CN115135753A - 视网膜色素上皮细胞的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供用于制备RPE细胞的方法，和通过所述方法制备的RPE细胞，以及用于生产适合于所述方法的RPE细胞的试剂。本发明的方法包括下述步骤：作为外源因子将下述引入哺乳动物体细胞中的步骤：MITF（小眼相关性转录因子）基因或其表达产物、OTX2（Orthodenticle同源异型框2）基因或其表达产物、LIN28基因或其表达产物和L‑MYC基因或其表达产物。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于生产视网膜色素上皮细胞的方法。更具体而言，本发明涉及通过直接转变（direct conversion）（直接·重编程序）生产视网膜色素上皮细胞的方法、以及将体细胞转变为视网膜色素上皮细胞的试剂等。
背景技术
包括从iPS细胞生产视网膜色素上皮（RPE）细胞并将其施用于患有湿性年龄相关性黄斑变性的患者的治疗方法需要约6个月的培养时间段并且非常昂贵。将iPS原种用于iPS细胞是现实的，在这种情况下进行同种异体移植。需要一种可以缩短培养时间段以降低成本并且尤其可以治疗是需要自体移植的患者的方法。
已经报道了通过在成纤维细胞中强制表达多种转录因子来生产RPE-样细胞的方法（PTL 1、NPL 1）。RPE-样细胞是通过超表达至少4种转录因子生产的，这些转录因子在前者中选自10种转录因子且在后者中选自8种转录因子；然而，尚未确立稳定的细胞系。每种组合都不同于本发明中的组合。
引用列表
专利文献
[PTL 1] US2017/0002319A1
非专利文献
[NPL 1] Zhang, Protein Cell 2014, 5(1): 48-58。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供用于生产能够对患者自体移植的RPE细胞的方法，对于所述患者RPE细胞的移植是有效的，例如，患有湿性年龄相关性黄斑变性的患者，通过所述方法生产的RPE细胞，以及用于生产适合于所述方法的RPE细胞的试剂（例如，载体）。
对所述问题的解决方案
考虑到上述问题，本发明人基于迄今为止的发现进行了深入细致的研究。具体而言，他们设法通过直接转变（直接·重编程序）技术从体细胞生产RPE细胞。直接重编程序可以通过转导编码在靶细胞分化阶段起关键作用的转录因子的基因或促进体细胞重编程序的基因来实现。本发明人已发现，通过引入一些基因，可以将体细胞直接转变为RPE细胞，确立了转变条件，并分析了获得的直接转变的RPE细胞的表型和功能，其导致完成了本发明。
因此，本发明提供了以下内容。
(1) 一种用于生产视网膜色素上皮细胞的方法，其包括作为外源因子将下述引入哺乳动物体细胞中的步骤
MITF（小眼相关性转录因子）基因或其表达产物、
OTX2（Orthodenticle同源异型框2）基因或其表达产物、
LIN28基因或其表达产物和
L-MYC基因或其表达产物。
(2) 上述(1)的方法，进一步包括作为外源因子引入CRX（视锥视杆同源异型框（cone-rod homeobox））基因或其表达产物的步骤。
(3) 上述(1)或(2)的方法，包括在体细胞中超表达引入的外源因子以产生基因组可塑性的时间段（时期1）、将体细胞个性转变为RPE细胞的时间段（时期2）和使转变的RPE细胞成熟的时间段（时期3）的3个阶段（时期）。
(4) 上述(3)的方法，包括在时期1中使用包含bFGF和2-ME的培养基。
(5) 上述(3)的方法，包括在时期2的时间段的一部分中使用包含毛壳菌素（Chetomin）和烟酰胺的培养基。
(6) 上述(3)的方法，包括在时期3中使用包含SB431542和bFGF的培养基。
(7) 上述(1)-(6)中任一项所述的方法，其中所述体细胞是人成纤维细胞。
(8) 通过上述(1)-(7)中任一项所述的方法生产的RPE细胞。
(9) 一种RPE细胞，其衍生自哺乳动物体细胞，且包含作为外源因子的
MITF基因或其表达产物、
OTX2基因或其表达产物、
LIN28基因或其表达产物和
L-MYC基因或其表达产物。
(10) 上述(9)的细胞，进一步包含作为外源因子的CRX基因或其表达产物。
(11) 上述(9)或(10)的细胞，其中所述体细胞是人成纤维细胞。
(12) 一种用于从体细胞直接生产视网膜色素上皮细胞的试剂，其包含
MITF基因或其表达产物、
OTX2基因或其表达产物、
LIN28基因或其表达产物和
L-MYC基因或其表达产物。
(13) 上述(12)的试剂，进一步包含CRX基因或其表达产物。
(14) 上述(12)或(13)的试剂，其中所述体细胞是人成纤维细胞。
发明的有利效果
目前最先进的产生患者特异性视网膜色素上皮（RPE）的方法是将其体细胞诱导为多潜能干（iPS）细胞。然后，技术人员必须扩充那些iPS细胞并证明其合格，且然后将那些iPS细胞分化为RPE细胞，从而需要超过180天的细胞培养，这对于实用医学而言过于昂贵。本发明提出的技术通过快速将体细胞供体细胞在2-3周内改变为具有RPE-样个性的细胞，并在40-60天内改变为大量稳定的早期RPE细胞，急剧缩减了体细胞向RPE细胞的转换。
本发明利用专门的细胞培养基条件和关键转录因子的超表达以从可容易获得的患者细胞，例如皮肤或血液快速且有效地产生RPE细胞。用于医学或研究的患者特异性细胞的成本几乎完全由每天所需的劳动力和材料产生，而目前最先进的患者特异性RPE细胞的生产对患者或科学家来说并不划算。本发明急剧降低了患者特异性自体RPE细胞的成本，以使得用于常规医疗和研究应用的现实细胞产品成为可能。
本发明与目前最先进的iPS细胞技术衍生的RPE进行了比较（图 1）。
附图说明
[图1] 图1显示了本发明与目前技术发展水平的比较。
[图2] 图2显示了人外源转录因子的超表达如何首先诱导中间细胞可塑性并其次加强RPE细胞个性发育的建议的模型。
[图3] 图3显示了重编程序培养基的三个时期和与重编程序因子的超表达（参见图 2）一起发挥作用以快速将细胞转变为RPE细胞个性的材料的不连续时间控制。
[图4] 随着时间的过去，对人包皮成纤维细胞重编程序为iRPE（诱导的RPE）细胞进行成像，并在30天内消除了RPE细胞的单集落生产。此后，可以对细胞进行继代培养，类似于具有RPE基因Best1的活成熟报道基因（BEST1::EGFP）的RPE细胞。
[图5] 由本发明系统诱导的人iRPE细胞表达关键的RPE基因RPE65和ZO-1（TJP1），如通过荧光免疫细胞化学显微镜术所检查的。（A）DNA（Hochest 33342）、（B）BEST1（Best1::EGFP报道基因）、（C）RPE65（免疫细胞化学）、（D）ZO-1（免疫细胞化学）、（E）A、B、C、D的合并图像。
[图6] 图6是显示由于添加CRX而导致集落平均直径形成增加的结果的图。人iRPE细胞可以在没有CRX的情况下被诱导，但集落形成效率、大小和增殖随着CRX的添加而大大增加。数据表示为平均值±最大值/最小值。在有或没有CRX的情况下的重编程序也通过在第9天计数并显示在表4中的集落数目来测量。
[图7] 人成纤维细胞的iRPE细胞重编程序在类似于成熟RPE的有色鹅卵石细胞（pigmented cobblestone cells）中诱导具有活成熟BEST1::EGFP报道基因活性的RPE-样细胞。
[图8] 在重编程序的时期2后期，使用毛壳菌素和烟酰胺治疗可以改善人成纤维细胞的iRPE细胞重编程序。在这两个实验对象组中，使用或不使用毛壳菌素和烟酰胺处理相同的iRPE重编程序混合群体，且然后使其进行入时期3，在那里色素形成强度和RPE-细胞区别可能会得到改善。（上图）不含毛壳菌素和烟酰胺，（下图）含有毛壳菌素和烟酰胺。
[图9] 将稳定培养的人iRPE细胞在高存活和整合的情况下移植到免疫妥协的的白化大鼠眼中。4.5个月后解剖时的荧光成像显示，移植的人iRPE细胞的几个大区域表达了BEST1::EGFP活成熟报道基因转移。（上图）照片，（下图）BEST1::EGFP。
[图10] 将稳定培养的人iRPE细胞在高存活和整合的情况下移植到免疫妥协的的白化大鼠眼中。4.5个月后对解剖的组织进行冷冻切片。苏木精和伊红染色表明，几种人iRPE细胞已变成色素细胞，它们已经生长、成熟并与神经视网膜连接，包括在正确的RPE-层中整合和片层形成。
具体实施方式
下面解释本发明。除非特别指出，否则本说明书中使用的术语具有本领域通常使用的含义。
本发明涉及用于通过将哺乳动物分化的体细胞转变为RPE细胞来生产视网膜色素上皮（RPE）细胞的方法。“转变”意指将体细胞改变为所期望的RPE细胞。本发明的方法的特征之一是一种在没有由产生iPS细胞所代表的完全重编程序细胞的步骤的情况下用于将体细胞转变为RPE细胞的方法，其被称为“直接重编程序”或“直接转变”。
理论上可以体外和体内进行向RPE细胞的诱导。
RPE细胞
本发明中的“视网膜色素上皮细胞”指构成视网膜色素上皮的上皮细胞及其祖细胞。是否为视网膜色素上皮细胞可以通过例如细胞标记（RPE65、CRALBP、MERTK、BEST1等）的表达、细胞形态（细胞内黑色素沉着、多角形和扁平细胞形态、多边形肌动蛋白束的形成等）等来证实。视网膜色素上皮细胞的祖细胞意指朝着被诱导以分化为视网膜细胞的细胞，且是否是祖细胞可以通过细胞标记（Mitf、Pax6、Rx、Crx等）的表达等来证实。本领域的普通技术人员可以通过设置适当的条件来执行这些功能评价和证实操作。
本发明所诱导和制备的RPE细胞也称为诱导的RPE细胞（iRPE细胞）。
体细胞
将作为本发明中直接重编程序的靶的体细胞没有特别限制，只要RPE细胞可以被诱导并且可以衍生自哺乳动物。在将iRPE细胞移植到活生物时，优选使用衍生自接受移植的测试主体的体细胞（自体细胞）以降低感染、排斥反应等的危险。然而，取决于目的，可以使用从其他人或其他动物的体细胞而不是自体细胞预先制备的RPE细胞用于移植。
在本说明书中，哺乳动物的例子包括小鼠、大鼠、仓鼠、人、狗、猫、猴、兔、牛、马、猪等，特别是人。
作为体细胞，可以使用可以容易从活体中采集的体细胞。其实例包括成纤维细胞、角质形成细胞、口黏膜上皮细胞、鼻黏膜上皮细胞、呼吸黏膜上皮细胞、胃黏膜上皮细胞、肠黏膜上皮细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、牙龈细胞（牙龈成纤维细胞和牙龈上皮细胞）、牙髓细胞、牙周韧带细胞、骨髓细胞、骨髓衍生间质细胞、白细胞、淋巴细胞、结膜上皮细胞和破骨细胞，优选成纤维细胞、角质形成细胞、口黏膜上皮细胞、牙龈细胞、白细胞和淋巴细胞。在本发明中，优选使用从活体采集的上述细胞。
基因或其表达产物
在本发明的方法中，作为外源因子，将MITF（小眼相关性转录因子）基因或其表达产物、OTX2（Orthodenticle同源异型框2）基因或其表达产物、LIN28基因或其表达产物和L-MYC基因或其表达产物引入体细胞中。当期望时，可以引入CRX（视锥视杆同源异型框）基因或其表达产物作为外源因子，且其引入从集落形成效率的观点是优选的。如本文中所用的，“表达产物”是例如MITF基因、OTX2基因、LIN28基因、L-MYC基因或CRX基因的mRNA或蛋白质。
所有上述基因在脊椎动物中都是高度保守的。在本说明书中，它们指包括同源物在内的基因，除非描述了具体的动物名称。基因进一步包括具有与野生型基因产物的那些同等功能的基因，即使当基因包括突变时，包括多态性。
例如，人（智人（Homo sapiens））MITF基因、OTX2基因、LIN28基因、L-MYC（MYCL）基因和CRX基因的核苷酸序列，以及由这些序列编码的蛋白质的氨基酸序列已在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）（NCBI）提供的GenBank中登记。作为实施方案，例示以下检索号（应理解，当已登记多个修订版时，每个编号均指最新修订版）：
人MITF基因：例如，AB006909.1，
人MITF蛋白质：例如，BAA32288.1，
人OTX2基因：例如，NM_021728.4，
人OTX2蛋白质：例如，NP_068374.1，
人LIN28基因：例如，NM_024674.6，
人LIN28蛋白质：例如，NP_078950.1，
人L-MYC基因：例如，NM_001033081.3，
人L-MYC蛋白质：例如，NP_001028253.1，
人CRX基因：例如，NM_000554.6，
人CRX蛋白质：例如，NP_000545.1。
显然，可以使用其他序列，只要它们分别对应于相同或相似的功能基因和/或蛋白质。
引入
除了选择具体的基因之外，本发明的方法可以根据已知的重编程序方法进行。具体而言，将作为外源因子的所期望的基因（以下简称为所期望的基因）引入靶向体细胞中并表达。
作为引入基因的方法，还可以使用例如包括用病毒载体感染的方法，例如反转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒（lentivirus）载体、腺伴随病毒载体、疱疹病毒载体或仙台病毒载体；以及在引入基因及其表达产物的情况下，包括用质粒载体、附加型载体或通过非病毒载体的基因表达产物（mRNA、蛋白质）转染的方法，例如阳离子脂质体、阳离子聚合物或电穿孔。另一方面，也可以引入mRNA。
也可以利用基因组编辑技术，例如CRISPR/Cas9系统（CRISPR 靶向反式激活）。
优选的一个实施方案是一种用于引入表达盒的方法，所述表达盒被设计为响应于外界刺激以时间段特异性的方式控制所期望的基因的表达。这种表达盒是核酸构建体，其至少含有能够响应于外界刺激诱导下游基因表达的启动子，以及其表达受所述启动子控制的所期望的基因。
启动子没有特别限制，只要其是能够响应于外界刺激诱导下游基因表达的启动子。其实例包括，当外界刺激是四环素抗生素（四环素、四环素衍生物如多西环素等）的存在时，能够通过结合四环素抗生素和四环素反式激活蛋白的复合物诱导下游基因表达的启动子。
必要时，表达盒可以含有增强子、沉默基因、选择标记基因（例如，抗药基因如新霉素抗性基因等）、SV40复制起点等。
因此，外界刺激包括在有或没有药物的情况下的培养。例如，在有多西环素的情况下并使用多西环素表达诱导系统（例如，多西环素表达诱导系统）来控制所期望的基因的表达。
多西环素表达诱导系统可以是可商购获得的（例如，TAKARA、Clontech等），或通过已知文献中描述的方法生产。
用于将上述表达盒引入体细胞的方法没有特别限制，且可以适当地选择和使用已知的方法。例如，上述表达盒被插入适当的表达载体中，且可以通过使用已知的转化方法引入，例如使用诸如反转录病毒载体、腺病毒载体等的病毒载体的病毒感染、脂转染方法、脂质体方法、电穿孔方法、磷酸钙方法、DEAE葡聚糖方法、显微注射方法等。
表达载体的实例包括病毒载体，如慢病毒、反转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺伴随病毒、仙台病毒等，以及动物细胞表达质粒。从引入效率的观点，慢病毒是优选的。
关于上述外界刺激，本领域普通技术人员可以考虑要利用的上述启动子的种类等并考虑添加的时间来适当调节要添加的刺激的量（水平）。例如，当外界刺激为多西环素的存在时，多西环素的优选添加浓度为0.1-2μg/ml，更优选0.5-1μg/ml。在一个实施方案中，在时期1和时期2中要添加的量是1μg/ml，且然后在时期3中短暂地减少到0.5μg/ml，在那里它不久被完全去除。
在所期望的基因转移后，允许诸如多西环素等的外界刺激存在于已引入所期望的基因的体细胞中达60天，优选至少50天。结果，体细胞被诱导为RPE细胞，并可以在时期3中成熟。
培养
在本发明的方法中，哺乳动物分化的体细胞可以在引入基因后在培养基中培养。例如，优选的实施方案是体外诱导（制备）RPE。
可以在适合贮存细胞和培养基的容器中进行培养。在黏着培养的情况下，优选使用细胞黏着培养容器，例如，用细胞外基质等（例如，聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、iMatrix511（产品名称））包被处理后的培养容器。诸如培养温度、CO2浓度和O2浓度的黏着培养的培养条件可以适当确定。在这种情况下，可以在有血清、已知的生长因子以及促进生长的添加剂和化学物质的情况下培养细胞。已知的生长因子的例子包括EGF、FGF等。促进生长的添加剂的实例包括N2添加物（Invitrogen）、B27添加物（Invitrogen）等。
只要不损害本发明的效果，培养时间段没有特别限制。例如，如所必要的，其可以被定为约30天、或40天、或50天、或60天或70天。必要时，培养基可被改变，且优选改变为具有根据阶段适当调节的组分的培养基（见下文“培养基”）。
培养基
本发明的方法中使用的培养基没有特别限制。可以使用通常的液体培养基，例如DMEM（Dulbecco改性Eagle培养基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium））、EMEM（Eagle极限必需培养基（Eagle’s Minimal Essential Medium））、αMEM（α改性极限必需培养基）、Ham’s F-12 （养分混合物F-12 Ham（Nutrient Mixture F-12 Ham））等。如果必要，则可以添加血清组分（胎牛血清（FBS）、人血清（HS）），血清代替物（SR），抗生素，如链霉素和青霉素，非必需氨基酸（NEAA）和类似组分。
考虑到通过本发明方法的RPE细胞的高制备效率，优选将RPE细胞的制备过程分为三个阶段（时期1、时期2、时期3），并使用适合于每个时期的培养基（见图 3）。为方便起见，这些培养基有时称为时期1培养基、时期2培养基和时期3培养基。
时期1培养基是用于在体细胞中超表达引入的所期望的基因的时间段的培养基，且一般在基因转移后使用8-10天。从维持早期细胞增殖的观点，培养基优选含有bFGF和2-ME。bFGF的优选添加浓度为1-100 ng/ml，更优选约10 ng/ml。2-ME的优选添加浓度为10-100μM，更优选约55μM。
时期2培养基是用于在时期1之后将已引入了所期望的基因的细胞转变为RPE细胞的时间段的培养基，且一般在时期1后使用34-38天。培养基优选含有毛壳菌素和烟酰胺，从而使得可以消除不期望的细胞。毛壳菌素的优选添加浓度为10-100 nM，更优选40-80 nM。烟酰胺的优选添加浓度为1-50 mM，更优选5-10 mM。
时期3培养基是用于时期2之后转变的RPE细胞成熟时间段的培养基，且一般在时期2后使用7-12天。从常见的RPE细胞成熟材料观点，培养基优选含有SB431542和bFGF。SB431542的优选添加浓度为0.5-1μM，更优选约0.5μM。bFGF的优选添加浓度为1-100 ng/ml，更优选约10 ng/ml。
生产（诱导）
因此，RPE 细胞由体细胞生产。细胞是否为视网膜色素上皮细胞可以由本领域普通技术人员基于例如细胞标记（RPE65、Mitf等）的表达、黑色素颗粒的存在、多角形的特征性细胞形态等证实。
诱导的RPE细胞（iRPE细胞）含有外源MITF基因、OTX2基因、LIN28基因和L-MYC基因（优选地，还有CRX基因）。如本文中所用的术语“外源”意指主要通过上述引入手段引入且不同于天然实施方案的基因或其表达产物的实施方案。
iRPE细胞可以作为与除iRPE细胞以外的细胞（例如，原始体细胞）的混合物获得。在这种情况下，如所必要的，iRPE细胞可以与除iRPE细胞以外的细胞分离。用于分离的手段没有特别限制。例如，它们可以使用细胞分选仪或磁珠进行分离。
由本发明产生的iRPE细胞具有与体内视网膜色素上皮细胞的那些非常相似的特征。因此，它也可用于筛选归因于视网膜细胞紊乱的疾病的治疗药物，或用于细胞治疗的移植材料，用于研究疾病的材料或用于归因于其他病因学的细胞损伤的治疗药物的药物发现材料。此外，它们还可用于化学物质等的毒性和药物功效评价中的毒性研究，如光毒性、毒性试验等。
归因于视网膜细胞紊乱的疾病的例子包括有机汞中毒、氯奎毒性视网膜病、色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性、青光眼、糖尿病性视网膜病、新生儿视网膜病等。
可以使用通过本发明生产的iRPE细胞作为用于移植的视网膜色素上皮细胞，其用于补充细胞损伤状态中的受损细胞或紊乱组织本身（例如，用于移植手术）等。
试剂
如上文所提及的，可以通过向体细胞中引入作为外源因子的MITF基因或其表达产物、OTX2基因或其表达产物、LIN28基因或其表达产物和L-MYC基因或其表达产物以及优选地除此之外的CRX基因或其表达产物来诱导RPE细胞。因此，本发明进一步提供了一种用于由体细胞生产RPE细胞的试剂，其含有MITF基因或其表达产物、OTX2基因或其表达产物、LIN28基因或其表达产物和L-MYC基因或其表达产物，以及优选地除此之外的CRX基因或其表达产物。这里的体细胞优选是成纤维细胞。
作为可将上述基因引入体细胞中的形式，试剂具体而言包括在其中并入了上述基因的载体。上述基因可以分别并入不同的载体中，或者两种或更多种基因可以同时并入一个载体中。
可以使用的载体的种类等如上所述。
下面通过参考不应解释为限制性的实施例来详细解释本发明。要使用的试剂和材料是可商购获得的，除非特别限制。
实施例
实施例1；RPE细胞的诱导
（时期1）
人体细胞（成纤维细胞；ATCC Cat#CRL2522）在标准培养基和方法中培养和扩充，直到期望重编程序为止。为了准备重编程序，用MITF、OTX2、LIN28、L-MYC和CRX的慢病毒dox-诱导型条件基因表达系统和dox-诱导型慢病毒（lentivirii）转导成纤维细胞。为了启动重编程序，将成纤维细胞以100-150 x 103个细胞/孔平板接种在包被有iMatrix511的6孔（6W）平板孔上。第二天，通过使用慢病毒dox-诱导型系统，在每天超表达人外源转录因子（MITF、OTX2、LIN28、L-MYC和CRX）的情况下应用重编程序培养基时期1（时期1培养基）。维持重编程序因子超表达，直到以后当iRPE变得稳定时在时期3早期逐渐将其去除为止（图 7）。使用时期1培养基的培养维持8-10天。
（时期2）
紧接着，两天一次（每隔一天）应用时期2培养基。在大约第24-32天，将重编程序的每个6W平板孔在一个或多个孔（一般2个孔）中以400-600 x 103个细胞/孔在时期2培养基中大批重新平板接种（replate）到iMatrix511包被的6W平板上。另一方面，可以以200-300x 103个细胞/孔使用12孔（12W）平板。另一方面，iRPE集落可以分离到个别iMatrix511包被的96孔（96W）平板孔中，尽管大批传代是适当的。
重新平板接种后，在时期2培养基中继续再重编程序达约一周。然后，可以添加40- 80 nM毛壳菌素和5 - 10 mM烟酰胺的任选处理达6 - 12天，以提高RPE细胞质量（图 8），或者可以两天一次使用时期2培养基继续培养达相同时间段。在去除毛壳菌素和烟酰胺后，再继续使用时期2培养基的培养2天（一次培养基改变）。
（时期3）
两天一次应用时期3 培养基以引起RPE-样成熟并增加极化和色素形成。7-12天，外源MITF、OTX2、LIN28、L-MYC和CRX的超表达逐渐减少，直到它们不再增加为止。在丧失重编程序外源和此后培养的所述过程中，iRPE和不期望的细胞的质量变得不同（图7）。
维持使用时期3 培养基的培养，并且色素细胞和/或那些具有继续BEST1::EGFP报道基因表达的细胞被认为稳定诱导成RPE（iRPE）。这些重编程序和分化的iRPE细胞可以利用标准RPE培养方法进行纯化、继代培养、检查和移植。
随着时间的过去，观察到人包皮成纤维细胞重编程序为iRPE细胞。检查了RPE-相关基因RPE65和BEST1以及构成紧密连接的ZO-1的表达。结果示于图5中。
RPE65:小鼠-抗RPE65，Millipore cat#MAB5428
BEST1:活Best1::EGFP转基因报道基因（Transgenic Reporter）
ZO-1:兔抗-ZO-1，Invitrogen cat#61-7300
重编程序培养基组成
时期1培养基：
[表1]
时期2培养基：
[表2]
时期3培养基：
[表3]
实施例2；RPE细胞的诱导（CRX）
比较了以与实施例1相同的方式引入的具有CRX和不具有CRX的外源因子。在第9天形成的iRPE集落在6-孔平板中的集落形成数目（每1个孔）在重编程序基因超表达的时期1结束时进行计数。结果示于下表中。
[表4]
在基因转移后第12天检查每个集落的大小分布。结果示于图6中。集落的直径用作指标。基因转移后的第12天是时期2的初始阶段。
尽管即使在没有CRX的情况下也从成纤维细胞诱导了RPE细胞，但在有CRX的情况下诱导在其数目和大小上都更有效。
添加CRX是任选的，但通过直径测量的，CRX诱导了数目多得多的集落和更多的增殖性集落。
实施例3； RPE细胞的诱导（毛壳菌素/烟酰胺）
检查了在时期2较后阶段用毛壳菌素和烟酰胺处理的效果。除了添加毛壳菌素和烟酰胺以外，以与实施例1相同的方式诱导RPE细胞。结果示于图8中。当添加这两种化合物时，证实了更强的染料沉着。根据这些结果，在从体细胞诱导RPE细胞的过程中的某个阶段用毛壳菌素和烟酰胺处理是有效的。
实施例4；将本发明的iRPE细胞移植到大鼠眼中
将实施例1中制备的稳定培养的人iRPE细胞移植到免疫妥协的白化大鼠的眼中。在移植后4.5个月检查BEST1活报道基因的表达（图9）。移植的人iRPE细胞的几个大区域表达了BEST1::EGFP活成熟报道基因基因转移。类似地，在移植后4.5个月，制备组织切片并用苏木精和伊红染色（图10）。几种人iRPE细胞已变成色素细胞，它们已经生长、成熟并与神经视网膜连接，包括在正确的RPE-层中整合和片层形成。
BEST1: 活Best1::EGFP转基因报道基因
苏木精和伊红染色；标准实践
工业适用性
本发明急剧降低了患者特异性自体RPE细胞的成本，以使得用于常规医疗和研究应用的现实细胞产品成为可能。
本申请基于在日本提交的专利申请No. 2020-033848（申请日：2020年2月28 日），其内容全文引入本文。
Claims (14)
1.用于生产视网膜色素上皮细胞的方法，其包括作为外源因子将下述引入哺乳动物体细胞中的步骤
MITF（小眼相关性转录因子）基因或其表达产物、
OTX2（Orthodenticle同源异型框2）基因或其表达产物、
LIN28基因或其表达产物和
L-MYC基因或其表达产物。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括作为外源因子引入CRX（视锥视杆同源异型框）基因或其表达产物的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，包括在体细胞中超表达引入的外源因子以产生基因组可塑性的时间段（时期1）、将体细胞个性转变为RPE细胞的时间段（时期2）和使转变的RPE细胞成熟的时间段（时期3）的3个阶段。
4.根据权利要求3所述的方法，包括在时期1中使用包含bFGF和2-ME的培养基。
5.根据权利要求3所述的方法，包括在时期2的时间段的一部分中使用包含毛壳菌素和烟酰胺的培养基。
6.根据权利要求3所述的方法，包括在时期3中使用包含SB431542和bFGF的培养基。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述体细胞是人成纤维细胞。
8. 通过根据权利要求1-7中任一项所述的方法生产的RPE细胞。
9. RPE细胞，其衍生自哺乳动物体细胞，且包含作为外源因子的
MITF基因或其表达产物、
OTX2基因或其表达产物、
LIN28基因或其表达产物和
L-MYC基因或其表达产物。
10.根据权利要求9所述的细胞，进一步包含作为外源因子的CRX基因或其表达产物。
11. 根据权利要求9或10所述的细胞，其中所述体细胞是人成纤维细胞。
12. 用于从体细胞直接生产视网膜色素上皮细胞的试剂，其包含
MITF基因或其表达产物、
OTX2基因或其表达产物、
LIN28基因或其表达产物和
L-MYC基因或其表达产物。
13.根据权利要求12所述的试剂，进一步包含CRX基因或其表达产物。
14.根据权利要求12或13所述的试剂，其中所述体细胞是人成纤维细胞。
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