経疾患のメカニズムの解明等に有用である。
　ＳＯＸ９遺伝子、ＮＦＩＡ遺伝子及びＮＦＩＢ遺伝子を強制発現するベクター、又は、ＳＯＸ９遺伝子、ＮＦＩＡ遺伝子及びＮＦＩＢ遺伝子の発現を誘導可能なベクターは、下記式（１）で表される塩基配列からなる核酸を含んでいてもよい。
　Ｆ１－Ｓ１－Ｆ２－Ｓ２－Ｆ３　…（１）
　式（１）中、Ｆ１、Ｆ２及びＦ３は、順不同で、ＳＯＸ９をコードする塩基配列、ＮＦＩＡをコードする塩基配列及びＮＦＩＢをコードする塩基配列を表し、Ｓ１及びＳ２は、セパレーター塩基配列を表す。
　Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３は、それぞれ、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢをコードする塩基配列であってもよいし、ＳＯＸ９、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＡをコードする塩基配列であってもよいし、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＳＯＸ９をコードする塩基配列であってもよいし、ＮＦＩＡ、ＳＯＸ９、ＮＦＩＢをコードする塩基配列であってもよいし、ＮＦＩＢ、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡをコードする塩基配列であってもよいし、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＡ、ＳＯＸ９をコードする塩基配列であってもよい。
　また、Ｓ１及びＳ２は、互いに同一の塩基配列であってもよいし、異なる塩基配列であってもよい。式（１）において、セパレーター塩基配列とは、バイシストロニックな発現を可能にする塩基配列であり、例えば、ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）配列、２Ａ配列等が挙げられる。２Ａ配列としては、例えば、Ｔｈｏｓｅａ　ａｓｉｇｎｅ由来のＴ２Ａ配列、Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ由来のＰ２Ａ配列、ｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ由来のＦ２Ａ配列、ｅｑｕｉｎｅ　ｒｈｉｎｉｔｉｓ　Ａ　ｖｉｒｕｓ由来のＥ２Ａ配列等が挙げられる。２Ａ配列のことを、自己切断ペプチド配列ともいう。
　バイシストロニックな発現とは、単一のｍＲＮＡから２つ以上のタンパク質を発現することを意味する。これにより、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢの発現量はモル比で１：１：１となる。
　なお、例えば、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢを当モル量ずつ細胞に導入する方法、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢをそれぞれ個別に発現する発現ベクターを同コピーずつ細胞に導入する方法等により、バイシストロニックな発現を行わなくても、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢの発現量をモル比で１：１：１に調整することは可能である。
　続いて、工程（Ｂ）において、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢが上方制御されたヒト多能性幹細胞を培養する。その結果、ヒト多能性幹細胞がアストロサイト様細胞に分化する。アストロサイトはグリア細胞の一種であるため、工程（Ｂ）において、培地としてグリア細胞培養用培地を用いることが考えられる。
　しかしながら、実施例において後述するように、発明者らは、工程（Ｂ）を多能性幹細胞培養用培地又は神経細胞培養用培地を用いて行うことにより、グリア細胞培養用培地を用いて行うよりもアストロサイトマーカーの発現量が高くなることを明らかにした。すなわち、工程（Ｂ）を多能性幹細胞培養用培地又は神経細胞培養用培地を用いて行うことにより、効率よくアストロサイト様細胞を製造することができる。
　多能性幹細胞培養用培地としては、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の培養に通常用いられる培地が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｓｔｅｍ　Ｆｉｔ（ＡＫ０２Ｎ）（味の素社）、　Ｓｔｅｍ　Ｆｉｔ（ＡＫ０３）（味の素社）、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ　ＤＥＦ－ＣＳ　５００（タカラバイオ社）、ｍＴｅＲＲ１（ステムセルテクノロジーズ社）、ｍＴｅＳＲ－Ｅ８（ステムセルテクノロジーズ社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　８（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）等が挙げられる。多能性幹細胞培養用培地には添加物が添加されていてもよい。添加物としては、塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ２、ＦＧＦ２）等が挙げられる。
　神経細胞培養用培地としては、神経細胞の培養に通常用いられる培地が挙げられる。より具体的には、例えば、ＫＢＭ　Ｎｅｕｒａｌ　Ｓｔｅｍ（コージンバイオ社）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｐｌｕｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｂｒａｉｎ　Ｐｈｙｓ（ステムセルテクノロジーズ社）等が挙げられる。神経細胞培養用培地には添加物が添加されていてもよい。添加物としては、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｂ２７プラス　サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＳＭ１サプリメント（ベリタス社）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、ジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）等が挙げられる。
　本実施形態の製造方法は、ヒト多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる工程を有していてもよいし、ヒト多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる工程を有しておらず、ヒト多能性幹細胞を直接アストロサイト様細胞に分化誘導するものであってもよい。
　本実施形態の製造方法が、ヒト多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる工程を有する場合、まずヒト多能性幹細胞を神経幹細胞に分化誘導し、その後に、神経幹細胞に分化誘導した細胞中の、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢを含む転写因子を上方制御する工程（Ａ）と、前記転写因子が上方制御された細胞を培養し、その結果、細胞がアストロサイト様細胞に分化する工程（Ｂ）を実施してもよい。
　ヒト多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる工程としては、通常行われる方法を適宜採用することができる。例えば、ヒト多能性幹細胞をＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ２（ＦＧＦ２）、Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ（ＲＯＣＫ）シグナル伝達経路阻害剤、Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）の存在下で培養する方法が挙げられる。
　ＲＯＣＫシグナル伝達経路阻害剤としては、例えば、Ｙ－２７６３２（ＣＡＳ番号：１２９８３０－３８－２）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（ＣＡＳ番号：１０５６２８－０７－７）、Ｈ－１１５２（ＣＡＳ番号：８７１５４３－０７－６）、Ｗｆ－５３６（ＣＡＳ番号：５３９８５７－６４－２）、これらの誘導体等が挙げられる。
　培地中のＲＯＣＫシグナル伝達経路阻害剤の終濃度は、通常０．１μＭ～１００μＭ、
好ましくは５μＭ～５０μＭ、より好ましくは１０μＭ～３０μＭである。
［アストロサイト様細胞］
　１実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造された、アストロサイト様細胞を提供する。本実施形態のアストロサイト様細胞はインビトロで効率よく製造することができるため、基礎研究や神経系疾患の解明等に好適に用いることができる。
　本実施形態のアストロサイト様細胞は、ゲノム中に、外来性のＳＯＸ９遺伝子、ＮＦＩＡ遺伝子、ＮＦＩＢ遺伝子が導入されていてもよい。また、ＳＯＸ９遺伝子、ＮＦＩＡ遺伝子、ＮＦＩＢ遺伝子はセパレーター塩基配列を介して連結されていてもよい。
［共培養物］
　１実施形態において、本発明は、上述したアストロサイト様細胞及び神経様細胞の共培養物を提供する。
　本明細書において、神経様細胞とは、生体内の神経細胞と機能的及び形態的に同等の細胞を意味し、神経細胞といいかえることもできる。神経様細胞は、ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ２（ＭＡＰ２）、シナプシン１（ＳＹＮ１）、βＩＩＩ－チューブリン（ＴＵＢＢ３）等の神経細胞マーカーを発現する。
　上述したように、多能性幹細胞から作製した脳オルガノイドは、主に神経細胞や神経幹細胞で構成されており、十分に成熟したグリア細胞を含んでいない。これに対し、本実施形態の共培養物によれば、大量に準備したアストロサイト様細胞と神経様細胞を共培養し、生体内に近い状態で神経細胞の機能を解析することができる。
［アストロサイト様細胞の製造のための培地の使用］
　１実施形態において、本発明は、塩基性繊維芽細胞増殖因子を含む培地、又は、脳由来神経栄養因子、グリア細胞株由来神経栄養因子、ニューロトロフィン３及びジブチリル環状ＡＭＰからなる群より選択される少なくとも１つの因子を含有する培地の、アストロサイト様細胞の製造のための使用を提供する。上述したように、本実施形態の使用により、アストロサイト様細胞をインビトロで効率よく製造することができる。
　次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
［実験例１］
（ｉＰＳ細胞のアストロサイト様細胞への分化）
　ヒトｉＰＳ細胞にＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢを発現させ、アストロサイト様細胞への分化を検討した。図１は、実験の概要を説明する図である。まず、トランスポゾンベクター（ＰｉｇｇｙＢａｃベクター、ベクタービルダー社）を用いて、ヒトｉＰＳ細胞（１２１０Ｂ２株）にリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ３Ｇ、ベクタービルダー社）を導入し、薬剤選択により遺伝子導入株を得た。ｒｔＴＡ３Ｇの薬剤選択マーカーとしては、ハイグロマイシン耐性遺伝子を使用した。ｒｔＴＡ３Ｇ及びハイグロマイシン耐性遺伝子の間にはｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）配列を導入し、これらの遺伝子をバイシストロニックに発現させた。トランスポザーゼとしてはＨｙＰＢａｓｅ（ベクタービルダー社）を使用した。
　続いて、レンチウイルスベクター（ベクタービルダー社）を用いて、ｒｔＴＡ３Ｇを安定発現する細胞株に、テトラサイクリン応答因子の制御下に、ＳＯＸ９遺伝子、ＮＦＩＢ遺伝子及びＮＦＩＡ遺伝子を導入し、薬剤選択により遺伝子導入株を得た。薬剤選択マーカーとしては、ピューロマイシン耐性遺伝子を使用した。ＳＯＸ９遺伝子、ＮＦＩＢ遺伝子及びＮＦＩＡ遺伝子の間にはＴ２Ａ配列を導入し、これらの遺伝子をバイシストロニックに発現させた。また、ＳＯＸ９遺伝子にはＦＬＡＧタグをコードする塩基配列を付加した。
　また、比較のために、レンチウイルスベクター（ベクタービルダー社）を用いて、ｒｔＴＡ３Ｇを安定発現する細胞株に、テトラサイクリン応答因子の制御下に、ＳＯＸ９遺伝子及びＮＦＩＢ遺伝子を導入し、薬剤選択により遺伝子導入株を得た。薬剤選択マーカーとしては、ピューロマイシン耐性遺伝子を使用した。ＳＯＸ９遺伝子及びＮＦＩＢ遺伝子の間にはＴ２Ａ配列を導入し、これらの遺伝子をバイシストロニックに発現させた。また、ＳＯＸ９遺伝子にはＦＬＡＧタグをコードする塩基配列を付加した。
　続いて、得られた遺伝子導入株を６日間拡大培養した。培地としては、多能性幹細胞培養用培地（製品名「Ｓｔｅｍ　Ｆｉｔ（ＡＫ０２Ｎ）」、味の素社）を用いた。
　続いて、細胞を解離させ、マトリゲルでコートした新しいプレートに播種してアストロサイト様細胞に分化誘導した。また、培地中にドキシサイクリンを添加し、ＳＯＸ９遺伝子、ＮＦＩＢ遺伝子及びＮＦＩＡ遺伝子、又は、ＳＯＸ９遺伝子及びＮＦＩＢ遺伝子を発現誘導した。培地としては、多能性幹細胞培養用培地、グリア細胞培養用培地及び神経細胞培養用培地を使用し、比較した。
　多能性幹細胞培養用培地としては、基本培地（商品名「Ｓｔｅｍ　Ｆｉｔ（ＡＫ０２Ｎ）　Ａ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ」、味の素社）に、商品名「Ｓｔｅｍ　Ｆｉｔ（ＡＫ０２Ｎ）　Ｂ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（味の素社）及び商品名「Ｓｔｅｍ　Ｆｉｔ（ＡＫ０２Ｎ）Ｃ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（味の素社）を添加した培地を使用した。
　グリア細胞培養用培地としては、基本培地（商品名「ＫＢＭ　Ｎｅｕｒａｌ　Ｓｔｅｍ」、コージンバイオ社）に、２％Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（富士フイルム和光純薬）、２０ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、１０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子（ＥＧＦ）、１０ｎｇ／ｍＬニューロトロフィン３（ＮＴ３）を添加した培地を使用した。
　神経細胞培養用培地としては、基本培地（商品名「Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　ＰｌｕｓＭｅｄｉｕｍ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に、２％Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、１％ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅサプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、２００μＭアスコルビン酸、２０ｎｇ／ｍＬ脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、２０ｎｇ／ｍＬグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、２０ｎｇ／ｍＬニューロトロフィン３（ＮＴ３）、１００μＭジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）を添加した培地を使用した。
［実験例２］
（アストロサイト様細胞の顕微鏡観察）
　実験例１でアストロサイト様細胞に分化誘導した細胞を顕微鏡で観察した。図２（ａ）及び（ｂ）は、実験例１において、ドキシサイクリンの存在下又は非存在下で５日間培養した細胞を顕微鏡で観察した結果を示す写真である。培地として神経細胞培養用培地を使用した代表的な結果である。スケールバーは１００μｍである。
　図２（ａ）はドキシサイクリンの非存在下で培養した細胞の写真であり、図２（ｂ）は、ドキシサイクリンの存在下で培養した細胞の写真である。図２（ａ）及び（ｂ）中、右の写真は、左の写真の四角で囲んだ領域を拡大した写真である。
　その結果、ドキシサイクリンの存在下で、ＳＯＸ９遺伝子、ＮＦＩＢ遺伝子及びＮＦＩＡ遺伝子の発現を誘導した細胞は、発現誘導開始からわずか５日後であるにもかかわらず、アストロサイトに特徴的な形態を示すことが明らかとなった。
［実験例３］
（免疫化学染色による検討）
　実験例１でアストロサイト様細胞に分化誘導した細胞を固定し、免疫化学染色を行った。図３（ａ）～（ｅ）は、ドキシサイクリンの存在下で２０日間培養した細胞をパラホルムアルデヒド固定し、免疫化学染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。培地として神経細胞培養用培地を使用した代表的な結果である。スケールバーは１００μｍである。
　図３（ａ）は、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２で核を染色した結果である。図３（ｂ）は、アストロサイトマーカーであるＧＦＡＰを抗ＧＦＡＰ抗体で染色した結果である。図３（ｃ）は、ＦＬＡＧタグを抗ＦＬＡＧ抗体で染色した結果である。上述したように、ＳＯＸ９遺伝子にはＦＬＡＧタグをコードする塩基配列を付加していたため、抗ＦＬＡＧ抗体によりＳＯＸ９の発現を検出することができる。図３（ｄ）は、図３（ｂ）及び（ｃ）を合成した写真である。図３（ｅ）は、図３（ｄ）の四角で囲んだ領域を拡大した写真である。その結果、ＧＦＡＰの発現が確認され、アストロサイトに分化していることが明らかとなった。
［実験例４］
（定量的ＲＴ－ＰＣＲによる検討）
　実験例１において、ドキシサイクリンの存在下で２０日間培養した各細胞におけるアストロサイトマーカーのｍＲＮＡを定量的ＲＴ－ＰＣＲにより定量した。アストロサイトマーカーとして、ＧＦＡＰ及びＳ１００βについて検討した。培地として神経細胞培養用培地を使用した細胞を使用した。
　図４（ａ）及び（ｂ）は、定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。図４（ａ）はＧＦＡＰの結果であり、図４（ｂ）はＳ１００βの結果である。図４（ａ）及び（ｂ）中、「（－）」は、ＳＯＸ９遺伝子及びＮＦＩＢ遺伝子を発現誘導した細胞の結果を示し、「ＮＦＩＡ」は、ＳＯＸ９遺伝子、ＮＦＩＡ遺伝子及びＮＦＩＢ遺伝子を発現誘導した細胞の結果を示す。縦軸はｍＲＮＡの発現量を示し、ＳＯＸ９遺伝子及びＮＦＩＢ遺伝子を発現誘導した細胞の結果を１とした相対値で示す。
　その結果、ＳＯＸ９遺伝子、ＮＦＩＡ遺伝子及びＮＦＩＢ遺伝子を発現誘導した細胞は、ＳＯＸ９遺伝子及びＮＦＩＢ遺伝子を発現誘導した細胞と比較して、ＧＦＡＰの発現量が４倍以上であり、Ｓ１００βの発現量が約７倍であることが明らかとなった。
［実験例５］
（培地の検討）
　実験例１において、ドキシサイクリンの存在下で２０日間培養し、ＳＯＸ９遺伝子、ＮＦＩＡ遺伝子及びＮＦＩＢ遺伝子を発現誘導した各細胞におけるアストロサイトマーカーのｍＲＮＡを定量的ＲＴ－ＰＣＲにより定量した。アストロサイトマーカーとして、ＧＦＡＰ及びＳ１００βについて検討した。培地として、多能性幹細胞培養用培地、グリア細胞培養用培地及び神経細胞培養用培地を使用した。
　図５（ａ）及び（ｂ）は、定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。図５（ａ）はＧＦＡＰの結果であり、図５（ｂ）はＳ１００βの結果である。図５（ａ）及び（ｂ）中、「ＰＳＣ　ｍｅｄｉｕｍ」は多能性幹細胞培養用培地を使用した結果であり、「Ｇｌｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ」はグリア細胞培養用培地を使用した結果であり、「Ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｍｅｄｉｕｍ」は神経細胞培養用培地を使用した結果である。縦軸はｍＲＮＡの発現量を示し、多能性幹細胞培養用培地を使用した結果を１とした相対値で示す。
　その結果、本来アストロサイトの培養に適していると考えられるグリア細胞培養用培地よりも、多能性幹細胞培養用培地又は神経細胞培養用培地で培養したほうが、アストロサイトマーカーの発現量が高くなることが明らかとなった。
　本発明によれば、アストロサイト様細胞をインビトロで効率よく製造することができる。

Claims (11)

  1. 　ヒト多能性幹細胞中の、ＳＲＹ－Ｂｏｘ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　９（ＳＯＸ９）、ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ＩＡ（ＮＦＩＡ）及びｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ＩＢ（ＮＦＩＢ）を含む転写因子を上方制御する工程（Ａ）と、
    　前記転写因子が上方制御された前記ヒト多能性幹細胞を培養し、その結果、前記ヒト多能性幹細胞がアストロサイト様細胞に分化する工程（Ｂ）を含む、アストロサイト様細胞の製造方法。
  2. 　前記工程（Ｂ）において、前記ヒト多能性幹細胞を、多能性幹細胞培養用培地又は神経細胞培養用培地中で培養する、請求項１に記載のアストロサイト様細胞の製造方法。
  3. 　前記工程（Ａ）が、前記転写因子をコードする核酸を含むベクターを、前記ヒト多能性幹細胞に導入することにより行われる、請求項１又は２に記載のアストロサイト様細胞の製造方法。
  4. 　前記工程（Ａ）が、テトラサイクリン応答因子の制御下に前記転写因子をコードする核酸を含むベクターが導入された前記ヒト多能性幹細胞の培地に、テトラサイクリン系抗生物質を添加又は除去することにより行われる、請求項１又は２に記載のアストロサイト様細胞の製造方法。
  5. 　前記ベクターが、下記式（１）で表される塩基配列からなる核酸を含む、請求項３又は４に記載のアストロサイト様細胞の製造方法。
    　Ｆ１－Ｓ１－Ｆ２－Ｓ２－Ｆ３　…（１）
    ［式（１）中、Ｆ１、Ｆ２及びＦ３は、順不同で、ＳＯＸ９をコードする塩基配列、ＮＦＩＡをコードする塩基配列及びＮＦＩＢをコードする塩基配列を表し、Ｓ１及びＳ２は、セパレーター塩基配列を表す。］
  6. 　前記ベクターが、トランスポゾンベクターである、請求項３～５のいずれか一項に記載のアストロサイト様細胞の製造方法。
  7. 　前記工程（Ｂ）において、前記ヒト多能性幹細胞中の、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ及びＮＦＩＢの存在量が、モル比で１：１：１である、請求項１～６のいずれか一項に記載のアストロサイト様細胞の製造方法。
  8. 　前記ヒト多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載のアストロサイト様細胞の製造方法。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の製造方法により製造された、アストロサイト様細胞。
  10. 　請求項９に記載のアストロサイト様細胞及び神経様細胞の共培養物。
  11. 　塩基性繊維芽細胞増殖因子を含む培地、又は
    　脳由来神経栄養因子、グリア細胞株由来神経栄養因子、ニューロトロフィン３及びジブチリル環状ＡＭＰからなる群より選択される少なくとも１つの因子を含有する培地の、
    　アストロサイト様細胞の製造のための使用。
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