JP2022522897A - 誘導された光受容細胞およびその産生方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は初期細胞(initial cell)由来の誘導された光受容細胞(photoreceptor cell)を産生する方法であって 、該方法は少なくともGON4Lを含む1つまたは複数の転写因子(TF)を初期細胞に供給することを含む、方法に関する。本発明の好ましい態様において、初期細胞はヒト人工多能性幹細胞(iPSC)である。他の態様において、本発明の方法は転写因子OTX2および/またはNEUROD1を初期細胞に供給することを含む。本発明は、本発明の方法によって産生され得ることができる細胞にも関し、網膜症の治療における医薬としてのこれらの細胞、本発明の光受容細胞を誘導するためのベクター、およびこの使用を目的とした転写因子の組み合わせの使用にも関する。
網膜疾患の治療のための再生治療における多能性幹細胞の使用は文献で議論されており、この目標を達成するためのいくつかのアプローチが提案されています(非特許文献1、非特許文献2)。光受容細胞を産生するためのさまざまな方法が出現した。1つの方法は、成長因子、阻害剤、または低分子化合物の添加により、ヒト胚性幹細胞から光受容体の分化を促進する(非特許文献3) 。別のアプローチでは、光受容体前駆細胞などの網膜前駆細胞は、特定の阻害分子を使用することによるWntおよびTGF-β/BMPシグナル伝達経路の操作を使用してマウスiPSCから分化される(非特許文献4)。
さらに、体細胞(1、2)または幹細胞(3Dオルガノイドを介す)(3-6)からの直接細胞変換(direct cell conversion)が示唆されている。体細胞からの直接変換(Directconversion)は、ヒト線維芽細胞での転写因子(TF)の過剰発現を利用し、光受容体様細胞を非常に少量で産生する。例えば、非特許文献5では、転写因子CRX、RAX、OTX2、およびNEURDの定義された組み合わせによって、線維芽細胞からヒト光受容細胞を誘導した。別のアプローチでは、培養で100日を超えると解離するヒトiPSCからヒト網膜オルガノイドを産生することであり、その結果、約10%の光受容体を大規模に精製する必要がある。
光受容体は、2D(線維芽細胞からの直接変換)または3Dオルガノイドから濃縮する必要があり、すべての解離および精製プロトコルは細胞にストレスを与え、蛍光活性化セルソーティング(FACS)または磁気活性化細胞選別(MACS)の特定のマーカーに依存するため、技術的に困難である(7)。さらに、ヒト線維芽細胞の増殖時間は、ヒトiPSCと比較して長く、これは開始細胞集団(starting cellpopulation)の量にとって重要である。3D網膜オルガノイドは、光受容体を収集する前に100日を超えて培養する必要があり、これにより、バッチ効果が発生し、最終的な品質が低下する。より長いインキュベーション時間と複雑な下流処理により、細胞移植のための医療製品のコストがさらに増大する。
インビボ網膜形成の広範な研究により、光受容体の発生に重要な多くの転写因子が知られており、ヒト線維芽細胞に適用されているが、それらは、ヒトiPSCのように、ヒトiPSCまたは他の多能性細胞からの光受容体の分化を促進するには不十分であり、光受容体前駆細胞は細胞の基底状態が異なり、線維芽細胞の分化転換(transdifferentation)プロトコルからの知識を他の初期細胞、特にiPSCに適用することはできない。
失明症を治療するためにヒトの光受容体を患者の網膜に移植するためには、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から大量かつ高品質のヒト光受容体を誘導するための効率的なプロトコルが必要である。したがって、細胞治療の品質でヒト光受容体を提供するために、高速で効率的で、適応が容易で、均質で制御可能な分化プロトコルを開発する必要がある。
これらの従来技術に照らして、損傷または変性した光受容体を交換するための細胞移植療法のための誘導された光受容体の細胞量および質を提供する、ヒトiPSCなどの初期細胞から誘導された光受容体を産生するための高速で効率的かつ均一な分化プロトコルに対する当技術分野における重要な必要性が依然として存在する。
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従来技術に照らして、本発明の根底にある技術的問題は、誘導された光受容細胞を産生するための代替または改善された方法を提供することである。本発明の別の目的は、損傷または変性した光受容体に関連する病状を治療するための代替または改善された治療薬の提供である。これらの目的に取り組む際に、本発明は、従来技術の不利な点を回避しようとする。
この課題は独立請求項の特徴によって解決される。本発明の好ましい態様は従属請求項により提供される。
したがって、本発明は、初期細胞から誘導された光受容細胞を産生する方法であって、該方法は少なくともGON4Lを含む1つまたは複数の転写因子(TF)を初期細胞に供給することを含む、方法に関する。
光受容体に関連して記載されたことがない転写因子GON4Lが、光受容体様細胞に再プログラミングする、初期細胞における光受容体表現型の誘導に有効な因子であることは、まったく驚くべきことだった。事実上すべてのヒト転写因子を含む偏りのないライブラリースクリーニングを実行することによってのみ、この完全に予想外の転写因子を特定することができた。驚くべきことに、光受容体の発生に関与することがすでに知られている転写因子を使用して、初期細胞の光受容体様細胞または光受容体前駆細胞への分化を誘導するだけでは不十分だったが、これを達成するにはGON4Lが必要だった。重要なことに、本発明の方法は、初期細胞における光受容体表現型の迅速かつ効率的な誘導を可能にし、比較的均質な細胞集団をもたらし、任意選択で、誘導された光受容細胞を単離することによってこれをさらに精製することができる。
初期細胞から光受容細胞を産生するための既知の2D細胞培養プロトコルとは対照的に、本発明の方法は、高速であり、かつ、iPSCなどの増殖細胞を含むさまざまな細胞型に適用できる。転写因子GON4Lおよび潜在的なさらなる転写因子の供給は、段階的に行うことができる。例えば、外因性核酸由来の因子の発現を誘導することなく、必要な転写因子をコードする1つまたは複数の外因性核酸を初期細胞に送達することが可能である。続いて、初期細胞は、転写因子の供給に対応する、核酸からの因子の発現を誘導する前に数ラウンドの複製で増殖できるため、光受容体の分化を誘導する前に初期細胞を大幅に増殖させることができ、わずかな初期細胞から大量の誘導された光受容細胞を産生することができる。これは、例えば線維芽細胞を初期細胞としてゆっくりと分裂させるために使用する既知の2D分化プロトコルに対する重要な利点を表す。
さらに、光受容体前駆体に似た表現型を示す細胞は、GON4Lおよび潜在的なさらなる転写因子の供給後の非常に早い段階で培養システムで同定することができる。そのような初期段階の前駆細胞、ならびにより分化したまたは成熟した光受容体の発生段階に対応する細胞は、本明細書の記載の手段および細胞の下流での適用(downstream application)について当技術分野で知られている手段によって容易に単離することができる。
GON4L、潜在的な他の転写因子、特にOTX2およびNEUROD1、および/または他の因子との組み合わせの供給は、培養における初期細胞に光受容体表現型を誘導するための新規方法を表す。
理論に制限されないが、光受容体の表現型を誘導するためのGON4Lの使用は、光受容体の分化のために初期細胞をプライミングするために必要であると考えられる。
特にiPSCを初期細胞として使用する場合、GON4Lの供給が初期細胞で光受容体表現型を誘導するのに十分であることは全く驚くべきことだった。添付された実施例から明らかであるが、GON4Lは他の転写因子と組み合わせた発現が好ましいが、光受容体特異的プロモーターの制御下でレポーター遺伝子の発現を誘導するために必要な唯一の転写因子である。
本発明によれば、GON4Lの発現は、初期細胞から光受容細胞を誘導するという技術的効果を達成するために必要であるように思われ、好ましくは、光受容体表現型を誘導するための別の転写因子の発現と組み合わせて使用され、より好ましくは、GON4LとOTX2および/またはNEUROD1の組み合わせた発現を介する(図5および図6参照)。
本発明の大きな利点は、誘導された光受容細胞を高純度で産生できることであり、これにより、細胞を精製して均一な集団に濃縮するためのさらなる下流処理が簡素化される。
本発明の態様において、初期細胞は、多能性(pluripotent)または複能性(multipotent)の哺乳動物細胞であり、少なくともGON4Lを含む1つまたは複数の転写因子(TF)を初期細胞に供給することにより、誘導された光受容細胞に分化する。
好ましくは、初期細胞は人工多能性幹細胞(iPSC)である。
これらの細胞はその増殖能力のため容易に増やすことができるので、本発明の方法のための初期細胞としてiPSCを使用することは特に有利である。すなわち、1つまたは複数の転写因子が、誘導可能な様式で1つまたは複数の核酸からの発現を介して提供される実施形態において、核酸の送達後であって核酸からの転写因子発現の誘導の前に、iPSCを増殖することが可能である。したがって、わずかな初期細胞から多数の光受容細胞を誘導することが可能である。この利点は、初期細胞として機能する可能性のある他の増殖細胞または増殖可能な細胞にも当てはまる。さらに、本発明の方法の初期細胞として個々の患者からiPSCを作製することが可能である。そのような個々人の細胞は、本発明による光受容体表現型の誘導後の同じ患者の治療における薬剤として使用することができる。すなわち、少数の単離された患者特異的細胞からのみ、患者特異的に誘導された光受容細胞を大量に生成することが可能である。
本発明の好ましい態様において、初期細胞はヒト起源である。
ヒト起源の初期細胞は、そのような細胞から生成された誘導された光受容細胞もまたヒトであるため、本発明の光受容細胞の治療および研究用途に好ましく、特に利点がある。誘導された光受容体がヒト起源である場合、それらは、そのような細胞を必要とする患者、例えば網膜変性または他の眼疾患に苦しむ患者への移植に使用することができる。さらに、本発明の細胞を研究開発目的、例えば薬物のスクリーニングおよび開発に使用するために、ヒト細胞を使用することは大きな利点である。
特定の態様において、初期細胞は線維芽細胞である。線維芽細胞は、ドナーから容易にアクセスでき、培養が容易であるため、有利な初期細胞である。すなわち、本発明の方法において初期細胞として直ちに適用することができる患者から多数の線維芽細胞を生成することが可能であり、患者から細胞を単離した後、誘導された光受容細胞の迅速な生成をもたらす。さらに好ましい初期細胞は、造血幹細胞、骨髄に存在する増殖前駆細胞、白血球、リンパ球などの骨髄由来細胞であってよい。
さらなる態様において、他の体細胞または前駆細胞を初期細胞として使用することができる。当業者は、一般的な知識および最新技術を考慮して、適切な初期細胞を選択することができる。分化した細胞の特定の細胞表現型は、iPSCなどの幹細胞から、または完全に分化している、またはまだ分化の可能性がある線維芽細胞または他の体細胞などの他の初期細胞から誘導できることが記載されている。そのような研究から、当業者は、初期細胞としてのiPSCにおける特定の表現型の誘導を促進することができる転写因子が、初期細胞として使用される異なる細胞型においてそのような特定の表現型を誘導するためにも有用であると結論付けることができる。
定義された転写因子発現によるヒト神経細胞の誘導は以前に記載されており、それにより、体細胞核移植、細胞融合、または系統特異的因子の発現は、多様な体細胞型において細胞運命変化を誘導することが示されている (Pang et al, Nature. 201 1 May 26;476(7359):220-3)。例えば、3つの転写因子(Brn2、AscM、およびMytl l)の異なる組み合わせの強制発現は、マウス線維芽細胞と多能性細胞を機能的に誘導されたニューロン(iN)細胞に効率的に変換できる。
すなわち、本発明に関する初期細胞型としてのiPSCの使用は、好ましい実施形態であるが、当業者は、初期細胞としてのiPSCの使用が本発明の本質的な特徴であることを期待しないであろう。対照的に、GON4LがiPSCで光受容細胞表現型を誘導できるという事実は、GON4Lが他の初期細胞型でも光受容体表現型の誘導を促進できることを示す。
一つの態様において、 初期細胞は、胚性幹細胞または胚から得られた他の細胞ではない。
本発明の態様において、誘導された光受容細胞は、錐体細胞である。
さらなる態様において、誘導された光受容細胞は、桿体細胞である。
いくつかの態様において、誘導された光受容細胞は、感光性網膜神経節細胞(photosensitive retinal ganglion cell)である。
本発明の方法の大きな利点は、因子の組み合わせを供給する培養条件を変更することにより、初期細胞から桿体、錐体、または感光性網膜神経節細胞を直接生成することが可能になることである。これは、特定の光受容体サブタイプに特異的な下流の用途で誘導された光受容細胞を使用する場合に特に有利である。
本発明の態様において、本発明の方法は、CRX、NEUROD1、NR2E1、NR2E3、NRL1、OTX2、ONECUT1、PAX6、RAX、RORB、RXRG、SIX3、SIX6、SOX2、THRBおよびVSX2から選択される1つまたは複数の転写因子を初期細胞に供給することを含む。
本発明の態様において、GON4Lを含む1つまたは複数の転写因子が初期細胞に供給される。別の態様において、GON4Lを含む3つまたはそれ以上の転写因子が初期細胞に供給される。
本発明の態様において、GON4Lを含む2つまたはそれ以上の転写因子およびCRX、NEUROD1、NR2E1、NR2E3、NRL1、OTX2、ONECUT1、PAX6、RAX、RORB、RXRG、SIX3、SIX6、SOX2、THRBおよびVSX2から選択される1つまたは複数の転写因子を初期細胞に供給することを含む。
少なくとももう1つの、好ましくは2つの追加の転写因子と一緒にGON4Lを供給することが、iPSCのような初期細胞において光受容体表現型を誘導するのに効果的であったことは全く驚くべきことであった。添付の実施例は、GON4LをSIX6、NEUROD1、またはOTX2と組み合わせて、目的の効果が得られたことを示す。1つの態様では、本発明はGON4LおよびOTX2を初期細胞、例えば、このましくはiPSC に供給することを含む。1つの態様では、本発明はGON4L およびSIX6を初期細胞、例えば、このましくはiPSC に供給することを含む。1つの態様では、本発明はGON4L およびNEUROD1を初期細胞、例えば、このましくはiPSCに供給することを含む。
これらの転写因子は、GON4Lと組み合わせて供給された場合、初期細胞からの光受容体の発達を促進し、初期細胞で光受容体の表現型をより効率的に誘導することが確認されている。
好ましい態様において、本発明の方法はOTX2 および/またはNEUROD1を初期細胞に供給することを含む。
驚くべきことに、OTX2またはNEUROD1のいずれか、および特に両方の転写因子の発現は、GON4Lと組み合わせて供給された場合、誘導された光受容体への初期細胞の分化能力を改善することが見出された。
1つの態様では、GON4L、OTX2、およびNEUROD1の組み合わせが初期細胞に供給される。1つの態様では、本発明はGON4L、OTX2 およびNEUROD1を初期細胞としてのiPSC に供給することを含む。いくつかの態様において、転写因子は、本発明の方法に関して、初期細胞における光受容体表現型の誘導のためにほぼ同時に供給される。さらなる態様において、転写因子は連続して供給されてもよい。例えば、GON4Lは、OTX2および/またはNEUROD1などの2つ目の転写因子の数分、数時間、または数日前に供給されてよい。3つ目の転写因子は1つめまたは2つ目の転写因子と同時にまたは後の時点で供給されてもよい。本発明の態様において、GON4Lは、OTX2および/またはNEUROD1などの少なくとも1つの他の転写因子の後に供給されます。この連続的な供給は、本発明の方法に関して初期細胞に提供され得るさらなる転写因子またはマイクロRNAなどの他の因子にも当てはまる。
本発明の態様において、OTX2、NEUROD1およびGON4Lは本質的に同時にまたは連続して初期細胞に供給される。
供給の順番は、(i) GON4L、(ii) OTX2 および (iii) NEUROD1 または (i) GON4L、(ii)NEUROD1および(iii) OTX2であってよい。さらに、供給の順番は、(i) OTX2、(ii)NEUROD1および(iii) GON4Lまたは(i) OTX2、(ii) GON4Lおよび(iii) NEUROD1であってよい。また、供給の順番は、(i) NEUROD1、(ii) GON4Lおよび (iii) OTX2 または(i)NEUROD1、(ii) OTX2および (iii)GON4Lであってよい。
また、因子の一つは、他の2つの因子がほぼ同時に供給される前に、最初に供給されてもよい。例えば、OTX2およびNEURD1の前にGON4L、または、GON4LおよびNEUROD1の前にOTX2、または、GON4LおよびOTX2の前にNEUROD1。
本発明の方法に関して供給され得る第1、第2、第3および/またはさらなる転写因子または他の因子の供給の間の時間枠は、約10、15、20、25、30、40、50および/または60分の範囲であってよい。また、約1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23および/または24時間の範囲にあってもよい。本発明の態様において、本発明の方法に関する転写因子および/または他の因子の供給の間の時間枠は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19および/または20日であってよい。
本発明の態様において、本発明の方法は初期細胞へのマイクロRNA、好ましくはmiR-182および/またはmiR-183の供給を含む。
さらなる態様において、1つまたは複数の転写因子および/または1つまたは複数のマイクロRNA(例えば、miR-182および/またはmiR-183)は、初期細胞内の1つまたは複数の外因性核酸分子から発現されるものであって、外因性核酸からの発現は、好ましくは、初期細胞、例えばヒトiPSCに存在するよりも高いレベルをもたらす。
本発明の別の態様において、初期細胞には、1つまたは複数の転写因子と、miR-182および/またはmiR-183などの他の因子が少なくとも4日間、好ましくは約7~10日間供給される。 本発明の態様において、光受容体の表現型がさらなる時間枠の後にのみ生じる可能性がある場合であっても、1つまたは複数の転写因子および潜在的な他の因子を約1日間だけ供給することで、誘導された光受容細胞への初期細胞の再プログラミングを誘導するのに十分である。
たとえ1つまたは複数の転写因子の初期の外因性の供給は、例えば1日などの短期間でのみ発生したとしても、GON4Lおよび潜在的な他の因子(例えば、OTX2およびNEUROD1)の1日などの短い初期時間のみの供給は、誘導された光受容細胞に発達するために、初期細胞で分化転換プログラムを誘導することで十分である可能性がある。本発明の態様において、初期細胞は、1つまたは複数の転写因子および潜在的な他の因子(例えば、miR-182および/またはmiR-183)で、少なくとも0.25、0.5、0.75、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20日に供給される。本発明の方法を実行する間に供給される異なる因子は、異なる期間に供給することができ、連続して供給することができる。
本発明の態様において、1つまたは複数の転写因子および潜在的なマイクロRNA(例えば、miR-182および/またはmiR-183)は、1つまたは複数のウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターから初期細胞で発現される。
さらなる態様において、1つまたは複数の転写因子および潜在的なマイクロRNA(例えば、miR-182および/またはmiR-183)は、因子のマイクロインジェクション、トランスフェクション、エレクトロポレーション、および/または因子の発現のための外因性核酸分子、例えば、mRNA分子のトランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって供給される。
いくつかの態様において、1つまたは複数の転写因子および潜在的なマイクロRNA(例えば、miR-182および/またはmiR-183)は、PiggyBac(PB)トランスポゾンシステムまたは他のトランスポゾンシステムによって供給される。遺伝要素が、例えば1つ以上の転写因子の一過性発現後に細胞から除去され得ることから、そのようなトランスポゾンシステムは、初期細胞への因子送達の安全な方法となるので有利である。
好ましい態様において、1つまたは複数の転写因子および潜在的なマイクロRNA(例えば、miR-182および/またはmiR-183)は、一過性に発現され、および/または発現は初期細胞で誘導される。
一過性および/または誘導された発現または因子の供給、および誘導された光受容細胞の分化または誘導された光受容細胞の生成につながる分化プログラムの誘導の後、外部からの因子の供給を終了することができ、および細胞の光受容体表現型は、内因性因子および/または細胞環境によって供給される因子の発現によって維持することができることから、因子の一過性および/または誘導された供給または発現での態様は、特に有利である。誘導された光受容細胞から供給された因子を取り除いた後、強制的な外部からの因子の供給がないので、これらの細胞はより生理学的に振る舞う可能性がある。したがって、細胞は、因子の除去後、自然に発生する光受容細胞により類似している可能性がある。
本発明の態様において、誘導性発現は、テトラサイクリン依存性の転写制御によって媒介される。テトラサイクリンまたはその誘導体の1つ、例えば ドキシサイクリンは、外因性核酸分子からの転写因子の発現を制御するために、初期細胞に容易に供給でき、また初期細胞から除去することができるので、1つまたは複数の転写因子および潜在的なマイクロRNA(例えば、miR-182および/またはmiR-183)のテトラサイクリン制御の転写活性化による発現は有利である。
さらなる態様において、本発明の方法は、細胞周期阻害剤を初期細胞、好ましくはAraCを投与することを含む。細胞周期阻害剤などの阻害剤は、本発明の方法中に細胞に供給することができる因子と見なされる。そのような阻害剤は、本発明の方法の間に特定の時点で細胞培養培地に単に添加してもよい。そのような阻害剤については、例えば、連続供給および供給の時間枠と同じ時間枠および基準が、転写因子および潜在的なマイクロRNAについて上で概説したように適用される。本発明の方法中の細胞周期阻害剤の使用は、初期細胞の再プログラミングを開始する1つまたは複数の転写因子の後に供給される場合に特に有利であり得る。
いくつかの態様において、細胞周期阻害剤は、初期細胞に1つまたは複数の転写因子を供給した後に、好ましくは1つまたは複数の転写因子を供給した後5日に投与される。いくつかの態様において、細胞周期阻害剤は、1つまたは複数の転写因子を供給した後0.25、0.5、0.75、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20日に初期細胞へ投与される。
本発明の方法の態様において、初期細胞は、例えばマトリゲルなどの基底膜様マトリックス上、またはポリ-L-リジンやポリ- D-リジンなどの光受容細胞の発生または維持をサポートする特定のコラーゲンまたはラミニン分子などの別のゼラチン状タンパク質混合物上で培養される。
いくつかの態様において、本発明の方法は、初期細胞と網膜色素上皮細胞(RPE細胞)との共培養を含む。そのような本発明の方法は、RPE細胞が、初期細胞の誘導された光受容細胞への分化を促進する細胞環境を提供するので、特に有利である。
誘導された光受容細胞の検出に関する態様
本発明の方法の態様において、初期細胞から産生された誘導された光受容細胞は、初期細胞に存在する光受容体レポーターシステムによって決定され、好ましくは、前記光受容体レポーターシステムは、アレスチンおよび/またはロドプシンプロモーター由来の配列などの1つまたは複数の光受容体特異的プロモーター配列、ならびに蛍光タンパク質遺伝子などの1つまたは複数のレポーター遺伝子および/または選択マーカーを含む。
本発明に関する光受容体レポーターシステムの使用は、初期細胞における光受容体表現型の発生を示し、したがって、誘導された細胞のどれが下流の用途に使用できるかについてのガイダンスを提供できるので、有利である。さらに、GFP、RFP、dsRedなどの蛍光レポーター遺伝子の使用は、顕微鏡検査およびフローサイトメトリーを含む、さまざまな方法で光受容体の表現型を検出できる。異なる特異性を有するいくつかの異なるプロモーター配列の使用は、表現型の特定をさらに可能にし、例えば、異なる色の蛍光タンパク質をコードする遺伝子などの異なるレポーター遺伝子を有する錐体および桿体特異的プロモーター配列の同時使用は、検出およびそれに続く本発明の方法の混合培養における桿体様および錐体様細胞の単離を可能にする。例えば、ロドプシンは桿体特異的タンパク質であるため、ロドプシンプロモーターの活性は桿体の表現型の発生を示す。対照的に、アレスチン-3などの特定のアレスチンタンパク質は錐体特異的であり、それらのプロモーターを本発明に関して使用して錐体の発生をモニターすることができる。さらに、抗生物質などの特定の毒性化学物質に対して細胞を耐性にする遺伝子などの選択マーカーは、混合細胞培養から誘導された光受容体を選択するために、光受容体特異的プロモーターの制御下で発現させることができる。
本発明の態様において、誘導された光受容細胞は、誘導されていない初期細胞または誘導された光受容体以外の他の細胞を含み得る細胞培養物から単離される。誘導された光受容体の単離は、マーカー遺伝子または蛍光タンパク質などのタンパク質の使用を通じて、例えば、蛍光活性化セルソーティングを通じて起こり得る。また、誘導された光受容細胞の単離は、例えば表面マーカーの発現に基づいて、磁気細胞分離FACSソーティングを通じて起こり得る。さらに、細胞を化合物に耐性にする発現選択マーカーを介して単離を行うことができるため、誘導されていないすべての細胞が培養物から消失する。当業者は当技術分野で知られているさらなる技術を使用して、誘導された光受容細胞を、さらなる細胞型を含む細胞培養システムから単離することができる。
本発明のさらなる態様において、誘導された光受容細胞からモノクローナルまたはクローン細胞株を生成することが有用である可能性がある。
本発明の態様において、誘導された光受容細胞の生成は、光受容細胞で特異的に発現されるが、本発明の方法の初期細胞では発現されない遺伝子またはタンパク質の発現によって決定される。いくつかの態様において、以下に説明するマーカー分子は、iPSCなどの初期細胞と比較して、誘導された光受容体でより多く発現される。本発明の態様において、誘導された光受容細胞の生成は、内因性のリカバリン、NCAM、OTX、CRX、RCVRN、RHO、OPN1 SWおよび/またはOPN1 LWの発現によって決定される。発現の検出は、例えば、qPCR、抗体媒介検出法、および当業者に知られている他の十分に確立された技術によって、タンパク質またはmRNAレベルで起こり得る。
いくつかの態様において、誘導された光受容細胞の生成は、in vitroアッセイでの神経突起伸長の形成によって決定される。神経突起伸長は、神経上皮光受容体の誘導を示すニューロン表現型の指標である。
いくつかの態様において、初期細胞はiPSCであり、誘導された光受容細胞の生成は、Tra1-60発現の喪失によって決定される。Tra1 -60は、光受容体の表現型が誘導されると初期細胞から消えるiPSCマーカーである。
誘導された光受容細胞に関する態様
さらに本発明は本発明の方法によって生成された誘導された光受容細胞に関する。
さらに、本発明は、本発明の方法によって得られる誘導された光受容細胞に関する。すなわち、本発明は本発明の方法によって生成された細胞と同一の表現型(例えば、特定の遺伝子発現特性、表面マーカーの組み合わせ、細胞形状および/または細胞機能)を示すすべての種類の誘導された光受容細胞に関し、これは、天然に存在する光受容細胞および最先端の方法によって生成された誘導された光受容細胞とは形態が異なる。
例えば、本発明の方法は、本発明の転写因子を供給する異なる手段を使用することによって実行することができることから、本発明の方法によって生成される細胞は、必ずしも構造的特徴によって最もよく記述され得るとは限らない。例えば、転写因子は、外因性核酸によって供給され得る。しかしながら、これらの核酸は、後で細胞から消えて(一過性で)よい。すなわち、細胞は必ずしも外因性核酸の存在によって定義されるとは限らない。同様に、本発明の方法に関し、転写因子の供給後、細胞は内因性転写因子の発現を開始できるため、一定期間後、細胞は内因性因子の発現によって誘導された光受容体表現型を維持しながら、外因性転写因子を検出できなくなる可能性がある。しかしながら、当業者は、本発明の方法によって生成された本発明の細胞を生理学的に存在する光受容細胞と区別するために、例えば、それらの全体的な発現プロファイルの分析によって分析することができる。
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、実施例に記載の誘導された光受容体の特徴を示す光受容細胞を誘導する。本発明は本明細書に開示される実施例に記載される誘導された光受容細胞にさらに関する。本発明の細胞は、NCAM、OTX2、CRX、RCVRN、RHO、mCAR、OPN I SWおよびOPN 1 LWを含む、実施例で測定された光受容体マーカーの少なくとも1つを発現する。いくつかの態様において、本発明の誘導された光受容体は、SOX2またはOCT4を発現しない。このことに関し、いくつかの態様において、それぞれの因子の発現は、本発明の細胞における発現を、iPSCにおけるそれぞれの因子の発現レベルと比較することによって判断することができる。 例えば、いくつかの態様において、OCT4またはSOX2の欠如は、iPSCでの発現よりも約10%以下の発現レベルに関連している可能性がある。他方、いくつかの態様において、本発明の細胞における光受容体マーカーの発現は、iPSCよりも約10倍高くなり得る。
本発明は、好ましくは、例えば、構成的または誘導性プロモーターまたはプロモーター/エンハンサーの組み合わせなどの適切な制御性核酸配列の制御下にある、GON4Lをコードする配列を含む少なくとも1つの外因性核酸分子を含む誘導された光受容細胞にさらに関する。本発明の細胞は、本明細書に開示される本発明のキットを使用して生成され得る。一般に、本発明の方法またはキットに関連して開示される特徴は、本発明の細胞に関しても関連しおよび本明細書に開示され、逆もまた同様である。
本発明の細胞は、研究開発の目的、例えば、光受容細胞に影響を与えるかまたはそれに作用する潜在的な薬物の同定、テストおよびスクリーニングのために使用することができる。
さらに、本発明は、網膜変性などの網膜症の治療における医薬として使用するための本発明の細胞に関する。細胞は、影響を受けた患者の網膜に移植することができる。本発明の移植される細胞は、異なる分化段階であってよい。例えば、誘導された光受容細胞は、移植の時点で光受容体前駆体段階にあり、網膜への移植後に成熟光受容体に発達する可能性がある。あるいはまたはさらに、より成熟したまたは成熟した誘導された光受容細胞を移植してもよく、ただし、これは個々の患者のニーズと状態に依存する場合がある。
本発明の方法の大きな利点は、患者の治療における医薬として使用され得る、患者特異的に誘導された光受容細胞の供給を可能にすることである。さらに、iPSCバンクからのHLA適合iPSCを使用することにより、iPSCを患者に適合させることで生成された適切な誘導された光受容細胞の供給が可能になる。これは、誘導された光受容細胞の移植または治療の必要性につながる状態が遺伝的である場合に特に有利である。なぜなら、光受容体移植を必要とする疾患につながる遺伝的原因の修正を必要とする可能性がある患者自身の細胞供与に依存することなく、適合する光受容細胞を提供することが可能だからである。
本発明のさらなる態様
本発明は、本明細書に開示される方法に従って、初期細胞から誘導された光受容細胞を産生するためのキットにも関する。本発明のキットは以下を含む:
a. GON4Lおよび任意でさらなる転写因子(好ましくはOTX2および/またはNEUROD1)を初期細胞へ供給するためのベクターシステム、および任意でmiR-182および/またはmiR-183、
b. 初期細胞から生成された誘導された光受容細胞を検出するための試薬、
例えば、
i. 光受容体特異的レポーターシステム
ii. 例えば、OPN1 SW、OPN1 LW、リカバリンおよび/またはNCAMなどの光受容体マーカータンパク質を検出するための抗体、および/または
iii. PCRによって、OTX、CRX、RCVRN、RHO、OPN1 SW、OPN1 MWおよび/またはOPN 1 LWのmRNAを検出するためのプライマー、および
c. 任意で、細胞周期阻害剤、好ましくはAraC。
a. GON4Lおよび任意でさらなる転写因子(好ましくはOTX2および/またはNEUROD1)を初期細胞へ供給するためのベクターシステム、および任意でmiR-182および/またはmiR-183、
b. 初期細胞から生成された誘導された光受容細胞を検出するための試薬、
例えば、
i. 光受容体特異的レポーターシステム
ii. 例えば、OPN1 SW、OPN1 LW、リカバリンおよび/またはNCAMなどの光受容体マーカータンパク質を検出するための抗体、および/または
iii. PCRによって、OTX、CRX、RCVRN、RHO、OPN1 SW、OPN1 MWおよび/またはOPN 1 LWのmRNAを検出するためのプライマー、および
c. 任意で、細胞周期阻害剤、好ましくはAraC。
さらに、本発明は1つまたは複数のプロモーターに作動可能に結合された1つまたは複数の核酸配列を含む発現ベクターシステムに関連するものであって、前記配列は、少なくともGON4L、OTX2およびNEUROD1、ならびに任意でmiR-182および/またはmiR-183を含む1つまたは複数の転写因子(TF)をコードする。ベクターの好ましい態様は下記のとおりである。
本発明は、少なくともGON4L、OTX2およびNEUROD1を含む転写因子の組み合わせにも関する。その組み合わせは、タンパク質形態の転写因子の組み合わせ、転写因子をコードする核酸の組み合わせ、ベクターまたは他の発現可能な態様の転写因子をコードする核酸の組み合わせ、または修飾された細胞において、iPSCなどの初期細胞のレベルを超えるこれらの転写因子の組み合わせに関連してよい。
本発明は、以下の図によってさらに説明される。これらは、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、より詳細に説明するために提供される本発明の好ましい実施形態または態様を表す。
特許および非特許文献の引用されたすべての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、初期細胞から誘導された光受容細胞を産生するための方法を対象とし、該方法は、少なくともGON4Lを含む1つ以上の転写因子(TF)を初期細胞に供給することを含む。
本発明において、誘導された光受容細胞という用語は、天然に存在する光受容細胞またはそのような光受容細胞の前駆細胞に類似する表現型を有する細胞に関するものであり、該誘導された光受容細胞は、光受容細胞ではない初期細胞から発生または分化したものである。誘導された光受容細胞は、光受容体およびそれらの前駆細胞に特異的な1つまたは複数の遺伝子およびタンパク質の発現などの光受容細胞および光受容細胞の前駆細胞の少なくとも互いに組み合わせられた特徴を示し、および/または神経突起の成長を含む光受容体様形態を示す。このようなマーカーには、これらに限定されないが、リカバリン (RCVRN)、ロドプシン、錐体アレスチン(アレスチン-4)、アレスチン-1、NCAM、CRX、NEUROD1、NR2E1、NR2E3、NRL1、OTX2、ONECUT1、PAX6、RAX、RORB、RXRG、SIX3、SIX6、SOX2、THRB、VSX2、OTX 、RHO、OPN1 SW、OPN1 MWおよび/またはOPN1 LWを含む。このようなマーカーの発現は、他の細胞型にもある程度存在する可能性があるが、このようなマーカーは、光受容体の分化に関与していることでよく知られている可能性がある。さらに、初期細胞からの光受容細胞の発生または誘導は、初期細胞のマーカーの不在によってモニターまたは検出され得る。初期細胞のそのような抑制されたマーカーの絶対的な欠如は、本発明による「抑制」のために必要とされない。それは細胞内に低レベル残っている可能性がある。初期細胞のマーカーの抑制は、初期細胞と比較して発現レベルの低下として特徴付けられ得る。適切な対照と比較して減少したレベルは、「抑制」を決定するために使用され得る。同様に、光受容体特異的遺伝子の遺伝子発現の「活性化」は、適切な対照、例えばそれぞれの初期細胞、と比較することによって決定することができる。誘導された光受容体は、バルク集団または単一細胞RNAシーケンシング分析から導き出すことができるそれらの転写プロファイルによって特徴付けられる。そのようなプロファイルは、本発明の誘導された光受容細胞を天然に存在する光受容細胞から区別するために使用することができる。
光受容細胞は、網膜に見られる特殊なタイプの神経上皮細胞であり、視覚的な光伝達が可能である。 光受容体は、光(可視電磁放射)を生物学的プロセスを刺激できるシグナルに変換する。これらの細胞の光受容体タンパク質は光子を吸収し、細胞の膜電位の変化を引き起こす。哺乳類の光受容細胞には、桿体、錐体、および光感受性網膜神経節細胞が含まれる。2つの古典的な光受容細胞は桿体と錐体である。桿体は錐体よりも細く、網膜全体に別々に分布しているが、光伝達をサポートするそれぞれの化学プロセスは似ている。光感受性神経節細胞は視力に直接寄与しないが、概日リズムおよび瞳孔反射をサポートすると考えられている。
桿体は非常に敏感で、単一の光子によってトリガーすることができる。非常に低い光レベルでは、視覚的経験は桿体シグナルのみに基づくため、低い光レベルで色を見ることができない。錐体は、シグナルを生成するために非常に明るい光(つまり、より多くの光子)を必要とする。ヒトでは、異なる波長の光に対する反応するパターンによって区別される、3つの異なるタイプの錐体細胞がある。色の経験は、これら3つの異なるシグナルから計算される。3種類の錐体細胞は、短波長、中波長、および長波長の光に(大まかに)反応する。ヒトの網膜には、約1億2000万個の桿体細胞と600万個の錐体細胞が含まれている。桿体と錐体の数と比率は、動物が主に昼行性であるか夜行性であるかにより、種によって異なる。ヒトの視覚系では、感光性の桿体と錐体に加え、約240万から300万の神経節細胞があり、そのうちの1から2%が感光性である。神経節細胞の軸索は2つの視神経を形成する。
本発明の方法は、1つまたは複数の転写因子を供給することに関する。本発明に関して、転写因子または他の因子、例えば、マイクロRNAを供給することは、転写因子を供給するか、利用可能にするか、初期細胞と接触させるか、または、初期細胞内に転写因子を導入するか、または、初期細胞内または初期細胞のすぐ近くから転写因子を生成することに関する。転写因子は、タンパク質レベルで、または転写因子をコードする核酸の形態で供給され得る。
すなわち、転写因子をコードする外因性核酸分子の送達の場合、転写因子は、外因性核酸分子由来のタンパク質の発現時に供給される。転写因子は、任意の所与の核酸分子からの発現を介して供給することができる。これには、内因性または外因性の核酸分子からのそれぞれの転写因子の発現の活性化が含まれる。さらに、転写因子は、例えばタンパク質トランスフェクションによって、細胞に直接送達することができる。好ましくは、転写因子の発現は、初期細胞(例えば、iPSC)よりも多い量で起こる。
転写因子の供給は、外因性核酸分子などの核酸分子由来の発現によって起こり得る。本明細書で使用される「核酸」は、DNA、RNA、およびそれらのハイブリッドまたはそれらの修飾変異体を含むがこれらに限定されない任意の核酸分子を意味するものとする。「外因性核酸」または「外因性遺伝要素」は、細胞に導入された任意の核酸に関連し、細胞の「元の」または「天然の」ゲノムの構成要素ではない。外因性核酸は、標的間葉系幹細胞の遺伝物質に組み込まれてよく、または組み込まれなくてもよく、または安定して形質導入された核酸に関連する可能性がある。外因性核酸の送達は、初期細胞における外因性核酸分子の恒久的な組み込みを介して、初期細胞の遺伝子改変をもたらす可能性がある。しかしながら、外因性核酸の送達は一過性でよく、これは、1つまたは複数の転写因子を供給するために送達された遺伝物質が特定の時間後に細胞から消失することを意味する。
核酸分子の送達および初期細胞(例えば、哺乳類またはヒトの細胞、好ましくはヒトiPSC)の潜在的な遺伝子改変は、一般的に利用可能な技術を使用する当業者によって実行および決定され得る。例えば、初期細胞のゲノムまたはその一部の遺伝子改変配列決定を検出するために可能であり、それにより、外因性核酸が存在するかどうかを同定する。あるいは、外因性遺伝物質を同定/増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの他の分子生物学的技術を適用することができる。外因性核酸は、ベクター配列、または遺伝子改変の部位に残っているベクター配列の一部によって検出され得る。ベクター配列(例えば、治療用導入遺伝子に隣接するベクター配列)をゲノムから除去できる場合でも、「非天然」のゲノム位置で治療遺伝子を組み込んだゲノム配列を検出することによる配列決定努力によって、治療用導入遺伝子の追加を検出してもよい。
核酸分子を送達するための任意の所与の遺伝子送達方法は、本発明に包含され、好ましくは、ウイルスまたは非ウイルスベクター、ならびにトランスフェクションの生物学的または化学的方法に関する。本方法は、使用するシステムで安定した遺伝子発現または一過性の遺伝子発現をもたらすことができる。さらに、哺乳動物細胞にタンパク質を送達するための当業者に知られている任意の方法は、1つまたは複数の転写因子および/またはマイクロRNAまたは他の因子の供給に関して、本発明に包含される。核酸分子およびタンパク質、ならびに本発明の方法に関連して因子として作用することができる他の生物学的および化学的分子、を送達するためのすべての既知の方法が包含される。これには、特にマイクロインジェクション、トランスフェクション、形質導入、小胞融合(vesicle fusion)、およびエレクトロポレーションが含まれる。
遺伝子組換えウイルスは、哺乳類細胞、特に幹細胞への遺伝子の送達に広く適用されている。本発明に関し、ウイルスベクターを使用してもよい。
好ましくは本明細書に記載される初期細胞の遺伝子改変用ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、特に、ガンマレトロウイルスベクターに関する。ガンマレトロウイルス(哺乳類C型レトロウイルスと呼ばれることもある)は、レンチウイルスクレードの姉妹属であり、レトロウイルスファミリーのオルソレトロウイルス亜科のメンバーである。マウス白血病ウイルス(MLVまたはMuLV)、ネコ白血病ウイルス(FeLV)、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス(XMRV)、およびテナガザル白血病ウイルス(GALV)はガンマレトロウイルス属のメンバーである。当業者は、MSCの遺伝子改変におけるガンマレトロウイルスの利用に必要な技術を知っている。例えば、Maetzigら(Gammaretroviral vectors: biology,technology and application, 2001 , Viruses Jun;3(6):677-713)に記載されるベクターまたは同様のベクターを使用することができる。例えば、単純ガンマレトロウイルスであるマウス白血病ウイルス(MLV)は、ガンマレトロウイルスで改変されたMSCを作成し、対象に送達した後、MSCから治療用導入遺伝子を発現させることに関して、遺伝子治療の効率的な媒体(vehicle)に変換できる。
レンチウイルスはレトロウイルス科のウイルスファミリーのメンバーである(M. Scherrら、Gene transfer intohematopoietic stem cells using lentiviral vectors. CurrGene Ther. 2002 Feb; 2(1 ):45-55)。
レンチウイルスベクターは、LTRおよびシス作用性パッケージングシグナルを除くウイルス配列全体の欠失によって生成される。得られたベクターは約8kbのクローニング能力を持っている。これらのベクターとレトロウイルスベクターの際立った特徴の1つは、分裂細胞、非分裂細胞、および最終分化細胞に形質転換する能力である。
本発明はそれを必要とする対象への発現ベクターの投与をさらに包含する。「ベクター」は、核酸を宿主細胞に移すための任意の手段である。好ましいベクターは、付着されたセグメントの複製をもたらすために別のDNAセグメントが付着し得るレプリコンに関する。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、具体的には、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで核酸を細胞に導入するための手段を指す。ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、水疱瘡、バキュロウイルス、ワクシニア、単純ヘルペス、エプスタインバーおよびアデノウイルスのベクターが含まれるが、これらに限定されない。
アデノウイルス、またはレンチウイルスなどのRNAウイルス、または他のレトロウイルスが適用され得る。
アデノウイルスは、遺伝子導入細胞工学のための一連のベクターを生成するために使用されてきた。アデノウイルスベクターの初期生成は、El遺伝子(ウイルス複製に必要)を削除して、4kbのクローニング能力を持つベクターを生成することによって産生された。E3(宿主の免疫応答に関与する)をさらに除去すると、8kbのクローニング能力が可能になった。 E2および/またはE4の除去を含むさらなる世代が生み出されている。
アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)などの非組み込みウイルスシステムは、多くの有利な利点のために、本明細書に記載の遺伝子治療アプローチの好ましい実施形態を示すものである(Asokan et al., Molecular Therapy vol. 20no. 4, 699-708参照)。例えば、AAVは、ヒトにおける免疫応答を誘発する能力が非常に限られているため、遺伝子治療で特に興味深いものであり、これは、免疫関連の病状のリスクを軽減しながら、ベクターの形質導入効率にプラスの影響を与える要因である。AAVゲノムは典型的には、長さが約4.7キロベースのポジティブまたはネガティブセンスの一本鎖デオキシリボ核酸(ssDNA)で構成されています。AAVゲノムは、DNA鎖の両端にある逆方向末端反復配列(ITR)と、2つのオープンリーディングフレーム(ORF)(repとcap)で構成されている。遺伝子治療ベクターとしてのAAVの開発は、ベクターのDNAからrepとcapを除去することにより、ベクターの組み込み能力を排除した。任意の所与の所望の遺伝子、および遺伝子の転写を駆動するためのプロモーター(例えば、本明細書に記載の本発明のTGIF2)は、一本鎖ベクターDNAが宿主細胞のDNAポリメラーゼ複合体によって二本鎖DNAに変換された後、核内でのコンカテマー形成を助ける逆方向末端反復配列(ITR)の間に挿入される。AAVベースの遺伝子治療ベクターは典型的には、宿主細胞の核内でエピソームコンカテマーを形成する。非分裂細胞では、これらのコンカテマーは宿主細胞の寿命の間無傷のままである。分裂中の細胞では、エピソームDNAが宿主細胞のDNAと一緒に複製されないため、AAV DNAは細胞分裂によって失われる。
ウイルスに関しては、これらは好ましくは事前に精製されている(例えば、塩化セシウム勾配での遠心分離、カラムクロマトグラフィー、プラーク精製などによって)。それらは、1mlあたり104から1015粒子、好ましくは105から1012粒子の割合でパッケージされ得る。
従来のプラスミド導入およびインテグラーゼまたはトランスポザーゼ技術の使用による標的遺伝子組み込みの適用を含む代替戦略などの非ウイルス法も使用することができる。これらは、効率的であり、かつ、多くの場合、組み込みにおいて部位特異的であるという利点を持つベクター形質転換のアプローチを代表する。ベクターを細胞に導入するための物理的方法は、当業者に公知である。1つの例としてエレクトロポレーションに関し、これは、膜の静電容量を克服することによって膜に一時的な細孔を形成する、短時間の高電圧電気パルスの使用に依存する。この方法の利点の1つは、ほとんどの細胞型で安定した遺伝子発現と一過性の遺伝子発現の両方に利用できることである。代替方法は、リポソームまたはタンパク質形質導入ドメインの使用に関する。適切な方法は当業者に知られており、本発明の実施形態を限定することを意図するものではない。さらに、mRNAトランスフェクションなどのRNA分子の送達は、外因性核酸からの転写因子を供給するための本発明の方法に関するものに含まれる。
さらに、因子を供給するための外因性核酸分子の送達は、転位因子(transposable element)によって達成され得る。例えば、Sleeping Beauty、Tol2および/またはPiggyBacトランスポゾンシステムまたは類似するシステムが使用されてよい。PiggyBac (PB) トランスポゾンは、「カットアンドペースト」メカニズムを介してベクターと染色体の間で効率的に転位する可動遺伝要素である。転位の間、PBトランスポザーゼは、トランスポゾンベクターの両端にあるトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列(ITR)を認識し、内容物を元の部位から効率的に移動して、TTAA染色体部位に効率的に組み込む。PiggyBacトランスポゾンシステムの強力な活性により、PBベクター内の2つのITR間の目的の遺伝子を標的ゲノムに容易に動員することができる。TTAA特異的トランスポゾンPiggyBacは、哺乳類やヒトの細胞、特に幹細胞やiPSCなど、さまざまな細胞の遺伝子工学に非常に役立つトランスポゾンである。
本発明の方法で使用される転写因子および他の因子の供給は、一時的または永続的であり得る。例えば、供給が核酸分子からの発現によって達成される場合、転写因子の発現は、構成的プロモーターまたは初期細胞ならびに誘導された光受容細胞において活性であるプロモーターの制御下で恒久的に活性であり得る。あるいは、転写因子の発現および供給は一時的であってもよい。これは、転写因子をコードする核酸分子が細胞から除去または消失するため、または発現が制御可能であり、たとえば制御された転写活性化を使用することによってオンとオフを切り替えることができるためである。本発明に関し、一過性の発現は、永続的な発現とは対照的に、核酸分子由来の因子の一時的な発現のみを指す。一過性の発現は、送達されたmRNA分子からの発現に基づくことができ、これは細胞内で時間とともに分解されるため、発現は送達されたmRNAが分解されていない場合にのみ生じる。
一過性発現は、他の例では、コードされた遺伝子の発現を駆動する制御可能な遺伝要素を含む外因性DNA分子からの遺伝子発現の誘導を通じて起こり得るものであり、したがって、誘導性遺伝子発現を含む。そのようなシステムにおいて、遺伝子発現は、例えば、化合物、例えば、遺伝子発現の活性化をもたらす抗生物質分子または薬物などの化合物の投与を介して、外部から制御することができる。そのようなシステムは当技術分野で十分に説明されており、当業者に公知である。
本発明に関して使用され得る遺伝子発現システムは、選択された遺伝子産物の産生のために特別に設計されたシステムである。これは通常タンパク質であるが、マイクロRNAなどのRNAの場合もある。発現システムは、通常DNAによってコードされる遺伝子と、提供された試薬を使用してDNAをmRNAに転写し、mRNAをタンパク質に翻訳するために必要な分子機構で構成される。したがって、発現システムはしばしばいくつかの方法において人工的であるが、遺伝子発現に必要な機構の特定の部分は、標的細胞によって提供される場合がある。
例えば、誘導性および/または制御された遺伝子発現は、テトラサイクリン制御の転写活性化を使用することによって達成することができる。テトラサイクリン制御転写活性化は、抗生物質テトラサイクリンまたはその誘導体の1つ(例えば、ドキシサイクリン)の存在下で転写が可逆的にオンまたはオフになる誘導性遺伝子発現の方法である。テトラサイクリン制御遺伝子発現は、グラム陰性菌に見られるテトラサイクリン抗生物質治療に対する耐性のメカニズムに基づくものであり、Ptetプロモーターは、リプレッサーであるTetRと、テトラサイクリン抗生物質を細菌細胞から排出するタンパク質であるTetAを発現する。Tet-OnシステムとTet-Offシステムの違いは、トランス活性化因子が遺伝子をオンにするかオフにするかではなく、両方のタンパク質が発現を活性化することである。その違いは、テトラサイクリンまたはドキシサイクリン(Dox、より安定したテトラサイクリン類似体)に対するそれぞれの応答に関連する。Tet-OffはDoxの非存在下で発現を活性化するが、Tet-OnはDoxの存在下で活性化する。
本発明に関し、転写因子(TF)という用語 は、特定のDNA配列に結合することにより、DNAからメッセンジャーRNAへの遺伝子情報の転写速度を制御するタンパク質に関する。転写因子の機能は、遺伝子を調節(オンとオフ)して、細胞と生物の生涯を通じて、適切な細胞で適切なタイミングで適切な量で遺伝子が発現されるようにすることである。転写因子のグループは、協調して機能し、生涯を通じて細胞分化、細胞分裂、細胞増殖、および細胞死、胚発生中の細胞移動と組織化(ボディプラン)を方向づけ、ならびに、ホルモンなどの細胞外からのシグナルに断続的に応答して方向づけする。転写因子は、特定の遺伝子へのRNAポリメラーゼ(DNAからRNAへの遺伝子情報の転写を実行する酵素)の動員を促進(活性化因子として)または遮断(抑制因子として)することにより、単独で、または複合体の他のタンパク質と一緒に機能する。転写因子の明確な特徴は、転写因子が制御する遺伝子に隣接する特定のDNA配列に結合する、少なくとも1つのDNA結合ドメイン(DBD)を含むことである。
転写因子は、哺乳動物細胞の異なる細胞型への再プログラミングまたは定方向分化(directeddifferentiation)に使用することができる。 初期細胞/開始細胞(staring cell)における異なる細胞型の誘導は、1つまたは複数の転写因子を供給することにより達成され得る。本発明に関して、用語「初期細胞(initial cell)」は、この細胞において光受容体表現型を誘導するための開始点として使用される細胞であって、少なくとも転写因子GON4Lが細胞内に供給されるものに関連する。本発明に関して、任意の種類の細胞、好ましくは哺乳動物細胞が初期細胞として使用することができる。好ましくは、初期細胞はヒト細胞である。細胞は、すべての既知の生物の基本的な構造的、機能的、および生物学的単位である。細胞は生命の最小単位である。細胞はしばしば「生命の構成要素」と呼ばれる。
本発明の好ましい初期細胞は、幹細胞を含む多能性(pluripotent)または複能性(multipotent)の哺乳類細胞である。好ましくは、初期細胞は哺乳類、好ましくはヒト人工多能性幹細胞(iPSC)を含むヒト細胞である。iPSCは、成体細胞から直接生成できる多能性幹細胞の一種である。iPSCは、細胞培養で無限に増殖することができるだけでなく、体内またはそれぞれの哺乳類生物、例えば、ニューロン、心臓細胞、膵臓細胞、肝臓細胞などのヒトの器官に他のすべての細胞型を生じさせることもでき、iPSCは損傷や病気で失われた細胞を置き換えるために使用できる単一の細胞の供給源を代表する。最もよく知られているタイプの多能性幹細胞は胚性幹細胞である。しかしながら、胚性幹細胞の生成には着床前段階の胚の操作が含まれるため、それらの使用をめぐって多くの倫理的論争があった。さらに、胚性幹細胞は胚からしか得られないため、これまでのところ、患者に合った胚性幹細胞株を作成することは不可能だった。iPSCは成人組織から直接誘導できるため、胚の必要性を回避するだけでなく、患者に合わせた方法で作成することもでき、すなわち、各個人が独自の多能性幹細胞株を持つことができる。自家細胞のこれらの無制限の供給は、免疫拒絶のリスクなしに移植片を生成するために使用することができる。さらに、iPSCおよびiPSC由来の細胞は、個別創薬や患者固有の疾患の基礎の理解に使用できる。これはまた、ヒト患者特異的iPSCに由来することができる本発明の誘導された光受容細胞にも当てはまる。iPSCは典型的には、特定の多能性関連遺伝子のセット、または「再プログラミング因子」の産物を所与の細胞型に導入することによって得られる。再プログラミング因子のオリジナルのセットは、転写因子Oct4(Pou5f1)、Sox2、cMyc、およびKlf4である。この組み合わせはiPSCの産生において最も一般的であるが、各因子は、関連する転写因子、miRNA、小分子、または系統指定子(lineage specifier)などの非関連遺伝子でさえ機能的に置き換えることができる。細胞の再プログラミングに必要な因子のそのような置き換えは、他の細胞の再プログラミングの取り組みにも当てはまる。
さらに、本発明に関して使用される初期細胞は、本発明の意味での光受容体ではない、線維芽細胞、網膜前駆細胞(RPC)、網膜色素上皮(RPE)細胞、ミューラーグリア細胞、および眼や網膜に見られるその他の細胞型である。
本発明の方法は初期細胞への転写因子GON4Lの供給を包含する。GON4Lは、ヒトではGON4L遺伝子によってコードされるタンパク質である。これは、2つのセリンリン酸部位とリジン-グルタミン架橋を含む核タンパク質であり、転写因子であると考えられる。GON4Lのホモログは、植物、線虫、ハエ、マウス、魚の細胞周期調節および/または胚のパターン形成において保存された役割を果たす。しかしながら、形態形成へのGON4Lまたは他のクロマチン因子の寄与は特によく理解されていない。
好ましくは本発明は、CRX、NEUROD1、NR2E1、NR2E3、NRL1、OTX2、ONECUT1、PAX6、RAX、RORB、RXRG、SIX3、SIX6、SOX2、THRBおよびVSX2から選択される1つまたは複数の転写因子の供給にさらに関する。これらの転写因子は、光受容細胞の分化および発生に非常に関連性があると説明されている。
OTX2は、ヒトではOTX2遺伝子によってコードされるタンパク質である。この遺伝子は、ホメオドメインを含む転写因子のビコイド(bicoid)サブファミリーのメンバーをコードする。このコードされたタンパク質は転写因子として機能し、脳と感覚器官の発生に役割を果たす可能性がある。適切な前脳の発生には、マウスの同様のタンパク質が必要である。この遺伝子について、異なるアイソフォームをコードする2つの転写変異体が同定されている。他の選択的スプライシングバリアントが存在する可能性があるが、それらの完全長配列は決定されていない。
NEUROD1/NeuroD1(神経原性分化1)、b2とも呼ばれる、は、NeuroDタイプの転写因子である。それはヒト遺伝子NEUROD1によってコードされている。これは、ベーシックヘリックス-ループ-ヘリックス(bHLH)転写因子のNeuroDファミリーのメンバーである。このタンパク質は他のbHLHタンパク質とヘテロダイマーを形成し、E-boxとして知られる特定のDNA配列を含む遺伝子の転写を活性化する。それはインスリン遺伝子の発現を調節し、この遺伝子の突然変異はII型糖尿病を引き起こす。NeuroDIは、in vivoにおいてマウスの脳内で反応性グリア細胞を機能的なニューロンに変換することがわかっている。
本発明に関し、1つまたは複数の転写因子はタンパク質レベルで、または転写因子をコードする核酸の形態で提供され得る。
GON4L、NEUROD1およびOTX2の好ましいアミノ酸配列は表1にリストされる。
本発明に関し、配列番号3に示されるGON4L アイソフォームB および/または配列番号6に示されるOTX2 アイソフォームの供給は特に有利である。
本発明はそれぞれの転写因子の機能的に類似配列にも関する。アミノ酸配列の置換を介して起こり得る本発明の転写因子に対するタンパク質修飾、およびそのような分子をコードする核酸配列もまた、本発明の範囲内に含まれる。本明細書で定義される置換は、タンパク質のアミノ酸配列に加えられた修飾であり、それにより、1つまたは複数のアミノ酸が同じ数の(異なる)アミノ酸で置き換えられ、原タンパク質とは異なるアミノ酸配列を含むタンパク質を産生する。いくつかの態様において、この修飾により、タンパク質の機能が大幅に変わることはない。付加と同様に、置換は天然または人工の場合がある。タンパク質の機能を著しく変化させることなくアミノ酸置換を行うことができることは当技術分野でよく知られている。これは、修飾が「保存的」アミノ酸置換に関連する場合に特に当てはまり、保存的置換は、あるアミノ酸を同様の特性の別のアミノ酸に置換することである。そのような「保存」アミノ酸は、サイズ、電荷、極性および構造のために、タンパク質の構造および機能に有意に影響を与えることなく置換することができる天然または合成のアミノ酸であり得る。多くの場合、多くのアミノ酸は、タンパク質の機能に悪影響を与えることなく、保存的アミノ酸に置き換えることができる。
一般的に、非極性アミノ酸Gly、Ala、Val、IleおよびLeu;非極性芳香族アミノ酸Phe、TrpおよびTyr;中性極性アミノ酸Ser、Thr、Cys、Gin、AsnおよびMet;正に帯電したアミノ酸Lys、ArgおよびHis;負に帯電したアミノ酸AspおよびGluは、保存的アミノ酸のグループを表す。このリストは網羅的ではない。例えば、Ala、Gly、Ser、場合によってはCysは、異なるグループに属していても、互いに代替できることがよく知られている。
本明細書に説明されたとおり、本発明に関して、1つまたは複数の転写因子は、タンパク質レベルで、または転写因子をコードする核酸の形態で提供され得る。
本発明の核酸配列は、表1に示されるGON4L、NEUROD1およびOTX2タンパク質配列 および機能的に類似する配列をコードする核酸配列を含む。GON4L、NEUROD1およびOTX2タンパク質配列をコードする好ましい核酸配列は表2にリストされる。
本発明の転写因子は、例えばタンパク質タグに対する抗体を使用することにより、標準的な技術を通じて細胞内に供給された転写因子の容易な識別を可能にするタンパク質タグを含み得る。本発明の核酸配列によってコードされ得る好ましいタンパク質タグは、V5タグである。V5タグの代わりに代替タグを使用できる。そのような代替タグは当技術分野で周知であり、当業者が選択することができる。
別の態様において、本発明は1つまたは複数の転写因子、特に、以下を含む群から選択される、GON4Lおよび任意でNEUROD1およびOTX2をコードする1つまたは複数の核酸分子の使用を包含する:
a) ヒトGON4L、好ましくは配列番号8に示されるヒトGON4Lをコードするヌクレオチド配列、および任意でNEUROD1、好ましくは配列番号10に示されるNEUROD1およびOTX2、好ましくは配列番号12に示されるOTX2をコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸分子、
b) a)に示されるヌクレオチド配列に相補的である1つまたは複数の核酸分子、
c) ストリンジェントな条件下でa)またはb)に示されるヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを受ける1つまたは複数の核酸分子、
d) a)、b)またはc)に示されるヌクレオチド配列に機能的に類似するのに十分な配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸分子、
e) 遺伝暗号の結果として、a)からd)に示されるヌクレオチド配列に縮重される1つまたは複数の核酸分子、および
f) 欠失、付加、置換、転座、逆位および/または挿入によって修飾され、および/またはa)からe)に示されるヌクレオチド配列に機能的に類似する、a)からe)のヌクレオチド配列に示される1つまたは複数の核酸分子。
a) ヒトGON4L、好ましくは配列番号8に示されるヒトGON4Lをコードするヌクレオチド配列、および任意でNEUROD1、好ましくは配列番号10に示されるNEUROD1およびOTX2、好ましくは配列番号12に示されるOTX2をコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸分子、
b) a)に示されるヌクレオチド配列に相補的である1つまたは複数の核酸分子、
c) ストリンジェントな条件下でa)またはb)に示されるヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを受ける1つまたは複数の核酸分子、
d) a)、b)またはc)に示されるヌクレオチド配列に機能的に類似するのに十分な配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸分子、
e) 遺伝暗号の結果として、a)からd)に示されるヌクレオチド配列に縮重される1つまたは複数の核酸分子、および
f) 欠失、付加、置換、転座、逆位および/または挿入によって修飾され、および/またはa)からe)に示されるヌクレオチド配列に機能的に類似する、a)からe)のヌクレオチド配列に示される1つまたは複数の核酸分子。
すなわち、 本発明はGON4L、および好ましくはNEUROD1およびOTX2をコードする核酸分子と少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、特に好ましくは90%の配列同一性を有する核酸分子包含する。
本発明の前記特性を維持する、例えば、提供された%配列同一性によって定義される、請求項に記載された核酸および/またはタンパク質の配列変異体は本発明の範囲にも含まれる。そのような変異体は、代替配列を示すが、提供される特定の配列が機能類似体または機能的類似体として知られていることから、GON4L機能および任意でNEUROD1およびOTX2機能などと本質的に同じ特性を維持する。配列同一性は、例えば、BLASTなどのソフトウェアを使用して配列アラインメントを実行するときの同一のヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージに関連する。
遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記載されるようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者によって理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性または配列同一性を有する。それにもかかわらず、コドン使用の違いのために変化するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に予期される。記載された配列同一性に該当する配列の欠失、置換および他の変化もまた、本発明に含まれる。
本発明に関して、用語「マイクロRNA」またはmicroRNA/miRNAは、RNAサイレンシングおよび遺伝子発現の転写後調節で機能する、植物、動物、および一部のウイルスに見られる小さな非コードのRNA分子を指す。miRNAは、mRNA分子内の相補配列との塩基対形成を介して機能する。結果として、これらのmRNA分子は、以下のプロセスの1つまたは複数によってサイレンシングされる:(1)mRNA鎖の2つの部分への切断、(2)そのポリ(A)テールの短縮によるmRNAの不安定化、および(3)リボソームによるmRNAのタンパク質への低い翻訳効率。miRNAは多くの哺乳類細胞型に豊富に存在し、ヒトや他の哺乳類の遺伝子の約60%を標的にしていると考えられる。本発明に関し、ヒトmiR-182 (Gene ID: 406958)およびmiR-183 (GeneID: 406959)の供給は特に有利である可能性がある。
細胞周期阻害剤という用語は、小さな化学分子などのあらゆる種類の分子だけでなく、さまざまなメカニズムを通じて細胞周期の進行を遅らせたり止めたりするタンパク質、核酸、またはその他の分子にも関する。細胞周期の停止はさまざまな段階で誘発される可能性があり、細胞分裂の速度と活発に細胞周期を前にすすめる細胞の数を減少させる。
本発明に関し、細胞周期阻害剤AraCの使用が特に好ましい。AraCは、シタラビンまたはシトシンアラビノシドとも呼ばれ、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、および非ホジキンリンパ腫を治療するための化学療法薬として使用される。多くの細胞周期阻害剤が当技術分野で知られており、当業者が特定することができ、プラジエノリドB、メトトレキサート、ロスコビチン、ダイゼイン、バイカレイン、インジルビン-3'-オキシム、エポチロンB、ナルシクラシン、AZD 5438、ABT751、YC 1、10058-F4、8-クロロデノシン、DIM、プルンバギン、ピリドスタチン五塩酸塩(Pyridostatin pentahydrochloride)、SKPin C1、CPI203、CGP 60474、XL 413塩酸塩、CHMFL-FLT3-122、強力で選択的なFLT3阻害剤、WYE 687二塩酸塩、NSC 23005ナトリウムを含むがこれらに限定されない。
細胞周期阻害剤の投与は、分子がこのようにして細胞に利用可能になった場合の、細胞培養培地への分子の添加に関する。投与という用語はまた、本発明の初期細胞などの治療される細胞内で因子を利用可能にするという意味で本明細書に記載される因子のすべての種類の供給を含む。
したがって、供給される因子は細胞周期阻害剤であってもよい。
本発明の方法の態様において、初期細胞は、例えばマトリゲルなどの基底膜様マトリックス、または光受容細胞の発生または維持をサポートする特定のコラーゲンまたはラミニン分子などの別のゼラチン状タンパク質混合物上で培養される。
マトリゲル:エンゲルブレス-ホルム-スウォーム(EHS)マウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物。マトリゲルは、多くの組織に見られる複雑な細胞外環境に似ており、細胞生物学者が細胞を培養するための基質(基底膜マトリックス)として使用している。同様に、本発明の場合、光受容体様表現型への初期細胞の分化を促進する環境である、培養細胞に好ましい微小環境を提供する特定の細胞培養システムに異なるゼラチン状タンパク質混合物を提供することが可能である。これは、網膜の細胞外マトリックスに豊富に存在する特定のラミニンまたは他の細胞外マトリックスタンパク質を含むマトリックスを供給することによって達成することができる。特に、本発明の細胞を培養し、本発明の方法を実施するためのマトリックスは、ポリ-L-オルニチン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジンおよび/またはラミニン(In)、好ましくはIn323、In423、In523および/またはIn521のようなb-2鎖を有するラミニンを含み得る。
本発明に関して、「光受容体レポーターシステム」という用語は、初期細胞の光受容細胞またはその前駆細胞への分化を示す光受容体様表現型の発生を決定するために使用することができる任意の種類のシステムに関する。このようなシステムは通常、レポート遺伝子またはマーカー遺伝子をコードする外因性核酸配列を使用する。このようなレポーター遺伝子は、好ましくは蛍光タンパク質をコードすることができ、顕微鏡検査、サイトメトリー他などの標準的な技術により発現時に容易に検出することができる。そのようなレポーターまたはマーカー遺伝子の発現は、光受容細胞またはその前駆細胞で典型的に発現される遺伝子のプロモーター配列、またはそのような配列の一部などの遺伝要素の制御下にあってよい。その遺伝的制御要素が光受容体レポーターシステムに関して使用され得るような光受容体特異的遺伝子の例は、錐体アレスチン、ロドプシン、リカバリン、NCAM、OTX、CRX、RCVRN、RHO、OPN1 SW、OPN1 MW および/またはOPN1 LWをコードする遺伝子を含む。当業者は当技術分野で利用可能な光受容細胞の典型的な遺伝子発現プロファイルを見ることによって、光受容体特異的遺伝子またはそのような遺伝子の組み合わせを同定することによって、さらに適切なプロモーター配列を同定することができる。細胞型特異的レポーターシステムの設計は、当業者に公知の明確に定義された技術である。マーカー遺伝子は、抗生物質のような化合物に対する耐性を提供するタンパク質をコードすることもでき、化合物の存在下で光受容体特異的プロモーター配列の制御下でそのようなマーカーを発現する混合培養システムから細胞を選択することを可能にする一方、他の細胞は、それぞれの化合物の存在下では生き残ることができない。
初期細胞を含む混合培養において誘導された光受容細胞を同定するさらなる方法は、初期細胞のマーカーの喪失、例えば、初期細胞としてのiPSCの場合のTra1 -60発現の喪失の検出であってよい。初期細胞の表面マーカーパターンと比較して、蛍光マーカータンパク質の発現および/または光受容細胞およびそれらの前駆細胞の典型的な表面タンパク質発現パターンを使用するフローサイトメトリーによって、細胞を特徴付け、誘導された光受容細胞を同定および単離することができる。
本発明に関して、網膜症という用語は、視力障害を引き起こす可能性がある、目の網膜への損傷に関する。しばしば、網膜症は、網膜血管疾患、または異常な血流によって引き起こされる網膜の損傷を指す。加齢黄斑変性症(Age-related macular degeneration)は、総称網膜症に含まれる。網膜症には網膜血管疾患が含まれ、増殖型と非増殖型に大きく分類できる。多くの場合、網膜症は、糖尿病や高血圧症に見られるような全身性疾患の眼症状である。
網膜症はさらに、加齢黄斑変性症(AMDまたはARMD)としても知られる黄斑変性症に関連し、視野の中心で視力がぼやけたり、視力がなくなったりする可能性のある病状である。時間の経過とともに、患者は片方または両方の目に影響を与える可能性のある視力の段階的な悪化を経験する可能性がある。完全な失明にはならないが、中心視力が失われると、顔の認識、運転、読書、またはその他の日常生活の活動が困難になる可能性がある。視覚的な幻覚も発生する可能性もあるが、これらは精神疾患を表すものではない。黄斑変性症は通常、高齢者に発生するが、遺伝的要因と喫煙も役割を果たす。
網膜の黄斑の損傷が原因と思われる。重症度は、初期、中期、および後期の型に分けられ、これらはすべて、本発明の細胞を使用することによって治療することができる。後期型はさらに「乾式」型と「湿式」型に分けられ、乾式が症例の90%を占め、すべての型が本発明の細胞の移植によって治療され得る。
網膜変性症は、その細胞の進行性の死によって引き起こされる網膜の悪化からなる網膜症である。網膜変性症は、いくつかの理由があり、動脈または静脈の閉塞、糖尿病性網膜症、R.L.F./R.O.P.(後水晶体線維増殖症(retrolental fibroplasia)/未熟児網膜症(retinopathy ofprematurity))、または疾患(通常は遺伝性)を含み、視力障害、夜盲症、網膜剥離、光感受性、トンネル視力、および周辺視力の喪失から視力の完全な喪失など、多くの異なる方法で現れる可能性がある。網膜変性疾患のうち、網膜色素変性症(RP)は非常に重要な例である。ヒトの遺伝性網膜変性疾患は、根本的な原因と臨床転帰において遺伝的および表現型の不均一性を示す。光伝達、ロドプシン分子の生合成と折り畳み、および網膜の構造的支持に関与する遺伝子の破壊など、網膜変性症にはさまざまな原因が考えられる。ロドプシン遺伝子の変異は、北米における常染色体優性網膜色素変性症(autosomal dominant retinitis pigmentosa :adRP)の全症例の約25%から30%を占めている。ロドプシン変異またはロドプシンの機能に関与または影響を与える変異に起因する網膜変性症の多くのメカニズムがある。網膜変性症の1つのメカニズムは、ロドプシンの過剰発現である。突然変異がロドプシンの切断を引き起こす別のメカニズムでは、桿体機能に影響を及ぼし、光受容体の変性率を増加させることがわかった。
細胞移植は、変性した成体神経網膜に対する視覚応答を回復するための新しい治療戦略であり、移植された有糸分裂後の光受容体前駆体は、成体マウス神経網膜に機能的に統合できることが示されている。
本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。これらは、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、より詳細に説明するために提供される本発明の好ましい実施形態または態様を表す。
少量の線維芽細胞から直接再プログラミングすることで光受容体を取得することは可能であるが、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)からin vitroで光受容体を生成するための効率的な2Dプロトコルを確立する必要がある。フォワードプログラミングは、幹細胞の異なる分化経路を活性化する転写因子(TF)の能力に依存している。幹細胞の光受容体への効率的な分化を促進する転写因子の組み合わせを見つけることを目的として、転写因子ライブラリーのライブラリースクリーニングを実行した。
方法
一般的手順
1748個のヒト転写因子からなる転写因子ライブラリーを使用して、特定の網膜細胞タイプ(桿体および錐体光受容体)を生成した。光受容体の発生(例:網膜および前神経褶ホメオボックス(RX)、錐体ロッドホメオボックス(CRX)、錐体アレスチン-3(CAR)、ロドプシン(RHO))の特定の状態で活性化され、異なる遍在性プロモーターからの蛍光タンパク質および選択マーカーの発現を誘導する光受容体特異的レポーター構築物が使用された。いくつかの場合において、複数のレポーターカセットが、レンチウイルス遺伝子導入を介して1つのiPS細胞株に組み込まれた。PiggyBacシステムを使用したレポーターカセットの導入により、さらなるレポーター細胞株が生成された。また、対応するノックイン細胞株が生成された。これらのレポーターヒトiPS細胞株は、網膜オルガノイドで発現をテストし、転写因子ライブラリーを適用するために最高のパフォーマンスを発揮する細胞株を選択した。転写因子誘導時に、蛍光標識された光受容体(CARおよびRHO)および/またはそれらの前駆細胞(RXおよびCRX)をスクリーニングした(図4、右)。並行して、光受容体の発生中に作用する転写因子の既存の知識を使用し、バイアスのかかったアプローチでこれらの選択された転写因子を具体的に適用した(図4、左)。後者の実験では、RX、SIX3、SIX6、LHX2、TLL、OTX2、PAX6、SOX1、SOX2、CRX、ONECUT1、VSX2、NRL、TRB2、NEUROD1、NR2E3、RXRG、RORBを誘導した(8)。これらはライブラリープールからPCR増幅され、個別に、または組み合わせて適用された。また、2つのライブラリーアプローチを組み合わせた。 失敗のリスクを最小限に抑え、限られた発生段階を特定するために、両方のアプローチからトランスクリプトミクスデータを生成した。光受容体をもたらすトランスクリプトミクスプロファイルと遺伝的プログラムを比較する。幹細胞由来の光受容体生成の重要なステップや落とし穴を特定し、デバッグするためには、中間的に停止している光受容体前駆細胞のプロファイルが特に興味深い。
桿体と錐体の光受容体は、それらの特定の遺伝子発現プロファイルによって簡単に区別できる。一般的に、これらの細胞型はin vivoで十分に特徴付けられているため、比較による不具合対策(comparativetroubleshooting)を実行できる。細胞の特性評価では、光伝達カスケードメンバーに対する特異的抗体、および機能的なパッチクランプ記録を適用して、誘導された光受容体を特性評価する。幹細胞由来の網膜の光受容体における2つのマイクロRNA(miR-182とmiR-183)のアップレギュレーションは、光感受性コンパートメント(外側のセグメント)の形成を促進するのに十分であることを以前に示した (11)。したがって、これらの非コードRNAの過剰発現は、光受容体の機能的成熟に有益である。
特定の実験
レポーターhiPSC株は、16の既知の転写因子のレンチウイルスライブラリーで形質導入され、続けて、1748のヒト転写因子からなる包括的なライブラリーで形質導入された。転写因子のないhiPSCは、レンチウイルスカセットに含まれているマーカーを使用した選択によって死滅させた。細胞の一部を、ドキシサイクリン(dox)で10日間処理することによる転写因子誘導に使用した。形質導入および誘導された細胞のうち、87個が蛍光標識され、個々のウェルに分類された(図5)。単一細胞のRNAを抽出し、分割して単一細胞のqPCR分析と過剰発現した転写因子の検出を行った特に、OTX、CRX、RCVRN、RHO、OPN1 SWおよびOPN1 LWは、過剰発現された転写因子に特異的なRTプライマーを使用することによって同定された。転写因子検出は、PCRによってcDNAから転写因子を増幅し、ゲルにロードし、増幅されたDNAバンドを切り出して配列決定することによって実行された。過剰発現された転写因子の同定に基づき、本発明の好ましい転写因子、特にGON4L、NEUROD1およびOTX2は、錐体表現型を誘導するのに特に効率的であると同定された(図6)。転写因子の組み合わせは、多能性マーカー(Tra1 -60)の喪失とニューロンマーカー(NCAM)のアップレギュレーションおよびレポーターカセットからの蛍光を検出するフローサイトメトリーを使用して、hiPSCレポーター株で検証された。
使用される転写因子をコードする核酸配列
本発明の実験で使用される転写因子GON4L、NEUROD1およびOTX2をコードする核酸配列は、表2にリストされるとおり、配列番号9、配列番号11および配列番号13に示される配列である。3つすべての転写因子はその3’末端にV5タグを有することに留意されたい。
細胞培養
PGP1 (GM23338、Coriell)、ATCC DYS0100 (ATCC(登録商標) ACS-1019(商標)、ATCC)およびCRTD5 (CRTD iPSC施設で再プログラミング、Kutsche et al. Cell Systems 2018, Oct24;7(4):438-452) ヒト人工多能性幹細胞 (hiPSC)は、mTeSRI培地(05850、StemCell Technologies)で培養された。hiPSCを追加する前に、通常の組織培養ウェルプレートをhESC認定のマトリゲルマトリックス(354277、Corning)でコーティングし、室温で60分間インキュベートした。hiPSCは標準状態(5% CO2、37℃)で培養し、mTeSRI培地を毎日交換した。継代では hiPSCはTrypLE Express (12604013、Thermo FisherScientific)を加えることによりウェルから分離し、リン酸緩衝食塩水(PBS、pH 7.2;14190169、Thermo Fisher Scientific)で洗浄し、400 x gでスピンダウンし、そして、3 pg/mlInSolution Y-27632 rhoキナーゼ阻害剤(688001、Merck Millipore)を含むmTeSRI培地の新鮮なマトリゲルコーティング組織培養ウェルに添加した。あるいは、細胞をmFreSR培地 (05854、StemCellTechnologies)中で凍結した。
誘導性転写因子または光受容体レポーターカセットの安定した組み込みは、PiggyBacトランスポゾンシステムを使用して行われた。5’コアインシュレーターおよびPiggyBacベクター骨格PB-TRE-dCas9-VPR13(Addgene plasmid #63800;Chavez et al., 2015, Nat Methods. 2015 Mar 2. doi:10.1038/nmeth.3312)のSV40 polyA部位間のすべてのベクター要素は、対応するDNA断片に置き換えられた。10pgのプラスミドを2pgのSuper PiggyBacトランスポザーゼ発現ベクター(PB210PA-1-S、Biocat)と混合し、Lonza 4D Xユニット、パルスCB-156、およびP3 Primary Cell 4D-NucleofectorKit L(V4XP-3024、Lonza)を使用してhiPSCにエレクトロポレーションした。選ばれた選択カセットに従って、ブラストサイジン(25pg/ml)、ピューロマイシン(0.5-1 pg/ml)、またはハイグロマイシンB(250 pl/ml)を適用した。
標準的なレンチウイルス形質導入は、転写因子スクリーニングのために実行された。感染多重度が1になるように、細胞数とウイルス粒子を調整した。光受容体レポーターカセットを含むPGP1 iPSCは、バイアスのない転写因子ライブラリー(レンチウイルスpLIX_403骨格中にそれぞれ含まれる1748個の転写因子(Addgene plasmid 41395))または選択された転写因子のライブラリー(Addgene plasmid 61473由来の骨格)のいずれかで連続的に形質導入され、その後、対応する選択マーカーによって選択された。
hiPSCを区別するための転写因子誘導:
TeTOnプロモーターからの転写は、0.5 pg/mlのドキシサイクリン(D9891、Sigma-Aldrich)をmTeSRI培地に適用することによって誘導された。
TeTOnプロモーターからの転写は、0.5 pg/mlのドキシサイクリン(D9891、Sigma-Aldrich)をmTeSRI培地に適用することによって誘導された。
光受容体レポーターシステムの詳細
光受容体レポーターシステムはPiggyBacベクター PB-TRE-dCas9-VPR13 (Addgene plasmid #63800; Chavez et al. , 2015, Nat Methods. 2015 Mar 2. doi:10.1038/nmeth.3312)に基づく。5’コアインシュレーターおよびSV40 polyA部位間のすべてのベクター要素は、マウス錐体アレスチンプロモーター(mCAR、Busskamp et al. Science 2010, Jul23;329(5990):413-7)から駆動されるeGFPカセットに置き換えられるか、または、赤色蛍光タンパク質dsREDを駆動するヒトロドプシンプロモーター(RHO、Busskamp et al. Science 2010, Jul 23;329(5990):413-7)に置き換えられた。蛍光タンパク質の下流に、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント(WPRE)と、ユビキチンCプロモーターから駆動されるブラスチシン選択カセット(両者Addgene plasmid 61473から取得)が追加された。対応するベクターpb-mCAR-EGFP-UBC-Blastiおよびpb-Rho-dsRed-UBC-BlastiをPGP1 hiPSCに共ヌクレオフェクト(co-nucleofect)し、両方のコンストラクトが組み込まれたトランスジェニッククローンを選択した。
それぞれの実験で使用された細胞周期阻害剤および他の成分の濃度
シトシンb-D-アラビノフラノシド塩酸塩(Ara-C、C6645、Sigma)を最終濃度5mMで24時間使用して、神経細胞培養物中の分裂細胞を枯渇させた。
結果
選別された細胞の87%は、テストされた光受容体特異的遺伝子の少なくとも1つに対してqPCR陽性であり、スクリーニングの細胞型精度を示している。GON4L、場合によってはOTX2およびNEUROD1を含むテスト済みの転写因子の組み合わせのいくつかは、多能性マーカーTra1-60の有意な喪失と、5日間の過剰発現後のニューロンマーカーNCAMのアップレギュレーションをもたらし(hiPSC:0.47±0.07%、hiPSC-TF:75.23±3.7%;平均±SEM、ウェルチの両側t検定; p =0.002)、細胞がニューロン系統に向かって分化していることを示す 。
さらに、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーは、10日後にGFP陽性細胞を検出し、錐体光受容体の存在を示唆した。
結論
我々は、in vivo研究とヒト転写因子ライブラリーに基づいて転写因子を体系的にスクリーニングし、in vitroでヒト光受容体を操作するという最終目標を達成するのに役立つ組み合わせを見つけた。我々のデータは、既知の因子が光受容体の分化を促進するには不十分であることを示唆しており、hiPSCからの光受容体の生成には追加の転写因子、特にGON4Lが必要であることを示す。GON4LとOTX2およびNEUROD1の組み合わせは、光受容体分化の効率的な誘導に特に有利だった。インビトロで操作された光受容体は、3Dヒト網膜オルガノイドから解離した場合の数百日と比較して10日以内に十分な量を生成できるため、失明を治療するための細胞移植のドナー材料として役立つ可能性がある。
誘導されたヒト光受容体を盲目のマウス網膜に移植
前述のとおり、光受容体を網膜変性のマウスモデルに移植する多くのアプローチがある。この目的のために、マウスの光受容体前駆細胞を採取して、盲目の網膜の網膜下腔(12~14)に注入することができる。さらに、3dオルガノイドに由来する桿体視細胞前駆細胞を単離して移植を成功させることができる(15)。これらのマウス細胞のごく一部は、宿主マウスの網膜に機能的に組み込まれることが示されている。誘導されたヒトの光受容体はこれまで使用されたことがないため、盲目のマウスの網膜に移植するための出発物質としてこれらの細胞を使用するのは我々が最初である。
移植された光受容体を視覚化して機能的にテストするために、過分極光遺伝学的ツール(16, 17)に融合した蛍光レポーターを注入する前に、これらの細胞にタグを付けることを計画する。蛍光検出に加えて、光遺伝学的ツールを光で刺激することによって光感度をトリガーし、その後、光応答を記録する。疾患マウスモデルの内因性光受容体は光に鈍感であるため、すべての光応答は、移植された、したがって機能的に組み込まれた細胞まで追跡することができる。桿体および錐体の固有の光伝達カスケードは、光遺伝学的センサーよりも感度が高い対数単位である。したがって、刺激のための光レベルを制御することにより、内在的光応答と光遺伝学的光応答の区別が可能になる。
再活性化の成功を測定するために、移植された光受容体から直接パッチクランプ記録を実行する。錐体が既存の網膜回路に組み込まれているかどうかをテストするために、パッチクランプまたは網膜神経節細胞からのMEAによって記録する。回復した視力も、従前に示されたように(16)行動テストを使用して調査される。機能研究に加えて、CRTD光学顕微鏡施設で免疫組織化学的分析を行い、続いて共焦点および電子顕微鏡を行う。また、正常に組み込まれたヒト光受容体のトランスクリプトミクスプロファイルを研究し、失敗したものと比較して、錐体の組み込みを改善するための限界生物学的パラメーターを決定する。
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14. Santos-Ferreira, T., et al., Stem Cells, 2015 Jan;33(1 ):79-90.
15. Gonzalez-Cordero, A., et al., Nat Biotechnol,2013 Aug;31 (8):741 -7.
16. Busskamp, V., et al., Science, 2010, Jul23;329(5990):413-7.
17. Chuong, A.S., et al., Nat Neurosci,2014, Aug;17(8):1 123-9.
図面の用語
cone 錐体
Selected TFs 選択された転写因子
TF Library 転写因子ライブラリー
Lentiviral production レンチウイルス産生
Conditional PR reporter iPS条件付きPRレポーターiPS
FACS and TF identification FACSおよび転写因子識別
Debugging デバッグをする
End point characterization Functional tests Revealing in vitro PR neurogenesispathways in vitroのPR神経新生経路を明らかにするエンドポイントの特性機能テスト
Transplanting human photoreceptors in blind mouse retinas盲目のマウス網膜へのヒト光受容体の移植
cell 細胞
qPCR photoreceptor gene panel qPCR光受容体遺伝子パネル
Transcription factors 転写因子
Biased group バイアス群
Fold change 倍変化
days 日数
Seeding 播種
daily media change毎日の培地交換
Dissociating and FACS of GFP+ cells GFP+細胞の解離とFACS
GFP+ viable GFP+生存
GFP viable analysis GFP生存解析
cone 錐体
Selected TFs 選択された転写因子
TF Library 転写因子ライブラリー
Lentiviral production レンチウイルス産生
Conditional PR reporter iPS条件付きPRレポーターiPS
FACS and TF identification FACSおよび転写因子識別
Debugging デバッグをする
End point characterization Functional tests Revealing in vitro PR neurogenesispathways in vitroのPR神経新生経路を明らかにするエンドポイントの特性機能テスト
Transplanting human photoreceptors in blind mouse retinas盲目のマウス網膜へのヒト光受容体の移植
cell 細胞
qPCR photoreceptor gene panel qPCR光受容体遺伝子パネル
Transcription factors 転写因子
Biased group バイアス群
Fold change 倍変化
days 日数
Seeding 播種
daily media change毎日の培地交換
Dissociating and FACS of GFP+ cells GFP+細胞の解離とFACS
GFP+ viable GFP+生存
GFP viable analysis GFP生存解析
Claims (15)
- 初期細胞から誘導された光受容細胞を産生する方法であって、該方法は少なくともGON4Lを含む1つまたは複数の転写因子(TF)を初期細胞に供給することを含む、方法。
- 初期細胞は人工多能性幹細胞(iPSC)である、請求項1に記載の方法。
- CRX、NEUROD1、NR2E1、NR2E3、NRL1、OTX2、ONECUT1、PAX6、RAX、RORB、RXRG、SIX3、SIX6、SOX2、THRBおよびVSX2から選択される1つまたは複数の転写因子を初期細胞に供給することを含む、請求項1または2に記載の方法。
- GON4L、OTX2およびNEUROD1の転写因子の組み合わせが初期細胞に供給されることを含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたは複数の転写因子は、初期細胞内の1つまたは複数の外因性核酸分子から(好ましくは、ヒトiPSCにおける発現よりも高いレベルで)発現されるものであって、好ましくは、1つまたは複数のウイルスベクターから発現され、好ましくはレンチウイルスベクターから発現される、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 初期細胞には、1つまたは複数の転写因子が少なくとも4日間、好ましくは約7~10日間供給される、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたは複数の転写因子は一過性に発現され、および/または発現は初期細胞で誘導される、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞周期阻害剤、好ましくはAraCを初期細胞に投与することを含み、該細胞周期阻害剤は、初期細胞に、好ましくは1つまたは複数の転写因子を供給した後投与され、好ましくは1つまたは複数の転写因子を供給した5日後に投与される、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 初期細胞から産生された誘導された光受容細胞は、初期細胞に存在する光受容体レポーターシステムによって決定され、前記レポーターシステムは、アレスチンプロモーターおよび/またはロドプシンプロモーター由来の配列などの1つまたは複数の光受容体特異的プロモーター配列、ならびに蛍光タンパク質遺伝子などの1つまたは複数のレポーター遺伝子および/または選択マーカーを好ましくは含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 誘導された光受容細胞の生成は、内因性のリカバリン、NCAM、OTX、CRX、RCVRN、RHO、OPN1 SWおよび/またはOPN1 LWの発現によって決定される、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 誘導された光受容細胞は錐体である、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1~11のいずれか1項に記載の方法によって得ることが可能な誘導された光受容細胞。
- 請求項1~11のいずれか1項に記載の方法による初期細胞由来の誘導された光受容細胞を産生するためのキットであって、
a. GON4Lおよび任意でさらなる転写因子(好ましくはOTX2および/またはNEUROD1)を初期細胞へ供給するためのベクターシステム、
b. 初期細胞から生成された誘導された光受容細胞を検出するための試薬、
例えば、
i. 光受容体特異的レポーターシステム、
ii. 例えば、OPN1 SW、OPN1 LW、リカバリンおよび/またはNCAMなどの光受容体マーカータンパク質を検出するための抗体、および/または
iii. PCRによって、OTX、CRX、RCVRN、RHO、OPN1 SW、OPN1 MWおよび/またはOPN 1 LWのmRNAを検出するためのプライマー、および
c. 任意で、細胞周期阻害剤、好ましくはAraC、
を含む、キット。 - 1つまたは複数のプロモーターに作動可能に結合された1つまたは複数の核酸配列を含む発現ベクターシステムであって、前記配列は、少なくともGON4L、OTX2およびNEUROD1、ならびに任意でmiR-182および/またはmiR-183を含む1つまたは複数の転写因子(TF)をコードする、発現ベクターシステム。
- 少なくともGON4L、OTX2およびNEUROD1を含む転写因子の組み合わせ。
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