WO2021221050A1 - 構造物及びその製造方法、それを用いた吸着体、並びに生体粒子の精製方法 - Google Patents

構造物及びその製造方法、それを用いた吸着体、並びに生体粒子の精製方法 Download PDF

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拓馬 末岡
正克 西八條
妃佐子 八浦
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株式会社カネカ
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    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a structure, a method for producing the same, an adsorbent using the structure, and a method for purifying biological particles.
  • Bioparticles such as viruses, virus-like particles, or viral vectors are very important molecules in the medical field such as gene therapy, vaccines, diagnostics, and blood purification. In addition, its removal is extremely important for the prevention and prevention of infection and the assurance of virological safety of pharmaceutical products. In recent years, these medical fields have attracted particular attention, and in addition to the technique for efficiently removing biological particles, the method for efficiently recovering biological particles from biological samples such as cell culture medium and blood is strong. It has been demanded.
  • Affinity chromatography is a method of separating impurities between an object and other substances using a carrier in which a ligand such as an antibody that specifically binds to a target molecule is immobilized on a bead substrate. From the viewpoint of stability and production efficiency, an example of using a low molecular weight antibody as a ligand is known (Patent Document 1 and the like).
  • Non-Patent Document 1 a method using a bead carrier on which a low molecular weight antibody is immobilized
  • a commercially available product GE's Capto (registered trademark) AVB, Thermo Scientific) POROS (registered trademark) CaptureSelect (registered trademark) AAVX, etc.) are known.
  • the bead carrier is expensive and difficult to prepare, and the small pore size of the bead base material causes a problem in efficiently recovering biological particles such as viruses. ..
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems in the past and to achieve the following objects. That is, the present invention provides a structure and a method for producing the same, an adsorbent using the same, and a method for purifying bioparticles, which are inexpensive, have a high bioparticle recovery rate in the elution step, and have a low bioparticle residual rate in the washing step. The purpose is to provide. In addition, in removing biological particles, an effective method is provided as an efficient removing means for these particles.
  • a method for producing a structure which comprises a step of connecting a water-insoluble fiber and a low molecular weight antibody, which can provide a structure having a high bioparticle recovery rate and a low bioparticle residual rate in a washing step. It was found that by adopting the above, it is possible to provide a method for producing a structure, which is inexpensive, has a high bioparticle recovery rate in the elution step, and has a low bioparticle residual rate in the washing step.
  • ⁇ 1> A structure characterized by having a water-insoluble fiber and a low-molecular-weight antibody connected to the water-insoluble fiber.
  • ⁇ 2> A method for producing a structure, which comprises a step of connecting a water-insoluble fiber and a low molecular weight antibody.
  • ⁇ 3> An adsorbent characterized by having the structure according to the above ⁇ 1>.
  • ⁇ 4> A method for purifying biological particles, which comprises using the structure according to ⁇ 1> or the adsorbent according to ⁇ 3>.
  • the above-mentioned problems in the prior art can be solved, the above-mentioned object can be achieved, the structure is inexpensive, the recovery rate of bioparticles in the elution step is high, and the residual rate of bioparticles in the washing step is low. It is possible to provide a production method, an adsorbent using the same, and a method for purifying biological particles.
  • FIG. 1 is a diagram showing the correlation between the average pore size calculated by the palm poromometer and the reciprocal of the square root of the ventilation time.
  • FIG. 2 is a diagram showing a chromatogram of AAV adsorption / desorption by the carrier 7.
  • FIG. 3 is a diagram showing a chromatogram of AAV adsorption / desorption by POROS® CaptureSelect® AAVX.
  • the structure has a water-insoluble fiber, a low molecular weight antibody connected to the water-insoluble fiber, and can further have other elements. That is, in the structure, the water-insoluble fiber and the low-molecular-weight antibody may be directly connected, or the water-insoluble fiber and the low-molecular-weight antibody are connected via other elements. May be good.
  • the water-insoluble fiber can be used as a base material for the structure.
  • the lower limit of the thickness of the water-insoluble fiber is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. However, from the viewpoint of production stability, 0.08 mm or more is preferable, and 0.10 mm or more is more preferable. It is preferable, and 0.12 mm or more is more preferable.
  • the upper limit of the thickness of the water-insoluble fiber is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. However, from the viewpoint of uniformity of basis weight, 0.50 mm or less is preferable, and 0.40 mm or less is more preferable. It is preferably 0.30 mm or less, and more preferably 0.30 mm or less.
  • the lower limit of the basis weight of the water-insoluble fiber is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. However, from the viewpoint of production stability, 5 g / m 2 or more is preferable, and 10 g / m 2 or more is preferable. Is more preferable.
  • the upper limit of the texture of the water-insoluble fiber is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. However, from the viewpoint of the uniformity of the water-insoluble fiber, 100 g / m 2 or less is preferable, and 90 g / m. 2 or less is more preferable, 80 g / m 2 or less is further preferable, and 70 g / m 2 or less is particularly preferable.
  • the lower limit of the bulk density of the water-insoluble fiber is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but 50 kg / kg / because there is little change in the water-insoluble fiber structure after charging into the device. M 3 or more is preferable, 60 kg / m 3 or more is more preferable, and 70 kg / m 3 or more is further preferable.
  • the upper limit of the bulk density of the water-insoluble fiber is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. However, from the viewpoint of liquid flow performance, 400 kg / m 3 or less is preferable, and 350 kg / m 3 or less is preferable. Is more preferable, and 300 kg / m 3 or less is further preferable.
  • the bulk density refers to a value obtained by measuring the weight per 1 m 3 of the water-insoluble fiber.
  • the shape of the water-insoluble fiber is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a circle, a quadrangle, a triangle, and a bale shape.
  • the surface of the water-insoluble fiber may be modified by graft polymerization, polymer coating, chemical treatment with alkali, acid or the like, plasma treatment or the like.
  • the graft polymerization is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a graft polymerization method in which electron beam irradiation is performed.
  • the water-insoluble fiber is irradiated with an electron beam in advance to generate a radical, and then a radical-polymerizable compound is added to the water-insoluble fiber in which the generated species is generated, and then the radical-polymerizable compound is applied.
  • the so-called pre-irradiation method in which the polymerization of the graft-polymerizable compound is promoted by post-polymerization, and the radical-polymerizable compound are imparted to the water-insoluble fiber, which is then irradiated with an electron beam to generate radicals, and then post-polymerization is performed.
  • a film is laminated on the surface of the water-insoluble fiber after the radical-polymerizable compound is applied to the water-insoluble fiber until the post-polymerization is completed. Is preferable. As a result, the volatilization of the radically polymerizable compound can be prevented, the graft polymerization is uniformly started, and the deactivation of radicals due to oxygen in the air is suppressed by blocking the air.
  • the surface of the water-insoluble fiber is sealed with a film even during electron beam irradiation, and the water-insoluble fiber and the radically polymerizable compound are blocked from oxygen in the air, so that oxygen in the air Oxidation of water-insoluble fibers is less likely to occur.
  • a polymer film having a thickness of 0.01 to 0.20 mm and having an appropriate thickness is used according to the penetrating power of the electron beam to be used.
  • the material of the film is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include polyester-based films such as polyethylene terephthalate and polyolefin-based films. Among these, polyethylene terephthalate is preferable. In particular, in the case of the simultaneous irradiation method, a polyethylene terephthalate film having low efficiency of polymer radical generation by electron beam irradiation and low oxygen permeability is preferable.
  • the polyester-based means polyester and its derivatives
  • the polyolefin-based means polyolefins and their derivatives.
  • a radical (polymer radical or the like) that induces a polymerization reaction is generated by irradiating the water-insoluble fiber with an electron beam.
  • the radical generation efficiency increases when the temperature is low, but it may be a normal room temperature.
  • the irradiation conditions of the electron beam are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose, but preferably, the acceleration voltage is set to 300 ppm or less in the irradiation atmosphere. It is appropriately determined in the range of 100 to 2000 kilovolts (hereinafter abbreviated as “kV”), more preferably 120 to 300 kV, and a current of 1 to 100 mA, depending on the thickness of the water-insoluble fiber, the target graft ratio, and the like.
  • kV 2000 kilovolts
  • the irradiation dose of the electron beam may be appropriately determined in consideration of the target graft rate and the deterioration of the physical properties of the water-insoluble fiber due to the irradiation, and is usually about 10 to 300 kilogray (hereinafter abbreviated as "kGy"). It is preferably 10 to 200 kGy. If the irradiation dose is less than 10 kGy, the radicals required for a sufficient amount of graft polymerization do not occur, and if it exceeds 300 kGy, the physical properties deteriorate due to the breakage of the main chain even when the water-insoluble fiber is made of a radiation-resistant polymer material. It is not preferable because it occurs.
  • the irradiation atmosphere is preferably an inert gas atmosphere such as nitrogen gas, but an air atmosphere may also be used.
  • an air atmosphere oxygen in the air may oxidize water-insoluble fibers.
  • a radically polymerizable compound is added to the water-insoluble fiber after the electron beam irradiation.
  • the water-insoluble fiber is immersed in a tank of a radically polymerizable compound solution from which dissolved oxygen has been removed by aerating nitrogen gas, or is allowed to stay for a predetermined time by being immersed and passed through the tank of the radically polymerizable compound solution. Is sufficiently imparted with a radically polymerizable compound.
  • immersion in the present invention means that the water-insoluble fiber comes into contact with the radically polymerizable compound solution. Therefore, various coating methods can be used as a method for imparting the radically polymerizable compound to the water-insoluble fiber. Among them, an impregnated coat, a comma direct coat, a comma reverse coat, a kiss coat, a gravure coat and the like can be efficiently coated, and are therefore preferable.
  • the water-insoluble fiber to which the radically polymerizable compound is added is taken out from the solution tank. At that time, it is preferable to laminate a film on the surface of the water-insoluble fiber.
  • the water-insoluble fiber to which the radically polymerizable compound solution is applied is sandwiched between the two films and brought into close contact with each other.
  • the graft reaction is further promoted by reacting the water-insoluble fiber with the radically polymerizable compound in a space sealed by laminating the film.
  • laminate in the present invention means that the water-insoluble fiber and the film are brought into contact with each other.
  • the water-insoluble fiber taken out from the solution tank is allowed to stay in the polymerization tank after a predetermined temperature for a predetermined time to promote the graft polymerization of the radically polymerizable compound (post-polymerization).
  • the post-polymerization temperature at this time is 0 ° C. to 130 ° C., more preferably 40 ° C. to 70 ° C. This promotes the graft polymerization reaction between the water-insoluble fiber and the radically polymerizable compound. Then, by washing and drying, grafted fibers can be obtained.
  • the post-polymerization atmosphere is preferably an inert gas atmosphere such as nitrogen gas, but an air atmosphere may be used when the post-polymerization is performed with the film laminated.
  • water is allowed to stay for a predetermined time by immersing it in a tank of a radically polymerizable compound solution from which dissolved oxygen has been removed by aerating nitrogen gas, or by letting the tank pass through the bath. Sufficiently impart a radically polymerizable compound to the insoluble fiber. Then, it is taken out from the solution tank and irradiated with an electron beam. When taken out from the solution tank, it is preferable to laminate a film on the surface of the water-insoluble fiber and irradiate an electron beam in this state.
  • the acceleration voltage may be appropriately determined according to the type of polymer material, the total thickness of the water-insoluble fiber to which the radically polymerizable compound solution is applied, the laminated film, and the target graft ratio. , The acceleration voltage of about 100 to 2000 kV is appropriate.
  • the irradiation dose of the electron beam may be the same as in the case of the pretreatment method.
  • the atmosphere during electron beam irradiation is preferably an inert gas atmosphere such as nitrogen or helium, but when a film is laminated on the surface of water-insoluble fibers, the irradiation atmosphere does not affect graft polymerization, so economic efficiency is taken into consideration. Therefore, irradiation in the air is appropriate.
  • the water-insoluble fiber irradiated with the electron beam is post-polymerized with the radically polymerizable compound in the same manner as in the case of the pre-irradiation method. Then, by washing and drying, grafted fibers can be obtained.
  • the post-polymerization atmosphere is preferably an inert gas atmosphere such as nitrogen gas, but an air atmosphere may be used when the post-polymerization is performed in the state where the film is laminated.
  • the radically polymerizable compound used in the present invention is a compound that forms a bond with a polymer radical generated in a water-insoluble fiber by electron beam irradiation.
  • unsaturated compounds having acidic groups such as acrylic acid, methacrylic acid, itaconic acid, methacrylic sulfonic acid, and styrene sulfonic acid, unsaturated carboxylic acid amides such as these esters, acrylamide, and methacrylic amide, and glycidyl at the terminal.
  • Examples thereof include unsaturated compounds having groups and hydroxyl groups, unsaturated organic phosphoric acid esters such as vinyl phosphonates, basic methacrylic acid esters such as tetraammonium salt and tertiary ammonium salt, fluoroacrylates, and acrylonitrile. It is not limited to these. These can be used alone or in combination of two or more.
  • unsaturated compounds having groups and hydroxyl groups unsaturated organic phosphoric acid esters such as vinyl phosphonates, basic methacrylic acid esters such as tetraammonium salt and tertiary ammonium salt, fluoroacrylates, and acrylonitrile. It is not limited to these. These can be used alone or in combination of two or more.
  • a composite grafted fiber in which the graft chain is composed of a copolymer of at least two kinds of radically polymerizable compounds can be obtained.
  • an acrylic monomer from the viewpoint of graft ratio.
  • an acrylic monomer having a carboxy group or an epoxy group at the molecular terminal is preferable, and acrylic acid, methacrylic acid and glycidyl methacrylate are more preferable. It is at least one species selected from the group consisting of (hereinafter abbreviated as "GMA").
  • the acrylic system means acrylic and its derivatives.
  • the above radically polymerizable compound may be an organic solvent such as water or a lower alcohol, or a diluted solution using a mixed solution thereof as a solvent.
  • concentration of the radically polymerizable compound in this diluted solution varies depending on the desired graft ratio, but can be prepared in an amount of 1 to 70% by volume.
  • the formation of the homopolymer may be suppressed by adding a metal salt of copper or iron to the diluted solution of the radically polymerizable compound.
  • the lower limit of the concentration of the radically polymerizable compound in the solution is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 1% by weight or more, more preferably 2.5% by weight or more. 5% by weight or more is more preferable, and 10% by weight or more is particularly preferable.
  • the upper limit of the concentration of the radically polymerizable compound in the solution is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 70% by weight or less, more preferably 60% by weight or less, and 50% by weight or less. It is more preferably 0% by weight or less, and particularly preferably 40% by weight or less.
  • the concentration of the emulsifier in the solvent is preferably adjusted to be in the range of 0.1 to 5% by weight.
  • the emulsifier is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • polysorbate is preferable, and polysorbate 20, 60, 65, 80 and the like are mentioned as the polysorbate, and among these, hydrophilic. Polysorbate 20 having a high property is more preferable.
  • the graft ratio of the graft polymerization reaction is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 50% or more.
  • the material of the water-insoluble fiber is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • polyolefin-based or cellulosic-based is preferable, polyolefin-based is more preferable, and polypropylene is further preferable, from the viewpoint of good reactivity of electron beam graft polymerization.
  • the polyolefin-based means polyolefin and its derivative
  • the polyester-based means polyester and its derivative
  • the cellulose-based means cellulose and its derivative.
  • the lower limit of the average fiber diameter of the water-insoluble fiber is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is 0.3 ⁇ m or more from the viewpoint of having good tensile strength or productivity. Is preferable, 0.4 ⁇ m or more is more preferable, and 0.5 ⁇ m or more is further preferable.
  • the upper limit of the average fiber diameter of the water-insoluble fiber is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. However, from the viewpoint of high purification performance, 15 ⁇ m or less is preferable, 10 ⁇ m or less is more preferable, and 5 ⁇ m is more preferable. The following is more preferable, and 3 ⁇ m or less is particularly preferable. If the average fiber diameter exceeds 15 ⁇ m, the purification performance is low, which is not preferable.
  • the lower limit of the average pore size of the water-insoluble fiber is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is 1.0 ⁇ m or more from the viewpoint of having good liquid passage performance or productivity. Is more preferable, more than 1.0 ⁇ m is more preferable, 1.5 ⁇ m or more is further preferable, 2.0 ⁇ m or more is further preferable, 2.5 ⁇ m or more is particularly preferable, and 3.0 ⁇ m or more is most preferable.
  • the upper limit of the average pore size of the water-insoluble fiber is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. However, from the viewpoint of high purification performance, 50 ⁇ m or less is preferable, 40 ⁇ m or less is more preferable, and 35 ⁇ m or less. Is more preferable, and 30 ⁇ m or less is particularly preferable.
  • the average pore size of the water-insoluble fiber is measured as follows. For the average pore size of the water-insoluble fiber, the mean flow pore size measured using a Palmery Meter (Capillary Flow Polymer CFP-1200AEXLCSHJ, manufactured by Pourous Materials Inc. (PMI)) is used as the average pore size.
  • the measurement software Autofilling Perm-Porometer v6.73.90
  • the analysis software CAPREP v6.71.51 are used for the measurement and calculation of the average pore size.
  • the water-insoluble fiber to be measured is punched into a circle with a diameter of 26 mm, immersed in a Galwick (US registered trademark) penetrant (manufactured by PMI, surface tension 15.9 Dynas / cm), placed in a desiccator, and depressurized with a vacuum pump for about 1 minute. The air is distilled off and the penetrant is filled.
  • This water-insoluble fiber was set on the sample table ( ⁇ 26) attached to the device, and the flow rate of air was gradually increased to 200,000 cc / m with respect to the sample impregnated with the penetrant, and then the pressure was adjusted to 0 kPa in the dry state.
  • the Gale air permeability of the water-insoluble fiber is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 60 seconds or less, preferably 30 seconds. The following is more preferable, 10 seconds or less is further preferable, 8 seconds or less is further preferable, 5 seconds or less is particularly preferable, and 2.5 seconds or less is most preferable.
  • the Gale air permeability is based on JIS L1096: 2010 (8.26.2 B method (Gale type method)), and water-insoluble fibers are placed on a circular ventilation surface with an area of 642 mm 2 and a height of 254 mm, outside. It is a value obtained by passing 300 mL of air through a water-insoluble fiber using a cylinder with a diameter of 76.2 mm, an inner diameter of 74 mm, and a mass of 567 g, and measuring the time required to pass the entire amount of 300 mL of air (ventilation time: seconds). .. At this time, 1 to 30 water-insoluble fibers are laminated according to the pore size, measured three times for each level, and the average value per fiber is calculated.
  • the water-insoluble fiber is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. It may be a non-woven fabric, a woven fabric or a knitted fabric, but from the viewpoint of simplification of the manufacturing process, the non-woven fabric Is preferable.
  • the method for producing the nonwoven fabric is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • examples include a thermal bond method, a chemical bond method, a needle punch method, a spunlace method (water flow entanglement method), a stitch bond method, and a steam jet method.
  • the melt blow method, the electrospinning method, the flash spinning method, the papermaking method and the like are preferable from the viewpoint of obtaining ultrafine fibers.
  • the melt blow method is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the thermoplastic resin melted by the extruder is blown from the melt blow die into a thread by a high temperature and high speed air flow to form a fiber.
  • examples thereof include a method in which fibers are entangled with each other and fused by accumulating the stretched resin on a conveyor to obtain a non-woven fabric of self-adhesive ultrafine fibers without binder.
  • the resin viscosity, melting temperature, discharge amount, hot air temperature, wind pressure, DCD (distance from the spinneret and the surface to the conveyor), etc. the fiber diameter, texture, fiber orientation, and fiber dispersibility of the non-woven fabric are adjusted. Can be controlled. Further, it is possible to control the thickness and average pore size of the non-woven fabric by hot pressing or tentering.
  • Immunoglobulin is a glycoprotein produced by B cells of lymphocytes, and has a function of recognizing and binding to a molecule such as a specific protein. Immunoglobulin has a function of specifically binding to this specific molecule (antigen) and a function of detoxifying / removing an antigen-bearing factor in cooperation with other biomolecules and cells.
  • Immunoglobulin G (hereinafter, may be abbreviated as "IgG") is a monomeric immunoglobulin, which is composed of two heavy chains ( ⁇ chains) and two light chains, and has two antigen binding sites. Have a part.
  • the location corresponding to the vertical bar in the lower half of the "Y" shape of the antibody is called the Fc region, and the "V" -shaped portion in the upper half is called the Fab region.
  • the Fc region has an effector function of inducing a reaction after the antibody binds to the antigen, and the Fab region has a function of binding to the antigen.
  • the Fab region and Fc region of the heavy chain are connected by a hinge portion, and the proteolytic enzyme papain contained in papain decomposes this hinge portion and cuts into two Fab regions (fragments) and one Fc region.
  • variable region The portion (domain) of the Fab region near the tip of the "Y" is called a variable region (V region) because various changes are observed in the amino acid sequence so that it can bind to various antigens.
  • the variable region of the light chain is called the VL region
  • variable region of the heavy chain is called the VH region.
  • the Fab region and the Fc region other than the V region are regions with relatively little change, and are called constant regions (C regions).
  • the constant region of the light chain is called the CL region
  • the constant region of the heavy chain is called the CH region.
  • the CH region is further divided into CH1 to CH3.
  • the Fab region of the heavy chain consists of the VH region and CH1, and the Fc region of the heavy chain consists of CH2 and CH3.
  • the hinge portion is located between CH1 and CH2.
  • heavy chain antibodies which are antibodies composed only of heavy chains without a light chain.
  • Heavy chain antibodies derived from camelids are distinguished from ordinary IgG antibodies (IgG1) having a light chain and are called IgG2 and IgG3.
  • IgNAR new antigen receptor
  • the low molecular weight antibody in the present invention is an antibody fragment in which a part of a full-length antibody (wholity antibody, for example, whool IgG, etc.) is deleted, and is not particularly limited as long as it has an antigen-binding ability.
  • the low molecular weight antibody in the present invention is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but preferably does not have a CH2 domain and a CH3 domain.
  • the low molecular weight antibody in the present invention preferably contains either or both of a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL).
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • the amino acid sequence of VH or VL can include additions, deletions and / or substitutions. Further, as long as it binds to an antigen, it is possible to delete a part of either or both of VH and VL.
  • the low molecular weight antibody is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • a variable region of a heavy chain antibody derived from a camel family (VHH) and a variable region of a heavy chain antibody derived from a fish (V). -NAR), Fab, Fab', F (ab') 2 , single chain antibody (scFv), diabody, triabody, minibody and the like are preferable from the viewpoint of stability and production efficiency.
  • variable region (VHH) of the heavy chain antibody derived from the camelid is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, it was purified from the serum of the camelid immunized with the adsorption target. Examples thereof include those prepared by expressing the VHH gene in a host cell, and those chemically synthesized based on an amino acid sequence. Further, as the VHH, a commercially available product can be used.
  • the camelid family is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include Bactrian camel, Dromedary camel, Llama, Alpaca, Vicuna and Guanaco.
  • the host cell expressing the VHH gene is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include bacteria such as Escherichia coli, fungi such as yeast, animal cells and plant cells.
  • the method for immunizing the camelid animal with the adsorption target is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include the method described in International Publication No. 2020/067418.
  • the method for producing by expressing the VHH gene in a host cell is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, International Publication No. 2020/067478 and JP-A-2015-119637 Examples thereof include the methods described in.
  • the commercially available product of VHH is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • CaptureSelect registered trademark
  • Biotin Anti-HSA Conjugate and CaptureSelect (registered trademark) Biotin Anti of Thermo Scientific Co., Ltd.
  • Examples include Fc (Human) Conjugate, CaptureSelect (registered trademark) Biotin Anti-AAVX Conjugate and the like.
  • the single chain antibody (scFv) is obtained by linking VH and VL of the antibody.
  • VH and VL are linked via a linker, preferably a peptide linker (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988 85: 5879).
  • the peptide linker is not particularly limited. For example, any single-stranded peptide consisting of about 3 to 25 residues can be used as the linker.
  • the scFv is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the scFv is prepared by expressing the scFv gene in a host cell, chemically synthesized based on an amino acid sequence, or an antibody having a known sequence. The heavy chain variable region and the light chain variable region of the above are connected by a linker, and the like. Further, as the scFv, a commercially available product can be used.
  • the host cell expressing the scFv gene is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include bacteria such as Escherichia coli, fungi such as yeast, animal cells and plant cells.
  • the low molecular weight antibody in the present invention preferably contains a single domain antibody.
  • the single domain antibody is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but one containing a variable region (VHH) of the heavy chain antibody derived from the camelid family is preferable.
  • VHH variable region
  • the low molecular weight antibody in the present invention may be chimeric or humanized.
  • the molecular weight of the low molecular weight antibody is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 130,000 or less, more preferably 100,000 or less, still more preferably 50,000 or less. 30,000 or less is particularly preferable, and 20,000 or less is most preferable.
  • the target for adsorption of the low molecular weight antibody is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • examples include the body and metabolites.
  • viruses, virus-like particles, and viral vectors are preferable.
  • the virus-like particles are all or part of the virus shell protein that mainly constitutes the capsid, and since they do not contain nucleic acids, there is no concern about infection, but they induce an immune response, and are therefore used as the active ingredient of the vaccine. be able to.
  • virus, virus-like particles, and virus vector are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • adeno-associated virus AAV
  • adenovirus adenovirus
  • enterovirus adenovirus
  • parvovirus adenovirus
  • papovavirus adenovirus
  • human papillomavirus adeno-associated virus
  • Non-enveloped viruses such as rotavirus, coxsackie virus, sapovirus, norovirus, poliovirus, echovirus, hepatitis A virus, hepatitis E virus, rhinovirus, astrovirus, circovirus, simian virus, retrovirus, lentivirus, Sendai Viruses, herpesviruses such as simple herpesviruses, vaccinia virus, measles virus, baculovirus, influenza virus, leukemia virus, enveloped viruses such as Sindbiswill, and capsids of these viruses, or virus vectors containing these genes, etc. Can be mentioned. Among these, adeno-associated virus, a capsid of adeno-associated virus, or a vector containing an adeno-associated virus gene is preferable.
  • the adeno-associated virus is a virus belonging to the parvoviridae family that contains linear single-stranded DNA in the capsid.
  • the serum types of the adeno-associated virus include type 1 AAV (AAV1), type 2 AAV (AAV2), type 3 AAV (AAV3), type 4 AAV (AAV4), type 5 AAV (AAV5), and type 6 AAV (AAV6). ), 7-inch AAV (AAV7), 8-inch AAV (AAV8), 9-inch AAV (AAV9), 10-inch AAV (AAV10), and the like are known.
  • VHH described in WO2018 / 104528 pamphlet
  • Biotin Anti-AAVX conjugate can also be used.
  • IgG antibodies such as GeneTex's Intact Particles [A20] antibody can be fragmented and used.
  • a low molecular weight antibody such as scFv from an antibody whose sequence is known
  • it can be obtained from a public database, for example, a heavy chain sequence of an antibody that binds to AAV2 registered in a protein data bank (PDB: 3J1S_H).
  • a light chain sequence (PDB: 3J1S_L) and the like can be used.
  • the AAV binding capacity of the structure is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but 1.0 ⁇ 10 12 vg / mL-volume or more is preferable, and 5.0 ⁇ 10 12 vg / More preferably, mL-volume or higher, more preferably 1.0 ⁇ 10 13 vg / mL-volume or higher, and particularly preferably 1.5 ⁇ 10 13 vg / mL-volume or higher.
  • a method for calculating the binding capacity there are a method based on the total adsorption amount obtained by subtracting the elution amount into the flow-through fraction from the load amount, and a method based on the total amount recovered in the elution step after adsorption. In the present invention, the binding capacity is calculated based on the total recovery amount of the latter.
  • the AAV binding capacity of the structure is measured by the following method.
  • the crude AAV purified solution is purified by affinity chromatography using the structure.
  • the following solutions A to F were prepared and filtered through a 0.2 ⁇ m filter before use.
  • Liquid A Tris-HCl (20 mmol / L), sodium chloride (500 mmol / L), pH 8.0
  • Liquid B citric acid (100 mmol / L), sodium chloride (500 mmol / L), pH 2.1
  • Solution C NaOH (10 mmol / L)
  • Liquid D Phosphoric acid (120 mmol / L), acetic acid (167 mmol / L), benzyl alcohol (2.2% v / v)
  • Liquid E 20% ethanol
  • liquid AAV crude purified liquid diluted with liquid A to prepare a pH of 8.0 ( about 2 ⁇ 10 13 vg)
  • the ligand density (low molecular weight antibody density) of the structure is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 0.01 mg / mL-volume or more and 100 mg / mL-volume or less. , 0.1 mg / mL-volume or more and 50 mg / mL-volume or less are more preferable, and 1 mg / mL-volume or more and 10 mg / mL-volume or less are further preferable.
  • the ligand density is measured as follows.
  • the filtrate at the time of ligand immobilization on the water-insoluble fiber is collected, and the ligand density of the ligand immobilized on the water-insoluble fiber is calculated by measuring the absorbance.
  • the other elements are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include spacers.
  • the structure containing the spacer is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • a structure in which the low molecular weight antibody is connected to the water-insoluble fiber via a spacer or the like. Can be mentioned.
  • the functional group of the spacer is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include an amino group, a hydroxy group, an epoxy group and a carboxy group. Among these, an epoxy group is preferable from the viewpoint of stability, reactivity, and ease of connection with a ligand.
  • the spacer is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include those containing a polymer, a monomer, a dimer, a trimer, and a tetramer. Among these, those containing a polymer are preferable.
  • the polymer may be a copolymer.
  • the polymer is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include those containing a hydrophilic polymer and a hydrophobic polymer. Among these, those containing a hydrophilic polymer are preferable from the viewpoints of being able to be handled with an aqueous solvent and suppressing the non-specific hydrophobic action between the protein and the spacer.
  • the hydrophilic polymer is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include those containing polyamines and polysaccharides.
  • the polyamine is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • Piperazine 2,5-dimethylpiperazin, isophoronediamine, 4,4'-dicyclohexylmethanediamine, 1,4-cyclohexanediamine and other diamines
  • polyamines such as diethylenetriamine, dipropylenetriamine, triethylenetetramine
  • hydrazine N , N'-Dimethylhydrazine, 1,6-hexamethylenebishydrazine and other hydrazines
  • dihydrazides such as succinate dihydrazide, adipic acid dihydrazide, glutarate dihydrazide, sebacic acid dihydrazide and isophthalic acid dihydrazide.
  • those containing polyethyleneimine or polyallylamine are preferable because molecules having different molecular weights can be easily obtained.
  • the polysaccharide is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the lower limit of the molar mass of the polymer is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. However, from the viewpoint of adsorptivity of biological particles, 500 g / mol or more is preferable, and 5000 g / mol or more is more preferable. Preferably, 10,000 g / mol or more is more preferable, and 60,000 g / mol or more is particularly preferable.
  • the upper limit of the molar mass of the polymer is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • 2,000,000 g / mol or less is preferable, and 1, It is more preferably ,000,000 g / mol or less, further preferably 500,000 g / mol or less, and particularly preferably 200,000 g / mol or less.
  • the polymer may be a polymer having a branched chain or a linear polymer, but a polymer having a branched chain is preferable from the viewpoint of adsorptivity of biological particles.
  • the method for producing the structure includes a step of connecting the water-insoluble fiber and the low molecular weight antibody, and can further include other steps.
  • the water-insoluble fiber and the low molecular weight antibody are as described above.
  • connection between the water-insoluble fiber and the low-molecular-weight antibody is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the low-molecular-weight antibody is added to the water-insoluble fiber and miscible.
  • examples thereof include a method of adding other elements to the water-insoluble fiber and mixing by inversion, and further adding a low molecular weight antibody and mixing by inversion.
  • the time for the inversion mixing is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 1 hour or more and 48 hours or less, more preferably 2 hours or more and 48 hours or less, and 3 hours. From the above, 24 hours or less is more preferable, and 8 hours or more and 24 hours or less is particularly preferable.
  • the method for producing the structure containing the spacer is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • a water-insoluble fiber is connected to one end of the spacer and a low molecular weight antibody is attached to the other end. Examples include the process of connecting.
  • the spacer, the water-insoluble fiber, and the low molecular weight antibody are as described above.
  • the order of connecting the water-insoluble fiber to one end of the spacer and the connection of the low molecular weight antibody to the other end of the spacer does not matter, but the reaction control for connection is easy. After connecting the water-insoluble fiber to one end of the spacer, it is preferable to connect the low molecular weight antibody to the other end of the spacer.
  • connection of the water-insoluble fiber to one end of the spacer is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a method of adding a spacer solution to the water-insoluble fiber and inversion mixing. ..
  • the time for the inversion mixing is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 1 hour or more and 48 hours or less, more preferably 2 hours or more and 48 hours or less, and 3 hours. From the above, 24 hours or less is more preferable, and 8 hours or more and 24 hours or less is particularly preferable.
  • connection of the low molecular weight antibody to the other end of the spacer is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the time for the inversion mixing is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 1 hour or more and 48 hours or less, more preferably 2 hours or more and 48 hours or less, and 3 hours. From the above, 24 hours or less is more preferable, and 8 hours or more and 24 hours or less is particularly preferable.
  • the structure of the present invention can be processed according to the purpose, and its shape is not particularly limited. For example, a flat film shape, a hollow thread shape, a pleated shape, a roll shape, a spiral shape, a tubular shape, or the like can be selected. These processed structures may be used alone, laminated, or connected in series or in parallel.
  • the shape of the device for filling the structure is not particularly limited, and a disk shape, a cylinder shape, a plate shape, or the like can be selected. From the viewpoint of achieving uniform liquid flow, a disk shape and a cylindrical shape are preferable.
  • the processed structure can be used, for example, as a column for purifying bioparticles, a filter and a mask for adsorbing and removing bioparticles, and the like.
  • the filter for example, it can be used as a filter for virus removal in the manufacturing process of biopharmaceuticals such as blood products, and as a filter for HEPA (High Efficiency Particulate Air).
  • the adsorbent may have the above-mentioned structure and may further have other components.
  • the adsorption target of the adsorbent is the same as the adsorption target of the small molecule antibody described above.
  • the method for purifying biological particles includes a step of separating by an affinity chromatography purification method using the above-mentioned structure or the above-mentioned adsorbent, and can further include other steps.
  • the purification target of the method for purifying biological particles is the same as the adsorption target of the small molecule antibody described above.
  • the purification is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include purification using the structure or a column packed with the adsorbent.
  • the material of the column is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include glass, resins such as polypropylene and acrylic, and metals such as stainless steel.
  • the purification method for biological particles can be basically achieved by the same procedure as the purification method using an affinity column containing a generally known protein ligand (for example, a commercially available protein A column or the like). Journal of Chromatography A 2007 1160: 44-55).
  • a generally known protein ligand for example, a commercially available protein A column or the like. Journal of Chromatography A 2007 1160: 44-55).
  • the solution is passed through an affinity column packed with the structure of the present invention or an adsorbent to adsorb the target bioparticles. ..
  • An acidic or basic buffer (which may contain a substance that promotes dissociation from the structure or adsorbent) adjusted to an appropriate pH is then passed through the column to elute the desired bioparticles. By doing so, high-purity purification is achieved.
  • the structure or adsorbent of the present invention is purely strongly acidic or strongly alkaline to the extent that the ligand (low molecular weight antibody) and the base material (water-insoluble fiber) of the carrier do not completely impair the function. It can be reused by washing it by passing it through a buffer solution (which may be a suitable modifier or a solution containing an organic solvent).
  • a buffer solution which may be a suitable modifier or a solution containing an organic solvent.
  • the other steps are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, before the step of separation by the affinity chromatography purification method or after the step of separation by the affinity chromatography purification method. , Other purification steps such as ion exchange chromatography purification step, ultracentrifugation purification step and the like.
  • the ion exchange chromatography purification step is a step of separating the mixture based on an electrostatic interaction with a charged ion exchange ligand.
  • the ultracentrifugal purification step is a step of centrifuging the mixture to separate substances having similar molecular weights.
  • the affinity chromatography purification method utilizes a ligand having a specific binding ability to the target bioparticles, so that the target bioparticles can be obtained from a mixture containing a large amount of impurities such as a culture solution. It has the advantage of being pure and easy to isolate.
  • the elution rate of the biological particles into the flow-through (FT) in the method for purifying the biological particles is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably less than 100%, more preferably 50% or less. It is preferable, 20% or less is more preferable, and 0% is particularly preferable.
  • the bioparticle recovery rate in the elution step in the method for purifying bioparticles is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 5% or more, more preferably 10% or more, and more preferably 50% or more. Is more preferable, and 70% or more is particularly preferable.
  • the residual ratio of biological particles in the washing step in the method for purifying biological particles is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 30% or less, more preferably 20% or less, and more preferably 10% or less. More preferably, 5% or less is particularly preferable.
  • the elution rate of bioparticles into the flow-through (FT), the bioparticle recovery rate in the elution step, and the bioparticle residual rate in the washing step are measured by the following methods.
  • the AAV pretreatment solution is purified by chromatography on a non-woven fabric carrier.
  • the following solutions A to F are prepared and filtered through a 0.2 ⁇ m filter before use.
  • Liquid A Tris-HCl (20 mmol / L), sodium chloride (500 mmol / L), pH 8.0
  • Liquid B citric acid (100 mmol / L), sodium chloride (500 mmol / L), pH 2.1
  • Solution C NaOH (10 mmol / L)
  • Liquid D Phosphoric acid (120 mmol / L), acetic acid (167 mmol / L), benzyl alcohol (2.2% v / v)
  • Liquid E 20% ethanol
  • liquid AAV pretreatment liquid diluted with liquid A and prepared to pH 8.0 ( about 1 ⁇ 10 12 vg)
  • a column packed with a carrier is connected to AKTA Avant 25, the flow rate is set to 0.2 mL / min, washed with pure water,
  • the liquid F is passed through, the AAV is held on the column carrier, washed with the liquid A, and the AAV is eluted with the liquid B.
  • the column is washed in the order of solution A, solution C, solution A, and solution D.
  • the amount of AAV contained in each fraction is quantified by quantitative PCR (qPCR) using a Quant Studio 3 real-time PCR system (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and the amount of AAV at the elution peak with respect to the amount of AAV contained in the total recovery solution is used as the recovery rate. calculate.
  • the amount of AAV in the flow-through (FT) solution with respect to the total amount of AAV of the passed F solution is calculated as the elution rate
  • the amount of AAV in the alkaline cleaning step with respect to the amount of AAV contained in the total recovered solution is calculated as the residual rate. ..
  • ⁇ Production Example 1 Preparation of water-insoluble fiber (nonwoven fabric 1)> Using polypropylene as a material, a non-woven fabric having an average fiber diameter of 1.19 ⁇ m, a basis weight of 30 g / m 2 , and a thickness of 0.17 mm was produced by the melt blow method. The radically polymerizable compound solution was mixed with GMA / polysorbate 20 / water so as to be 10/2/88 by weight, and dissolved oxygen was removed by aerating nitrogen gas. The prepared non-woven fabric was irradiated with an electron beam at room temperature in a nitrogen gas atmosphere under the conditions of an acceleration voltage of 250 kV and an irradiation dose of 50 kGy.
  • the non-woven fabric after electron beam irradiation was immersed in a radically polymerizable compound solution and heated at 50 ° C. for 40 minutes in a reaction vessel to accelerate the polymerization reaction. Then, the non-woven fabric was washed with water at room temperature and then dried to obtain a water-insoluble fiber (nonwoven fabric 1) having a graft ratio of 50%. As shown below, the average fiber diameter and average pore size of the non-woven fabric were measured, and the non-woven fabric before and after graft polymerization was summarized in Table 1. The results after graft polymerization are also shown in Table 2.
  • the average fiber diameter of the non-woven fabric was determined based on the observation with a scanning electron microscope. From the obtained electron microscope images, the diameters of 100 or more randomly selected fibers were measured. The average number of measured values of 100 or more was defined as the average fiber diameter.
  • the average pore size of the non-woven fabric was defined as the mean flow pore size measured using a palm porometer (Capillary Flow Polymer CFP-1200AEXLCSHJ, manufactured by Pourous Materials Inc. (PMI)). In measuring and calculating the average pore size, measurement software (Autofilling Perm-Porometer v6.73.90) and analysis software (CAPREP v6.71.51) were used.
  • the non-woven fabric to be measured is punched into a circle with a diameter of 26 mm, immersed in a Galwick (US registered trademark) penetrant (manufactured by PMI, surface tension 15.9 Dynas / cm), placed in a desiccator, depressurized by a vacuum pump for about 1 minute, and air.
  • Maxflow 200000 (cc / m) Bubbleflow 2.00 (cc / m) F / PT 200 (old bubble time) Minbpress 0 (kPa) Zerotime 1.0 (sec) V2incr 5 (cts * 3) Preginc 0.3 Pulselay 2 Maxpres 1378.94666 (kPa) Pulsewise 0.2 (sec) Minextime 30 (sec) Presslew 10 (cts * 3) Flowslew 50 (cts * 3) Equiter 5 (0.1 sec) Aveiter 20 (0.1 sec) Maxpdif 0.69 (kPa) Maxfdiv 50 (cc / m)
  • ⁇ Production Example 2 Preparation of water-insoluble fiber (nonwoven fabric 2)> Using polypropylene as a material, a non-woven fabric having an average fiber diameter of 0.56 ⁇ m, a basis weight of 15 g / m 2 , and a thickness of 0.11 mm was produced. Using a radically polymerizable compound solution in which GMA / polysorbate 20 / water was mixed so as to be 8/2/90 by weight, electron beam graft polymerization was carried out in the same manner as in Production Example 1, and water insoluble with a graft ratio of 70%. A fiber (nonwoven fabric 2) was obtained. The average fiber diameter and the average pore diameter of the non-woven fabric were measured in the same manner as in Production Example 1, and are shown in Table 2.
  • ⁇ Production Example 3 Preparation of water-insoluble fiber (nonwoven fabric 3)> Using polypropylene as a material, a non-woven fabric having an average fiber diameter of 0.56 ⁇ m, a basis weight of 15 g / m 2 , and a thickness of 0.11 mm was produced. Using a radically polymerizable compound solution in which GMA / polysorbate 20 / water was mixed so as to be 2.4 / 2 / 95.6 by weight, electron beam graft polymerization was carried out in the same manner as in Production Example 1, and the graft ratio was 20. %% Water-insoluble fiber (nonwoven fabric 3) was obtained. The average fiber diameter and the average pore diameter of the non-woven fabric were measured in the same manner as in Production Example 1, and are shown in Table 2.
  • ⁇ Production Example 4 Preparation of water-insoluble fiber (nonwoven fabric 4)> Using polypropylene as a material, a non-woven fabric having an average fiber diameter of 0.56 ⁇ m, a basis weight of 15 g / m 2 , and a thickness of 0.11 mm was produced. The radically polymerizable compound solution was mixed with acrylic acid (AA) / neoethanol so as to be 20/80 by weight, and dissolved oxygen was removed by aerating nitrogen gas. The prepared non-woven fabric was irradiated with an electron beam at room temperature in a nitrogen gas atmosphere under the conditions of an acceleration voltage of 200 kV and an irradiation dose of 10 kGy.
  • AA acrylic acid
  • neoethanol neoethanol
  • the non-woven fabric after electron beam irradiation was immersed in a radically polymerizable compound solution and heated at 50 ° C. for 30 minutes in a reaction vessel to accelerate the polymerization reaction. Then, the non-woven fabric was washed with water at room temperature and then dried to obtain a water-insoluble fiber (nonwoven fabric 4) having a graft ratio of 12%.
  • the average fiber diameter and the average pore diameter of the non-woven fabric were measured in the same manner as in Production Example 1, and are shown in Table 2.
  • ⁇ Production Example 5 Preparation of water-insoluble fiber (nonwoven fabric 5)> Using polypropylene as a material, a non-woven fabric having an average fiber diameter of 3 ⁇ m, a basis weight of 30 g / m 2 , and a thickness of 0.28 mm was produced by the melt blow method. Using a radically polymerizable compound solution in which GMA / polysorbate 20 / water was mixed so as to be 10/2/88 by weight, electron beam graft polymerization was carried out in the same manner as in Production Example 1, and the graft ratio was 50% water-insoluble. A fiber (nonwoven fabric 5) was obtained. The average fiber diameter and the average pore diameter of the non-woven fabric were measured in the same manner as in Production Example 1, and are shown in Table 2.
  • nonwoven fabric 6 ⁇ Water-insoluble fiber (nonwoven fabric 6)>
  • non-woven fabric 6 505SWJD manufactured by Futamura Chemical Co., Ltd.
  • the average fiber diameter and the average pore diameter of the non-woven fabric were measured in the same manner as in Production Example 1, and are shown in Table 2.
  • the non-woven fabrics 2, 3 and 5 and the non-woven fabric 6 produced in Production Examples 2, 3 and 5 were measured for their Gale air permeability using a Gale-type densometer (manufactured by TOYOSEIKI).
  • the Gale air permeability is based on JIS L1096: 2010 (8.26.2 B method (Gale type method)), and water-insoluble fibers are placed on a circular ventilation surface with an area of 642 mm 2 and a height of 254 mm, outside.
  • the ventilation time is considered to be inversely proportional to the area of the holes, that is, the square of the average hole diameter. Therefore, the reciprocal of the square root of the ventilation time was taken, and the correlation with the average pore size calculated by the palm poromometer was compared. The results are shown in Table 3 and FIG.
  • a regenerated cellulose membrane having an average pore diameter of 0.2 ⁇ m (manufactured by cytiva, product code 10410314, hereinafter referred to as membrane 1) and a regenerated cellulose membrane having an average pore diameter of 0.45 ⁇ m (manufactured by cytiva, product code 10410214).
  • Membrane 2 a regenerated cellulose membrane having an average pore size of 1 ⁇ m (manufactured by Cytiva, product code 10410014, hereinafter referred to as Membrane 3) were prepared.
  • the average pore size of the non-woven fabric and the average pore size of the membrane measured by the palm porometer are well in phase with the reciprocal of the square root of the aeration time, and it does not depend on the type and material of the base material. It was confirmed.
  • a regenerated cellulose membrane having an average pore size of 0.2 ⁇ m (Cytiva, product code 10410314, membrane 1), a regenerated cellulose membrane having an average pore size of 0.45 ⁇ m (Cytiva, product code 10410214, membrane 2), and A regenerated cellulose membrane (manufactured by Cytiva, product code 10410014, membrane 3) having an average pore size of 1 ⁇ m was punched into a circle with a diameter of 5 mm to prepare a base disk (membrane disk) for filling the column.
  • ⁇ Production Example 7 Preparation of anti-AAV-scFv antibody> Based on the heavy chain sequence (PDB: 3J1S_H) and light chain sequence (PDB: 3J1S_L) of the antibody that binds to AAV2 registered in the protein data bank, the single chain antibody that binds to AAV2 shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. (Hereinafter, anti-AAV-scFv antibody) was designed.
  • a gene for Escherichia coli expression in which a signal sequence (pelB) was added to this anti-AAV-scFv antibody was designed (SEQ ID NO: 2), and the gene-synthesized sequence was used as a pET-22b (+) (Merck) vector NcoI site.
  • the plasmid introduced into the NotI site was prepared by consignment (GenScript).
  • the gene-synthesized plasmid was referred to as E.I. It was transformed into colli BL21 (DE3) (manufactured by Merck) and cultured in a Sakaguchi flask using Magic Media (manufactured by Thermo Fisher) containing kanamycin to produce an anti-AAV-scFv antibody. Affinity purification was performed from the obtained culture solution using a protein L carrier Kaneka KanCap L (manufactured by Kaneka Corporation), and the buffer was exchanged with an ultrafiltration membrane to obtain a refined product of an anti-AAV-scFv antibody.
  • ⁇ Production Example 8 Preparation of anti-AAV-VHH antibody 1> An anti-AAV-VHH antibody for expressing Escherichia coli was designed based on the amino acid sequence of the anti-AAV-VHH antibody described in International Patent Publication WO2018 / 104528 (SEQ ID NO: 59 in the sequence listing of International Patent Publication WO2018 / 104528) (sequence). Number 3). A gene for Escherichia coli expression in which a signal sequence (pelB) was added to this anti-AAV-VHH antibody was designed (SEQ ID NO: 4), and the gene-synthesized sequence was used as a pET-28b (+) (Merck) vector XbaI, Bpu1102I. The plasmid introduced into the site was prepared by commission (GenScript).
  • the gene-synthesized plasmid was referred to as E.I. It was transformed into colli BL21 (DE3) (manufactured by Merck) and cultured in a Sakaguchi flask using Magic Media (manufactured by Thermo Fisher) containing kanamycin to produce an anti-AAV-VHH antibody.
  • the obtained culture solution is purified using a cation exchange carrier Cellufine MAX S (manufactured by JNC), buffer exchanged with a centrifugal ultrafiltration membrane, and a refined product of an anti-AAV-VHH antibody (hereinafter referred to as VHH1).
  • VHH1 cation exchange carrier
  • ⁇ Production Example 9 Preparation of anti-AAV-VHH antibody 2> The immunological experiment was carried out by the method described in Example 6 of the International Publication No. 2020/067418 pamphlet.
  • the antibody gene group was obtained from the immunized alpaca blood by the method described in Example 1 of JP2015-119637A, and a phage library of anti-AAV-VHH antibody was prepared.
  • the screening of anti-AAV-VHH antibody from the phage library was carried out by the biopanning method described in Example 1 of JP2015-119637A using the AAV particle as an antigen.
  • AAV particle parts were prepared by the method described in Example 3 of Pamphlet International Publication No. 2020/0674718.
  • phage-infected Escherichia coli was serially diluted and cultured on 2YT agar medium (1.6% tryptone, 1.0% yeast extract, 2.0% agar) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin and 2% glucose. Single colonies were cultured overnight at 37 ° C. in 3 mL of 2YT medium containing 100 ⁇ g / mL ampicillin and 2% glucose. 30 ⁇ L of the culture solution cultured overnight was added to 5 mL of 2YT medium containing 100 ⁇ g / mL ampicillin, and the cells were cultured at 37 ° C. and 300 rpm for 1 hour.
  • anti-AAV-VHH antibodies having an affinity for AAV2, AAV5, AAV1 and 6 were designated as VHH ligands 2, 3 and 4, respectively.
  • An anti-AAV-VHH antibody was purified from the obtained VHH expression culture medium by cation exchange chromatography using AKTA york 25 (GE Healthcare).
  • the sample was loaded on Cellufine MAX S-r 100 mL (manufactured by JNC) equilibrated with 25 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0), and the buffer used for equilibration and sodium phosphate buffer containing 1 M NaCl (manufactured by JNC) were loaded. It was eluted with a linear gradient of pH 6.0).
  • the purified anti-AAV-VHH antibody was concentrated with a centrifugal ultrafiltration unit OMEGA Membrane 1K (manufactured by PALL) to obtain purified VHH antibody (VHH ligands 2, 3, 4).
  • Example 1 Preparation of carrier 1>
  • Example 1-1 Immobilization of polyethyleneimine (PEI) spacer on non-woven fabric 1>
  • PEI solution manufactured by Alfa Aesar, Mw: 70,000, branched chain
  • Example 1-2 Functional grouping of PEI spacer-immobilized non-woven fabric>
  • 4 mL of ultrapure water and 0.8 mL of a 2N sodium hydroxide aqueous solution were added and mixed by inversion for 30 minutes.
  • 4 mL of 1,4-butanediol diglycidyl ether (manufactured by Nagase Brothers) was added, and the mixture was inverted and mixed at 37 ° C. for 4 hours. After the reaction, the non-woven fabric was transferred to a glass filter and washed with pure water to obtain an epoxidized non-woven fabric 1.
  • Example 1-3 Immobilization of scFv ligand 1 on epoxidized non-woven fabric 1> A 0.2 mol / L carbonate buffer (pH 10.0) containing 0.5 mol / L NaCl was added to the epoxidized nonwoven fabric 1 obtained in Example 1-2. On the other hand, 1.7 mg of the purified scFv antibody (scFv ligand 1) prepared in Production Example 7 was added so that the liquid volume became 5 mL. After inversion mixing at 37 ° C. for 30 minutes, 0.497 g of anhydrous sodium sulfate was slowly added to dissolve the mixture, and the mixture was further inverted and mixed at 37 ° C. for 16 hours.
  • scFv ligand 1 Immobilization of scFv ligand 1 on epoxidized non-woven fabric 1> A 0.2 mol / L carbonate buffer (pH 10.0) containing 0.5 mol / L NaCl was added to the epoxidized nonwoven fabric
  • the non-woven fabric was transferred to a glass filter and washed with the above-mentioned carbonate buffer. The filtrate at this time was collected, and the ligand density of the scFv ligand immobilized on the non-woven fabric was calculated by measuring the absorbance. The calculated ligand density was 0.4 mg / mL-column (Table 4). Subsequently, in order to seal the epoxy group remaining on the non-woven fabric after washing, a 0.2 mol / L phosphate buffer solution (pH 8.0) containing 0.1 mol / L NaCl and 10% v / v thioglycerol was used. Was added, and the mixture was inverted and mixed at 25 ° C. for 16 hours. After the reaction, the non-woven fabric was transferred to a glass filter and washed with pure water and 20% ethanol to obtain scFv1 immobilized non-woven fabric 1 (carrier 1).
  • Example 2 Preparation of carrier 2>
  • the scFv ligand 1 is replaced with the VHH ligand 1, and the buffer solution at the time of ligand immobilization is a 0.2 mol / L carbonate buffer solution (pH 10.0) containing 0.5 mol / L NaCl and 1.2 mol / L guanidine hydrochloride.
  • Spacer immobilization, functionalization, and VHH1 immobilization were carried out in the same manner as in Example 1 to obtain a VHH1 immobilized non-woven fabric 1 (carrier 2).
  • the ligand density was measured in the same manner as in Example 1, and the measurement results are shown in Table 4.
  • ⁇ Comparative Example 1 Preparation of Carrier 3> ⁇ Comparative Example 1-1: Functionalization of beads 1> POROS® 50 OH Hydroxyl Activated Resin (hereinafter referred to as bead 1; Thermo Scientific pore diameter 50-1000 nm (nominal value)) was weighed in 5 mL-gel, and the same method as in Example 1-2 was used. Beads 1 (epoxidized beads 1) into which an epoxy group was introduced were obtained. The ligand density was measured in the same manner as in Example 1, and the measurement results are shown in Table 4.
  • ⁇ Comparative Example 1-2 Immobilization of VHH2 on epoxidized beads 1> A 0.2 mol / L carbonate buffer (pH 10.0) containing 0.5 mol / L NaCl was added to the epoxidized beads 1 obtained in Comparative Example 1-2. On the other hand, 5 mg of the purified VHH antibody ligand 2 prepared in Production Example 9 was added so that the liquid volume became 5 mL. After inversion mixing at 37 ° C. for 30 minutes, 0.497 g of anhydrous sodium sulfate was slowly added to dissolve the mixture, and the mixture was further inverted and mixed at 37 ° C. for 16 hours.
  • the beads were transferred to a glass filter and washed with the above-mentioned carbonate buffer. The filtrate at this time was collected, and the ligand density of the VHH ligand was calculated by measuring the absorbance. Subsequently, a 0.2 mol / L phosphate buffer solution (pH 8.0) containing 0.1 mol / L NaCl and 10% v / v thioglycerol was used to seal the epoxy groups remaining on the washed beads. Was added, and the mixture was inverted and mixed at 25 ° C. for 16 hours. After the reaction, the beads were transferred to a glass filter and washed with pure water and 20% ethanol to obtain VHH2-immobilized beads 1 (carrier 3). The ligand density was measured in the same manner as in Example 1, and the measurement results are shown in Table 4.
  • Example 3 Preparation of carrier 7> Spacer immobilization, functionalization, and VHH2 immobilization were carried out in the same manner as in Example 1 except that the scFv ligand 1 was replaced with the VHH ligand 2, to obtain a VHH2-immobilized non-woven fabric 1 (carrier 7). The ligand density was measured in the same manner as in Example 1, and the measurement results are shown in Table 4.
  • Example 4 Preparation of carrier 8> Spacer immobilization, functionalization, and VHH2 immobilization were carried out in the same manner as in Example 1 except that the non-woven fabric 1 was replaced with the non-woven fabric 2, to obtain a VHH2 immobilized nonwoven fabric 2 (carrier 8). The ligand density was measured in the same manner as in Example 1, and the measurement results are shown in Table 4.
  • Example 5 Preparation of carrier 9> Spacer immobilization, functionalization, and VHH2 immobilization were carried out in the same manner as in Example 1 except that the non-woven fabric 1 was replaced with the non-woven fabric 3, to obtain a VHH2 immobilized nonwoven fabric 3 (carrier 9). The ligand density was measured in the same manner as in Example 1, and the measurement results are shown in Table 4.
  • Example 6 Preparation of carrier 10> A 20% aqueous ethanol solution was added to the non-woven fabric 4. On the other hand, 5 mg of the purified VHH antibody ligand 2 prepared in Production Example 9 and 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl) (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added in an amount of 0.2 mg, the liquid volume was adjusted to 5 mL, and the mixture was inverted and mixed at 37 ° C. for 4 hours.
  • the non-woven fabric was transferred to a glass filter and washed with pure water to obtain a carrier 10.
  • the filtrate at this time was collected, and the ligand density of the VHH ligand was calculated by measuring the absorbance.
  • the ligand density was measured in the same manner as in Example 1, and the measurement results are shown in Table 4.
  • Example 7 Preparation of carrier 11> Spacer immobilization, functionalization, and VHH2 immobilization were carried out in the same manner as in Example 1 except that the non-woven fabric 1 was replaced with the non-woven fabric 5, to obtain a VHH2 immobilized nonwoven fabric 5 (carrier 11). The ligand density was measured in the same manner as in Example 1, and the measurement results are shown in Table 4.
  • Example 8 Preparation of carrier 12>
  • the non-woven fabric 4 was functionalized and VHH2 was immobilized by the same method as in Example 6 except that the non-woven fabric 4 was replaced with the non-woven fabric 6, to obtain a VHH2 immobilized nonwoven fabric 6 (carrier 12).
  • the ligand density was measured in the same manner as in Example 1, and the measurement results are shown in Table 4.
  • VHH3 immobilized beads 1 were obtained by functionalizing and immobilizing VHH3 in the same manner as in Comparative Example 1 except that VHH ligand 2 was replaced with VHH ligand 3.
  • the ligand density was measured in the same manner as in Example 1, and the measurement results are shown in Table 4.
  • Example 9 Preparation of carrier 14> Spacer immobilization, functionalization, and VHH3 immobilization were carried out in the same manner as in Example 1 except that the scFv ligand 1 was replaced with the VHH ligand 3, to obtain a VHH3 immobilized nonwoven fabric 1 (carrier 14). The ligand density was measured in the same manner as in Example 1, and the measurement results are shown in Table 4.
  • Example 10 Preparation of carrier 15> Spacer immobilization, functionalization, and VHH4 immobilization were carried out in the same manner as in Example 1 except that the scFv ligand 1 was replaced with the VHH ligand 4, to obtain a VHH4 immobilized nonwoven fabric 1 (carrier 15). The ligand density was measured in the same manner as in Example 1, and the measurement results are shown in Table 4.
  • ⁇ Production Example 10 Filling of a non-woven fabric carrier into a column> The carriers 7 to 12, 14 and 15 prepared in Examples 3 to 10 were superposed one by one, and 0.2 mL-column was charged in a Tricorn® 5/20 column.
  • ⁇ Production Example 12 Filling the column of bead carrier> Carriers 3 and 13 prepared in Comparative Examples 1 and 5 and POROS (registered trademark) CaptureSelect (registered trademark) AAVX (manufactured by Thermo Scientific) were measured by 0.2 mL-gel in wet volume, respectively, and Tricorn (registered trademark) 5 It was filled in a / 20 column (manufactured by GE Healthcare).
  • POROS registered trademark
  • CaptureSelect registered trademark
  • AAVX manufactured by Thermo Scientific
  • a plasmid for AAV2 preparation expressing VENUS (GenBank: ACQ43955.1), which is a variant of the fluorescent protein GFP, was prepared using an AAV vector preparation kit (“AAVpro® Helper Free System” manufactured by Takara Bio Inc.).
  • AAV vector preparation kit (“AAVpro® Helper Free System” manufactured by Takara Bio Inc.).
  • AAVpro® Helper Free System” manufactured by Takara Bio Inc. was prepared using an AAV vector preparation kit (“AAVpro® Helper Free System” manufactured by Takara Bio Inc.).
  • AAVpro® Helper Free System manufactured by Takara Bio Inc.
  • Cultured HEK293 cells were transfected with a plasmid prepared using a transfection reagent (“Polyethylenimine MAX” manufactured by Polysciences, MW: 40,000) to produce AAV. After completion of the culture, the cells were detached and the cell culture solution was collected.
  • AAV-producing cells obtained above were suspended in darbecolinic acid buffered saline (manufactured by Sigma-Aldrich, hereinafter abbreviated as "PBS") containing 0.1% Triton X-100, and 20 in ice. The cells were disrupted with stirring for 1 minute. To the obtained cell disruption solution, 7.5 v / v% 1M magnesium chloride aqueous solution and 0.1 v / v% 250 kU / mL Kaneka Endonucleose (manufactured by Kaneka Corporation) were added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes.
  • PBS darbecolinic acid buffered saline
  • Triton X-100 0.1% Triton X-100
  • ⁇ Production Example 14 Preparation of AAV2 crude purified solution>
  • the AAV2 pretreatment liquid obtained in Production Example 13 was purified by cation exchange chromatography with reference to a non-patent document (Journal of Visual Methods 2007 140: 183-192).
  • POROS (registered trademark) 50HS (manufactured by Thermo) was filled in Tricorn (registered trademark) 10/150 (manufactured by GE Healthcare) to prepare a column for cation exchange purification.
  • the following solutions A to F were prepared and passed through a 0.2 ⁇ m filter before use.
  • Liquid A NaPO4 (20 mmol / L), NaCl (100 mmol / L), pH 7.4
  • Liquid B NaPO4 (20 mmol / L), NaCl (100 mmol / L), Sarkosyl (5 mmol / L), pH 7.4
  • Solution C NaPO4 (20 mmol / L), NaCl (370 mmol / L), pH 7.4
  • Liquid D NaCl (1 mol / L)
  • Liquid E NaOH (0.5 mol / L)
  • Liquid F A solution prepared by diluting the AAV2 pretreatment liquid with liquid A and adjusting the pH to 7.4. The above column was connected to AKTA Avant 25, washed with liquid D, and equilibrated with liquid A.
  • ⁇ Production Example 15 Production of adeno-associated virus (AAV1, 5, 6) by animal cells, and preparation of AAV 1, 5, 6 pretreatment solution> AAV1, 5, 6 pretreatment solutions were prepared in the same manner as in Production Example 13 except that the AAV2 preparation plasmid was replaced with the AAV1, 5, 6 preparation plasmid.
  • ⁇ Test Example 1 AAV recovery test 1 using a non-woven fabric carrier> A small amount of the crude AAV2 purified solution prepared in Production Example 14 was added to the three discs of the carriers 1 and 7 prepared in Examples 1 and 3 and mixed by inversion for 16 hours to adsorb AAV2 on the carrier. After removing the supernatant, an eluate (citric acid (100 mmol / L), sodium chloride (500 mmol / L), pH 2.1) was added to elute AAV2 from the carrier. The amount of AAV contained in the liquid was quantified by quantitative PCR (qPCR) using a Quant Studio 3 real-time PCR system (manufactured by Thermo Fisher Scientific). In terms of the amount of adsorption per volume, the carrier 1 was 2.7 ⁇ 10 11 vg / mL-volume, and the carrier 7 was 1.9 ⁇ 10 12 vg / mL-volume.
  • Example 2 AAV recovery test 2 using a non-woven fabric carrier> An AAV recovery test was performed on the carrier 2 prepared in Example 2 in the same manner as in Test Example 1 except that the liquid to be added was replaced with the AAV1 pretreatment liquid prepared in Production Example 15 from the crude AAV2 purified liquid. The amount of AAV1 adsorbed was 1.1 ⁇ 10 11 vg / mL-column.
  • ⁇ Test Example 3 Recovery of AAV2 using a non-woven fabric carrier> Using the columns of carriers 7 and 10 prepared in Production Example 10, the AAV2 crude purified solution obtained in Production Example 14 was purified by affinity chromatography. The following solutions A to F were prepared and filtered through a 0.2 ⁇ m filter before use.
  • Liquid A Tris-HCl (20 mmol / L), sodium chloride (500 mmol / L), pH 8.0
  • Liquid B citric acid (100 mmol / L), sodium chloride (500 mmol / L), pH 2.1
  • Solution C NaOH (10 mmol / L)
  • Liquid D Phosphoric acid (120 mmol / L), acetic acid (167 mmol / L), benzyl alcohol (2.2% v / v)
  • Solution E 20% ethanol
  • solution AAV2 crude purified solution diluted with solution A to adjust the pH to 8.0 ( about 1 ⁇ 10 12 vg)
  • the column packed with the columns of the carriers 7 and 10 prepared in Production Example 10 was connected to AKTA Avant 25, the flow rate was set to 0.2 mL / min, washed with pure water, and equilibrated with solution A. Then, the F solution was passed through, the AAV was held on the column carrier, washed with the A solution, and the AAV was eluted with the B solution (eluting step). After the elution was completed, the column was washed in the order of solution A, solution C, solution A, and solution D (cleaning step). After washing, the column was replaced with Liquid E and stored in a refrigerator.
  • the amount of AAV contained in each fraction was quantified by quantitative PCR (qPCR) using a Quant Studio 3 real-time PCR system (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • qPCR quantitative PCR
  • FT flow-through
  • FT flow-through
  • ⁇ Test Example 4 Recovery of AAV2 using a membrane carrier> Using the columns of carriers 4, 5 and 6 prepared in Production Example 11, the crude AAV2 purified solution obtained in Production Example 14 was purified by affinity chromatography. The amount of AAV contained in each fraction was quantified by the same method as in Test Example 3, and the ratio of the amount of leaked AAV and the amount of residual AAV was calculated. The results are shown in Table 5.
  • ⁇ Test Example 5 Recovery of AAV2 using a bead carrier> Using the POROS® CaptureSelect® AAVX prepared in Production Example 12 and the column of carrier 3, the AAV2 crude purified solution obtained in Production Example 14 was purified by affinity chromatography. The amount of AAV contained in each fraction was quantified by the same method as in Test Example 3, and the ratio of the amount of leaked AAV and the amount of residual AAV was calculated. The results are shown in Table 5.
  • ⁇ Test Example 6 Recovery of AAV2 using a non-woven fabric carrier under high flow velocity conditions> Using the columns of carriers 7, 8, 9, 11, and 12 prepared in Production Example 10, the AAV2 crude purified solution obtained in Production Example 14 was purified by affinity chromatography. Each of them was carried out in the same manner as in Test Example 3 except that the flow velocity of the chromatograph was changed from 0.2 mL / min to 1.2 mL / min (residence time 10 seconds) or 2.4 mL / min (residence time 5 seconds). The amount of AAV contained in the fraction was quantified, and the ratio of the amount of leaked AAV and the amount of residual AAV was calculated. The results are shown in Table 6.
  • ⁇ Test Example 7 Recovery of AAV2 under high flow velocity conditions using a bead carrier>
  • the POROS® CaptureSelect® AAVX column prepared in Production Example 12 the AAV2 crude purified solution obtained in Production Example 14 was purified by affinity chromatography. Each of them was carried out in the same manner as in Test Example 3 except that the flow velocity of the chromatograph was changed from 0.2 mL / min to 1.2 mL / min (residence time 10 seconds) or 2.4 mL / min (residence time 5 seconds).
  • the amount of AAV contained in the fraction was quantified, and the ratio of the amount of leaked AAV and the amount of residual AAV was calculated. The results are shown in Table 6.
  • the non-woven fabric carriers 7, 8, 9 and 11 have a low ratio of AAV leaking to the FT and a low ratio of residual AAV even if the flow velocity is increased and the residence time is shorter than 1 minute. all right.
  • the carrier 12 had a low ratio of residual AAV, but a large ratio of leaked AAV.
  • the amount of AAV leaked to the FT of the carrier 11 is smaller than that of other carriers, but this is because it is outside the lower limit of the calibration curve and is comparable to the results of carriers 7, 8 and 9. Is assumed.
  • ⁇ Test Example 8 Purification of AAV2 by carrier 7> Using the column of the carrier 7 prepared in Production Example 10, the AAV2 pretreatment liquid obtained in Production Example 13 was purified by affinity chromatography. The following solutions A to F were prepared and filtered through a 0.2 ⁇ m filter before use.
  • Liquid A Tris-HCl (20 mmol / L), sodium chloride (500 mmol / L), pH 8.0
  • Liquid B citric acid (100 mmol / L), sodium chloride (500 mmol / L), pH 2.1
  • Solution C NaOH (10 mmol / L)
  • Liquid D Phosphoric acid (120 mmol / L), acetic acid (167 mmol / L), benzyl alcohol (2.2% v / v)
  • Liquid E 20% ethanol
  • liquid AAV2 pretreatment liquid diluted with liquid A and prepared to pH 8.0 ( about 1 ⁇ 10 12 vg)
  • the column packed with the carrier 7 prepared in Production Example 10 was connected to AKTA Avant 25, the flow rate was set to 0.2 mL / min, washed with pure water, and equilibrated with solution A. Then, the F solution was passed through, the AAV was held on the column carrier, washed with the A solution, and the AAV was eluted with the B solution. After the elution was completed, the column was washed in the order of solution A, solution C, solution A, and solution D. After washing, the column was replaced with Liquid E and stored in a refrigerator. The chromatogram at the time of purification is shown in FIG.
  • ⁇ Test Example 9 Purification of AAV2 with bead carrier>
  • the AAV pretreatment solution was subjected to affinity chromatography in the same manner as in Test Example 8 except that a column packed with POROS® CaptureSelect® AAVX produced in Production Example 12 was used instead of the column of the carrier 7.
  • Purified The obtained chromatogram is shown in FIG.
  • the recovered AAV in the elution step and the residual AAV in the washing step were calculated in the same manner as in Test Example 8. The results are shown in Table 7.
  • ⁇ Test Example 10 Purification of AAV5 with carrier 14> Using the column of the carrier 14 prepared in Production Example 10, the AAV5 pretreatment liquid obtained in Production Example 15 was purified by affinity chromatography. The following solutions A to F were prepared and filtered through a 0.2 ⁇ m filter before use.
  • Liquid A Tris-HCl (20 mmol / L), sodium chloride (100 mmol / L), pH 8.0
  • Liquid B citric acid (20 mmol / L), sodium chloride (100 mmol / L), pH 2.1
  • Solution C NaOH (10 mmol / L)
  • Liquid D Phosphoric acid (120 mmol / L), acetic acid (167 mmol / L), benzyl alcohol (2.2% v / v)
  • Solution E 20% ethanol
  • solution AAV5 pretreatment solution diluted with solution A to adjust the pH to 8.0 ( about 1 x 10 12 vg)
  • the column packed with the carrier 14 prepared in Production Example 10 was connected to AKTA Avant 25, the flow rate was set to 0.2 mL / min, washed with pure water, and equilibrated with solution A. Then, the F solution was passed through, the AAV was held on the column carrier, washed with the A solution, and the AAV was eluted with the B solution. After the elution was completed, the column was washed in the order of solution A, solution C, solution A, and solution D. After washing, the column was replaced with Liquid E and stored in a refrigerator.
  • ⁇ Test Example 11 Purification of AAV5 by carrier 13>
  • the AAV5 pretreatment solution was purified by affinity chromatography in the same manner as in Test Example 10 except that the column packed with the carrier 13 produced in Production Example 12 was used instead of the column of the carrier 14.
  • the recovered AAV in the elution step and the residual AAV in the washing step were calculated in the same manner as in Test Example 10. The results are shown in Table 8.
  • ⁇ Test Example 12 Purification of AAV1, 6 by carrier 15> Using the column of the carrier 15 prepared in Production Example 10, the AAV1 pretreatment liquid and the AAV6 pretreatment liquid obtained in Production Example 15 were purified by affinity chromatography. AAV1 and 6 were purified by the same method as in Test Example 10 except that the F solution was changed to the AAV1 pretreatment solution or the AAV6 pretreatment solution. The amount of AAV contained in the elution step was 2.2 ⁇ 10 10 vg / mL- volume for AAV1 and 4.4 ⁇ 10 10 vg / mL-volume for AAV6.
  • the structure of the present application is a structure having a high bioparticle recovery rate in the elution step and a low bioparticle residual rate in the washing step.
  • ⁇ Test Example 13 Calculation of AAV binding capacity of non-woven fabric carrier> Using the column of the carrier 7 prepared in Production Example 10, the crude AAV purified solution obtained in Production Example 14 was purified by affinity chromatography. The following solutions A to F were prepared and filtered through a 0.2 ⁇ m filter before use.
  • Liquid A Tris-HCl (20 mmol / L), sodium chloride (500 mmol / L), pH 8.0
  • Liquid B citric acid (100 mmol / L), sodium chloride (500 mmol / L), pH 2.1
  • Solution C NaOH (10 mmol / L)
  • Liquid D Phosphoric acid (120 mmol / L), acetic acid (167 mmol / L), benzyl alcohol (2.2% v / v)
  • Liquid E 20% ethanol
  • liquid AAV crude purified liquid diluted with liquid A to prepare a pH of 8.0 ( about 2 ⁇ 10 13 vg)
  • the column was connected to AKTA Avant 25, the flow rate was set to 0.2 mL / min, washed with pure water, and equilibrated with solution A. Then, the F solution was passed through, the AAV was held on the column carrier, washed with the A solution, and the AAV was eluted with the B solution. After the elution was completed, the column was washed in the order of solution A, solution C, solution A, and solution D. After washing, the column was replaced with Liquid E and stored in a refrigerator. The amount of AAV contained in each fraction was quantified by qPCR, and the binding volume was calculated from the amount of AAV contained in the elution step. The results are shown in Table 9.
  • the structure of the present invention exhibits performance comparable to that of commercially available products from the viewpoint of virus adsorption.
  • the crude AAV purified solution prepared this time contains a large amount of a gene-free capsid in addition to the AAV containing a viral gene. Since only AAV containing viral genes is quantified in qPCR measurement, the actual binding capacity is assumed to be larger than the value shown in Table 9.
  • Examples of aspects of the present invention include the following.
  • ⁇ 1> A structure characterized by having a water-insoluble fiber and a low-molecular-weight antibody connected to the water-insoluble fiber.
  • ⁇ 2> The structure according to ⁇ 1>, wherein the water-insoluble fiber is a non-woven fabric.
  • ⁇ 3> The structure according to ⁇ 2>, wherein the nonwoven fabric contains a polyolefin and a derivative thereof.
  • ⁇ 4> The structure according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the low molecular weight antibody can adsorb a virus, a virus-like particle, or a viral vector.
  • ⁇ 5> The structure according to ⁇ 4> above, wherein the virus, virus-like particles, or virus vector is an adeno-associated virus, or a capsid of an adeno-associated virus, or a viral vector containing an adeno-associated virus gene.
  • ⁇ 6> The structure according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the low molecular weight antibody does not have a CH2 domain and a CH3 domain.
  • ⁇ 7> The structure according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the low molecular weight antibody contains a heavy chain variable region or a light chain variable region of a full-length antibody.
  • ⁇ 8> The structure according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the low molecular weight antibody contains a single domain antibody.
  • the single domain antibody contains a variable region of a heavy chain antibody derived from a camelid.
  • the low molecular weight antibody is connected to the water-insoluble fiber via a spacer.
  • the spacer contains any one of an amino group, a hydroxy group, an epoxy group, and a carboxy group.
  • ⁇ 12> The structure according to any one of ⁇ 10> or ⁇ 11>, wherein the spacer contains a polymer.
  • ⁇ 13> A method for producing a structure, which comprises a step of connecting a water-insoluble fiber and a low molecular weight antibody.
  • ⁇ 14> An adsorbent having the structure according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 12>.
  • ⁇ 15> A method for purifying biological particles, which comprises using the structure according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 12> or the adsorbent according to ⁇ 14>.

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Abstract

水不溶性繊維と、前記水不溶性繊維に接続された低分子化抗体と、を有することを特徴とする構造物、及び水不溶性繊維と、低分子化抗体と、を接続する工程を含むことを特徴とする構造物の製造方法である。

Description

構造物及びその製造方法、それを用いた吸着体、並びに生体粒子の精製方法
　本発明は、構造物及びその製造方法、それを用いた吸着体、並びに生体粒子の精製方法に関する。
　ウイルス、ウイルス様粒子、又はウイルスベクターなどの生体粒子は、遺伝子治療、ワクチン、検査診断、血液浄化などの医療分野で非常に重要な分子である。また、その除去は、感染予防及び防止や医薬品のウイルス学的安全性の確保の上で非常に重要である。
　近年、これらの医療分野は、特に注目されている分野であり、生体粒子を効率的に除去する技術に加え、生体粒子を細胞培養液や血液などの生体試料から効率的に回収する手法が強く求められている。
　一般的に高純度なウイルスの精製には、ウイルスを生産させた形質転換細胞の培養液や鶏卵の漿尿液から、先ず、細胞や細胞片などの固形物を濾過により取り除き、次いでクロマトグラフィー法、超遠心法などにより精製する方法が採用されている。
　アフィニティークロマトグラフィーは、対象分子に特異的に結合する抗体などのリガンドをビーズ基材に固定化した担体を用いて、対象物とそれ以外との不純物とを分離する方法である。安定性、産生効率の観点から、リガンドに低分子化抗体を使用する例が知られている（特許文献１など）。また、従来のウイルス精製方法においても、低分子化抗体の固定化されたビーズ担体を用いた方法（非特許文献１など）や市販品（ＧＥ社のＣａｐｔｏ（登録商標）　ＡＶＢ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＰＯＲＯＳ（登録商標）　ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）　ＡＡＶＸなど）が知られている。
　しかしながら、従来のビーズ担体を用いたクロマトグラフィーでは、ビーズ担体が高価で調製が難しいうえ、ビーズ基材の孔径が小さいことにより、ウイルスなどの生体粒子を効率的に回収する上で課題があった。
　したがって、安価で、溶出工程の生体粒子回収率は高く、洗浄工程の生体粒子残存率が低い、構造物及びその製造方法、それを用いた吸着体、並びに生体粒子の精製方法は全く知られておらず、これらの提供が強く求められている。
国際公開第０１／４４３０１号パンフレット
Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．　２０１８　９：３３
　本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、安価で、溶出工程の生体粒子回収率は高く、洗浄工程の生体粒子残存率が低い、構造物及びその製造方法、それを用いた吸着体、並びに生体粒子の精製方法を提供することを目的とする。そのほか、生体粒子の除去においては、これらの効率的な除去手段としても有効な手法を提供する。
　本発明者らが、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、水不溶性繊維と、前記水不溶性繊維に接続された低分子化抗体と、を有する構造物により、安価で、溶出工程の生体粒子回収率は高く、洗浄工程の生体粒子残存率が低い、構造物が提供でき、水不溶性繊維と、低分子化抗体と、を接続する工程を含むことを特徴とする構造物の製造方法を採用することにより、安価で、溶出工程の生体粒子回収率は高く、洗浄工程の生体粒子残存率が低い、構造物の製造方法が提供できることを知見した。
　本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
　＜１＞　水不溶性繊維と、前記水不溶性繊維に接続された低分子化抗体と、を有することを特徴とする構造物である。
　＜２＞　水不溶性繊維と、低分子化抗体と、を接続する工程を含むことを特徴とする構造物の製造方法である。
　＜３＞　前記＜１＞に記載の構造物を有することを特徴とする吸着体である。
　＜４＞　前記＜１＞に記載の構造物、又は前記＜３＞に記載の吸着体を用いることを特徴とする生体粒子の精製方法である。
　本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、安価で、溶出工程の生体粒子回収率は高く、洗浄工程の生体粒子残存率が低い、構造物及びその製造方法、それを用いた吸着体、並びに生体粒子の精製方法を提供することができる。
図１は、パームポロメーターで算出した平均孔径と、通気時間の平方根の逆数との相関を示す図である。 図２は、担体７によるＡＡＶ吸脱着のクロマトグラムを示す図である。 図３は、ＰＯＲＯＳ（登録商標）　ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＡＡＶＸによるＡＡＶ吸脱着のクロマトグラムを示す図である。
　（構造物）
　前記構造物は、水不溶性繊維と、前記水不溶性繊維に接続された低分子化抗体と、を有し、さらにその他の要素を有することができる。
　すなわち、前記構造物は、前記水不溶性繊維と前記低分子化抗体とが直接接続していてもよいし、前記水不溶性繊維と前記低分子化抗体とがその他の要素を介して接続していてもよい。
－水不溶性繊維－
　前記水不溶性繊維は、前記構造物の基材として使用できる。
　前記水不溶性繊維の厚みの下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、製造の安定性の点から、０．０８ｍｍ以上が好ましく、０．１０ｍｍ以上がより好ましく、０．１２ｍｍ以上がさらに好ましい。
　前記水不溶性繊維の厚みの上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、目付の均一性の点から、０．５０ｍｍ以下が好ましく、０．４０ｍｍ以下がより好ましく、０．３０ｍｍ以下がさらに好ましい。
　前記水不溶性繊維の目付の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、製造の安定性の点から、５ｇ／ｍ２以上が好ましく、１０ｇ／ｍ２以上がより好ましい。
　前記水不溶性繊維の目付の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、水不溶性繊維の均一性の点から、１００ｇ／ｍ２以下が好ましく、９０ｇ／ｍ２以下がより好ましく、８０ｇ／ｍ２以下がさらに好ましく、７０ｇ／ｍ２以下が特に好ましい。
　前記水不溶性繊維の嵩密度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、デバイスへの装入後の水不溶性繊維構造の変化が少ない点から、５０ｋｇ／ｍ３以上が好ましく、６０ｋｇ／ｍ３以上がより好ましく、７０ｋｇ／ｍ３以上がさらに好ましい。
　前記水不溶性繊維の嵩密度の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、通液性能の点から、４００ｋｇ／ｍ３以下が好ましく、３５０ｋｇ／ｍ３以下がより好ましく、３００ｋｇ／ｍ３以下がさらに好ましい。
　なお、前記嵩密度とは、前記水不溶性繊維１ｍ３当たりの重さを測定した値を言う。
　前記水不溶性繊維の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、円形、四角形、三角形、俵型、などが挙げられる。
　前記水不溶性繊維の表面は、グラフト重合、ポリマーコーティング、アルカリ、酸等の薬品処理、プラズマ処理などで改質されていてもよい。
　前記グラフト重合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、電子線照射を行うグラフト重合法などが挙げられる。
　前記電子線照射を行うグラフト重合法には、予め水不溶性繊維に電子線を照射してラジカルを発生させた後、該発生種が発生した水不溶性繊維にラジカル重合性化合物を付与し、その後の後重合によりグラフト重合性化合物の重合を促進させる、いわゆる前照射法と、水不溶性繊維にラジカル重合性化合物を付与した後、これに電子線を照射してラジカルを発生させ、その後の後重合によりグラフト重合化合物の重合を促進させる、いわゆる同時照射法とがある。本発明では、前記前照射法と同時照射法のいずれも採用することができる。
　前記前照射法及び同時照射法のいずれの場合において、水不溶性繊維へラジカル重合性化合物を付与した後、後重合が終了するまでの間は、水不溶性繊維の表面にフィルムをラミネートしておくことが好ましい。これにより、ラジカル重合性化合物の揮散を防ぐことができ、均一にグラフト重合が開始され、かつ空気を遮断することで空気中の酸素によるラジカルの失活が抑制される。また、同時照射法の場合には、電子線照射時にも水不溶性繊維表面がフィルムによりシールされていて、水不溶性繊維とラジカル重合性化合物は空気中の酸素と遮断されるため、空気中の酸素による水不溶性繊維の酸化が起こりにくくなる。
　前記フィルムとしては、０．０１～０．２０ｍｍの厚みを有する高分子フィルムであって、使用する電子線の透過力に応じて、適切な厚さのものを使用する。
　前記フィルムの材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル系やポリオレフィン系などが挙げられるが、これらの中でも、ポリエチレンテレフタレートが好ましい。特に、同時照射法の場合には、電子線照射でポリマーラジカルの生成効率が低く、また酸素透過性の低いポリエチレンテレフタレートフィルムが好適である。
　なお、前記ポリエステル系とは、ポリエステル及びその誘導体を意味し、前記ポリオレフィン系とは、ポリオレフィン及びその誘導体を意味する。
　前記前照射法においては、先ず、水不溶性繊維に電子線を照射することにより、重合反応を誘発するラジカル（ポリマーラジカルなど）が生成する。電子線照射時の雰囲気温度は、低い温度の方がラジカルの生成効率が上がるが、通常の室温でもよい。
　前照射法の場合の前記電子線の照射条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、好ましくは照射雰囲気の酸素濃度を３００ｐｐｍ以下に設定した状態で、加速電圧１００～２０００キロボルト（以下「ｋＶ」と略記する。）、より好ましくは１２０～３００ｋＶ及び電流１～１００ｍＡの範囲において、水不溶性繊維の厚み、目標グラフト率などに応じて適宜決定する。
　また、前記電子線の照射線量は、目標グラフト率及び照射による水不溶性繊維の物性低下を考慮して適宜決定すればよく、通常１０～３００キログレイ（以下「ｋＧｙ」と略記する。）程度が適当であり、好ましくは１０～２００ｋＧｙである。照射線量が１０ｋＧｙ未満では充分なグラフト重合量に必要なラジカルの生成が起こらず、３００ｋＧｙを越えると、水不溶性繊維が放射線耐性のある高分子素材からなる場合においても主鎖の切断による物性低下が起こるので好ましくない。
　なお、前照射法の場合の照射雰囲気は、窒素ガスなど不活性ガス雰囲気が好ましいが、空気雰囲気でもよい。ただし、空気雰囲気では空気中の酸素により、水不溶性繊維が酸化される可能性がある。
　次いで、前記電子線照射後の水不溶性繊維に、ラジカル重合性化合物を付与する。例えば、窒素ガスを通気することで溶存酸素を除去されたラジカル重合性化合物溶液の槽に浸漬する、又は前記ラジカル重合性化合物溶液の槽を浸漬通過させることにより所定時間滞留させて、水不溶性繊維にラジカル重合性化合物を十分付与する。
　なお、本発明における「浸漬」とは、水不溶性繊維がラジカル重合性化合物溶液に接触することを意味する。よって、水不溶性繊維にラジカル重合性化合物を付与する方法としては、様々なコーティング方法を用いることができる。その中でも含浸コート、コンマダイレクトコート、コンマリバースコート、キスコート、グラビアコート等は効率良くコーティングできるため、好ましい。
　ラジカル重合性化合物を付与した水不溶性繊維を、前記溶液槽から取り出す。その際、水不溶性繊維の表面にフィルムをラミネートすることが好ましい。例えば、水不溶性繊維がシート状又は繊維状の場合には、２枚のフィルムの間に、ラジカル重合性化合物溶液を付与した水不溶性繊維を挟み、密着させる。ラジカル重合性化合物溶液を付与した水不溶性繊維にフィルムを密着させることで、ラジカル重合性化合物溶液の付与率を一定に制御でき、かつ水不溶性繊維に対してラジカル重合性化合物を均一に付与できる。また、フィルムをラミネートして密閉された空間内で、水不溶性繊維とラジカル重合性化合物とを反応させることで、グラフト反応がより促進される。
　なお、本発明における「ラミネート」とは、水不溶性繊維とフィルムを接触させることを意味する。
　前記溶液槽から取り出した水不溶性繊維を、所定温度の後重合槽に所定の時間滞留させることで、ラジカル重合性化合物のグラフト重合を促進させる（後重合）。このときの後重合温度は、０℃～１３０℃、より好ましくは４０℃～７０℃である。これにより、水不溶性繊維とラジカル重合性化合物のグラフト重合反応が促進される。その後、洗浄・乾燥することで、グラフト化繊維を得ることができる。なお、後重合雰囲気は、窒素ガスなど不活性ガス雰囲気が好ましいが、フィルムをラミネートした状態で後重合を行う場合には空気雰囲気でもよい。
　また、前記同時照射法の場合は、窒素ガスを通気することで溶存酸素を除去されたラジカル重合性化合物溶液の槽に浸漬する、又は前記槽を浸漬通過させることにより所定時間滞留させて、水不溶性繊維にラジカル重合性化合物を十分に付与する。その後、前記溶液槽から取り出し、電子線を照射する。溶液槽から取り出す際、水不溶性繊維の表面にフィルムをラミネートし、この状態で、電子線を照射することが好ましい。
　同時照射法の場合の加速電圧は、高分子素材の種類、ラジカル重合性化合物溶液を付与した水不溶性繊維及びラミネートしたフィルムの合計厚さ、目標グラフト率に応じて適宜決定すればよいが、通常、加速電圧１００～２０００ｋＶ程度が適当である。また、電子線の照射線量は前記前処理法の場合と同様でよい。電子線照射時の雰囲気は、窒素やヘリウムなど不活性ガス雰囲気が好ましいが、水不溶性繊維の表面にフィルムをラミネートした場合には、照射雰囲気によるグラフト重合への影響はないので、経済性を考慮して、空気中照射が適当である。
　電子線照射された水不溶性繊維は、前記前照射法の場合と同様にして、ラジカル重合性化合物の後重合を行う。その後、洗浄・乾燥することで、グラフト化繊維を得ることができる。なお、同時照射法においても、後重合雰囲気は、窒素ガスなど不活性ガス雰囲気が好ましいが、フィルムをラミネートした状態で後重合を行う場合には空気雰囲気でもよい。
　また、本発明で使用されるラジカル重合性化合物は、電子線照射により水不溶性繊維に生成したポリマーラジカルと結合を生じる化合物である。具体的には、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、メタクリルスルホン酸、スチレンスルホン酸などの酸性基を有する不飽和化合物やこれらのエステル、アクリルアミド、メタクリルアミドなどの不飽和カルボン酸アミド、末端にグリシジル基や水酸基を有する不飽和化合物、ビニルホスホネート等の不飽和有機燐酸エステル、第４アンモニウム塩、第３アンモニウム塩などの塩基性を有するメタクリル酸エステル、フルオロアクリレート、アクリロニトリルなどを挙げることができるが、これらに限られるものではない。これらは単独又は２種以上混合して用いることができる。２種類以上のラジカル重合性化合物を用いることで、グラフト鎖が少なくとも２種類以上のラジカル重合性化合物の共重合体からなる複合グラフト化繊維が得られる。
　これらラジカル重合性化合物の中でも、本発明においては、グラフト率の観点からアクリル系モノマーを用いることが好ましい。更に、アミノ基、水酸基、チオール基などを有するリガンドとの反応性の観点から、分子末端にカルボキシ基やエポキシ基を有するアクリル系モノマーが好ましく、より好ましくは、アクリル酸、メタクリル酸及びメタクリル酸グリシジル（以下「ＧＭＡ」と略記する）からなる群から選ばれる少なくとも１種である。
　なお、前記アクリル系とは、アクリル及びその誘導体を意味する。
　上記のラジカル重合性化合物は、水、低級アルコールのような有機溶剤又はこれらの混合溶液を溶媒とした希釈溶液であってもよい。この希釈溶液のラジカル重合性化合物の濃度は希望するグラフト率により変化するが、１～７０容量％で調製することができる。また、ホモポリマーの生成しやすいラジカル重合性化合物を用いる場合は、ラジカル重合性化合物の希釈溶液に、銅や鉄の金属塩を添加することで、ホモポリマーの生成を抑制してもよい。
　前記溶液中の前記ラジカル重合性化合物の濃度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１重量％以上が好ましく、２．５重量％以上がより好ましく、５重量％以上がさらに好ましく、１０重量％以上が特に好ましい。
　前記溶液中の前記ラジカル重合性化合物の濃度の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７０重量％以下が好ましく、６０重量％以下がより好ましく、５０重量％以下がさらに好ましく、４０重量％以下が特に好ましい。
　また、前記ラジカル重合性化合物溶液が溶剤を含むと、グラフト率が向上する。この場合において、溶媒中における乳化剤の濃度は０．１～５重量％の範囲となるように調整することが好ましい。
　前記乳化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えばポリソルベートが好ましく、前記ポリソルベートとしては、ポリソルベート２０、６０、６５、８０等が挙げられるが、これらの中でも親水性が高いポリソルベート２０がより好ましい。
　なお、ラジカル重合性化合物溶液はあらかじめ、窒素ガスなど不活性ガスを吹き込むことで、溶存酸素を除去することが望ましい。
　前記グラフト重合反応のグラフト率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５０％以上が好ましい。
　本発明で前記「グラフト率」とは、グラフト反応前の水不溶性繊維乾燥重量（Ｗ１）とグラフト反応後のグラフト化繊維乾燥重量（Ｗ２）から以下のように算出した値である。
　グラフト率＝〔（Ｗ２－Ｗ１）／Ｗ１〕×１００（％）
　前記水不溶性繊維の材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリオレフィン系、ポリプロピレン、無水マレイン酸ポリプロピレン、変性ポリプロピレン、ポリエチレン、セルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、エチルセルロース、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリエステル系、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリスチレン、臭素化ポリスチレン、ポリアルキル（メタ）アクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリクロロプレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリブタジエン、ブタジエン－アクリロニトリル共重合体、スチレン－ブタジエン共重合体、エチレン－ビニルアルコール共重合体、アラミド、ガラス、ナイロン、レーヨンなどが挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、電子線グラフト重合の反応性が良好な点から、ポリオレフィン系、又はセルロース系が好ましく、ポリオレフィン系がより好ましく、ポリプロピレンがさらに好ましい。
　なお、前記ポリオレフィン系とは、ポリオレフィン及びその誘導体を意味し、前記ポリエステル系とは、ポリエステル及びその誘導体を意味し、前記セルロース系とは、セルロース及びその誘導体を意味する。
　前記水不溶性繊維の平均繊維直径の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、良好な引張強度を有する点、もしくは生産性の点から、０．３μｍ以上が好ましく、０．４μｍ以上がより好ましく、０．５μｍ以上がさらに好ましい。
　前記水不溶性繊維の平均繊維直径の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、精製性能が高い点から、１５μｍ以下が好ましく、１０μｍ以下がより好ましく、５μｍ以下がさらに好ましく、３μｍ以下が特に好ましい。平均繊維直径が１５μｍを超えるものは、精製性能が低いため好ましくない。
　前記水不溶性繊維の平均孔径の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、良好な通液性能を有する点、もしくは生産性の点から、１．０μｍ以上が好ましく、１．０μｍ超がより好ましく、１．５μｍ以上がさらに好ましく、２．０μｍ以上がよりさらに好ましく、２．５μｍ以上が特に好ましく、３．０μｍ以上が最も好ましい。
　前記水不溶性繊維の平均孔径の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、精製性能が高い点から、５０μｍ以下が好ましく、４０μｍ以下がより好ましく、３５μｍ以下がさらに好ましく、３０μｍ以下が特に好ましい。
　前記水不溶性繊維の平均孔径は、以下のとおり測定する。
　前記水不溶性繊維の平均孔径は、パームポロメーター（Ｐｏｒｏｕｓ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　Ｉｎｃ．（ＰＭＩ社）製、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｆｌｏｗ　Ｐｏｒｏｍｅｔｅｒ　ＣＦＰ－１２００ＡＥＸＬＣＳＨＪ）を用いて測定したミーン・フロー・ポアサイズを平均孔径とする。前記平均孔径の測定、算出は、測定ソフトウェア（Ａｕｔｏｆｉｌｌｉｎｇ　Ｐｅｒｍ－Ｐｏｒｏｍｅｔｅｒ　ｖ６．７３．９０）及び解析ソフトウェア（ＣＡＰＲＥＰ　ｖ６．７１．５１）を用いる。
　測定する水不溶性繊維は直径２６ｍｍの円形に打ち抜き、Ｇａｌｗｉｃｋ（米国登録商標）浸透液（ＰＭＩ社製、表面張力１５．９Ｄｙｎｅｓ／ｃｍ）に浸漬後、デシケーターに入れて真空ポンプで１分程度減圧して空気を留去し、浸透液を充填する。この水不溶性繊維を装置付属の試料台（Φ２６）にセットし、浸透液に含侵させたサンプルに対して空気の流量を２０００００ｃｃ／ｍまで徐々に増加させ、その後、乾燥状態で０ｋＰａの圧力となるまで空気の流量を徐々に減少させる。その際の圧力をプロットし、バブルポイント法にて平均流量径（平均孔径）を算出する。測定条件を下記のとおりとする。
Ｍａｘｆｌｏｗ　２０００００（ｃｃ／ｍ）
Ｂｕｂｌｆｌｏｗ　２．００（ｃｃ／ｍ）
Ｆ／ＰＴ　２００（ｏｌｄｂｕｂｌｔｉｍｅ）
Ｍｉｎｂｐｒｅｓｓ　０（ｋＰａ）
Ｚｅｒｏｔｉｍｅ　１．０（ｓｅｃ）
Ｖ２ｉｎｃｒ　５（ｃｔｓ＊３）
Ｐｒｅｇｉｎｃ　０．３
Ｐｕｌｓｅｄｅｌａｙ　２
Ｍａｘｐｒｅｓ　１３７８．９４６６（ｋＰａ）
Ｐｕｌｓｅｗｉｄｔｈ　０．２（ｓｅｃ）
Ｍｉｎｅｑｔｉｍｅ　３０（ｓｅｃ）
Ｐｒｅｓｓｌｅｗ　１０（ｃｔｓ＊３）
Ｆｌｏｗｓｌｅｗ　５０（ｃｔｓ＊３）
Ｅｑｕｉｔｅｒ　５（０．１ｓｅｃ）
Ａｖｅｉｔｅｒ　２０（０．１ｓｅｃ）
Ｍａｘｐｄｉｆ　０．６９（ｋＰａ）
Ｍａｘｆｄｉｆ　５０（ｃｃ／ｍ）
　前記水不溶性繊維のガーレ通気度（３００ｍＬの空気全量の通過に要する時間（秒））としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、６０秒以下が好ましく、３０秒以下がより好ましく、１０秒以下がさらに好ましく、８秒以下がよりさらに好ましく、５秒以下が特に好ましく、２．５秒以下が最も好ましい。
　前記ガーレ通気度は、ＪＩＳ　Ｌ１０９６：２０１０（８．２６．２　Ｂ法（ガーレ形法））に準拠して、面積６４２ｍｍ２の円形の通気面に水不溶性繊維を設置し、高さ２５４ｍｍ、外径７６．２ｍｍ、内径７４ｍｍ、質量５６７ｇの円筒を用い、水不溶性繊維に空気３００ｍＬを通過させ、３００ｍＬの空気全量の通過に要する時間（通気時間：秒）を測定することで得られる値である。この際、水不溶性繊維は孔径に応じて１～３０枚重ね合わせ、水準ごとに３回ずつ測定し、１枚あたりの平均値を算出する。
　前記水不溶性繊維としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、不織布であっても、織布もしくは編物であってもよいが、製造工程の簡略化の点から、不織布が好ましい。
　前記不織布の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、湿式法、乾式法、メルトブロー法、エレクトロスピニング法、フラッシュ紡糸法、抄造法、スパンボンド法、サーマルボンド法、ケミカルボンド法、ニードルパンチ法、スパンレース法（水流絡合法）、ステッチボンド法、スチームジェット法などが挙げられる。これらの中でも、極細繊維が得られる点から、メルトブロー法、エレクトロスピニング法、フラッシュ紡糸法、抄造法などが好ましい。
　前記メルトブロー法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、押出機で溶融した熱可塑性樹脂をメルトブローダイから高温・高速の空気流で糸状に吹き出し、繊維状に延伸された樹脂をコンベアー上で集積することで、繊維同士の絡み合い、及び融着が起こりノーバインダーの自己接着型極細繊維の不織布を得る方法などが挙げられる。この際、樹脂粘度、溶融温度、吐出量、熱風温度、風圧、ＤＣＤ（紡糸口金と表面からコンベアーまでの距離）などを調整することにより、前記不織布の繊維直径、目付、繊維配向、繊維分散性を制御することができる。更に、熱プレス加工やテンター加工等により、不織布の厚み、平均孔径の制御を行うことが可能である。
－低分子化抗体－
　「抗体」は免疫グロブリンの機能に着目した、一般的な名称である。免疫グロブリンは、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、この特定の分子（抗原）に特異的に結合する機能と、他の生体分子や細胞と協同して抗原を有する因子を無毒化・除去する機能を有する。
　全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造からなり、“Ｙ”字型の４本鎖構造（軽鎖・重鎖の２本のポリペプチド鎖が２本ずつ）を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）には、λ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（以下、「ＩｇＧ」と略記する場合がある）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
　抗体の“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク質分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域（断片）と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分（ドメイン）は、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため、可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１～ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。
　ラクダ科動物由来抗体やサメなどの魚類由来抗体の中には、軽鎖が存在しない重鎖のみで構成される抗体である、重鎖抗体が存在する。ラクダ科動物由来重鎖抗体は、軽鎖を有する通常のＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１）と区別され、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３と呼ばれる。一方、魚類由来の重鎖抗体は、ＩｇＮＡＲ（ｎｅｗ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と呼ばれる。
　本発明における低分子化抗体とは、全長抗体（ｗｈｏｌｅ　ａｔｉｂｏｄｙ、例えばｗｈｏｌｅ　ＩｇＧ等）の一部分が欠損している抗体断片であって、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。
　本発明における低分子化抗体は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有さないことが好ましい。
　本発明における低分子化抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のいずれか、又は両方を含むことが好ましい。ＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列は、付加、欠失及び／又は置換を含むことができる。さらに抗原に結合する限り、ＶＨ及びＶＬのいずれか、又は両方の一部を欠損させることもできる。
　前記低分子化抗体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ラクダ科動物由来重鎖抗体の可変領域（ＶＨＨ）、魚類由来重鎖抗体の可変領域（Ｖ－ＮＡＲ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｍｉｎｉｂｏｄｙを含むものなどが挙げられる。これらの中でも、安定性、及び産生効率の点から、ラクダ科動物由来重鎖抗体の可変領域（ＶＨＨ）、及び一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含むものが好ましい。
　前記ラクダ科動物由来の重鎖抗体の可変領域（ＶＨＨ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記吸着対象を免疫したラクダ科動物の血清から精製したもの、宿主細胞にＶＨＨ遺伝子を発現させて作製したもの、アミノ酸配列に基づいて化学合成したものなどが挙げられる。
　また、前記ＶＨＨは、市販品を利用することができる。
　前記ラクダ科動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーニャ、グアナコなどが挙げられる。
　ＶＨＨ遺伝子を発現させる前記宿主細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌などの細菌、酵母などの真菌、動物細胞、植物細胞などが挙げられる。
　前記ラクダ科動物に前記吸着対象を免疫する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、国際公開第２０２０／０６７４１８号パンフレットに記載の方法などが挙げられる。
　宿主細胞にＶＨＨ遺伝子を発現させて作製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、国際公開第２０２０／０６７４１８号パンフレット、及び特開２０１５－１１９６３７号公報に記載の方法などが挙げられる。
　前記ＶＨＨの市販品としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えばＴｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）　Ｂｉｏｔｉｎ　Ａｎｔｉ－ＨＳＡ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，　ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）　Ｂｉｏｔｉｎ　Ａｎｔｉ－ＩｇＧ－Ｆｃ　（Ｈｕｍａｎ）　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，　ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）　Ｂｉｏｔｉｎ　Ａｎｔｉ－ＡＡＶＸ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅなどが挙げられる。
　前記一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、抗体のＶＨとＶＬを連結することにより得られる。ｓｃＦｖにおいて、ＶＨとＶＬは、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ　１９８８　８５：５８７９）。当該ペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば、３から２５残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。
　前記ｓｃＦｖとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、宿主細胞にｓｃＦｖ遺伝子を発現させて作製したもの、アミノ酸配列に基づいて化学合成したもの、配列既知の抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域をリンカーでつなぎ合わせものなどが挙げられる。
　また、前記ｓｃＦｖは、市販品を利用することができる。
　ｓｃＦｖ遺伝子を発現させる前記宿主細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌などの細菌、酵母などの真菌、動物細胞、植物細胞などが挙げられる。
　本発明における低分子化抗体は、シングルドメイン抗体を含むことが好ましい。
　前記シングルドメイン抗体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ラクダ科動物由来の重鎖抗体の可変領域（ＶＨＨ）を含むものが好ましい。
　本発明における低分子化抗体は、キメラ化やヒト化されていてもよい。
　前記低分子化抗体の分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１３０，０００以下が好ましく、１００，０００以下がより好ましく、５０，０００以下がさらに好ましく、３０，０００以下が特に好ましく、２０，０００以下が最も好ましい。
　前記低分子化抗体の吸着対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、核酸、抗体、酵素、ホルモン、及びそれらの複合体や代謝産物などが挙げられる。これらの中でも、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクターが好ましい。
　前記ウイルス様粒子は、主にカプシドを構成するウイルス外殻タンパク質の全部又は一部であり、核酸を含まないため感染の懸念が無い一方で、免疫反応を惹起するため、ワクチンの有効成分として用いることができる。
　前記ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、エンテロウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ヒトパピローマウイルス、ロタウイルス、コクサッキーウイルス、サポウイルス、ノロウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、アストロウイルス、サーコウイルス、シミアンウイルス等のノンエンベロープウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、単純ヘルペスウイルス等のヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、バキュロウイルス、インフルエンザウイルス、白血病ウイルス、シンドビスウイル等のエンベロープウイルス、及びこれらのウイルスのカプシド、又はこれらの遺伝子を含むウイルスベクターなどが挙げられる。これらの中でも、アデノ随伴ウイルス、又はアデノ随伴ウイルスのカプシド、若しくはアデノ随伴ウイルス遺伝子を含むベクターが好ましい。
　前記アデノ随伴ウイルスは、カプシド中に直鎖状一本鎖ＤＮＡを含むパルボウイルス科に属するウイルスである。前記アデノ随伴ウイルスの血清型としては、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ３）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）及び１０型ＡＡＶ（ＡＡＶ１０）などが知られている。
　前記低分子化抗体の吸着対象が、前記アデノ随伴ウイルスである場合には、前記低分子化抗体として、国際公開第２０１８／１０４５２８号パンフレットに記載されている公知のＶＨＨを利用することができる。
　また、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ　Ａｎｔｉ－ＡＡＶＸ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅなどの市販品を利用することもできる。
　加えて、ＧｅｎｅＴｅｘ社のＩｎｔａｃｔ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　［Ａ２０］抗体などのＩｇＧ抗体を断片化して利用することができる。
　ｓｃＦｖなどの低分子化抗体を配列既知の抗体から作製する際は、公共のデータベースから取得することができ、例えばプロテインデータバンクに登録されているＡＡＶ２に結合する抗体の重鎖配列（ＰＤＢ：３Ｊ１Ｓ＿Ｈ）及び軽鎖配列（ＰＤＢ：３Ｊ１Ｓ＿Ｌ）などを利用することができる。
－－ＡＡＶ結合容量－－
　前記構造物のＡＡＶ結合容量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１．０×１０１２ｖｇ／ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎ以上が好ましく、５．０×１０１２ｖｇ／ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎ以上がより好ましく、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎ以上がさらに好ましく、１．５×１０１３ｖｇ／ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎ以上が特に好ましい。なお、結合容量の算出方法としては、負荷量からフロースルー画分への溶出量を差し引いた総吸着量に基づく方法と、吸着後に溶出工程にて回収される総量に基づく方法がある。本発明では、後者の総回収量をもとに結合容量を算出する。
　前記構造物のＡＡＶ結合容量は、以下の方法により測定する。
　ＡＡＶ粗精製液を前記構造物を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。
下記Ａ～Ｆ液を調製し、使用前に０．２μｍフィルターでろ過した。
Ａ液：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ８．０
Ｂ液：クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ２．１
Ｃ液：ＮａＯＨ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｄ液：リン酸（１２０ｍｍｏｌ／Ｌ），酢酸（１６７ｍｍｏｌ／Ｌ），ベンジルアルコール（２．２％ｖ／ｖ）
Ｅ液：２０％エタノール
Ｆ液：ＡＡＶ粗精製液をＡ液で希釈し、ｐＨ８．０に調製した溶液（２×１０１３ｖｇ程度）
　カラムをＡＫＴＡ　Ａｖａｎｔ　２５に接続し、流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎに設定し、純水で洗浄、Ａ液で平衡化する。その後、Ｆ液を通液し、ＡＡＶをカラム担体に保持させた後、Ａ液で洗浄し、Ｂ液にてＡＡＶを溶出する。溶出終了後、カラムはＡ液、Ｃ液、Ａ液、Ｄ液の順に洗浄する。各フラクションに含まれるＡＡＶ量をｑＰＣＲにて定量し、溶出工程に含まれるＡＡＶ量から結合容量を算出する。
－－リガンド密度－－
　前記構造物のリガンド密度（低分子化抗体密度）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０１ｍｇ／ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎ以上、１００ｍｇ／ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎ以下が好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎ以上、５０ｍｇ／ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎ以下がより好ましく、１ｍｇ／ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎ以上、１０ｍｇ／ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎ以下がさらに好ましい。
　前記リガンド密度は、以下のとおり測定する。
　水不溶性繊維へのリガンド固定化の際のろ液を回収し、吸光度を測定することにより水不溶性繊維に固定化されたリガンドのリガンド密度を算出する。
－その他の要素－
　前記その他の要素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スペーサーなどが挙げられる。
－－スペーサー－－
　前記スペーサーを含む構造物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記低分子化抗体が、スペーサーを介して前記水不溶性繊維に接続されている構造物などが挙げられる。
　前記スペーサーが有する官能基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アミノ基、ヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基などが挙げられる。これらの中でも、安定性、反応性、リガンドとの接続の容易さの点からエポキシ基が好ましい。
　前記スペーサーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリマー、モノマー、ダイマー、トライマー、テトラマーを含むものなどが挙げられる。これらの中でも、ポリマーを含むものが好ましい。前記ポリマーは、コポリマーであってもよい。
　前記ポリマーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、親水性ポリマー、疎水性ポリマーを含むものなどが挙げられる。これらの中でも、水系溶媒での取り扱いが可能な点、タンパク質とスペーサーとの非特異的な疎水性作用を抑制する点から、親水性ポリマーを含むものが好ましい。
　前記親水性ポリマーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリアミン、多糖類を含むものなどが挙げられる。
　前記ポリアミンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリリジン、エチレンジアミン、１，２－プロパンジアミン、１，６－ヘキサメチレンジアミン、ピペラジン、２，５－ジメチルピペラジン、イソホロンジアミン、４，４’－ジシクロヘキシルメタンジアミン、１，４－シクロヘキサンジアミン等のジアミン類；ジエチレントリアミン、ジプロピレントリアミン、トリエチレンテトラミン等のポリアミン類；ヒドラジン、Ｎ，Ｎ’－ジメチルヒドラジン、１，６－ヘキサメチレンビスヒドラジン等のヒドラジン類；コハク酸ジヒドラジッド、アジピン酸ジヒドラジド、グルタル酸ジヒドラジド、セバシン酸ジヒドラジド、イソフタル酸ジヒドラジド等のジヒドラジド類などが挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、分子量の異なる分子を容易に入手可能である点から、ポリエチレンイミン、又はポリアリルアミンを含むものが好ましい。
　前記多糖類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、キトサン、キチン、セルロース、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、ヒアルロン酸、ペクチン、キシログルカン、グルコマンナン、デンプン、グリコーゲンなどが挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、アミノ基を含む点から、キトサンが好ましい。
　前記ポリマーのモル質量の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、生体粒子の吸着性の点から、５００ｇ／ｍｏｌ以上が好ましく、５０００ｇ／ｍｏｌ以上がより好ましく、１０，０００ｇ／ｍｏｌ以上がさらに好ましく、６０，０００ｇ／ｍｏｌ以上が特に好ましい。
　前記ポリマーのモル質量の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、生体粒子の吸着性の点から、２，０００，０００ｇ／ｍｏｌ以下が好ましく、１，０００，０００ｇ／ｍｏｌ以下がより好ましく、５００，０００ｇ／ｍｏｌ以下がさらに好ましく、２００，０００ｇ／ｍｏｌ以下が特に好ましい。
　前記ポリマーは、分岐鎖を有するポリマーであっても、線状ポリマーであってもよいが、生体粒子の吸着性の点から、分岐鎖を有するポリマーが好ましい。
　（構造物の製造方法）
　前記構造物の製造方法は、水不溶性繊維と、低分子化抗体と、を接続する工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
　前記水不溶性繊維、及び前記低分子化抗体は、前述のとおりである。
　前記水不溶性繊維と、前記低分子化抗体との接続としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記水不溶性繊維に前記低分子化抗体を加え、転倒混和する方法、前記水不溶性繊維にその他の要素を加え、転倒混和し、さらに、低分子化抗体を加え転倒混和する方法などが挙げられる。
　前記転倒混和の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、るが、１時間以上から４８時間以下が好ましく、２時間以上から４８時間以下がより好ましく、３時間以上から２４時間以下がさらに好ましく、８時間以上２４時間以下が特に好ましい。
　前記スペーサーを含む構造物の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スペーサーの、一端に水不溶性繊維を接続し、他端に低分子化抗体を接続する工程などが挙げられる。
　前記スペーサー、前記水不溶性繊維、及び前記低分子化抗体は、前述のとおりである。
　ここで、スペーサーの、一端への水不溶性繊維の接続と、スペーサーの、他端への低分子化抗体の接続の順序は問わないが、接続のための反応制御が容易であるという点から、スペーサーの、一端への水不溶性繊維の接続の後、スペーサーの、他端への低分子化抗体の接続を行うことが好ましい。
　前記スペーサーの、一端への水不溶性繊維の接続としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水不溶性繊維にスペーサー溶液を加え、転倒混和する方法などが挙げられる。
　前記転倒混和の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、るが、１時間以上から４８時間以下が好ましく、２時間以上から４８時間以下がより好ましく、３時間以上から２４時間以下がさらに好ましく、８時間以上２４時間以下が特に好ましい。
　前記スペーサーの、他端への低分子化抗体の接続としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水不溶性繊維に低分子化抗体を加え、転倒混和する方法などが挙げられる。
　前記転倒混和の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、るが、１時間以上から４８時間以下が好ましく、２時間以上から４８時間以下がより好ましく、３時間以上から２４時間以下がさらに好ましく、８時間以上２４時間以下が特に好ましい。
　本発明の構造物は、目的に応じて加工することができ、その形状は特に限定されない。例えば、平膜状、中空糸状、プリーツ状、ロール状、スパイラル状、チューブラー状等の形状を選択することができる。これらの加工された構造物は、単体で用いてもよいし、積層してもよく、直列及び並列に接続して使用してもよい。
　前記構造物を充填するためのデバイスの形状は特に限定されず、円盤状、円筒状、板状などを選択することができる。均一な通液を実現する観点からは、円盤状及び円筒状が好ましい。
　加工後の構造物は、例えば、生体粒子の精製をするためのカラム、生体粒子の吸着及び除去を目的としたフィルター及びマスクなどとして使用することができる。フィルターとしては、例えば、血液製剤などのバイオ医薬品の製造工程でのウイルス除去、ＨＥＰＡ（Ｈｉｇｈ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ　Ａｉｒ）などのフィルターとして使用できる。
　（吸着体）
　前記吸着体は、前述の構造物を有し、さらにその他の構成要素を有することができる。
　前記吸着体の吸着対象は、前述の低分子化抗体の吸着対象のとおりである。
　（生体粒子の精製方法）
　前記生体粒子の精製方法は、前述の構造物、又は前述の吸着体を用いた、アフィニティークロマトグラフィー精製法により分離する工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
　前記生体粒子の精製方法の精製対象は、前述の低分子化抗体の吸着対象のとおりである。
　前記精製としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記構造物、又は前記吸着体を充填したカラムを用いた精製などが挙げられる。
　前記カラムの材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス、ポリプロピレンやアクリルなどの樹脂、ステンレスなどの金属などが挙げられる。
　前記生体粒子の精製法は基本的に、一般に知られているタンパク質リガンドを含むアフィニティーカラムを用いた精製法と、同様の手順で達成することができる（例えば、市販品として存在するプロテインＡカラムなどが挙げられる。Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａ　２００７　１１６０：４４－５５）。
　すなわち、対象の生体粒子を含有する緩衝液を中性となるように調整した後、該溶液を本発明の構造物、又は吸着体を充填したアフィニティーカラムに通過させ、対象の生体粒子を吸着させる。
　次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望の生体粒子はカラム内の本発明の構造物又は吸着体に吸着されている。
　次いで、適切なｐＨに調整した酸性、もしくは塩基性の緩衝液（該構造物もしくは該吸着体からの解離を促進する物質を含む場合もある）をカラムに通液し、所望の生体粒子を溶出することにより、高純度な精製が達成される。
　本発明の構造物、又は吸着体は、リガンド（低分子化抗体）や担体の基材（水不溶性繊維）が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、又は、強アルカリ性の純粋な緩衝液（適当な変性剤、又は、有機溶剤を含む溶液の場合もある）を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。
－その他の工程－
　前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記アフィニティークロマトグラフィー精製法により分離する工程前、又は前記アフィニティークロマトグラフィー精製法により分離する工程後の、イオン交換クロマトグラフィー精製工程、超遠心精製工程等のその他の精製工程などが挙げられる。
　前記イオン交換クロマトグラフィー精製工程は、電荷を帯びたイオン交換リガンドとの静電相互作用に基づき、混合物を分離する工程である。
　また、前記超遠心精製工程は、混合物を遠心することで分子量の近い物質ごとに分離する工程である。
　前記その他の精製方法と比較してアフィニティークロマトグラフィー精製法は、対象の生体粒子への特異的な結合能を有するリガンドを利用するため、培養液など不純物を多く含む混合物から目的の生体粒子を高純度で単離しやすいという利点がある。
－生体粒子のフロースルー（ＦＴ）への溶出率、溶出工程の生体粒子回収率、及び洗浄工程の生体粒子残存率－
　前記生体粒子の精製方法における生体粒子のフロースルー（ＦＴ）への溶出率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１００％未満が好ましく、５０％以下がより好ましく、２０％以下がさらに好ましく、０％が特に好ましい。
　前記生体粒子の精製方法における溶出工程の生体粒子回収率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５％以上が好ましく、１０％以上がより好ましく、５０％以上がさらに好ましく、７０％以上が特に好ましい。
　前記生体粒子の精製方法における洗浄工程の生体粒子残存率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３０％以下が好ましく、２０％以下がより好ましく１０％以下がさらに好ましく、５％以下が特に好ましい。
　生体粒子のフロースルー（ＦＴ）への溶出率、溶出工程の生体粒子回収率、及び洗浄工程の生体粒子残存率は、以下の方法により測定する。
　ＡＡＶ前処理液を不織布担体によるクロマトグラフィーにより精製する。
　下記Ａ～Ｆ液を調製し、使用前に０．２μｍフィルターでろ過する。
Ａ液：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ８．０
Ｂ液：クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ２．１
Ｃ液：ＮａＯＨ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｄ液：リン酸（１２０ｍｍｏｌ／Ｌ），酢酸（１６７ｍｍｏｌ／Ｌ），ベンジルアルコール（２．２％ｖ／ｖ）
Ｅ液：２０％エタノール
Ｆ液：ＡＡＶ前処理液をＡ液で希釈し、ｐＨ８．０に調製した溶液（１×１０１２ｖｇ程度）
　担体を充填したカラムをＡＫＴＡ　Ａｖａｎｔ　２５に接続し、流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎに設定し、純水で洗浄、Ａ液で平衡化する。その後、Ｆ液を通液し、ＡＡＶをカラム担体に保持させた後、Ａ液で洗浄し、Ｂ液にてＡＡＶを溶出する。溶出終了後、カラムはＡ液、Ｃ液、Ａ液、Ｄ液の順で洗浄する。
　各フラクションに含まれるＡＡＶ量をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３　リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）にて定量し、全回収液に含まれるＡＡＶ量に対する溶出ピークのＡＡＶ量を回収率として算出する。また、通液したＦ液の総ＡＡＶ量に対するフロースルー（ＦＴ）溶液中のＡＡＶ量を溶出率として算出し、全回収液に含まれるＡＡＶ量に対するアルカリ洗浄工程のＡＡＶ量を残存率として算出する。
　以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
＜製造例１：水不溶性繊維（不織布１）の作製＞
　ポリプロピレンを材料として、メルトブロー法により平均繊維径１．１９μｍ、目付３０ｇ／ｍ２、厚さ０．１７ｍｍの不織布を作製した。ラジカル重合性化合物溶液はＧＭＡ／ポリソルベート２０／水を重量％で１０／２／８８となるように混合し、窒素ガスを通気することで溶存酸素を除去した。作製した不織布に加速電圧２５０ｋＶ、照射線量５０ｋＧｙとなる条件で、窒素ガス雰囲気下、室温で電子線照射を行った。電子線照射後の不織布をラジカル重合性化合物溶液に浸漬し、反応槽にて５０℃で４０分間過熱して重合反応を促進させた。その後、常温の水で不織布を洗浄した後、乾燥し、グラフト率５０％の水不溶性繊維（不織布１）を得た。
　下記のとおり、不織布の平均繊維径、及び平均孔径を測定し、グラフト重合前後の不織布について、表１にまとめた。グラフト重合後の結果については、表２にも示した。
　不織布の平均繊維径は、走査電子顕微鏡観察をもとに求めた。得られた電子顕微鏡画像から、無作為に選択した１００本以上の繊維の直径を計測した。１００以上の計測値の数平均値を平均繊維直径とした。また、グラフト率は、グラフト反応前の不織布（Ｗ１）とグラフト反応後の不織布重量（Ｗ２）を測定し以下のように算出した値である。
　グラフト率＝〔（Ｗ２－Ｗ１）／Ｗ１〕×１００（％）
　不織布の平均孔径は、パームポロメーター（Ｐｏｒｏｕｓ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　Ｉｎｃ．（ＰＭＩ社）製、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｆｌｏｗ　Ｐｏｒｏｍｅｔｅｒ　ＣＦＰ－１２００ＡＥＸＬＣＳＨＪ）を用いて測定したミーン・フロー・ポアサイズを平均孔径とした。平均孔径の測定、算出にあたっては、測定ソフトウェア（Ａｕｔｏｆｉｌｌｉｎｇ　Ｐｅｒｍ－Ｐｏｒｏｍｅｔｅｒ　ｖ６．７３．９０）および解析ソフトウェア（ＣＡＰＲＥＰ　ｖ６．７１．５１）を用いた。
　測定する不織布は直径２６ｍｍの円形に打ち抜き、Ｇａｌｗｉｃｋ（米国登録商標）浸透液（ＰＭＩ社製、表面張力１５．９Ｄｙｎｅｓ／ｃｍ）に浸漬後、デシケーターに入れて真空ポンプで１分程度減圧して空気を留去し、浸透液を充填した。この不織布を装置付属の試料台（Φ２６）にセットし、浸透液に含侵させたサンプルに対して空気の流量を２０００００ｃｃ／ｍまで徐々に増加させ、その後、乾燥状態で０ｋＰａの圧力となるまで空気の流量を徐々に減少させた。その際の圧力をプロットし、バブルポイント法にて平均流量径（平均孔径）を算出した。測定条件を下記に示す。
Ｍａｘｆｌｏｗ　２０００００（ｃｃ／ｍ）
Ｂｕｂｌｆｌｏｗ　２．００（ｃｃ／ｍ）
Ｆ／ＰＴ　２００（ｏｌｄｂｕｂｌｔｉｍｅ）
Ｍｉｎｂｐｒｅｓｓ　０（ｋＰａ）
Ｚｅｒｏｔｉｍｅ　１．０（ｓｅｃ）
Ｖ２ｉｎｃｒ　５（ｃｔｓ＊３）
Ｐｒｅｇｉｎｃ　０．３
Ｐｕｌｓｅｄｅｌａｙ　２
Ｍａｘｐｒｅｓ　１３７８．９４６６（ｋＰａ）
Ｐｕｌｓｅｗｉｄｔｈ　０．２（ｓｅｃ）
Ｍｉｎｅｑｔｉｍｅ　３０（ｓｅｃ）
Ｐｒｅｓｓｌｅｗ　１０（ｃｔｓ＊３）
Ｆｌｏｗｓｌｅｗ　５０（ｃｔｓ＊３）
Ｅｑｕｉｔｅｒ　５（０．１ｓｅｃ）
Ａｖｅｉｔｅｒ　２０（０．１ｓｅｃ）
Ｍａｘｐｄｉｆ　０．６９（ｋＰａ）
Ｍａｘｆｄｉｆ　５０（ｃｃ／ｍ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜製造例２：水不溶性繊維（不織布２）の作製＞
　ポリプロピレンを材料として、平均繊維径０．５６μｍ、目付１５ｇ／ｍ２、厚さ０．１１ｍｍの不織布を作製した。ＧＭＡ／ポリソルベート２０／水を重量％で８／２／９０となるように混合したラジカル重合性化合物溶液を用いて、製造例１と同様に電子線グラフト重合を行い、グラフト率７０％の水不溶性繊維（不織布２）を得た。
　製造例１と同様にして、不織布の平均繊維径、及び平均孔径を測定し、表２に示した。
＜製造例３：水不溶性繊維（不織布３）の作製＞
　ポリプロピレンを材料として、平均繊維径０．５６μｍ、目付１５ｇ／ｍ２、厚さ０．１１ｍｍの不織布を作製した。ＧＭＡ／ポリソルベート２０／水を重量％で２．４／２／９５．６となるように混合したラジカル重合性化合物溶液を用いて、製造例１と同様に電子線グラフト重合を行い、グラフト率２０％の水不溶性繊維（不織布３）を得た。
　製造例１と同様にして、不織布の平均繊維径、及び平均孔径を測定し、表２に示した。
＜製造例４：水不溶性繊維（不織布４）の作製＞
　ポリプロピレンを材料として、平均繊維径０．５６μｍ、目付１５ｇ／ｍ２、厚さ０．１１ｍｍの不織布を作製した。ラジカル重合性化合物溶液はアクリル酸（ＡＡ）／ネオエタノールを重量％で２０／８０となるように混合し、窒素ガスを通気することで溶存酸素を除去した。作製した不織布に加速電圧２００ｋＶ、照射線量１０ｋＧｙとなる条件で、窒素ガス雰囲気下、室温で電子線照射を行った。電子線照射後の不織布をラジカル重合性化合物溶液に浸漬し、反応槽にて５０℃で３０分間過熱して重合反応を促進させた。その後、常温の水で不織布を洗浄した後、乾燥し、グラフト率１２％の水不溶性繊維（不織布４）を得た。
　製造例１と同様にして、不織布の平均繊維径、及び平均孔径を測定し、表２に示した。
＜製造例５：水不溶性繊維（不織布５）の作製＞
　ポリプロピレンを材料として、メルトブロー法により平均繊維径３μｍ、目付３０ｇ／ｍ２、厚さ０．２８ｍｍの不織布を作製した。ＧＭＡ／ポリソルベート２０／水を重量％で１０／２／８８となるように混合したラジカル重合性化合物溶液を用いて、製造例１と同様に電子線グラフト重合を行い、グラフト率５０％の水不溶性繊維（不織布５）を得た。
　製造例１と同様にして、不織布の平均繊維径、及び平均孔径を測定し、表２に示した。
＜水不溶性繊維（不織布６）＞
　セルロース不織布（以下不織布６と表記、５０５ＳＷＪＤ、フタムラ化学社製）について、製造例１と同様にして、不織布の平均繊維径、及び平均孔径を測定し、表２に示した。
　製造例２、３及び５で作製した不織布２、３及び５並びに不織布６について、ガーレ式デンソメーター（ＴＯＹＯＳＥＩＫＩ社製）を用いてガーレ通気度を測定した。
　前記ガーレ通気度は、ＪＩＳ　Ｌ１０９６：２０１０（８．２６．２　Ｂ法（ガーレ形法））に準拠して、面積６４２ｍｍ２の円形の通気面に水不溶性繊維を設置し、高さ２５４ｍｍ、外径７６．２ｍｍ、内径７４ｍｍ、質量５６７ｇの円筒を用い、各不織布に空気３００ｍＬを通過させ、３００ｍＬの空気全量の通過に要する時間（通気時間：秒）を測定した。この際、不織布２、３及び５は、５枚、１０枚、１５枚重ねた水準で各３回ずつ測定、不織布６は５枚、１０枚、１５枚、３０枚重ねた水準で各３回ずつ測定し、１枚あたりの平均値を算出した。結果を表３に示した。
　前記通気時間は、孔の面積、すなわち平均孔径の２乗に反比例すると考えられる。そこで、通気時間の平方根の逆数を取り、パームポロメーターで算出した平均孔径との相関を比較した。結果を表３及び図１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　より孔径の小さな基材として、平均孔径０．２μｍの再生セルロースメンブレン（ｃｙｔｉｖａ社製、製品コード１０４１０３１４、以下メンブレン１と表記）、平均孔径０．４５μｍの再生セルロースメンブレン（ｃｙｔｉｖａ社製、製品コード１０４１０２１４、以下メンブレン２と表記）、及び平均孔径１μｍの再生セルロースメンブレン（ｃｙｔｉｖａ社製、製品コード１０４１００１４、以下メンブレン３と表記）を用意した。そのうち通気度測定に十分なサイズで市販されているメンブレン１及びメンブレン３について、不織布と同様に通気度を測定し、平均孔径との相関を比較した。その際、メンブレン１、３ともに、１枚、３枚、５枚重ねた水準で各３回ずつ測定し、１枚あたりの平均値を算出した。結果を表３及び図１に示した。
　表３及び図１の結果より、パームポロメーターで測定した不織布の平均孔径、及びメンブレンの平均孔径は通気時間の平方根の逆数とよく相間しており、基材の種類、材質によらないことが確かめられた。
＜製造例６：ディスクの作製＞
　ポンチを用いて、前記製造例１～５で作製した不織布１～５、及び不織布６を直径５ｍｍの円形に打ち抜き、カラムに充填するための水不溶性繊維ディスク（不織布ディスク）を作製した。
　同様の方法で、平均孔径０．２μｍの再生セルロースメンブレン（ｃｙｔｉｖａ社製、製品コード１０４１０３１４、メンブレン１）、平均孔径０．４５μｍの再生セルロースメンブレン（ｃｙｔｉｖａ社製、製品コード１０４１０２１４、メンブレン２）、及び平均孔径１μｍの再生セルロースメンブレン（ｃｙｔｉｖａ社製、製品コード１０４１００１４、メンブレン３）を直径５ｍｍの円形に打ち抜き、カラムに充填するための基材ディスク（メンブレンディスク）を作製した。
＜製造例７：抗ＡＡＶ－ｓｃＦｖ抗体の調製＞
　プロテインデータバンクに登録されているＡＡＶ２に結合する抗体の重鎖配列（ＰＤＢ：３Ｊ１Ｓ＿Ｈ）及び軽鎖配列（ＰＤＢ：３Ｊ１Ｓ＿Ｌ）を基に、配列表の配列番号１に示すＡＡＶ２に結合する単鎖抗体（以下、抗ＡＡＶ－ｓｃＦｖ抗体）を設計した。
　この抗ＡＡＶ－ｓｃＦｖ抗体にシグナル配列（ｐｅｌＢ）を付加した大腸菌発現用の遺伝子を設計し（配列番号２）、遺伝子合成した配列をｐＥＴ－２２ｂ（＋）（Ｍｅｒｃｋ社製）ベクターのＮｃｏＩサイト、ＮｏｔＩサイトに導入したプラスミドを委託調製した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）。
　遺伝子合成したプラスミドをＥ．　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｍｅｒｃｋ社製）に形質転換し、カナマイシンを含むＭａｇｉｃ　Ｍｅｄｉａ　（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて坂口フラスコで培養し、抗ＡＡＶ－ｓｃＦｖ抗体を生産した。
　得られた培養液から、プロテインＬ担体ＫＡＮＥＫＡ　ＫａｎＣａｐ　Ｌ（カネカ社製）を用いてアフィニティー精製し、遠心限外ろ過膜によりバッファー交換して、抗ＡＡＶ－ｓｃＦｖ抗体の精製品を得た。
＜製造例８：抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体の調製１＞
　国際特許公報ＷＯ２０１８／１０４５２８に記載の抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列（国際特許公報ＷＯ２０１８／１０４５２８の配列表の配列番号５９）を基に、大腸菌発現用の抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体を設計した（配列番号３）。
　この抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体にシグナル配列（ｐｅｌＢ）を付加した大腸菌発現用の遺伝子を設計し（配列番号４）、遺伝子合成した配列をｐＥＴ－２８ｂ（＋）（Ｍｅｒｃｋ社製）ベクターのＸｂａＩ、Ｂｐｕ１１０２Ｉサイトに導入したプラスミドを委託調製した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）。
　遺伝子合成したプラスミドをＥ．　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｍｅｒｃｋ社製）に形質転換し、カナマイシンを含むＭａｇｉｃ　Ｍｅｄｉａ　（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて坂口フラスコで培養し、抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体を生産した。
　得られた培養液から、陽イオン交換担体Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｓ（ＪＮＣ製）を用いて精製し、遠心限外ろ過膜によりバッファー交換して、抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体の精製品（以下、ＶＨＨ１と表記）を得た。
＜製造例９：抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体の調製２＞
　国際公開第２０２０／０６７４１８号パンフレットの実施例６に記載の方法で免疫実験を実施した。免疫したアルパカの血液から特開２０１５－１１９６３７号公報の実施例１に記載の方法で、抗体遺伝子群を取得し、抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体のファージライブラリーを調製した。ファージライブラリーからの抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体のスクリーニングは、ＡＡＶのｅｍｐｔｙ　ｐａｒｔｉｃｌｅを抗原として、特開２０１５－１１９６３７号公報の実施例１に記載のバイオパンニングの方法で実施した。ＡＡＶのｅｍｐｔｙ　ｐａｒｔｉｃｌｅは、国際公開第２０２０／０６７４１８号パンフレットの実施例３に記載の方法で調製した。
　バイオパンニング後のファージ感染した大腸菌を段階希釈し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンと２％グルコースを含む２ＹＴ寒天培地（１．６％トリプトン、１．０％酵母エキス、２．０％寒天）で培養した。シングルコロニーを１００μｇ／ｍＬアンピシリンと２％グルコースを含む２ＹＴ培地　３ｍＬで３７℃で一晩培養した。１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む２ＹＴ培地　５ｍＬに一晩培養した培養液を３０μＬ加え、３７℃、３００ｒｐｍで１時間培養した。培養後、培養液３ｍＬを分取し、ヘルパーファージ（Ｍ１３ＫＯ７（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）：１．０×１０１３／ｍＬ）をＭＯＩ＝５で感染させた。３７℃で３０分間静置した後、３７℃、３００ｒｐｍで３０分間振とうした。この培養液にカナマイシンを５０μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃、３００ｒｐｍで一晩培養した。培養後、培養液を４℃、４，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、上清を０．２μｍのフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）でろ過し、大腸菌を除去し、抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体がディスプレイされたファージを取得した。
　このうち、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ１及び６に親和性を持つ抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体を、それぞれＶＨＨリガンド２、３、４とした。
　このファージ溶液を抗体溶液とし、国際公開第２０２０／０６７４１８号パンフレットに記載の方法で、ＡＡＶに対する結合活性を評価し、結合活性の高いクローンを選抜した。結合活性の高いファージクローンをＥ．ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４（タカラバイオ社製）に感染させ、抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体をペリプラズムに発現する大腸菌を育種した。この大腸菌を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＴＢ培地（１．２％トリプトン、２．４％酵母エキス、０．８％グリセロール、０．９４％リン酸水素二カリウム、０．２２％リン酸二水素カリウム）を用いて３７℃で１時間培養した後、終濃度が１ｍＭになるようにイソプロピル－β－チオガラクトピラノシドを添加し、３７℃で一晩培養した。
　得られたＶＨＨ発現培養液からＡＫＴＡ　ａｖａｎｔ　２５（ＧＥヘルスケア社）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーにより抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体を精製した。サンプルは２５ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＣｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｓ－ｒ　１００　ｍＬ（ＪＮＣ社製）に負荷し、平衡化に用いたバッファーと１Ｍ　ＮａＣｌを含むリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）のリニアグラジエントにより溶出した。精製した抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体を遠心限外ろ過ユニットＯＭＥＧＡ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　１Ｋ（ＰＡＬＬ社製）で濃縮し、精製ＶＨＨ抗体（ＶＨＨリガンド２、３、４）を得た。
＜実施例１：担体１の作製＞
＜実施例１－１：不織布１へのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）スペーサー固定化＞
　製造例１で得られた不織布１に対し、ＰＥＩ溶液（Ａｌｆａ　Ａｅｓａｒ社製、Ｍｗ：７０，０００、分岐鎖）を加え、３７℃で１６時間転倒混和した。反応後、不織布をグラスフィルターに移して純水で洗浄し、ＰＥＩスペーサーの固定化された不織布１を得た。
＜実施例１－２：ＰＥＩスペーサー固定化不織布への官能基化＞
　実施例１－１で得られたＰＥＩスペーサー固定化不織布１に対し、超純水４ｍＬ、及び２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．８ｍＬを加えて３０分間転倒混和した。１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ナガセ社製）４ｍＬを加え、３７℃で４時間転倒混和した。反応後、不織布をグラスフィルターに移して純水で洗浄し、エポキシ化不織布１を得た。
＜実施例１－３：エポキシ化不織布１へのｓｃＦｖリガンド１の固定化＞
　実施例１－２で得られたエポキシ化不織布１に対し、０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む０．２ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ１０．０）を加えた。それに対し、製造例７で作製した精製ｓｃＦｖ抗体（ｓｃＦｖリガンド１）を１．７ｍｇ分添加し、液量が５ｍＬとなるようにした。３７℃で３０分間転倒混和した後、無水硫酸ナトリウム０．４９７ｇをゆっくりと加えて溶解させ、さらに３７℃で１６時間転倒混和した。反応後、不織布をグラスフィルターに移して上記炭酸緩衝液で洗浄した。この際のろ液を回収し、吸光度を測定することにより不織布に固定化されたｓｃＦｖリガンドのリガンド密度を算出した。算出したリガンド密度は０．４ｍｇ／ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎであった（表４）。続いて、洗浄後の不織布に残存するエポキシ基を封止するため、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、及び１０％ｖ／ｖチオグリセロールを含む０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、２５℃で１６時間転倒混和した。反応後、不織布をグラスフィルターに移して純水及び２０％エタノールで洗浄し、ｓｃＦｖ１固定化不織布１（担体１）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜実施例２：担体２の作製＞
　ｓｃＦｖリガンド１を、ＶＨＨリガンド１に代え、リガンド固定化時の緩衝液を０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１．２ｍｏｌ／Ｌのグアニジン塩酸塩を含む０．２ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ１０．０）に代えた以外は、実施例１と同様の方法でスペーサー固定化、官能基化、ＶＨＨ１固定化を行い、ＶＨＨ１固定化不織布１（担体２）を得た。
　実施例１と同様にして、リガンド密度を測定し、測定結果を表４に示した。
＜比較例１：担体３の作製＞
＜比較例１－１：ビーズ１の官能基化＞
　ＰＯＲＯＳ（登録商標）５０　ＯＨ　Ｈｙｄｒｏｘｙｌ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｒｅｓｉｎ（以下ビーズ１と表記、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製　孔径５０－１０００ｎｍ（公称値））を５ｍＬ－ｇｅｌ計量し、それに対して実施例１－２と同様の方法でエポキシ基を導入したビーズ１（エポキシ化ビーズ１）を得た。
　実施例１と同様にして、リガンド密度を測定し、測定結果を表４に示した。
＜比較例１－２：エポキシ化ビーズ１へのＶＨＨ２の固定化＞
　比較例１－２で得られたエポキシ化ビーズ１に対し、０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む０．２ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ１０．０）を加えた。それに対し、製造例９で作製した精製ＶＨＨ抗体リガンド２を５ｍｇ分添加し、液量が５ｍＬとなるようにした。３７℃で３０分間転倒混和した後、無水硫酸ナトリウム０．４９７ｇをゆっくりと加えて溶解させ、さらに３７℃で１６時間転倒混和した。反応後、ビーズをグラスフィルターに移して上記炭酸緩衝液で洗浄した。この際のろ液を回収し、吸光度を測定することによりＶＨＨリガンドのリガンド密度を算出した。続いて、洗浄後のビーズに残存するエポキシ基を封止するため、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、及び１０％ｖ／ｖチオグリセロールを含む０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、２５℃で１６時間転倒混和した。反応後、ビーズをグラスフィルターに移して純水及び２０％エタノールで洗浄し、ＶＨＨ２固定化ビーズ１（担体３）を得た。
　実施例１と同様にして、リガンド密度を測定し、測定結果を表４に示した。
＜比較例２：担体４の作製＞
　ビーズ１を、再生セルロースメンブレンＲＣ５８（メンブレン１）に代えた以外は、比較例１と同様の方法で官能基化及びＶＨＨ２の固定化を行い、ＶＨＨ２固定化メンブレン１（担体４）を得た。
　実施例１と同様にして、リガンド密度を測定し、測定結果を表４に示した。
＜比較例３：担体５の作製＞
　ビーズ１を、再生セルロースメンブレンＲＣ５５（メンブレン２）に代えた以外は、比較例１と同様の方法で官能基化及びＶＨＨ２の固定化を行い、ＶＨＨ２固定化メンブレン２（担体５）を得た。
　実施例１と同様にして、リガンド密度を測定し、測定結果を表４に示した。
＜比較例４：担体６の作製＞
　ビーズ１を、再生セルロースメンブレンＲＣ６０（メンブレン３）に代えた以外は、比較例１と同様の方法で官能基化及びＶＨＨ２の固定化を行い、ＶＨＨ２固定化メンブレン３（担体６）を得た。
　実施例１と同様にして、リガンド密度を測定し、測定結果を表４に示した。
＜実施例３：担体７の作製＞
　ｓｃＦｖリガンド１を、ＶＨＨリガンド２に代えた以外は、実施例１と同様の方法でスペーサー固定化、官能基化、ＶＨＨ２固定化を行い、ＶＨＨ２固定化不織布１（担体７）を得た。
　実施例１と同様にして、リガンド密度を測定し、測定結果を表４に示した。
＜実施例４：担体８の作製＞
　不織布１を、不織布２に代えた以外は、実施例１と同様の方法でスペーサー固定化、官能基化、ＶＨＨ２固定化を行い、ＶＨＨ２固定化不織布２（担体８）を得た。
　実施例１と同様にして、リガンド密度を測定し、測定結果を表４に示した。
＜実施例５：担体９の作製＞
　不織布１を、不織布３に代えた以外は、実施例１と同様の方法でスペーサー固定化、官能基化、ＶＨＨ２固定化を行い、ＶＨＨ２固定化不織布３（担体９）を得た。
　実施例１と同様にして、リガンド密度を測定し、測定結果を表４に示した。
＜実施例６：担体１０の作製＞
　不織布４に対し、２０％エタノール水溶液を加えた。それに対して、製造例９で作製した精製ＶＨＨ抗体リガンド２を５ｍｇ分、及び４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（富士フイルム和光純薬社製）を０．２ｍｇ分添加し、液量が５ｍＬになるようにして、３７℃で４時間転倒混和した。反応後、不織布をグラスフィルターに移して純水で洗浄し、担体１０を得た。この際のろ液を回収し、吸光度を測定することによりＶＨＨリガンドのリガンド密度を算出した。
　実施例１と同様にして、リガンド密度を測定し、測定結果を表４に示した。
＜実施例７：担体１１の作製＞
　不織布１を、不織布５に代えた以外は、実施例１と同様の方法でスペーサー固定化、官能基化、ＶＨＨ２固定化を行い、ＶＨＨ２固定化不織布５（担体１１）を得た。
　実施例１と同様にして、リガンド密度を測定し、測定結果を表４に示した。
　＜実施例８：担体１２の作製＞
　不織布４を、不織布６に代えた以外は、実施例６と同様の方法で官能基化及びＶＨＨ２の固定化を行い、ＶＨＨ２固定化不織布６（担体１２）を得た。
　実施例１と同様にして、リガンド密度を測定し、測定結果を表４に示した。
＜比較例５：担体１３の作製＞
　ＶＨＨリガンド２を、ＶＨＨリガンド３に代えた以外は、比較例１と同様の方法で官能基化及びＶＨＨ３の固定化を行い、ＶＨＨ３固定化ビーズ１（担体１３）を得た。
　実施例１と同様にして、リガンド密度を測定し、測定結果を表４に示した。
＜実施例９：担体１４の作製＞
　ｓｃＦｖリガンド１を、ＶＨＨリガンド３に代えた以外は、実施例１と同様の方法でスペーサー固定化、官能基化、ＶＨＨ３固定化を行い、ＶＨＨ３固定化不織布１（担体１４）を得た。
　実施例１と同様にして、リガンド密度を測定し、測定結果を表４に示した。
＜実施例１０：担体１５の作製＞
　ｓｃＦｖリガンド１を、ＶＨＨリガンド４に代えた以外は、実施例１と同様の方法でスペーサー固定化、官能基化、ＶＨＨ４固定化を行い、ＶＨＨ４固定化不織布１（担体１５）を得た。
　実施例１と同様にして、リガンド密度を測定し、測定結果を表４に示した。
＜製造例１０：不織布担体のカラムへの充填＞
　実施例３～１０で調製した担体７～１２、１４、１５をそれぞれ１枚ずつ重ね合わせ、０．２ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎ分をＴｒｉｃｏｒｎ（登録商標）５／２０カラムに充填した。
＜製造例１１：メンブレン担体のカラムへの充填＞
　比較例２～４で調製した担体４～６をそれぞれ１枚ずつ重ね合わせ、０．２ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎ分をＴｒｉｃｏｒｎ（登録商標）５／２０カラムに充填した。
＜製造例１２：ビーズ担体のカラムへの充填＞
　比較例１及び５で調製した担体３、１３、並びにＰＯＲＯＳ（登録商標）　ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＡＡＶＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）をそれぞれ湿潤体積で０．２ｍＬ－ｇｅｌ測り取り、Ｔｒｉｃｏｒｎ（登録商標）５／２０カラム（ＧＥヘルスケア社製）へ充填した。
＜製造例１３：動物細胞によるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ２）産生、及びＡＡＶ２前処理液の調製＞
　蛍光タンパク質ＧＦＰの改変体であるＶＥＮＵＳ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＱ４３９５５．１）を発現するＡＡＶ２作製用プラスミドを、ＡＡＶベクター作製キット（「ＡＡＶｐｒｏ（登録商標）　Ｈｅｌｐｅｒ　Ｆｒｅｅ　Ｓｙｓｔｅｍ」タカラバイオ社製）を用いて作製した。
　培養したＨＥＫ２９３細胞に、トランスフェクション試薬（「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ　ＭＡＸ」Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＭＷ：４０，０００）を用いて作製したプラスミドをトランスフェクションし、ＡＡＶを産生させた。培養終了後、細胞を剥離し、細胞培養液を回収した。これを遠心分離し、上清を除去し、ＡＡＶ産生細胞を得た。
　上記で得たＡＡＶ産生細胞を、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、以下、「ＰＢＳ」と略記する）に懸濁し、氷中で２０分間撹拌し、細胞破砕した。得られた細胞破砕液に、７．５ｖ／ｖ％の１Ｍ塩化マグネシウム水溶液と、０．１ｖ／ｖ％の２５０ｋＵ／ｍＬ　ＫＡＮＥＫＡ　Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（カネカ社製）を添加し、３７℃で３０分間静置し、細胞由来核酸を分解した。反応後、反応液に対して１５ｖ／ｖ％の０．５Ｍ　ＥＤＴＡ溶液を添加した後、デプスフィルター（Ｐａｌｌ社製）により清澄化した。得られた清澄化液をＡＡＶ２前処理液とした。
＜製造例１４：ＡＡＶ２粗精製液の調製＞
　非特許文献（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　２００７　１４０：１８３－１９２）を参考に、製造例１３で得られたＡＡＶ２前処理液を陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
　ＰＯＲＯＳ（登録商標）　５０ＨＳ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）をＴｒｉｃｏｒｎ（登録商標）１０／１５０（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、陽イオン交換精製用のカラムとした。
　下記Ａ～Ｆ液を調製し、使用前に０．２μｍフィルターを通した。
Ａ液：ＮａＰＯ４（２０ｍｍｏｌ／Ｌ），ＮａＣｌ（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ７．４
Ｂ液：ＮａＰＯ４（２０ｍｍｏｌ／Ｌ），ＮａＣｌ（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），Ｓａｒｋｏｓｙｌ（５ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ７．４
Ｃ液：ＮａＰＯ４（２０ｍｍｏｌ／Ｌ），ＮａＣｌ（３７０ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ７．４
Ｄ液：ＮａＣｌ（１ｍｏｌ／Ｌ）
Ｅ液：ＮａＯＨ（０．５ｍｏｌ／Ｌ）
Ｆ液：ＡＡＶ２前処理液をＡ液で希釈し、ｐＨ７．４に調製した溶液
　上記カラムをＡＫＴＡ　Ａｖａｎｔ　２５に接続し、Ｄ液で洗浄、Ａ液で平衡化した。その後、Ｆ液を通液し、ＡＡＶをカラム担体に保持させた後、Ａ液、Ｂ液、Ａ液の順に洗浄し、Ｃ液でＡＡＶを溶出した。溶出終了後、カラムはＤ液、及びＥ液で洗浄した。
　粗精製したＡＡＶはＳＤＳ－ＰＡＧＥで精製度合いの確認、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で液中のＡＡＶ量を定量した。
＜製造例１５：動物細胞によるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ１、５、６）産生、及びＡＡＶ１、５、６前処理液の調製＞
　ＡＡＶ２作製用プラスミドをＡＡＶ１、５、６作製用プラスミドに代えた以外は、製造例１３と同様の方法で、ＡＡＶ１、５、６前処理液を調製した。
＜試験例１：不織布担体によるＡＡＶの回収試験１＞
　実施例１及び３で作製した担体１及び７のディスク３枚に対し、製造例１４で作製したＡＡＶ２粗精製液を少量加えて、１６時間転倒混和して担体にＡＡＶ２を吸着させた。
　上澄みを除いた後、溶出液（クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ２．１）を加えてＡＡＶ２を担体から溶出させた。
　液中に含まれるＡＡＶ量をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３　リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）にて定量した。体積あたりの吸着量に換算すると、担体１で２．７×１０１１ｖｇ／ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎ、担体７で１．９×１０１２ｖｇ／ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎであった。
＜試験例２：不織布担体によるＡＡＶの回収試験２＞
　加える液をＡＡＶ２粗精製液から製造例１５で作製したＡＡＶ１前処理液に代えた以外は試験例１と同様の方法で、実施例２で作製した担体２に対するＡＡＶの回収試験を行った。吸着したＡＡＶ１の量は、１．１×１０１１ｖｇ／ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎであった。
＜試験例３：不織布担体を用いたＡＡＶ２の回収＞
　製造例１０で作製した担体７及び１０のカラムを用い、製造例１４で得られたＡＡＶ２粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
　下記Ａ～Ｆ液を調製し、使用前に０．２μｍフィルターでろ過した。
Ａ液：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ８．０
Ｂ液：クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ２．１
Ｃ液：ＮａＯＨ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｄ液：リン酸（１２０ｍｍｏｌ／Ｌ），酢酸（１６７ｍｍｏｌ／Ｌ），ベンジルアルコール（２．２％ｖ／ｖ）
Ｅ液：２０％エタノール
Ｆ液：ＡＡＶ２粗精製液をＡ液で希釈し、ｐＨ８．０に調製した溶液（１×１０１２ｖｇ程度）
　製造例１０で作製した担体７及び１０のカラムを充填したカラムをＡＫＴＡ　Ａｖａｎｔ　２５に接続し、流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎに設定し、純水で洗浄、Ａ液で平衡化した。その後、Ｆ液を通液し、ＡＡＶをカラム担体に保持させた後、Ａ液で洗浄し、Ｂ液にてＡＡＶを溶出した（溶出工程）。溶出終了後、カラムはＡ液、Ｃ液、Ａ液、Ｄ液の順に洗浄した（洗浄工程）。洗浄後、カラムをＥ液に置換し冷蔵保存した。
　各フラクションに含まれるＡＡＶ量をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３　リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）にて定量した。また、溶出工程の回収ＡＡＶ量に対するフロースルー（ＦＴ）への漏出ＡＡＶ量の比率、及び溶出工程の回収ＡＡＶ量に対する洗浄工程の残存ＡＡＶ量の比率を算出した。結果を表５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
＜試験例４：メンブレン担体を用いたＡＡＶ２の回収＞
　製造例１１で作製した担体４、５、６のカラムを用い、製造例１４で得られたＡＡＶ２粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。試験例３と同様の方法で、各フラクションに含まれるＡＡＶ量を定量し、漏出ＡＡＶ量、残存ＡＡＶ量の比率を算出した。結果を表５に示した。
＜試験例５：ビーズ担体を用いたＡＡＶ２の回収＞
　製造例１２で作製したＰＯＲＯＳ（登録商標）　ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）　ＡＡＶＸ、及び担体３のカラムを用い、製造例１４で得られたＡＡＶ２粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。試験例３と同様の方法で、各フラクションに含まれるＡＡＶ量を定量し、漏出ＡＡＶ量、残存ＡＡＶ量の比率を算出した。結果を表５に示した。
　表５の結果より、担体７及び１０は、ＰＯＲＯＳ（登録商標）　ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＡＡＶＸ、及び担体３～６に比べ、残存ＡＡＶ量の比率が低かった。これらの結果より、効率的にＡＡＶを回収する上で、担体の基材として、水不溶性繊維を用いることが好ましいことが分かった。
＜試験例６：不織布担体を用いた高流速条件でのＡＡＶ２の回収＞
　製造例１０で作製した担体７、８、９、１１、１２のカラムを用い、製造例１４で得られたＡＡＶ２粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。クロマトの流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎから１．２ｍＬ／ｍｉｎ（滞留時間１０秒）、又は２．４ｍＬ／ｍｉｎ（滞留時間５秒）に変更した以外は、試験例３と同様の方法で、各フラクションに含まれるＡＡＶ量を定量し、漏出ＡＡＶ量、残存ＡＡＶ量の比率を算出した。結果を表６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
＜試験例７：ビーズ担体を用いた高流速条件でのＡＡＶ２の回収＞
　製造例１２で作製したＰＯＲＯＳ（登録商標）　ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）　ＡＡＶＸのカラムを用い、製造例１４で得られたＡＡＶ２粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。クロマトの流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎから１．２ｍＬ／ｍｉｎ（滞留時間１０秒）、又は２．４ｍＬ／ｍｉｎ（滞留時間５秒）に変更した以外は、試験例３と同様の方法で、各フラクションに含まれるＡＡＶ量を定量し、漏出ＡＡＶ量、残存ＡＡＶ量の比率を算出した。結果を表６に示した。
　表６の結果より、不織布担体７、８、９、１１は流速を上げて滞留時間を１分より短くしても、ＦＴに漏出するＡＡＶの比率が低く、かつ残存ＡＡＶの比率も低いことがわかった。一方で、担体１２は残存ＡＡＶの比率は低いが、漏出ＡＡＶの比率は大きくなった。なお、担体１１のＦＴへの漏出ＡＡＶ量が他の担体よりも少ない数値となっているが、これは検量線の下限範囲外となったためであり、担体７、８、９の結果と遜色ないと想定される。
＜試験例８：担体７によるＡＡＶ２精製＞
　製造例１０で作製した担体７のカラムを用い、製造例１３で得られたＡＡＶ２前処理液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
　下記Ａ～Ｆ液を調製し、使用前に０．２μｍフィルターでろ過した。
Ａ液：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ８．０
Ｂ液：クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ２．１
Ｃ液：ＮａＯＨ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｄ液：リン酸（１２０ｍｍｏｌ／Ｌ），酢酸（１６７ｍｍｏｌ／Ｌ），ベンジルアルコール（２．２％ｖ／ｖ）
Ｅ液：２０％エタノール
Ｆ液：ＡＡＶ２前処理液をＡ液で希釈し、ｐＨ８．０に調製した溶液（１×１０１２ｖｇ程度）
　製造例１０で作製した担体７を充填したカラムをＡＫＴＡ　Ａｖａｎｔ　２５に接続し、流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎに設定し、純水で洗浄、Ａ液で平衡化した。その後、Ｆ液を通液し、ＡＡＶをカラム担体に保持させた後、Ａ液で洗浄し、Ｂ液にてＡＡＶを溶出した。溶出終了後、カラムはＡ液、Ｃ液、Ａ液、Ｄ液の順に洗浄した。洗浄後、カラムをＥ液に置換し冷蔵保存した。精製時のクロマトグラムを図２に示す。
　また、各フラクションに含まれるＡＡＶ量をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３　リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）にて定量した。また、溶出工程の回収ＡＡＶ量に対する洗浄工程の残存ＡＡＶ量の比率を算出した。結果を表７に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
＜試験例９：ビーズ担体によるＡＡＶ２精製＞
　担体７のカラムに代えて、製造例１２で製造したＰＯＲＯＳ（登録商標）　ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＡＡＶＸを充填したカラムを用いた以外は試験例８と同様にしてＡＡＶ前処理液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。得られたクロマトグラムを図３に示した。試験例８と同様にして溶出工程の回収ＡＡＶ、及び洗浄工程の残存ＡＡＶを算出した。結果を表７に示した。
＜試験例１０：担体１４によるＡＡＶ５精製＞
　製造例１０で作製した担体１４のカラムを用い、製造例１５で得られたＡＡＶ５前処理液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。下記Ａ～Ｆ液を調製し、使用前に０．２μｍフィルターでろ過した。
Ａ液：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ８．０
Ｂ液：クエン酸（２０ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ２．１
Ｃ液：ＮａＯＨ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｄ液：リン酸（１２０ｍｍｏｌ／Ｌ），酢酸（１６７ｍｍｏｌ／Ｌ），ベンジルアルコール（２．２％ｖ／ｖ）
Ｅ液：２０％エタノール
Ｆ液：ＡＡＶ５前処理液をＡ液で希釈し、ｐＨ８．０に調製した溶液（１×１０１２ｖｇ程度）
　製造例１０で作製した担体１４を充填したカラムをＡＫＴＡ　Ａｖａｎｔ　２５に接続し、流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎに設定し、純水で洗浄、Ａ液で平衡化した。その後、Ｆ液を通液し、ＡＡＶをカラム担体に保持させた後、Ａ液で洗浄し、Ｂ液にてＡＡＶを溶出した。溶出終了後、カラムはＡ液、Ｃ液、Ａ液、Ｄ液の順に洗浄した。洗浄後、カラムをＥ液に置換し冷蔵保存した。
　また、各フラクションに含まれるＡＡＶ量をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３　リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）にて定量した。また、溶出工程の回収ＡＡＶ量に対する洗浄工程の残存ＡＡＶ量の比率を算出した。結果を表８に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
＜試験例１１：担体１３によるＡＡＶ５精製＞
　担体１４のカラムに代えて、製造例１２で製造した担体１３を充填したカラムを用いた以外は試験例１０と同様にしてＡＡＶ５前処理液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。試験例１０と同様にして溶出工程の回収ＡＡＶ、及び洗浄工程の残存ＡＡＶを算出した。結果を表８に示した。
＜試験例１２：担体１５によるＡＡＶ１、６精製＞
　製造例１０で作製した担体１５のカラムを用い、製造例１５で得られたＡＡＶ１前処理液及びＡＡＶ６前処理液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。Ｆ液をＡＡＶ１前処理液もしくはＡＡＶ６前処理液に変更した以外は、試験例１０と同様の方法でＡＡＶ１、６を精製した。溶出工程に含まれるＡＡＶ量は、ＡＡＶ１で２．２×１０１０ｖｇ／ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎ、ＡＡＶ６で４．４×１０１０ｖｇ／ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎであった。
　試験例８～１２の結果より、本願の構造物は、ＡＡＶのセロタイプに限定されず広く適用可能であることがわかった。
　図１、２及び表５～８の結果より、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＡＡＶＸ、担体１４などのビーズ担体を用いた場合は、溶出工程の後の洗浄工程からＡＡＶが一定量検出されたことから、担体内部に閉塞したＡＡＶを十分に回収することは難しい資材であるといえる。
　一方で、本発明の構造物である担体を用いた場合は、溶出工程に単一ピークが現れ、溶出工程の後の洗浄工程に残存したＡＡＶが大幅に少なく、担体内部にＡＡＶが詰まらず効率的に回収することが可能な資材であるといえる。
　以上より、本願の構造物は、溶出工程の生体粒子回収率は高く、洗浄工程の生体粒子残存率が低い、構造物であることが分かった。
＜試験例１３：不織布担体のＡＡＶ結合容量の算出＞
　製造例１０で作製した担体７のカラムを用い、製造例１４で得られたＡＡＶ粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
下記Ａ～Ｆ液を調製し、使用前に０．２μｍフィルターでろ過した。
Ａ液：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ８．０
Ｂ液：クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ２．１
Ｃ液：ＮａＯＨ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｄ液：リン酸（１２０ｍｍｏｌ／Ｌ），酢酸（１６７ｍｍｏｌ／Ｌ），ベンジルアルコール（２．２％ｖ／ｖ）
Ｅ液：２０％エタノール
Ｆ液：ＡＡＶ粗精製液をＡ液で希釈し、ｐＨ８．０に調製した溶液（２×１０１３ｖｇ程度）
　カラムをＡＫＴＡ　Ａｖａｎｔ　２５に接続し、流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎに設定し、純水で洗浄、Ａ液で平衡化した。その後、Ｆ液を通液し、ＡＡＶをカラム担体に保持させた後、Ａ液で洗浄し、Ｂ液にてＡＡＶを溶出した。溶出終了後、カラムはＡ液、Ｃ液、Ａ液、Ｄ液の順に洗浄した。洗浄後、カラムをＥ液に置換し冷蔵保存した。各フラクションに含まれるＡＡＶ量をｑＰＣＲにて定量し、溶出工程に含まれるＡＡＶ量から結合容量を算出した。結果を表９に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９の結果より、本発明の構造物はウイルス吸着の観点においても、市販品と遜色ない性能を示すことがわかった。なお、今回調製したＡＡＶ粗精製液には、ウイルス遺伝子を含むＡＡＶに加え、遺伝子を含まないカプシドが多量に含まれている。ｑＰＣＲ測定ではウイルス遺伝子を含むＡＡＶのみを定量するため、実際の結合容量は表９に示した数値より大きいと想定される。
　本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
　＜１＞　水不溶性繊維と、前記水不溶性繊維に接続された低分子化抗体と、を有することを特徴とする構造物である。
　＜２＞　前記水不溶性繊維が不織布である、前記＜１＞に記載の構造物である。
　＜３＞　前記不織布がポリオレフィン及びその誘導体を含む、前記＜２＞に記載の構物である。
　＜４＞　前記低分子化抗体がウイルス、ウイルス様粒子、又はウイルスベクターを吸着可能である、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の構造物である。
　＜５＞　前記ウイルス、ウイルス様粒子、又はウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス、又はアデノ随伴ウイルスのカプシド、若しくはアデノ随伴ウイルス遺伝子を含むウイルスベクターである、前記＜４＞に記載の構造物である。
　＜６＞　前記低分子化抗体が、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有さない、前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の構造物である。
　＜７＞　前記低分子化抗体が、全長抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含む、前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の構造物である。
　＜８＞　前記低分子化抗体が、シングルドメイン抗体を含む、前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の構造物である。
　＜９＞　前記シングルドメイン抗体が、ラクダ科動物由来の重鎖抗体の可変領域を含む、前記＜８＞に記載の構造物である。
　＜１０＞　前記低分子化抗体が、スペーサーを介して前記水不溶性繊維に接続されている、前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の構造物である。
　＜１１＞　前記スペーサーが、アミノ基、ヒドロキシ基、エポキシ基、及びカルボキシ基のいずれかを含む前記＜１０＞に記載の構造物である。
　＜１２＞　前記スペーサーがポリマーを含む、前記＜１０＞又は＜１１＞のいずれかに記載の構造物である。
　＜１３＞　水不溶性繊維と、低分子化抗体と、を接続する工程を含むことを特徴とする構造物の製造方法である。
　＜１４＞　前記＜１＞から＜１２＞のいずれかに記載の構造物を有することを特徴とする吸着体である。
　＜１５＞　前記＜１＞から＜１２＞のいずれかに記載の構造物、又は前記＜１４＞に記載の吸着体を用いることを特徴とする生体粒子の精製方法である。

Claims (15)

  1. 　水不溶性繊維と、前記水不溶性繊維に接続された低分子化抗体と、を有することを特徴とする構造物。
  2. 　前記水不溶性繊維が不織布である、請求項１に記載の構造物。
  3. 　前記不織布がポリオレフィン及びその誘導体を含む、請求項２に記載の構造物。
  4. 　前記低分子化抗体がウイルス、ウイルス様粒子、又はウイルスベクターを吸着可能である、請求項１から３のいずれかに記載の構造物。
  5. 　前記ウイルス、ウイルス様粒子、又はウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス、又はアデノ随伴ウイルスのカプシド、若しくはアデノ随伴ウイルス遺伝子を含むウイルスベクターである、請求項４に記載の構造物。
  6. 　前記低分子化抗体が、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有さない、請求項１から５のいずれかに記載の構造物。
  7. 　前記低分子化抗体が、全長抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含む、請求項１から６のいずれかに記載の構造物。
  8. 　前記低分子化抗体が、シングルドメイン抗体を含む、請求項１から７のいずれかに記載の構造物。
  9. 　前記シングルドメイン抗体が、ラクダ科動物由来の重鎖抗体の可変領域を含む、請求項８に記載の構造物。
  10. 　前記低分子化抗体が、スペーサーを介して前記水不溶性繊維に接続されている、請求項１から９のいずれかに記載の構造物。
  11. 　前記スペーサーが、アミノ基、ヒドロキシ基、エポキシ基、及びカルボキシ基のいずれかを含む請求項１０に記載の構造物。
  12. 　前記スペーサーがポリマーを含む、請求項１０又は１１に記載の構造物。
  13. 　水不溶性繊維と、低分子化抗体と、を接続する工程を含むことを特徴とする構造物の製造方法。
  14. 　請求項１から１２のいずれかに記載の構造物を有することを特徴とする吸着体。
  15. 　請求項１から１２のいずれかに記載の構造物、又は請求項１４に記載の吸着体を用いることを特徴とする生体粒子の精製方法。
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