JP2020524504A - ヒト誘導神経ボーダー幹細胞の生成と利用のための新規な方法 - Google Patents

ヒト誘導神経ボーダー幹細胞の生成と利用のための新規な方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、体細胞の直接的な変換によってヒト誘導神経ボーダー幹細胞（iNBSC）を生成させる新規なアプローチと、そのような細胞の新規な利用に関するものであり、その中には、これら幹細胞をCNSや神経堤系列のタイプの細胞へと分化させることと、そのような細胞の利用が含まれる。

Description

本発明は、体細胞（末梢血、皮膚生検）の直接的な変換によってヒト誘導神経ボーダー幹細胞（iNBSC）を生成させるための新規なアプローチと、そのような細胞の新規な利用に関するものであり、その中には、これら幹細胞をCNSや神経堤系列のタイプの細胞へと分化させることや、そのような細胞の利用が含まれる。
多能性幹細胞（PSC）のほか、胎仔と成体の脳組織からの定方向分化によってさまざまなタイプの神経幹細胞と神経前駆細胞（NSPC）を誘導することができる（1、2、3、4、5、6、7）。しかしNSPCは自己複製能力と分化能力が大きく変動し、その変動は、（a）細胞の出所（すなわち胚性幹細胞（ESC）、人工多能性幹細胞（iPSC）、一次組織）、（b）種（マウス、ヒト）、（c）培養条件に依存している。さらに、ESC由来のNSPCとiPSC由来のNSPCを生成させるのに技術的な障害があり、例えば時間がかかる上に効率の低い分化プロトコルのため異なる種類の細胞からなる集団になったり、腫瘍になりやすい多能性残留物が同時に維持されるリスクがあったりする。定方向分化によって生成したNSPCと、そのNSPCに由来する細胞の種類が変動することは、将来臨床に応用することを考えると特に問題である。
同様の欠点を考慮せねばならないのが、直接的な変換によって神経運命に向かわせる際に特に山中因子（OCT4、SOX2、KLF4、MYC）を利用するプロトコルに頼るときである。これらの因子は再プログラミングの間に2種類以上の細胞を生じさせることが知られている（8、9、10）ため、異種性が大きくなる。われわれは最近、Sox2、Klf4、c-Mycを過剰発現させると同時にOct4の活性を低下させると、マウス線維芽細胞から放射状グリア型の幹細胞集団が誘導されることを明らかにした（11）。その後われわれは同様のアプローチを利用して、より早い発生段階でさえロックを外すことが可能であることを示した（12）。しかし因子のこの組み合わせではヒト細胞の変換はうまくいかず（M. Thier、未公開の観察結果）、出発材料として神経細胞が必要であった。
現時点で、直接的な再プログラミングという数多くあるアプローチの深刻な欠点は、自己複製能力と分化潜在力が限定された細胞が生成することと、決まった生理学的対応物のない混合された前駆細胞培養物が誘導されることである。これらの制限は、明確で増殖可能な患者由来の神経前駆細胞株を必要とする研究で直接再プログラムされた細胞を利用する際の障害になっている。というのも、そのような神経前駆細胞株が、多くの臨床応用のための前提条件だからである。
成熟細胞を再び分化させるためのアプローチがこれまでにかなり多く試みられてきた。
Bajpaiら（Stem Cells 第35巻（2017年）1402〜1415ページ）は、ケラチノサイト（KC）を神経堤（NC）子孫細胞へと分化させることのできる培養プロトコルを記載している。KCの全体的な分子特徴づけはかなり大まかだが、著者は、胚性神経板ボーダーが形成される間にいくつかのマーカー（MYC、SOX9、SNAI2、MSX2、IRX2、DLX3、TFAP2A、KLF4）も発現することを観察している。これらマーカーの発現レベルはまだ皮膚線維芽細胞と比較して示されているだけで一次対照が欠けているため、より詳しい文脈がないと解釈することは難しい。さらに、KCは、神経板ボーダーの本質的な特徴、すなわち神経上皮マーカー（SOX1、SOX2、PAX6、ネスチンなど）の発現と、中枢神経系細胞と神経堤へと分化する機能的潜在力を示さない。したがってKCは成体の体細胞集団であり、ケラチン14とそれ以外の表面外胚葉マーカーの発現を特徴としている。さらに、KCはPAX3を発現しない。機能的にはKCは神経堤子孫細胞へと分化することができるが、中枢神経系と末梢神経系の子孫細胞へと分化する潜在力は示さない。
Kimら（Cell Stem Cell 第15巻（2014年）497〜506ページ）は、単一の転写因子を用いたヒト生後線維芽細胞の直接的な再プログラミングによる多能性誘導神経堤の生成を示している。誘導神経堤細胞（iNC）は、SOX10、MPZ、TFAP2A、BRN3Aを発現する（503ページ参照）。iNCは、オリゴデンドロサイトなどのCNS子孫細胞にはならない（504ページ参照）。さらに、iNCはHNK1陽性である。
Bungら（J. Mol. Biol. 第428巻（2015年）1476〜1483ページ）は、Brn2とc-Mycによるマウス放射状グリア型神経幹細胞の部分的脱分化を示しており、その結果として初期神経上皮前駆細胞が生じる。この論文では、誘導神経上皮細胞（iNEP）は、マウス放射状グリア-幹細胞に由来する。iNEPは異種細胞集団であり、クローンのレベルでは明確でなく、詳細な分子分析が欠けている。さらに、ヒト皮膚線維芽細胞からヒトiNEPを誘導することには成功しなかった（下記の実施例xxを参照されたい）。
Ishiiら（Stem Cells and Development 第21巻（2012年）3069〜3080ページ）は、マウスからの安定な頭蓋神経堤細胞株の生成を記載している。マウス「O9-1」頭蓋神経堤細胞株はID2、ZIC1、ZIC2を発現しなかったが、AP2aは発現する。O9-1細胞はニューロン分化を示さないが、間葉系頭蓋神経堤を有することが記載されている。
Edriら（Nature Communications 第6巻（2015年）6500ページ）は、Notch活性のある神経前駆細胞の連続的な単離によるヒト神経幹細胞個体発生の分析結果を示している。神経ボーダーの特徴を持つ細胞の継続した培養は見られなかった。神経上皮の状態でHES5 GFP+細胞はOTX2陽性である。
このように神経幹細胞と神経前駆細胞の生成に関していくらかの進展はあったが、多くの制約が相変わらず存在しており、このような細胞を生成させる確実で安全な方法はまだ存在していない。
この問題に対する解決法、すなわちヒト成人の体細胞を再プログラミングすることにより、明確で増殖可能で自己複製する初期神経前駆細胞で、広いが特定可能な分化潜在力を持つものにすることは、先行技術では提供も示唆もされていない。
そこで本発明の目的は、明確で増殖可能で自己複製する初期神経前駆細胞で、広いが特定可能な分化潜在力を持つものを生成させる新規な方法を提供することにより、そのような細胞、その生成と分化をさらに特徴づけられるようにすること、神経障害や神経疾患を研究するための疾患モデルを開発できるようにすること、そのようなモデル、および／またはインビトロで分化したそのような細胞に基づいて新規な治療法を開発できるようにすることであった。
驚くべきことに、段階特異的な転写因子の過剰発現に組み合わせて増殖培地による十分なシグナル伝達のきっかけを提供することで、成人の体細胞を直接的に再プログラミングして初期胚性神経前駆細胞の特徴を実現できることが見いだされた。
そこで第1の側面では、本発明は、成熟ヒト細胞を直接再プログラミングするインビトロの方法に関するものであり、この方法は、その成熟ヒト細胞を転写因子の混合物の存在下で培養する工程を含み、その混合物は、因子BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3を含んでおり、その培養を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）の存在下で実施する。別の1つの側面では、本発明は、多能性ヒト幹細胞（特に胚性幹細胞（ESC）または人工多能性幹細胞（iPSC））を直接分化させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、そのヒト多能性幹細胞を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）の存在下で培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、誘導神経ボーダー幹細胞を生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、成熟ヒト細胞を転写因子の混合物の存在下で培養する工程を含み、その混合物は、因子BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3を含んでいて、その培養を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）の存在下で実施する。別の1つの側面では、本発明は、神経ボーダー幹細胞を生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、多能性ヒト幹細胞（特に胚性幹細胞（ESC）または人工多能性幹細胞（iPSC））を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）の存在下で培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3をコードする核酸配列に関するものである。
次の1つの側面では、本発明は、BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3をコードするポリシストロン性ベクターに関するものである。
次の1つの側面では、本発明は、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）から選択された少なくとも2つの構成成分、さらに特定するならば3つすべての構成成分を含むキットに関係している。
次の1つの側面では、本発明は、単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株に関するものである。
次の1つの側面では、本発明は、本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株を増殖させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、その単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞を培養する工程を含んでいて、特にその培養を、増殖支援サイトカインから、特にNotchシグナル伝達活性化物質から、特にDLL1、DLL3、DLL4、Jagged-1、Jagged-2から、さらに特定するならばDLL4とJagged-1から選択された物質の存在下で実施する。
次の1つの側面では、本発明は、（誘導）神経ボーダー幹細胞、特に本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株の細胞、または本発明のインビトロでの方法によって得られた細胞をインビトロで分化させる方法に関するものであり、この方法は、その（誘導）神経ボーダー幹細胞を分化因子の存在下で培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、中枢神経系系列の単離された中枢神経系プライムド神経前駆細胞株に関するものであり、特に（i）その細胞株は、妊娠8〜12週の胚から取得できる一次前駆神経細胞と同じ発生段階である、および／または（ii）その細胞株は、前駆細胞マーカーLONRF2、ZNF217、NESTIN、SOX1、SOX2、特にLONRF2とZNF217を特徴とするとともに、MSX1、PAX3、TFAP2に関して陰性であることを特徴とする、および／または（iii）その細胞株は、成熟ヒト細胞にエピジェネティック（epigenetically）に対応することを特徴としていて、特にその細胞株は、本発明による直接的な再プログラミング法においてその成熟ヒト細胞から得られたものである。
次の1つの側面では、本発明は、CNS前駆細胞を生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（誘導）神経ボーダー幹細胞を、場合によっては本発明の方法で（誘導）神経ボーダー幹細胞を最初に分化させた後、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk4, 5, 7阻害剤（特にSB431542）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）；bFGF；LIFを含む培地の中で培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、単離された中枢神経系前駆細胞株に関するものであり、特にその細胞株は、成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特にその細胞株は、本発明による直接的な再プログラミング法においてその成熟ヒト細胞から得られたものである。
次の1つの側面では、本発明は、本発明の中枢神経系前駆細胞株を分化させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、その中枢神経系前駆細胞株からの細胞を分化因子の存在下で培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、放射状グリア型の幹細胞表現型を有する単離された細胞集団に関するものであり、その細胞集団は、成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特にその細胞集団は、本発明による直接的な再プログラミング法においてその成熟ヒト細胞から得られたものである。
次の1つの側面では、本発明は、神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株に関するものであり、特にその細胞株は、成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特にその細胞株は、本発明による直接的な再プログラミング法においてその成熟ヒト細胞から得られたものである。
次の1つの側面では、本発明は、神経堤前駆細胞を生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（誘導）神経ボーダー幹細胞を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；BMP4の存在下で3日間培養した後、GSK-3阻害剤（特にChir99021）、FGF8、IGF1、DAPTの存在下で培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、単離された神経堤前駆細胞株に関するものであり、特にその細胞株は、成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特にその細胞株は、本発明による直接的な再プログラミング法においてその成熟ヒト細胞から得られたものである。
次の1つの側面では、本発明は、本発明の神経堤前駆細胞株を分化させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、その神経堤前駆細胞株を分化因子の存在下で培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、神経ボーダー幹細胞表現型を有する単離された細胞集団に関するものであり、その細胞株は、成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特にその細胞集団は、本発明による直接的な再プログラミング法においてその成熟ヒト細胞から得られたものである。
次の1つの側面では、本発明は、ドーパミン作動性ニューロンを生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）（誘導）神経ボーダー幹細胞を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で培養する工程と、（ii）マウス線維芽細胞上で、FGF8とヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を補足した培地に変更する工程と、（iii）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物（マトリゲル）の上にある（ii）に従う培地の中で細胞を7日間培養する工程と、（iv）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を補足した培地に変更する工程と、（v）細胞を、（iv）に従う培地の中で2日間培養する工程と、（vi）その培地を成熟培地に変更する工程と、（vii）細胞をその成熟培地の中で5週間培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、運動ニューロンを生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と、（ii）FGF8とヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を補足した培地に変更する工程と、（iii）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物（マトリゲル）の上にある（ii）に従う培地の中で細胞を2日間培養する工程と、（iv）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）と全トランス型レチノイン酸を補足した培地に変更する工程と、（v）細胞を、（iv）に従う培地の中で7日間培養する工程と、（vi）その培地を成熟培地に変更する工程と、（vii）細胞をその成熟培地の中で5週間培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、グルタミン酸作動性ニューロンとGABA作動性ニューロンを生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と、（ii）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を補足した培地に変更する工程と、（iii）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物（マトリゲル）の上にある（ii）に従う培地の中で細胞を7日間培養する工程と、（iv）その培地を、BDNFとGDNFを含む成熟培地に変更する工程と、（v）細胞をその成熟培地の中で5週間培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、アストロサイトを生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と、（ii）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を補足した培地に変更する工程と、（iii）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物（マトリゲル）の上にある（ii）に従う培地の中で細胞を7日間培養する工程と、（iv）その培地を、BDNF、GDNF、1％FCSを含む成熟培地に変更する工程と、（v）細胞をその成熟培地の中で5週間培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、オリゴデンドロサイトを生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と、（ii）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を補足した培地に変更する工程と、（iii）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物（マトリゲル）の上にある（ii）に従う培地の中で細胞を7日間培養する工程と、（iv）その培地を、T3、IGF、フォルスコリン、PDGF、EGFを含む培地に変更する工程と、（v）細胞を、（iv）に従う培地の中で2週間培養する工程と、（vi）その培地を、T3、IGF、フォルスコリン、PDGF、ドルソモルフィンを含む培地に変更する工程と、（vii）細胞を、（vi）に従う培地の中で1週間培養する工程と、（viii）その培地を、T3、IGF、フォルスコリンを含む培地に変更する工程と、（ix）細胞を、（viii）に従う培地の中で3週間培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、神経堤由来のニューロンを生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と、（ii）GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；BMP4を補足した培地に変更する工程と、（iii）細胞を、（ii）に従う培地の中で3日間培養する工程と、（iv）その培地を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）、FGF阻害剤（特にSU5402）、Notch阻害剤（特にDAPT）、NGFを含む培地に変更する工程と、（v）細胞を、（iv）に従う培地の中で10日間培養する工程と、（vi）その培地を、BDNF、GDNF、NGFを含む成熟培地に変更する工程と、（vii）細胞を、（vi）に従う成熟培地の中で3週間培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、間葉系幹細胞表現型を有する細胞を生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と、（ii）GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；BMP4を補足した培地に変更する工程と、（iii）細胞を、（ii）に従う培地の中で3日間培養する工程と、（iv）その培地を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）、FGF8、IGF、Notch阻害剤（特にDAPT）を含む培地に変更する工程と、（v）細胞を、（iv）に従う培地の中で7日間培養する工程と、（vi）その培地を、bFGFとIGFを含む成熟培地に変更する工程と、（vii）細胞を、（vi）に従う成熟培地の中で2週間培養する工程と、（viii）その培地を、間葉系幹細胞培地に変更する工程と、（ix）その間葉系幹細胞培地の中で培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、間葉系幹細胞表現型を有する細胞を生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物（マトリゲル）で覆ったプレートの上にiNBSCを播種する工程と、（ii）その細胞を、4μMのChir99021、10 ng/mlのBMP4、10μMのDAPTの中で7日間培養する工程と、（iii）その細胞を、10 ng/mlのbFGFと10 ng/mlのIGF-1を含有する基本培地の中で少なくとも5継代にわたって培養する工程と、（iv）培地を間葉系幹細胞培地に切り換えることによって細胞を安定化させ、少なくとも2継代にわたって培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、間葉系幹細胞表現型を有する細胞を脂肪細胞へと分化させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）本発明のインビトロの方法によって間葉系幹細胞表現型を有するその細胞を生成させる工程と、（ii）培地を、10％FCSを含む間葉系誘導培地に変更する工程と、（iii）細胞を、（ii）に従う培地の中で5日間培養する工程と、（iv）その培地を、脂肪生成分化培地に変更する工程と、（v）細胞を、（iv）に従う培地の中で培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、間葉系幹細胞表現型を有する細胞を軟骨細胞へと分化させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）本発明のインビトロの方法によって間葉系幹細胞表現型を有するその細胞を生成させる工程と、（ii）培地を、10％FCSを含む間葉系誘導培地に変更する工程と、（iii）細胞を、（ii）に従う培地の中で5日間培養する工程と、（iv）その培地を、軟骨細胞分化培地に変更する工程と、（v）細胞を、（iv）に従う培地の中で培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、間葉系幹細胞表現型を有する細胞を平滑筋細胞へと分化させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）本発明のインビトロの方法によって間葉系幹細胞表現型を有するその細胞を生成させる工程と、（ii）培地を、10％FCSを含む間葉系誘導培地に変更する工程と、（iii）細胞を、（ii）に従う培地の中で3〜5週間培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、神経管様3D培養物を生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と、（ii）工程（i）に従って培養した細胞の単一細胞懸濁液を、エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物（マトリゲル）の中に包埋した後、SBとヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地を添加する工程と、（iii）（ii）に従うその単一細胞懸濁液を9日間培養する工程と、（iv）培地を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）、SB、ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）、bFGFを含む培地に変更する工程と、（v）4日間培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、神経堤様3D培養物を生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と、（ii）工程（i）に従って培養した細胞の単一細胞懸濁液を、エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物（マトリゲル）の中に包埋した後、GSK-3阻害剤（特にChir99021）、Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）、BMP4、FGF2を含む培地を添加する工程と、（iii）12日間培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、変異表現型を示す細胞を生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、本発明の中枢神経系系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、本発明の単離された中枢神経系前駆細胞株からの細胞、本発明の放射状グリア型幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、本発明の神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、本発明の単離された神経堤前駆細胞株からの細胞、本発明の神経ボーダー幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、本発明の方法によって生成される細胞のうちのいずれかの細胞の遺伝子配列の変化、および／またはその細胞の遺伝子配列の転写または翻訳の変化、および／またはその細胞の遺伝子配列によってコードされるタンパク質の変化を引き起こすか可能にする工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、薬をスクリーニングするためのインビトロの方法に関するものであり、この方法は、本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、本発明の中枢神経系系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、本発明の単離された中枢神経系前駆細胞株からの細胞、本発明の放射状グリア型幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、本発明の神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、本発明の単離された神経堤前駆細胞株からの細胞、本発明の神経ボーダー幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、本発明の方法によって生成される細胞、本発明の方法に従って得られて変異表現型を示す細胞のうちのいずれかの細胞を薬物質に曝露する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は医薬組成物に関するものであり、この医薬組成物は、本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、本発明の中枢神経系系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、本発明の単離された中枢神経系前駆細胞株からの細胞、本発明の放射状グリア型幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、本発明の神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、本発明の単離された神経堤前駆細胞株からの細胞、本発明の神経ボーダー幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、本発明の方法によって生成される細胞、本発明の方法に従って得られて変異表現型を示す細胞のうちのいずれかの細胞を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、神経障害を患っている患者の治療に用いるための細胞に関するものであり、その細胞は、本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、または本発明の中枢神経系系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、または本発明の単離された中枢神経系前駆細胞株からの細胞、または本発明の放射状グリア型幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、または本発明の神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、または本発明の単離された神経堤前駆細胞株からの細胞、または本発明の神経ボーダー幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、または本発明の方法によって生成される細胞、または本発明の方法に従って得られて変異表現型を示す細胞である。
図1は、体細胞から神経ボーダー幹細胞への直接的な変換を示している。a：体細胞を神経に変換するのに用いる再プログラミング用ベクター。b：体細胞から神経前駆細胞への変換の模式図。FPF、ADF、PBMCにBKSZ導入遺伝子を形質導入し、ドキシサイクリン（dox）とCAPTを添加してから1日後に再プログラミングを開始した。12日目以降はdoxを除去し、CAPを補足した培地に切り換えて変換させた。コロニーの採取を21日目以降に実施した。免疫蛍光写真は、採取前の代表的なコロニーのPAX6とSOX1に関する染色を示している；スケール棒は50μm。c：ADFに由来する代表的な神経前駆細胞株のBF画像。d：神経ボーダー細胞マーカーと神経幹細胞マーカーに関して陽性に染色されるADF由来神経前駆細胞株の代表的な共焦点画像；矢印の先端は二重陽性細胞と三重陽性細胞をそれぞれ示す；スケール棒は50μm。e：ADF、血液、iPSCに由来する(i)NBSC、PSC、ADFの、マイクロアレイに基づく転写プロファイリング。主成分分析は、（ADF、血液、iPSCに由来する）(i)NBSC、その体細胞（ADF）先祖、そのPSC（hESCs/iPSCs）先祖をそれぞれ表わす3つの明確に異なるクラスターを示している。f：ADFと比較してiNBSC株の中で上方調節された上位200個の遺伝子に基づく遺伝子オントロジー（GO）プロセス。g：主成分分析でサンプルの分離に関して最大の寄与をした200個のプローブに基づくiNBSC、ADF、PSCの発現ヒートマップ。iNBSC、ADF、PSCに関する特異的マーカーを強調してある。h：ADF由来iNBSC、PSC、ADFの、アレイに基づくメチル化プロファイリング。多次元スケーリングプロットから、各集団の明確に異なるクラスターが明らかである。i：ADFと比較したiNBSCの低メチル化プロモータ部位の遺伝子セットエンリッチメント解析。用語は、規格化したエンリッチメントスコア（NES）によって順位付けしてある。
iNBSCが初期神経発生を再現し、CNSと神経堤前駆細胞を生じさせることを示している。a：iNBSCからCNS運命とNC運命への定方向分化。CSPとbFGFを補足した培地、またはCAとBMP4を補足した培地の中でiNBSCを5日間培養してそれぞれCNS系列とNC系列へと分化させた。その後、培養物のCD133とP75の発現をフローサイトメトリーによって分析した。ゲーティングスキームと代表的な結果を、iNBSC、CNSでプライミングした培養物、NCでプライミングした培養物について示してある。b：3つの独立なiNBSCクローンをCNS でプライミングした後とNCでプライミングした後のCD133+/P75 neg集団とP75+/CD133neg集団の定量結果（t検定、* P＜0.05、** P＜0.01、平均値とSEM）。c：iNBSCをCNSまたはNCでプライミングした後のCNSマーカーとNCマーカーのmRNA発現。CNSでプライミングした培養物とNCでプライミングした培養物をそれぞれCD133+/P75negまたはP75+/CD133negに関してFACSでソーティングし、qRT-PCRによって分析した（n＝6、t検定、* P＜0.05、** P＜0.01、平均値とSEM）。d：iNBSCをNCSC様細胞へと分化させた後のサイトメトリーの代表的なデータ。細胞をCABの中で3日間培養した後、Chir99028と、FGF8と、IGFと、DAPTを補足した培地に切り換えてさらに7日間培養した。右側の図は、SSEA-1neg/CD133neg細胞集団を示している。SSEA-1neg/ CD133neg/P75+/HNK1+について細胞のソーティングを実施した。e：SSEA-1neg/CD133neg/P75+/ HNK1+についてソーティングされた細胞での神経堤マーカーに関する染色の共焦点画像。f：SSEA-1neg/CD133neg/P75+/HNK1+についてソーティングされた神経堤（赤色）とiNBSC（灰色）における上位のDEG（log 2倍率変化＞2）。g：iNBSCからcNPCへの誘導。iNBSC をCPSの中でbFGFおよびLIFとともに培養するスキームと、安定なcNPCサブクローンを誘導する前（左）と後（右）の代表的なBF写真；スケール棒は250μm。h：独立なiNBSC株（n＝3）とcNPC株（n＝8）における神経ボーダーマーカーの発現。mRNAの発現をqRT-PCRによって分析し、hESCに規格化した（t検定、* P＜0.05、**** P＜0.0001、平均値とSEM）。i：cNPCにおける神経前駆細胞マーカーの共焦点画像。矢印の先端（上図）は、SOX1/PAX6二重陽性細胞を示している；MSX1が存在しないことに注意されたい。；スケール棒は50μm。j：cNPC（青色）とiNBSC（灰色）の遺伝子セットエンリッチメント解析（GSEA）によって生成する一連のプロセス。k：iNBSC からRG様幹細胞への誘導。iNBSCを神経分化培地の中で7週間培養した後、bFGFとEGFとLIFを培地に添加した。その後、培地をCD133+/SSEA1+/GLAST+三重陽性細胞についてFACSでソーティングしてRG様SCを富化した。FACSプロットは、FACSソーティング前の代表的な分化を示している。l：iNBSC由来RG様SCに関する放射状グリアマーカーの免疫蛍光染色；スケール棒は50μm。m：独立なRG様SC（n＝3）とiNBSC（n＝3）における放射状グリアマーカーのmRNA発現（t検定、* P＜0.05、平均値とSEM）。n：RG様SCとiNBSCの時間的一致。iNBSCとRG様幹細胞（CD133+/SSEA1+/GLAST+）の発現データを機械学習フレームワーク（CoNTExT）によって分析し、データを発生中のヒト脳のトランスクリプトームアトラスと突き合わせた。o：iNBSCとその子孫細胞の転写風景。iNBSC、cNPC、神経堤（SSEA-1neg/CD133neg/ P75+/HNK1+）、Rg様SC（CD133+/SSEA1+/GLAST+）のPCAは4つの明確に異なるクラスターになることが明らかであり、発生プロセスにおいて距離が大きくなる。
図3は、iNBSCから成熟CNSと神経堤子孫細胞への分化を示している。さまざまな神経サブタイプとグリアサブタイプに分化したiNBSCの免疫蛍光画像。染色は、分化後に6週間を過ぎて（神経染色）または10週間を過ぎて（グリア染色）から実施した。矢印の先端は、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、運動ニューロン、GABA作動性ニューロン、（左から右へ、上図）のほか、セロトニンニューロン、シナプス形成、アストロサイト、オリゴデンドロサイト（左から右へ、下図）をそれぞれ示している。スケール棒は50μm。b：サブタイプ特異的ニューロンマーカーのmRNA発現。iNBSCをドーパミン作動性ニューロン運命（緑色、ドーパ分化）または運動ニューロン運命（青色、運動分化）へと方向づけ、7週間超にわたって成熟させた後、qRT-PCRを実施した。マーカーの発現を不定方向と定方向（ドーパ／運動）の分化プロトコルについて示してある（t検定、* P＜0.05、** P＜0.01、平均値とSEM）。c：6週間超にわたってインビトロで分化させたニューロンの電気生理学的特性。脱分極電圧ステップに反応した活動電位の反復列。d：6週間超にわたってインビトロで分化させたニューロンの自発的シナプス後電流。e：iNBSCは、3D培養によって神経管様構造と移動性堤様細胞を形成する。iNBSCを単一細胞懸濁液としてMGの中に包埋し、CNS運命または神経堤運命へと方向づけた。CNSでプライミングすると神経管様構造を観察することができた（上側のBF画像、スケール棒は100μm）。神経堤でプライミングすることによって細胞がマトリックス全体を移動した（下側のBF画像、スケール棒は100μm）。矢印の先端は、CNSプライミングとNCプライミングの後の代表的なSOX1/ネスチン二重陽性神経上皮構造とSOX10+/ AP2a+/PAX6neg細胞をそれぞれ示している；スケール棒は50μm。f：cNPCは3Dで分化させると神経管様構造を形成する。cNPCを単一細胞懸濁液としてMGの中に包埋し、CNSプライミング条件のもとで分化させた。BF画像は、分化から8日後の3D培養物の代表的な断面を示している；スケール棒は250μm。神経上皮マーカーSOX1とCD133に関して陽性に染色された代表的な神経管様構造；星印はCD133の管腔分布を示している。スケール棒は50μm。g：iNBSCは生体内で3つの主要な神経系列をすべて生じさせる。GFPを形質導入したiNBSCを8日間分化させた後、8週齢のNOD.Prkdcscid.Il2rgnull（NSG）マウスの線条体に移植した。移植してから7〜8週間後にマウスを分析した。共焦点画像の中の矢印の先端は、iNBSC子孫細胞（GFP）と、ニューロン（NeuN）、アストロサイト（GFAP）、オリゴデンドロサイト（MBP）に関するマーカーが、同時に染色されることを示している。h：6週間超にわたって生体内で分化させたニューロンの電気生理学的特性。脱分極電圧ステップに反応した活動電位の反復列。i：6週間超にわたって生体内で分化させたニューロンの自発的シナプス後電流。j：移植したニューロン子孫細胞の形態再構成。GFP陽性ニューロンにビオシチンを充填し、3,3'-ジアミノベンジジン染色によって同定し、Neurolucida追跡プログラムを利用して再構成した；スケール棒は200μm。k：末梢ニューロンへと分化したiNBSCの免疫蛍光画像。矢印の先端は感覚ニューロン（BRN3a/ペリフェリン二重陽性）を示している；スケール棒は50μm。l：NCでプライミングしたiNBSCの間葉系堤への分化。間葉系堤分化物の染色から、平滑筋細胞（SMA）、軟骨細胞（アルシアンブルー）、脂肪細胞（オイルレッド）が明らかである；スケール棒は100μm（SMA）と250μm（アルシアンブルー）。
図4は、マウス胚から一次神経ボーダー幹細胞への誘導を示している。a：pNBSCを誘導するためのスキーム。b：E8.5段階の胚から誘導された代表的な神経前駆細胞株のBF画像と免疫蛍光染色。BF画像は、9週間培養した後の代表的な形態を示している（P26）。神経前駆細胞マーカー（Sox1）と神経ボーダーマーカー（Msx1）の免疫蛍光染色。スケール棒は50μm。c：pNBSCと対照における神経前駆細胞マーカーと神経ボーダーマーカーのmRNA発現。qRT-PCRを3つの独立なpNBSC株で実施し、全E13.5段階胎仔脳に規格化した。マウスESCを陰性対照として使用した。d：CNSでプライミングしたpNBSCの免疫蛍光染色。pNBSCをプルモルファミンの存在下で3日間分化させ、ロゼット段階マーカーPlzf、Zo1に関して染色した；スケール棒は100μm。e：神経堤でプライミングしたpNBSCの免疫蛍光染色。pNBSCをChir99028とBMP4の存在下で2日間分化させ、神経堤幹細胞マーカーAp2aとSox10に関して同時染色した；スケール棒は50μm。f：pNBSCからの放射状グリア様幹細胞の安定化。CNSでプライミングしたpNBSCは、bFGFとEGFを補足した培地の中で培養することにより、放射状グリア様段階で安定化した。矢印の先端は、放射状グリアマーカーOlig2／ネスチンと幹細胞マーカーSox2／ネスチンの同時発現を示している；スケール棒は50μm。g：さまざまなニューロンサブタイプとグリアサブタイプに分化したpNBSCの免疫蛍光画像。染色は、分化から2週間超が過ぎてから実施した。pNBSCは大きなニューロン生成潜在力（Tuj1）を示し、オリゴデンドロサイト（O4）とアストロサイト（GFAP）も生じさせた。GabaとThに関する染色から、特定のサブタイプへの分化が明らかである；スケール棒は100μm。h：3週間超にわたってインビトロで分化させたニューロンの電気生理学的特性。脱分極電圧ステップに反応した活動電位の反復列。i：pNBSCから神経堤誘導体への分化。神経堤分化物の染色から、軟骨細胞（アルシアンブルー）、脂肪細胞（オイルレッド）、末梢ニューロン（ペリフェリン）、平滑筋細胞（SMA）が明らかである；スケール棒は100μm。j：pNBSC、pNBSC由来神経堤、pNBSC由来放射状グリア様幹細胞（RG様SC）、E13.5段階由来RG様SCの、マイクロアレイに基づく転写プロファイリング。主成分分析は、pNBSC、そのNC、そのRG様SC子孫細胞を表わす3つの明確に異なるクラスターを示している。E13.5段階由来RG様SCがpNBSC由来神経堤RG様SCと合わさってクラスターになっていることに注目されたい。k：GO解析によって豊富であった遺伝子の遺伝子発現ヒートマップ。ヒートマップは、pNBSC、その神経堤、そのRG様SC子孫細胞で豊富なGO用語に関係する一連の遺伝子のほか、一連の多能性マーカーを示している（拡張データ図4lも参照されたい）E13.5段階由来RG SCとESCを対照として用いる。
図5は、iNBSC、一次マウスNBSC、一次ヒト前駆細胞の比較を示している。a：ヒトiNBSCとマウスpNBSCの発現データの比較。iNBSC対ADFとpNBSC対MEFの遺伝子発現の違いを、類似性に関して発現差一致手続き（AGDEX）を適用することによって評価した。分析から、0.457という正の相関がわかる（並べ替えp値は0.0256）。b：iNBSCとpNBSCで豊富な共有されている生物学的プロセス。iNBSC株とpNBSC株で上方調節されていてlog 2倍率変化が1よりも大きい遺伝子（258個の遺伝子）に基づく遺伝子オントロジーのプロセス。c：ADFおよびMEFと比べてiNBSCとpNBSCで下方調節されている生物学的プロセス。iNBSC株とpNBSC株に共通して下方調節されている上位200個の遺伝子に基づく遺伝子オントロジーのプロセス。d：iNBSCとpNBSCの共有コアネットワーク。iNBSC株とpNBSC株に共通して上方調節されていてlog 2倍率変化が2よりも大きい遺伝子（74個の遺伝子）について、STRING v10ウェブインターフェイスを利用してネットワーク分析を実施した；ネットワークの接続されているノードだけを表示してある。
図6は、変異遺伝子に関係する機能を研究するのにiNBSCが有用であることを示している。a：CRISPR Cas9を媒介としたSCN9aのノックアウトと、カルシウム流束測定による機能分析の模式図。b：未分化のiNBSCと、野生型iNBSCおよびSCN9-/- iNBSCに由来する感覚ニューロンのウエスタンブロット分析。ブロットは、2つの独立なiNBSCクローンと、3つの独立なiNBSCの野生型クローンおよびSCN9a-/-クローンからの3つの独立な感覚ニューロン分化物を示している。分化後4週間を過ぎてからすべてのニューロン培養物を回収した。矢印の先端は、タンパク質ラダーの200 kDaのバンドを示している。アクチンに関するウエスタンブロットをローディング対照として用いる。c：SCN9a-/- iNBSCクローンに由来する感覚ニューロン分化物の代表的な共焦点画像。矢印の先端は、BRN3a/ペリフェリン二重陽性細胞を示す；スケール棒は50μm。d：30μMのα,β-メチレン-ATPを用いて刺激する前後の野生型iNBSCとSCN9a-/- iNBSCに由来する感覚ニューロンのカルシウム流束測定。画像全体の蛍光強度（Fluo-3 AM）をベースライン測定に対する倍率変化として示してある。プロットは、3つの独立な野生型感覚ニューロン分化物と、P2X2/3のアンタゴニストであるA-317491で追加処理した3つの独立な野生型分化物と、3つの独立なSCN9-/-感覚ニューロン分化物に関する平均値（濃い色の線）と標準偏差（薄い色）を示している。e：カルシウム流束の定量。グラフは、α,β-メチレン-ATPで処理した後の最大蛍光強度（Fluo-3 AM）を、4つの独立な野生型感覚ニューロン分化物と、P2X2/3のアンタゴニストであるA-317491で追加処理した3つの独立な野生型分化物と、4つの独立なSCN9-/-感覚ニューロン分化物について、ベースラインに対する相対値として示している（t検定、* P＜0.05、平均値とSEM）。f：NBSCの直接的な変換と単離、CRISPR Cas9を通じたNBSCの操作、CNSと神経堤系列から神経子孫細胞への分化の模式図。
拡張データ図1：a：3つの独立した実験の神経コロニー誘導率の経時変化。ADFにBKSZを形質導入し、その1日後のDOX処理とCAPT処理によって再プログラミングプロセスを誘導した。次いでそれぞれ8〜20日後にDOXを除去し、コロニー誘導の効率を20日目に求めた。b：分子または導入遺伝子なしでの再プログラミングの代表的なBF画像。導入遺伝子と分子の役割を明らかにするため、ADFにBKSZ導入遺伝子を形質導入する（左）か、形質導入なしにADF をCAPTで処理した（右）。両方の条件で神経コロニーの形成は観察できなかった；スケール棒は250μm。c：神経再プログラミングの間にOCT4発現の有意な増加はなかった。ADFにBKSZを形質導入し、DOXとCAPTを適用することによって再プログラミングを開始した。RNAは、示されている時点における3つの独立な実験に由来するものであった；形質導入なしのADFを陰性対照とした。OCT4の有意な増加は検出できなかった（t検定、P＞0.05、平均値とSEM）。d：異なるタイプの体細胞からの神経再プログラミングの概要。表は、FPF、ADF、PBMCの3回超の独立な再プログラミング実験から採取したコロニーの数を示している。単独コロニーを単離した後、フィーダー細胞の上にあるCAPの中で細胞をDOXなしで増殖させた。細胞が上皮の形態を示し、しかも5継代を超えて細胞を培養物の中に維持することができない場合には、その細胞を増殖やすことのできる株と呼ぶ。マーカーの発現、分化能力、増殖潜在力に関していくつかの株をさらに分析したため、その株を特徴づけられた株と呼ぶ。この研究で使用したすべての株を培地の中で40継代を超えて（6ヶ月超）維持することができた。e：異なるタイプの体細胞の変換効率。PBMC、ADF、FPFにBKSZを形質導入し、DOXとCAPTで処理することによって再プログラミングを開始した。形質導入してから19日目にコロニーの数を求めた。効率は、形質導入後の細胞数に対するコロニーの数として計算した。効率は、PBMC、ADF、MSCそれぞれの3つの独立な再プログラミング実験に基づいて計算した。f：異なるタイプの細胞に由来するiNBSC の中の神経前駆細胞マーカーと神経ボーダーマーカーのmRNA発現。神経前駆細胞マーカーと神経ボーダーマーカーのmRNA発現は、ADF由来の(i)NBSC株（n＝3）、PBMC由来の(i)NBSC株（n＝4）、iPSC由来の(i)NBSC株（n＝3）の安定な株から求めた。ADFとhESCを対照とする。異なる供給源の間でマーカー発現の有意な差は検出できなかった（t検定、P＞0.05、平均値とSEM）。g：mRNAのレベルに対する導入遺伝子除去の確認。Creを媒介とした組み換えの前後に、導入遺伝子特異的プライマーを用いたqRT-PCRを、3つの独立なiNBSCクローンのcDNAに対して実施した。形質導入されていないADFと、BKSZを形質導入したADFを、基準として用いた。h：gDNAからの導入遺伝子除去の確認。Creを媒介とした組み換えの前後に、導入遺伝子特異的なプライマーを用いたqRT-PCRを、3つの独立なiNBSCクローンのgDNAに対して実施した。形質導入されていない細胞を基準として用いた。i：培養を延長した（P43、7ヶ月超の連続培養）後でさえ神経ボーダー幹細胞マーカーと神経幹細胞マーカーに関する染色が陽性であるPBMC由来の神経前駆細胞株の代表的な共焦点画像；矢印の先端は、三重陽性細胞を示す；スケール棒は50μm。j：ADF、血液、iPSCに由来する(i)NBSC、PSC、PBMCの、マイクロアレイに基づく転写プロファイリング。主成分分析は3つの明確に異なるクラスターを示しており、（ADF、血液、iPSCに由来する）(i)NBSC、その体細胞（PBMC）先祖、そのPSC（hESC/iPSC）先祖をそれぞれ表わしている。k：神経ボーダー幹細胞マーカーと神経幹細胞マーカーに関する染色が陽性であるiPSC由来の神経前駆細胞株の代表的な共焦点画像；矢印の先端は、三重陽性細胞を示す；スケール棒は50μm。l：iNBSC、PSC、ADF、中胚葉に特徴的な遺伝子の遺伝子発現ヒートマップ。細胞のタイプに特異的な遺伝子発現による、ADFクラスター、PSCクラスター、ADF由来(i)NBSCクラスター、PBMC由来(i)NBSCクラスター、iPSC由来(i)NBSCクラスター。m：ADFと比較したiNBSCの高メチル化プロモータ部位の遺伝子セットエンリッチメント解析。用語は、規格化したエンリッチメントスコア（NES）によって順位付けする。
拡張データ図2：a：iNBSC のCNSプライミングまたはNCプライミングの後のTFAP2aのmRNA発現。細胞を（CNSプライミングされた）CD133+/P75 negと（NCプライミングされた）P75+/CD133negについてFACSでソーティングし、qRT-PCRによって分析した（n＝6、t検定、* P＜0.05、平均値とSEM）。b：神経堤表面マーカーパネルに関して染色されたiNBSC の代表的なサイトメトリーデータ。右図はSSEA-1neg/CD133neg細胞集団を示している。c： SSEA-1neg/CD133neg/P75+/HNK1+についてソーティングしたiNBSC由来神経堤とiNBSCにおけるCNS特異的マーカーとNC特異的マーカーのmRNA発現。3つの独立なiNBSC株と神経堤誘導体のmRNA発現をqRT-PCRによって分析した。発現はhESCに規格化した（t検定、** P＜0.01、平均値とSEM）。d：iNBSC由来神経堤とiNBSC からのDEGのGO解析。iNBSC 由来神経堤とiNBSC からの上方調節された上位100個の遺伝子をEnrichr解析ツールによって解析した。グラフは、WikiPathways 2016ライブラリに基づく解析の上位の結果を示している。e：MSC表面マーカーパネルに関して染色されたiNBSC とiNBSC 由来MSCの代表的なサイトメトリーのデータ。NCでプライミングしたiNBSC をMSC様細胞へと分化させ、MSC培地の中で2継代超にわたって増殖させた後、分析した。f：CD13+/ CD44+/CD90+/CD105+/CD146+ についてソーティングしたMSC様細胞（赤色）とiNBSC（灰色）における上位20個のDEG。g：iNBSC株と比べてMSC様細胞で上方調節された上位150個の遺伝子に基づき、MSC様細胞の中で豊富であった遺伝子オントロジーの用語。h：iNBSCとcNPCにおける神経ボーダーマーカーの発現。iNBSCとiNBSC由来cNPCにおけるmRNA発現のqRT-PCRによる分析（t検定、*** P＜0.001、平均値とSEM）。i：P75とCD133に関するiNBSC株とiNBSC由来NPC株の代表的なフローサイトメトリーブロット。j：フローサイトメトリーによるCD133+/P75-集団、CD133+/P75+集団、CD133-/P75+集団の定量。データは、独立なiNBSC株（n＝5）とcNPC株（n＝3）から導出された（t検定、** P＜0.01、**** P＜0.0001、平均値とSEM）。k：cNPCとiNBSCにおけるCXCR4の発現。CXCR4の発現レベルは、iNBSCとiNBSC由来cNPCにおいてフローサイトメトリーによって求めた。l：iNBSC条件で培養した後の表面マーカーCD133とP75の発現。CAP培地を用いてiNBSC維持条件下で培養し、フィーダー細胞上で増殖させたiNBSCとNPCの代表的なフローサイトメトリーデータ。m：CAP培地を用いてiNBSC維持条件下で培養し、フィーダー細胞上で増殖させた独立なiNBSC株（n＝5）とNPC株（n＝3）におけるCXCR4の発現。CXCR4の発現レベルはフローサイトメトリーによって求めた。n：NCプライミング条件でNPCを培養した後の表面マーカーCD133とP75の発現。CAB培地の中で5日間培養したcNPCの代表的なフローサイトメトリーのデータ。o：NCプライミング条件で培養した後のiNBSCとNPCにおけるP75+/ CD133-集団とP75-/ CD133+集団の分析。3つの独立なiNBSC株とcNPC株をCABの中で5日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した（t検定、* P＜0.05、平均値とSEM）。p：iNBSCとNPCの領域アイデンティティ。領域特異的マーカーのmRNA発現をiNBSC株（n＝4）とNPC株（n＝8）で明らかにした。発現はhESCに規格化した。q：放射状グリア表面マーカーパネルに関して染色したiNBSCの代表的なサイトメトリーのデータ。右図はSSEA-1+細胞集団を示す。r：独立なiNBSC由来RG様SC（n＝3）とiNBSC（n＝3）における放射状グリア関連マーカーのmRNA発現（平均値とSEM）。
拡張データ図3：a：ドーパミン作動性ニューロンへと分化したiNBSCの共焦点画像。iNBSCを、Chir99028、プルモルファミン、FGF8の存在下で8日間分化させた後、プルモルファミンの中でさらに2日間培養し、さらに6週間成熟させた。矢印の先端は、FOXA2、TH、EN1三重陽性ニューロンを示している。スケール棒は50μm。b：RG様SCからオリゴデンドロサイトへの分化。iNBSC由来RG様幹細胞をオリゴデンドロサイトへと分化させ、6ヶ月間成熟させた。スケール棒は50μm。c：CNSと神経堤でプライミングした3D培養物の中のCNSマーカーと神経堤マーカーの発現。iNBSCの単一細胞懸濁液をMGの中に包埋し、CNSプライミング条件またはNCプライミング条件で12日間培養した。独立なCNS分化物（n＝3）とNC分化物（n＝3）のmRNA発現をqRT-PCRによって調べた（t検定、** P＜0.01、**** P＜0.0001、平均値とSEM）。d：神経堤でプライミングしたNPCの3D培養。iNBSC由来NPCの単一細胞懸濁液をMGの中に包埋し、神経堤プライミング（CABF）条件で12日間培養した。スケール棒は250μm。e：オリゴデンドロサイトの3D再構成の共焦点画像。GFPを形質導入したiNBSCを、Chir99028、プルモルファミン、FGF8を補足した培地の中で8日間分化させた後、8週齢のNOD.Prkdcscid.Il2rgnull（NSG）マウスの線条体に移植した。移植してから8週間後にマウスを分析した。f：感覚ニューロン運命へと分化したiNBSCの共焦点画像。分化してから4週間後に細胞を分析した；スケール棒は50μm。
拡張データ図4：a：pNBSCを単離するためのE8.5段階の胚の調製。神経組織を切除する前のE8.5段階の胚の代表的な顕微鏡写真。点線は、単一細胞懸濁液のために単離して消化させた後に培養する領域を示す。b：E7.5〜E9.5段階の胚からpNBSCを単離した結果を示す表。c：pNBSCでの神経ボーダーマーカーと幹細胞マーカーの代表的な免疫蛍光画像。pNBSCはE8.5トマト-マウスに由来し、フィーダー細胞の上にあるCAPの中で20継代にわたって培養した；スケール棒は50μm。d：pNBSC と対照でのZfp521のmRNA発現。3つの独立なpNBSC株でqRT-PCRを実施し、全E13.5段階の胎仔脳に規格化した；マウスESCを陰性対照として用いた。e：pNBSCを長期間培養した後の神経前駆細胞マーカーと神経ボーダーマーカーの発現。4ヶ月超にわたって培養したpNBSCの代表的な免疫蛍光画像；スケール棒は50μm。f：pNBSCのクローン生成能力。pNBSCを単一細胞としてFACSでソーティングし、不活化MEFの上にあるCAPの中で（pNBSC）、またはフィブロネクチンの上にあるbFGF/EGF補足培地の中で（一次RG）7日間培養した後、分析した。結果を2つの独立なpNBSCクローンとE13.5段階由来RG様SCについて示してある（n＝3；t検定、** P＜0.01、平均値とSEM）。g：Notchリガンド（500 ng/mlのDll4と500 ng/mlのJagged-1）の存在下または不在下にて、不活化MEF（フィーダー）またはマトリゲルの上で培養したpNBSC。h：pNBSCの領域アイデンティティ。3つの独立なpNBSC株で領域特異的マーカーのmRNA発現を調べた。発現は全E13.5段階胎仔脳に規格化した。i：維持条件下と神経堤プライミング条件下のpNBSC株のフローサイトメトリーデータ。pNBSCをCAPの中、またはCA＋BMP4の中で5日間培養した後、Ssea1とP75のレベルをフローサイトメトリーによって求めた。j：ニューロン分化時のセロトニンに関する免疫蛍光染色。pNBSCをプルモルファミンの存在下で3日間分化させ、さらに2週間成熟させた後、染色した；スケール棒は50μm。k：CNSプライミングまたはNCプライミングの後にMGの中に単一細胞懸濁液として包埋したpNBSC のBF画像。pNBSCは、CSPの中で6日間（上図）、またはCABFの中で10日間（下図）培養した。写真はそれぞれ2.5日目、4日目、6日目、10日目に撮影した。スケール棒は50μm。l：pNBSC、pNBSC由来RG様SC、pNBSC由来NCにおいて豊富であった遺伝子オントロジー（GO）のプロセス。GOは、各グループの上方調節された上位200個の遺伝子に基づいている。
拡張データ図5：a：CRISPR Cas9によるSCN9aのエキソン22/27のターゲティング。図は、SCN9a遺伝子座と、特異的ガイドRNAを通じたターゲティング戦略と、本研究で用いるSCN9-/-クローンの中の遺伝子座に関するシークエンシング結果を示している。点線は、存在していない塩基を示す。赤色の配列は終止コドンを示す。b：未分化のiNBSCと、野生型およびSCN9-/- iNBSCに由来する感覚ニューロンのウエスタンブロット分析。Nav1.7とアクチンに関するブロットの完全な膜が図6bに示されている。c：野生型クローンとSCN9-/- iNBSC クローンに由来する培養物の中のBRN3a/ペリフェリン二重陽性ニューロンの定量。3つの独立な野生型iNBSCと4つの独立なSCN9-/- iNBSCからの感覚ニューロン分化物を定量した。有意差を検出することはできなかった（t検定、P＞0.05、平均値とSEM）。
本発明は、本発明の以下の詳細な説明とその中に含まれる実施例を参照することによってより容易に理解することができよう。
そこで第1の側面では、本発明は、成熟ヒト細胞を直接再プログラミングするインビトロの方法に関するものであり、この方法は、その成熟ヒト細胞を転写因子の混合物の存在下で培養する工程を含み、その混合物は、因子BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3を含んでおり、その培養を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）の存在下で実施する。
特別な一実施態様では、培養工程は、フィーダー細胞としての不活化されたマウス胚性線維芽細胞（MEF）の上で実施される。
別の1つの側面では、本発明は、多能性ヒト幹細胞（特に胚性幹細胞（ESC）または人工多能性幹細胞（iPSC））を直接分化させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、そのヒト多能性幹細胞を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）の存在下で培養する工程を含んでいる。
特別な一実施態様では、培養工程は、フィーダー細胞としての不活化されたマウス胚性線維芽細胞（MEF）の上で実施される。
本発明の文脈では、「成熟ヒト細胞」という用語は、十分に（または最後まで）分化したヒト細胞、すなわちもはや多系列分化潜在力を持たないヒト細胞を意味する。いくつかの実施態様では、成熟ヒト細胞は、ヒト組織またはヒト血液から単離されるか、単離することができる。いくつかの実施態様では、成熟ヒト細胞は体細胞から選択され、その非限定的な例は、皮膚由来のケラチノサイト、毛包由来のケラチノサイト、肝細胞、粘膜細胞、末梢血細胞、内皮細胞である。
特別な一実施態様では、体細胞の選択は、成人線維芽細胞（AFC）；膵臓由来間葉系間質細胞（pMSC）；末梢血細胞（特に末梢血単核細胞（PBMC））からなされる。
さらに別の1つの側面では、本発明は、多能性非ヒト幹細胞（特に胚性幹細胞（ESC）または人工多能性幹細胞（iPSC））を直接分化させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、その非ヒト多能性幹細胞を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）の存在下で培養する工程を含んでいる。
特別な1つの側面では、多能性非ヒト幹細胞は、多能性マウス幹細胞（マウスPSC）である。
本発明の文脈では、「造血幹・前駆細胞」という用語はHSPCという略号で示され、造血幹細胞（HSC）と、HSC分化の第1段階であるその前駆細胞を合わせたものを意味する（HSPCの特徴と、HSPCを同定するためのアッセイに関する概説に関しては、STEMCELL Technologies Inc.社が公開しているWognumとSzilvassy「Hematopoietic Stem and Progenitor Cells」、文書#29068、バージョン6.0.0、2015年4月を参照されたい）。
本発明の文脈では、「含む」または「含んでいる」という用語は、「含有している」を意味するが、それに限定されない。この用語は範囲が限定されておらず、記載されているあらゆる特徴、エレメント、整数、工程、構成要素が存在することは明確だが、1つ以上の他の特徴、エレメント、整数、工程、構成要素、グループの存在または追加が除外されることはないことを想定している。したがって「含んでいる」という用語は、「からなる」と「主に…からなる」という、より制限のある表現を含有する。
成熟ヒト細胞（ヒト成人の体細胞など）を再プログラムして初期胚性自己複製タイプの神経幹細胞にするため、初期神経段階へのアクセスを可能にするとわれわれが仮定したさまざまな転写因子（BRN2、SOX2、KLF4、MYC、TLX、ZIC3）と、さまざまな小分子と、さまざまなサイトカインの多彩な組み合わせをヒト成人細胞（ヒト皮膚線維芽細胞（ADF）など）に形質導入した。最終的に、4つの因子BRN2、KLF4、SOX2、ZIC3（BSKZ）と、分子Chir99021（GSK-3阻害剤）、Alk5阻害剤II、プルモルファミン（ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト）と、場合によってはトラニルシプロミン（モノアミン-オキシダーゼ（MAO）とCYP2酵素（A6、C19、D6）の阻害剤）（CAPT）の組み合わせが、神経再プログラミングを可能にすることを同定した。
特別な一実施態様では、培養は、モノアミン-オキシダーゼの阻害剤（特にトラニルシプロミン）を追加して存在させて実施される。
本発明の文脈では、「トラニルシプロミン」という用語は、モノアミン-オキシダーゼ（MAO）とCYP2酵素（A6、C19、D6）の阻害剤（CAPT）を意味する。
特別な一実施態様では、モノアミン-オキシダーゼの阻害剤（特にトラニルシプロミン）は、誘導相の間だけ存在し、特に培養の最初の12〜21日目の間にだけ存在し、特にADFに関しては最初の12〜21日目の間、pHSCに関しては最初の12〜16日目の間、PBMCに関しては最初の17〜21日目の間にだけ存在する。
次の1つの側面では、本発明は、誘導神経ボーダー幹細胞を生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、成熟ヒト細胞を転写因子の混合物の存在下で培養する工程を含み、その混合物は、因子BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3を含んでおり、その培養を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）の存在下で実施する。
別の1つの側面では、本発明は、神経ボーダー幹細胞を生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、多能性ヒト幹細胞（特に胚性幹（ES）細胞または人工多能性幹（iPS）細胞）を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）の存在下で培養する工程を含んでいる。
特別な一実施態様では、培養は、モノアミン-オキシダーゼの阻害剤（特にトラニルシプロミン）を追加して存在させて実施する。
特別な一実施態様では、モノアミン-オキシダーゼの阻害剤（特にトラニルシプロミン）は誘導段階にだけ存在し、特に前記培養の最初の12〜21日目の間にだけ存在し、特にADFに関しては最初の12〜21日目の間、pHSCに関しては最初の12〜16日目の間、PBMCに関しては最初の17〜21日目の間にだけ存在する。
特別な実施態様では、培養工程は、支持フィーダー細胞の上、特にマウス線維芽細胞の上で実施する。
特別な実施態様では、成熟ヒト細胞を含む培養物に因子BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3を形質導入する。
特別な一実施態様では、因子BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3がベクターに含まれる。
特別な一実施態様では、ベクターはポリシストロン性ベクターである。
特別な実施態様では、ベクターはドキシサイクリン誘導ベクターであり、特に配列ID番号1に従うベクターpHAGE2-TetOminiCV-BRN22AKlf4-IRES-Sox2E2AZic3-Wである。
特別な一実施態様では、培養を形質導入後の少なくとも12日間にわたって、特に12日間、または13日間、または14日間、または15日間、または16日間にわたって、ドキシサイクリンの存在下で実施する。
特別な実施態様では、上記の方法は、単一コロニーをクローンで増やす工程をさらに含んでいる。
特別な一実施態様では、形質導入後19日目〜24日目から選択された日までコロニーを増やす。
特別な実施態様では、ベクターは、因子BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3をコードする核酸配列に隣接するloxP部位をさらに含んでいて、特にこのベクターは、配列ID番号2に従うベクターpHAGE2-TetOminiCV-BRN22AKlf4-IRES-Sox2E2AZic3-W-loxpである。
特別な一実施態様では、ベクターに含まれる因子BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3をコードする核酸配列はCreリコンビナーゼによって切除される。
特別な一実施態様では、本発明のインビトロの方法は、Creリコンビナーゼをコードするプラスミドを細胞に形質導入する工程を含んでいる。
特別な一実施態様では、CreリコンビナーゼはCherry-Creリコンビナーゼである（20）。
次の1つの側面では、本発明は、BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3をコードする核酸配列に関する。
次の1つの側面では、本発明は、BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3をコードするポリシストロン性ベクターに関する。
特別な一実施態様では、ベクターはポリシストロン性ベクターである。
特別な実施態様では、ベクターはドキシサイクリン誘導ベクターであり、特に配列ID番号1に従うpHAGE2-TetOminiCV-BRN22AKlf4-IRES-Sox2E2AZic3-Wベクターである。
特別な実施態様では、このベクターはさらにloxP部位を含んでいて、特にこのベクターは、配列ID番号2に従うpHAGE2-TetOminiCV-BRN22AKlf4-IRES-Sox2E2AZic3-W-loxpベクターである。
次の1つの側面では、本発明は、GSK阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）から選択された少なくとも2つの構成要素、さらに特定するならば3つすべての構成要素を含むキットに関する。
特別な一実施態様では、本発明のキットはモノアミン-オキシダーゼの阻害剤（特にトラニルシプロミン）をさらに含んでいる。
特別な一実施態様では、このキットは、本発明の方法で用いられるベクター；支持フィーダー細胞（特にマウス線維芽細胞）；Creリコンビナーゼ（特にCherry-Creリコンビナーゼ）をコードするプラスミドから選択された1つ以上の構成要素をさらに含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株に関する。本発明の文脈では、「（誘導）神経ボーダー幹細胞株」または「（誘導）神経ボーダー幹細胞」という用語は、成熟ヒト細胞を再プログラミングすることによって得られる（誘導）神経ボーダー幹細胞株／（誘導）神経ボーダー幹細胞、または多能性幹細胞（ESCやiPSCなど）を分化させることによって得られる（誘導）神経ボーダー幹細胞株／（誘導）神経ボーダー幹細胞を意味する。
特別な一実施態様では、本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株は、（i）初期神経マーカー（特にPAX6、ASCL1、BRN2、SOX1）と；（ii）幹細胞マーカー（特にネスチン、SOX2）の両方に関して陽性であることを特徴とする。
特別な一実施態様では、単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株は、COL3A1（コラーゲンIII型α1）の発現を特徴とする。この遺伝子は、線維芽細胞で通常は活性だが、神経細胞では活性でない。COL3A1の発現は、本発明の方法に従って線維芽細胞を再プログラムすることによって得られる細胞でも観察される。
細胞がPBMCの再プログラミングによって得られる別の特別な一実施態様では、単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株は、神経細胞で発現しないPBMC特異的遺伝子の発現を特徴とする。
特別な一実施態様では、本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株は、初期神経マーカーASCL1に関しても陽性であることを特徴とする。
本発明の文脈では、「初期神経マーカー」という用語は、神経板の形成から始まって神経胚形成の終わりまでという胚性神経発生の間に神経上皮細胞で発現する遺伝子または遺伝子の組み合わせを意味する。具体的には、PAX6、SOX1、CD133/2の発現の組み合わせと、GFAPとGLASTの発現の同時不在が、「初期神経マーカー」のセットを規定すると見なされる。
本発明の文脈では、「幹細胞マーカー」という用語は、以前から神経幹細胞と神経前駆細胞の自己複製性および／または多能性と結び付けられている遺伝子または遺伝子の組み合わせを意味する。
特別な一実施態様では、本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株は、MSX1、ZIC1、PAX3の発現をさらに特徴とする。
特別な実施態様では、本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株は、HES5、SOX3、HOXA2に関してさらに陽性であることを特徴とする。
特別な実施態様では、本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株は、ID2、IRX3、ZIC3、プロミニン1、CXCR4に関してさらに陽性であることを特徴とする。
特別な一実施態様では、本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株は、（i）初期神経マーカーPAX6、BRN2、SOX1のすべてに関して陽性であることと；（ii）幹細胞マーカーであるネスチンとSOX2の両方に関して陽性であることと；（iii）MSX1、ZIC1、PAX3を発現することと；（iv）追加してHES5、SOX3、HOXA2に関して陽性であることと；（v）追加してID2、IRX3、ZIC3、プロミニン1、CXCR4に関して陽性であることを特徴とする。
特別な一実施態様では、本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株は、（vi）初期神経マーカーASCL1に関して陽性であることを特徴とする。
本発明の文脈では、「に関して陽性」と「発現することによって」という表現は同義語として用いられ、特定の遺伝子のmRNAおよび／またはタンパク質の発現が、技術的バックグラウンドおよび／または陰性対照におけるよりも有意に高いレベル（p＜0.05）で検出されることを意味する。
特別な一実施態様では、本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株は、K14、および／またはSOX10、および／またはFOXD3、および／またはMPZ、および／またはOTX2を発現しないことをさらに特徴とする。
特別な実施態様では、本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株は、追加してTFAP2Aおよび／またはHNK1の不在（特にTFAP2AとHNK1両方の不在）をさらに特徴とする。
本発明の文脈では、「発現しないことにより」という表現は、特定の遺伝子のmRNAが検出できないこと、または技術的バックグラウンドおよび／または陰性対照の信号よりも有意に高いレベル（p＜0.05）ではないことを意味する。
特別な実施態様では、単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株は、本発明のインビトロの方法によって生成されたものである。
本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株の特別な一実施態様では、細胞株の一塩基多型分析の結果は、成熟ヒト細胞の一塩基多型分析の結果とクラスターを形成する。
特別な実施態様では、単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株は、本発明のインビトロの方法によって生成されたものであり、この細胞株の遺伝子発現網羅的比較分析の主成分分析の結果は、（i）単離された誘導神経ボーダー幹細胞株の場合には成熟ヒト細胞の遺伝子発現網羅的比較分析の主成分分析の結果とクラスターを形成せず、（ii）ヒト人工多能性幹細胞の遺伝子発現網羅的比較分析の主成分分析の結果とクラスターを形成しない。
次の1つの側面では、本発明は、本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株を増やすインビトロの方法に関するものであり、この方法は、この単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞を培養する工程を含み、特にこの培養を、増殖を支援するサイトカイン（特にNotchシグナル伝達活性化物質、特にDLL1、DLL3、DLL4、Jagged-1、Jagged-2から選択された物質、さらに特定するならばDLL4とJagged-1から選択された物質）の存在下で実施する。
神経系の形成は、原腸胚形成から短時間経過した後の神経板段階から始まる。シグナル伝達経路（WNT、BMP、SHHなど）が協調し、神経になる予定の細胞を多様化させる。この細胞がもとになり、さまざまな脳領域、脊髄のほか、神経堤を発生させる（13、14、15）。
特別な一実施態様では、培養を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）の存在下にて、特に5％O2で実施する。
特別な実施態様では、培養を支持フィーダー細胞（特にマウス線維芽細胞）の層の上で実施する。
特別な実施態様では、培養を40継代まで実施する。
次の1つの側面では、本発明は、（誘導）神経ボーダー幹細胞（本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株の細胞、または本発明のインビトロの方法によって得られる細胞）を分化させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、その（誘導）神経ボーダー幹細胞を分化因子の存在下で培養する工程を含んでいる。
特別な一実施態様では、（誘導）神経ボーダー幹細胞を分化させて中枢神経系系列の細胞にする。
特別な実施態様では、（誘導）神経ボーダー幹細胞を、GSK阻害剤（特にChir99021）；Alk4, 5, 7阻害剤（特にSB431542）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）の存在下で、bFGFを添加して培養する。
特別な実施態様では、上記の方法はCD133+/P75neg細胞の増加を特徴とする。
特別な実施態様では、上記の方法は、CNS関連遺伝子（特にPAX6）のためのmRNAの富化と、神経ボーダー関連遺伝子（特にTFAP2aとSOX10）の下方調節を特徴とする。
次の1つの側面では、本発明は、本発明の方法による分化によって（誘導）神経幹細胞株から中枢神経系プライムド神経前駆細胞株を単離するインビトロの方法に関する。
次の1つの側面では、本発明は、中枢神経系系列の単離された中枢神経系プライムド神経前駆細胞株に関するものであり、特に（i）この細胞株は、妊娠8〜12週の胚から得ることのできる一次神経前駆細胞と同じ発生状態であり、および／または（ii）この細胞株は、前駆細胞マーカーSPRY4、ETV4、LONRF2、ZNF217、ネスチン、SOX1、SOX2（特にSPRY4、ETV4、LONRF2、ZNF217）を特徴とするとともに、MSX1、PAX3、TFAP2に関して陰性であることを特徴とし、および／または（iii）この細胞株は、成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特に本発明に従う直接的な再プログラミング法においてその成熟ヒト細胞から得られたものである。
本発明の中枢神経系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株は、本発明の方法によって生成される。
特別な一実施態様では、単離された中枢神経系プライムド神経前駆細胞株は、COL3A1（コラーゲンIII型α1）の発現を特徴とする。この遺伝子は、線維芽細胞で通常は活性だが、神経細胞では活性でない。COL3A1の発現は、本発明の方法に従って線維芽細胞を再プログラムすることによって得られる細胞でも観察される。
細胞がPBMCの再プログラミングによって得られる別の特別な一実施態様では、単離された中枢神経系プライムド神経前駆細胞株は、神経細胞で発現しないPBMC特異的遺伝塩発現を特徴とする。
次の1つの側面では、本発明は、CNS前駆細胞を生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、場合によっては本発明の方法で（誘導）神経ボーダー幹細胞を最初に分化させた後に、（誘導）神経ボーダー幹細胞を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk4, 5, 7阻害剤（特にSB431542）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）；bFGF；LIFを含む培地の中で培養する工程を含んでいる。
本発明のインビトロの方法の特別な一実施態様では、培養物を、エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）の上で維持する。
次の1つの側面では、本発明は、単離された中枢神経系前駆細胞株に関するものであり、この細胞株は、成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特に本発明に従う直接的再プログラミング法においてその成熟ヒト細胞から得られたものである。
特別な一実施態様では、単離された中枢神経系前駆細胞株は、COL3A1（コラーゲンIII型α1）の発現を特徴とする。この遺伝子は、線維芽細胞で通常は活性だが、神経細胞では活性でない。COL3A1の発現は、本発明の方法に従って線維芽細胞を再プログラムすることによって得られる細胞でも観察される。
細胞がPBMCの再プログラミングによって得られる別の特別な一実施態様では、単離された中枢神経系前駆細胞株は、神経細胞で発現しないPBMC特異的遺伝塩発現を特徴とする。
特別な一実施態様では、本発明の単離された中枢神経系前駆細胞株は、本発明の方法によって生成される。
特別な実施態様では、本発明の単離された中枢神経系前駆細胞株は、（誘導）神経ボーダー幹細胞と比較して（ia）FGFR3、HES5、ASCL1、CLDN5、ZIC3の下方調節と、（ib）PAX6、SOX1、SOX2、CD133/2、ネスチンの発現維持を特徴とし、および／または（ii）成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特に項1〜20のいずれか1項に記載の直接的再プログラミング法においてその成熟ヒト細胞から得られたものであることを特徴とする。
次の1つの側面では、本発明は、本発明の中枢神経系前駆細胞株を分化させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、その中枢神経系前駆細胞株からの細胞を分化因子の存在下で培養する工程を含んでいる。
特別な一実施態様では、細胞は、本発明の方法を7週間実施した後、bFGF、EGF、LIFを補足した増殖培地の中で培養することによって得られる。
本発明のインビトロの方法の特別な実施態様では、得られる細胞集団は、SSEA1、CD133、グルタミン酸アスパラギン酸輸送体（GLAST；SLC1A3）に関して陽性である。
次の1つの側面では、本発明は、放射状グリア型幹細胞表現型を持つ単離された細胞集団に関するものであり、特にこの細胞集団は、成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特に本発明の直接的再プログラミング法においてその成熟ヒト細胞から得られたものである。
特別な一実施態様では、単離された細胞集団は、（i）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）で覆ったプレートにNBSCまたはcNPCを播種した後、1μMのプルモルファミンと10 ng/mlのFGF8を補足した基本培地の中で1週間培養する工程と；（ii）基本培地の中で1μMのプルモルファミンとともにさらに1日間培養する工程と；（iii）10 ng/mlのBDNFと10 ng/mlのGDNFを含有する基本培地の中で培養物をさらに7週間増殖させる工程と；（iv）基本培地と、20 ng/mlのbFGFと、20 ng/mlのEGFと、10 ng/mlのLIFからなる放射状グリア培地の中で細胞を培養する工程を含む方法によって得られる。
特別な実施態様では、単離された細胞集団は、細胞が（ia）SSEA1、CD133、GLASTに関して三重陽性であり、（ib）グリアマーカーであるビメンチン、GFAP、GLASTを強く発現し、（ic）幹細胞マーカーであるPAX6、ネスチン、SOX1、BLBPに関して陽性であることを特徴とし、および／または（ii）この細胞集団が成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特に本発明の直接的再プログラミング法において成熟ヒト細胞から得られたものである。
特別な一実施態様では、放射状グリア型幹細胞表現型を有する単離された細胞集団は、COL3A1（コラーゲンIII型α1）の発現を特徴とする。この遺伝子は、線維芽細胞で通常は活性だが、神経細胞では活性でない。COL3A1の発現は、本発明の方法に従って線維芽細胞を再プログラムすることによって得られる細胞でも観察される。
細胞がPBMCの再プログラミングによって得られる別の特別な一実施態様では、放射状グリア型幹細胞表現型を有する単離された細胞集団は、神経細胞で発現しないPBMC特異的遺伝塩発現を特徴とする。
特別な一実施態様では、（誘導）神経ボーダー幹細胞を分化させて神経堤系列の細胞にする。
特別な一実施態様では、（誘導）神経ボーダー幹細胞を、GSK阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；BMP4の存在下で培養する。
特別な実施態様では、上記の方法は、P75+/CD133neg細胞の増加を特徴とする。
特別な実施態様では、上記の方法は、神経堤関連遺伝子（特にSOX10とAP2a）のためのmRNAの富化を特徴とする。
次の1つの側面では、本発明は、神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株に関するものであり、特にこの細胞株は、成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特に本発明の直接的再プログラミング法において成熟ヒト細胞から得られたものである。
特別な一実施態様では、神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株は、本発明のインビトロの方法によって生成される。
特別な一実施態様では、神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株は、COL3A1（コラーゲンIII型α1）の発現を特徴とする。この遺伝子は、線維芽細胞で通常は活性だが、神経細胞では活性でない。COL3A1の発現は、本発明の方法に従って線維芽細胞を再プログラムすることによって得られる細胞でも観察される。
細胞がPBMCの再プログラミングによって得られる別の特別な一実施態様では、神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株は、神経細胞で発現しないPBMC特異的遺伝塩発現を特徴とする。
次の1つの側面では、本発明は、神経堤前駆細胞を生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（誘導）神経ボーダー幹細胞を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；BMP4の存在下で3日間培養する工程と；その後、GSK-3阻害剤（特にChir99021）、FGF8、IGF1、DAPTの存在下で培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、単離された神経堤前駆細胞に関するものであり、特にこの細胞は、成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特に本発明の直接的再プログラミング法において成熟ヒト細胞から得られたものである。
特別な一実施態様では、単離された神経堤前駆細胞は、本発明のインビトロの方法によって生成される。
特別な実施態様では、本発明の単離された神経堤前駆細胞は、それぞれの場合に（誘導）神経ボーダー幹細胞と比較して（ia）移動性堤マーカーP75とHNK1が誘導され；（ib）CD133とSSEA1のレベルが低下し；（ic）SOX10が存在し；（id）PAX6が不在であることを特徴とし、および／または（ii）成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特に本発明の直接的再プログラミング法において成熟ヒト細胞から得られたものである。
特別な一実施態様では、本発明の神経堤前駆細胞は、それぞれの場合に（誘導）神経ボーダー幹細胞と比較して、KANK4、BGN、TFAP2A、SOX10が、上方調節されている最上位の遺伝子であり、神経前駆細胞マーカー（特にHES5とPAX6）が下方調節されている。
特別な一実施態様では、単離された神経堤前駆細胞は、COL3A1（コラーゲンIII型α1）の発現を特徴とする。この遺伝子は、線維芽細胞で通常は活性だが、神経細胞では活性でない。COL3A1の発現は、本発明の方法に従って線維芽細胞を再プログラムすることによって得られる細胞でも観察される。
細胞がPBMCの再プログラミングによって得られる別の特別な一実施態様では、単離された神経堤前駆細胞は、神経細胞で発現しないPBMC特異的遺伝塩発現を特徴とする。
次の1つの側面では、本発明は、神経堤前駆細胞株を分化させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、神経堤前駆細胞株を分化因子の存在下で培養する工程を含んでいる。
特別な一実施態様では、細胞の取得は、（i）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）で覆ったプレートにiNBSCを1×105/6ウエルで播種した後、4μMのChir99021、5μMのAlk5阻害剤II、10 ng/mlのBMP4を補足した基本培地の中で3日間増殖させ；（ii）その細胞を、4μMのChir99021、10 ng/mlのFGF8、10 ng/mlのIGF1、1μMのDAPTを補足した基本培地の中で5日間増殖させ；（iii）SSEA-1negCD133negP75+HNK1+に関する細胞ソーティングによってNCSC様細胞を精製する工程を含む方法を実施することによってなされ、特にすべての培養物を37℃、5％CO2、20％O2で増殖させる。
特別な実施態様では、得られる細胞集団は、図2fに示した第1のマーカー群（KANK4、ANKRD38、BGN、DLX1、TRH、TFAP2B、CHN2、TRIL、RBP1、CUEDC1、ETS1、RELN、MIR1974、PHACTR3、SCG2、TFAP2A、SCRN1、ACSF2、LYPD1、SOX10、RARA、MAFB、SNORD3A、SNORD3D、BCAR3、ZNF533、IGSF3、CDH6、HBE1）、特にHNK1、P75、DLX1、ETS1、TFAP2a、TFAP2b、SOX10に関して陽性であり、図2fに示した第2のマーカー群、特にCD133、SSEA1、HES5、PAX6に関して陰性である。
次の1つの側面では、本発明は、神経ボーダー幹細胞表現型を有する単離された細胞集団（前の段落に記載されているマーカーを参照されたい）に関するものであり、特に成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特に本発明の直接的再プログラミング法における成熟ヒト細胞から得られたものである。
特別な一実施態様では、単離された細胞集団は、本発明の方法によって得られる。
特別な実施態様では、単離された細胞集団は、それぞれの場合に（誘導）神経ボーダー幹細胞と比較して（i）移動性堤マーカーP75とHNK1が誘導され；（ii）CD133とSSEA1のレベルが低下し；（iii）SOX10が存在し；（iv）PAX6が不在であることを特徴とする。
特別な一実施態様では、単離された細胞集団は、それぞれの場合に（誘導）神経ボーダー幹細胞と比較して、KANK4、BGN、TFAP2A、SOX10が、上方調節されている最上位の遺伝子であり、神経前駆細胞マーカー（特にHES5とPAX6）が下方調節されていることをさらに特徴とする。
特別な一実施態様では、神経ボーダー幹細胞表現型を有する単離された細胞集団は、COL3A1（コラーゲンIII型α1）の発現を特徴とする。この遺伝子は、線維芽細胞で通常は活性だが、神経細胞では活性でない。COL3A1の発現は、本発明の方法に従って線維芽細胞を再プログラムすることによって得られる細胞でも観察される。
細胞がPBMCの再プログラミングによって得られる別の特別な一実施態様では、神経ボーダー幹細胞表現型を有する単離された細胞集団は、神経細胞で発現しないPBMC特異的遺伝塩発現を特徴とする。
次の1つの側面では、本発明は、ドーパミン作動性ニューロンを生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と；（ii）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）の上で、FGF8とヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を補足した培地に変更する工程と；（iii）（ii）に従う培地の中で細胞を7日間培養する工程と；（iv）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を補足した培地に変更する工程と；（v）（iv）に従う培地の中で細胞を2日間培養する工程と；（vi）その培地を成熟培地に変更する工程と；（vii）その成熟培地の中で細胞を5週間培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、運動ニューロンを生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と；（ii）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を補足した培地に変更する工程と；（iii）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）の上にある（ii）に従う培地の中で細胞を2日間培養する工程と；（iv）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）と全トランスレチノイン酸を補足した培地に変更する工程と；（v）（iv）に従う培地の中で細胞を7日間培養する工程と；（vi）その培地を成熟培地に変更する工程と；（vii）その成熟培地の中で細胞を5週間培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、グルタミン酸作動性ニューロンとGABA作動性ニューロンを生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と；（ii）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を補足した培地に変更する工程と；（iii）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）の上にある（ii）に従う培地の中で細胞を7日間培養する工程と；（iv）その培地を、BDNFとGDNFを含む成熟培地に変更する工程と；（v）その成熟培地の中で細胞を5週間培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、セロトニン作動性ニューロンを生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）で覆ったプレートの上にあって、3μMのChir99021、Alk5阻害剤（特に3μMのSB431542）、ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特に1μMのプルモルファミン）を含む基本培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を1週間培養する工程と；次いで（ii）3μMのChir99021、Alk5阻害剤（特に3μMのSB431542）、ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特に1μMのプルモルファミン）、10 ng/mlのFGF4の中でさらに1週間培養する工程と；次いで（iii）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特に1μMのプルモルファミン）に2日間切り換える工程と；その後（iv）基本培地と、500μM のdbcAMP（Sigma社）と、1 ng/mlのTGFβ3と、10 ng/mlのBDNFと、10 ng/mlのGDNFを含むニューロン成熟培地の中で細胞を少なくともさらに5週間増殖させる工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、アストロサイトを生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と；（ii）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を補足した培地に変更する工程と；（iii）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）の上にある（ii）に従う培地の中で細胞を7日間培養する工程と；（iv）その培地を、BDNF、GDNF、1％FCSを含む成熟培地に変更する工程と；（v）その成熟培地の中で細胞を5週間培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、オリゴデンドロサイトを生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と；（ii）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を補足した培地に変更する工程と；（iii）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）の上にある（ii）に従う培地の中で細胞を7日間培養する工程と；（iv）その培地を、T3、IGF、フォルスコリン、PDGF、EGFを含む成熟培地に変更する工程と；（v）（iv）に従う培地の中で細胞を2週間培養する工程と；（vi）培地を、T3、IGF、フォルスコリン、PDGF、ドルソモルフィンを含む成熟培地に変更する工程と；（vii）（vi）に従う培地の中で細胞を1週間培養する工程と；（viii）培地を、T3、IGF、フォルスコリンを含む培地に変更する工程と；（ix）（viii）に従う培地の中で細胞を3週間培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、神経堤由来のニューロンを生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と；（ii）GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；BMP4を補足した培地に変更する工程と；（iii）（ii）に従う培地の中で細胞を3日間培養する工程と；（iv）その培地を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；FGF阻害剤（特にSU5402）；Notch阻害剤（特にDAPT）；NGFを含む培地に変更する工程と；（v）（iv）に従う培地の中で細胞を10日間培養する工程と；（vi）その培地を、BDNF、GDNF、NGFを含む培地に変更する工程と；（vii）（vi）に従う培地の中で細胞を3週間培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、間葉系幹細胞表現型を有する細胞を生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と；（ii）GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；BMP4を補足した培地に変更する工程と；（iii）（ii）に従う培地の中で細胞を3日間培養する工程と；（iv）その培地を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）、FGF8、IGF、Notch阻害剤（特にDAPT）を含む培地に変更する工程と；（v）（iv）に従う培地の中で細胞を7日間培養する工程と；（vi）その培地を、bFGFとIGFを含む成熟培地に変更する工程と；（vii）細胞を（vi）に従う成熟培地の中で2週間培養する工程と；（viii）その培地を間葉系幹細胞培地に変更する工程と；（ix）その間葉系幹細胞培地の中で培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、間葉系幹細胞表現型を有する細胞を生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）で覆ったプレートにiNBSCを播種する工程と；（ii）その細胞を、4μMのChir99021、10 ng/mlのBMP4、10μMのDAPTの中で7日間培養する工程と；（iii）その細胞を、10 ng/mlのbFGFと10 ng/mlのIGF-1を含有する基本培地の中で少なくとも5継代にわたって培養する工程と；（iv）その培地を間葉系幹細胞培地に切り換えることによって細胞を安定させ、少なくとも2継代にわたって培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、間葉系幹細胞表現型を有する細胞を分化させて脂肪細胞にするインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）本発明のインビトロの方法によって間葉系幹細胞表現型を有する細胞を生成させる工程と；（ii）培地を、10％FCSを含む間葉系誘導培地に変更する工程と；（iii）（ii）に従う培地の中で細胞を5日間培養する工程と；（iv）その培地を、脂肪生成分化培地に変更する工程と；（v）（iv）に従う培地の中で細胞を培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、間葉系幹細胞表現型を有する細胞を分化させて軟骨細胞にするインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）本発明のインビトロの方法によって間葉系幹細胞表現型を有する細胞を生成させる工程と；（ii）培地を、10％FCSを含む間葉系誘導培地に変更する工程と；（iii）（ii）に従う培地の中で細胞を5日間培養する工程と；（iv）その培地を軟骨細胞分化培地に変更する工程と；（v）（iv）に従う培地の中で細胞を培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、間葉系幹細胞表現型を有する細胞を分化させて平滑筋細胞にするインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）本発明のインビトロの方法によって間葉系幹細胞表現型を有する細胞を生成させる工程と；（ii）培地を、10％FCSを含む間葉系誘導培地に変更する工程と；（iii）（ii）に従う培地の中で細胞を3〜5週間培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、神経管様3D培養物を生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と；（ii）工程（i）に従って培養した細胞の単一細胞懸濁液をエンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）の中に包埋した後、SBとヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地を添加する工程と；（iii）（ii）に従う単一細胞懸濁液を9日間培養する工程と；（iv）その培地を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）、SB、ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）、bFGFを含む培地に変更する工程と；（v）4日間培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、神経堤様3D培養物を生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と；（ii）工程（i）に従って培養した細胞の単一細胞懸濁液をエンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）の中に包埋した後、GSK-3阻害剤（特にChir99021）、Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）、BMP4、FGF2を含む培地を添加する工程と；（iii）12日間培養する工程を含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、変異表現型を示す細胞を生成させるインビトロの方法に関するものであり、この方法は、（i）本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、本発明の中枢神経系系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、本発明の単離された中枢神経系前駆細胞株からの細胞、本発明の放射状グリア型幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、本発明の神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、本発明の単離された神経堤前駆細胞株からの細胞、本発明の神経ボーダー幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、本発明の方法によって生成する細胞のうちのいずれかの細胞の遺伝子配列の変化、および／または遺伝子配列の転写または翻訳の変化、および／または遺伝子配列によってコードされるタンパク質の変化を引き起こすか可能にする工程を含んでいる。
特別な一実施態様では、遺伝子編集を利用することによって、特にCRISPR Cas9を媒介としたノックアウトを利用することによって工程（i）を実施する。
特別な一実施態様では、遺伝子サイレンシングを利用することによって、特にDNAザイム、アンチセンスDNA、siRNA、shRNAのいずれかを利用することによって工程（i）を実施する。
特別な一実施態様では、タンパク質阻害剤を利用することによって、特にタンパク質に対する抗体を利用することによって工程（i）を実施する。
次の1つの側面では、本発明は、薬をスクリーニングするインビトロの方法に関するものであり、この方法は、本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、本発明の中枢神経系系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、本発明の単離された中枢神経系前駆細胞株からの細胞、本発明の放射状グリア型幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、本発明の神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、本発明の単離された神経堤前駆細胞株からの細胞、本発明の神経ボーダー幹細胞表現型を有する単離された細胞集団のいずれかからの細胞、本発明の方法によって生成する細胞、本発明の方法に従って得られて変異表現型を示す細胞のうちのいずれかの細胞を薬物質に曝露する工程を含んでいる。
特別な一実施態様では、インビトロの方法は、薬物質との相互作用の影響を受ける可能性のある1つ以上の因子を明らかにすることをさらに含んでいる。
次の1つの側面では、本発明は、本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、本発明の中枢神経系系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、本発明の単離された中枢神経系前駆細胞株からの細胞、本発明の放射状グリア型幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、本発明の神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、本発明の単離された神経堤前駆細胞株からの細胞、本発明の神経ボーダー幹細胞表現型を有する単離された細胞集団のいずれかからの細胞、本発明の方法によって生成する細胞、本発明の方法に従って得られて変異表現型を示す細胞のうちのいずれかの細胞を含む医薬組成物に関する。
次の1つの側面では、本発明は、神経障害を患っている患者の治療に用いるための、本発明の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、または本発明の中枢神経系系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、または本発明の単離された中枢神経系前駆細胞株からの細胞、または本発明の放射状グリア型幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、または本発明の神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、または本発明の単離された神経堤前駆細胞株からの細胞、または本発明の神経ボーダー幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、または本発明の方法によって生成する細胞、または本発明の方法によって得られて変異表現型を示す細胞に関する。
そこでまとめると、本発明は以下の項目に関係している。
1．（i）成熟ヒト細胞を直接再プログラミングするインビトロの方法であって、その成熟ヒト細胞を転写因子の混合物の存在下で培養する工程を含み、その混合物は、因子BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3を含んでおり、その培養を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）の存在下で実施する方法、または（ii）多能性ヒト幹細胞（特に胚性幹（ES）細胞または人工多能性幹（iPS）細胞）を直接分化させるインビトロの方法であって、その多能性ヒト幹細胞を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）の存在下で培養することを含む方法。
2．前記培養を、モノアミン-オキシダーゼの阻害剤（特にトラニルシプロミン）を追加して存在させて実施する、項1に記載のインビトロの方法。
3．モノアミン-オキシダーゼの前記阻害剤（特にトラニルシプロミン）が誘導相の間だけ存在し、特に前記培養の最初の12〜21日目の間にだけ存在し、特にADFに関しては最初の12〜21日目の間、pHSCに関しては最初の12〜16日目の間、PBMCに関しては最初の17〜21日目の間にだけ存在する、項2に記載のインビトロの方法。
4．（i）誘導神経ボーダー幹細胞を生成させるインビトロの方法であって、成熟ヒト細胞を転写因子の混合物の存在下で培養する工程を含み、その混合物は、因子BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3を含んでおり、その培養を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）の存在下で実施する方法、または（ii）神経ボーダー幹細胞を生成させるインビトロの方法であって、多能性ヒト幹細胞（特に胚性幹（ES）細胞または人工多能性幹（iPS）細胞）を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）の存在下で培養する工程を含む方法。
5．前記培養を、モノアミン-オキシダーゼの阻害剤（特にトラニルシプロミン）を追加して存在させて実施する、項4に記載のインビトロの方法。
6．モノアミン-オキシダーゼの前記阻害剤（特にトラニルシプロミン）が誘導相の間だけ存在し、特に前記培養の最初の12〜21日目の間にだけ存在し、特にADFに関しては最初の12〜21日目の間、pHSCに関しては最初の12〜16日目の間、PBMCに関しては最初の17〜21日目の間にだけ存在する、項5に記載のインビトロの方法。
7．前記成熟ヒト細胞が体細胞である、項1（i）〜6のいずれか1項に記載のインビトロの方法、または前記多能性幹細胞がiPS細胞である、項1（ii）〜6のいずれか1項に記載のインビトロの方法。
8．前記体細胞の選択が、成人線維芽細胞；膵臓由来間葉系間質細胞；末梢血細胞（特に末梢血単核細胞）からなされる、項7に記載のインビトロの方法。
9．前記培養工程を、支持フィーダー細胞の上、特にマウス線維芽細胞の上で実施する、項1〜8のいずれか1項に記載のインビトロの方法。
10．前記成熟ヒト細胞を含む培養物に前記因子BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3を形質導入する、項1（i）〜9のいずれか1項に記載のインビトロの方法。
11．前記因子BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3がベクターに含まれる、項10に記載のインビトロの方法。
12．前記ベクターがポリシストロン性ベクターである、項11に記載のインビトロの方法。
13．前記ベクターがドキシサイクリン誘導ベクターであり、特に配列ID番号1に従うベクターpHAGE2-TetOminiCV-BRN22AKlf4-IRES-Sox2E2AZic3-Wである、項10または11に記載のインビトロの方法。
14．前記培養を形質導入後の少なくとも12日間にわたって、特に12日間、または13日間、または14日間、または15日間、または16日間にわたって、ドキシサイクリンの存在下で実施する、項13に記載のインビトロの方法。
15．単一コロニーをクローンで増やす工程をさらに含む、項13または14に記載のインビトロの方法。
16．形質導入後19日目〜24日目から選択された日まで前記コロニーを増やす、項15に記載のインビトロの方法。
17．前記ベクターが、前記因子BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3をコードする核酸配列に隣接するloxP部位をさらに含んでいて、特にこのベクターが、配列ID番号2に従うベクターpHAGE2-TetOminiCV-BRN22AKlf4-IRES-Sox2E2AZic3-W-loxpである、項11〜16のいずれか1項に記載のインビトロの方法。
18．前記ベクターに含まれる前記因子BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3をコードする核酸配列がCreリコンビナーゼによって切除される、項17に記載のインビトロの方法。
19．前記Creリコンビナーゼをコードするプラスミドを前記細胞に形質導入する工程を含む、項18に記載のインビトロの方法。
20．前記CreリコンビナーゼがCherry-Creリコンビナーゼである、項19に記載のインビトロの方法。
21．BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3をコードする核酸配列。
22．BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3をコードするポリシストロン性ベクター。
23．ポリシストロン性ベクターである、項22に記載のベクター。
24．ドキシサイクリン誘導ベクターであり、特に配列ID番号1に従うベクターpHAGE2-TetOminiCV-BRN22AKlf4-IRES-Sox2E2AZic3-Wである、項22または23に記載のベクター。
25．loxP部位をさらに含んでいて、特に配列ID番号2に従うベクターpHAGE2-TetOminiCV-BRN22AKlf4-IRES-Sox2E2AZic3-W-loxpである、項22〜24のいずれか1項に記載のベクター。
26．GSK阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）から選択された少なくとも2つの構成要素、さらに特定するならば3つすべての構成要素を含むキット。
27．モノアミン-オキシダーゼの阻害剤（特にトラニルシプロミン）をさらに含む、項26に記載のキット。
28．項22〜25のいずれか1項に記載のベクター；支持フィーダー細胞（特にマウス線維芽細胞）；Creリコンビナーゼ（特にCherry-Creリコンビナーゼ）をコードするプラスミドから選択された1つ以上の構成要素をさらに含む、項26または27に記載のキット。
29．単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株。
30．（i）初期神経マーカー（特にPAX6、ASCL1、BRN2、SOX1）と；（ii）幹細胞マーカー（特にネスチン、SOX2）の両方に関して陽性であることを特徴とする、項29に記載の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株。
31．MSX1、ZIC1、PAX3を発現することをさらに特徴とする、項30に記載の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株。
32．追加してHES5、SOX3、HOXA2に関して陽性であることを特徴とする、項30または31に記載の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株。
33．項1〜20のいずれか1項に記載のインビトロの方法によって生成した、項29〜32のいずれか1項に記載の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株。
34．項33に記載の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株において、この細胞株の一塩基多型分析の結果が、前記成熟ヒト細胞の一塩基多型分析の結果とクラスターを形成する細胞株。
35．項29〜34のいずれか1項に記載の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株において、この単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株が、項1〜20のいずれか1項に記載のインビトロの方法によって生成されたものであり、この細胞株の遺伝子発現網羅的比較分析の主成分分析の結果が、（i）単離された誘導神経ボーダー幹細胞株の場合には前記成熟ヒト細胞の遺伝子発現網羅的比較分析の主成分分析の結果とクラスターを形成せず、（ii）ヒト人工多能性幹細胞の遺伝子発現網羅的比較分析の主成分分析の結果とクラスターを形成しない、単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株。
36．項29〜35のいずれか1項に記載の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株を増やすインビトロの方法であって、この単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞を培養する工程を含み、特にこの培養を、増殖を支援するサイトカイン（特にNotchシグナル伝達活性化物質、特にDLL1、DLL3、DLL4、Jagged-1、Jagged-2から選択された物質、さらに特定するならばDLL4とJagged-1から選択された物質）の存在下で実施する、インビトロの方法。
37．前記培養を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）の存在下にて、特に5％O2で実施する、項36に記載のインビトロの方法。
38．前記培養を支持フィーダー細胞（特にマウス線維芽細胞）の層の上で実施する、項36または37に記載のインビトロの方法。
39．前記培養を40継代まで実施する、項36〜38のいずれか1項に記載のインビトロの方法。
40．（誘導）神経ボーダー幹細胞（特に項29〜35のいずれか1項に記載の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株の細胞、または項36〜39のいずれか1項に記載のインビトロの方法によって得られる細胞）を分化させるインビトロの方法であって、その（誘導）神経ボーダー幹細胞を分化因子の存在下で培養する工程を含む方法。
41．前記（誘導）神経ボーダー幹細胞を分化させて中枢神経系系列の細胞にする、項40に記載のインビトロの方法。
42．前記（誘導）神経ボーダー幹細胞を、GSK阻害剤（特にChir99021）；Alk4, 5, 7阻害剤（特にSB431542）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）の存在下で、bFGFを添加して培養する、項41に記載のインビトロの方法。
43．CD133+/P75neg細胞の増加を特徴とする、項41または42に記載のインビトロの方法。
44．CNS関連遺伝子（特にPAX6）のためのmRNAの富化と、神経ボーダー関連遺伝子（特にTFAP2aとSOX10）の下方調節を特徴とする、項41〜43のいずれか1項に記載のインビトロの方法。
45．項41〜44のいずれか1項に記載の方法による分化によって（誘導）神経幹細胞株から中枢神経系プライムド神経前駆細胞株を単離するインビトロの方法。
46．中枢神経系系列の単離された中枢神経系プライムド神経前駆細胞株であって、特に（i）この細胞株が、妊娠8〜12週の胚から得ることのできる一次神経前駆細胞と同じ発生状態であり、および／または（ii）この細胞株が、前駆細胞マーカーLONRF2、ZNF217、ネスチン、SOX1、SOX2（特にLONRF2とZNF217）を特徴とし、および／または（iii）この細胞株が、成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特に項1〜20のいずれか1項に記載の直接的な再プログラミング法においてその成熟ヒト細胞から得られたものである、中枢神経系系列の単離された中枢神経系プライムド神経前駆細胞株。
47．項41〜44のいずれか1項に記載の方法によって生成される、項46の中枢神経系系列の単離された中枢神経系プライムド神経前駆細胞株。
48．CNS前駆細胞を生成させるインビトロの方法であって、場合によっては項41〜44のいずれか1項に記載の方法で（誘導）神経ボーダー幹細胞を最初に分化させた後に、（誘導）神経ボーダー幹細胞を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk4, 5, 7阻害剤（特にSB431542）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）；bFGF；LIFを含む培地の中で培養する工程を含む方法。
49．前記培養物を、エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）の上で維持する、項48に記載のインビトロの方法。
50．成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特に項1〜20のいずれか1項に記載の直接的再プログラミング法においてその成熟ヒト細胞から得られたものである、単離された中枢神経系前駆細胞株。
51．項48または49に記載の方法によって生成される、項50に記載の単離された中枢神経系前駆細胞株。
52．（誘導）神経ボーダー幹細胞と比較して（ia）FGFR3、HES5、ASCL1、CLDN5、ZIC3の下方調節と、（ib）PAX6、SOX1、SOX2、ネスチンの発現維持を特徴とし、および／または（ii）成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特に項1〜20のいずれか1項に記載の直接的再プログラミング法においてその成熟ヒト細胞から得られたものであることを特徴とする、項50または51に記載の単離された中枢神経系前駆細胞株。
53．項50〜52のいずれか1項に記載の中枢神経系前駆細胞株を分化させるインビトロの方法であって、その中枢神経系前駆細胞株からの細胞を分化因子の存在下で培養する工程を含む方法。
54．前記細胞が、項48または49に記載の方法を7週間実施した後、bFGF、EGF、LIFを補足した増殖培地の中で培養することによって得られる、項53に記載のインビトロの方法。
55．得られる細胞集団が、SSEA1、CD133、グルタミン酸アスパラギン酸輸送体（GLAST；SLC1A3）に関して陽性である、項53または54に記載のインビトロの方法。
56．成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特に項1〜20のいずれか1項に記載の直接的再プログラミング法においてその成熟ヒト細胞から得られたものである、放射状グリア型幹細胞表現型を持つ単離された細胞集団。
57．（i）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）で覆ったプレートにNBSCまたはcNPCを播種した後、1μMのプルモルファミンと10 ng/mlのFGF8を補足した基本培地の中で1週間培養する工程と；（ii）基本培地の中で1μMのプルモルファミンとともにさらに1日間培養する工程と；（iii）10 ng/mlのBDNFと10 ng/mlのGDNFを含有する基本培地の中で培養物をさらに7週間増殖させる工程と；（iv）基本培地と、20 ng/mlのbFGFと、20 ng/mlのEGFと、10 ng/mlのLIFからなる放射状グリア培地の中で細胞を培養する工程を含む方法によって得られる、項56に記載の単離された細胞集団。
58．項56または57に記載の単離された細胞集団であって、細胞が（ia）SSEA1、CD133、GLASTに関して三重陽性であり、（ib）グリアマーカーであるビメンチン、GFAP、GLASTを強く発現し、（ic）幹細胞マーカーであるPAX6、ネスチン、SOX1、BLBPに関して陽性であることを特徴とし、および／または（ii）この細胞集団が成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特に項1〜20のいずれか1項に記載の直接的再プログラミング法において成熟ヒト細胞から得られたものである、単離された細胞集団。
59．前記（誘導）神経ボーダー幹細胞を分化させて神経堤系列の細胞にする、項40に記載のインビトロの方法。
60．前記（誘導）神経ボーダー幹細胞を、GSK阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；BMP4の存在下で培養する、項59に記載のインビトロの方法。
61．P75+/CD133neg細胞の増加を特徴とする、項59または60に記載のインビトロの方法。
62．神経堤関連遺伝子（特にSOX10とAP2a）のためのmRNAの富化を特徴とする、項59〜61のいずれか1項に記載のインビトロの方法。
63．特に成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特に項1〜20のいずれか1項に記載の直接的再プログラミング法において前記成熟ヒト細胞から得られたものである、神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株。
64．項59〜62のいずれか1項に記載のインビトロの方法によって生成する、項63に記載の神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株。
65．神経堤前駆細胞を生成させるインビトロの方法であって、（誘導）神経ボーダー幹細胞を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；BMP4の存在下で3日間培養する工程と；その後、GSK-3阻害剤（特にChir99021）、FGF8、IGF1、DAPTの存在下で培養する工程を含む方法。
66．特に成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特に項1〜20のいずれか1項に記載の直接的再プログラミング法において前記成熟ヒト細胞から得られたものである、単離された神経堤前駆細胞株。
67．項65に記載のインビトロの方法によって生成する、項66に記載の単離された神経堤前駆細胞株。
68．それぞれの場合に（誘導）神経ボーダー幹細胞と比較して（ia）移動性堤マーカーP75とHNK1が誘導され；（ib）CD133とSSEA1のレベルが低下し；（ic）SOX10が存在し；（id）PAX6が不在であることを特徴とし、および／または（ii）成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特に項1〜20のいずれか1項に記載の直接的再プログラミング法において成熟ヒト細胞から得られたものである、項66または67に記載の単離された神経堤前駆細胞株。
69．それぞれの場合に（誘導）神経ボーダー幹細胞と比較して、KANK4、BGN、TFAP2A、SOX10が、上方調節されている最上位の遺伝子であり、神経前駆細胞マーカー（特にHES5とPAX6）が下方調節されている、項68に記載の単離された神経堤前駆細胞株。
70．項66〜69のいずれか1項に記載の神経堤前駆細胞株を分化させるインビトロの方法であって、神経堤前駆細胞株を分化因子の存在下で培養する工程を含む方法。
71．前記細胞の取得が、（i）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）で覆ったプレートにiNBSCを1×105/6ウエルで播種した後、4μMのChir99021、5μMのAlk5阻害剤II、10 ng/mlのBMP4を補足した基本培地の中で3日間増殖させ；（ii）その細胞を、4μMのChir99021、10 ng/mlのFGF8、10 ng/mlのIGF1、1μMのDAPTを補足した基本培地の中で5日間増殖させ；（iii）SSEA-1negCD133negP75+HNK1+に関する細胞ソーティングによってNCSC様細胞を精製する工程を含む方法を実施することによってなされ、特にすべての培養物を37℃、5％CO2、20％O2で増殖させる、項70に記載のインビトロの方法。
72．得られる細胞集団が、図2fに示した第1のマーカー群、特にHNK1、P75、SOX10に関して陽性であり、図2fに示した第2のマーカー群、特にCD133、SSEA1、HES5、PAX6に関して陰性である、項70または71に記載のインビトロの方法。
73．特に成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とし、特に項1〜20のいずれか1項に記載の直接的再プログラミング法において成熟ヒト細胞から得られたものである、神経ボーダー幹細胞表現型を有する単離された細胞集団。
74．項70〜72のいずれか1項に記載の方法によって得られる、項73に記載の単離された細胞集団。
75．それぞれの場合に（誘導）神経ボーダー幹細胞と比較して（i）移動性堤マーカーP75とHNK1が誘導され；（ii）CD133とSSEA1のレベルが低下し；（iii）SOX10が存在し；（iv）PAX6が不在であることを特徴とする、項73または74に記載の単離された細胞集団。
76．それぞれの場合に（誘導）神経ボーダー幹細胞と比較して、KANK4、BGN、TFAP2A、SOX10が、上方調節されている最上位の遺伝子であり、神経前駆細胞マーカー（特にHES5とPAX6）が下方調節されていることをさらに特徴とする、項75に記載の単離された細胞集団。
77．ドーパミン作動性ニューロンを生成させるインビトロの方法であって、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と；（ii）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）の上で、FGF8とヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を補足した培地に変更する工程と；（iii）（ii）に従う培地の中で細胞を7日間培養する工程と；（iv）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を補足した培地に変更する工程と；（v）（iv）に従う培地の中で細胞を2日間培養する工程と；（vi）その培地を成熟培地に変更する工程と；（vii）その成熟培地の中で細胞を5週間培養する工程を含む方法。
78．セロトニン作動性ニューロンを生成させるインビトロの方法であって、（i）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）で覆ったプレートの上にあって、3μMのChir99021、Alk5阻害剤（特に3μMのSB431542）、ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特に1μMのプルモルファミン）を含む基本培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を1週間培養する工程と；次いで（ii）3μMのChir99021、Alk5阻害剤（特に3μMのSB431542）、ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特に1μMのプルモルファミン）、10 ng/mlのFGF4の中でさらに1週間培養する工程と；次いで（iii）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特に1μMのプルモルファミン）に2日間切り換える工程と；その後（iv）基本培地と、500μM のdbcAMP（Sigma社）と、1 ng/mlのTGFβ3と、10 ng/mlのBDNFと、10 ng/mlのGDNFを含むニューロン成熟培地の中で細胞を少なくともさらに5週間増殖させる工程を含む方法。
79．運動ニューロンを生成させるインビトロの方法であって、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と；（ii）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を補足した培地に変更する工程と；（iii）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）の上にある（ii）に従う培地の中で細胞を2日間培養する工程と；（iv）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）と全トランスレチノイン酸を補足した培地に変更する工程と；（v）（iv）に従う培地の中で細胞を7日間培養する工程と；（vi）その培地を成熟培地に変更する工程と；（vii）その成熟培地の中で細胞を5週間培養する工程を含む方法。
80．グルタミン酸作動性ニューロンとGABA作動性ニューロンを生成させるインビトロの方法であって、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と；（ii）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を補足した培地に変更する工程と；（iii）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）の上にある（ii）に従う培地の中で細胞を7日間培養する工程と；（iv）その培地を、BDNFとGDNFを含む成熟培地に変更する工程と；（v）その成熟培地の中で細胞を5週間培養する工程を含む方法。
81．アストロサイトを生成させるインビトロの方法であって、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と；（ii）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を補足した培地に変更する工程と；（iii）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）の上にある（ii）に従う培地の中で細胞を7日間培養する工程と；（iv）その培地を、BDNF、GDNF、1％FCSを含む成熟培地に変更する工程と；（v）その成熟培地の中で細胞を5週間培養する工程を含む方法。
82．オリゴデンドロサイトを生成させるインビトロの方法であって、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と；（ii）ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を補足した培地に変更する工程と；（iii）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）の上にある（ii）に従う培地の中で細胞を7日間培養する工程と；（iv）その培地を、T3、IGF、フォルスコリン、PDGF、EGFを含む成熟培地に変更する工程と；（v）（iv）に従う培地の中で細胞を2週間培養する工程と；（vi）培地を、T3、IGF、フォルスコリン、PDGF、ドルソモルフィンを含む成熟培地に変更する工程と；（vii）（vi）に従う培地の中で細胞を1週間培養する工程と；（viii）培地を、T3、IGF、フォルスコリンを含む培地に変更する工程と；（ix）（viii）に従う培地の中で細胞を3週間培養する工程を含む方法。
83．神経堤由来のニューロンを生成させるインビトロの方法であって、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と；（ii）GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；BMP4を補足した培地に変更する工程と；（iii）（ii）に従う培地の中で細胞を3日間培養する工程と；（iv）その培地を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；FGF阻害剤（特にSU5402）；Notch阻害剤（特にDAPT）；NGFを含む培地に変更する工程と；（v）（iv）に従う培地の中で細胞を10日間培養する工程と；（vi）その培地を、BDNF、GDNF、NGFを含む培地に変更する工程と；（vii）（vi）に従う培地の中で細胞を3週間培養する工程を含む方法。
84．間葉系幹細胞表現型を有する細胞を生成させるインビトロの方法であって、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と；（ii）GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；BMP4を補足した培地に変更する工程と；（iii）（ii）に従う培地の中で細胞を3日間培養する工程と；（iv）その培地を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）、FGF8、IGF、Notch阻害剤（特にDAPT）を含む培地に変更する工程と；（v）（iv）に従う培地の中で細胞を7日間培養する工程と；（vi）その培地を、bFGFとIGFを含む成熟培地に変更する工程と；（vii）細胞を（vi）に従う成熟培地の中で2週間培養する工程と；（viii）その培地を間葉系幹細胞培地に変更する工程と；（ix）その間葉系幹細胞培地の中で培養する工程を含む方法。
85．間葉系幹細胞表現型を有する細胞を生成させるインビトロの方法であって、（i）エンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）で覆ったプレートにiNBSCを播種する工程と；（ii）その細胞を、4μMのChir99021、10 ng/mlのBMP4、10μMのDAPTの中で7日間培養する工程と；（iii）その細胞を、10 ng/mlのbFGFと10 ng/mlのIGF-1を含有する基本培地の中で少なくとも5継代にわたって培養する工程と；（iv）その培地を間葉系幹細胞培地に切り換えることによって細胞を安定させ、少なくとも2継代にわたって培養する工程を含む方法。
86．間葉系幹細胞表現型を有する細胞を分化させて脂肪細胞にするインビトロの方法であって、（i）項84または85に記載のインビトロの方法によって間葉系幹細胞表現型を有する細胞を生成させる工程と；（ii）培地を、10％FCSを含む間葉系誘導培地に変更する工程と；（iii）（ii）に従う培地の中で細胞を5日間培養する工程と；（iv）その培地を、脂肪生成分化培地に変更する工程と；（v）（iv）に従う培地の中で細胞を培養する工程を含む方法。
87．間葉系幹細胞表現型を有する細胞を分化させて軟骨細胞にするインビトロの方法であって、（i）項84または85に記載のインビトロの方法によって間葉系幹細胞表現型を有する細胞を生成させる工程と；（ii）培地を、10％FCSを含む間葉系誘導培地に変更する工程と；（iii）（ii）に従う培地の中で細胞を5日間培養する工程と；（iv）その培地を軟骨細胞分化培地に変更する工程と；（v）（iv）に従う培地の中で細胞を培養する工程を含む方法。
88．間葉系幹細胞表現型を有する細胞を分化させて平滑筋細胞にするインビトロの方法であって、（i）項84または85に記載のインビトロの方法によって間葉系幹細胞表現型を有する細胞を生成させる工程と；（ii）培地を、10％FCSを含む間葉系誘導培地に変更する工程と；（iii）（ii）に従う培地の中で細胞を3〜5週間培養する工程を含む方法。
89．神経管様3D培養物を生成させるインビトロの方法であって、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と；（ii）工程（i）に従って培養した細胞の単一細胞懸濁液をエンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）の中に包埋した後、SBとヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地を添加する工程と；（iii）（ii）に従う単一細胞懸濁液を9日間培養する工程と；（iv）その培地を、GSK-3阻害剤（特にChir99021）、SB、ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）、bFGFを含む培地に変更する工程と；（v）4日間培養する工程を含む方法。
90．神経堤様3D培養物を生成させるインビトロの方法であって、（i）マウス線維芽細胞の上にあって、GSK-3阻害剤（特にChir99021）；Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）；ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト（特にプルモルファミン）を含む培地の中で、（誘導）神経ボーダー幹細胞を培養する工程と；（ii）工程（i）に従って培養した細胞の単一細胞懸濁液をエンゲルブレス-ホルム-スワムマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物（マトリゲル）の中に包埋した後、GSK-3阻害剤（特にChir99021）、Alk5阻害剤（特にAlk5阻害剤II）、BMP4、FGF2を含む培地を添加する工程と；（iii）12日間培養する工程を含む方法。
91．変異表現型を示す細胞を生成させるインビトロの方法であって、（i）項29〜35のいずれか1項に記載の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、項46または47に記載の中枢神経系系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、項50〜52のいずれか1項に記載の単離された中枢神経系前駆細胞株からの細胞、項56〜58のいずれか1項に記載の放射状グリア型幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、項63または64に記載の神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、項66〜69のいずれか1項に記載の単離された神経堤前駆細胞株からの細胞、項73〜76のいずれか1項に記載の神経ボーダー幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、項77〜90のいずれか1項に記載の方法によって生成する細胞のうちのいずれかの細胞の遺伝子配列の変化、および／または遺伝子配列の転写または翻訳の変化、および／または遺伝子配列によってコードされるタンパク質の変化を引き起こすか可能にする工程を含む方法。
92．遺伝子編集を利用することによって、特にCRISPR Cas9を媒介としたノックアウトを利用することによって前記工程（i）を実施する、項91に記載のインビトロの方法。
93．遺伝子サイレンシングを利用することによって、特にDNAザイム、アンチセンスDNA、siRNA、shRNAのいずれかを利用することによって前記工程（i）を実施する、項91に記載のインビトロの方法。
94．タンパク質阻害剤を利用することによって、特にタンパク質に対する抗体を利用することによって前記工程（i）を実施する、項91に記載のインビトロの方法。
95．薬をスクリーニングするインビトロの方法であって、項29〜35のいずれか1項に記載の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、項46または47に記載の中枢神経系系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、項50〜52のいずれか1項に記載の単離された中枢神経系前駆細胞株からの細胞、項56〜58のいずれか1項に記載の放射状グリア型幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、項63または64に記載の神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、項66〜69のいずれか1項に記載の単離された神経堤前駆細胞株からの細胞、項73〜76のいずれか1項に記載の神経ボーダー幹細胞表現型を有する単離された細胞集団のいずれかからの細胞、項77〜90のいずれか1項に記載の方法によって生成する細胞、項91〜94のいずれか1項に記載の方法に従って得られて変異表現型を示す細胞のうちのいずれかの細胞を薬物質に曝露する工程を含む方法。
96．前記薬物質との相互作用の影響を受ける可能性のある1つ以上の因子を明らかにすることをさらに含む、項95に記載のインビトロの方法。
97．項29〜35のいずれか1項に記載の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、項46または47に記載の中枢神経系系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、項50〜52のいずれか1項に記載の単離された中枢神経系前駆細胞株からの細胞、項56〜58のいずれか1項に記載の放射状グリア型幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、項63または64に記載の神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、項66〜69のいずれか1項に記載の単離された神経堤前駆細胞株からの細胞、項73〜76のいずれか1項に記載の神経ボーダー幹細胞表現型を有する単離された細胞集団のいずれかからの細胞、項77〜90のいずれか1項に記載の方法によって生成する細胞、項91〜94のいずれか1項に記載の方法に従って得られて変異表現型を示す細胞のうちのいずれかの細胞を含む医薬組成物。
98．神経障害を患っている患者の治療に用いるための、項29〜35のいずれか1項に記載の単離された（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、または項46または47に記載の中枢神経系系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、または項50〜52のいずれか1項に記載の単離された中枢神経系前駆細胞株からの細胞、または項56〜58のいずれか1項に記載の放射状グリア型幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、または項63または64に記載の神経堤系列の単離された分化（誘導）神経ボーダー幹細胞株からの細胞、または項66〜69のいずれか1項に記載の単離された神経堤前駆細胞株からの細胞、または項73〜76のいずれか1項に記載の神経ボーダー幹細胞表現型を有する単離された細胞集団からの細胞、または項77〜90のいずれか1項に記載の方法によって生成する細胞、または項91〜94のいずれか1項に記載の方法によって得られて変異表現型を示す細胞。
はじめに
定方向分化によって多能性iPSCからさまざまなタイプの機能的ヒト神経細胞を生成させるのは非効率的である。さらに、直接的な再プログラミングによって体細胞を神経に変換すると、典型的には増殖および／または分化の潜在力が制限されたタイプの細胞になる。われわれはここに、4つの神経転写因子（BRN2、SOX2、KLF4、ZIC3）の異所性発現によってヒト成人の線維芽細胞または末梢血細胞を再プログラミングしてこれまで同定されていない自己複製する神経ボーダー幹細胞（iNBSC）集団にすることが可能であることを報告する。ヒトiNBSCは、われわれがE8.5胚の神経褶から単離することができた対応するマウスNBSC集団と分子的特徴および機能的特徴を共有している。iNBSCは、分化すると発生段階を次々に通過して（1）CNSプライムド前駆細胞、放射状グリア型幹細胞、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、運動ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを生成させるか、（2）末梢ニューロンを含む神経堤系列を生成させることができる。われわれは、ヒト成人細胞の直接的な再プログラミングにより、ヒトとマウスで新規な胚性神経幹細胞集団を規定する増殖可能な天然かつ多能性の胚性iNBSCになることを証明する。さらに、CRISPR/Cas9を用いた編集によって変異SCN9a遺伝子を有するiNBSCを増やして感覚ニューロンへと分化させることができることの証拠を提供する。これらは、ヒト疼痛症候群を模倣する機能的特性が損なわれていないことを示す。したがってiNBSCによって患者特異的で機構に基づいた研究の新たな可能性が開かれ、その研究を、ハイスループットの薬スクリーニングまたは細胞に基づく再生医学と関係づけることが可能である。
本研究のゴールは、先行技術のこれら制約を克服することと、ヒト成人の体細胞を再プログラムすることで、広いが特定の分化潜在力を有する明確で自己複製する初期神経前駆細胞にできるかどうかを探ることであった。
結果
神経系の形成は、原腸胚形成から短時間経過した後の神経板段階から始まる。シグナル伝達経路（WNT、BMP、SHHなど）が協調し、神経になる予定の細胞を多様化させる。この細胞がもとになり、さまざまな脳領域、脊髄のほか、神経堤を発生させる（13、14、15）。われわれは、段階特異的な転写因子の過剰発現に、増殖培地による十分なシグナル伝達のきっかけの提供が組み合わされると、成人の体細胞の直接的な再プログラミングによって幹細胞の特徴（自己複製性と多能性が含まれる）を持った初期胚性神経前駆細胞にすることができる可能性があると仮定した。
ヒト成人の体細胞を再プログラムして自己複製型の初期胚性神経幹細胞にするため、ヒト成人皮膚線維芽細胞（ADF）を、初期神経段階へのアクセスを可能にするとわれわれが仮定したさまざまな転写因子（BRN2、SOX2、KLF4、MYC、TLX、ZIC3）と小分子の組み合わせで形質転換した。その目的で、神経再プログラミングを可能にする4つの因子BRN2、KLF4、SOX2、 ZIC3（BKSZ）と、4つの小分子Chir99021（GSK-3阻害剤）、Alk5阻害剤II、プルモルファミン（ヘッジホッグ／スムーズンドアゴニスト）、トラニルシプロミン（モノアミン-オキシダーゼ（MAO）とCYP2酵素（A6、C19、D6）の阻害剤）（CAPT）の組み合わせを同定した。
要するに、ADFを、BKSZを含有するポリシストロン性ドキシサイクリン（DOX）誘導ベクターで形質転換した後、CAPTの存在下で培養した。loxP部位を含有する改変バージョンも誘導し（図1a、図1b）、その後のCreを媒介とする導入遺伝子の除去を可能にした。形質導入してから14日後、コロニーの形成が観察された。DOXを除去するとコロニーは増殖を続け、初期神経マーカーPAX6とSOX1を発現した（図1b）。個々のコロニーをクローンで増やすと、形質導入してから19〜24日後に安定な株になった（図1b）。
再プログラミングプロセスの詳細な経時変化実験から、常にCAPTが存在しているときにBKSZが活性である最も短い期間が12日間であった一方で、再プログラミングの効率はDOXの適用が延長されるとさらに増加することが明らかになった（拡張データ図1a）。重要なことだが、BKSZの過剰発現と、小分子なしの増殖またはCAPTだけを用いた処理では、コロニーが形成されなかった（拡張データ図1b）。以下の結果は、BKSZを媒介とした再プログラミングに多能性中間状態が関与しないことを示唆している。第1に、導入遺伝子の誘導によってOCT4発現の有意な増加はなかった（拡張データ図1c）。第2に、ADFをBKSZで再プログラミングしてiPSCを誘導することは、多能性幹細胞培地に切り換えた後も不可能であった（データは示さず）。
次に、他のタイプの成人細胞を神経再プログラミングの供給源として使用できるかどうかを調べた。実際にわれわれは、ヒト胎児膵臓線維芽細胞（FPF）と末梢血単球細胞（PBMC）の変換に成功し、30を超える安定な神経前駆細胞株を確立した（拡張データ図1d）。以前の報告と合致するように、変換効率は元になる細胞の成熟度によって異なり、FPFで最高（0.166％）、PBMCで最低であった（0.015％）（16）（拡張データ図1e）。重要なことだが、安定な株が一旦確立されると、元になる細胞のタイプは、増殖する能力、神経マーカーが発現または分化する能力に対して明らかな影響を及ぼさなかった（拡張データ図1d、図1f、図1i）。
安定な再プログラミングの前提条件は、iPSCで示されているように、異所性発現した導入遺伝子を沈黙させて正常な分化を保証することである（17）。重要なことだが、導入遺伝子の再活性化が制御されないと、生体内で腫瘍が誘導されるリスクがある（18、19）。DOXを除去した後、ポリシストロン性導入遺伝子カセットの下方調節が1000倍超に維持された安定な神経株を確立することができた（拡張データ図1h）。Tet-On系の系に固有な漏れがクローンの分化能力または自己複製能力に及ぼす潜在的な効果を排除するため、上述のBKSZベクターのLoxP改変バージョンを用いた（図1a）。クローン株を誘導した後、Cherry-Creリコンビナーゼ（20）をコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトし、Cherry陽性に関してソーティングし、細胞をクローン密度で播種した。そうするに当たり、mRNAレベルで導入遺伝子を発現せず（拡張データ図1g）、ゲノム統合（拡張データ図1h）も示さなかったサブクローンを誘導した。これらの結果は、総合すると、誘導された神経クローンが導入遺伝子とは独立であることを示している。
ADF、FPF、PBMCから誘導された変換されたクローン性神経細胞株は、支持フィーダー層の上と、Chir99021とAlk5阻害剤IIとプルモルファミン（CAP）を含有する培地の中で、増殖潜在力を失うことなく、初期神経マーカー（PAX6、SOX1など）の高発現を維持して、40継代（7ヶ月）を超えて培養することができた（図1d、拡張データ図1i）。さらに、培養物は幹細胞マーカーであるネスチンとSOX2に関して一様に陽性であり、MSX1、ZIC1、PAX3も発現したため、変換された細胞は神経ボーダー様であることを示唆している（図1d、拡張データ図1i）。iNBSCが実際にそれぞれPBMCとADFに由来することを正式に証明するため、クローンを一塩基多型（SNP）に関して分析したところ、それぞれヒトドナーに由来することが明らかになった（データは示さない）。これらの細胞が自己複製能力を維持していて神経ボーダーマーカーを発現していることから、これらの細胞を「誘導神経ボーダー幹細胞」（iNBSC）と名づけた。
iNBSCの分子アイデンティティをより詳しく探るため、iNBSCと、iPSCと、元になる細胞（すなわちADF、PBMC）の遺伝子発現網羅的比較分析を実施した。主成分分析から、各タイプの細胞が明確にクラスター化して別々の発現クラスターになることが明らかになった（図1e、拡張データ図1j）。すべてのiNBSCクローンが接近したクラスターになった。これは、元になった細胞がiNBSCのアイデンティティに大きな影響を与えなかったことを示している。次に、NBSCをiPSCからの定方向分化を通じて得ることもできるかどうかを調べた。というのも、そうであれば、再プログラミングプロセスの間にだけ起こる人工的な状態が排除されると考えられるからである。その目的で、分化したiPSCからのクローン株における神経ボーダーマーカーの発現を分析し、その発現が、ADF由来のiNBSCおよびPBMC由来のiNBSCの発現と実際に似ていることを見いだした（拡張データ図1f、拡張データ図1k）。さらに、iPSC由来のクローンの発現プロファイルもiNBSCの発現プロファイルとクラスターになったため、多能性幹細胞からのインビトロでの分化の間にもNBSC状態を確立できるとわれわれは結論する（図1e、拡張データ図1j）。
iNBSCの発現プロファイルをADFの発現プロファイルと比較することで、細胞のアイデンティティの大きな変化を反映して発現が異なっている10917個の遺伝子（DEG）（p＜0.05）が明らかになった。iNBSCにおいて上方調節された上位200個の遺伝子の遺伝子オントロジー（GO）分析から、幹細胞関連プロセス（「神経幹細胞集団の維持」、「神経前駆細胞増殖の正の調節」など）のほか、中枢神経系（CNS）と神経堤（NC）のアイデンティティに関係するプロセス（それぞれ「脳発生」、「頭発生」など）が豊富であることが明らかになった（図1f）。iNBSCでは、その増殖特性に一致するように、「細胞周期」と「Notchシグナル伝達経路」もADFと比べて豊富になっていた（図1f）。したがって多数の神経遺伝子が、ADFと多能性幹細胞からiNBSCを分離するのに最も大きく寄与した遺伝子である（図1g）。その中には、神経幹細胞マーカーであるネスチン、PAX6、HES5のほか、神経ボーダーマーカーと神経堤マーカーであるMSX1、TPAP2a、SOX3、HOXB2などが含まれる（図1g、拡張データ図1l）。それとは対照的に、多能性マーカー（OCT4/POU5F1とNANOG）は上方調節されなかった（図1g、拡張データ図1l）。興味深いことに、大半の中胚葉マーカーと線維芽細胞マーカー（すなわちBRACHYURY/T、THY1）は強く下方調節された一方で、ADF由来のiNBSC ではCOL3A1のいくらかの残留発現が検出されたが、PBMC由来のiNBSCでは検出されなかったため、これは何らかのエピジェネティックな記憶を示している可能性がある（拡張データ図1l）。
トランスクリプトームとは対照的に、細胞のメチル化パターンはむしろ細胞のアイデンティティと運命に確実に関係しており、いくつかの細胞状態（すなわち活発な分裂や休止）とは独立である。ADFで変換された(i)NBSC とiPSC由来の(i)NBSC のDNAメチル化プロファイルをADFおよびhESCと比較することにより、3つの明確に異なるクラスターが明らかになった（図1h）。ADFで変換された(i)NBSC とiPSCが分化した(i)NBSCは近くでクラスター化したことから、メチロームのレベルでも非常に似ていることが確認される。ADFを、ADFで変換された(i)NBSC およびiPSCが分化した(i)NBSCと比較すると、メチル化が異なる9067個のプロモータ領域が得られた（FDR調整p値＜0.05）。ADFと比較したiNBSCの低メチル化プロモータ部位の遺伝子セットエンリッチメント解析から、「パターン特定」、「骨格系発生」、「ニューロン運命拘束」などの遺伝子オントロジーの用語が豊富であることが明らかになった。これらのデータは、再プログラミングによってエピジェネティックなレベルでもNBSCのアイデンティティになることと整合している（図1i）。低メチル化プロモータ部位の分析から、「形質膜接着分子を通じた細胞-細胞接着」、「カルシウム依存性細胞-細胞接着」、「自然免疫反応」、「コラーゲン線維組織化」など、線維芽細胞のアイデンティティに関係するプロセスが明らかになり（拡張データ図1m）、これらは明らかに沈黙した。これらの結果は、合わせると、ADFが再プログラミングによってiNBSCになった後にメチル化と転写の風景が大きく変化したことを示している。まとめると、われわれは、さまざまなタイプの成人ヒト細胞をiNBSCへと直接変換する戦略を提示しており、そのiNBSCは、神経ボーダーマーカーの高発現、自己複製能力の維持、神経ボーダー様表現型と合致した発現とエピゲノムの風景の獲得を特徴としている。
iNBSCは中枢神経系と神経堤の前駆細胞を生じさせる
初期原腸胚形成後神経発生の間、シグナル伝達分子（Wnt、BMP、FGF、SHHなど）が神経板の発生とパターニングを細かく調節することによって多様化をガイドして中枢神経系と神経堤にする。そこでわれわれは、iNBSCがCNS系列とNC系列に分かれる前に1つの発生段階を示すかどうかを調べた。その目的でiNBSCクローンを、（1）CNSへの分化を誘導するためChir99021、SB431542（ALK 4, 5, 7阻害剤）、プルモルファミン（CPS）の後にbFGFを追加して存在させて培養するか、（2）NC運命への分化を促進するためChir99021、Alk-5阻害剤、BMP4を含有する培地の存在下で培養した（図2a）。
CNS運命とNC運命の誘導をモニタするため、CD133とP75それぞれの発現をフローサイトメトリーによって分析した。実際、iNBSCをCABの存在下にて低密度で播種すると、CNSでプライミングされた培地と比べてP75+/CD133neg細胞が有意に増加したため、これはNCへと分化したことを示している（図2a、図2b）。それとは対照的に、CSP＋bFGF培養物はP75+細胞をわずかな割合でしか含有していなかったが、その代わりにP75+/CD133neg細胞の強力で大きな増加を示した（図2a、図2b）。興味深いことに、iNBSC株はクローン密度で播種した培養物から確立されていた（上に記載したことも参照されたい）が、iNBSCクローンは、CAP培地の中である割合のP75+/CD133neg細胞を示したため、これは、ある程度の自発的な分化が維持条件下でも起こることを示している。ソーティングされたCD133+/P75negまたはP75+/CD133negに関する定量PCRから、CNS関連遺伝子（例えばPAX6）またはNC関連遺伝子（例えばSOX10、AP2a）がそれぞれ豊富であることが確認された（図2c、拡張データ図2a）。これらのデータは、iNBSCがCNSアイデンティティまたはNCアイデンティティを持つ子孫細胞を生成させうることを示唆している。データは、iNBSCが多能性であり、CNS系列とNC系列へと拘束される前に前駆細胞状態を模倣している可能性が大きいという仮定と整合しているが、この点を正式に証明するには将来の単一細胞分析が必要になろう。
次に、系列拘束性のCNS前駆細胞またはNC前駆細胞をiNBSCの下流から誘導できるかどうかを調べた。この目的に向かってわれわれは、最初にiNBSCをNCプライミング条件で3日間培養した後、Chir99021、FGF8、IGF1、DAPTを含有するNC幹細胞（NCSC）培地の中で培養した。移動性堤マーカーP75とHNK1の強い誘導と並行して、CD133とSSEA1の発現レベルの低下が観察された（図2d、拡張データ図2b）。SSEA-1neg/CD133neg/P75+/HNK1+でソーティングされた細胞の免疫蛍光分析と定量PCR分析から、SOX10、P75、HNK1三重陽性細胞の発現が明らかになったが、PAX6は発現しなかったため、これはNCSC様アイデンティティを示している（図2e、拡張データ図2c）。さらに、iNBSCとSSEA-1neg/CD133neg/P75+/HNK1+ NCSC様細胞の発現プロファイルの比較から、移動性堤マーカーとNC幹細胞マーカー（KANK4、BGN、TFAP2A、SOX10など）が調節された上位の遺伝子であった一方で、神経前駆細胞マーカー（HES5、PAX6など）は大きく下方調節されたことが明らかになった（図2f）。NCSC様細胞とiNBSCで上方調節された発現の違いが上位であった100個の遺伝子の遺伝子オントロジー解析からこの知見が確認され、遺伝子オントロジーは生物プロセス（「神経堤分化」など）に向けられていたため、これは、iNBSCアイデンティティからNC系列へと向かうロバストな発生であることをさらに示している（拡張データ図2d）（21）。
NCでプライミングした細胞を分化させて表現型が明確なCD105+/CD44+/CD13+/ CD90+/CD146+間葉系幹細胞にすることもできた（拡張データ図2e）。MSC様細胞をiNBSCと比較した遺伝子発現プロファイルの分析から、MSCの維持と分化に関与する遺伝子（COL1A1、GREMLIN1、TAGLNなど）の上方調節が明らかになり、それはさらに、遺伝子オントロジー解析によって「細胞外マトリックス組織化」や「骨格系発生」などの生物プロセスに関係することが支持された（拡張データ図2f、2g）。これらのデータは、総合すると、NCでプライミングしたiNBSC の分化は、NC発生の生理学的諸段階を反復することと、それぞれの前駆細胞は、特定の培養条件を利用して安定化させることができることを示している。
iNBSCからCNSへの分化軸を調べ、制限されたCNS前駆細胞を単離できるかどうかを検証するため、iNBSCをCSPの中で培養した後、マトリゲル（商標）（MG）の上に維持しながらbFGFとLIF（CSPFL）を添加した（図2g）。このアプローチを利用して、非常に増殖性のあるロゼット様コロニーを含有する混合培養物を得た（図2g）。これらのコロニーを取り出すとサブクローンが確立され、CSPFLの存在下ではそのサブクローンを20継代超にわたって維持することができた。興味深いことに、神経前駆細胞（NPC）のこれらサブクローンでは、iNBSCと比べて神経ボーダーマーカーTFAP2a、PAX3、PAX7、MSX1が有意に下方調節された（図2h、図2i、拡張データ図2h）。それとは対照的に、神経幹細胞マーカーPAX6、SOX1、SOX2、ネスチンは発現したままであったが、神経ボーダーマーカーMSX1はもはや検出できなかった（図2i）。iNBSCとNPCの網羅的発現データで遺伝子セットエンリッチメント解析を実施することにより、この知見がさらに確認された。iNBSCでは「神経堤分化」、「Notchシグナル伝達」、「WNTβカテニンシグナル伝達」などのプロセスが優勢であるように見える一方で、NPCでは、「mTORC1シグナル伝達」、「上皮間葉系転移」、「IL-6シグナル伝達」が優勢である（図2J）。これは、総合すると、転写プログラムの大きな変化を明らかにするとともに、神経ボーダー様前駆細胞アイデンティティからCNS前駆細胞アイデンティティへの移行を示している。それに加え、神経幹細胞マーカーCD133と、初期神経前駆細胞マーカーCD184（CXCR4）、P75に関するFACS分析から、iNBSCとNPCの間の発現の大きな違いが明らかになった。iNBSCはCD133に関して陽性であり、P75（CD133+P75int）は中間レベルであったのに対し、NPCはP75（CD133+P75int）を有意なレベルで発現しなかった（拡張データ図2i、2j）。興味深いことに、神経多能性前駆細胞マーカーCD184はiNBSCにおいて強力かつ一様に発現したのに対し、NPCではレベルがより低く、低い発現から中程度の発現の範囲であった（拡張データ図2k）。iNBSCからNPCへの分化が可逆的であるかどうかを調べるため、NPCを（FGF2とLIFなしの）CAP培地の中のフィーダーの上に播種した。NPCはP75に関して陰性のままに留まり、CD184/CXCR4の発現レベルは低いままであった（拡張データ図2l、2m）ため、iNBSCへの逆分化の証拠を得ることはできなかった。NPCもNC系列を発生させる能力を有するかどうかを調べるため、NCプライミング条件でNPCを培養した。iNBSCとは明確に異なり、NPCは非常にわずかな割合のP75+/CD133neg細胞しか示さなかった（拡張データ図2n、2o）。これは、NPCが、CNSプライミングの強い神経前駆細胞（cNPC）であることを示している。
iNBSCとiNBSC由来cNPCの領域アイデンティティを調べるため、領域特異的転写因子の発現を分析した。iNBSCは前-後脳マーカーGBX2、IRX3、HOXA2、HOXB2を発現したのに対し、cNPCはGBX2、EN1、FGF8、PAX2を優先的に発現した（拡張データ図2p）。両方の集団で前脳マーカー（EMX1、FOXG1）の発現は検出できないかほんのわずかであり、前-中脳マーカーOTX2の発現はそれよりも多かった（拡張データ図2p）。cNPCは背-腹軸に沿って腹マーカーNKX6.1を発現したが、NKX2.2は発現しなかった一方で、背マーカー（MSX1、PAX3、PAX7など）は、iNBSCと比べてはるかに低い発現であった（補足の図2h、図2p）。総合すると、iNBSCの転写因子風景は、背側前-後脳運命とほぼ整合しているのに対し、cNPCは背側中-後脳アイデンティティを示す。
より成熟した発生段階をiNBSCから誘導できるかどうかを調べるため、CNSでプライミングしたiNBSCを7週間にわたって小分子なしで分化させた後、bFGF、EGF、LIFを補足した増殖培地に切り換えた。そうすることで、SSEA1+、CD133+、グルタミン酸-アスパラギン酸-輸送体（GLAST；SLC1A）に関して陽性である細胞の部分集団、すなわち放射状グリア様幹細胞（RG様SC）アイデンティティに関連した表現型（7、22）を取得することができた（図2k、拡張データ図2q）。SSEA1+、CD133+、GLAST+に関して三重陽性の細胞は、グリアマーカーであるビメンチン、GFAP、GLASTと、幹細胞マーカーであるPAX6、ネスチン、SOX1、BLBPの両方を強く発現した（図2l、図2m、拡張データ図2r）。
RG様幹細胞の発生段階をその親であるiNBSCと比べて研究することを目的として、最近報告された機械学習フレームワーク（CoNTExT）（23）を利用した。これは、インビトロで誘導した神経培養物をヒト脳の時空間トランスクリプトーム地図と照らし合わせるために開発された。この分析により、iNBSCからRG様SCへと明確に成熟することが明らかになった。iNBSCが胚段階と初期胎仔段階にマッピングされた一方で、われわれのRG様SCは、より後期の発生段階（初期／後期胎仔と幼児）にマッピングされた（図2n）。これは、iNBSCとその子孫細胞の発現データを組み合わせるとき、主成分分析にも反映された（図2o）。したがってiNBSC、cNPC、RG様SC、NCSCは別々にクラスター化し、NBSC状態に関して距離の増加を示した。これらのデータは、総合すると、iNBSC集団は、CNS運命またはNC運命へと方向づけることが可能な胚性神経前駆細胞のように多能性の挙動をすることを示している。注目すべきことに、各系列内で、以前に決められた発生段階に対応するより一層制限された前駆細胞を生成させて安定化させることが可能である。
iNBSCから成熟したCNS細胞とNC細胞への分化
iNBSCが成熟タイプの細胞へと分化する潜在力を調べるため、iNBSCに分化への特殊なきっかけを与えた。CNSアイデンティティを有するニューロンを誘導するため、最初に細胞の培養を、プルモルファミンの存在下にて、FGF8（ドーパミン作動性ニューロン）、全トランスレチノイン酸（ATRA）（運動ニューロン）を補足するか、追加のきっかけ（GABA作動性／グルタミン酸作動性分化）なしで、7日間実施した。その後、培地を成熟培地に切り換え、5週間後に分析した（図3a）。
iNBSCは大きな神経生成潜在力を示し、CAP培地を除去すると迅速に分化した。免疫蛍光染色とqPCR分析から、グルタミン酸作動性ニューロン（vGLUT2）、ドーパミン作動性ニューロン（FOXA2、TH、EN1）、運動ニューロン（CHAT、ISLET1）、GABA作動性ニューロン（GABA、GAD67）の存在が明らかになった（図3a、図3b；拡張データ図3a）。最近、多能性幹細胞から機能的セロトニンニューロンがインビトロで誘導されることが初めて報告された（24）。興味深いことに、改変したプロトコルを適用することでセロトニン作動性ニューロンも誘導することができ、それはTHP2とセロトニンの同時発現によって証明された。SYN1に関して陽性であるというのはシナプスが形成されたことを反映しており、これは成熟ニューロンと関係している（図3a）。分化の10週間後、ニューロンのサブタイプに加え、アストロサイトとオリゴデンドロサイトが検出されたことが、それぞれGFAP/S100βとOlig2/MBPの発現からわかる（図3a）。
インビトロで分化したiNBSC由来ニューロンのニューロン表現型を確認するため、10週齢の神経培養物で全細胞パッチ-クランプ記録を取った。こうすることで、脱分極電圧ステップに反応した活動電位の反復列が明らかになった（3つの培養物の中の12個の細胞；図3c）。さらに、パッチされたニューロンも自発的なシナプス後電流を示したため、成熟していて機能的なニューロン表現型に合致している（3つの培養物の中の7個の細胞；図3D）。
最近、3次元培養物とオルガノイド培養物が、神経発生を空間的にモデル化し、背後にある分化プロセスを反復するための貴重な系であるとして評価されている（25、26、27、28）。そこでiNBSCを単一細胞懸濁液としてマトリゲルの中に包埋し、CNSプライミング培養条件またはNCプライミング培養条件でそれぞれ増殖させた（図3e）。iNBSCを最初にSPの中で9日間培養した後、bFGFを補足したCSPに切り換えた。注目すべきことに、単独のiNBSCは3次元的な球を効率的に生成させ、そのうちのいくつかは分化プロセスの間に神経管の形態に似た中央管腔を発達させた（図3eと下記参照）。免疫蛍光分析から、3D培養物は神経前駆細胞マーカーSOX1とネスチンに関して陽性であることが明らかになった（図3e）。PAX6とSOX2の発現からさらに、CNS前駆細胞アイデンティティであることが確認された（拡張データ図3c）。それとは対照的に、包埋されたiNBSCをNCプライミング条件とbFGF（CABF）で増殖させると、球は得られなかった。その代わりにiNBSCは、間葉タイプの細胞がゆるく接着したクラスターへと分化し、そのクラスターがマトリックス全体に移動した（図3e）。3D培養物の中の細胞は、AP2aとSOX10に関して二重陽性であるか、SOX10だけを発現したため、これはNC発生の段階の違いを反映している（図3e）。NCでプライミングした3D培養物の発現分析から、PAX6とSOX1の発現が下方調節されると同時にSOX10とSOX9が誘導されることが確認された。さらに、堤関連EMTマーカーSNAILが上方調節された（拡張データ図3c）。したがってCNSプライミング条件またはNCプライミング条件で増殖させたiNBSC由来の3D培養物の表現型と遺伝子発現は、明確に分かれていた。
次に、cNPC（CSP＋bFGF）の3D培養物を調製した。興味深いことに、このアプローチによって球が成長し、神経管様構造が頻繁に形成された（中央管腔の形成が含まれる）。免疫蛍光分析からSOX1と管腔プロミニンの発現が明らかになったため、神経管様構造と類似している（図3f）。興味深いことに、NCプライミング条件で増殖させたcNPCは、iNBSCが分化する際に存在する移動性の細胞を生成させなかったため、これは、上に特徴づけたiNBSCのより制限された発生潜在力と整合している（拡張データ図3d）。
iNBSCの生体内分化潜在力を評価するため、GFPで標識したiNBSCを8日間にわたってあらかじめ分化させ、6週齢のNOD.Prkdcscid.Il2rgnull（NSG）マウスの線条体に移植した。移植の6週間後、マウスを安楽死させ、移植を受けた細胞を免疫蛍光によって検出した。GFP陽性細胞に含まれていたのは、NeuN陽性ニューロン、GFAP陽性アストロサイト、MBP陽性オリゴデンドロサイトであったため、iNBSCが3つの主要な神経系列すべてに分化する潜在力を持つことと、子孫細胞が生体内で生存することを示している（図3g、拡張データ図3e）。iNBSC由来ニューロンが生体内で成熟した機能的特性を示すことを確認するため、新鮮な脳スライスの中の移植されたニューロンの全細胞パッチ-クランプ分析を実施した。実際、GFAP陽性ニューロンは、脱分極電流を注入すると反復活動電位を示した（3匹のマウスからの6個の細胞；図3h）。ニューロンアイデンティティであることを、ビオシチンを充填したパッチされたニューロンの形態的再構成によってさらに確認した（図3i）。
iNBSCがNCタイプの細胞へと分化する潜在力を調べるため、最初にiNBSCをNC誘導培地の中で培養した後、神経成熟培地（29）または間葉系成熟培地へと切り換えた。4週間後に分化が始まり、末梢感覚ニューロンに特徴的なBRN3a/ペリフェリン/NAV1.7三重陽性ニューロンを観察することができた（図3j、拡張データ図3f）。それとは対照的に、間葉系分化培地の中でのiNBSCの分化により、平滑筋アクチン（SMA）陽性細胞、アルシアンブルー陽性軟骨形成細胞、オイルレッド陽性脂肪細胞が生成した（図3k）。われわれのデータは、総合すると、iNBSCが、インビトロと生体内の両方で機能性ニューロンに分化できること、広いニューロン分化能力を示すこと、CNSとNCのグリア細胞と間葉系細胞を生じさせうることを示している。
マウス胚からの一次神経ボーダー幹細胞の誘導
iNBSCの存在と、インビトロで多能性細胞からiNBSCを安定化させる能力は、通常の胚発生の間に「一次神経ボーダー幹細胞（pNBSC）」も出現するどうかという疑問を生む。その目的で、E7.5〜E10.5のマウス胚を単離した。視組織と非神経組織を物理的操作で取り出して酵素で消化させた後、得られた単一細胞懸濁液を支持用マウス胚性線維芽細胞の層の上に播種し、CAPの存在下で培養した（図4a、拡張データ図4a）。播種してから2〜3日後、単独のコロニーを採取することによってクローン株を確立した。注目すべきことに、すべての胚段階が多彩な神経前駆細胞を生じさせたにもかかわらず、E8.5段階の胚からだけ安定に増殖する株を確立することができたため、これは、発生過程の短い期間の間だけ、その細胞が胚の中に存在することを示している（拡張データ図4b）。神経マーカーの発現は、上記のヒトiNBSCの発現と同様であった。したがってpNBSCの中に、Sox1、Sox2、Pax6、Zfp521のほか、神経ボーダーマーカーMsx1 、Pax3が検出された（図4b、図4c、拡張データ図4c、図4d）。さらに、pNBSCは自己複製能力を維持しており、初期マーカーの発現が消えることなく40継代を超えて（4ヶ月超）培養し続けることができた（拡張データ図4e）。さらに、pNBSCは、単一細胞ソーティングをすると、E13.5段階の胚から単離して培養した一次放射状グリア幹細胞と比べて10倍も大きいクローン生成能力を示した（拡張データ図4f）（1）。興味深いことに、pNBSCは、フィーダーの不在下でヒトiNBSCよりも迅速に分化するにもかかわらず、pNBSCの培養もフィーダーに依存していた。フィーダーの不在下での迅速な分化は、NotchリガンドであるDll4とJagged1の存在下でpNBSCをMG上で培養したときに部分的に停止させることができた（拡張データ図4g）。これは、フィーダーを媒介としたNBSCニッチの維持の少なくとも一部がNotchシグナル伝達によって媒介されることを示している。
pNBSCの領域アイデンティティを調べるため、領域特異的転写因子の発現を分析した。この分析により、pNBSCは前-後脳マーカーGBX2、IRX3、HOXA2、HOXB2を発現することが明らかになった（拡張データ図4h）。ヒトiNBSCとは対照的に、中-後脳マーカーFgf8はpNBSCですでに発現していたが、Six3など前脳マーカーも検出されなかった（拡張データ図4h）。総合すると、マウスpNBSCは、ヒトiNBSCと同様の領域化を示す。これは、両者が背側中-後脳から前-後脳へのアイデンティティを共有しているという考え方に合致するシナリオである。
次に、pNBSCの分化能力を取り扱った。プルモルファミンの存在下でpNBSCの分化を誘導するとき、Plzf/Zo1二重陽性ロゼットが2日以内に形成されたため、これは、CNS前駆細胞が活性であることを示唆している（図4d）。この時点でFgf2とEgfに切り換えると、Olig2、Sox2、ネスチンに関して陽性のRG様細胞が安定に増えた（図4f）。それとは対照的に、pNBSCをChir99021とBMP4で処理するとP75の発現が誘導され、Ap2a/Sox10二重陽性NC細胞が生じた（図4e、拡張データ図4i）。これらのデータが示唆しているのは、一次マウスNBSCは、CNS、RG様幹細胞、NC子孫細胞を生成させる潜在力を持っており、したがって直接的な再プログラミングによって得られるヒトiNBSCと似た自己複製性の多能性神経前駆細胞を構成することである。
pNBSCをさらに分化させると、プルモルファミンによるCNSプライミングの後にロバストな神経分化（Tuj1）が優勢になったが、グリア子孫細胞（オリゴデンドロサイト（O4）、アストロサイト（Gfap）など）も検出された。神経培養物の中で、GAB陽性ニューロン、TH陽性ニューロン、セロトニン陽性ニューロンが同定された（図4g、拡張データ図4j）。これは、広いニューロン分化潜在力があることを示している。3週間にわたって成熟させていた神経培養物からの電気生理学的記録から、ニューロンのアイデンティティに関する機能的証拠が提供された。全細胞モードに保持したパッチ-クランプした細胞は、脱分極電位ステップに反応して活動電位の反復列を示したため、pNBSCが成熟ニューロンへと分化したことが明確にわかる（図4h）。NCプライミングによって分化させると、末梢ニューロン、平滑筋細胞、オイルレッド陽性脂肪細胞、アルシアンブルー陽性軟骨細胞を観察することができた（図4i）。最後に、pNBSCを単一細胞懸濁液としてマトリゲルの中に包埋し、その細胞をCNSプライミング培養条件またはNCプライミング培養条件にそれぞれ切り換えた（拡張データ図4k）。pNBSCをCSPの中で培養すると、小さな上皮クラスターが2日後に見えるようになり、そのうちのいくつかがその後の2日以内に神経管様構造を形成した（拡張データ図4k）。それとは対照的に、iNBSCに関して上に報告したように、CABFの中での連続培養では神経管様構造にならなかったが、その代わりにゆるく接続された間葉様細胞が生じ、マトリックス全体への移動を開始した（拡張データ図4k）。
pNBSCとその子孫細胞での遺伝子発現についてより多くの情報を得るため、遺伝子発現網羅的比較分析を実施した。その目的で、pNBSCを分化させた後、FACSでRG様SC（Ssea1+、Glast+）またはNC（P75+、Glast-、Ssea1-）に関してソーティングした。主成分分析から、pNBSCとそのRG様子孫細胞およびNC子孫細胞が別々にクラスターを形成することが明らかになった（図4j）。注目すべきことに、E13.5段階の胚から単離されたRG様SCは、pNBSCに由来するRG様SCと大きく重なっていたため、そのアイデンティティが確認された（図4j）。ヒトiNBSCからの結果と整合するように、MEFと比べたpNBSCの遺伝子オントロジー解析から、「管発生」、「神経前駆細胞増殖の調節」、「脳発生」、「頭発生」などのプロセスが著しく豊富であることがわかった（拡張データ図4l）。RG様SCまたはNCとpNBSCの比較から、RG様SCに関しては、「グリア生成」、「オリゴデンドロサイト分化」、「神経系発生」、「中枢神経系発生」などのプロセスが上方調節され、神経堤誘導体に関しては、「胚性頭蓋骨格形態発生」、「細胞移動の調節」、「組織発生」に関係するプロセスが上方調節されていることがわかった（拡張データ図4l）。pNBSCとその子孫細胞におけるGO解析によって同定された遺伝子の分析からも、そのそれぞれのアイデンティティが確認された。pNBSCは前駆細胞マーカー（Hes5、Sox1、Lin28など）の特別な上方調節を示した一方で、RG様細胞は、グリア関連マーカー（Olig 2、Omg、S100bなど）を発現した（図4k）。その一方でNC子孫細胞は、NC関連遺伝子（Dlx2とPDGFの受容体）の上方調節と、神経前駆マーカーとグリアマーカーの下方調節をそれぞれ示した（図4k）。注目すべきことに、pNBSCもその子孫細胞も、多能性関連マーカー（Nanog、Oct4、Utf1など）は発現しなかった（図4k）。
まとめると、これらの結果は、pNBSCに由来するマウス胚が、直接再プログラムされたヒトiNBSCと非常によく似ていることを示唆している。これは、維持のため、初期マーカーの発現のため、長期にわたる安定な増殖のため、CNS系列とNC系列のナイーブ子孫細胞と成熟子孫細胞を生み出すことによって初期神経発生を反復する潜在力のために同じシグナル伝達のきっかけが必要とされることに反映されている。注目すべきことに、pNBSCは、初期マウス脳器官形成の間に活性であるこれまで同定されていない神経前駆細胞集団であるとともに、増殖潜在力が維持された独自の安定な前ロゼット集団でもある。
iNBSCとマウスpNBSCの比較
ヒトiNBSCとマウスpNBSCは多くの特徴を共有しており、そのような特徴に含まれるのは、長期の自己複製能力、特定のマーカーの発現、発生潜在力である。比較をさらに分子発現風景へと拡張するため、マウスpNBSCとヒトiNBSCの網羅的遺伝子発現プロファイルを分析した。
その目的で、種間の比較を可能にするために開発された発現差一致手続き（AGDEX）（30）を適用してiNBSC対ADFとpNBSC対MEFの遺伝子発現差の類似性を評価した。この分析から、iNBSC とpNBSCの遺伝子発現差に関して0.457という正の相関が明らかになった（図5a）。共通して上方調節されている上位の遺伝子（log 2倍率変化＞1；248個の遺伝子）に関する遺伝子オントロジー解析により、「神経前駆脂肪増殖」、「神経系発生」、「頭発生」などのプロセスが上方調節された一方で、下方調節されたDEGは、「外傷治癒に対する反応」、「組織発生」、「細胞外マトリックス組織化」に関係していることが同定された（図5b、図5c）。共通して上方調節されている上位の遺伝子（log 2倍率変化＞1.75；74個の遺伝子）に関してSTRINGデータベースを用いてネットワーク分析をすることにより、pNBSCとiNBSCのコア-ネットワークが明らかになった（図5d）（31）。これは、Notchシグナル伝達経路のメンバー（HES5、DLL1、NOTCH1など）のほか、主要な神経転写因子（SOX2、ASCL1、PAX6など）を含んでいる。注目すべきことに、このネットワークは、iNBSCの再プログラミングに用いられる4つの因子のうちの2つ（POU3f2（BRN2）、SOX2）のほか、ZICファミリーのメンバーZIC2を含んでいた。
総合すると、pNBSCとiNBSCは、非常によく似た全体的発現シグネチャを示し、胚性神経前駆細胞ネットワークを共有している。これは、pNBSCが、NBSCの生理学的な胚性対応物であることを反映しているという考え方をさらに支持している。
iNBSCの遺伝子編集による、SCN9Aを媒介とした疼痛感受性症候群のモデル化
iNBSCは自己複製潜在力と大きな分化潜在力を有するため、遺伝子に基づいてヒト神経症候群をモデル化するための強力なツールである。そのことを直接証明するため、CRISPR/Cas9を媒介とした遺伝子編集を利用して、SCN9a遺伝子によってコードされる侵害受容体である電位依存性ナトリウムチャネルNav1.7を変異させた。このチャネルは末梢神経系で発現しており、SCN9aにおける機能獲得変異によって原発性肢端紅痛症と発作性疼痛障害になる一方で、機能喪失変異によって疼痛に対して先天的に非感受性になる。感覚ニューロンに由来するヒトiNBSCでの機能喪失状況をモデル化するため、特殊なガイドRNAでSCN9aを標的としてエキソン22/27を変異させると、この遺伝子の切断バージョンが得られた（図6aと拡張データ図5a）。欠失した対立遺伝子を有するSCN9-/- iNBSCサブクローンを増やした後、感覚ニューロンへと分化させた。ウエスタンブロット分析から、SCN9a-/- iNBSCに由来するニューロンにはSCN9aが不在であることが確認されたが、対照はそうでなかった（図6b、拡張データ図5b）。感覚ニューロンマーカーBRN3aとペリフェリンに関する3週齢超のニューロン培養物の染色から、SCN9aにおける変異が感覚ニューロンの分化を妨げることが除外された（図6c）。ペリフェリン/BRN3a二重陽性ニューロンは、対照とSCN9a-/-由来の培養物の間で有意差を示さなかった（拡張データ図5c）。次に、感覚ニューロンで発現していて、活性化することで炎症性疼痛を媒介するP2RX3受容体の選択的アゴニストであるα,β-メチレン-ATP（29）を用いて刺激したときのニューロンの活性を、カルシウム流測定によって評価した。予想通り、α,β-メチレン-ATPの添加によって大半の細胞で活性が同期カルシウム流に伴って大きく増加した（図6d）。それとは対照的に、SCN9-/-培養物が示す同期カルシウム流の活性と欠乏はより少なかった（図6d、図6e）。α,β-メチレン-ATPがP2RX3受容体によって媒介されることを確認するため、α,β-メチレン-ATPによって誘導されるカルシウム流の測定を選択的P2RX3アンタゴニストA-317491の存在下で実施したところ、予想通り、ニューロンの活性は対照と比べて有意に低下した（図6d、図6e）。まとめると、データは、疼痛が媒介するシグナル伝達にSCN9Aが必要であることを示しており、より重要なこととして、ヒトiNBSCには、ヒトで遺伝子によって起こる神経疾患の文脈において、将来のモデル化または遺伝子救済のほか、関連する機能的スクリーニングで使用される大きな潜在力があることを示している。
考察
本明細書では、ヒトの皮膚線維芽細胞と血液細胞から多能性クローンiNBSCへの直接変換を証明する。したがってこのiNBSCはこれまで同定されていない神経前駆細胞であり、自己複製能力とCNS系列およびNC系列への分化能力が保持されている。われわれは、ヒトiNBSCがE8.5段階の杯性神経褶に由来するタイプのマウス神経前駆細胞を模倣していることの証拠を提供する。さまざまなヒト細胞とマウス細胞の両方が、似た発現プロファイルのほか、分化と増殖の潜在力を共有している。したがってNBSCは新規な真正の胚性多能性自己複製性前駆細胞であり、それは、成人の体細胞の直接的再プログラミングによって誘導すること、または一次胚性脳組織から単離して取得することができる（図6f）。
われわれと、他の研究者が、マウス胚性線維芽細胞を神経前駆細胞に直接変換することを以前に報告している（32、33、11）。それとは対照的に、ヒト体細胞を再プログラムして神経前駆細胞にする試みは報告されているが、典型的には、不均質で発生学的にタイプが特定されない細胞になった（34、35、36）。この現象に関して考えられる理由には、（1）クローン細胞株の分析が欠けていたため機能と細胞が不均質になること、または（2）変換するため多能性因子を使用して関連する多能性マーカーを永続的に発現させたこと、または（3）詳細な系列分析がなされなかったことが含まれる。最後に、これらの研究では、変換された細胞が天然の胚性脳細胞のタイプと同等であることが示されないままになっている。
これらの課題を克服するため、化学的に明確な無血清培地と一群の小分子を用いて特定の転写因子セット（BKSZ）を過剰発現させることにより、iNBSCを誘導した。このiNBSCは導入遺伝子とは独立であり、維持されている自己複製能力、大きなクローン生成能力、神経ボーダー様発現シグネチャを示す。以前の報告とは異なり、われわれは、iNBSCの下流の多彩なCNS系列とNC系列の前駆細胞（cNPC、RG様SC、NCSC、MSC様細胞など）の安定化と特徴づけを明らかにする。さらに、iNBSCは、CNSとNCの成熟子孫細胞への分化が可能であり、3Dマトリックスに包埋されたときには初期神経発生を反復することもできる。したがってiNBSCは、明確な分子的特徴と機能的特徴を持つ神経前駆細胞である。
ヒト多能性幹細胞から神経前駆細胞を分化させて安定化させるのに、直接的な変換以外にさまざまな試みが存在する。注目すべきなのは、多能性幹細胞から出発して定方向分化によってNBSCを生成させることも可能なことである。SHHと、NotchリガンドであるJagged-1、Dll4との組み合わせによってロゼット型NSC（R-NSC）（すなわちCNS子孫細胞とNC子孫細胞を生じさせることのできる初期前駆細胞）が安定化することが報告されている（37）。しかしR-NSC状態は一過性であり、長期培養によって不均質な集団になる。より最近になり、小分子の使用により、増やすことのできるNPCを安定化させるという新たな可能性が開かれている。Chir99028、SB431542、LIFの組み合わせが、大きなニューロン生成潜在力を保持していて培地の中での増殖が維持される初期中-後脳前駆体を安定化させることが報告されている（4）。これらの前駆体は、本明細書で特徴づけるiNBSC由来のcNPCと同様に多CNS系列に寄与するが、NC系列の細胞を生じさせる潜在力は非常に小さい。Reinhardtとその共同研究者は、マトリックスで覆ったプレート上でChir99028とプルモルファミンの存在下にて維持できるCNS分化能力とNC分化能力を有する神経前駆細胞を記載している（6）。これら前駆細胞は、iNBSCと機能的特性がいくらか重複するが、明確に異なる分子シグネチャと培養条件を示す（データは示さない）。
これらの報告とそれ以外の報告を考慮すると、(i)NBSCは、非常に広い分化能力を有するこれまで同定されていない自己複製性神経前駆細胞である。しかし関連文献では、「神経前駆細胞」という用語は、発生段階、出所となる領域、増殖能力が異なる多彩な集団をあいまいに記述するのに用いられてきた（37、3、4、6）。したがって対応する生体内の細胞種と分子および機能を比較することが、特に異所性再プログラミングによる細胞の場合には、適切な特徴づけのための重要な一歩となる。
われわれの研究において(i)NBSCを天然の胚性神経前駆細胞と直接比較することで、再プログラムされた細胞の性質が明確になり、再プログラミングが発生と直接結び付く。pNBSCは胚性神経組織から安定化させることができるため、NBSCのアイデンティティが、多能性細胞の定方向分化、または転写因子を媒介とした再プログラミングを通じてだけアクセスすることのできる人工的な状態を反映している可能性が除外される。注目すべきなのは、pNBSCが、これまでに報告されたマウスの神経発生における最も可塑性のある神経前駆細胞の1つであると同時に、維持された増殖潜在力を示すことである。pNBSCは発生過程の短い期間（E8.5）に発生するため、胚性脳の中に一過性にだけ存在する前駆細胞である可能性がある。将来は、単一細胞技術を利用して、胚性脳発生の間に起こる一連の異なる一過性前駆細胞段階を解明すると興味深いであろう。
発生潜在力、全体的遺伝子発現、コア調節ネットワークに関してマウス一次NBSCとヒトiNBSCの間に大きな類似性があるというのは、この発生状態がさまざまな種の間で保存されていることを示している。他の種（特に霊長類）におけるNBSCのさらなる研究が、これら初期神経前駆細胞の保存されている特徴と種特異的特徴に光を当てるとともに、ヒト神経発生へのさらなる見通しを与える助けになろうであろう。
(i)NBSCは、クローン生成能力、増殖性、多能性が大きく、健康であれ病気であれ任意の個人に由来するものが可能である。これらの特徴が、(i)NBSCを、遺伝子編集アプローチのための理想的な細胞集団にしている。本明細書に例示してあるように、CRISPR/Cas9を媒介としたSCN9aにおける機能喪失変異が、感覚ニューロンを、炎症性疼痛に関与するP2RX3アゴニストであるα,β-メチレン-ATPに対して非感受性にする。インビトロでの病理生理学的反応は、痛みに対して先天的に非感受性であるためニューロパチー性疼痛を除いていかなる様式の痛みも感じない患者でのSCN9aの機能欠如を模倣している（38）。したがってiNBSCは、CRISPR/Cas9遺伝子編集と組み合わせることで、神経疾患の背後にある遺伝子欠陥をモデル化および／または修復するための理想的なツールとなる。
総合すると、(i)NBSCとそれに由来する前駆細胞は、さまざまな体細胞から生成させることができるため、明確で拡張性のある神経前駆細胞を取得するための代替アプローチを提供する。この戦略は、多能性でがんになりやすいiPSCの生成を回避するだけでなく、iPSCから神経前駆細胞への非効率な分化工程を飛ばしてもいる。さらに、iNBSCは、ゲノム編集と組み合わせて使用されるとき、神経発生の研究と、本研究で例示されているように、疾患関連表現型を有するタイプの成熟細胞の研究の両方にとって有用なツールとなる。したがって(i)NBSCは、神経疾患（例えばパーキンソン病、運動失調、神経障害性疾患）の背後にある遺伝子欠陥のモデル化および／または修復にとって貴重であることが判明する可能性があるため、最終的には再生医療のための新たな選択肢を提供することになろう。
方法：
実施例1：ウイルス産生と、誘導神経ボーダー幹細胞への再プログラミング
レンチウイルス粒子を産生させるため、別の箇所に記載されている（40）ようにして、pHAGE2-TetO-BKSZ-floxまたはm2RTTA（39、Addgeneプラスミド#20342）をコードするプラスミドをヘルパープラスミドpsPAX2（Addgeneプラスミド#12260）およびpMD2.G（Addgeneプラスミド#12259）とともに293FT細胞株（Life technologies社）にトランスフェクトした。
BKSZ-floxを含有するレンチウイルス上清とm2RTTAを含有するレンチウイルス上清を2：1の比で混合し、5μg/mlのポリブレン（Sigma社）を補足し、新鮮な状態で、8×105/6ウエルの一次ADFと膵臓線維芽細胞に形質導入するのに使用した。PBMCの再プログラミングのため、レンチウイルス上清を超遠心分離によって濃縮し、PBMCへの形質導入を、50μg/mlのアスコルビン酸（Sigma社）と、50 ng/mlのSCF（R&D Systems社）と、10 ng/mlのIL-3（R&D Systems社）と、2 U/mlのEPO（R&D Systems社）と、40 ng/mlのIGF-1（Peprotech社）と、1μMのデキサメタゾン（Sigma社）と、5μg/mlのポリブレンを含有するQBSF-60幹細胞培地（Quality Biological社）の中で実施した（詳細に関しては41を参照されたい）。翌日、形質導入された2×105個のPBMCを6ウエルのプレートの1つのウエルに移し、不活化したMEFで覆い、再プログラミングを1日後に開始した。
再プログラミングのため、形質導入された細胞を、64μg/mlのL-アスコルビン酸2-リン酸（LAAP、Sigma社）と、ITS-X（1：100、Life Technologies社）と、NEAA（1：100、Life Technologies社）と、2％FCSと、8％血清代替物（Life Technologies社）を含有していて4μMのChir99021（Sigma社）、5μMのAlk5阻害剤II（Enzolifesciences社）、0.5μMのプルモルファミン（Sigma社）、5μMのトラニルシプロミン（Sigma社）、1μg/mlのドキシサイクリン（Sigma社）を補足したDMEM/F-12 Glutamax (Life Technologies社）の中で培養し、5％O2と5％CO2の中で37℃にてインキュベートした。再プログラミングの間、培地を2日ごとに交換した。最初のコロニーが見えるようになったとき、または遅くとも19日後に、培地をNBSC維持培地に変更した。NBSC維持培地は、（iNBSCのための）DMEM/F-12 Glutamaxまたは（pNBSCのための）Adv. DMEM/F12 Glutamaxと、64μg/mlのLAAP、N2 Supplement（1：100、Life Technologies社）、RAなしのB27 (1：50、Life Technologies社）、18μg/mlのAlbumax I（Life Technologies社）、 Glutamax（1：200、Life Technologies社）を含有する神経基礎培地（1：1）に加え、4μMのChir99028と、5μMのAlk5阻害剤IIと、0.5μMのプルモルファミンで構成されている。
明確なコロニーが見えるようになると手作業で取り出し、5％O2と5％CO2の中で37℃にて、不活化マウス胚性線維芽細胞（フィーダー）の上にあるNBSC維持培地の中で培養した。確立されたiNBSC株を分析する前に、マイコプラズマ、リスザルレトロウイルス、エプスタイン-バーウイルスの汚染に関して調べた。iNBSC株をAccutase（Life Technologies社）で処理してから4〜5日後に常法に従って分割し、新鮮なフィーダーの上に移した。
実施例2：BSKZフロックスの欠失
導入遺伝子カセットを切除するため、以前に報告されている（42）ようにして5×105個のiNBSCを新鮮なフィーダーの上に播種し、Cherry-Creをコードするプラスミドをトランスフェクトした。48時間後、細胞を回収し、Cherry蛍光を探すソーティングを実施した。フィーダーで覆った10 cmの皿の上に5000個のCherry陽性細胞を播種し、コロニーが見えるようになるまでインキュベートした。単独のコロニーを採取し、ゲノムDNAに関する導入遺伝子特異的PCRによって導入遺伝子の除去をチェックした。
実施例3：ヒトPBMCとADFの誘導
PBMCは健康な男性ドナー（年齢24〜30歳）に由来するものであり、Ficoll勾配法を利用して単離した。PBMCは、直接使用するか、以前に報告されているように90％血清代替物／10％DMSOの中で凍結させて使用した（詳細は41を参照されたい）。
Meyer他、2015年（43）に記載されているように、成人皮膚線維芽細胞は、健康な男性ドナー（年齢24〜30歳）の皮膚生検に由来するものであった。ADFは、4継代まで増やし、90％血清代替物／10％DMSOの中で凍結させた後に使用した。
すべての培養物を5％CO2と20％O2の中で37℃にて増殖させた。
細胞は、全ドナーからインフォームドコンセントを得たものであり、ハイデルベルク大学の倫理委員会IIの承認番号2009-350N-MAに従って取り扱った。
ヒト胎児膵臓線維芽細胞の培養
ヒト一次膵臓線維芽細胞をVitro Biopharma社から取得し、10％FCSを補足したMSC-Gro（商標）培地（Vitro Biopharma社）の中で培養した。細胞は、4継代にわたって増やした後に使用した。細胞は、5％CO2と20％O2の中で37℃にて増殖させた。
実施例4：ヒトiPSCの培養とNBSCへの分化
ヒトiPSCを、フィーダー細胞の上にあるDMEM/F12、64μg/mlのLAAP、1×NEAA、15％血清代替物、20 ng/mlのbFGFの中で常法に従って増殖させた。ヒトiPSCは、NBSCへと分化させる前に、マトリゲル（商標）で覆ったプレートの上にあって20 ngmlのbFGFと1 ng/mlのTGFβ1を補足した基本培地の中で1継代培養した。
細胞が集密状態に到達すると、1 mg/mlのコラゲナーゼII（Life Technologies社）で処理することによってiPSCを回収し、細胞クランプを、NBSC維持培地を含有する被覆されていないペトリ皿に移した。この時点で培地を20％O2から5％O2へと切り換えた後、この条件下で増殖させた。5日後、球をフィーダー細胞の上に載せ、NBSC維持培地の中で増殖させた。翌日、接着した球をAccutaseで処理することによって分割し、3×104個の細胞を、フィーダーを含有する10 cmの皿の上に播種した。単独のコロニーを手作業で採取し、クローン株を確立した。
実施例5：iNBSCの分化
実施例5.1：cNPCへの分化
マトリゲル（商標）で覆ったプレート（1：36、増殖因子が減らされている、BD Biosciences社）の上にNBSCを播種することによってcNPCへの分化を開始させ、NBSC維持培地から、4μMのChir99028と、3μMのSB431542（Sigma社）と、0.5μMのプルモルファミンを含む基本培地へと切り換えた。5日後、10 ng/mlのbFGF（Peprotech社）と10 ng/mlのLIFを培地（Peprotech社）（CSPFL）に添加した。
CSPFLの中で1継代させた後、マトリゲルで覆ったプレートの上に5000個の細胞/6ウエルを播種し、単独のコロニーを手作業で採取した。cNPCサブクローンは、CSPFLの中のMGで覆ったプレート上で30継代を超えて（3ヶ月超）維持することができ、Accutase を用いて処理することにより3日後に常法に従って分割した。すべての培養物を37℃、5％CO2、5％O2にてインキュベートした。
実施例5.2：RG様細胞への分化
マトリゲル（商標）で覆ったプレートの上にNBSCを播種し、1μMのプルモルファミンと10 ng/mlのFGF8を補足した基本培地の中で1週間培養した後、1μMのプルモルファミンを含む基本培地の中でさらに追加して1日間培養した。その後、培養物を、10 mg/mlのBDNFと10 mg/mlのGDNFを含有する基本培地の中でさらに7週間増殖させた。その後、細胞を、基本培地と、20 ng/mlのbFGFと、20 ng/mlのEGFと、10 ng/mlのLIFからなる放射状グリア培地の中で培養した。RG様細胞は増殖すると見えるようになったため、培養物をAccutaseで処理し、マトリゲルで覆ったプレートの上にある放射状グリア培地の中で増やした。最後に、CD133/2、SSEA1、GLASTに関する細胞ソーティングによって培養物のRG様細胞を富化した。すべての培養物を37℃、5％CO2、20％O2にて増殖させた。
実施例5.3：NCSC様細胞への分化
堤への分化を開始させるため、マトリゲルで覆ったプレートの上に1×105個/6ウエルのiNBSCを播種し、4μMのChir99028と、5μMのAlk5阻害剤IIと、10 ng/mlのBMP4（CAB）（Peprotech社）を補足した基本培地の中で3日間増殖させた。その後、培地を、4μMのChir99028と、10 ng/mlのFGF8（Peprotech社）と、10 ng/mlのIGF1（Peprotech社）と、1μMのDAPT（Sigma社）を補足した基本培地に切り換えた。5日後、NCSC様細胞をSSEA-1negCD133negP75+HNK1+に関する細胞ソーティングによって精製した。すべての培養物を37℃、5％CO2、20％O2にて増殖させた。
実施例5.4：MSC様細胞と神経堤子孫細胞への分化
間葉系堤細胞を誘導するため、マトリゲルで覆ったプレートの上にiNBSCを最初に播種し、4μMのChir99028と、10 ng/mlのBMP4と、10μMのDAPTを補足した基本培地の中で7日間増殖させた。その後、細胞を、10 ng/mlのbFGFと10 ng/mlのIGF-1を含有する基本培地の中で5継代を超えて培養した。その後、培地を間葉系幹細胞培地（Gibco社）に切り換えることによってMSC様細胞を安定化させた。MSC様細胞を2継代超にわたって培養した後に分析した。
成熟間葉系堤細胞を誘導するため、NCでプライミングした培養物を、DMEM/F12と、64μg/mlのLAAPと、10％FCSを含有する間葉系誘導培地の中で5日間処理した。その後、細胞を、StemPro（登録商標）脂肪生成分化キット（Life Technologies社）またはStemPro（登録商標）軟骨細胞分化キット(Life Technologies社）の中で培養するか、間葉系誘導培地の中に維持し、脂肪細胞、軟骨細胞、平滑筋をそれぞれ生成させた。
感覚ニューロンを誘導するため、iNBSCを、3μMのChir99028、10μMのDAPT（Sigma社）、10μMのSU5402（Sigma社）の存在下にて、マトリゲルで覆ったプレートの上にある基本培地の中で増殖させた。その後、培養物を、基本培地と、10 ng/mlのBDNFと、10 ng/mlのGDNFと、10 ng/mlのNT-3（Peprotech社）と、25 ng/mlのNGF（Peprotech社）を含む成熟培地の中で少なくともさらに3週間増殖させた（44）。
実施例5.5：成熟CNS子孫細胞への分化
ニューロンへの分化を誘導するため、マトリゲルで覆ったプレートの上にiNBSCを播種し、iNBSC維持培地を、1μMのプルモルファミン（不定方向分化）、1μMのプルモルファミン、および10 ng/mlのFGF8（ドーパミン作動性ニューロンへの分化）を含有する神経誘導培地、または1μMのプルモルファミンと1μMの全トランスレチノイン酸（Sigma社）（運動神経への分化）を含有する神経誘導培地に1週間切り換えた。iNBSCを、基本培地、3μMのChir99028、3μMのSB431542、1μMのプルモルファミンの中で1週間培養した後、3μMのChir99028、3μMのSB431542、1μMのプルモルファミン、10 ng/mlのFGF4の中でさらに1週間培養し、最後に1μMのプルモルファミンに2日間切り換えることによってセロトニン作動性ニューロンへの分化を開始させた。
神経誘導の後、培養物を、基本培地と、500μMのdbcAMP（Sigma社）と、1 ng/mlのTGFβ3と、10 ng/mlのBDNFと、10 ng/mlのGDNFを含むニューロン成熟培地の中で少なくともさらに5週間増殖させた。5週間にわたって分化させた後からアストロサイトとオリゴデンドロサイトをニューロン培養物の中に見いだすことができた。
実施例5.6：iNBSCの3D分化
iNBSCとcNPCを三次元培養物として分化させるため、2×104個の単一細胞懸濁液を10μlの基本培地の中に再懸濁させ、氷の上で150μlのマトリゲルと混合した。次に、この混合物の30μlの液滴をカバーガラスの上に分配し、37℃で10分間インキュベートした。ゲル化の後、包埋された細胞に分化培地を適用した。
CNSプライミングによる分化のため、最初に、包埋されたiNBSC培養物を、3μMのSB431542と1μMのプルモルファミンを補足した基本培地で9日間処理した。その後、培養物を、3μMのChir99028と、3μMのSB431542と、1μMのプルモルファミンと、20 ng/mlのbFGFを補足した基本培地に切り換え、4〜6日間培養した。包埋されたcNPCはCNSプライミングの必要がなく、3μMのChir99028と、3μMのSB431542と、1μMのプルモルファミンと、20 ng/mlのbFGFを補足した基本培地の中で直接培養した。
神経堤でプライミングする分化に関しては、包埋されたiNBSC培養物を、4μMのChir99028と、5μMのAlk5阻害剤と、10 ng/mlのBMP4と、20 ng/mlのbFGFを補足した基本培地の中で少なくとも12日間培養した。
培養物は、4％パラホルムアルデヒドで固定して共焦点顕微鏡で分析するか、ARCTURUS PicoPure RNA単離キットを用いて全RNAを抽出した。
実施例６：マウスでの生体内実験
マウス：
本研究を通じて6〜12週齢のマウスを使用した。異なる妊娠段階の胚はトマト-マウスに由来するものであった（Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo）。雌のNOD.Prkdcscid.Il2rgnull（NSG）マウスへの移植を実施した。すべてのマウスを、DKFZ（ドイツがん研究センター）において、特定の病原体がない（SPF）条件のもとで個別換気ケージ（IVC）の中に維持した。サンプルサイズを推定するのに統計学の方法を利用せず、マウス実験は無作為化も盲検化もしなかった。
動物の手続きは、ドイツ国の当局Regierungsprasidium Karlsruheによって承認されているプロトコル（Nr.Z110/02、DKFZ 299、G184-13）に従って実施した。
移植
移植の前に、MGで覆ったプレート上にあって1μMのプルモルファミンと10 ng/mlのFGF8を補足した基本培地の中で8日間培養することにより、iNBSCの分化を開始させた。移植の当日、プライミングした培養物を解離させて単一細胞懸濁液にし、培地の中に1μl当たり細胞5×104個の密度で再懸濁させた。6週齢の雌のNSGマウスをイソフランで麻酔し、定位装置の中に取り付け、手術中はイソフラン麻酔下に維持した。3μlの神経細胞懸濁液をガラス製マイクロピペットで線条体の中に両側から輸液した。移植では以下の座標を使用した：ブレグマと脳表面から前／後：0 mm；中央／側面±2.5；背／腹-2.5 mm。
頭蓋切開を縫合し、術後鎮痛剤を与えて回復を助けた（0.03 mg/kgのKGメタミゾール）。
処置してから8〜12週後に電気生理学的実験を実施した。
pNBSCの誘導
雄と雌のトマトマウスをつがいにし、翌日に膣栓を調べた。栓試験の陽性を性交後0.5日と見なした。胚を性交後8.5日目に回収し、視組織と非神経組織を物理的操作で取り出した。神経組織をAccutaseで消化させ、得られた単一細胞懸濁液をマウス胚性線維芽細胞の層の上に播種し、NBSC維持培地の中で5％CO2、5％O2、37℃にて培養した。播種してから2〜3日後、単独のコロニーを物理的操作で採取し、クローンpNBSC株を確立した。pNBSC株をAccutaseで処理することによって新鮮なフィーダー細胞上で3日ごとに常法に従って分割すると、40継代を超えて（4ヶ月超）培地の中に維持することができた。
pNBSCの分化
pNBSCをCNSへと分化させるため、マトリゲルで覆ったプレートの上にpNBSCを播種し、1μMのプルモルファミンを補足した基本培地の中で3日間培養した。分化の開始後2〜4日目にロゼット様SC構造を観察することができた。ロゼット様細胞の培地を、20 ng/mlのbFGFと20 ng/mlのEGFを補足した基本培地に切り換えることにより、RG様SCを安定化させた。細胞を3継代超にわたって増やした後、Ssea1+Glast+に関するFACSソーティングによってRG様SCをさらに富化した。1μMのプルモルファミンを補足した基本培地の中でpNBSCを3日間培養した後、10 ng/mlのBDNFと10 ng/mlのGDNFを含有する基本培地に3週間超にわたって切り換えることにより、成熟した子孫細胞（ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど）を誘導した。
NCSC様細胞を誘導するため、マトリゲルで覆った6ウエルのプレートの上に1×104個のpNBSCを播種し、4μMのChir99028と10 ng/mlのBMP4を補足した基本培地の中で3日間培養した。その後、細胞を、10 ng/mlのbFGF と10 ng/mlのEGFを補足した基本培地の中で4日間培養し、P75+Glast-Ssea1-を探すFACSソーティングによってNCSC様細胞を富化した。pNBSCを4μMのChir99028と10 ng/mlのBMP4の中で3日間培養した後、10 ng/mlのbFGFを2日間培地に添加し、10 ng/mlのbFGF と10 ng/mlのEGFを補足した培地にさらに3週間にわたって切り換えることにより、オイルレッド陽性脂肪細胞を取得した。pNBSCを4μMのChir99028と10 ng/mlのBMP4の中で3日間培養し、10 ng/mlのbFGFをその培地に2日間添加した後、10％FCSを補足した基本培地に切り換えることにより、軟骨細胞と平滑筋細胞を誘導した。pNBSC をChir99028と10 ng/mlのBMP4の中で3日間培養した後、10 ng/mlのBDNFと10 ng/mlのGDNFを補足した基本培地に2週間切り換えることにより、末梢ニューロンをpNBSCから分化させた。
マウス胚からの一次RGの誘導
雄と雌のトマト-マウスをつがいにし、翌日に膣栓を調べた。栓試験の陽性を性交後0.5日と見なした。胚を性交後13.5日目に回収し、内側と外側の基底核原基を物理的操作で単離した。個々の胚からの神経組織をAccutaseで処理することによって消化させた。得られた単一細胞懸濁液をペトリ皿に移し、20 ng/mlのbFGF と20 ng/mlのEGFを補足した基本培地の中で5日間培養した。得られた球を、フィブロネクチンで覆った細胞培養皿の上に載せ、少なくとも3継代にわたって増やした後、Glast+Ssea1+細胞を探すFACSソーティングを実施して下流分析に使用した。
pNBSCの3D分化
2×104個のpNBSCからなる単一細胞懸濁液を10μlの基本培地の中に再懸濁させ、氷の上で150μlのマトリゲルと混合した。次に、混合物の30μlの液滴をカバーガラスの上に分配し、37℃で10分間インキュベートした。ゲル化の後、包埋された細胞に分化培地を適用した。
CNSでプライミングする分化に関しては、神経管様構造が形成されるまで、包埋されたpNBSC培養物を、4μMのChir99028と、3μMのSB431542と、1μMのプルモルファミンを補足した基本培地で6日間処理した。
神経堤でプライミングする分化に関しては、包埋されたpNBSC培養物を、4μMのChir99028と、5μMのAlk5阻害剤と、10 ng/mlのBMP4と、20 ng/mlのbFGFを補足した基本培地の中で少なくとも10日間培養した。
電気生理学
スライスの調製
電気生理学的記録を6〜12週齢の雌マウスで実施した。線条体を含有する急性冠状スライス（300μm）から記録した。
マウスにイソフランを吸入させて深い麻酔をかけた後、212 mMのスクロースと、26 mMのNaHCO3と、1.25 mMのNaH2PO4と、3 mMのKClと、7 mMのMgCl2と、10 mMのグルコースと、0.2 mMのCaCl2を含有する約30 mlの氷冷スクロース溶液をカルボゲンガス（95％O2／5％CO2、pH 7.4）で酸素化したものを用いて経心灌流を実施した。氷で冷やした酸素化スクロース溶液の中で切片を切り出し、12.5 mMのNaClと、2.5 mMのNaHCO3と、0.125 mMのNaH2PO4と、0.25 mMのKClと、2 mMのCaCl2と、1 mMのMgCl2と、25 mMのグルコースを含有する酸素化細胞外溶液の中でインキュベートした。線条体の中の細胞をDIC光学装置で可視化し、落射を利用してGFP蛍光を検出した。
全細胞記録
浴の温度を30〜32℃にして全細胞パッチ-クランプ記録を実施した。直立顕微鏡（Olympus社BW-X51）に取り付けた水没記録チェンバーの中に個々のスライスまたはカバーガラスを配置し、酸素化細胞外溶液を灌流させた。記録ピペットをホウケイ酸ガラスキャピラリーから引っ張ると、先端の抵抗は5〜8MΩであった。液間電位差は補正しなかった。直列抵抗をできるだけ補償し、記録中は連続してモニタした。「ギガシール」が最初に得られなかった場合、または直列抵抗が20％を超えて変化するか40MΩよりも大きかった場合には、細胞を廃棄した。
以下の細胞内溶液を使用した：発火パターンのための低Cl-カリウム系溶液で、130 mMのグルコン酸カリウムと、10 mMのグルコン酸ナトリウムと、10 mMのへペスと、10 mMのホスホクレアチンと、4 mMのNaClと、4 mMのMg-ATPと、0.3 mMのGTPを含有していてKOHでpH を7.2に調節したもの。細胞培養物の中の自発活動のための高Cl-溶液で、127.5 mMのKClと、11 mMのEGTAと、10 mMのへペスと、1 mMのCaCl2と、2 mMのMgCl2と、2 mMのMg-ATPを含有するもの（pH 7.3）。移植されたニューロンの中の自発活動のためのCs+系溶液で、120 mMのグルコン酸Cs+と、10 mMのCsClと、10 mMのへペスと、0.2 mMのEGTAと、8 mMのNaClと、10 mMのホスホクレアチンと、2 mMのMg-ATPと、0.3 mMのGTPを含有していて、CsOHでpHを7.3に調節したもの。
パッチされた細胞に関するその後の形態的特徴づけと免疫細胞化学的特徴づけのため、ビオシチン（約10 mg/ml；Sigma社）をそれぞれの細胞内溶液に添加した。
細胞を最初はセルアタッチモードに維持した。「ギガシール」を達成した後、全細胞配置を確立し、電流クランプモードにおいて1秒間の電流パルスを印加することによって静止膜電位で発火パターンを分析した。そのとき、培養物については-30 pAから開始して5 pAのステップで最大発火頻度に到達するまで、急性スライスについては-200 pAから開始して20 pAのステップで電流パルスを印加した。（中間的興奮タイプの細胞については）活動電位閾値で-30 pA/-200 pAの電流を注入したときの個々の軌跡を、発火パターンを図解するために選択した。
保持電位-70 mVでニューロンの自発活動を記録した。
すべての記録は、HEKA PatchMaster EPC 10増幅器を用いて実現し、信号は3 kHzでフィルタリングし、10kHzまたは20 kHzでサンプリングした。データ分析は、HEKAソフトウエアFitMasterとClampfit（Molecular Devices社、アメリカ合衆国）を利用してオフラインで実施した。
細胞の同定と再構成
MECの中のビオシチン充填細胞を含む急性スライスを4％パラホルムアルデヒドの中で一晩固定した後、PBSで徹底的に洗浄した。
形態再構成のため、ビオシチン充填MEC細胞を3,3'-ジアミンベンジジン（DAB）染色によって同定した。切片を1％H2O2の中で5分間クエンチした。新たに洗浄した後、1％トリトンX-100を含むPBSの中で1時間かけて切片を透過性にした。その後、室温にてPBSの中で切片をアビジン-ビオチン-セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体とともに2時間インキュベートした。PBSの中で洗浄した後、切片をDABの中で現像し、Mowiolに取り付けた。Neurolucida (MBF bioscience社、ウィルストン、ヴァーモント州、アメリカ合衆国）を用い、標識した細胞を再構成した。
カルシウムイメージング
細胞培養物を、細胞透過性蛍光Ca2+インジケータFluo-3 AM（2μM；F1242、Thermo Scientific（商標））とCell Tracker Red CMTPX（1μM；C34552、Thermo Scientific（商標））を含む溶液の中でインキュベートし、細胞膜を明確にした。染料ローディングは、インキュベータの中で37℃、5％CO2にて30分間実施した。
20倍（1開口数）の水中対物レンズを備えたTCS SP5顕微鏡（Leica社）で、蛍光標識した細胞のイメージングを実施した。画像（512×512画素）を、xy方向では0.5μm/画素の解像度で、z方向では3〜4μmのステップで、1000 Hzの速度にて0.8〜1.6秒ごとに取得した。アルゴンレーザーとHeNe-543レーザーを用いてFluo-3 AM染料とCell Tracker Red CMTPX染料をそれぞれ励起させた。120 mMのNaClと、3.5 mMのKClと、2.5 mMのCaCl2と、1.3 mMのMgSO4と、1.25 mMのNaH2PO4と、25 mMのNaHCO3と、25 mMのグルコースを含有する人工脳脊髄液（ACSF）（pH 7.2）をポンプ灌流システムによって一定の流量（1.5 ml/分）で適用し、記録チェンバーの中のバッファーを連続的に更新した。ベースラインの蛍光を2分間記録した後、α,β-メチレンATP（ACSFの中に30μM；COMPANY）を2分間適用した。合計して10分間になるまで記録を続けた。染料ローディングを実施するとともにP2X3受容体とP2X2/3受容体の非ヌクレオチドアンタゴニスト（1μM；A-317491、COMPANY）を添加すると、それが、全細胞記録の間、ACSFの中にも存在していた。1つの群につき3〜5回の独立な実験でLeica Application Suite AFソフトウエアとFIJIソフトウエア（45）を利用して蛍光活性の記録と測定をそれぞれ実施した。
相対的な蛍光の変化（Fi/F0）を取得した。ここにF0は、配列の最初の50フレームを平均することによって形成される蛍光画像であり、F（i）は、記録の各（i）フレームを表わす。最初の50個の値と最後の50個の値を通るようにフィットさせた線形回帰線を差し引くことによって曲線を規格化し、最大ピーク強度を適用可能な各時点で揃えた（野生型測定）。
次に、野生型ニューロン培養物（n＝3）とSCN9-/-ニューロン培養物（n＝4）において、α,β-メチレンATPで刺激する前の画像全体と、その刺激に反応した画像全体での蛍光強度を平均することによって全体カルシウム活性を調べた。
Prism 6を利用して統計解析を実施した。群間の差は、スチューデントのt検定を利用して調べた。以下の分析では、p＜0.05の値を統計的に有意であると見なした。
フローサイトメトリー
細胞をAccutaseで処理することによって回収し、補足なしのDMEM/F12で2回洗浄した。その後細胞を培地の中に再懸濁させ、抗体を用いて4℃で30分間染色した。使用した抗体は以下の通りである：抗SSEA1 (MC480)-V450抗体（Becton Dickinson社）、抗CD133/2 (293C3)-FITC抗体（Miltenyi Biotec社）、抗CD271 (ME20.4-1.H4)-PE抗体（Miltenyi Biotec社）、抗CD271 (ME20.4-1.H4)-APC抗体（Miltenyi Biotec社）、抗GLAST (ACSA-1)-APC抗体（Miltenyi Biotec社）、抗HNK1 (TB01)-PeCy7抗体（eBioscience社）、マウス抗HNK1抗体（クローンVC1.1、Sigma社）、ロバ抗マウスAlexa Fluor 488抗体（Abcam, ab150105社）、抗CXCR4 (12G5)-PeCy5抗体（BioLegend社）、抗Cxcr4(L276F12)-BV421抗体（BioLegend社）、抗PSA-NCAM(クローン：2-2B)-PE抗体（Miltenyi Biotec社）、抗CD44(G44-26)-PE抗体（BD Pharmingen社）、抗CD105 (43A3)-FITC抗体（BioLegend社）、抗CD90 (5E10)-BV421抗体（BioLegend社）、抗CD146-Alexa647抗体（Biolegend社）、抗CD13 (WM15)-APCCy7抗体（BioLegend社）。FACS分析をLSRIIまたはLSR Fortessaフローサイトメータ（Becton Dickinson社、サンノゼ、カリフォルニア州）で実施した。データはFlowJoソフトウエア（Tree Star社、アッシュランド、オレゴン州）を利用して分析した。細胞ソーティング実験はBD FACSAria（商標）IIIソーター（Becton Dickinson社、サンノゼ、カリフォルニア州）で実施した。分別パラメータとして、100μmのノズル；約2000事象/秒を使用した。
免疫蛍光
4％パラホルムアルデヒドを含むPBS（Electron Microscopy Sciences社、19208）の中で細胞を15分間固定した。次に、固定した細胞をPBSで3回洗浄し、0.1％トリトンX-100と1％BSAを含有するPBSの中で1時間ブロックした。一次抗体を4℃の0.1％トリトンX-100と1％BSAに適用した。本研究で使用した一次抗体と希釈液のリストに関しては、拡張データ表1を参照されたい。細胞をPBSで3回洗浄した後、二次抗体とともに室温で2時間インキュベートした。
細胞をDAPI（Sigma社、D9542）染色した後、LSM 710 ConfoCor 3共焦点顕微鏡（Zeiss社）にマウントし（DAKO社、S3035）、分析した。
免疫組織化学分析
IHC分析のため、移植されたマウスの脳を4％パラホルムアルデヒドの中で一晩固定し、20％スクロースを含むPBSを用いて連続的に脱水した。その後、脳を3％アガロースの中に包埋し、Leica VT1000S滑走式ミクロトームを用いて100μmの冠状切片を調製した。脳のスライスを、3％ヤギ血清と0.25％トリトン-Xを含むTBSの中で4℃にて1時間ブロックした。一次抗体（拡張データ表1）を、3％ヤギ血清と0.25％トリトン-Xを含むTBSに4℃で72時間適用した。スライスをTBSの中で3回洗浄した後、二次抗体を、3％ヤギ血清と0.25％トリトン-Xを含むTBSの中で室温にて2時間インキュベートした。脳のスライスをDAPIで染色した後、LSM 710 ConfoCor 3共焦点顕微鏡（Zeiss社）にマウントして分析した。
オイルレッド染色
脂肪細胞分化物を室温にて4％パラホルムアルデヒドの中で15分間固定した。細胞をddH2Oで2回洗浄した後、60％イソプロパノールとともに5分間インキュベートし、あとで完全に乾燥させた。3.5 mg/mlのRed O（Sigma社）を含む60％イソプロパノールからなる新鮮なオイルレッド染色溶液を室温で細胞に10分間適用した。細胞をddH2Oで4回洗浄した後、顕微鏡（Nikon社、Eclipse Ti-E）の画像を取得した。
アルシアンブルー染色
軟骨細胞分化物を4％パラホルムアルデヒドの中で15分間固定した後、PBSで3回すすいだ。10 mg/mlのアルシアンブルーGX（Sigma社）を含む3％酢酸からなるアルシアンブルー溶液を1時間適用し、0.1 MのHClで2回すすいだ。細胞をPBSで2回洗浄した後、顕微鏡（Nikon社、Eclipse Ti-E）の画像を取得した。
ウエスタンブロット
野生型iNBSCとSCN9a-/- iNBSCを少なくとも3週間分化させて感覚ニューロンにした後、RIPAバッファー（Cell Signaling Technology社）と、1 mMのPMSF（Sigma社）と、1 mMのEDTAと、Halt Protease-Phosphates Inhibitor Cocktail（Pierce社）を用いて全細胞ライセートを調製した。5％SDSの中で95℃にてライセートを変性させた後、タンパク質サンプルを4〜12％TGXゲル（Criterion、Bio-Rad社）の上でTGS（トリス-グリシン-SDS）ランニングバッファー（Bio-Rad社）を用いて解像し、PVDF膜（Trans-Blot TURBO、Bio-Rad社）の上にブロットした。0.3％（vol/vol）のトゥイーン-20と5％（wt/vol）のBSA粉末を含有するTBSを用いて膜を1時間ブロックした。一次抗体（拡張データ表1）をシェイカー上で4℃にて一晩インキュベートした。徹底的に洗浄した後、0.3％のトゥイーン-20を含有するTBSの中で二次HRP結合抗体を室温で1時間インキュベートした。膜を洗浄し、ECLキット（Amersham International社）を用いて免疫複合体を可視化した。
CRISPR-Cas9を媒介としたノックアウト
ガイドRNAをDNAオリゴ（Sigma社）として注文し、別の文献（46）に記載されているようにしてpSpCas9(BB)-2A-Puroベクター（PX459）（Feng Zhang氏からAddgeneを通じて寄贈）でクローニングした。マウス神経幹細胞のためのNucleofector（商標）キット（Lonza社）を用いて0.5〜2×106個のiNBSCを0.5〜2 ngのプラスミドDNAとともにプログラムA-033でヌクレオフェクト（nucleofect）し、新鮮なフィーダー細胞の上に播種した。トランスフェクトされた培養物を48時間後に回収し、GFP蛍光に関してソーティングし、フィーダーの上に載せた。5〜7日後に個々のコロニーを手作業で単離した。QIAamp DNAミニキット（QIAGEN社）を用いてゲノムDNAを抽出し、ガイドRNA標的部位を増幅し、サンガーシークエンシング（GATC）によって分析した。CRISP-ID（47）を用いて二遺伝子座配列を復元した。
定量逆転写PCRによる遺伝子発現分析
オン-カラムDNA消化（Qiagen社、79254）を含むARCTURUS PicoPure RNA単離キット（Life Technologies社、Invitrogene社）を利用して全RNAを単離した。大容量cDNA合成キット（Applied Bioystems社）を利用して逆転写を実施した。ViiA7機械上のABI Power SYBR Green Mastermix（Applied Bioystems社）でリアルタイム定量PCRを実施した。結果は、ViiA7-ソフトウエアV1.2.4を利用して分析した。発現は、ハウスキーピング遺伝子GAPDHに規格化した。すべてのPCR反応を技術的トリプリケートとして実施した。25回超の増幅サイクルでRNAの品質が低かったサンプル、および／またはハウスキーピング遺伝子が検出されたサンプルは、研究から除外した。本研究で使用したプライマーについては拡張データ表2を参照されたい。
マイクロアレイ分析
オン-カラムDNA消化（Qiagen社、79254）を含むARCTURUS PicoPure RNA単離キット（Life Technologies社、Invitrogene社）を利用して全RNAを単離した。humanHT-12 v4 Expression BeadChip（Illumina社）またはMouse 430 V2.0 GeneChips (Affymetrix社）を利用したRNA発現プロファイリングを、製造者の指示に従ってDKFZ Genomics and Proteomics Core Facility（ハイデルベルク、ドイツ国）で実施した。
生データをDKFZ GenomicsとProteomics Core Facilityから取得し、Gene Expression Omnibusデータベースから公開されている発現データと融合させた。本研究で用いたデータセットは以下の通りである。
GSE40838
GSE40838_Patient1_repl1
GSE40838_Patient1_repl2
GSE40838_Patient2_repl1
GSE40838_Patient2_repl2
GSE40838_Patient3_repl1
GSE51980
GSE51980_FIB_y
GSE51980_ESC_H9_y
GSE51980_ESC_H9_y.1
GSE69486
GSE69486_FIB
GSE34904
GSE34904_ESC_H1_1
GSE34904_ESC_H1_2
データセット全体を分位正規化し（自己記述関数）、log 2変換した。
def quant_norm(df):

df_num = df._get_numeric_data()
df_anno = df.drop(df_num.columns, axis=1)
df_ranks = df.apply(rankdata, axis = 0)
df_ranks = df_ranks.applymap(int)
df_sorted = df.apply(np.sort, axis = 0)
means = np.mean(df_sorted, axis = 1)
output = df_ranks.applymap(lambda x: helper_function(means, x))
output_2 = pd.concat([df_anno, output], axis=1)

return output_2
主成分分析ではsklearn.decompositionからのPCA関数を使用して計算し、可視化した（seaborn）。
遺伝子発現ヒートマップは、クラスター化されたヒートマップとして可視化した（seaborn、clustermap）。PCAに基づく発現ヒートマップを作成するため、式：
を適用して寄与が最大である200個のプローブを抽出した。
2つのサンプル間で発現が異なる遺伝子を、scipy.statsパッケージからのttest_indを利用して特定し、Benjamini-Hochberg偽発見コントロール（stats、R-package）を利用してp値を相関させた。
STRING Version 10.0（48）と、EnrichR（49）と、Broad Institute GSEAソフトウエア（50）を利用して遺伝子オントロジー解析と遺伝子セットエンリッチメント解析を実施した。遺伝子セットエンリッチメント解析は、「Hallmark遺伝子セット」と、「Wikipathway2017」ライブラリからの遺伝子セットで実施した。
ヒト脳の時空アトラスを用いて神経集団をマッピングするため、iNBSC由来RG様SCとiNBSCに機械学習フレームワークCoNTExT（51）のオンラインツールを適用した。識別子ファイルと、発現データからの識別子のサブセットを用い、データを著者らが示唆しているようにしてアップロードした。
ヒトのデータとマウスのデータを比較するため、BioMart（R）からの相同性情報を用いてiNBSC/ADFとpNBSC/Mefを分析した。発現のlog 2倍率変化を相関させ、両方の比較で発現の倍率変化（p＜0.05）の絶対値が1よりも大きかった遺伝子を遺伝子オントロジーエンリッチメントに関して解析した。
メチル化分析
DNeasy Blood and Tissue Kit（Qiagen社）を製造者の指示に従って用いてゲノムDNAを抽出した。Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip アレイを用いたDNAメチル化プロファイリングを製造者の指示に従ってDKFZ Genomics and Proteomics Core Facility（ハイデルベルク、ドイツ国）で実施した。GEOリポジトリから、以下のデータセットからの参照データを取得した。
hESCとヒトADFに関する参照データは、Gene Expression Omnibusデータベースから取得した。
GSE52025:
GSM1257669: GM02704
GSM1257670: GM02706
GSM1257671: GM01650
GSM1257672: GM01653
GSE61461:
GSM1505345 B105-ES
GSM1505346 B152-ES
GSM1505347 B160-ES
GSM1505348 B209-ES
GSM1505349 B220-ES
GSM1505350 B312-ES
Bioconductorスイートからのミニパッケージ（53）を利用してすべてのメチル化データを処理した。検出のp値が0.01未満であるプローブ、または既知のSNPと一致するプローブと、X染色体とY染色体に関するすべてのプローブを除外した。preprocessIllumina関数を用いてデータセットを規格化し、古典的な多次元スケーリングを利用して可視化した。
メチル化差分析に関しては、RnBeads（54）パッケージ（Bioconductor社）を利用してプロモータのメチル化を分析した。プロモータをその総合順位統計（RnBeads）に基づいて順位を付けて最も有意な高メチル化から最も有意な低メチル化へと並べ、450kアレイによってカバーされる遺伝子に限定された遺伝子セットファイルとともにGSEAの入力として使用した。GSEAを「古典的」エンリッチメント統計（50）で走らせた。
統計分析
すべての実験で、少なくとも3つの生物学的レプリケートを使用した。定量的な結果は、GraphicPad社のPrism 6を用い、対応のない両側スチューデントのt検定によって分析した。
各群内の変動は、特に断わらない限りs.e.m.によって推定した。有意性のレベルは、* p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；**** p＜0.0001に決めた。
データの入手可能性
本研究の知見を裏づける遺伝子発現とDNAメチル化のデータはGene Expression Omnibusデータベースに寄託されており、ArrayExpressで入手することができる。
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配列リスト
べクターpHAGE2-TetOminiCV-BRN22AKlf4-IRES-Sox2E2AZic3-W（配列ID番号：1）の全配列：
tggaagggctaattcactcccaaagaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattagcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgacccggagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagtacttcaagaactgctgatatcgagcttgctacaagggactttccgctggggactttccagggaggcgtggcctgggcgggactggggagtggcgagccctcagatcctgcatataagcagctgctttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcgccgaattcacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggactagtccacaccctaactgacacactcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagctcggtacccgggtcgaggtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctgcggccgccATGGCGACCGCAGCGTCTAACCACTACAGCCTGCTCACCTCCAGCGCCTCCATCGTGCACGCCGAGCCGCCCGGCGGCATGCAGCAGGGCGCGGGGGGCTACCGCGAAGCGCAGAGCCTGGTGCAGGGCGACTACGGCGCTCTGCAGAGCAACGGACACCCGCTCAGCCACGCTCACCAGTGGATCACCGCGCTGTCCCACGGCGGCGGCGGCGGGGGCGGTGGCGGCGGCGGGGGGGGCGGGGGCGGCGGCGGGGGCGGCGGCGACGGCTCCCCGTGGTCCACCAGCCCCCTGGGCCAGCCGGACATCAAGCCCTCGGTGGTGGTGCAGCAGGGCGGCCGCGGAGACGAGCTGCACGGGCCAGGCGCCCTGCAGCAGCAGCATCAGCAGCAGCAACAGCAACAGCAGCAGCAACAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCGGCCGCCGCATCTGGTGCACCACGCCGCTAACCACCACCCGGGACCCGGGGCATGGCGGAGCGCGGCGGCTGCAGCGCACCTCCCACCCTCCATGGGAGCGTCCAACGGCGGCTTGCTCTACTCGCAGCCCAGCTTCACGGTGAACGGCATGCTGGGCGCCGGCGGGCAGCCGGCCGGTCTGCACCACCACGGCCTGCGGGACGCGCACGACGAGCCACACCATGCCGACCACCACCCGCACCCGCACTCGCACCCACACCAGCAGCCGCCGCCCCCGCCGCCCCCGCAGGGTCCGCCTGGCCACCCAGGCGCGCACCACGACCCGCACTCGGACGAGGACACGCCGACCTCGGACGACCTGGAGCAGTTCGCCAAGCAGTTCAAGCAGCGGCGGATCAAACTGGGATTTACCCAAGCGGACGTGGGGCTGGCTCTGGGCACCCTGTATGGCAACGTGTTCTCGCAGACCACCATCTGCAGGTTTGAGGCCCTGCAGCTGAGCTTCAAGAACATGTGCAAGCTGAAGCCTTTGTTGAACAAGTGGTTGGAGGAGGCGGACTCGTCCTCGGGCAGCCCCACGAGCATAGACAAGATCGCAGCGCAAGGGCGCAAGCGGAAAAAGCGGACCTCCATCGAGGTGAGCGTCAAGGGGGCTCTGGAGAGCCATTTCCTCAAATGCCCCAAGCCCTCGGCCCAGGAGATCACCTCCCTCGCGGACAGCTTACAGCTGGAGAAGGAGGTGGTGAGAGTTTGGTTTTGTAACAGGAGACAGAAAGAGAAAAGGATGACCCCTCCCGGAGGGACTCTGCCGGGCGCCGAGGATGTGTACGGGGGGAGTAGGGACACTCCACCACACCACGGGGTGCAGACGCCCGTCCAGggaagtggcgtgaaacagactttgaattttgaccttctcaagttggcgggagacgtggagtccaacccagggcccatgGCTGTCAGCGACGCTCTGCTCCcgtccttctccacgttcgcgtccggcccggcgggaagggagaagacactgcgtccagcaggtgccccgactaaccgttggcgtgaggaactctctcacatgaagcgacttcccccacttcccggccgcccctacgacctggcggcgacggtggccacagacctggagagtggcggagctggtgcagcttgcagcagtaacaacccggccctcctagcccggagggagaccgaggagttcaacgacctcctggacctagactttatcctttccaactcgctaacccaccaggaatcggtggccgccaccgtgaccacctcggcgtcagcttcatcctcgtcttccccagcgagcagcggccctgccagcgcgccctccacctgcagcttcagctatccgatccgggccgggggtgacccgggcgtggctgccagcaacacaggtggagggctcctctacagccgagaatctgcgccacctcccacggcccccttcaacctggcggacatcaatgacgtgagcccctcgggcggcttcgtggctgagctcctgcggccggagttggacccagtatacattccgccacagcagcctcagccgccaggtggcgggctgatgggcaagtttgtgctgaaggcgtctctgaccacccctggcagcgagtacagcagcccttcggtcatcagtgttagcaaaggaagcccagacggcagccaccccgtggtagtggcgccctacagcggtggcccgccgcgcatgtgccccaagattaagcaagaggcggtcccgtcctgcacggtcagccggtccctagaggcccatttgagcgctggaccccagctcagcaacggccaccggcccaacacacacgacttccccctggggcgg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ベクターpHAGE2-TetOminiCV-BRN22AKlf4-IRES-Sox2E2AZic3-W-loxp（配列ID番号2）の全配列：
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Claims (15)

  1. 成人線維芽細胞（AFC）；膵臓由来間葉系間質細胞（pMSC）；および末梢血単核細胞（PBMC）から選択された成熟ヒト細胞を直接再プログラミングするインビトロの方法であって、その成熟ヒト細胞を転写因子の混合物の存在下で培養する工程を含み、その混合物は、因子BRN2、SOX2、KLF4、およびZIC3を含んでおり、そしてその培養を、GSK-3阻害剤Chir99021；Alk5阻害剤II；およびプルモルファミンの存在下で実施する方法。
  2. （i）初期神経マーカーであるPAX6、ASCL1、BRN2、およびSOX1と；（ii）幹細胞マーカーであるネスチンおよびSOX2の両方に対して陽性であることを特徴とする、単離された誘導神経ボーダー幹細胞株。
  3. 請求項2に記載の単離された誘導神経ボーダー幹細胞株を増殖させるインビトロの方法であって、その単離された誘導神経ボーダー幹細胞株からの細胞を培養する工程を含み、特にその培養を、増殖支援サイトカインであるDLL4およびJAGGED-1の存在下で実施する方法。
  4. 誘導神経ボーダー幹細胞、特に請求項2に記載の単離された誘導神経ボーダー幹細胞株の細胞、または請求項3に記載のインビトロの方法によって得られる細胞を分化させるインビトロの方法であって、その誘導神経ボーダー幹細胞を分化因子の存在下で培養する工程を含む方法。
  5. （i）妊娠8〜12週の胚から取得可能な一次神経前駆細胞と同じ発生状態であり、（ii）前駆細胞マーカーLONRF2およびZNF217を特徴とするとともに、MSX1、PAX3、およびTFAP2に関して陰性であることを特徴とし、そして（iii）成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とする、中枢神経系系列の単離された中枢神経系プライムド神経前駆細胞株。
  6. CNS前駆細胞を生成させるインビトロの方法であって、誘導神経ボーダー幹細胞を、GSK-3阻害剤Chir99021；ALK4, 5, 7阻害剤IIプルモルファミン；bFGF；およびLIFを含む培地の中で培養する工程を含む方法。
  7. 成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とする、単離された中枢神経系前駆細胞株。
  8. 請求項7に記載の中枢神経系前駆細胞株を分化させるインビトロの方法であって、その中枢神経系前駆細胞株からの細胞を分化因子の存在下で培養する工程を含む方法。
  9. 放射状グリア型肝細胞表現型を持つ単離された細胞集団であって、前記細胞株が成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とする細胞集団。
  10. 前記誘導神経ボーダー幹細胞を神経堤系列の細胞へと分化させる、請求項4に記載のインビトロの方法。
  11. 成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とする、神経堤系列の単離された分化誘導神経ボーダー幹細胞株。
  12. 神経堤前駆細胞を生成させるインビトロの方法であって、誘導神経ボーダー幹細胞を、GSK-3阻害剤Chir99021；Alk5阻害剤II；およびBMP4の存在下で3日間培養した後、GSK-3阻害剤Chir99021；FGF8；IGF1；およびDAPTの存在下で培養する工程を含む方法。
  13. 成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とする、単離された神経堤前駆細胞株。
  14. 請求項13に記載の神経堤前駆細胞株を分化させるインビトロの方法であって、その神経堤前駆細胞株からの細胞を分化因子の存在下で培養する工程を含む方法。
  15. 成熟ヒト細胞にエピジェネティックに対応することを特徴とする、神経ボーダー幹細胞表現型を有する単離された細胞集団。
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