JP2023515174A - 網膜色素上皮細胞の製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＲＰＥ細胞の製造方法、該方法により製造されたＲＰＥ細胞、および該方法に適したＲＰＥ細胞を製造するための試薬を提供することを目的とする。本発明の方法は、以下の工程：外因性因子として、ＭＩＴＦ（小眼球症関連転写因子）遺伝子またはその発現産物、ＯＴＸ２（オルトデンティクルホメオボックス２）遺伝子またはその発現産物、ＬＩＮ２８遺伝子またはその発現産物、およびＬ－ＭＹＣ遺伝子またはその発現産物を哺乳類の体細胞に導入する工程を含む。【選択図】なし
Description
本発明は、網膜色素上皮細胞の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、ダイレクトコンバージョン（ダイレクト・リプログラミング）による網膜色素上皮細胞の製造方法、および体細胞を網膜色素上皮細胞に変換するための試薬等に関する。
ｉＰＳ細胞から網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を製造し、それを滲出型加齢黄斑変性の患者に投与することを含む治療法は、約６ヶ月の培養期間が必要であり、非常に費用がかかる。ｉＰＳ細胞のためにｉＰＳストックを使用することが現実的であり、その場合、同種移植が行われる。培養期間を短縮してコストを削減し、特に自家移植を必要とする患者を治療できる方法が必要である。
線維芽細胞で複数の転写因子を強制的に発現させることによるＲＰＥ様細胞の製造方法が報告されている（特許文献１、非特許文献１）。前者では１０種類の転写因子から、および後者では８種類の転写因子から選択される、少なくとも４種類の転写因子を過剰発現させることによって、ＲＰＥ様細胞が製造される。しかしながら、安定した細胞株は、確立されていない。各組合せは、本発明のものとは異なる。
線維芽細胞で複数の転写因子を強制的に発現させることによるＲＰＥ様細胞の製造方法が報告されている（特許文献１、非特許文献１）。前者では１０種類の転写因子から、および後者では８種類の転写因子から選択される、少なくとも４種類の転写因子を過剰発現させることによって、ＲＰＥ様細胞が製造される。しかしながら、安定した細胞株は、確立されていない。各組合せは、本発明のものとは異なる。
Zhang, Protein Cell 2014, 5(1): 48-58
本発明は、ＲＰＥ細胞の移植が有効である患者、例えば滲出型加齢黄斑変性の患者に対して自家移植が可能なＲＰＥ細胞を製造する方法、該方法により製造されたＲＰＥ細胞、および該方法に適したＲＰＥ細胞を製造するための試薬（例えば、ベクター）を提供することを目的とする。
上記課題に鑑み、本発明者らは、これまでの知見に基づいて鋭意検討を行った。具体的には、本発明者らは、体細胞からＲＰＥ細胞をダイレクトコンバージョン（ダイレクト・リプログラミング）技術によって製造することを試みた。ダイレクトリプログラミングは、標的細胞の分化段階で重要な役割を果たす転写因子をコードする遺伝子、または体細胞のリプログラミングを促進する遺伝子を形質導入することによって達成することができる。本発明者らは、いくつかの遺伝子を導入することによって、体細胞をＲＰＥ細胞に直接変換できることを見出し、その変換の条件を確立し、得られた直接変換されたＲＰＥ細胞の表現型および機能を解析し、本発明を完成するに至った。
従って本発明は、以下のものを提供する。
（１）外因性因子として、
ＭＩＴＦ（小眼球症関連転写因子）遺伝子またはその発現産物、
ＯＴＸ２（オルトデンティクルホメオボックス２（Orthodenticle homeobox 2））遺伝子またはその発現産物、
ＬＩＮ２８遺伝子またはその発現産物、および
Ｌ－ＭＹＣ遺伝子またはその発現産物
を哺乳類の体細胞に導入する工程を含む、網膜色素上皮細胞の製造方法。
（２）外因性因子としてＣＲＸ（錐体－杆体ホメオボックス（cone-rod homeobox））遺伝子またはその発現産物を導入する工程をさらに含む、上記（１）の方法。
（３）体細胞中の導入された外因性因子を過剰発現させてゲノム可塑性を生じさせる期間（フェーズ１）、体細胞アイデンティティ（somatic cell identity）をＲＰＥ細胞に変換する期間（フェーズ２）、および変換されたＲＰＥ細胞を成熟させる期間（フェーズ３）の３段階（フェーズ）を含む、上記（１）または（２）の方法。
（４）フェーズ１でｂＦＧＦおよび２－ＭＥを含む培地を使用することを含む、上記（３）の方法。
（５）フェーズ２の一部の期間でケトミンおよびニコチンアミドを含む培地を使用することを含む、上記（３）の方法。
（６）フェーズ３でＳＢ４３１５４２およびｂＦＧＦを含む培地を使用することを含む、上記（３）の方法。
（７）体細胞がヒト線維芽細胞である、上記（１）～（６）のいずれかの方法。
（８）上記（１）～（７）のいずれかの方法により製造されたＲＰＥ細胞。
（９）哺乳類の体細胞に由来し、且つ外因性因子として、
ＭＩＴＦ遺伝子またはその発現産物、
ＯＴＸ２遺伝子またはその発現産物、
ＬＩＮ２８遺伝子またはその発現産物、および
Ｌ－ＭＹＣ遺伝子またはその発現産物
を含むＲＰＥ細胞。
（１０）外因性因子としてＣＲＸ遺伝子またはその発現産物をさらに含む、上記（９）の細胞。
（１１）体細胞がヒト線維芽細胞である、上記（９）または（１０）の細胞。
（１２）ＭＩＴＦ遺伝子またはその発現産物、
ＯＴＸ２遺伝子またはその発現産物、
ＬＩＮ２８遺伝子またはその発現産物、および
Ｌ－ＭＹＣ遺伝子またはその発現産物
を含む、体細胞から網膜色素上皮細胞を直接製造するための試薬。
（１３）ＣＲＸ遺伝子またはその発現産物をさらに含む、上記（１２）の試薬。
（１４）体細胞がヒト線維芽細胞である、上記（１２）または（１３）の試薬。
従って本発明は、以下のものを提供する。
（１）外因性因子として、
ＭＩＴＦ（小眼球症関連転写因子）遺伝子またはその発現産物、
ＯＴＸ２（オルトデンティクルホメオボックス２（Orthodenticle homeobox 2））遺伝子またはその発現産物、
ＬＩＮ２８遺伝子またはその発現産物、および
Ｌ－ＭＹＣ遺伝子またはその発現産物
を哺乳類の体細胞に導入する工程を含む、網膜色素上皮細胞の製造方法。
（２）外因性因子としてＣＲＸ（錐体－杆体ホメオボックス（cone-rod homeobox））遺伝子またはその発現産物を導入する工程をさらに含む、上記（１）の方法。
（３）体細胞中の導入された外因性因子を過剰発現させてゲノム可塑性を生じさせる期間（フェーズ１）、体細胞アイデンティティ（somatic cell identity）をＲＰＥ細胞に変換する期間（フェーズ２）、および変換されたＲＰＥ細胞を成熟させる期間（フェーズ３）の３段階（フェーズ）を含む、上記（１）または（２）の方法。
（４）フェーズ１でｂＦＧＦおよび２－ＭＥを含む培地を使用することを含む、上記（３）の方法。
（５）フェーズ２の一部の期間でケトミンおよびニコチンアミドを含む培地を使用することを含む、上記（３）の方法。
（６）フェーズ３でＳＢ４３１５４２およびｂＦＧＦを含む培地を使用することを含む、上記（３）の方法。
（７）体細胞がヒト線維芽細胞である、上記（１）～（６）のいずれかの方法。
（８）上記（１）～（７）のいずれかの方法により製造されたＲＰＥ細胞。
（９）哺乳類の体細胞に由来し、且つ外因性因子として、
ＭＩＴＦ遺伝子またはその発現産物、
ＯＴＸ２遺伝子またはその発現産物、
ＬＩＮ２８遺伝子またはその発現産物、および
Ｌ－ＭＹＣ遺伝子またはその発現産物
を含むＲＰＥ細胞。
（１０）外因性因子としてＣＲＸ遺伝子またはその発現産物をさらに含む、上記（９）の細胞。
（１１）体細胞がヒト線維芽細胞である、上記（９）または（１０）の細胞。
（１２）ＭＩＴＦ遺伝子またはその発現産物、
ＯＴＸ２遺伝子またはその発現産物、
ＬＩＮ２８遺伝子またはその発現産物、および
Ｌ－ＭＹＣ遺伝子またはその発現産物
を含む、体細胞から網膜色素上皮細胞を直接製造するための試薬。
（１３）ＣＲＸ遺伝子またはその発現産物をさらに含む、上記（１２）の試薬。
（１４）体細胞がヒト線維芽細胞である、上記（１２）または（１３）の試薬。
患者特異的な網膜色素上皮（ＲＰＥ）を生成するための現在の最先端のアプローチは、その体細胞を多能性幹（ｉＰＳ）細胞に誘導することである。当業者は、それらのｉＰＳ細胞を増幅および品質を確認し、次いでそれらのｉＰＳ細胞をＲＰＥ細胞に分化させなければならず、これは、１８０日を超える細胞培養が必要であり、これは実用的な医療にとって法外に高価である。本発明が提案する技術は、体細胞ドナー細胞を、２～３週間以内でＲＰＥ様アイデンティティ（RPE-like identity）を有する細胞に、および４０～６０日以内で十分に安定な初期ＲＰＥ細胞に急速に変化させることによって、体細胞からＲＰＥ細胞への移行期間を劇的に減らす。
本発明は、特殊な細胞培地条件および重要な転写因子の過剰発現を利用して、皮膚または血液等の入手しやすい患者細胞からＲＰＥ細胞を迅速および効率的に生成する。医療または研究のための患者特異的な細胞のコストは、毎日必要とされる労力および材料にほぼ完全に由来するものであり、患者特異的なＲＰＥ細胞の現在の最先端の製造は、患者または科学者にとって費用効果的でない。本発明は、患者特異的な自家ＲＰＥ細胞のコストを劇的に削減し、通常の医療および研究用途のための現実的な細胞製品を可能にする。
本発明を、現在の最先端のｉＰＳ細胞技術で誘導されたＲＰＥと比較する（図１）。
本発明は、特殊な細胞培地条件および重要な転写因子の過剰発現を利用して、皮膚または血液等の入手しやすい患者細胞からＲＰＥ細胞を迅速および効率的に生成する。医療または研究のための患者特異的な細胞のコストは、毎日必要とされる労力および材料にほぼ完全に由来するものであり、患者特異的なＲＰＥ細胞の現在の最先端の製造は、患者または科学者にとって費用効果的でない。本発明は、患者特異的な自家ＲＰＥ細胞のコストを劇的に削減し、通常の医療および研究用途のための現実的な細胞製品を可能にする。
本発明を、現在の最先端のｉＰＳ細胞技術で誘導されたＲＰＥと比較する（図１）。
本発明を以下で説明する。特に示さない限り、本明細書で使用される用語は、該分野で一般的に使用される意味を有する。
本発明は、哺乳類の分化した体細胞をＲＰＥ細胞に変換することによる網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の製造方法に関する。「変換する」とは、体細胞を所望のＲＰＥ細胞に変えることを意味する。本発明の方法の特徴の１つは、ｉＰＳ細胞の製造に代表される細胞を完全にリプログラムする工程が無い、「ダイレクトリプログラミング」または「ダイレクトコンバージョン（direct conversion）」と呼ばれる、体細胞をＲＰＥ細胞に変換する方法である。
ＲＰＥ細胞への誘導は、理論的にはインビトロおよびインビボの両方で行うことができる。
ＲＰＥ細胞
本発明における「網膜色素上皮細胞」とは、網膜色素上皮を構成する上皮細胞およびその前駆細胞をいう。網膜色素上皮細胞であるか否かは、例えば、細胞マーカー（ＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、ＭＥＲＴＫ、ＢＥＳＴ１等）の発現、細胞形態（細胞内メラニン色素沈着、多角形および扁平細胞形態、多角形アクチン束の形成等）等により確認することができる。網膜色素上皮細胞の前駆細胞とは、網膜細胞に分化するように誘導されることを指示される細胞を意味し、前駆細胞であるか否かは、細胞マーカー（Ｍｉｔｆ、Ｐａｘ６、Ｒｘ、Ｃｒｘ等）の発現等によって確認することができる。これらの機能評価および確認操作は、適切な条件を設定することによって当業者が行うことができる。
本発明によって誘導および調製されるＲＰＥ細胞は、誘導ＲＰＥ細胞（ｉＲＰＥ細胞）とも呼ばれる。
本発明における「網膜色素上皮細胞」とは、網膜色素上皮を構成する上皮細胞およびその前駆細胞をいう。網膜色素上皮細胞であるか否かは、例えば、細胞マーカー（ＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、ＭＥＲＴＫ、ＢＥＳＴ１等）の発現、細胞形態（細胞内メラニン色素沈着、多角形および扁平細胞形態、多角形アクチン束の形成等）等により確認することができる。網膜色素上皮細胞の前駆細胞とは、網膜細胞に分化するように誘導されることを指示される細胞を意味し、前駆細胞であるか否かは、細胞マーカー（Ｍｉｔｆ、Ｐａｘ６、Ｒｘ、Ｃｒｘ等）の発現等によって確認することができる。これらの機能評価および確認操作は、適切な条件を設定することによって当業者が行うことができる。
本発明によって誘導および調製されるＲＰＥ細胞は、誘導ＲＰＥ細胞（ｉＲＰＥ細胞）とも呼ばれる。
体細胞
本発明においてダイレクトリプログラミングの標的となる体細胞は、ＲＰＥ細胞が誘導され得るものである限り、特に限定されず、哺乳類に由来することができる。ｉＲＰＥ細胞を生体に移植する場合、感染、拒絶反応等のリスクを低減するために、移植を受ける被検体由来の体細胞（自家細胞）が、好ましくは使用される。しかしながら、目的に応じて、自家細胞ではなく、他人または他の動物の体細胞から予め調製されたＲＰＥ細胞を移植に使用することができる。
本発明においてダイレクトリプログラミングの標的となる体細胞は、ＲＰＥ細胞が誘導され得るものである限り、特に限定されず、哺乳類に由来することができる。ｉＲＰＥ細胞を生体に移植する場合、感染、拒絶反応等のリスクを低減するために、移植を受ける被検体由来の体細胞（自家細胞）が、好ましくは使用される。しかしながら、目的に応じて、自家細胞ではなく、他人または他の動物の体細胞から予め調製されたＲＰＥ細胞を移植に使用することができる。
本明細書において、哺乳類の例としては、マウス、ラット、ハムスター、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ等が挙げられ、特にヒトである。
体細胞としては、生体から容易に採取できる体細胞を使用することができる。その例としては、線維芽細胞、ケラチノサイト、口腔粘膜上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞、呼吸器粘膜上皮細胞、胃粘膜上皮細胞、腸粘膜上皮細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、歯肉細胞（歯肉線維芽細胞および歯肉上皮細胞）、歯髄細胞、歯周靭帯細胞、骨髄細胞、骨髄由来間質細胞、白血球、リンパ球、結膜上皮細胞、および破骨細胞が挙げられ、好ましくは線維芽細胞、ケラチノサイト、口腔粘膜上皮細胞、歯肉細胞、白血球、およびリンパ球である。本発明において、生体から採取した上記細胞が、好ましくは使用される。
遺伝子またはその発現産物
本発明の方法では、外因性因子として、ＭＩＴＦ（小眼球症関連転写因子）遺伝子またはその発現産物、ＯＴＸ２（オルトデンティクルホメオボックス２）遺伝子またはその発現産物、ＬＩＮ２８遺伝子またはその発現産物、およびＬ－ＭＹＣ遺伝子またはその発現産物を、体細胞に導入する。所望により、外因性因子としてＣＲＸ（椎体－杆体ホメオボックス）遺伝子またはその発現産物を導入することができ、コロニー形成効率の観点からは、その導入が好ましい。本明細書で使用される「発現産物」は、例えば、ＭＩＴＦ遺伝子、ＯＴＸ２遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子、Ｌ－ＭＹＣ遺伝子またはＣＲＸ遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質である。
本発明の方法では、外因性因子として、ＭＩＴＦ（小眼球症関連転写因子）遺伝子またはその発現産物、ＯＴＸ２（オルトデンティクルホメオボックス２）遺伝子またはその発現産物、ＬＩＮ２８遺伝子またはその発現産物、およびＬ－ＭＹＣ遺伝子またはその発現産物を、体細胞に導入する。所望により、外因性因子としてＣＲＸ（椎体－杆体ホメオボックス）遺伝子またはその発現産物を導入することができ、コロニー形成効率の観点からは、その導入が好ましい。本明細書で使用される「発現産物」は、例えば、ＭＩＴＦ遺伝子、ＯＴＸ２遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子、Ｌ－ＭＹＣ遺伝子またはＣＲＸ遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質である。
上記遺伝子の全ては、脊椎動物において高度に保存されている。本明細書において、特定の動物名が記載されていない限り、それらは相同体を含む遺伝子を指す。遺伝子としては、野生型遺伝子産物のものと同等の機能を有する遺伝子が（該遺伝子が多型等の変異を含む場合でも）、さらに挙げられる。
例えば、ヒト（ホモサピエンス）ＭＩＴＦ遺伝子、ＯＴＸ２遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子、Ｌ－ＭＹＣ（ＭＹＣＬ）遺伝子、ＣＲＸ遺伝子のヌクレオチド配列、およびこれらの配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、アメリカ国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information、ＮＣＢＩ）によって提供される GenBank で登録されている。実施形態として、以下の受入番号が例示される（複数の改訂が登録されている場合、各番号は最新の改訂を指すことが理解されるべきである）：
ヒトＭＩＴＦ遺伝子：例えば、AB006909.1、
ヒトＭＩＴＦタンパク質：例えば、BAA32288.1、
ヒトＯＴＸ２遺伝子：例えば、NM_021728.4、
ヒトＯＴＸ２タンパク質：例えば、NP_068374.1、
ヒトＬＩＮ２８遺伝子：例えば、NM_024674.6、
ヒトＬＩＮ２８タンパク質：例えば、NP_078950.1、
ヒトＬ－ＭＹＣ遺伝子：例えば、NM_001033081.3、
ヒトＬ－ＭＹＣタンパク質：例えば、NP_001028253.1、
ヒトＣＲＸ遺伝子：例えば、NM_000554.6、
ヒトＣＲＸタンパク質：例えば、NP_000545.1。
他の配列が、それぞれ同一または同様の機能遺伝子および／またはタンパク質に対応する限り、他の配列を使用できることは明らかである。
ヒトＭＩＴＦ遺伝子：例えば、AB006909.1、
ヒトＭＩＴＦタンパク質：例えば、BAA32288.1、
ヒトＯＴＸ２遺伝子：例えば、NM_021728.4、
ヒトＯＴＸ２タンパク質：例えば、NP_068374.1、
ヒトＬＩＮ２８遺伝子：例えば、NM_024674.6、
ヒトＬＩＮ２８タンパク質：例えば、NP_078950.1、
ヒトＬ－ＭＹＣ遺伝子：例えば、NM_001033081.3、
ヒトＬ－ＭＹＣタンパク質：例えば、NP_001028253.1、
ヒトＣＲＸ遺伝子：例えば、NM_000554.6、
ヒトＣＲＸタンパク質：例えば、NP_000545.1。
他の配列が、それぞれ同一または同様の機能遺伝子および／またはタンパク質に対応する限り、他の配列を使用できることは明らかである。
導入
本発明の方法は、特定の遺伝子が選択されること以外は、公知のリプログラミング法に従って行うことができる。具体的には、外因性因子として所望の遺伝子（以下、単に所望の遺伝子ともいう）を導入し、標的の体細胞内で発現させる。
遺伝子を導入する方法としては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはセンダイウイルスベクター等のウイルスベクターでの感染を伴う方法；並びに、遺伝子およびその発現産物を導入する場合には、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー等の非ウイルスベクターまたはエレクトロポレーションによる、プラスミドベクター、エピソームベクター、または遺伝子発現産物（ｍＲＮＡ、タンパク質）でのトランスフェクションを伴う方法も使用することができる。あるいはｍＲＮＡを導入することもできる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（ＣＲＩＳＰＲ標的トランス活性化）等のゲノム編集技術も利用することができる。
本発明の方法は、特定の遺伝子が選択されること以外は、公知のリプログラミング法に従って行うことができる。具体的には、外因性因子として所望の遺伝子（以下、単に所望の遺伝子ともいう）を導入し、標的の体細胞内で発現させる。
遺伝子を導入する方法としては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはセンダイウイルスベクター等のウイルスベクターでの感染を伴う方法；並びに、遺伝子およびその発現産物を導入する場合には、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー等の非ウイルスベクターまたはエレクトロポレーションによる、プラスミドベクター、エピソームベクター、または遺伝子発現産物（ｍＲＮＡ、タンパク質）でのトランスフェクションを伴う方法も使用することができる。あるいはｍＲＮＡを導入することもできる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（ＣＲＩＳＰＲ標的トランス活性化）等のゲノム編集技術も利用することができる。
好ましい一実施形態は、外部刺激に応答して期間特異的な方法で所望の遺伝子の発現を制御するように設計された発現カセットを導入する方法である。そのような発現カセットは、外部刺激に応答して下流で遺伝子の発現を誘導することができるプロモーターと、該プロモーターによって発現が制御される所望の遺伝子とを少なくとも含有する核酸構築物である。
プロモーターは、外部刺激に応答して下流で遺伝子の発現を誘導することができるプロモーターである限り、特に限定されない。その例としては、外部刺激がテトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ドキシサイクリン等のテトラサイクリン誘導体）の存在である場合、テトラサイクリン系抗生物質とテトラサイクリントランスアクチベーターとの複合体の結合によって下流で遺伝子の発現を誘導することができるプロモーターが挙げられる。
発現カセットは、必要に応じて、エンハンサー、サイレンサー、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子）、ＳＶ４０複製起点等を含有することができる。
従って、外部刺激には、薬物の存在下または非存在下での培養が含まれる。例えば、所望の遺伝子の発現は、ドキシサイクリンの存在下で、およびドキシサイクリン発現誘導システム（例えば、ドキシサイクリン発現誘導システム）を使用して制御される。
ドキシサイクリン発現誘導システムは、市販品（例えば、タカラ、クロンテック等）でもよく、公知文献に記載の方法によって製造してもよい。
上記発現カセットを体細胞に導入する方法は、特に限定されず、公知の方法を適宜選択および使用することができる。例えば、上記発現カセットを、適切な発現ベクターに挿入し、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等のウイルスベクターを使用するウイルス感染、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法等の公知の形質転換法によって導入することができる。
発現ベクターの例としては、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター、および動物細胞発現プラスミドが挙げられる。導入効率の観点から、レンチウイルスが好ましい。
上記外部刺激について、当業者は、利用する前記プロモーターの種類等を考慮して、および添加時期を考慮して、加える刺激の量（レベル）を適宜調整することができる。例えば、外部刺激がドキシサイクリンの存在である場合、ドキシサイクリンの好ましい添加濃度は、０．１～２μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５～１μｇ／ｍｌである。一実施形態において、該添加量は、フェーズ１およびフェーズ２で１μｇ／ｍｌであり、次いでフェーズ３で０．５μｇ／ｍｌに一時的に減少し、そこで直ぐに完全に除去される。
ドキシサイクリン等の外部刺激は、所望の遺伝子が導入された体細胞内に、所望の遺伝子導入後６０日間、好ましくは少なくとも５０日間存在してもよい。その結果、体細胞は、ＲＰＥ細胞に誘導され、フェーズ３で成熟することができる。
培養
本発明の方法において、哺乳類の分化した体細胞は、遺伝子の導入後に培地中で培養することができる。例えば、ＲＰＥがインビトロで誘導（調製）されることは、好ましい実施形態である。
本発明の方法において、哺乳類の分化した体細胞は、遺伝子の導入後に培地中で培養することができる。例えば、ＲＰＥがインビトロで誘導（調製）されることは、好ましい実施形態である。
培養は、細胞および培地の保管に適した容器内で行うことができる。接着培養の場合、細胞接着培養容器、例えば、細胞外マトリックス等（例えば、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチン、iMatrix511（製品名））でコーティング処理した後の培養容器が、好ましく使用される。培養温度、ＣＯ２濃度、およびＯ２濃度等の接着培養の培養条件を適宜決定することができる。この場合、細胞を、血清、公知の増殖因子、並びに増殖を促進する添加剤および化学物質の存在下で培養することができる。公知の増殖因子の例としては、ＥＧＦ、ＦＧＦ等が挙げられる。増殖を促進する添加剤の例としては、Ｎ２サプリメント（Invitrogen）、Ｂ２７サプリメント（Invitrogen）等が挙げられる。
培養の期間は、本発明の効果が損なわれない限り、特に限定されない。例えば、必要に応じて、約３０日間、または４０日間、または５０日間、または６０日間、または７０日間に設定することができる。必要に応じて、培地を交換することができ、段階に応じて適宜調整された成分を有する培地に交換することが好ましい（以下の「培地」参照）。
培地
本発明の方法で使用される培地は、特に限定されない。ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＥＭＥＭ（イーグル最小必須培地）、αＭＥＭ（アルファ改変最小必須培地）、ハムＦ－１２（栄養混合物Ｆ－１２ハム）等の通常の液体培地を使用することができる。必要に応じて、血清成分（ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト血清（ＨＳ））、血清代替品（ＳＲ）、ストレプトマイシンおよびペニシリン等の抗生物質、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、および同様の成分を添加することができる。
本発明の方法で使用される培地は、特に限定されない。ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＥＭＥＭ（イーグル最小必須培地）、αＭＥＭ（アルファ改変最小必須培地）、ハムＦ－１２（栄養混合物Ｆ－１２ハム）等の通常の液体培地を使用することができる。必要に応じて、血清成分（ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト血清（ＨＳ））、血清代替品（ＳＲ）、ストレプトマイシンおよびペニシリン等の抗生物質、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、および同様の成分を添加することができる。
本発明の方法によるＲＰＥ細胞の高い製造効率を考慮すると、ＲＰＥ細胞の製造プロセスを、３段階（フェーズ１、フェーズ２、フェーズ３）に分け、各フェーズに適した培地を用いることが好ましい（図３参照）。これらの培地を、便宜上、フェーズ１培地、フェーズ２培地、およびフェーズ３培地と呼ぶことがある。
フェーズ１培地は、体細胞中の導入された所望の遺伝子の過剰発現期間に使用される培地であり、典型的には遺伝子導入後８～１０日間使用される。初期の細胞増殖を持続させる観点から、該培地は、好ましくはｂＦＧＦおよび２－ＭＥを含有する。ｂＦＧＦの好ましい添加濃度は１～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌである。２－ＭＥの好ましい添加濃度は、１０～１００μＭ、より好ましくは約５５μＭである。
フェーズ２培地は、フェーズ１の後に所望の遺伝子が導入された細胞からＲＰＥ細胞への変換期間に使用される培地であり、典型的にはフェーズ１後に３４～３８日間使用される。該培地は、望ましくない細胞を排除することができるように、好ましくはケトミンおよびニコチンアミドを含有する。ケトミンの好ましい添加濃度は、１０～１００ｎＭ、より好ましくは４０～８０ｎＭである。ニコチンアミドの好ましい添加濃度は、１～５０ｍＭ、より好ましくは５～１０ｍＭである。
フェーズ３培地は、フェーズ２後の変換されたＲＰＥ細胞の成熟期間に使用される培地であり、典型的にはフェーズ２後に７～１２日間使用される。一般的なＲＰＥ細胞成熟材料の観点から、該培地は、好ましくはＳＢ４３１５４２およびｂＦＧＦを含有する。ＳＢ４３１５４２の好ましい添加濃度は、０．５～１μＭ、より好ましくは約０．５μＭである。ｂＦＧＦの好ましい添加濃度は、１～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌである。
フェーズ１培地は、体細胞中の導入された所望の遺伝子の過剰発現期間に使用される培地であり、典型的には遺伝子導入後８～１０日間使用される。初期の細胞増殖を持続させる観点から、該培地は、好ましくはｂＦＧＦおよび２－ＭＥを含有する。ｂＦＧＦの好ましい添加濃度は１～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌである。２－ＭＥの好ましい添加濃度は、１０～１００μＭ、より好ましくは約５５μＭである。
フェーズ２培地は、フェーズ１の後に所望の遺伝子が導入された細胞からＲＰＥ細胞への変換期間に使用される培地であり、典型的にはフェーズ１後に３４～３８日間使用される。該培地は、望ましくない細胞を排除することができるように、好ましくはケトミンおよびニコチンアミドを含有する。ケトミンの好ましい添加濃度は、１０～１００ｎＭ、より好ましくは４０～８０ｎＭである。ニコチンアミドの好ましい添加濃度は、１～５０ｍＭ、より好ましくは５～１０ｍＭである。
フェーズ３培地は、フェーズ２後の変換されたＲＰＥ細胞の成熟期間に使用される培地であり、典型的にはフェーズ２後に７～１２日間使用される。一般的なＲＰＥ細胞成熟材料の観点から、該培地は、好ましくはＳＢ４３１５４２およびｂＦＧＦを含有する。ＳＢ４３１５４２の好ましい添加濃度は、０．５～１μＭ、より好ましくは約０．５μＭである。ｂＦＧＦの好ましい添加濃度は、１～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌである。
製造（誘導）
そうして、ＲＰＥ細胞が体細胞から製造される。細胞が網膜色素上皮細胞であるか否かは、例えば細胞マーカー（ＲＰＥ６５、Ｍｉｔｆ等）の発現、メラニン顆粒の存在、多角形の特徴的な細胞形態等に基づいて、当業者によって確認することができる。
そうして、ＲＰＥ細胞が体細胞から製造される。細胞が網膜色素上皮細胞であるか否かは、例えば細胞マーカー（ＲＰＥ６５、Ｍｉｔｆ等）の発現、メラニン顆粒の存在、多角形の特徴的な細胞形態等に基づいて、当業者によって確認することができる。
誘導ＲＰＥ細胞（ｉＲＰＥ細胞）は、外因性のＭＩＴＦ遺伝子、ＯＴＸ２遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子およびＬ－ＭＹＣ遺伝子を、（好ましくはＣＲＸ遺伝子も）含有する。本明細書で使用される「外因性」という用語は、主に上記の導入手段によって導入され、および天然の態様とは異なる、遺伝子またはその発現産物の態様を意味する。
ｉＲＰＥ細胞は、ｉＲＰＥ細胞以外の細胞（例えば、元の体細胞）との混合物として得ることができる。この場合、必要に応じてｉＲＰＥ細胞をｉＲＰＥ細胞以外の細胞から分離することができる。分離手段は、特に限定されない。例えば、それらは、セルソーターまたは磁気ビーズを使用して分離することができる。
本発明によって製造されるｉＲＰＥ細胞は、体内の網膜色素上皮細胞のものと極めて類似した特徴を有する。従って、それを、網膜細胞の障害による疾患の治療薬のスクリーニング、または細胞治療のための移植材料、疾患の研究のための材料、または他の病因による細胞損傷の治療薬のための創薬材料のために使用することもできる。加えて、それらを、光毒性等の毒性の研究、化学物質等の毒性および薬効評価における毒性試験等に利用することができる。
網膜細胞の障害による疾患の例としては、有機水銀中毒、クロロキン網膜症、網膜色素変性、加齢黄斑変性、緑内障、糖尿病性網膜症、新生児網膜症等が挙げられる。
本発明によって製造されるｉＲＰＥ細胞は、移植用の網膜色素上皮細胞として使用することができ、これは、細胞損傷状態にある損傷細胞や障害組織自体を補うため（例えば、移植手術に使用される）等に使用される。
網膜細胞の障害による疾患の例としては、有機水銀中毒、クロロキン網膜症、網膜色素変性、加齢黄斑変性、緑内障、糖尿病性網膜症、新生児網膜症等が挙げられる。
本発明によって製造されるｉＲＰＥ細胞は、移植用の網膜色素上皮細胞として使用することができ、これは、細胞損傷状態にある損傷細胞や障害組織自体を補うため（例えば、移植手術に使用される）等に使用される。
試薬
上述したように、ＲＰＥ細胞は、外因性因子として、ＭＩＴＦ遺伝子またはその発現産物、ＯＴＸ２遺伝子またはその発現産物、ＬＩＮ２８遺伝子またはその発現産物、およびＬ－ＭＹＣ遺伝子またはその発現産物、並びに好ましくは、それらに加えてＣＲＸ遺伝子またはその発現産物を体細胞に導入することによって誘導することができる。従って、本発明はさらに、体細胞からＲＰＥ細胞を製造するための試薬であって、ＭＩＴＦ遺伝子またはその発現産物、ＯＴＸ２遺伝子またはその発現産物、ＬＩＮ２８遺伝子またはその発現産物、およびＬ－ＭＹＣ遺伝子またはその発現産物、並びに好ましくは、それらに加えてＣＲＸ遺伝子またはその発現産物を含有する試薬を提供する。ここで体細胞は、好ましくは線維芽細胞である。
試薬は、具体的には、上記遺伝子を体細胞に導入できる形態として、上記遺伝子が組み込まれたベクターを含む。上記遺伝子は、それぞれ異なるベクターに組み込まれていてもよく、２種またはそれ以上の遺伝子が１つのベクターに同時に組み込まれていてもよい。
使用することができるベクターの種類等は上述の通りである。
本発明を、実施例を参照することによって、以下で詳細に説明するが、限定的に解釈されるべきではない。使用する試薬および材料は、特に限定されない限り、商業的に入手可能である。
上述したように、ＲＰＥ細胞は、外因性因子として、ＭＩＴＦ遺伝子またはその発現産物、ＯＴＸ２遺伝子またはその発現産物、ＬＩＮ２８遺伝子またはその発現産物、およびＬ－ＭＹＣ遺伝子またはその発現産物、並びに好ましくは、それらに加えてＣＲＸ遺伝子またはその発現産物を体細胞に導入することによって誘導することができる。従って、本発明はさらに、体細胞からＲＰＥ細胞を製造するための試薬であって、ＭＩＴＦ遺伝子またはその発現産物、ＯＴＸ２遺伝子またはその発現産物、ＬＩＮ２８遺伝子またはその発現産物、およびＬ－ＭＹＣ遺伝子またはその発現産物、並びに好ましくは、それらに加えてＣＲＸ遺伝子またはその発現産物を含有する試薬を提供する。ここで体細胞は、好ましくは線維芽細胞である。
試薬は、具体的には、上記遺伝子を体細胞に導入できる形態として、上記遺伝子が組み込まれたベクターを含む。上記遺伝子は、それぞれ異なるベクターに組み込まれていてもよく、２種またはそれ以上の遺伝子が１つのベクターに同時に組み込まれていてもよい。
使用することができるベクターの種類等は上述の通りである。
本発明を、実施例を参照することによって、以下で詳細に説明するが、限定的に解釈されるべきではない。使用する試薬および材料は、特に限定されない限り、商業的に入手可能である。
実施例１；ＲＰＥ細胞の誘導
（フェーズ１）
ヒト体細胞（線維芽細胞；ATCC Cat#CRL2522）を培養し、リプログラミングが望まれるまで標準的な培地および方法で、培養および増殖した。リプログラミングの準備のために、線維芽細胞を、ＭＩＴＦ、ＯＴＸ２、ＬＩＮ２８、Ｌ－ＭＹＣ、およびＣＲＸのための、レンチウイルスｄｏｘ誘導性の条件的遺伝子発現システムおよびｄｏｘ誘導性のレンチウイルスで形質導入した。リプログラミングを開始するために、iMatrix511 でコートされた６ウェル（６Ｗ）プレートウェル上に１００～１５０×１０３細胞／ウェルで、線維芽細胞を播種した。翌日、リプログラミング培地フェーズ１（フェーズ１培地）を添加し、レンチウイルスｄｏｘ誘導性システムを用いてヒト外因性転写因子（ＭＩＴＦ、ＯＴＸ２、ＬＩＮ２８、Ｌ－ＭＹＣおよびＣＲＸ）を毎日過剰発現させた。リプログラミング因子の過剰発現は、ｉＲＰＥが安定するフェーズ３初期で徐々に除去されるまで維持された（図７）。フェーズ１培地を使用した培養を８～１０日間維持した。
（フェーズ１）
ヒト体細胞（線維芽細胞；ATCC Cat#CRL2522）を培養し、リプログラミングが望まれるまで標準的な培地および方法で、培養および増殖した。リプログラミングの準備のために、線維芽細胞を、ＭＩＴＦ、ＯＴＸ２、ＬＩＮ２８、Ｌ－ＭＹＣ、およびＣＲＸのための、レンチウイルスｄｏｘ誘導性の条件的遺伝子発現システムおよびｄｏｘ誘導性のレンチウイルスで形質導入した。リプログラミングを開始するために、iMatrix511 でコートされた６ウェル（６Ｗ）プレートウェル上に１００～１５０×１０３細胞／ウェルで、線維芽細胞を播種した。翌日、リプログラミング培地フェーズ１（フェーズ１培地）を添加し、レンチウイルスｄｏｘ誘導性システムを用いてヒト外因性転写因子（ＭＩＴＦ、ＯＴＸ２、ＬＩＮ２８、Ｌ－ＭＹＣおよびＣＲＸ）を毎日過剰発現させた。リプログラミング因子の過剰発現は、ｉＲＰＥが安定するフェーズ３初期で徐々に除去されるまで維持された（図７）。フェーズ１培地を使用した培養を８～１０日間維持した。
(フェーズ２)
次に、フェーズ２培地を隔日（２日ごと）に添加した。およそ２４～３２日目に、リプログラミングの各６Ｗプレートウェルを、iMatrix511 でコートされた６Ｗプレート上のフェーズ２培地に、４００～６００×１０３細胞／ウェルで、１つまたはそれ以上のウェル（典型的には２ウェル）に、大量に再播種した。あるいは１２ウェル（１２Ｗ）プレートを、２００～３００×１０３細胞／ウェルで使用することができる。あるいはｉＲＰＥコロニーを、個々の iMatrix511 でコートされた９６ウェル（９６Ｗ）プレートウェルに単離することができるが、バルク継代（bulk passage）が推奨される。
再播種後、さらに約１週間、フェーズ２培地でリプログラミングを継続した。次いで、ＲＰＥ細胞品質を改善するために、４０～８０ｎＭのケトミンおよび５～１０ｍＭのニコチンアミドでの任意処理を、６～１２日間追加することができ（図８）、またはフェーズ２培地を使用する培養を、同じ期間、隔日で継続することができる。
フェーズ２培地を使用する培養を、ケトミンおよびニコチンアミドの除去後、さらに２日間（培地交換１回）継続した。
次に、フェーズ２培地を隔日（２日ごと）に添加した。およそ２４～３２日目に、リプログラミングの各６Ｗプレートウェルを、iMatrix511 でコートされた６Ｗプレート上のフェーズ２培地に、４００～６００×１０３細胞／ウェルで、１つまたはそれ以上のウェル（典型的には２ウェル）に、大量に再播種した。あるいは１２ウェル（１２Ｗ）プレートを、２００～３００×１０３細胞／ウェルで使用することができる。あるいはｉＲＰＥコロニーを、個々の iMatrix511 でコートされた９６ウェル（９６Ｗ）プレートウェルに単離することができるが、バルク継代（bulk passage）が推奨される。
再播種後、さらに約１週間、フェーズ２培地でリプログラミングを継続した。次いで、ＲＰＥ細胞品質を改善するために、４０～８０ｎＭのケトミンおよび５～１０ｍＭのニコチンアミドでの任意処理を、６～１２日間追加することができ（図８）、またはフェーズ２培地を使用する培養を、同じ期間、隔日で継続することができる。
フェーズ２培地を使用する培養を、ケトミンおよびニコチンアミドの除去後、さらに２日間（培地交換１回）継続した。
（フェーズ３）
フェーズ３培地を隔日で添加し、ＲＰＥ様成熟を引き起こし、分極および色素沈着を増加させた。７～１２日間、外因性のＭＩＴＦ、ＯＴＸ２、ＬＩＮ２８、Ｌ－ＭＹＣおよびＣＲＸの過剰発現は、それらがもはや追加されなくなるまで、徐々に減少した。外因性のリプログラミングの消失、およびその後の培養というプロセスの間、ｉＲＰＥおよび望ましくない細胞の品質が明確になった（図７）。
フェーズ３培地を使用する培養を維持し、色素沈着細胞および／またはＢＥＳＴ１：：ＥＧＦＰレポーター（reproter）発現が継続している色素沈着細胞が、ＲＰＥ（ｉＲＰＥ）に安定的に誘導されたと考えられた。これらのリプログラムされ分化したｉＲＰＥ細胞を、次いで精製し、継代培養し、検査し、および標準的なＲＰＥ培養法で移植することができる。
ヒト包皮線維芽細胞のｉＲＰＥ細胞へのリプログラミングが経時的に観察された。ＲＰＥ関連遺伝ＲＰＥ６５およびＢＥＳＴ１、並びに密着結合を構成するＺＯ－１の発現を調べた。結果を図５に示す。
ＲＰＥ６５：マウス抗ＲＰＥ６５（Mouse-anti RPE65）、Millipore cat#MAB5428
ＢＥＳＴ１：ライブＢｅｓｔ１：：ＥＧＦＰトランスジェニックレポーター（Live Best1::EGFP Transgenic Reporter）
ＺＯ－１：ウサギ抗ＺＯ－１（Rabbit anti-ZO-1）、Invitrogen cat#61-7300
リプログラミング培地組成
フェーズ１培地：
フェーズ３培地を隔日で添加し、ＲＰＥ様成熟を引き起こし、分極および色素沈着を増加させた。７～１２日間、外因性のＭＩＴＦ、ＯＴＸ２、ＬＩＮ２８、Ｌ－ＭＹＣおよびＣＲＸの過剰発現は、それらがもはや追加されなくなるまで、徐々に減少した。外因性のリプログラミングの消失、およびその後の培養というプロセスの間、ｉＲＰＥおよび望ましくない細胞の品質が明確になった（図７）。
フェーズ３培地を使用する培養を維持し、色素沈着細胞および／またはＢＥＳＴ１：：ＥＧＦＰレポーター（reproter）発現が継続している色素沈着細胞が、ＲＰＥ（ｉＲＰＥ）に安定的に誘導されたと考えられた。これらのリプログラムされ分化したｉＲＰＥ細胞を、次いで精製し、継代培養し、検査し、および標準的なＲＰＥ培養法で移植することができる。
ヒト包皮線維芽細胞のｉＲＰＥ細胞へのリプログラミングが経時的に観察された。ＲＰＥ関連遺伝ＲＰＥ６５およびＢＥＳＴ１、並びに密着結合を構成するＺＯ－１の発現を調べた。結果を図５に示す。
ＲＰＥ６５：マウス抗ＲＰＥ６５（Mouse-anti RPE65）、Millipore cat#MAB5428
ＢＥＳＴ１：ライブＢｅｓｔ１：：ＥＧＦＰトランスジェニックレポーター（Live Best1::EGFP Transgenic Reporter）
ＺＯ－１：ウサギ抗ＺＯ－１（Rabbit anti-ZO-1）、Invitrogen cat#61-7300
リプログラミング培地組成
フェーズ１培地：
フェーズ２培地：
フェーズ３培地：
実施例２；ＲＰＥ細胞の誘導（ＣＲＸ）
実施例１と同様にして導入した、ＣＲＸ有りの外因性因子とＣＲＸ無しの外因性因子とを比較した。９日目に形成されたｉＲＰＥコロニーの、６ウェルプレート中のコロニー形成数（１ウェルあたり）を、リプログラミング遺伝子過剰発現のフェーズ１の終了時にカウントした。結果を下記表に示す。
実施例１と同様にして導入した、ＣＲＸ有りの外因性因子とＣＲＸ無しの外因性因子とを比較した。９日目に形成されたｉＲＰＥコロニーの、６ウェルプレート中のコロニー形成数（１ウェルあたり）を、リプログラミング遺伝子過剰発現のフェーズ１の終了時にカウントした。結果を下記表に示す。
各コロニーのサイズ分布を、遺伝子導入後１２日目に調べた。結果を図６に示す。コロニーの直径を指標として使用した。遺伝子導入後１２日目はフェーズ２の初期段階である。
ＲＰＥ細胞はＣＲＸの非存在下においても線維芽細胞から誘導されたが、その誘導は、その数および大きさの両方においてＣＲＸの存在下でより効果的であった。
ＣＲＸの添加は任意であるが、ＣＲＸは、数ではるかに多くのコロニーを誘導し、および直径によって測定される、はるかに多くの増殖性コロニーを誘導した。
ＲＰＥ細胞はＣＲＸの非存在下においても線維芽細胞から誘導されたが、その誘導は、その数および大きさの両方においてＣＲＸの存在下でより効果的であった。
ＣＲＸの添加は任意であるが、ＣＲＸは、数ではるかに多くのコロニーを誘導し、および直径によって測定される、はるかに多くの増殖性コロニーを誘導した。
実施例３；ＲＰＥ細胞の誘導（ケトミン／ニコチンアミド）
フェーズ２の後期段階でケトミンおよびニコチンアミドによる処理の効果を調べた。ケトミンおよびニコチンアミドを添加したこと以外は実施例１と同じ方法で、ＲＰＥ細胞を誘導した。結果を図８に示す。両方の化合物を添加したときにより強い色素堆積（dye deposition）が確認された。これらの結果から、体細胞からＲＰＥ細胞を誘導するプロセスの或る段階でのケトミンおよびニコチンアミドによる処理が効果的であることが分かった。
フェーズ２の後期段階でケトミンおよびニコチンアミドによる処理の効果を調べた。ケトミンおよびニコチンアミドを添加したこと以外は実施例１と同じ方法で、ＲＰＥ細胞を誘導した。結果を図８に示す。両方の化合物を添加したときにより強い色素堆積（dye deposition）が確認された。これらの結果から、体細胞からＲＰＥ細胞を誘導するプロセスの或る段階でのケトミンおよびニコチンアミドによる処理が効果的であることが分かった。
実施例４；ラットの眼への本発明のｉＲＰＥ細胞の移植
実施例１で調製した安定培養ヒトｉＲＰＥ細胞を、免疫不全アルビノラットの眼に移植した。ＢＥＳＴ１ライブレポーターの発現を、移植後４．５ヶ月で調べた（図９）。移植されたヒトｉＲＰＥ細胞のいくつかの大きな領域は、ＢＥＳＴ１：：ＥＧＦＰライブ成熟レポーター遺伝子導入を発現した。同様に、移植後４．５ヶ月で組織切片を調製し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した（図１０）。いくつかのヒトｉＲＰＥ細胞は色素細胞となり、該色素細胞が、成長し、成熟し、および神経網膜と接続している（正規のＲＰＥ層へのインテグレーションやシート形成など）。
ＢＥＳＴ１：ライブＢＥＳＴ１：：ＥＧＦＰトランスジェニックレポーター
ヘマトキシリンおよびエオシン染色；標準作業（Standard Practice）
実施例１で調製した安定培養ヒトｉＲＰＥ細胞を、免疫不全アルビノラットの眼に移植した。ＢＥＳＴ１ライブレポーターの発現を、移植後４．５ヶ月で調べた（図９）。移植されたヒトｉＲＰＥ細胞のいくつかの大きな領域は、ＢＥＳＴ１：：ＥＧＦＰライブ成熟レポーター遺伝子導入を発現した。同様に、移植後４．５ヶ月で組織切片を調製し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した（図１０）。いくつかのヒトｉＲＰＥ細胞は色素細胞となり、該色素細胞が、成長し、成熟し、および神経網膜と接続している（正規のＲＰＥ層へのインテグレーションやシート形成など）。
ＢＥＳＴ１：ライブＢＥＳＴ１：：ＥＧＦＰトランスジェニックレポーター
ヘマトキシリンおよびエオシン染色；標準作業（Standard Practice）
本発明は、患者特異的な自家ＲＰＥ細胞のコストを劇的に削減し、通常の医療および研究用途のための現実的な細胞製品を可能にする。
本願は、日本に出願された特願２０２０－０３３８４８号（出願日：２０２０年２月２８日）を基礎としており、その内容は本願明細書に全て包含される。
本願は、日本に出願された特願２０２０－０３３８４８号（出願日：２０２０年２月２８日）を基礎としており、その内容は本願明細書に全て包含される。
Claims (14)
- 外因性因子として、
ＭＩＴＦ（小眼球症関連転写因子）遺伝子またはその発現産物、
ＯＴＸ２（オルトデンティクルホメオボックス２）遺伝子またはその発現産物、
ＬＩＮ２８遺伝子またはその発現産物、および
Ｌ－ＭＹＣ遺伝子またはその発現産物
を哺乳類の体細胞に導入する工程を含む、網膜色素上皮細胞の製造方法。 - 外因性因子としてＣＲＸ（錐体－杆体ホメオボックス）遺伝子またはその発現産物を導入する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 体細胞中の導入された外因性因子を過剰発現させてゲノム可塑性を生じさせる期間（フェーズ１）、体細胞アイデンティティをＲＰＥ細胞に変換する期間（フェーズ２）、および変換されたＲＰＥ細胞を成熟させる期間（フェーズ３）の３段階を含む、請求項１または２に記載の方法。
- フェーズ１でｂＦＧＦおよび２－ＭＥを含む培地を使用することを含む、請求項３に記載の方法。
- フェーズ２の一部の期間でケトミンおよびニコチンアミドを含む培地を使用することを含む、請求項３に記載の方法。
- フェーズ３でＳＢ４３１５４２およびｂＦＧＦを含む培地を使用することを含む、請求項３に記載の方法。
- 体細胞がヒト線維芽細胞である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１～７のいずれか１項に記載の方法により製造されたＲＰＥ細胞。
- 哺乳類の体細胞に由来し、且つ外因性因子として、
ＭＩＴＦ遺伝子またはその発現産物、
ＯＴＸ２遺伝子またはその発現産物、
ＬＩＮ２８遺伝子またはその発現産物、および
Ｌ－ＭＹＣ遺伝子またはその発現産物
を含むＲＰＥ細胞。 - 外因性因子としてＣＲＸ遺伝子またはその発現産物をさらに含む、請求項９に記載の細胞。
- 体細胞がヒト線維芽細胞である、請求項９または１０に記載の細胞。
- ＭＩＴＦ遺伝子またはその発現産物、
ＯＴＸ２遺伝子またはその発現産物、
ＬＩＮ２８遺伝子またはその発現産物、および
Ｌ－ＭＹＣ遺伝子またはその発現産物
を含む、体細胞から網膜色素上皮細胞を直接製造するための試薬。 - ＣＲＸ遺伝子またはその発現産物をさらに含む、請求項１２に記載の試薬。
- 体細胞がヒト線維芽細胞である、請求項１２または１３に記載の試薬。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020033848 | 2020-02-28 | ||
| JP2020033848 | 2020-02-28 | ||
| PCT/JP2021/007320 WO2021172510A1 (en) | 2020-02-28 | 2021-02-26 | Production method of retinal pigment epithelial cell |
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|---|---|
| JP2023515174A true JP2023515174A (ja) | 2023-04-12 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022551418A Pending JP2023515174A (ja) | 2020-02-28 | 2021-02-26 | 網膜色素上皮細胞の製造方法 |
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2021
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