CN114514314A - 小白蛋白阳性神经细胞的制造方法、细胞及分化诱导剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种小白蛋白阳性神经细胞的制造方法，包含在细胞内诱导Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因的表达的诱导表达工序，以及培养上述诱导表达后的细胞而由上述细胞分化小白蛋白阳性神经细胞的分化工序。一种细胞，其以能表达的方式导入有Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因。以及一种分化诱导剂，其含有Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因或它们的基因产物作为有效成分，用于将细胞分化诱导为小白蛋白阳性神经细胞。

Description

小白蛋白阳性神经细胞的制造方法、细胞及分化诱导剂
技术领域
本发明涉及小白蛋白阳性神经细胞的制造方法、细胞和分化诱导剂。
本申请基于2019年8月29日在日本提出申请的特愿2019-157194号而要求优先权，在此引用其内容。
背景技术
小白蛋白(Parvalbumin)阳性神经细胞是与脑神经系统的疾病相关的重要的神经细胞之一，小白蛋白阳性神经细胞的存在量、功能下降被认为会引发各种精神神经疾病、神经发育障碍(非专利文献1、非专利文献2)。因此，长久以来其功能解析受到关注，特别是近年来，强烈期望由人iPS细胞等多能干细胞来制作小白蛋白阳性神经细胞的技术。
但是，虽然也有报告将部分包含小白蛋白阳性神经细胞等的抑制性神经细胞进行特异性分化诱导的方法，但小白蛋白阳性神经细胞自身的诱导效率极低(非专利文献3)。另外，在非专利文献4中报告了一种小白蛋白阳性神经细胞的出现率为现有诱导法中最高效率的方法，但是，该方法需要经过多个分化诱导工序，且产生小白蛋白阳性神经细胞需要80天左右，然后产生的小白蛋白阳性神经细胞的阳性率为20～30％左右。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Lewis DA et al.,Trends Neurosci.2012Jan；35(1):57-67.
非专利文献2:Rodriguez RA et al.,Front Mol Neurosci.2018Apr 24；11:132.
非专利文献3:Yang N.et al.,Nat Methods.2017Jun；14(6):621-628.
非专利文献4:Yuan F.et al.,eLIFE.2018Sep 25；7.pii:e37382.
发明内容
本发明的目的在于提供一种分化诱导工序少、在短时间以高效率制造小白蛋白阳性神经细胞的制造方法、能诱导为上述小白蛋白阳性神经细胞的细胞、和用于分化诱导为上述小白蛋白阳性神经细胞的分化诱导剂。
本发明包含以下方式。
[1]一种小白蛋白阳性神经细胞的制造方法，包含：诱导表达工序，在细胞内诱导Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因的表达；以及分化工序，培养上述诱导表达后的细胞而由上述细胞分化小白蛋白阳性神经细胞。
[2]根据[1]所述的小白蛋白阳性神经细胞的制造方法，其中，上述诱导表达工序包含将Ascl1基因和Dlx2基因以能表达的方式导入到上述细胞内的基因导入工序。
[3]根据[2]所述的小白蛋白阳性神经细胞的制造方法，其中，上述诱导表达工序进一步包含以能表达的方式导入MEF2C基因的基因导入工序。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的制造方法，其中，上述Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因为四环素调控性(Tet-ON)。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的制造方法，其中，上述诱导表达工序包含同时诱导表达选自微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因中的至少1种的工序。
[6]根据[5]所述的制造方法，其中，上述诱导表达工序包含以能表达的方式导入选自微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因中的至少1种的基因导入工序。
[7]根据[5]或[6]所述的制造方法，其中，上述微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因为四环素调控性(Tet-ON)。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的制造方法，其中，上述细胞为成纤维细胞或多能干细胞。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的制造方法，其中，上述诱导表达工序进行1～5天。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的制造方法，其中，上述分化工序进行10天以上。
[11]一种细胞，其以能表达的方式导入有Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因。
[12]根据[11]所述的细胞，其中，上述Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因为四环素调控性(Tet-ON)。
[13]根据[11]或[12]所述的细胞，其中，进一步以能表达的方式导入有选自微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因中的至少1种。
[14]根据[13]所述的细胞，其中，上述微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因为四环素调控性(Tet-ON)。
[15]根据[11]～[14]中任一项所述的细胞，其中，上述细胞为成纤维细胞或多能干细胞。
[16]一种分化诱导剂，其含有Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因、或它们的基因产物作为有效成分，用于将细胞分化诱导为小白蛋白阳性神经细胞。
[17]根据[16]所述的分化诱导剂，其中，上述Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因为四环素调控性(Tet-ON)。
[18]根据[16]或[17]所述的分化诱导剂，其中，进一步含有选自微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因中的至少1种或它们的基因产物作为有效成分。
[19]根据[18]所述的分化诱导剂，其中，上述微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因为四环素调控性(Tet-ON)。
[20]根据[16]～[19]中任一项所述的分化诱导剂，其中，上述细胞为成纤维细胞或多能干细胞。
根据本发明，可以提供分化诱导工序少、在短时间以高效率制造小白蛋白阳性神经细胞的制造方法，能诱导为上述小白蛋白阳性神经细胞的细胞，和用于分化诱导为上述小白蛋白阳性神经细胞的分化诱导剂。
附图说明
图1A表示对人多能干细胞利用piggyBac载体导入与药剂选择进行的克隆的时间进程。
图1B表示对人多能干细胞利用慢病毒(Lentivirus)载体感染与强力霉素进行的Tet驱动性神经诱导的时间进程。图中，MC表示培养基交换，Neurobasal Plus B27 Plus表示神经细胞用培养基，Dox表示强力霉素。
图1C为表示用于基因导入的质粒载体和慢病毒载体的图。图中，CMV、PGK、CAG、EF1a表示恒定表达基因启动子。Puro.R表示嘌呤霉素耐性基因，Hygro.R表示潮霉素耐性基因，Neo.R表示G418耐性基因，Blast.R表示杀稻瘟菌素耐性基因，Tet表示Tet操纵子DNA重复成分，HyPBase表示转座酶，rtTA3G表示反向四环素调控性反式激活因子，ITR表示反向重复序列。
图2为表示小白蛋白基因(PVALB)报告细胞株的制作方案的图。
图3为表示在神经诱导后经过20天(诱导表达5天、分化15天)后的细胞的免疫染色图像的图。图中，PV-GFP表示用Anti-PV抗体的免疫染色图像，GFP/Phase表示明视野图像，Hoechst表示核染色图像，Anti-GFP表示用Anti-GFP抗体的免疫染色图像。+表示基因导入，-表示无基因导入。
图4为表示在诱导表达后经过20天(诱导表达5天、分化15天)后的细胞的免疫染色图像的图。左图表示在未进行miRNA-9/9*、miRNA-124、BclxL基因的瞬时表达的情况下的细胞的免疫染色图像，右图表示在进行了miRNA-9/9*、miRNA-124、BclxL基因的瞬时表达的情况下的细胞的免疫染色图像。+表示基因导入，-表示无基因导入。箭头表示用Anti-PV抗体和Anti-GFP抗体进行染色的细胞中的典型细胞。
图5为表示利用定量PCR法解析小白蛋白mRNA表达水平的图表。图中，+表示基因导入，-表示无基因导入。
具体实施方式
[小白蛋白阳性神经细胞的制造方法]
在1个实施方式中，本发明提供一种小白蛋白阳性神经细胞(以下也称为PV+神经细胞)的制造方法，包含：诱导表达工序，在细胞内诱导Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因的表达；以及，分化工序，培养上述诱导表达后的细胞，由上述细胞分化小白蛋白阳性神经细胞。
如实施例中后述那样，通过本实施方式的制造方法，从而可以提供分化诱导工序少、在短时间以高效率制造PV+神经细胞的方法。现有的PV+神经细胞的分化诱导方法中，分化诱导工序多，PV+神经细胞的含量最大也只有20～30％左右。而且，分化诱导为PV+神经细胞的时间为60～80天左右，需要很长时间。与此相对，根据本实施方式的方法，分化诱导工序少，以20天就可以制造85％以上为PV+神经细胞的细胞团。
作为用于本实施方式的制造方法的细胞，只要是能诱导为PV+神经细胞的细胞即可，没有特别限定，例如可举出成纤维细胞、间充质干细胞、多能干细胞等，但优选为成纤维细胞和多能干细胞。
本说明书中，作为多能干细胞，可举出胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)等。多能干细胞可以是来自人的细胞，也可以是来自小鼠、大鼠、猪、山羊、绵羊、猴子等非人动物的细胞。
另外，上述的多能干细胞可以是来自健康人的人工多能干细胞，也可以是来自神经疾病患者的人工多能干细胞。在由来自神经疾病患者的人工多能干细胞制造PV+神经细胞的情况下，可以将得到的PV+神经细胞用作神经疾病的模型。这样的PV+神经细胞对于神经疾病的机制的解析等是有用的。
本实施方式的制造方法中，Ascl1是在神经产生初期发挥作用的属于bHLH家族的转录因子。Dlx2是在来自大脑基底神经节原基的细胞中表达、在大脑的GABA能神经细胞的产生中重要的转录因子。MEF2C是在肌肉细胞和神经细胞中显示特别高的表达的转录因子。将人和小鼠的Ascl1、Dlx2和MEF2C的蛋白质和mRNA的NCBI登录号的例子示于下述表1和表2。
[表1]
蛋白质 人 小鼠
Ascl1 NP_004307.2 NP_032579.2
Dlx2 NP_004396.1 NP_034184.1
MEF2C NP_001351262.1 NP_001334503.1
[表2]
mRNA 人 小鼠
Ascl1 NM_004316.4 NM_008553.5
Dlx2 NM_004405.4 NM_010054.2
MEF2C NM_001364333.2 NM_001347574.1
上述Ascl1、Dlx2和MEF2C的各因子只要具有分化诱导为PV+神经细胞的活性，也可以有变异。在分化诱导为PV+神经细胞的上述各因子有变异的情况下，该因子相对于由表1或表2所例示的NCBI登录号所确定的蛋白质或mRNA，优选具有80％以上的序列同源性，更优选具有90％以上的序列同源性，进一步优选具有95％以上的序列同源性。
在此，氨基酸序列的序列同源性为表示对象的氨基酸序列(对象氨基酸序列)与作为基准的氨基酸序列(基准氨基酸序列)相一致的比例的值。对象氨基酸序列相对于基准氨基酸序列的序列同源性例如可以按下述方式求出。首先，对基准氨基酸序列和对象氨基酸序列进行比对。在此，各氨基酸序列中，可以以序列同源性为最大的方式包含空位。接着，可以在基准氨基酸序列和对象氨基酸序列中，算出一致的氨基酸的数量，按照下述式(1)，求出序列同源性。
序列同源性(％)＝一致的氨基酸的数量/对象氨基酸序列的总氨基酸数量×100…(1)
同样地，对象碱基序列相对于基准碱基序列的序列同源性例如可以按下述方式求出。首先，对基准碱基序列和对象碱基序列进行比对。在此，各碱基序列中，可以以序列同源性为最大的方式包含空位。接着，可以在基准碱基序列和对象碱基序列中，算出一致的碱基的数量，按照下述式(2)，求出序列同源性。
序列同源性(％)＝一致的碱基的数量/对象碱基序列的总碱基数量×100…(2)
本实施方式的制造方法中，分化诱导为PV+神经细胞的因子可以是蛋白质，也可以是编码该蛋白质的基因(核酸)。另外，基因(核酸)可以是mRNA，也可以是DNA。在上述的因子为DNA的情况下，该DNA可以被包含在表达载体中。
本实施方式的制造方法中，Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因只要可以诱导表达，则可以是细胞内的内源物质，也可以是以能表达的方式从外部导入的物质。在以能表达的方式从外部导入上述基因的情况下，上述诱导表达工序包含将Ascl1基因和Dlx2基因以能表达的方式导入的基因导入工序。上述基因导入工序也可以进一步包含以能表达的方式导入MEF2C基因的基因导入工序。上述基因导入工序中，例如可以构建包含Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因的表达载体而导入到细胞内。
本实施方式的制造方法中，Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因可以通过根据外部刺激的响应来调节表达的表达盒而控制表达。这样的表达盒为一种核酸构建体，其至少包含能响应外部刺激而诱导下游基因的表达的启动子、以及由该启动子控制表达的Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因。
作为启动子，只要是能响应外部刺激而诱导下游基因的表达的启动子，就没有特别限定，例如在外部刺激为存在四环素系抗生素(四环素、或强力霉素等四环素衍生物)的情况下，可举出可以通过四环素系抗生素与四环素反式活化剂的复合物的结合从而诱导下游基因的表达的启动子。另一方面，在外部刺激为不存在四环素系抗生素的情况下，可举出可以通过四环素阻遏物的解离从而诱导下游基因的表达的启动子。另外，在外部刺激为存在蜕皮甾体(蜕皮激素、幕黎甾酮A、坡那甾酮A等)的情况下，可举出可以通过蜕皮甾体与蜕皮激素受体-类视黄醇受体复合物的结合从而诱导下游基因的表达的启动子。进而，在外部刺激为存在FKCsA的情况下，可举出可以通过FKCsA与融合于FKBP12的Gal4 DNA结合域-融合于亲环素的VP16激活域复合物的结合从而诱导下游基因的表达的启动子。
表达盒根据需要，还可以包含增强子、沉默子、选择标记基因(例如，新霉素耐性基因等药剂耐性基因)、SV40复制起点等。另外，如果是本领域技术人员，则能够考虑所利用的上述启动子的种类等，从公知的增强子、沉默子、选择标记基因和终止子等中适当选择并组合，从而构建能够以期望的表达水平诱导Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因的表达的表达盒。
如此，外部刺激包含在药物的存在或非存在下的培养。例如，使用四环素诱导表达系统(例如，Takara等)，在强力霉素存在下控制目的基因的表达。例如，可以按照Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因能在四环素调控性(Tet-On)的启动子控制下表达的方式制作载体。即，本实施方式的制造方法中，Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因可以是四环素调控性(Tet-ON)。
接下来，将上述Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因表达载体转染到细胞，制作转基因细胞。另一方面，制作表达反向四环素调控性反式激活因子(rtTA)的Tet-On调节质粒，将该调节质粒导入上述细胞。如果在培养基中添加强力霉素，则rtTA与四环素应答因子结合，诱导下游基因表达。另外，如果在培养基中不存在强力霉素，则无法诱导下游目的基因的表达。
四环素调控性表达系统可以使用市售品(例如，KnockoutTM Tet RNAi System P(Clontech公司制))，或也可以按Dickins RA.et al.,(Nature Genetics,39(7)：914-921(2007))所述的方法制作。
本实施方式的制造方法中，优选在与Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因的诱导表达同时，进一步诱导表达选自微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因中的至少1种；更优选使微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因全部同时表达。微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因可以是内源性的，也可以是以能表达的方式从外部导入的。在以能表达的方式从外部导入上述基因的情况下，上述诱导表达工序包含以能表达的方式导入选自微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因中的至少1种的基因导入工序。在以能表达的方式从外部导入的情况下，可以与Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因同样地构建表达盒而导入细胞。另外，可以按照微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因能在四环素调控性(Tet-On)的启动子控制下表达的方式制作载体。即，微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因可以是四环素调控性(Tet-ON)。
人miRNA-9/9*、人miRNA-124的核酸序列的NCBI登录号分别为NR_029692.1、NR_029669.1。另外，小鼠miRNA-9/9*、小鼠miRNA-124的核酸序列的NCBI登录号分别为NR_029818.1、NR_029814.1。另外，人BclxL的蛋白质、mRNA的NCBI登录号分别为NP_001309169.1、NM_001322240.2。小鼠BclxL的蛋白质、mRNA的NCBI登录号分别为NP_001341982.1、NM_001355053.1。
本实施方式的制造方法中，作为将上述表达盒导入细胞的方法，没有特别限定，可以适当选择公知的手法来使用。例如，可以将上述表达盒插入到适当的表达载体，通过使用了逆转录病毒载体、腺病毒载体等病毒载体的病毒感染、脂质体转染法、脂质体法、电穿孔法、磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、显微注射法等公知的转化方法来进行。
作为表达载体，只要是能在细胞中使这些基因表达，就没有特别限定，可以是质粒载体，也可以是病毒载体，还可以是转座子载体。病毒载体的基因导入效率高，容易使用。作为病毒载体，可举出逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体等。在使用转座子载体、慢病毒载体的情况下，可以将Ascl1基因、Dlx2基因、MEF2C基因、微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因在基因组上插入多个拷贝。由此，可以维持作为四环素调控性(Tet-On)的神经诱导用细胞的状态。进而，可以通过上述的外部刺激，来排除基因等未能插入基因组的细胞，仅维持能分化诱导为PV+神经细胞的细胞。另外，转座子载体根据需要可以从细胞中完全地除去。作为这样的转座子载体，例如可举出Piggybac转座子载体等。
另外，关于上述外部刺激，如果是本领域技术人员，则能够考虑所利用的上述启动子的种类等而适当调节在后述的培养基中的添加量。例如，在外部刺激为存在强力霉素的情况下，作为强力霉素的优选的添加浓度，为0.1～10μg/ml，更优选为1～2μg/ml。
作为为了在细胞内诱导Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因的表达的诱导表达工序而添加上述外部刺激的培养液，可举出神经细胞用培养基，例如Neurobasal Plus Medium(Thermo Fisher Scientific公司制)等。培养液中可以含有培养中通常添加的添加物。作为上述添加物，可举出γ-分泌酶抑制剂、二丁酰cAMP(dbcAMP)、Y27632等ROCK抑制剂等。作为γ-分泌酶抑制剂，可举出DAPT(γ-分泌酶抑制剂IX)、Compound E、γ-分泌酶抑制剂XI、γ-分泌酶抑制剂III等。但是，在诱导表达工序和之后的分化工序中，无需加入血清，在本实施方式的制造方法的一个方式中，向PV+神经细胞的分化诱导是在不存在血清下进行的。
本实施方式的制造方法中，在诱导表达上述Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因前，可以将细胞解离为单一细胞，并重新接种。在此，解离为单一细胞是指，粘接在培养容器上的细胞1个个彼此分离地解离。向单一细胞的解离通常可以通过进行用于细胞解离的细胞消化液(Accutase)、胰蛋白酶、胶原酶、TrypLE Select酶[TrypLE(注册商标)Select]等酶处理并移液等，从而进行。
包含Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因的细胞、或以能表达的方式导入了Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因的细胞的诱导表达工序进行1～8天，优选进行1～5天。在强力霉素等外部刺激的情况下，使外部刺激存在1～8天，优选存在1～5天。接下来使诱导表达工序结束而进行培养的分化工序的结果是，上述细胞分化为PV+神经细胞。在诱导表达工序结束后，将上述细胞培养10天以上，优选培养20天以上。作为可用于上述分化工序的培养基，可举出神经细胞用培养基，例如Neurobasal Plus Medium(Thermo Fisher Scientific公司制)等。上述分化工序中，可以含有培养中通常添加的添加物。作为上述添加物，可举出二丁酰cAMP(dbcAMP)、BDNF、GDNF、抗坏血酸等。
通过上述诱导表达工序结束后的分化工序，从而包含上述基因的细胞分化为PV+神经细胞。分化为PV+神经细胞例如可以在从诱导表达工序结束后起一定时间(例如40天)内，通过神经细胞中的PV的表达而确认。另外，也可以通过神经细胞标志物TUBB3、认为在PV+神经细胞中上升的GRIA4、SYT1、NRXN2a等基因的表达来确认。例如，在细胞群导入Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因、进而导入微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因、且给予强力霉素的外部刺激的情况下，可以确认到：细胞群的至少70％、至少85％在从外部刺激结束后起5～20天、优选10～40天的时间内分化为PV+神经细胞。
[诱导表达细胞]
在1个实施方式中，本发明提供一种以能表达的方式导入有Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因的细胞。本实施方式的细胞通过以能表达的方式导入Ascl1基因、Dlx2基因、进而是MEF2C基因，从而可以分化为PV+神经细胞。本实施方式的细胞可以进一步以能表达的方式导入选自微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因中的至少1种，优选进一步以能表达的方式导入微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因。通过导入Ascl1基因、Dlx2基因、进而是MEF2C基因，从而制成分化效率高的前体细胞，除此之外，通过以能表达的方式导入选自微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因中的至少1种，优选以能表达的方式导入微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因，从而可以在短时间以高效率得到PV+神经细胞。
本实施方式的诱导表达细胞中，Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因可以是四环素调控性(Tet-ON)。另外，在本实施方式的细胞进一步以能表达的方式导入选自微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因中的至少1种、优选进一步以能表达的方式导入微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因的情况下，微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因可以是四环素调控性(Tet-ON)。
用于分化诱导本实施方式的PV+神经细胞的细胞可以通过上述制造方法的诱导表达工序中记载的方法而制造。
本实施方式的细胞中，作为以能表达的方式导入了Ascl1基因、Dlx2基因、进而是MEF2C基因的细胞，只要是Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因能表达、且能分化为PV+神经细胞的细胞即可，没有特别限定，例如可举出成纤维细胞、间充质干细胞、多能干细胞等，优选为成纤维细胞和多能干细胞。
[分化诱导剂]
在1个实施方式中，本发明提供一种分化诱导剂，其含有Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因、或它们的基因产物作为有效成分，用于将细胞分化诱导为PV+神经细胞。本实施方式的分化诱导剂可以对没有分化为上述PV+神经细胞的能力的未分化细胞赋予分化为PV+神经细胞的能力。本实施方式的分化诱导剂可以进一步含有选自微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因中的至少1种作为有效成分，优选进一步含有微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因作为有效成分。通过除Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因之外含有选自微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因中的至少1种作为有效成分，优选通过除Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因之外含有微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因作为有效成分，由此，可以进一步以短时间高效率得到PV+神经细胞。因此，本发明的分化诱导剂为对于上述Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因而进一步包含选自微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因中的至少1种的分化诱导剂，优选为对于上述Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因而进一步包含微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因的分化诱导剂。
在本实施方式的分化诱导剂中，Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因可以是四环素调控性(Tet-ON)。另外，在本实施方式的分化诱导剂进一步含有选自微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因中的至少1种作为有效成分，优选进一步含有微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因作为有效成分的情况下，微小RNA-9/9*(miRNA-9/9*)、微小RNA-124(miRNA-124)和BclxL基因可以是四环素调控性(Tet-ON)。
在本实施方式的分化诱导剂中，分化诱导为PV+神经细胞的有效成分可以是Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因，也可以是它们的基因产物。作为上述基因产物，除了由上述基因产生的蛋白质自身之外，也可以是上述蛋白质与其它蛋白质或肽等的融合基因产物的形态。例如，也可以使用与绿色荧光蛋白质(GFP)的融合蛋白质、与组氨酸标签等肽的融合基因产物。这样的融合基因产物的制备方法是公知的，本领域技术人员可以根据目的而容易地设计适当的融合基因产物并制备。
上述基因可以被包含在表达载体中。即，本实施方式的分化诱导剂也可以是以能表达的方式导入有分化诱导为PV+神经细胞的上述基因的表达载体。上述表达载体可以使用上述制造方法的诱导表达工序中举出的表达载体等。
通过将本实施方式的分化诱导剂导入细胞，从而可以将细胞分化诱导为PV+神经细胞。在本实施方式的分化诱导剂为蛋白质、RNA等的情况下，作为将分化诱导剂导入细胞的方法，例如可举出与细胞的接触、显微注射、使用病毒样粒子的方法、脂质体转染法、这些的组合等。
另外，在本实施方式的分化诱导剂为载体等的情况下，作为将分化诱导剂导入细胞的方法，例如可举出与细胞的接触、脂质体转染法、电穿孔法、显微注射法、DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法、这些的组合等。另外，在载体为病毒载体的情况下，可通过感染细胞从而导入细胞。
本实施方式的分化诱导剂向细胞的导入可以在体外进行，也可以在体内进行。另外，分化诱导剂可以单独使用1种，也可以混合2种以上使用。
作为本实施方式的分化诱导剂所分化诱导的细胞，只要是能诱导PV+神经细胞的细胞即可，没有特别限定，例如可举出成纤维细胞、间充质干细胞、多能干细胞等，但优选为成纤维细胞和多能干细胞。
另外，作为成为本实施方式的分化诱导剂所分化诱导的对象的细胞的种类，可举出人、小鼠、大鼠、兔、狗、猴、猪、山羊、绵羊等。
实施例
以下，示出实施例对本发明进行进一步的详细说明，但是本发明不限定于以下的实施例。
[实验例1]
(iPS细胞的维持培养)
对于iPS细胞(1210B2株)，将细胞传代时的iPS细胞接种密度设为在6孔板中为1.5×104个细胞/孔，无需进行细胞传代时的事前板涂布，在即将细胞接种前，向6孔板中以1.5ml/孔注入未分化细胞用培养基Stem Fit(AK02N、味之素株式会社制)，该培养基包含1.5mL的10μg/ml ROCK抑制剂Y27632(Fuji Film Wako Pure Chemical Co.,Ltd.制)和1.5μg/ml iMatrix-511(Nippi Co.，Ltd.制)，直接进行细胞接种，除此以外，依据京都大学iPS研究所所公开的公知的细胞培养法进行培养。
[实验例2]
(对iPS细胞导入Ascl1基因和Dlx2基因)
将对iPS细胞导入Ascl1基因和Dlx2基因的方案示于图1A。具体来说按照以下的方式，对iPS细胞进行Ascl1基因和Dlx2基因导入。
(1)基因导入操作后的细胞接种用板的培养基准备和涂布准备
向Stem Fit(AK02N、味之素株式会社制)添加20μg/ml Y27632(Fuji Film WakoPure Chemical Co.,Ltd.制)和2.5μg/ml iMatrix-511(Nippi Co.，Ltd.制)，在6孔板中将其以2ml/孔放入6个孔(1个板)，以37℃、5％CO2孵育。
(2)iPS细胞的单一细胞化
将在6孔板中以成为约1.5×104个细胞/孔的方式接种的iPS细胞用Stem Fit(AK02N、味之素株式会社制)培养约1周左右，用抽吸器除去培养基后，使用PBS(-)以1ml/孔进行细胞清洗。接下来，除去PBS(-)后，以0.5ml/孔加入0.5×TrypLE(注册商标)Select[在以TrypLE Select(ThemoFisher公司制):PBS(-)＝1:1进行混合而得的物质中、以相当于总量的1/2000量的容量混合0.5M EDTA(pH8.0)而得到的物质]，在37℃、5％CO2孵育约5分钟，细胞间粘接下降，在确认到能一定程度上看到一个一个的细胞的轮廓后，使用PBS(-)以1ml/孔清洗细胞。
接下来，使用包含10μg/ml Y27632(Fuji Film Wako Pure Chemical Co.,Ltd.制)的Stem Fit(AK02N、味之素株式会社制)1ml，迅速进行细胞剥离，转移到15ml或50ml离心管中，充分地搅拌后，使10μl的细胞悬浮液与台盼蓝染色液混合，加入到血细胞计数器，计算活细胞数，算出悬浮液的活细胞密度。将细胞悬浮液于4℃或冰上静置，将一部分作为用于维持培养的传代用途，以1.5×104个细胞在6孔板上进行细胞接种。
(3)导入了Ascl1基因和Dlx2基因的载体向iPS细胞的导入
将基于脂质体转染法的基因导入试剂Gene Juice(#70967、Merck Millipore公司制)恢复至室温，用涡旋混合器等充分搅拌后，将4.5μl加入到1.5mL管内的100μl Opti-MEM(#31985088、Thermo Fisher Scientific公司制)中，充分搅拌，在室温静置5分钟，制备脂质体转染试剂合剂。
将如图1C上段所示的转座酶表达载体(pCMV-HyPBase-PGK-Puro)、如图1C中段所示的rtTA表达用PiggyBac载体(pG-PB-CAG-rtTA3G-IH)、Tet诱导性hAscl1基因表达用PiggyBac载体(PB-P(tetO)-hAscl1-pAPGK-PuroTK-pA)、Tet诱导性hDlx2基因表达用PiggyBac载体(PB-p(tetO)-hDlx2-pA-floxPGKneo-pA)各0.4μg加入到上述制备的脂质体转染试剂合剂中，充分搅拌，在室温静置15分钟，制备载体·脂质体转染试剂。
在15分钟的静置期间，将相当于3×105个细胞的(2)中单一细胞化后的细胞悬浮液转移到1.5ml管，以200G×5分钟进行离心分离，经过15分钟后，除去离心分离后的上清液，将上述制备的载体·脂质体转染试剂合剂加入颗粒，进行移液，在室温静置5分钟。
将得到的细胞在(1)中事先孵育了的细胞培养用板中以15～20μl/孔于各孔内平均地接种，在37℃、5％CO2孵育约3小时。之后，将包含20μg/ml Y27632(Fuji Film WakoPure Chemical Co.,Ltd.制)的Stem Fit(AK02N、味之素株式会社制)以37℃加热，以2ml/孔对所有孔进行全部培养基交换。
(4)利用抗生素筛选能诱导为PV+神经细胞的iPS细胞
在(3)的基因导入1天后，用添加了50μg/ml潮霉素和100μg/ml G418的Stem Fit(AK02N、味之素株式会社制)进行全部培养基交换(1.5ml/孔)，培养2天。
在2天培养后，用添加了100μg/ml潮霉素(Hygromycin B Solution、#09287-84、Nakarai Co.,Ltd.制)、100μg/ml G418(G 418Disulfate、#08973-14、Nakarai Co.,Ltd.制)和5μg/ml嘌呤霉素(#ant-pr-1、INVIVOGEN公司制、#14861-71、Nakarai Co.,Ltd.制)的Stem Fit(AK02N、味之素株式会社制)进行全部培养基交换(1.5ml/孔)，培养2天。
在2天培养后，用添加了200μg/ml潮霉素、100μg/mlG418和10μg/ml嘌呤霉素的Stem Fit(AK02N、味之素株式会社制)进行全部培养基交换(1.5ml/孔)，培养2天。
在2天培养后，用Stem Fit(AK02N、味之素株式会社制)进行全部培养基交换(1.5ml/孔)，不加抗生素培养1天，对于存活的iPS细胞根据需要进行传代或冻结保存。
[实验例3]
(对iPS细胞导入MEF2C基因、miRNA-9/9*、miRNA-124和BclxL基因)
将对iPS细胞导入MEF2C基因、miRNA-9/9*、miRNA-124和BclxL基因的方案示于图1B。具体来说按照以下的方式，对iPS细胞导入MEF2C基因、miRNA-9/9*、miRNA-124和BclxL基因。
(1)导入了MEF2C基因、miRNA-9/9*、miRNA-124和BclxL基因的慢病毒的纯化
按照常规方法，纯化如图1C下段所示的、导入了MEF2C基因、miRNA-9/9*、miRNA-124和BclxL基因的慢病毒。具体来说按照以下的方式，纯化导入了MEF2C基因、miRNA-9/9*、miRNA-124和BclxL基因的慢病毒。
将0.01％多聚-L-赖氨酸溶液(0.01％、#P4832、Sigma公司制)用PBS(-)混合至1:100而得到溶液，将使用该溶液进行涂布的细胞·组织培养用100mm培养皿以PBS(-)清洗后，将用包含10％FBS、2mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基(#D5796、Sigma公司制)培养为半成品的HEK293T细胞相对于1个培养皿而与500μl HBSS、3μg包装载体(pCAG-HIVgp)、3μg包膜生成载体/Rev表达载体(VSV-G、REV表达载体、pCMV-VSV-G-RSV-Rev)、6μg的SIN载体(Tet感受性miRNA-9/9*、miRNA-124、BclxL基因表达载体、CSIV-124-9-BClxL-TRE-EF-BsdT)、6μg的SIN载体(Tet感受性MEF2C基因表达载体、pLV-TRE3G-HA-hMEF2C-mPGK-Zeo)和聚乙烯亚胺(分子量：25000、#23966、Polysciences公司制)[Milli-Q(注册商标)水中1mg/ml]24μl充分混合，在室温静置15分钟，将得到的物质平均地滴加到培养皿。
在37℃、5％CO2孵育12小时后，培养基交换为包含10μM毛喉素的DMEM(#D5796、Sigma公司制)，再次在37℃、5％CO2进行孵育。在48小时后取出细胞培养上清液，通过0.45μm针筒过滤器，除去悬浮细胞等，然后，使用PBS(-)回收使用超离心器以50000×G离心分离2小时后所得的微量颗粒后，估算病毒滴度。
(2)miRNA-9/9*、miRNA-124、BclxL基因导入用慢病毒载体和MEF2C基因导入用慢病毒载体对iPS细胞的感染
在6-孔板中，放入包含10μg/ml Y27632(Fuji Film Wako Pure Chemical Co.,Ltd.制)、1.5μg/ml iMatrix-511(Nippi Co.，Ltd.制)的Stem Fit(AK02N、味之素株式会社制)，将实验例2中制备的iPS细胞以1.5×104个细胞/孔进行接种，培养1天。
接下来，将未添加Y27632、iMatrix-511的Stem Fit(AK02N、味之素株式会社制)以1.5ml/孔进行全部培养基交换后，添加(1)中制备的病毒悬浮液(各MOI＝2.0)使之感染，培养2天。
(3)利用抗生素筛选慢病毒感染完成的iPS细胞
在(2)的病毒悬浮液的添加2天后，将培养基以1.5ml/孔全部培养基交换为StemFit(AK02N、味之素株式会社制)，添加20μg/ml杀稻瘟菌素(Blastcidin)或200μg/ml博来霉素(Zeocin)，培养2天。
在2天培养后，以1.5ml/孔全部培养基交换为Stem Fit(AK02N、味之素株式会社制)，同样地添加上述20μg/ml杀稻瘟菌素(Blasticidin S,Hydrochloride、#KK-400、Funakoshi公司制)或200μg/ml博来霉素(Zeocin溶液、#ant-zn-1、INVIVOGEN公司制、#61483-26、Nakarai Co.,Ltd.制)，培养1天。
之后，全部培养基交换为不含上述抗生素的Stem Fit(AK02N、味之素株式会社制)，对于存活的iPS细胞，根据需要，进行传代或冻结保存。
[实验例4]
(基因导入完成的iPS细胞的向PV+神经细胞的分化)
(1)细胞培养板的预涂布
用PBS(-)将多聚-L-赖氨酸溶液(0.01％、#P4832、Sigma公司制)稀释100倍，注入板，涂布6小时以上。作为RNA解析等细胞回收用的板，使用6孔板，以1.5ml/孔涂布。作为免疫染色、成像用的板，使用玻璃底96孔板，以100μl/孔涂布。应予说明，涂布时放入细胞培养用的CO2培育箱等，以不会干燥的方式保持一定的湿度。
在接种神经分化用的iPS细胞的1小时前，将多聚-L-赖氨酸溶液抽吸除去，用PBS(-)清洗3次。6孔板以各1ml/孔的程度进行清洗，96孔板以各100μl/孔的程度进行清洗，3次清洗后，充分地抽吸除去残存液体。
接下来，使用50ml离心管等，制作将减少生长因子基质胶(#354230、Corning公司制)用PBS(-)稀释50倍而得的物质，6孔板以各1.5ml/孔进行涂布，96孔板以各100μl/孔进行涂布。
在上述的基质胶涂布中，通过与实验例2的(2)同样的方法而使神经分化用iPS细胞单一细胞化，算出细胞悬浮液的细胞密度。
(2)向PV+神经细胞的分化
作为分化用培养基，准备混合了下述物质的培养基。
·Neurobasal Plus Medium(#A3582901、Thermo Fisher Scientific公司制，作为基础培养基而混合下述物质)
·B27 Plus Supplement(50×、#A3582801、Thermo Fisher Scient ific公司制)(1:50)
·Glutamax(Thermo Fisher Scientific公司制)(1:100)
·dbcAMP(N6,2'-O-二丁酰腺苷3',5'-单磷酸钠盐、#11540-61、Nakar ai Co.,Ltd.制)(100μM)
·DAPT[N-[N-(3,5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰)]-(S)-苯基甘氨酸叔丁酯、#D5942-5MG、Sigma公司制)(10μM)
·强力霉素(#D4116、东京化成株式会社制)(2.0μg/ml)
·Y27632(#030-24026、Fuji Film Wako Pure Chemical Co.,Ltd.制)(20μg/ml)
在即将注入板前，将iMatrix-511(Nippi Co.，Ltd.制)1.0μg/ml添加到上述分化用培养基中，6孔板以2.0ml/孔注入，96孔板以100μl/孔注入。
接下来，将实验例3中制备的iPS细胞悬浮液均等地以6.0×105个细胞/孔接种到6孔板，以3.0×104个细胞/孔接种到96孔板。
(3)PV+神经细胞的培养
在培养开始后第5天，将(2)中分化的iPS细胞全部交换为以下的培养基。6孔板以2.0ml/孔注入，96孔板以各100μl/孔注入。
·Neurobasal Plus Medium(#A3582901、Thermo Fisher Scientific公司制，作为基础培养基而混合下述物质)
·B27 Plus Supplement(50×、#A3582801、Thermo Fisher Scientific公司制)(1:50)
·Glutamax(Thermo Fisher Scientific公司制)(1:100)
·dbcAMP(N6,2'-O-二丁酰腺苷3',5'-单磷酸钠盐、#11540-61、Nakarai Co.,Ltd.制)(100μM)
·BDNF(重组人BDNF蛋白、#B-250、alomone labs公司制)(10ng/ml)
·GDNF(重组人GDNF蛋白、#G-240、allomone labs公司制)(10ng/ml)
·L-抗坏血酸(#016-04805、Fuji Film Wako Pure Chemical Co.,Ltd.制)(200μM)
培养以每5天交换上述组成的培养基的一半量来进行，从培养第10天以后，进行基于细胞回收的RNA纯化、基于细胞固定的免疫染色等。
[实验例5]
(小白蛋白基因(PVALB)报告细胞株的制作)
图2表示小白蛋白基因(PVALB)报告细胞株的制作方案。具体来说按照以下的方式制作小白蛋白基因(PVALB)报告细胞株。
利用CRISPR/Cas9，在人Parvalbumin基因(PVALB)的终止密码子部位，插入由EGFP和分泌型荧光素酶(SNLuc)和PiggyBac ITR夹住的恒定表达性启动子所驱动的嘌呤霉素耐性基因。在基因导入后，通过药剂选择，取得纯合型PVALB敲入细胞，之后，通过转座酶除去ITR内部的序列，取得在PVALB基因下游2A肽下表达的EGFP、SNLuc的报告细胞株。
[实验例6]
(诱导表达后20天(诱导表达5天、分化15天)后的细胞的免疫染色)
对于Ascl1基因、Dlx2基因、miRNA-9/9*、miRNA-124、BclxL基因的瞬时表达细胞，进行MEF2C基因的瞬时表达非诱导和诱导。在诱导表达后20天(诱导表达5天、分化15天)后固定细胞，用抗Tubb3(神经细胞标志物)抗体、抗小白蛋白(PV)抗体、抗GFP抗体进行免疫染色。另外，作为细胞核染色，还进行Hoechst(Ho)。将其结果示于图3和图4。
如图3和图4所示那样，在MEF2C诱导组中确认到了大量PV+神经细胞。另外，如图3和图4所示那样，在miRNA-9/9*、miRNA-124、BclxL基因非诱导组中，也确认到了对于MEF2C诱导组而言分化诱导为PV+神经细胞。
[实验例7]
(利用定量PCR法解析小白蛋白mRNA表达水平)
在基于Ascl1基因和Dlx2基因的抑制性神经细胞诱导下，对于导入了miRNA-9/9*、miRNA-124和BclxL基因、导入了MEF2C基因的各组合，在诱导表达后10天、20天、40天和60天经时地进行细胞回收，进行小白蛋白mRNA的定量PCR。将其结果示于图5。
如图5所示那样，在诱导表达20天后(Day20)、40天后(Day40)、60天后(Day60)，如果miRNA-9/9*、miRNA-124、BclxL基因与MEF2C基因这两方共同表达，则与単独表达相比，小白蛋白基因表达水平协同地上升。
产业上的可利用性
根据本发明，可以提供分化诱导工序少、在短时间以高效率制造小白蛋白阳性神经细胞的制造方法，能诱导为上述PV+神经细胞的细胞，和用于分化诱导为上述PV+神经细胞的分化诱导剂。

Claims (20)

1.一种小白蛋白阳性神经细胞的制造方法，包含：
诱导表达工序，在细胞内诱导Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因的表达，以及
分化工序，培养所述诱导表达后的细胞而由所述细胞分化小白蛋白阳性神经细胞。
2.根据权利要求1所述的小白蛋白阳性神经细胞的制造方法，其中，所述诱导表达工序包含将Ascl1基因和Dlx2基因以能表达的方式导入到所述细胞内的基因导入工序。
3.根据权利要求2所述的小白蛋白阳性神经细胞的制造方法，其中，所述诱导表达工序进一步包含以能表达的方式导入MEF2C基因的基因导入工序。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，所述Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因为四环素调控性、即Tet-ON。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，所述诱导表达工序包含同时诱导表达选自微小RNA-9/9*即miRNA-9/9*、微小RNA-124即miRNA-124和BclxL基因中的至少1种的工序。
6.根据权利要求5所述的制造方法，其中，所述诱导表达工序包含以能表达的方式导入选自微小RNA-9/9*即miRNA-9/9*、微小RNA-124即miRNA-124和BclxL基因中的至少1种的基因导入工序。
7.根据权利要求5或6所述的制造方法，其中，所述微小RNA-9/9*即miRNA-9/9*、微小RNA-124即miRNA-124和BclxL基因为四环素调控性、即Tet-ON。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的制造方法，其中，所述细胞为成纤维细胞或多能干细胞。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的制造方法，其中，所述诱导表达工序进行1～5天。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的制造方法，其中，所述分化工序进行10天以上。
11.一种细胞，其以能表达的方式导入有Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因。
12.根据权利要求11所述的细胞，其中，所述Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因为四环素调控性、即Tet-ON。
13.根据权利要求11或12所述的细胞，其中，进一步以能表达的方式导入有选自微小RNA-9/9*即miRNA-9/9*、微小RNA-124即miRNA-124和BclxL基因中的至少1种。
14.根据权利要求13所述的细胞，其中，所述微小RNA-9/9*即miRNA-9/9*、微小RNA-124即miRNA-124和BclxL基因为四环素调控性、即Tet-ON。
15.根据权利要求11～14中任一项所述的细胞，其中，所述细胞为成纤维细胞或多能干细胞。
16.一种分化诱导剂，其含有Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因、或者它们的基因产物作为有效成分，用于将细胞分化诱导为小白蛋白阳性神经细胞。
17.根据权利要求16所述的分化诱导剂，其中，所述Ascl1基因、Dlx2基因和MEF2C基因为四环素调控性、即Tet-ON。
18.根据权利要求16或17所述的分化诱导剂，其中，进一步含有选自微小RNA-9/9*即miRNA-9/9*、微小RNA-124即miRNA-124和BclxL基因中的至少1种或者它们的基因产物作为有效成分。
19.根据权利要求18所述的分化诱导剂，其中，所述微小RNA-9/9*即miRNA-9/9*、微小RNA-124即miRNA-124和BclxL基因为四环素调控性、即Tet-ON。
20.根据权利要求16～19中任一项所述的分化诱导剂，其中，所述细胞为成纤维细胞或多能干细胞。
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