WO2021220562A1 - 多重リングマスク、光照射装置、光学顕微鏡および光音響顕微鏡 - Google Patents

多重リングマスク、光照射装置、光学顕微鏡および光音響顕微鏡 Download PDF

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ring mask
light irradiation
intensity
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直也 松本
向陽 渡辺
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浜松ホトニクス株式会社
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    • G02B2207/00—Coding scheme for general features or characteristics of optical elements and systems of subclass G02B, but not including elements and systems which would be classified in G02B6/00 and subgroups
    • G02B2207/113—Fluorescence

Definitions

  • the present disclosure discloses a multi-ring mask that spatially intensity-modulates the light beam cross section of the input light and outputs the modulated light, a light irradiation device including such a multi-ring mask, and such light irradiation. It relates to an optical microscope and a photoacoustic microscope equipped with an apparatus.
  • Patent Document 1 When observing an object to be observed or processing an object to be processed, the light output from a light source such as a laser light source passes through a condensing optical system including a lens or the like to the object (object to be observed or an object to be processed). The surface or interior of the lens is focused and irradiated. When light is focused in this way, it is known that the beam waist diameter, which is a measure of the size of the focused diameter, can be reduced to only about half of the wavelength of light. This is called the diffraction limit.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 describe a technique for condensing light in a region smaller than the diffraction limit.
  • Non-Patent Document 1 The technique of the light irradiation device described in Non-Patent Document 1 (hereinafter referred to as "conventional technique 1”) uses a single ring mask.
  • This single ring mask has a single ring-shaped light-shielding portion and transmission portions provided inside and outside the light-shielding portion.
  • a single ring mask is arranged between the light source and the condensing position by the condensing optical system, and the light passing through the inside and outside transmission portions of the light-shielding portion of the single ring mask reaches the condensing position. do. It is said that the light can be focused in a region smaller than the diffraction limit by the interference of the two lights at the focusing position.
  • the technique of the light irradiation device described in Patent Document 1 uses a multiple ring mask.
  • the multiple ring mask used in the prior art 2 has a plurality of ring-shaped light-shielding portions and a transmissive portion provided between the plurality of light-shielding portions, and the light-shielding portions and the transmissive portions are alternately provided. ing. Further, in this multiple ring mask, the farther from the center position, the larger the radial width of the ring-shaped light-shielding portion or transmission portion.
  • a multiple ring mask is arranged between the light source and the light condensing position by the condensing optical system, and the light passing through each transmission portion of the multi-ring mask reaches the condensing position. Even in the prior art 2, it is said that light can be focused in a region smaller than the diffraction limit.
  • the light can be focused in a region smaller than the diffraction limit at the focusing position, a part of the light may be focused in a region different from this, and the focusing region The size or shape of the light may not be as intended.
  • the present invention has been made to solve the above problems, and an object of the present invention is to provide a light irradiation device capable of efficiently condensing light in a region smaller than the diffraction limit. Another object of the present invention is to provide a multi-ring mask that is suitably used in such a light irradiation device. Another object of the present invention is to provide an optical microscope and a photoacoustic microscope equipped with such a light irradiation device and capable of acquiring an image having high spatial resolution.
  • the first aspect of the present invention is a multiple ring mask.
  • the multiple ring mask is a multiple ring mask that spatially modulates the intensity of the input light beam cross section and outputs the modulated light, and is a ring-shaped plurality of light-shielding portions provided around the center position.
  • a transmissive portion provided between two adjacent light-shielding portions of the plurality of light-shielding portions, and a transmissive portion of the innermost layer provided inside the light-shielding portion of the innermost layer of the plurality of light-shielding portions.
  • It has a transmissive portion of the outermost layer provided outside the light-shielding portion of the outermost layer of the plurality of light-shielding portions, and the radial width of each of the two adjacent light-shielding portions of the plurality of light-shielding portions is large. It is larger than the radial width of the transmissive portion provided between these two light-shielding portions.
  • the second aspect of the present invention is a light irradiation device.
  • the light irradiation device is provided on an optical path between a light source that outputs coherent light, a condensing optical system that condenses the light output from the light source, and a condensing position between the light source and the condensing optical system.
  • the above-mentioned multiple ring mask is provided.
  • the third aspect of the present invention is an optical microscope.
  • the optical microscope includes the above-mentioned light irradiation device that concentrates and irradiates the surface or the inside of the object, and a light detection device that detects the light generated by the object in response to the light irradiation of the object by the light irradiation device. , Equipped with.
  • the fourth aspect of the present invention is a photoacoustic microscope.
  • the photoacoustic microscope includes the above-mentioned light irradiation device that condenses and irradiates the surface or inside of the object with pulsed light, and a sound wave that detects the sound wave generated by the object in response to the pulsed light irradiation of the object by the light irradiation device. It includes a detection device.
  • light can be efficiently focused in a region smaller than the diffraction limit.
  • FIG. 1 is a diagram showing a configuration of a light irradiation device 1 including a single ring mask or a multiple ring mask.
  • FIG. 2 is a diagram showing a configuration of a single ring mask.
  • FIG. 3 is a diagram showing a configuration of a multiple ring mask.
  • 4 (a) to 4 (l) are diagrams showing various configuration examples of masks and PSFs.
  • 5 (a) to 5 (d) are diagrams showing fluorescence generation regions when the single ring mask is used / not used and when the aberration medium is present / absent.
  • 6 (a) to 6 (j) are diagrams showing various configuration examples of masks and PSFs.
  • 7 (a) to 7 (j) are diagrams showing various configuration examples of masks and PSFs.
  • FIG. 1 is a diagram showing a configuration of a light irradiation device 1 including a single ring mask or a multiple ring mask.
  • FIG. 2 is a diagram showing a configuration of
  • FIG. 8 is a diagram showing a comparison between the multiple ring mask of the prior art 2 and the multiple ring mask of the present embodiment.
  • FIG. 9 is a diagram showing a comparison between the multiple ring mask of the prior art 2 and the multiple ring mask of the present embodiment.
  • FIG. 10 is a diagram showing a comparison between the multiple ring mask of the prior art 2 and the multiple ring mask of the present embodiment.
  • FIG. 11 is a table summarizing the radial widths of the light-shielding portion and the transmissive portion in the multiple ring mask of the prior art 2 shown in the upper part of FIG. FIG.
  • FIG. 12 is a table summarizing the radial widths of the light-shielding portion and the transmissive portion in the multiple ring mask of the present embodiment shown in the lower part of FIG. 13 (a) to 13 (d) are diagrams showing PSF when light is focused and irradiated on the surface of an object (when there is no aberration). 14 (a) to 14 (e) are diagrams showing the PSF when light is focused and irradiated inside the object (when there is an aberration).
  • FIG. 15 is a graph showing the improvement rate for PSF in each case shown in FIG.
  • FIG. 16 is a graph showing the size of the second lobe for the PSF in each case shown in FIG.
  • 17 (a) and 17 (b) are diagrams showing grating patterns presented to the SLM when a multi-ring mask is constructed using a phase modulation type SLM.
  • 18 (a) and 18 (b) are diagrams showing the configuration of a modified example of the multiple ring mask of the present embodiment.
  • FIG. 19 is a diagram showing an example of the light transmittance distribution in the 7-layer ring mask of the present embodiment.
  • 20 (a) to 20 (d) are diagrams showing an example of a toroidal lens pattern and a ring pattern projected by the pattern.
  • FIG. 21 is a diagram showing a configuration of a multi-ring mask having a light-shielding portion and a transmissive portion according to the pattern of the toroidal lens.
  • FIG. 22 (a) to 22 (d) are diagrams showing a configuration example of a multiple ring mask in which a plurality of masks are laminated.
  • FIG. 23 is a diagram showing an example of a pattern of a double ring mask suitable for generating fluorescence through a three-photon absorption process.
  • FIG. 24 is a diagram showing the configuration of the optical microscope 1A.
  • FIG. 25 is a diagram showing the configuration of the optical microscope 1B.
  • FIG. 26 is a diagram showing the configuration of the optical microscope 1C.
  • FIG. 27 is a diagram showing the configuration of the optical microscope 1D.
  • FIG. 28 is a diagram showing the configuration of the optical microscope 1E.
  • FIG. 29 is a diagram showing an example of a pattern of multiple ring masks used during PSF 2 observation in optical microscopes 1C to 1E.
  • FIG. 30 is a diagram showing an example of the pattern of the multiple ring mask used at the time of PSF 4 observation in the optical microscopes 1C to 1E.
  • FIG. 31 is a diagram showing an example of a pattern of the multiple ring mask used at the time of PSF 6 observation in the optical microscopes 1C to 1E.
  • 32 (a) to 32 (c) are diagrams showing an example of PSF 2 in the case of two-photon excitation.
  • 33 (a) to 33 (c) are diagrams showing an example of PSF 4 in the case of two-photon excitation.
  • 34 (a) to 34 (c) are diagrams showing an example of PSF 6 in the case of two-photon excitation.
  • FIG. 35 is a table summarizing the radial and axial sizes of the PSF in various cases.
  • 36 (a) and 36 (b) are diagrams showing the light intensity distribution in the condensing region inside the object 2.
  • FIGS. 37 (a) and 37 (b) are diagrams showing examples of images acquired by a two-photon excitation fluorescence microscope.
  • FIG. 38 is a diagram showing the configuration of the photoacoustic microscope 1F.
  • FIG. 39 is a diagram showing the configuration of a photoacoustic microscope 1G.
  • FIG. 1 is a diagram showing a configuration of a light irradiation device 1 including a single ring mask or multiple ring masks.
  • the light irradiation device 1 collects light on the surface or inside of the object 2 to observe or process the object 2, and includes a laser light source 11, a lens 12, a lens 13, a mask 14, a wave plate 15, and a wavelength plate 15.
  • a lens 16 is provided.
  • the laser light source 11 outputs a coherent laser beam, and is, for example, a He-Ne laser light source.
  • the laser light source 11 may oscillate continuously or oscillate in a pulse.
  • the pulse-oscillating laser light source may be configured so that the pulse width can be adjusted by an optical fiber. Examples of the pulse laser include a nano-pico femtosecond laser and the like.
  • the lens 12 and the lens 13 act as a beam expander, input the light output from the laser light source 11, expand the beam diameter of the light, and output the light as parallel light.
  • the mask 14 inputs light whose beam diameter is expanded by a beam expander including the lens 12 and the lens 13 and spatially modulates the intensity in the beam cross section of the light to wavelength the modulated light. Output to plate 15.
  • the mask 14 has a ring-shaped light-shielding portion and a transmission portion provided in contact with the inside and the outside of the light-shielding portion.
  • the mask 14 is a single ring mask in the prior art 1, and is a multiple ring mask in the prior art 2 and the present embodiment. This figure shows an example of the light intensity distribution in the beam cross section of the light input to the mask 14, and also shows an example of the light intensity distribution in the beam cross section of the light output from the mask 14.
  • the mask 14 may be provided after the lens 16.
  • the wave plate 15 inputs the light output from the mask 14 and manipulates the polarization of the light to output the light.
  • the lens 16 is a condensing optical system that inputs the light output from the wave plate 15 and condenses the light on the surface or inside of the object 2.
  • the single ring mask and the multiple ring mask will be described below.
  • the figure showing the structure of the mask shows the mask in the optical axis direction, the light-shielding portion is shown in the black region, and the transmissive portion is shown in the white region. Further, after explaining the problems of the single ring mask of the prior art 1, the multiple ring mask of the present embodiment will be described in comparison with the multiple ring mask of the prior art 2.
  • FIG. 2 is a diagram showing the configuration of a single ring mask.
  • the single ring mask has a single ring-shaped light-shielding portion A1 provided around the center position. Further, the single ring mask includes a transmission portion B1 provided inside the light-shielding portion A1, a ring-shaped transmission portion B2 provided outside the light-shielding portion A1, and a light-shielding portion A2 provided outside the light-shielding portion B2. And have.
  • the light irradiation device of the prior art 1 uses such a single ring mask.
  • FIG. 3 is a diagram showing the configuration of the multiple ring mask.
  • the multiple ring mask has a plurality of (three in this figure) ring-shaped light-shielding portions A1, A2, and A3 provided around the center position. Further, the multiple ring mask includes a transparent portion B1 of the innermost layer provided inside the light-shielding portion A1, a ring-shaped transparent portion B2 provided between the light-shielding portion A1 and the light-shielding portion A2, and a light-shielding portion A2.
  • the light transmittance in the transmitting portions B1 to B4 is larger than the light transmittance in the light-shielding portions A1 to A4.
  • the light transmittance in the transmitting portions B1 to B4 may be 1 or may be smaller than 1.
  • the light transmittance in the light-shielding portions A1 to A4 may be 0 or may be larger than 0.
  • the boundary between the adjacent transmission part and the light-shielding part of the transmission part B1, the light-shielding part A1, the transmission part B2, the light-shielding part A2, the transmission part B3, the light-shielding part A3, the transmission part B4 and the light-shielding part A4 is concentric. It may be present or it may be elliptical. In the following, it will be described assuming that the boundary is a circle.
  • the radial width (radius) of the transmitting portion B1 is b1, the radial width of the light-shielding portion A1 is a1, the radial width of the transmitting portion B2 is b2, and the radial width of the light-shielding portion A2 is a2.
  • the radial width of the transmission portion B3 is b3, the radial width of the light-shielding portion A3 is a3, and the radial width of the transmission portion B4 is b4.
  • the multiple ring mask of the prior art 2 has a relationship represented by the following equation (1).
  • the radial width of each of the two adjacent light-shielding portions A1, A2, and A3 of the ring-shaped light-shielding portions is provided between the two light-shielding portions. It is larger than the radial width of the transparent part. That is, the multiple ring mask of the present embodiment has a relationship represented by the following equation (2) with respect to the radial widths of the light-shielding portions A1 and A2 and the transmission portion B2, respectively, and the light-shielding portions A2 and A3 and the transmission portion B2.
  • the width of each of B3 in the radial direction has a relationship represented by the following equation (3). It is preferable to have such a relationship for all combinations of two adjacent ring-shaped light-shielding portions.
  • the object is irradiated with the light focused by the lens.
  • the intensity distribution of the focused light has a spread depending on the wavelength of the light and the performance of the lens. This spread is called the point spread function (PSF).
  • PSF point spread function
  • the PSF has an elliptical sphere that is longer in the direction parallel to the optical axis than in the direction perpendicular to the optical axis.
  • the result obtained by convolving the PSF and the object shape is an observation image.
  • an image of substantially the same size as the PSF can be observed. Reducing the PSF leads to an increase in the optical resolution of the microscope. Normally, the PSF is reduced by adopting an objective lens having a large NA.
  • the single ring mask and the multiple ring mask are amplitude-modulated masks having a ring-shaped light-shielding portion.
  • the PSF can be reduced by condensing the light transmitted through the transmissive portion of these masks.
  • FIG. 4 is a diagram showing various configuration examples of the mask and PSF.
  • FIG. 4A shows the configuration of a mask having a single transmissive portion in a circular region and a light-shielding portion provided around the transmissive portion.
  • 4 (b) to 4 (f) show a configuration example of a single ring mask.
  • 4 (g) to 4 (l) show the PSF on the plane (xz plane) including the optical axis (z axis) of the lens.
  • FIG. 4 (g) shows the PSF when the mask having the configuration of FIG. 4 (a) is used.
  • FIG. 4 (h) shows the PSF when the single ring mask having the configuration of FIG. 4 (b) is used.
  • FIG. 4A shows the configuration of a mask having a single transmissive portion in a circular region and a light-shielding portion provided around the transmissive portion.
  • 4 (b) to 4 (f) show a configuration example of a single ring mask.
  • FIG. 4 (i) shows the PSF when the single ring mask having the configuration of FIG. 4 (c) is used.
  • FIG. 4 (j) shows the PSF when the single ring mask having the configuration of FIG. 4 (d) is used.
  • FIG. 4 (k) shows the PSF when the single ring mask having the configuration of FIG. 4 (e) is used.
  • FIG. 4 (l) shows the PSF when the single ring mask having the configuration of FIG. 4 (f) is used.
  • the size and shape of the PSF differ depending on the inner and outer diameters of the ring-shaped light-shielding portion.
  • the PSF can be reduced (FIG. 4 (h)).
  • the PSF may become large (FIG. 4 (i)), or the main condensing area may be large.
  • a region (side lobe) having a high light intensity is generated above and below the (main lobe) (FIG. 4 (j)), and the PSF becomes longer in the optical axis direction (FIG. 4 (k)).
  • Non-Patent Document 1 attempts to determine the configuration of a single ring mask so that the light intensity of the side lobes is small and the region of the main lobes is small.
  • FIG. 5 is a diagram showing a fluorescence generation region when the single ring mask is used / not used and when the aberration medium is present / absent. This figure shows a region where fluorescence is generated by two-photon absorption of excitation light.
  • FIG. 5A shows a fluorescence generation region when there is no single ring mask and no aberration medium.
  • FIG. 5B shows a fluorescence generation region with a single ring mask and without an aberration medium.
  • FIG. 5C shows a fluorescence generation region without a single ring mask and with an aberration medium.
  • FIG. 5D shows a fluorescence generation region with a single ring mask and an aberration medium.
  • the spherical aberration that occurs under this condition is very small.
  • the PSF only slightly extends in the optical axis direction (FIG. 5 (c)).
  • a strong second lobe is produced (FIG. 5 (d)).
  • the second lobe may occur at a position different from that of the side lobe depending on conditions such as the difference in refractive index, the depth of focus, and NA.
  • the single ring mask may have side lobes and second lobes in addition to the main lobe, and it may not be possible to make the main lobe smaller.
  • the multiple ring mask of the present embodiment can solve the problems of such a single ring mask.
  • the multiple ring mask will be described below.
  • FIG. 6 and 7 are diagrams showing various configuration examples of masks and PSFs.
  • the light (excitation light) input to the mask is constant (top hat) in the beam cross section.
  • the light (excitation light) input to the mask has a Gaussian distribution with a cut hem in the beam cross section.
  • (a) shows the configuration of a mask having a single transmissive portion in a circular region and a light-shielding portion provided around the transmissive portion.
  • (B) shows the structure of the double ring mask.
  • (C) shows the structure of the triple ring mask.
  • (D) shows the structure of the quadruple ring mask.
  • (E) shows the structure of the 6-layer ring mask.
  • (F) to (j) show the PSF on the surface (xz surface) including the optical axis (z axis) of the lens with respect to the fluorescence generated by the two-photon absorption of the excitation light on the surface of the object.
  • (F) shows the PSF when the mask having the configuration of (a) is used.
  • (G) shows the PSF when the double ring mask having the configuration of (b) is used.
  • (H) shows the PSF when the triple ring mask having the configuration of (c) is used.
  • (I) shows the PSF when the quadruple ring mask having the configuration of (d) is used.
  • J) shows the PSF when the 6-layer ring mask having the configuration of (e) is used.
  • the PSF of the main lobe can be reduced and the light peak intensity of the side lobe can be lowered.
  • the transmissive portion B1, the light-shielding portion A1, the transmissive portion B2, the light-shielding portion A2, the transmissive portion B3, the light-shielding portion A3, the transmissive portion B4 and the light-shielding portion will be described with reference to FIG.
  • the optimum value of the radius of the circle, which is the boundary between the adjacent transmissive portion and the light-shielding portion in A4, is searched for.
  • the size of the main lobe (for example, volume) and the size of the side lobes can be used as the evaluation at the time of searching for the optimum value.
  • the size of the main lobe may be the size of the condensing region of the illumination light, or the size of the fluorescence region generated through monophoton absorption or multiphoton absorption when the excitation light is condensed and irradiated. It may be the size of the region where non-linear processing is presumed to occur due to multiphoton absorption.
  • the magnitude of fluorescence is proportional to the n-th power of the intensity, so the ratio between the side lobe and the main lobe becomes large, and as a result, observation with a small side lobe can be realized. can.
  • an observation image having a small second lobe can be obtained.
  • the multiple ring mask of the present embodiment can further improve the resolution.
  • FIGS. 8 to 10 are views showing a comparison between the multiple ring mask of the prior art 2 and the multiple ring mask of the present embodiment.
  • the light input to the multiple ring mask is constant (top hat) in the beam cross section.
  • the light input to the multiple ring mask has a Gaussian distribution (the following equation (4)) in which the tail is cut off in the beam cross section.
  • r is the distance from the center position when the outer radius of the transparent portion of the outermost layer is standardized as 1.
  • Wex is a value of r at which the intensity becomes 1 / e 2 when the intensity at the center position is standardized as 1. In FIG. 9, Wex was set to 1.0, and in FIG. 10, Wex was set to 0.6.
  • the upper figure shows the double ring mask, the triple ring mask, and the quadruple ring mask of the prior art 2.
  • the lower figure shows the double ring mask, the triple ring mask, and the quadruple ring mask of the present embodiment.
  • FIG. 11 is a table summarizing the radial widths of the light-shielding portion and the transmissive portion in the multiple ring mask of the prior art 2 shown in the upper part of FIG. As shown in this table, in the multiple ring mask of the prior art 2, the radial widths of each light-shielding portion and each transmissive portion have the relationship of the above equation (1).
  • FIG. 12 is a table summarizing the radial widths of the light-shielding portion and the transmissive portion in the multiple ring mask of the present embodiment shown in the lower part of FIG. As shown in this table, in the multiple ring mask of the present embodiment, the radial widths of each light-shielding portion and each transmission portion have the relationship of the above equations (2) and (3).
  • FIG. 13 is a diagram showing a PSF when light is focused and irradiated on the surface of an object (when there is no aberration).
  • FIG. 13A shows the PSF when the mask is not used.
  • FIG. 13B shows a PSF when the double ring mask of the prior art 2 is used.
  • FIG. 13C shows the PSF when the double ring mask of the present embodiment is used.
  • FIG. 13D shows the PSF when the quadruple ring mask of the present embodiment is used.
  • the PSF can be made smaller when the double ring mask of the prior art 2 is used (FIG. 13 (b)) as compared with the case where the mask is not used (FIG. 13 (a)).
  • the PSF can be further reduced.
  • the value of the improvement rate (described later) in each case is shown.
  • the improvement rate in the case of FIG. 13 (b) is 1.34
  • the improvement rate in the case of FIG. 13 (c) is 1.65
  • the improvement rate in the case of FIG. 13 (d) is 1.78. ..
  • FIG. 14 is a diagram showing a PSF when light is focused and irradiated inside an object (when there is an aberration).
  • the inside of the living body (average refractive index 1.38) (depth 100 ⁇ m position) is irradiated with excitation light, and the fluorescent PSF generated from a minute fluorescent substance existing at that position is shown. Under this condition, a second lobe occurs when a ring mask is used due to the effect of spherical aberration caused by the difference in refractive index between the living body and air.
  • FIG. 14A shows a PSF without a mask.
  • FIG. 14B shows the PSF when the single ring mask of the prior art 1 is used.
  • FIG. 14C shows the PSF when the double ring mask of the prior art 2 is used.
  • FIG. 14D shows a PSF when the triple ring mask of the present embodiment is used without considering the internal light collection.
  • FIG. 14E shows a PSF when the triple ring mask of the present embodiment in consideration of internal light collection is used.
  • FIG. 15 is a graph showing the improvement rate for PSF in each case shown in FIG.
  • the improvement rate represents the degree of reduction of the PSF in each case with reference to the volume of the PSF when there is no aberration and no mask is used.
  • the larger the improvement rate the smaller the PSF.
  • FIG. 16 is a graph showing the size of the second lobe for the PSF in each case shown in FIG.
  • the second lobe indicates the magnitude of unnecessary light in the presence of aberration, and the intensity ratio with the main lobe is expressed as a numerical value. The smaller this number, the smaller the second robe.
  • the multiple ring mask of the present embodiment has a high improvement rate. Further, the multiple ring mask of the present embodiment has a large second lobe as compared with the multiple ring mask of the prior art 2, but has a small second lobe as compared with the single ring mask of the prior art 1.
  • the multiple ring mask of the present embodiment can be configured by applying a light-shielding material to the area of the light-shielding portion on the main surface of a flat plate made of a transparent material (for example, glass or the like). Further, the multiple ring mask of the present embodiment can be configured by using a spatial light modulator (SLM: Spatial Light Modulator).
  • SLM Spatial Light Modulator
  • the spatial light modulator may be either an amplitude modulation type or a phase modulation type. Depending on the pattern presented to the SLM, it may have a light-shielding portion and a transmissive portion.
  • Amplitude modulation type SLM includes a transmissive type such as a TFT (Thin-Film-Transistor) monitor and a reflective type such as a DMD (Digital Mirror Device).
  • FIG. 17 is a diagram showing a grating pattern presented to the SLM when a multiple ring mask is configured using a phase modulation type SLM.
  • the hatched region is the region where the grating is presented and can generate primary diffracted light.
  • the black-filled area is an area where the grating is not presented, and outputs the 0th-order light without generating the 1st-order diffracted light.
  • the SLM outputs the 0th-order light and the 1st-order diffracted light in different directions.
  • FIG. 17A shows a region where the grating pattern is presented as a transmitting portion.
  • the first-order diffracted light of the 0th-order light and the first-order diffracted light output from the SLM is selectively lensed. Condenses with light and blocks the 0th order light.
  • FIG. 17B shows a region where the grating pattern is not presented as a light-shielding portion. In this case, the 0th-order light of the 0th-order light and the 1st-order diffracted light output from the SLM is selectively lensed. Condenses with, and blocks the primary diffracted light.
  • a wave plate is arranged after the SLM, and the wavelength plate is used to change the polarization to arbitrary polarization.
  • An area of at least 2 pixels is required to present the grating pattern to the SLM.
  • the width of the transmissive portion in the radial direction is smaller than that of the light-shielding portion. Therefore, the case of condensing using the 0th-order light (FIG. 17B) is preferable.
  • the present embodiment it is also effective to perform aberration correction using SLM or the like.
  • Aberrations may be present not only in the object but also in the optical system including the SLM. By reducing the phase difference by correcting the aberration, good focusing can be achieved.
  • residual aberrations residual aberrations
  • residual aberrations may exist due to incomplete aberration correction, and short-term aberrations may occur due to unexpected or unsuppressable causes.
  • the immersion liquid intervening between the lens and the object has a non-uniform refractive index due to convection of the immersion liquid due to temperature unevenness, dissolution of the contents into the immersion liquid from the object, and the like. Aberration occurs due to the Schrelin phenomenon and the like.
  • aberration occurs due to the difference in the refractive index between the surface of the object and the immersion liquid and the variation in the refractive index due to the structure inside the object. Many of these are not easy to correct. Therefore, in order to obtain or process a high-quality image, it is important to use light having a high robustness against aberrations.
  • the multiple ring mask of the present embodiment can generate highly robust light.
  • FIG. 18 is a diagram showing a configuration of a modified example of the multiple ring mask of the present embodiment.
  • FIG. 18A shows a configuration in which a double ring mask having two ring-shaped light-shielding portions has a small light-shielding portion near the center position.
  • FIG. 18B shows a configuration in which a triple ring mask having three ring-shaped light-shielding portions has a small light-shielding portion near the center position.
  • FIG. 19 is a diagram showing an example of the light transmittance distribution in the 7-layer ring mask of the present embodiment.
  • the light transmittance in the transmitting portion is 1, and the light transmittance in the light-shielding portion is 0.3.
  • the multiple ring mask When changing to a lens for condensing with different magnification or NA, or when changing the intensity distribution of the input light to the multiple ring mask by changing the magnification of the beam expander or imaging system in the microscope, It is preferable to switch the pattern of the multiple ring mask. Further, when a laser light source in which the wavelength of the output light is variable is used, the light intensity distribution may change when the wavelength is changed, and in this case as well, it is preferable to switch the pattern of the multiple ring mask. In these cases, if the multiple ring mask is configured by using SLM, the pattern of the multiple ring mask can be switched easily and quickly.
  • the multiple ring mask may be one that utilizes the light that has passed through the transmitting portion of the input light by one flat plate shape, but the light is configured as described below with reference to FIGS. 20 and 21. It is also possible to form a configuration having a light-shielding portion and a transmissive portion by efficiently utilizing light by shaping the above.
  • FIG. 20 is a diagram showing an example of a toroidal lens pattern and a ring pattern projected by the pattern.
  • FIG. 20 (a) shows the phase pattern of a toroidal lens that collects light in a single ring-shaped region at the designed focal position.
  • FIG. 20 (b) shows a single ring pattern projected at the focal position by a toroidal lens having this phase pattern (FIG. 20 (a)).
  • FIG. 20 (c) shows the phase pattern of a toroidal lens that collects light in a double ring-shaped region at the designed focal position.
  • FIG. 20 (d) shows the pattern of the double ring projected at the focal position by the toroidal lens having this phase pattern (FIG. 20 (c)).
  • the pattern of FIG. 20 (c) is suitable for producing thin lines, but does not provide wide condensing. However, if ray tracing is used to design a ring-shaped mask pattern as shown in FIG. 20 (c), the position and width of the light can be controlled.
  • FIG. 21 is a diagram showing the configuration of a multiple ring mask having a light-shielding portion and a transmissive portion according to the pattern of the toroidal lens.
  • the multiplex ring mask includes an amplitude modulation element 21 and a phase modulation element 22, and outputs light having a light intensity distribution as shown on the right side of this figure from the phase modulation element 22. can do.
  • the amplitude modulation element 21 and the phase modulation element 22 may be SLM.
  • the light output from the laser light source and having an expanded beam diameter is input to the amplitude modulation element 21 in which the phase pattern as shown in FIG. 20 (c) is presented, and is spatially spatially provided by the amplitude modulation element 21. After the amplitude is modulated, it is input to the phase modulation element 22.
  • the light output from the amplitude modulation element 21 may propagate in different directions due to diffraction or refraction with respect to the light input to the amplitude modulation element 21. As the light propagates from the amplitude modulation element 21 to the phase modulation element 22, the light intensity distribution in the beam cross section changes.
  • the phase modulation element 22 is arranged at a position where a desired light intensity distribution (pattern as shown in FIG. 20D) can be obtained.
  • the light output from the phase modulation element 22 may propagate in different directions due to diffraction or refraction with respect to the light input to the phase modulation element 22.
  • the light output from the phase modulation element 22 travels in a direction parallel to the optical axis.
  • the light intensity distribution in the beam cross section of the light output from the phase modulation element 22 is a desired light intensity distribution (a pattern as shown in FIG. 20D).
  • the output light may be parallel light, the output light may be convergent light, or the output light may be divergent light. Further, the phase modulation element 22 may be a phase pattern that converges the output light to a plurality of points, or may be a phase pattern that corrects aberrations.
  • the multiple ring mask of the present embodiment has a configuration in which a plurality of masks each having one or a plurality of ring-shaped light-shielding portions provided around the center position are laminated. It may have.
  • FIG. 22 is a diagram showing a configuration example of a multiple ring mask in which a plurality of masks are laminated.
  • the triple ring mask shown in FIG. 3 can be formed by laminating the four masks shown in FIGS. 22 (a) to 22 (d) so that the center positions are matched.
  • the boundary between the light-shielding portion and the transmissive portion is a circle in the multiple ring mask of the present embodiment, but it may be an ellipse.
  • the shape of the beam cross section of the light output from the laser diode is elliptical, it is preferable to make the boundary between the light-shielding portion and the transmissive portion elliptical in the multiple ring mask.
  • FIG. 23 is a diagram showing an example of a pattern of a double ring mask suitable for generating fluorescence through a three-photon absorption process.
  • optical microscopes include a light irradiation device 1 (FIG. 1) that includes the multiple ring mask of the present embodiment and concentrates and irradiates the surface or the inside of the object 2, and the object 2 by the light irradiation device 1. It is provided with a light detection device that detects the light generated by the object 2 in response to the light irradiation of the object 2.
  • the light generated by the object 2 may be reflected light or scattered light having the same wavelength as the irradiation light, or may be fluorescent or Raman scattered light having a wavelength different from the wavelength of the irradiation light. ..
  • FIG. 24 is a diagram showing the configuration of the optical microscope 1A.
  • the optical microscope 1A includes a laser light source 11, a lens 12, a lens 13, a mask 14, a wave plate 15, and an objective lens 16. These constitute a light irradiation device (FIG. 1) that condenses and irradiates the surface or the inside of the object 2 with excitation light.
  • the excitation light output from the laser light source 11 is collimated as the beam diameter is expanded by the lenses 12 and 13, and is spatially intensity-modulated in the beam cross section by the mask 14 and output.
  • the excitation light output from the mask 14 is focused on the surface or inside of the object 2 by the objective lens 16 after the polarization is manipulated by the wave plate 15.
  • the optical microscope 1A includes a dichroic mirror 31, a lens 32, and a photodetector 33. These constitute a photodetector that detects the fluorescence generated in the object 2 in response to the excitation light irradiation of the object 2 by the light irradiation device.
  • the dichroic mirror 31 is provided on the optical path between the wave plate 15 and the objective lens 16.
  • the dichroic mirror 31 transmits the excitation light output from the laser light source 11 and reaches through the lens 12, the lens 13, the mask 14, and the wave plate 15, and outputs the excitation light to the objective lens 16.
  • fluorescence is generated at the focused position.
  • the dichroic mirror 31 reflects the fluorescence that has arrived from the object 2 through the objective lens 16 and outputs the fluorescence to the lens 32.
  • the dichroic mirror 31 may be provided on the optical path between the mask 14 and the wave plate 15.
  • the lens 32 collects the fluorescence arriving from the dichroic mirror 31 on the light receiving surface of the photodetector 33.
  • the photodetector 33 detects the fluorescence generated in the object 2 in response to the irradiation of the object 2 with the excitation light.
  • the photodetector 33 may be a photomultiplier tube or a photodiode. Further, a filter that selectively transmits fluorescence may be provided in front of the light receiving surface of the photodetector 33.
  • the optical microscope 1A includes a computer 41 and a stage 42.
  • the computer 41 inputs the data of the fluorescence detection result by the photodetector 33.
  • the stage 42 places the object 2 on it.
  • the stage 42 can move the object 2 in the z-direction, and also in the x-direction and the y-direction.
  • the object 2 can also be moved.
  • a scanning unit for example, a galvano scanner
  • an actuator for example, an actuator
  • a piezo actuator may be provided.
  • the computer 41 scans the excitation light condensing position on the object 2 by driving the stage 42, and is a photodetector when the excitation light condensing position is set at each position of the object 2 by the scanning.
  • the data of the fluorescence detection result by 33 is input.
  • the computer 41 can acquire a three-dimensional fluorescence image of the object 2.
  • the optical microscope 1A can realize a smaller PSF and suppress the generation of side lobes and second lobes, so that the spatial resolution is higher.
  • a three-dimensional fluorescence image having the above can be obtained.
  • the optical microscope 1A can acquire a three-dimensional fluorescence image having a higher spatial resolution by using a multiple ring mask having a pattern suitable for generating fluorescence through a multiphoton absorption process as the mask 14. can.
  • FIG. 25 is a diagram showing the configuration of the optical microscope 1B.
  • the configuration of the optical microscope 1B (FIG. 25) is that a pinhole plate 34 is provided between the lens 32 and the photodetector 33 in the photodetector. It's different.
  • the pinhole plate 34 has a small-diameter opening through which light can pass.
  • the opening of the pinhole plate 34 is at a position conjugate with respect to the excitation light condensing position by the light irradiator.
  • the photodetector 33 receives the fluorescence generated in the object 2 that has passed through the opening of the pinhole plate 34.
  • the optical microscope 1B has the configuration of a confocal fluorescence microscope.
  • the optical microscope 1B can realize a smaller PSF and suppress the generation of side lobes and second lobes, so that the spatial resolution is higher.
  • a three-dimensional fluorescence image having the above can be obtained.
  • a multiple ring mask having a pattern suitable for generating fluorescence through a multiphoton absorption process may be used as the mask 14.
  • FIG. 26 is a diagram showing the configuration of the optical microscope 1C.
  • the configuration of the optical microscope 1C shows an acoustic optical element (AOM: Acousto-Optic Modulator) 35 between the laser light source 11 and the lens 12 in the light irradiation device.
  • AOM Acousto-Optic Modulator
  • the AOM35 is a modulation unit that temporally modulates the intensity of excitation light irradiation on the object 2.
  • the AOM 35 modulates the intensity of the excitation light irradiation in a sinusoidal manner at the modulation frequency ⁇ instructed by the computer 41. As a result, the intensity of the excitation light applied to the object 2 changes in a sinusoidal manner over time.
  • the optical microscope 1C has the configuration of a saturated excitation (SAX) microscope.
  • SAX microscope utilizes the following phenomena.
  • the intensity of the excitation light applied to the object is small, the intensity of the fluorescence generated by the object due to the irradiation of the excitation light is proportional to the intensity of the excitation light.
  • the fluorescence intensity saturates and becomes a non-linear relationship with the excitation light intensity. Therefore, when an object is irradiated with high-intensity excitation light time-modulated at the modulation frequency ⁇ , the temporal change in the fluorescence intensity generated in the object includes the fundamental wave component of the frequency ⁇ and is also critical.
  • the nth harmonic component which is a positively formed component. Since the excitation light intensity is higher in the excitation light condensing region as it is closer to the center position, the nth harmonic component of the fluorescence intensity signal represents the intensity of fluorescence generated near the center position in the excitation light condensing region. ..
  • the optical microscope 1C as a SAX microscope utilizes such a phenomenon, and can acquire a three-dimensional fluorescence image having a higher spatial resolution.
  • the optical microscope 1C has a higher spatial resolution by using the multiple ring mask of the present embodiment (particularly, a multiple ring mask having a pattern suitable for generating fluorescence through a multiphoton absorption process) as the mask 14. A three-dimensional fluorescence image having the above can be obtained.
  • FIG. 27 is a diagram showing the configuration of the optical microscope 1D.
  • the configuration of the optical microscope 1D includes AOM35A, AOM35B, and the like as modulation units that temporally modulate the intensity of excitation light irradiation on the object 2.
  • the difference is that the photodetector 36 is further provided, and a reference signal having the same frequency as the modulation frequency of the excitation light is given to the lock-in amplifier 43 from the photodetector 36.
  • the modulation unit that temporally modulates the intensity of the excitation light irradiation on the object 2 includes a beam splitter 51, a beam splitter 52, a mirror 53, and a mirror 54 in addition to the AOM35A and AOM35B. These are provided on the optical path of the excitation light between the laser light source 11 and the lens 12.
  • the beam splitter 51 splits the excitation light output from the laser light source 11 into two to obtain the first branch light and the second branch light.
  • the first branching light output from the beam splitter 51 is input to the beam splitter 52 via the AOM35A.
  • the second branch light output from the beam splitter 51 is input to the beam splitter 52 via the mirror 53, AOM35B and the mirror 54.
  • the beam splitter 52 inputs the first-branched light arriving from the AOM35A and the second-branched light arriving from the mirror 54, and bifurcates each of the first-branched light and the second-branched light.
  • the excitation light due to the interference between the first branch light and the second branch light is output to both the lens 12 and the light detector 36.
  • the AOM35A and 35B modulate the waveform of the excitation light in a sinusoidal manner at different modulation frequencies instructed by the computer 41.
  • the intensity of the excitation light output from the beam splitter 52 to the lens 12 and the photodetector 36 changes in a sinusoidal manner over time.
  • the modulation frequency ⁇ of the excitation light output from the beam splitter 52 corresponds to the difference between different modulation frequencies instructed by the computer 41 to the AOM 35A and 35B.
  • the excitation light output from the beam splitter 52 to the lens 12 is focused and irradiated on the surface or inside of the object 2.
  • the photodetector 36 receives the excitation light output from the beam splitter 52 and outputs a reference signal having the same frequency as the modulation frequency ⁇ of the excitation light to the lock-in amplifier 43.
  • the lock-in amplifier 43 inputs a fluorescence intensity signal representing a temporal change in the fluorescence intensity detected by the photodetector 33, and also inputs a reference signal of the modulation frequency ⁇ output from the photodetector 36. Then, the lock-in amplifier 43 selectively detects the component of the frequency n ⁇ which is n times the modulation frequency ⁇ of the input fluorescence intensity signal and outputs it to the computer 41.
  • n is a positive integer.
  • the lock-in amplifier 43 selectively detects and outputs the fundamental wave component of frequency ⁇ among the fluorescence intensity signals. If n ⁇ 2, the lock-in amplifier 43 selectively detects and outputs the nth harmonic component of the fluorescence intensity signal.
  • the optical microscope 1D has the same effect and effect as the optical microscope 1C, and when n ⁇ 2, it has the same SAX microscope configuration as the optical microscope 1C, so that a three-dimensional fluorescence image having higher spatial resolution can be obtained. can do.
  • FIG. 28 is a diagram showing the configuration of the optical microscope 1E. Compared with the configuration of the optical microscope 1A (FIG. 24), the configuration of the optical microscope 1E (FIG. 28) is different in that the adjusting unit 37 is provided between the laser light source 11 and the lens 12 in the light irradiation device. ..
  • the adjusting unit 37 adjusts the intensity of the excitation light irradiation on the object 2.
  • the adjusting unit 37 may be an optical component having a variable transmittance (for example, an acoustic optical element, an ND filter, a liquid crystal cell, etc.), or may be a combination of two or more optical components (for example, a wave plate and a polarizer). It may be configured.
  • the adjusting unit 37 is composed of a wave plate and a polarizer, the intensity of excitation light irradiation to the object 2 can be adjusted by changing the direction of the optical axis of the wavelength plate or the polarizer.
  • the adjusting unit may be integrated with the laser light source 11. For example, the intensity of the excitation light output from the laser light source 11 can be adjusted by changing the drive current given to the laser light source 11. May be good.
  • the computer 41 sets the intensity of the excitation light output from the adjusting unit 37 and irradiates the object 2 to each of a plurality of values, and inputs a fluorescence intensity signal representing the fluorescence intensity detected by the photodetector 33. Then, the computer 41 uses the light generated by the object 2 based on the intensity of the fluorescence generated by the object 2 when the excitation light irradiation intensity to the object 2 is set to each of a plurality of values by the adjusting unit 37. Find the non-linear component contained in.
  • the non-linear component contained in the fluorescence can be obtained as follows.
  • the intensity of the excitation light irradiating the object 2 is set by the adjustment unit 37 to I ex_L, the fluorescence intensity of the light detector 33 detects at this time and I L.
  • I ex_L is an excitation light intensity in a range in which the fluorescence intensity is proportional to the excitation light intensity.
  • the intensity of the excitation light applied to the object 2 is set to I ex_H by the adjusting unit 37, and the fluorescence intensity detected by the photodetector 33 at this time is set to I H.
  • I ex_H is the excitation light intensity in the range in which the fluorescence intensity is saturated and has a non-linear relationship with the excitation light intensity. Then, the non-linear component I SAX included in the fluorescence intensity when the intensity of the excitation light applied to the object 2 is set to I ex_H is obtained by the following equation.
  • This optical microscope 1E is similar to the optical microscope 1C and the optical microscope 1D in that a non-linear component included in the fluorescence intensity when the intensity of the excitation light applied to the object 2 is set to a large value is obtained. Therefore, the optical microscope 1E can acquire a three-dimensional fluorescence image having a higher spatial resolution, similar to the optical microscope 1C and the optical microscope 1D.
  • the excitation light output from the laser light source 11 may be continuous light or pulsed light.
  • the excitation light is preferably pulsed light.
  • the optical microscopes 1C to 1E which are SAX microscopes, can be configured as a confocal fluorescence microscope in the same manner as the optical microscope 1B. That is, a pinhole plate having a small-diameter opening at a position conjugate with respect to the excitation light condensing position is arranged in front of the light receiving surface of the photodetector 33, and among the fluorescence generated in the object 2, the pinhole plate of the pinhole plate The fluorescence that has passed through the aperture may be received by the photodetector 33.
  • the intensity of the fundamental wave component of fluorescence generated through the two-photon absorption process of excitation light is P 1
  • the intensity of the second harmonic component is P 2
  • the intensity of the third harmonic component is P 3 .
  • these P 1 ⁇ P 3 represents the intensity of fluorescence generated in a region mainly represented by the following equation (6).
  • PSF 2 corresponds to PSF in the two-photon absorption process
  • PSF 4 corresponds to PSF in the four-photon absorption process
  • PSF 6 corresponds to PSF in the six-photon absorption process. It is a thing.
  • the PSF 4 component can be obtained by detecting the 3rd harmonic component.
  • the PSF 6 component can be obtained by the following equation (7) by detecting the fundamental wave component, the second harmonic component, and the third harmonic component.
  • FIG. 29 is a diagram showing an example of a pattern of multiple ring masks used during PSF 2 observation in optical microscopes 1C to 1E.
  • FIG. 30 is a diagram showing an example of the pattern of the multiple ring mask used at the time of PSF 4 observation in the optical microscopes 1C to 1E.
  • FIG. 31 is a diagram showing an example of a pattern of the multiple ring mask used at the time of PSF 6 observation in the optical microscopes 1C to 1E.
  • FIG. 32 is a diagram showing an example of PSF 2 in the case of two-photon excitation.
  • Figure 32 (a) shows the PSF 2 during mask unused
  • FIG 32 (b) shows the PSF 2 when using single-ring mask
  • FIG. 32 (c) is PSF 2 when using 8-fold ring mask Mask show.
  • FIG. 33 is a diagram showing an example of PSF 4 in the case of two-photon excitation. Shown in FIG. 33 (a) shows the PSF 4 when mask nonuse
  • FIG 33 (b) shows the PSF 4 when using single-ring mask
  • FIG. 33 (c) is PSF 4 when using 8-fold ring mask Mask show.
  • FIG. 34 is a diagram showing an example of PSF 6 in the case of two-photon excitation.
  • Figure 34 (a) shows the PSF 6 when the mask not in use
  • FIG. 34 (b) shows the PSF 6 during use single ring mask
  • FIG. 35 is a table summarizing the radial and axial sizes of the PSF in various cases.
  • the magnitude (unit: nm) in the radial and axial directions of the PSF when the objective lens 16 having a magnification of 60 times, an NA of 1.3, and a working distance of 300 ⁇ m is used is shown.
  • PSF 4 is smaller than PSF 2 and PSF 6 is smaller than PSF 4. Further, PSF 2 , PSF 4 , and PSF 6 are smaller when the single ring mask is used than when the mask is not used, and smaller when the multiple ring mask is used than when the single ring mask is used.
  • FIG. 36 is a diagram showing the light intensity distribution in the condensing region inside the object 2.
  • the object to be observed is an epoxy resin containing a plurality of fluorescent beads having a size of 0.2 ⁇ m. This light intensity distribution was observed with a two-photon excitation fluorescence microscope and is on the xz plane. A silicone immersion objective lens having an NA of 1.05 was used.
  • FIG. 36 (a) shows the light intensity distribution observed when the mask was not used
  • FIG. 36 (b) shows the light intensity distribution observed when the 6-layer ring mask was used.
  • the focusing region can be reduced by using the multiple ring mask of the present embodiment.
  • FIG. 37 is a diagram showing an example of an image acquired by a two-photon excitation fluorescence microscope.
  • the object to be observed is an epoxy resin containing a plurality of fluorescent beads having a size of 0.2 ⁇ m.
  • FIG. 37 (a) shows an image acquired when the mask is not used
  • FIG. 37 (b) shows an image acquired when the triple ring mask is used.
  • a fluorescence image having high spatial resolution can be obtained by using the multiple ring mask of the present embodiment in a two-photon excitation fluorescence microscope.
  • photoacoustic microscopes include a light irradiation device 1 (FIG. 1) that includes the multiple ring mask of the present embodiment and concentrates and irradiates the surface or the inside of the object 2, and the object by the light irradiation device 1. It is provided with a sound wave detection device that detects the sound wave generated in the object 2 in response to the pulsed light irradiation to 2.
  • a light irradiation device 1 FIG. 1
  • sound wave detection device that detects the sound wave generated in the object 2 in response to the pulsed light irradiation to 2.
  • FIG. 38 is a diagram showing the configuration of the photoacoustic microscope 1F.
  • the photoacoustic microscope 1F includes a laser light source 11, a lens 12, a lens 13, a mask 14, a wave plate 15, and an objective lens 16. These constitute a light irradiation device (FIG. 1) that condenses and irradiates the surface or the inside of the object 2.
  • the pulsed light output from the laser light source 11 is collimated as the beam diameter is expanded by the lenses 12 and 13, and is spatially intensity-modulated in the beam cross section by the mask 14 and output.
  • the pulsed light output from the mask 14 is focused on the surface or inside of the object 2 by the objective lens 16 after the polarization is manipulated by the wave plate 15.
  • the photoacoustic microscope 1F is provided with a transducer 38.
  • the transducer 38 is a sound wave detection device that detects sound waves generated by the object 2 in response to pulsed light irradiation of the object 2. When pulsed light is focused and irradiated on the surface or inside of the object 2, a shock wave is generated at the focused position.
  • the transducer 38 outputs an electric pulse having a pulse height corresponding to the magnitude of the shock wave (sound wave) to the computer 41.
  • the computer 41 inputs the electric pulse signal output from the transducer 38.
  • the photoacoustic microscope 1F scans a stage (or a pulsed light condensing position) for moving the object 2 in the x-direction, the y-direction, and the z-direction, respectively, in the same manner as the configuration of the optical microscope 1A (FIG. 24).
  • a scanning unit and an actuator for moving the objective lens 16 in the z direction) are provided.
  • the stage is not shown in FIG. 38.
  • the computer 41 scans the pulsed light condensing position on the object 2 by driving the stage (or scanning unit, actuator), and sets the pulsed light condensing position at each position of the object 2 by the scanning.
  • An electric pulse signal representing the sound detection result by the transducer 38 at that time is input.
  • the computer 41 can acquire a three-dimensional image of the object 2.
  • the photoacoustic microscope 1F can realize a smaller PSF and suppress the generation of side lobes and second lobes, so that the space is higher.
  • a three-dimensional image having a resolution can be acquired.
  • the photoacoustic microscope 1F can acquire a three-dimensional image having a higher spatial resolution by using a multiple ring mask having a pattern suitable for generating a shock wave through a multiphoton absorption process as the mask 14. can.
  • the photoacoustic microscope 1F is provided with an adjusting unit for adjusting the pulse width of the pulsed light applied to the object 2.
  • This adjusting unit may be integrated with the laser light source 11. The shorter the pulse width of the pulsed light, the more likely it is that non-linear absorption of the pulsed light will occur in the object 2, and not only a shock wave will be generated by the single photon absorption process, but also a shock wave will be generated by the two-photon absorption process.
  • the electric pulse signal from the transducer 38 that detected the shock wave shock wave caused by both the single photon absorption process and the two-photon absorption process generated when the pulse width was set short, and the pulse width can be obtained.
  • the electric pulse signal from the transducer 38 that detected the shock wave generated when the setting was long mainly the shock wave due to the single photon absorption process
  • the component of the shock wave mainly due to the two-photon absorption process that is, that is).
  • Information on a narrow area where the two-photon absorption process can occur can be obtained. This makes it possible to acquire a three-dimensional image having high spatial resolution.
  • FIG. 39 is a diagram showing the configuration of a photoacoustic microscope 1G.
  • the configuration of the photoacoustic microscope 1G includes a photodetector 36, a lock-in amplifier 43, AOM35A, AOM35B, a beam splitter 51, a beam splitter 52, and a mirror 53. And a mirror 54. These are similar to those in the configuration of the optical microscope 1D (FIG. 27).
  • the AOM35A, AOM35B, beam splitter 51, beam splitter 52, mirror 53, and mirror 54 constitute a modulation unit that temporally modulates the intensity of pulsed light irradiation on the object 2.
  • the photodetector 36 receives the pulsed light output from the beam splitter 52 and outputs a reference signal having the same frequency as the modulation frequency ⁇ of the pulsed light to the lock-in amplifier 43.
  • the lock-in amplifier 43 inputs a shock wave intensity signal representing a temporal change in the shock wave intensity detected by the transducer 38, and also inputs a reference signal of the modulation frequency ⁇ output from the photodetector 36. Then, the lock-in amplifier 43 selectively detects the component of the frequency n ⁇ which is n times the modulation frequency ⁇ of the input shock wave intensity signal and outputs it to the computer 41. n is a positive integer. If n ⁇ 2, the lock-in amplifier 43 selectively detects and outputs the nth harmonic component of the shock wave intensity signal.
  • the nth harmonic component of the frequency n ⁇ in the shock wave intensity signal is based on the shock wave generated through the n photon absorption process of the pulsed light in the object 2. Since the pulsed light intensity is higher as it is closer to the center position in the pulsed light condensing region, the nth harmonic component of the shock wave intensity signal represents the intensity of the shock wave generated near the center position in the pulsed light condensing region. ..
  • the photoacoustic microscope 1G can realize a smaller PSF and suppress the generation of side lobes and second lobes, so that the space is higher.
  • a three-dimensional image having a resolution can be acquired.
  • the photoacoustic microscope 1G can acquire a three-dimensional image having a higher spatial resolution by obtaining the nth harmonic component of the shock wave intensity signal.
  • the multiple ring mask of the present embodiment, the light irradiation device provided with the multiple ring mask, and the microscope provided with the light irradiation device have the following effects.
  • immersion liquid or an object may be an aberration factor.
  • aberrations occur due to the Schrelin phenomenon in which the refractive index becomes non-uniform due to convection of the immersion liquid due to temperature unevenness, dissolution of the contents from the object into the immersion liquid, and the like.
  • aberration occurs due to the difference in the refractive index between the surface of the object and the immersion liquid and the variation in the refractive index due to the structure inside the object.
  • Measurable aberrations can be corrected. However, it is not easy to deal with unexpected short-time aberrations by correction.
  • the multiple ring mask of the present embodiment can not only further increase the improvement rate of PSF, but also reduces the influence of aberration by designing in consideration of the second lobe caused by aberration, so that good observation can be performed. It can be realized.
  • the multiple ring mask of this embodiment enables high-resolution observation due to these effects.
  • improvement of about 1.2 times is expected in both the horizontal direction (direction perpendicular to the optical axis) and the vertical direction (direction perpendicular to the optical axis). This is the same as the one in which the NA of the objective lens is improved by 1.05 times.
  • Internal processing with small processing marks can be expected in processing as well.
  • the PSF can be reduced beyond the restriction.
  • the number of ring-shaped light-shielding portions may be 2 or more, and the upper limit is not particularly specified, but about 28 is sufficient, preferably about 3 or more and 16 or less. If the number of ring-shaped light-shielding portions is large, the light utilization efficiency is lowered, which is not preferable, and also, the expressive ability is lowered because the radial width of the transmitting portion is reduced, which is not preferable. However, when the number of ring-shaped light-shielding portions is large, the amount of increase in background noise due to the influence of aberration during internal observation of the living body can be suppressed, and a high-quality image can be obtained.
  • the upper limit of the number of ring-shaped light-shielding portions is about 28.
  • the light irradiation device When the light irradiation device is provided with the multiple ring mask of the present embodiment, the focused region of the excitation light can be reduced, high-resolution measurement is possible, or processing with small processing marks is possible.
  • the light irradiation device provided with the multiple ring mask of the present embodiment can be suitably used in microscopic observation and processing using multiphoton absorption in which the intensity ratio of the main lobe and the side lobe becomes large.
  • a laser scanning confocal microscope is known as a microscope with high resolution.
  • This confocal microscope can acquire a fluorescence image by utilizing single photon excitation of excitation light. Since the confocal microscope mainly uses the excitation light in the visible region, the excitation light is largely absorbed and scattered in the object (living body). Further, in a confocal microscope, fluorescence may be generated from all the regions irradiated with the excitation light in the object, and a pinhole is used as a local detection element for improving the resolution. In observing the deep part of the object, the effect of this pinhole becomes small because the aberration and scattering caused by the object become large. Therefore, the confocal microscope has a demerit that the optical resolution is low. However, a confocal microscope is effective when observing the surface of an object.
  • the microscope using the light irradiation device provided with the multiple ring mask of the present embodiment suppresses the influence of aberration not only on the surface of the object but also inside the object to acquire a high-resolution fluorescence image. Can be done. Further, when multiphoton absorption is used, the excitation light in the near infrared region can be used, so that the absorption and scattering of the excitation light in the object (living body) is small. In this respect as well, the light irradiation device of the present embodiment can be suitably used for observing the inside of the object.
  • the multiple ring mask, the light irradiation device, and the microscope are not limited to the above embodiments and configuration examples, and can be variously modified.
  • the multiple ring mask of the above embodiment is a multiple ring mask that spatially intensity-modulates the light beam cross section of the input light and outputs the modulated light, and has a ring shape provided around the center position.
  • It has a transmissive portion and a transmissive portion of the outermost layer provided outside the light-shielding portion of the outermost layer of the plurality of light-shielding portions, and has a radial direction of each of two adjacent light-shielding portions of the plurality of light-shielding portions.
  • the width of is larger than the radial width of the transmissive portion provided between these two light-shielding portions.
  • This multiplex ring mask includes an amplitude modulation type or phase modulation type spatial light modulator, and preferably has a light shielding portion and a transmissive portion according to the pattern presented to the spatial light modulator. It is preferable that the multiple ring mask includes a toroidal lens and has a light-shielding portion and a transmissive portion according to the pattern of the toroidal lens. Further, it is preferable that the multiple ring mask has a configuration in which a plurality of masks each having one or a plurality of ring-shaped light-shielding portions provided around the center position are laminated.
  • the light irradiation device of the above embodiment is on an optical path between a light source that outputs coherent light, a condensing optical system that condenses the light output from the light source, and a condensing position between the light source and the condensing optical system. It is configured to include the above-mentioned multiple ring mask provided in the above.
  • the optical microscope of the above embodiment detects the above-mentioned light irradiating device that concentrates and irradiates the surface or the inside of the object, and the light generated by the object in response to the light irradiation of the object by the light irradiating device. It is configured to include an optical detection device.
  • the photodetector is a pinhole plate that has an aperture at a position conjugate with the condensing position of the photoirradiator, and light detection that receives light that has passed through the aperture among the light generated by the object. It is preferable to have a configuration including a vessel.
  • the light irradiation device includes a modulation unit that temporally modulates the intensity of light irradiation to the object, and the light detection device includes a modulation frequency of the light generated in the object when the light irradiation intensity is modulated by the modulation unit. It is also preferable to have a configuration in which a frequency component of n times (n is an integer of 1 or more) is obtained.
  • the light irradiation device includes an adjusting unit for adjusting the intensity of light irradiation to the object
  • the photodetector device is a target when the light irradiation intensity to the object is set to each of a plurality of values by the adjusting unit. It is also preferable to detect the light generated by the object and obtain the non-linear component contained in the light generated by the object based on the detection results.
  • the photoacoustic microscope of the above embodiment includes the above-mentioned light irradiation device that concentrates and irradiates the surface or the inside of the object with pulsed light, and the sound wave generated by the object in response to the pulsed light irradiation of the object by the light irradiation device. It is configured to include a sound wave detection device for detecting light.
  • the light irradiation device includes an adjusting unit for adjusting the pulse width of the pulsed light applied to the object, and the sound wave detecting device includes a pulse width set to each of a plurality of values by the adjusting unit. It is also preferable to detect the sound waves generated by the object and to obtain the components of the sound waves generated by the multiphoton absorption process among the sound waves generated by the object based on these detection results. Further, the light irradiation device includes a modulation unit that temporally modulates the intensity of pulse light irradiation to the object, and the sound wave detection device is used when the pulse light irradiation intensity is modulated by the modulation unit among the sounds generated in the object. It is also preferable to obtain a component having a frequency n times (n is an integer of 1 or more) of the modulation frequency of.
  • the present invention can be used as a device capable of efficiently condensing light in a region smaller than the diffraction limit. It can also be used as a microscope capable of acquiring images with high spatial resolution.

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Abstract

光照射装置１は、対象物２の表面または内部に光を集光して、対象物２を観察または加工するものであり、レーザ光源１１、レンズ１２、レンズ１３、マスク１４、波長板１５およびレンズ１６を備える。マスク１４は、入力される光のビーム断面において空間的に強度変調して当該変調後の光を出力する多重リングマスクであって、中心位置の周りに設けられたリング形状の複数の遮光部と、複数の遮光部のうちの隣り合う二つの遮光部の間に設けられた透過部と、を有する。複数の遮光部のうちの隣り合う二つの遮光部それぞれの径方向の幅が、これら二つの遮光部の間に設けられた透過部の径方向の幅より大きい。これにより、回折限界より小さい領域に効率よく光を集光することができる光照射装置が実現される。

Description

多重リングマスク、光照射装置、光学顕微鏡および光音響顕微鏡
　本開示は、入力される光のビーム断面において空間的に強度変調して当該変調後の光を出力する多重リングマスク、このような多重リングマスクを備える光照射装置、ならびに、このような光照射装置を備える光学顕微鏡および光音響顕微鏡に関するものである。
　被観察物を観察する場合や被加工物を加工する場合に、レーザ光源等の光源から出力される光は、レンズ等を含む集光光学系を経て対象物（被観察物または被加工物）の表面または内部に集光照射される。このように光を集光する場合、その集光径の大きさの目安であるビームウェスト径は、光の波長の半分程度までしか小さくすることができないことが知られている。これは回折限界と呼ばれる。特許文献１および非特許文献１には、回折限界より小さい領域に光を集光する技術が記載されている。
　非特許文献１に記載された光照射装置の技術（以下「従来技術１」という。）は、単リングマスクを用いる。この単リングマスクは、単一のリング形状の遮光部と、この遮光部の内側および外側それぞれに設けられた透過部とを有する。従来技術１では、光源と集光光学系による集光位置との間に単リングマスクが配置され、単リングマスクの遮光部の内側および外側それぞれの透過部を通過した光が集光位置に到達する。集光位置において、二つの光が干渉することにより、回折限界より小さい領域に光を集光することができるとされている。
　特許文献１に記載された光照射装置の技術（以下「従来技術２」という。）は、多重リングマスクを用いる。従来技術２で用いられる多重リングマスクは、複数のリング形状の遮光部と、これらの複数の遮光部の間に設けられた透過部とを有し、遮光部と透過部とが交互に設けられている。また、この多重リングマスクでは、中心位置から遠いほど、リング形状の遮光部または透過部の径方向の幅が大きい。従来技術２では、光源と集光光学系による集光位置との間に多重リングマスクが配置され、多重リングマスクの各透過部を通過した光が集光位置に到達する。従来技術２でも、回折限界より小さい領域に光を集光することができるとされている。
特許第５１４４２１２号公報
Ryosuke Oketani, et al, "Saturated two-photon excitation fluorescence microscopy with core-ring illumination," Optics Letters, Vol.42, No.3, pp.571-574 (2017).
　従来技術１，２では、集光位置において回折限界より小さい領域に光が集光され得るものの、これとは異なる領域にも光の一部が集光される場合があり、また、集光領域の大きさ又は形状が意図どおりにならない場合がある。
　本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、回折限界より小さい領域に効率よく光を集光することができる光照射装置を提供することを目的とする。また、このような光照射装置において好適に用いられる多重リングマスクを提供することを目的とする。また、このような光照射装置を備えて高空間分解能の画像を取得することができる光学顕微鏡および光音響顕微鏡を提供することを目的とする。
　本発明の第１態様は多重リングマスクである。多重リングマスクは、入力される光のビーム断面において空間的に強度変調して当該変調後の光を出力する多重リングマスクであって、中心位置の周りに設けられたリング形状の複数の遮光部と、複数の遮光部のうちの隣り合う二つの遮光部の間に設けられた透過部と、複数の遮光部のうちの最内層の遮光部の内側に設けられた最内層の透過部と、複数の遮光部のうちの最外層の遮光部の外側に設けられた最外層の透過部と、を有し、複数の遮光部のうちの隣り合う二つの遮光部それぞれの径方向の幅が、これら二つの遮光部の間に設けられた透過部の径方向の幅より大きい。
　本発明の第２態様は光照射装置である。光照射装置は、コヒーレントな光を出力する光源と、光源から出力される光を集光する集光光学系と、光源と集光光学系による集光位置との間の光路上に設けられた上記の多重リングマスクと、を備える。
　本発明の第３態様は光学顕微鏡である。光学顕微鏡は、対象物の表面または内部に光を集光照射する上記の光照射装置と、光照射装置による対象物への光照射に応じて対象物で生じた光を検出する光検出装置と、を備える。
　本発明の第４態様は光音響顕微鏡である。光音響顕微鏡は、対象物の表面または内部にパルス光を集光照射する上記の光照射装置と、光照射装置による対象物へのパルス光照射に応じて対象物で生じた音波を検出する音波検出装置と、を備える。
　本発明の各態様によれば、回折限界より小さい領域に効率よく光を集光することができる。また、高空間分解能の画像を取得することができる顕微鏡を実現することができる。
図１は、単リングマスクまたは多重リングマスクを備える光照射装置１の構成を示す図である。 図２は、単リングマスクの構成を示す図である。 図３は、多重リングマスクの構成を示す図である。 図４（ａ）～（ｌ）は、マスクの様々な構成例およびＰＳＦを示す図である。 図５（ａ）～（ｄ）は、単リングマスクの使用／非使用および収差媒体の有／無それぞれの場合の蛍光発生領域を示す図である。 図６（ａ）～（ｊ）は、マスクの様々な構成例およびＰＳＦを示す図である。 図７（ａ）～（ｊ）は、マスクの様々な構成例およびＰＳＦを示す図である。 図８は、従来技術２の多重リングマスクと本実施形態の多重リングマスクとを比較して示す図である。 図９は、従来技術２の多重リングマスクと本実施形態の多重リングマスクとを比較して示す図である。 図１０は、従来技術２の多重リングマスクと本実施形態の多重リングマスクとを比較して示す図である。 図１１は、図８の上段に示した従来技術２の多重リングマスクにおける遮光部および透過部それぞれの径方向の幅を纏めた表である。 図１２は、図８の下段に示した本実施形態の多重リングマスクにおける遮光部および透過部それぞれの径方向の幅を纏めた表である。 図１３（ａ）～（ｄ）は、対象物の表面に光を集光照射する場合（収差がない場合）のＰＳＦを示す図である。 図１４（ａ）～（ｅ）は、対象物の内部に光を集光照射する場合（収差がある場合）のＰＳＦを示す図である。 図１５は、図１４に示した各場合のＰＳＦについて改善率を示すグラフである。 図１６は、図１４に示した各場合のＰＳＦについてセカンドローブの大きさを示すグラフである。 図１７（ａ）および図１７（ｂ）は、位相変調型のＳＬＭを用いて多重リングマスクを構成する場合においてＳＬＭに提示するグレーティングパターンを示す図である。 図１８（ａ）および図１８（ｂ）は、本実施形態の多重リングマスクの変形例の構成を示す図である。 図１９は、本実施形態の７重リングマスクにおける光透過率分布の例を示す図である。 図２０（ａ）～（ｄ）は、トロイダルレンズのパターン及びこれにより投影されるリングパターンの例を示す図である。 図２１は、トロイダルレンズのパターンに応じて遮光部および透過部を有する多重リングマスクの構成を示す図である。 図２２（ａ）～（ｄ）は、複数のマスクが積層されてなる多重リングマスクの構成例を示す図である。 図２３は、３光子吸収過程を経て蛍光を発生させる場合に好適な２重リングマスクのパターンの例を示す図である。 図２４は、光学顕微鏡１Ａの構成を示す図である。 図２５は、光学顕微鏡１Ｂの構成を示す図である。 図２６は、光学顕微鏡１Ｃの構成を示す図である。 図２７は、光学顕微鏡１Ｄの構成を示す図である。 図２８は、光学顕微鏡１Ｅの構成を示す図である。 図２９は、光学顕微鏡１Ｃ～１ＥにおいてＰＳＦ２観測時に用いられる多重リングマスクのパターンの例を示す図である。 図３０は、光学顕微鏡１Ｃ～１ＥにおいてＰＳＦ４観測時に用いられる多重リングマスクのパターンの例を示す図である。 図３１は、光学顕微鏡１Ｃ～１ＥにおいてＰＳＦ６観測時に用いられる多重リングマスクのパターンの例を示す図である。 図３２（ａ）～（ｃ）は、２光子励起の場合のＰＳＦ２の例を示す図である。 図３３（ａ）～（ｃ）は、２光子励起の場合のＰＳＦ４の例を示す図である。 図３４（ａ）～（ｃ）は、２光子励起の場合のＰＳＦ６の例を示す図である。 図３５は、様々な場合におけるＰＳＦの径方向および軸方向の大きさを纏めた表である。 図３６（ａ），（ｂ）は、対象物２の内部の集光領域における光強度分布を示す図である。 図３７（ａ），（ｂ）は、２光子励起蛍光顕微鏡により取得された画像の例を示す図である。 図３８は、光音響顕微鏡１Ｆの構成を示す図である。 図３９は、光音響顕微鏡１Ｇの構成を示す図である。
　以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
　図１は、単リングマスクまたは多重リングマスクを備える光照射装置１の構成を示す図である。光照射装置１は、対象物２の表面または内部に光を集光して、対象物２を観察または加工するものであり、レーザ光源１１、レンズ１２、レンズ１３、マスク１４、波長板１５およびレンズ１６を備える。
　レーザ光源１１は、コヒーレントなレーザ光を出力するものであり、例えばＨｅ-Ｎｅレーザ光源等である。レーザ光源１１は、連続発振するものであってもよいし、パルス発振するものであってもよい。パルス発振するレーザ光源は、光ファイバによってパルス幅を調整可能なように構成されていてもよい。パルスレーザとしてナノ・ピコ・フェムト秒レーザ等が挙げられる。レンズ１２およびレンズ１３は、ビームエクスパンダとして作用するものであって、レーザ光源１１から出力された光を入力し、その光のビーム径を拡大して、該光を平行光として出力する。
　マスク１４は、レンズ１２およびレンズ１３を含むビームエクスパンダによりビーム径が拡大されて出力された光を入力し、その光のビーム断面において空間的に強度変調して、当該変調後の光を波長板１５へ出力する。マスク１４は、リング形状の遮光部と、その遮光部の内側および外側それぞれに接して設けられた透過部と、を有する。マスク１４は、従来技術１では単リングマスクであり、従来技術２および本実施形態では多重リングマスクである。この図には、マスク１４に入力される光のビーム断面における光強度分布の例が示され、また、マスク１４から出力される光のビーム断面における光強度分布の例が示されている。マスク１４は、レンズ１６の後段に設けられてもよい。
　波長板１５は、マスク１４から出力された光を入力し、その光の偏光を操作して光を出力する。レンズ１６は、波長板１５から出力された光を入力して該光を対象物２の表面または内部に集光する集光光学系である。
　以下では、単リングマスクおよび多重リングマスクについて説明する。マスクの構成を示す図は、光軸方向にマスクを見たものであり、遮光部を黒色領域で示し、透過部を白色領域で示す。また、従来技術１の単リングマスクの問題点について説明した後、従来技術２の多重リングマスクと対比しつつ本実施形態の多重リングマスクについて説明する。
　図２は、単リングマスクの構成を示す図である。単リングマスクは、中心位置の周りに設けられた単一のリング形状の遮光部Ａ１を有する。さらに、単リングマスクは、遮光部Ａ１の内側に設けられた透過部Ｂ１と、遮光部Ａ１の外側に設けられたリング形状の透過部Ｂ２と、透過部Ｂ２の外側に設けられた遮光部Ａ２と、を有する。従来技術１の光照射装置は、このような単リングマスクを用いる。
　図３は、多重リングマスクの構成を示す図である。多重リングマスクは、中心位置の周りに設けられた複数（この図では３個）のリング形状の遮光部Ａ１，Ａ２，Ａ３を有する。さらに、多重リングマスクは、遮光部Ａ１の内側に設けられた最内層の透過部Ｂ１と、遮光部Ａ１と遮光部Ａ２との間に設けられたリング形状の透過部Ｂ２と、遮光部Ａ２と遮光部Ａ３との間に設けられたリング形状の透過部Ｂ３と、遮光部Ａ３の外側に設けられたリング形状の最外層の透過部Ｂ４と、透過部Ｂ４の外側に設けられた遮光部Ａ４と、を有する。
　透過部Ｂ１～Ｂ４における光透過率は、遮光部Ａ１～Ａ４における光透過率より大きい。透過部Ｂ１～Ｂ４における光透過率は、１であってもよいし、１より小さくてもよい。遮光部Ａ１～Ａ４における光透過率は、０であってもよいし、０より大きくてもよい。
　透過部Ｂ１、遮光部Ａ１、透過部Ｂ２、遮光部Ａ２、透過部Ｂ３、遮光部Ａ３、透過部Ｂ４および遮光部Ａ４のうちの隣り合う透過部と遮光部との間の境界は、同心円であってもよいし、楕円であってもよい。以下では、境界が円であるとして説明をする。透過部Ｂ１の径方向の幅（半径）をｂ１とし、遮光部Ａ１の径方向の幅をａ１とし、透過部Ｂ２の径方向の幅をｂ２とし、遮光部Ａ２の径方向の幅をａ２とし、透過部Ｂ３の径方向の幅をｂ３とし、遮光部Ａ３の径方向の幅をａ３とし、透過部Ｂ４の径方向の幅をｂ４とする。
　従来技術２の多重リングマスクでは、中心位置から遠いほど、リング形状の遮光部または透過部の径方向の幅が大きい。すなわち、従来技術２の多重リングマスクは、下記（１）式で表される関係を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　これに対して、本実施形態の多重リングマスクでは、リング形状の遮光部Ａ１，Ａ２，Ａ３のうちの隣り合う二つの遮光部それぞれの径方向の幅が、これら二つの遮光部の間に設けられた透過部の径方向の幅より大きい。すなわち、本実施形態の多重リングマスクは、遮光部Ａ１，Ａ２および透過部Ｂ２それぞれの径方向の幅については下記（２）式で表される関係を有し、遮光部Ａ２，Ａ３および透過部Ｂ３それぞれの径方向の幅については下記（３）式で表される関係を有する。隣り合う二つのリング形状の遮光部の全ての組合せについて、このような関係を有するのが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　高分解能な加工または測定を実現させるために、レンズにより集光した光を対象物に照射する。集光した光の強度分布は、光の波長およびレンズの性能に応じた拡がりを有している。この拡がりは点像分布関数（ＰＳＦ：　Point　spread　function）と呼ばれる。光が円偏光や直線偏光であるときには、ＰＳＦは、光軸方向に垂直な方向より光軸方向に平行な方向に長い楕円球を有している。
　計測においては、このＰＳＦと対象物形状との畳み込みによって得られた結果が観察像となる。実験においては、レンズにより集光できる性能（回折限界）よりもはるかに小さい対象物を観察した際には、ＰＳＦと略同じ大きさの像を観察することができる。ＰＳＦを小さくすることは、顕微鏡の光学分解能を高めることにつながる。通常は、ＮＡが大きい対物レンズを採用することで、ＰＳＦを小さくする。
　単リングマスクおよび多重リングマスクは、リング形状の遮光部を有する振幅変調型のマスクである。これらのマスクの透過部を透過した光を集光することによりＰＳＦを小さくすることができる。
　図４は、マスクの様々な構成例およびＰＳＦを示す図である。図４（ａ）は、円形領域の単一の透過部と、その透過部の周囲に設けられた遮光部と、を有するマスクの構成を示す。図４（ｂ）～（ｆ）は、単リングマスクの構成例を示す。図４（ｇ）～（ｌ）は、レンズの光軸（ｚ軸）を含む面（ｘｚ面）におけるＰＳＦを示す。図４（ｇ）は、図４（ａ）の構成のマスクを用いたときのＰＳＦを示す。図４（ｈ）は、図４（ｂ）の構成の単リングマスクを用いたときのＰＳＦを示す。図４（ｉ）は、図４（ｃ）の構成の単リングマスクを用いたときのＰＳＦを示す。図４（ｊ）は、図４（ｄ）の構成の単リングマスクを用いたときのＰＳＦを示す。図４（ｋ）は、図４（ｅ）の構成の単リングマスクを用いたときのＰＳＦを示す。図４（ｌ）は、図４（ｆ）の構成の単リングマスクを用いたときのＰＳＦを示す。
　この図から分かるように、リング形状の遮光部の内径および外径によって、ＰＳＦの大きさ及び形状は異なる。図４（ａ）のマスクを用いた場合のＰＳＦ（図４（ｇ））と比べると、リング形状の遮光部の内径および外径を適切に設定した場合（図４（ｂ））には、ＰＳＦを小さくすることができる（図４（ｈ））。しかし、リング形状の遮光部の内径および外径の設定が適切でない場合（図４（ｃ）～（ｅ））には、ＰＳＦが大きくなったり（図４（ｉ））、メインの集光領域（メインローブ）の上下に光強度が大きい領域（サイドローブ）が生じたり（図４（ｊ））、また、ＰＳＦが光軸方向に長くなったりする（図４（ｋ））。
　メインローブに加えて光強度が大きいサイドローブが生じると、三重焦点観察のように光軸方向に三箇所の蛍光領域が存在するかのように観察されたり、画像のＳＮ比の低下が生じたりする。このように、単リングマスクの場合も、ＰＳＦを小さくするために、リング形状の遮光部の内径および外径を適切に設計することが重要である。非特許文献１は、サイドローブの光強度が小さくメインローブの領域が小さくなるように、単リングマスクの構成を決定しようとしている。
　図５は、単リングマスクの使用／非使用および収差媒体の有／無それぞれの場合の蛍光発生領域を示す図である。この図は、励起光の２光子吸収により蛍光が生じる領域を示している。図５（ａ）は、単リングマスク無し且つ収差媒体無しの場合の蛍光発生領域を示す。図５（ｂ）は、単リングマスク有り且つ収差媒体無しの場合の蛍光発生領域を示す。図５（ｃ）は、単リングマスク無し且つ収差媒体有りの場合の蛍光発生領域を示す。図５（ｄ）は、単リングマスク有り且つ収差媒体有りの場合の蛍光発生領域を示す。
　この図から分かるように、単リングマスクを用いた分解能向上方法では、厚みのある生体組織の内部観察やガラスなどの内部加工時に所望の分解能を得ることが容易でない。生体内部観測や内部加工では、空気や浸液の屈折率と異なる屈折率を有する対象物の内部に光を集光させることになる。このとき、屈折率差によって球面収差が生じるので、単リングマスクによって空間的に振幅変調がなされた励起光は、球面収差の値が僅かであっても顕著に影響を受ける。
　水浸対物レンズを用いて対象物の表面上に励起光を集光照射し、対象物表面上に存在する回折限界よりも微小な蛍光物質から多光子吸収過程を経て蛍光を生じさせると、収差が存在しないので、単リングマスクを用いない場合（図５（ａ））と比べて、単リングマスクを用いる場合（図５（ｂ））には、メインローブの領域を小さくすることができる。
　生体（平均屈折率１.３８）の内部（深さ７０μｍ位置）に励起光を照射し、その位置に存在する微小な蛍光物質から多光子吸収過程を経て蛍光を生じさせると、収差が存在するので、単リングマスクを用いない場合（図５（ｃ））と比べて、単リングマスクを用いる場合（図５（ｄ））には、サイドローブとほぼ同じ位置に強い蛍光強度を有するスポットが生じる。以下では、収差が存在する状況下で生じるこの明るいスポットをセカンドローブという。このセカンドローブもサイドローブと同様に計測画像の劣化につながる。
　なお、今回の条件下で生じる球面収差は非常に小さいものである。単リングマスクを用いない場合には、光軸方向にＰＳＦが光軸方向に僅かに伸びるだけである（図５（ｃ）)。しかし、単リングマスクを用いる場合には、強いセカンドローブが生じる（図５（ｄ））。このように単リングマスクは特に球面収差に弱い。なお、このセカンドローブは、屈折率差、集光深さ及びＮＡなどの条件によっては、サイドローブと異なる位置に生じることがある。
　以上のように、単リングマスクは、メインローブの他にサイドローブやセカンドローブが生じる場合があり、また、メインローブを小さくすることができない場合がある。本実施形態の多重リングマスクは、このような単リングマスクが有する問題点を解消し得るものである。以下では、多重リングマスクについて説明する。
　図６および図７は、マスクの様々な構成例およびＰＳＦを示す図である。図６では、マスクに入力される光（励起光）はビーム断面において一定（トップハット）であるとした。図７では、マスクに入力される光（励起光）はビーム断面において裾が切れたガウシアン分布を有するとした。
　図６および図７の何れにおいても、（ａ）は、円形領域の単一の透過部と、その透過部の周囲に設けられた遮光部と、を有するマスクの構成を示す。（ｂ）は、２重リングマスクの構成を示す。（ｃ）は、３重リングマスクの構成を示す。（ｄ）は、４重リングマスクの構成を示す。（ｅ）は、６重リングマスクの構成を示す。（ｆ）～（ｊ）は、対象物表面において励起光の２光子吸収により生じる蛍光についてレンズの光軸（ｚ軸）を含む面（ｘｚ面）におけるＰＳＦを示す。（ｆ）は、（ａ）の構成のマスクを用いたときのＰＳＦを示す。（ｇ）は、（ｂ）の構成の２重リングマスクを用いたときのＰＳＦを示す。（ｈ）は、（ｃ）の構成の３重リングマスクを用いたときのＰＳＦを示す。（ｉ）は、（ｄ）の構成の４重リングマスクを用いたときのＰＳＦを示す。（ｊ）は、（ｅ）の構成の６重リングマスクを用いたときのＰＳＦを示す。
　図６および図７の何れにおいても、本実施形態の多重リングマスクを用いると、メインローブのＰＳＦを小さくすることができ、サイドローブの光ピーク強度を低くすることができる。また、対象物の内部に集光照射する際の収差によって生じるセカンドローブを小さくすることができる。
　本実施形態の多重リングマスクの設計に際しては、図３を用いて説明すると、透過部Ｂ１、遮光部Ａ１、透過部Ｂ２、遮光部Ａ２、透過部Ｂ３、遮光部Ａ３、透過部Ｂ４および遮光部Ａ４のうちの隣り合う透過部と遮光部との間の境界である円の半径の最適値を探索する。最適値探索時の評価として、メインローブの大きさ（例えば体積）およびサイドローブの大きさを用いることができる。メインローブの大きさとしては、照明光の集光領域の大きさであってもよいし、励起光を集光照射したときに単光子吸収または多光子吸収を経て発生する蛍光の領域の大きさであってもよいし、多光子吸収によって非線形加工が生じると推測される領域の大きさであってもよい。特にｎ光子吸収を用いた蛍光発光では、蛍光の大きさは強度のｎ乗に比例するので、サイドローブとメインローブとの比が大きくなり、その結果、サイドローブの小さい観察を実現することができる。さらに、生じると予測される収差、または、収差補正などの技術によって除去しきれない残留収差を考慮して設計することで、セカンドローブの小さい観察像を得ることができる。
　特許文献１に記載された従来技術２の多重リングマスクと比べて、本実施形態の多重リングマスクは、更なる分解能の向上が可能である。
　図８～図１０は、従来技術２の多重リングマスクと本実施形態の多重リングマスクとを比較して示す図である。図８では、多重リングマスクに入力される光はビーム断面において一定（トップハット）であるとした。図９および図１０では、多重リングマスクに入力される光はビーム断面において裾が切れたガウシアン分布（下記（４）式）を有するとした。この（４）式において、ｒは、最外層の透過部の外半径を１として規格したときに中心位置からの距離である。Ｗexは、中心位置での強度を１として規格化したときに強度が１／ｅ２になるｒの値である。図９ではＷexを１.０とし、図１０ではＷexを０.６とした。
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　図８～図１０の何れにおいても、上段の図は、従来技術２の２重リングマスク、３重リングマスクおよび４重リングマスクを示す。下段の図は、本実施形態の２重リングマスク、３重リングマスクおよび４重リングマスクを示す。
　図１１は、図８の上段に示した従来技術２の多重リングマスクにおける遮光部および透過部それぞれの径方向の幅を纏めた表である。この表に示されるように、従来技術２の多重リングマスクでは、各遮光部および各透過部の径方向の幅は上記（１）式の関係を有する。
　図１２は、図８の下段に示した本実施形態の多重リングマスクにおける遮光部および透過部それぞれの径方向の幅を纏めた表である。この表に示されるように、本実施形態の多重リングマスクでは、各遮光部および各透過部の径方向の幅は上記（２）式、（３）式の関係を有する。
　図１３は、対象物の表面に光を集光照射する場合（収差がない場合）のＰＳＦを示す図である。入力光はビーム断面において裾が切れたガウシアン分布（Ｗex＝１.０）であるとした。図１３（ａ）はマスクを用いない場合のＰＳＦを示す。図１３（ｂ）は従来技術２の２重リングマスクを用いた場合のＰＳＦを示す。図１３（ｃ）は本実施形態の２重リングマスクを用いた場合のＰＳＦを示す。図１３（ｄ）は本実施形態の４重リングマスクを用いた場合のＰＳＦを示す。
　この図から分かるように、マスクを用いない場合（図１３（ａ））と比較すると、従来技術２の２重リングマスクを用いた場合（図１３（ｂ））にはＰＳＦを小さくすることができるが、本実施形態の多重リングマスクを用いた場合（図１３（ｃ），図１３（ｄ））には更にＰＳＦを小さくすることができる。なお、この図には、それぞれの場合における改善率（後述）の値が示されている。図１３（ｂ）の場合の改善率は１.３４であり、図１３（ｃ）の場合の改善率は１.６５であり、図１３（ｄ）の場合の改善率は１.７８である。
　図１４は、対象物の内部に光を集光照射する場合（収差がある場合）のＰＳＦを示す図である。入力光はビーム断面において裾が切れたガウシアン分布（Ｗex＝１.０）であるとした。生体（平均屈折率１.３８）の内部（深さ１００μｍ位置）に励起光を照射し、その位置に存在する微小な蛍光物質から生じた蛍光のＰＳＦを示す。この条件下では、生体と空気との間の屈折率差によって生じる球面収差の影響により、リングマスクを用いたときにはセカンドローブが生じる。図１４（ａ）はマスクを用いない場合のＰＳＦを示す。図１４（ｂ）は従来技術１の単リングマスクを用いた場合のＰＳＦを示す。図１４（ｃ）は従来技術２の２重リングマスクを用いた場合のＰＳＦを示す。図１４（ｄ）は内部集光を考慮しない本実施形態の３重リングマスクを用いた場合のＰＳＦを示す。図１４（ｅ）は内部集光を考慮した本実施形態の３重リングマスクを用いた場合のＰＳＦを示す。
　この図から分かるように、従来技術１の単リングマスクを用いた場合（図１４（ｂ））には、セカンドローブが大きい。内部集光を考慮しない本実施形態の３重リングマスクを用いた場合（図１４（ｄ））も、セカンドローブが現れる。しかし、内部集光を考慮した本実施形態の３重リングマスクを用いた場合（図１４（ｅ））には、セカンドローブが小さく且つメインローブも小さくすることができる。
　図１５は、図１４に示した各場合のＰＳＦについて改善率を示すグラフである。改善率は、収差がなく且つマスクを用いない場合のＰＳＦの体積を基準として、各場合のＰＳＦの縮小の程度を表す。改善率が大きいほど、ＰＳＦが小さい。図１６は、図１４に示した各場合のＰＳＦについてセカンドローブの大きさを示すグラフである。セカンドローブは、収差が存在する状況での不要光の大きさを示し、メインローブとの強度比を数値として表す。この数値が小さいほど、セカンドローブが小さい。これらのグラフから分かるように、本実施形態の多重リングマスクは改善率が高い。また、本実施形態の多重リングマスクは、従来技術２の多重リングマスクと比べるとセカンドローブが大きいものの、従来技術１の単リングマスクと比べるとセカンドローブが小さい。
　本実施形態の多重リングマスクは、透明な材料（例えばガラス等）からなる平板の主面上に遮光部の領域に遮光材料を塗布して構成することができる。また、本実施形態の多重リングマスクは、空間光変調器（ＳＬＭ：　Spatial　Light　Modulator）を用いて構成することができる。空間光変調器は振幅変調型および位相変調型の何れであってもよい。ＳＬＭに提示されたパターンに応じて遮光部および透過部を有することができる。振幅変調型のＳＬＭには、ＴＦＴ（Thin-Film-Transistor）モニタなどの透過型のタイプや、ＤＭＤ（Digital　Mirror　Device）など反射型のタイプなどがある。
　図１７は、位相変調型のＳＬＭを用いて多重リングマスクを構成する場合においてＳＬＭに提示するグレーティングパターンを示す図である。この図において、ハッチング領域は、グレーティングが提示されている領域であり、１次回折光を生じさせることができる。黒塗り潰し領域は、グレーティングが提示されていない領域であり、１次回折光を生じさせることなく０次光を出力する。ＳＬＭは、０次光と１次回折光とを互いに異なる方向へ出力する。図１７（ａ）は、グレーティングパターンが提示されている領域を透過部とするものであり、この場合、ＳＬＭから出力された０次光および１次回折光のうちの１次回折光を選択的にレンズにより集光し、０次光を遮断する。図１７（ｂ）は、グレーティングパターンが提示されていない領域を遮光部とするものであり、この場合、ＳＬＭから出力された０次光および１次回折光のうちの０次光を選択的にレンズにより集光し、１次回折光を遮断する。ＳＬＭを用いる場合には、ＳＬＭの後段に波長板を配置して、この波長板により任意の偏光に変える。
　ＳＬＭにグレーティングパターンを提示するには少なくとも２画素分の領域が必要である。本実施形態の多重リングマスクでは遮光部より透過部の方が径方向の幅が小さいので、回折効率を考慮すると、１次回折光を利用して集光する場合（図１７（ａ））と比べて、０次光を利用して集光する場合（図１７（ｂ））の方が好ましい。
　本実施形態においては、ＳＬＭ等を用いて収差補正を行うことも有効である。収差は、対象物だけでなく、ＳＬＭを含む光学系にも存在する場合がある。収差補正により位相差を低減することで、良好な集光をすることができる。しかし、収差補正が不完全であることにより残存した収差（残存収差）が存在する場合があり、また、予期しない又は抑制できない原因により生じる短時間の収差が生じる場合もある。例えば、レンズと対象物との間に介在する浸液については、温度ムラに起因する浸液の対流や、対象物からの浸液への内容物の溶け出し等により、屈折率不均一となるシュレ―リン現象などにより収差が生じる。また、対象物については、対象物表面と浸液との間の屈折率差や、対象物内部の構造による屈折率のバラツキにより、収差が生じる。これらのうちには補正が容易ではないものも多い。したがって、質のよい画像取得または加工をするためには、収差に対してロバスト性の高い光を利用することが重要である。本実施形態の多重リングマスクは、ロバスト性の高い光を生成することができる。
　これまでの説明では、本実施形態の多重リングマスクにおいて中心位置が最内層の透過部に含まれていた。しかし、これに限られることなく、本実施形態の多重リングマスクは、図１８に示されるように中心位置が遮光部に含まれていてもよい。図１８は、本実施形態の多重リングマスクの変形例の構成を示す図である。図１８（ａ）は、２個のリング形状の遮光部を有する２重リングマスクにおいて中心位置付近に小さい遮光部を有する構成を示す。図１８（ｂ）は、３個のリング形状の遮光部を有する３重リングマスクにおいて中心位置付近に小さい遮光部を有する構成を示す。
　これまでの説明では、透過部における光透過率が１であって、遮光部における光透過率が０であるとした。しかし、これに限られることなく、本実施形態の多重リングマスクは、透過部における光透過率が１より小さくてもよいし、或いは、遮光部における光透過率が０より大きくてもよい。図１９は、本実施形態の７重リングマスクにおける光透過率分布の例を示す図である。この例では、透過部における光透過率は１であって、遮光部における光透過率は０.３である。
　倍率やＮＡが異なる集光用のレンズに変更する場合や、顕微鏡内のビームエクスパンダや結像系などの倍率を変更することにより多重リングマスクへの入力光の強度分布を変更する場合に、多重リングマスクのパターンを切り替えるのが好ましい。また、出力光の波長が可変であるレーザ光源を用いると、波長を変更すると光強度分布も変わる場合があり、この場合にも多重リングマスクのパターンを切り替えるのが好ましい。これらの場合、ＳＬＭを用いて多重リングマスクを構成していれば、多重リングマスクのパターンの切り替えを容易かつ迅速に行うことができる。
　多重リングマスクは、一つの平板形状のものにより入力光のうち透過部を通過した光を利用するものであってもよいが、次に図２０および図２１を用いて説明するような構成により光を整形することで光を効率的に利用して遮光部および透過部を有する構成とすることもできる。
　図２０は、トロイダルレンズのパターン及びこれにより投影されるリングパターンの例を示す図である。図２０（ａ）は、設計した焦点位置に単一のリング形状の領域に光を集めるトロイダルレンズの位相パターンを示す。図２０（ｂ）は、この位相パターン（図２０（ａ））を有するトロイダルレンズにより焦点位置に投影される単一リングのパターンを示す。図２０（ｃ）は、設計した焦点位置に二重のリング形状の領域に光を集めるトロイダルレンズの位相パターンを示す。図２０（ｄ）は、この位相パターン（図２０（ｃ））を有するトロイダルレンズにより焦点位置に投影される二重リングのパターンを示す。図２０（ｃ）のパターンは、細線を生成するのには適しているが、幅のある集光を得ることができない。しかし、光線追跡を用いて図２０（ｃ）のような輪帯状のマスクパターンを設計すると、光の位置および幅を制御することができる。
　図２１は、トロイダルレンズのパターンに応じて遮光部および透過部を有する多重リングマスクの構成を示す図である。この図に示される構成では、多重リングマスクは、振幅変調用素子２１および位相変調用素子２２を含み、この図の右に示されるような光強度分布を有する光を位相変調用素子２２から出力することができる。振幅変調用素子２１および位相変調用素子２２は、ＳＬＭであってもよい。
　レーザ光源から出力されビーム径が拡げられた光は、図２０（ｃ）に示されたような位相パターンが提示された振幅変調用素子２１に入力され、この振幅変調用素子２１により空間的に振幅が変調された後に、位相変調用素子２２に入力される。振幅変調用素子２１に入力される光に対し、振幅変調用素子２１から出力される光は、回折または屈折により、異なる方向に伝搬する場合がある。振幅変調用素子２１から位相変調用素子２２へ光が伝搬するに従って、ビーム断面における光強度分布が変化していく。
　位相変調用素子２２は、所望の光強度分布（図２０（ｄ）に示されたようなパターン）が得られる位置に配置されている。位相変調用素子２２に入力される光に対し、位相変調用素子２２から出力される光は、回折または屈折により、異なる方向に伝搬する場合がある。位相変調用素子２２から出力される光は、光軸に平行な方向に進む。位相変調用素子２２から出力される光のビーム断面における光強度分布は、所望の光強度分布（図２０（ｄ）に示されたようなパターン）となる。
　位相変調用素子２２は、出力光を平行光にする他、出力光を収束光にしてもよいし、出力光を発散光にしてもよい。また、位相変調用素子２２は、出力光を多点に収束させる位相パターンであってもよいし、収差を補正する位相パターンであってもよい。
　また、本実施形態の多重リングマスクは、図２２を用いて説明するように、中心位置の周りに設けられたリング形状の１または複数の遮光部を各々有する複数のマスクが積層された構成を有するものであってもよい。図２２は、複数のマスクが積層されてなる多重リングマスクの構成例を示す図である。中心位置を一致させて、図２２（ａ）～（ｄ）の４個のマスクを積層することで、図３に示された３重リングマスクを構成することができる。
　これまでの説明では、本実施形態の多重リングマスクにおいて遮光部と透過部との境界は円であるとしたが、楕円であってもよい。例えば、レーザダイオードから出力される光のビーム断面の形状は楕円であるので、それに応じて、多重リングマスクにおいて遮光部と透過部との境界を楕円とするのが好適である。
　これまで、対象物の表面または内部に励起光を照射して２光子吸収過程を経て蛍光を発生させる場合に好適な多重リングマスクのパターンについて説明した。しかし、これに限られることなく、本実施形態の多重リングマスクは、３光子吸収過程を経て蛍光を発生させる場合に好適な多重リングマスクのパターンを有していてもよい。図２３は、３光子吸収過程を経て蛍光を発生させる場合に好適な２重リングマスクのパターンの例を示す図である。
　次に、光学顕微鏡の実施形態について説明する。図２４～図２８は光学顕微鏡の構成例を示す。これらの光学顕微鏡は、本実施形態の多重リングマスクを含み対象物２の表面または内部に光を集光照射する光照射装置１（図１）、および、この光照射装置１による対象物２への光照射に応じて対象物２で生じた光を検出する光検出装置を備える。対象物２で生じる光は、照射光の波長と同じ波長を有する反射光または散乱光などであってもよいし、照射光の波長と異なる波長を有する蛍光またはラマン散乱光などであってもよい。
　図２４は、光学顕微鏡１Ａの構成を示す図である。光学顕微鏡１Ａは、レーザ光源１１、レンズ１２、レンズ１３、マスク１４、波長板１５および対物レンズ１６を備える。これらは、対象物２の表面または内部に励起光を集光照射する光照射装置（図１）を構成する。
　レーザ光源１１から出力された励起光は、レンズ１２，１３によりビーム径が拡大されるとともにコリメートされ、マスク１４によりビーム断面において空間的に強度変調されて出力される。マスク１４から出力された励起光は、波長板１５により偏光が操作された後、対物レンズ１６により対象物２の表面または内部に集光される。
　また、光学顕微鏡１Ａは、ダイクロイックミラー３１、レンズ３２および光検出器３３を備える。これらは、光照射装置による対象物２への励起光照射に応じて対象物２で生じた蛍光を検出する光検出装置を構成する。
　ダイクロイックミラー３１は、波長板１５と対物レンズ１６との間の光路上に設けられている。ダイクロイックミラー３１は、レーザ光源１１から出力されてレンズ１２、レンズ１３、マスク１４および波長板１５を経て到達した励起光を透過させて、この励起光を対物レンズ１６へ出力する。この励起光が対物レンズ１６から対象物２の表面または内部に集光照射されると、その集光位置で蛍光が発生する。ダイクロイックミラー３１は、対象物２から対物レンズ１６を経て到達した蛍光を反射させて、この蛍光をレンズ３２へ出力する。ダイクロイックミラー３１は、マスク１４と波長板１５との間の光路上に設けられてもよい。レンズ３２は、ダイクロイックミラー３１から到達した蛍光を光検出器３３の受光面上に集光する。光検出器３３は、対象物２への励起光照射に応じて対象物２で生じた蛍光を検出する。
　光検出器３３は、光電子増倍管であってもよいし、フォトダイオードであってもよい。また、光検出器３３の受光面の前に、蛍光を選択的に透過させるフィルタが設けられてもよい。
　更に、光学顕微鏡１Ａは、コンピュータ４１およびステージ４２を備える。コンピュータ４１は、光検出器３３による蛍光検出結果のデータを入力する。ステージ４２は対象物２を載置する。図中に示されるとおり励起光の入射方向に平行なｚ軸を有するｘｙｚ直交座標系を設定すると、ステージ４２は、ｚ方向に対象物２を移動させることができ、また、ｘ方向およびｙ方向にも対象物２を移動させることができる。
　ステージ４２に加えて又は替えて、励起光集光位置をｘ方向およびｙ方向に走査する走査部（例えばガルバノスキャナ）が設けられてもよいし、対物レンズ１６をｚ方向に移動させるアクチュエータ（例えばピエゾアクチュエータ）が設けられてもよい。
　コンピュータ４１は、ステージ４２を駆動することにより対象物２における励起光の集光位置を走査するとともに、その走査により励起光集光位置が対象物２の各位置に設定されたときの光検出器３３による蛍光検出結果のデータを入力する。これにより、コンピュータ４１は、対象物２の３次元蛍光像を取得することができる。
　光学顕微鏡１Ａは、マスク１４として本実施形態の多重リングマスクを用いることにより、より小さいＰＳＦを実現することができるとともに、サイドローブやセカンドローブの発生を抑制することができるので、より高い空間分解能を有する３次元蛍光像を取得することができる。また、光学顕微鏡１Ａは、多光子吸収過程を経て蛍光を発生させる場合に好適なパターンを有する多重リングマスクをマスク１４として用いることにより、更に高い空間分解能を有する３次元蛍光像を取得することができる。
　図２５は、光学顕微鏡１Ｂの構成を示す図である。光学顕微鏡１Ａの構成（図２４）と比較すると、光学顕微鏡１Ｂの構成（図２５）は、光検出装置においてレンズ３２と光検出器３３との間にピンホール板３４が設けられている点で相違する。ピンホール板３４は、光を通過させる小径の開口を有する。ピンホール板３４の開口は、光照射装置による励起光集光位置に対して共役の位置にある。光検出器３３は、対象物２で生じた蛍光のうちピンホール板３４の開口を通過した蛍光を受光する。
　光学顕微鏡１Ｂは、共焦点蛍光顕微鏡の構成を有している。光学顕微鏡１Ｂは、マスク１４として本実施形態の多重リングマスクを用いることにより、より小さいＰＳＦを実現することができるとともに、サイドローブやセカンドローブの発生を抑制することができるので、より高い空間分解能を有する３次元蛍光像を取得することができる。光学顕微鏡１Ｂは、多光子吸収過程を経て蛍光を発生させる場合に好適なパターンを有する多重リングマスクをマスク１４として用いてもよい。
　図２６は、光学顕微鏡１Ｃの構成を示す図である。光学顕微鏡１Ａの構成（図２４）と比較すると、光学顕微鏡１Ｃの構成（図２６）は、光照射装置においてレーザ光源１１とレンズ１２との間に音響光学素子（ＡＯＭ:　Acousto-Optic　Modulator）３５が設けられている点で相違し、光検出装置において光検出器３３からの出力信号を入力するロックインアンプ４３が設けられている点で相違する。
　ＡＯＭ３５は、対象物２への励起光照射の強度を時間的に変調する変調部である。ＡＯＭ３５は、コンピュータ４１から指示される変調周波数ωで励起光照射の強度を正弦波状に変調する。これにより、対象物２へ照射される励起光の強度は時間的に正弦波状に変化する。
　ロックインアンプ４３は、光検出器３３が検出した蛍光強度の時間的変化を表す蛍光強度信号を入力するとともに、ＡＯＭ３５の変調周波数ωと同じ又は整数倍の周波数を有する参照信号をコンピュータ４１から入力する。そして、ロックインアンプ４３は、入力した蛍光強度信号のうち変調周波数ωのｎ倍の周波数ｎωの成分を選択的に検出してコンピュータ４１へ出力する。ｎは正の整数である。ｎ＝１であれば、ロックインアンプ４３は、蛍光強度信号のうち周波数ωの基本波成分を選択的に検出して出力する。ｎ≧２であれば、ロックインアンプ４３は、蛍光強度信号のうち第ｎ高調波成分を選択的に検出して出力する。
　ｎ≧２である場合、光学顕微鏡１Ｃは、飽和励起（ＳＡＸ:　Saturated　Excitation）顕微鏡の構成を有する。ＳＡＸ顕微鏡は次のような現象を利用するものである。対象物へ照射される励起光の強度が小さいときには、その励起光の照射により対象物で発生する蛍光の強度は励起光強度に比例する。しかし、励起光強度が大きくなると、蛍光強度は、飽和して、励起光強度に対して非線形な関係となる。したがって、変調周波数ωで時間的に変調された高強度の励起光を対象物に照射すると、その対象物で発生する蛍光の強度の時間的変化は、周波数ωの基本波成分を含む他、批正形成分である第ｎ高調波成分を含む。励起光集光領域において中心位置に近いほど励起光強度は大きいから、蛍光強度信号のうちの第ｎ高調波成分は、励起光集光領域のうちでも中心位置近傍で発生した蛍光の強度を表す。
　ＳＡＸ顕微鏡としての光学顕微鏡１Ｃは、このような現象を利用するものであり、より高い空間分解能を有する３次元蛍光像を取得することができる。そして、光学顕微鏡１Ｃは、本実施形態の多重リングマスク（特に、多光子吸収過程を経て蛍光を発生させる場合に好適なパターンを有する多重リングマスク）をマスク１４として用いることにより、更に高い空間分解能を有する３次元蛍光像を取得することができる。
　図２７は、光学顕微鏡１Ｄの構成を示す図である。光学顕微鏡１Ｃの構成（図２６）と比較すると、光学顕微鏡１Ｄの構成（図２７）は、対象物２への励起光照射の強度を時間的に変調する変調部としてＡＯＭ３５ＡおよびＡＯＭ３５Ｂ等を備える点で相違し、光検出器３６を更に備える点で相違し、この光検出器３６から励起光の変調周波数と同じ周波数を有する参照信号がロックインアンプ４３へ与えられる点で相違する。
　対象物２への励起光照射の強度を時間的に変調する変調部は、ＡＯＭ３５ＡおよびＡＯＭ３５Ｂの他、ビームスプリッタ５１、ビームスプリッタ５２、ミラー５３およびミラー５４を含む。これらは、レーザ光源１１とレンズ１２との間の励起光の光路上に設けられていている。
　ビームスプリッタ５１は、レーザ光源１１から出力された励起光を２分岐して第１分岐光および第２分岐光とする。ビームスプリッタ５１から出力された第１分岐光は、ＡＯＭ３５Ａを経て、ビームスプリッタ５２に入力される。ビームスプリッタ５１から出力された第２分岐光は、ミラー５３、ＡＯＭ３５Ｂおよびミラー５４を経て、ビームスプリッタ５２に入力される。ビームスプリッタ５２は、ＡＯＭ３５Ａから到達した第１分岐光を入力するとともに、ミラー５４から到達した第２分岐光を入力して、これら第１分岐光および第２分岐光それぞれを２分岐することにより、第１分岐光と第２分岐光との干渉による励起光をレンズ１２および光検出器３６の双方へ出力する。
　ＡＯＭ３５Ａ，３５Ｂは、コンピュータ４１から指示される互いに異なる変調周波数で励起光の波形を正弦波状に変調する。これにより、ビームスプリッタ５２からレンズ１２および光検出器３６それぞれへ出力される励起光の強度は時間的に正弦波状に変化する。ビームスプリッタ５２から出力される励起光の変調周波数ωは、コンピュータ４１からＡＯＭ３５Ａ，３５Ｂに指示される互いに異なる変調周波数の差に応じたものである。ビームスプリッタ５２からレンズ１２へ出力された励起光は、対象物２の表面または内部で集光照射される。
　光検出器３６は、ビームスプリッタ５２から出力される励起光を受光して、その励起光の変調周波数ωと同じ周波数を有する参照信号をロックインアンプ４３へ出力する。ロックインアンプ４３は、光検出器３３が検出した蛍光強度の時間的変化を表す蛍光強度信号を入力するとともに、光検出器３６から出力された変調周波数ωの参照信号を入力する。そして、ロックインアンプ４３は、入力した蛍光強度信号のうち変調周波数ωのｎ倍の周波数ｎωの成分を選択的に検出してコンピュータ４１へ出力する。ｎは正の整数である。ｎ＝１であれば、ロックインアンプ４３は、蛍光強度信号のうち周波数ωの基本波成分を選択的に検出して出力する。ｎ≧２であれば、ロックインアンプ４３は、蛍光強度信号のうち第ｎ高調波成分を選択的に検出して出力する。
　光学顕微鏡１Ｄは、光学顕微鏡１Ｃと同様の作用効果を奏し、ｎ≧２である場合には光学顕微鏡１Ｃと同様にＳＡＸ顕微鏡の構成を有するので、より高い空間分解能を有する３次元蛍光像を取得することができる。
　図２８は、光学顕微鏡１Ｅの構成を示す図である。光学顕微鏡１Ａの構成（図２４）と比較すると、光学顕微鏡１Ｅの構成（図２８）は、光照射装置においてレーザ光源１１とレンズ１２との間に調整部３７が設けられている点で相違する。
　調整部３７は、対象物２への励起光照射の強度を調整するものである。調整部３７は、透過率が可変である光学部品（例えば、音響光学素子、ＮＤフィルタ、液晶セルなど）であってもよいし、２以上の光学部品の組合せ（例えば波長板および偏光子）により構成されるものであってもよい。調整部３７が波長板および偏光子により構成される場合には、波長板または偏光子の光学軸の方位を変更することにより、対象物２への励起光照射の強度を調整することができる。また、調整部はレーザ光源１１と一体とされたものであってもよく、例えば、レーザ光源１１に与える駆動電流を変化させることで、レーザ光源１１から出力される励起光の強度を調整してもよい。
　コンピュータ４１は、調整部３７から出力されて対象物２に照射される励起光の強度を複数の値それぞれに設定するとともに、光検出器３３が検出した蛍光強度を表す蛍光強度信号を入力する。そして、コンピュータ４１は、調整部３７により対象物２への励起光照射強度が複数の値それぞれに設定されたときに対象物２で生じた蛍光の強度に基づいて、対象物２で生じた光に含まれる非線形成分を求める。
　具体的には、励起光の２光子吸収過程を経て蛍光が発生する場合、その蛍光に含まれる非線形成分を次のようにして求めることができる。対象物２に照射される励起光の強度をＩex_Lに調整部３７により設定し、このときに光検出器３３が検出した蛍光強度をＩＬとする。Ｉex_Lは、蛍光強度が励起光強度に比例する範囲の励起光強度である。また、対象物２に照射される励起光の強度をＩex_Hに調整部３７により設定し、このときに光検出器３３が検出した蛍光強度をＩＨとする。Ｉex_Hは、蛍光強度が飽和して励起光強度に対して非線形な関係となる範囲の励起光強度である。そして、次式により、対象物２に照射される励起光の強度をＩex_Hに設定したときの蛍光強度に含まれる非線形成分ＩSAXを求める。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　この光学顕微鏡１Ｅは、対象物２に照射される励起光の強度を大きい値に設定したときの蛍光強度に含まれる非線形成分を求める点で、光学顕微鏡１Ｃおよび光学顕微鏡１Ｄと同様である。したがって、光学顕微鏡１Ｅは、光学顕微鏡１Ｃおよび光学顕微鏡１Ｄと同様に、より高い空間分解能を有する３次元蛍光像を取得することができる。
　以上までに説明した光学顕微鏡１Ａ～１Ｅにおいて、レーザ光源１１から出力される励起光は、連続光であってもよいし、パルス光であってもよい。対象物２において多光子吸収過程を経て発生する蛍光を検出する場合には、励起光はパルス光であるのが好ましい。また、励起光がパルス光である場合、光検出器３３とロックインアンプ４３との間に設けたフィルタにより、光検出器３３から出力される蛍光強度信号のうち、励起光パルスの繰り返し周波数成分およびこれの高調波成分を選択的に遮断して、周波数ωの基本波成分および周波数ｎωの第ｎ高調波成分を選択的に透過させてロックインアンプ４３に入力させるのが好ましい。
　ＳＡＸ顕微鏡である光学顕微鏡１Ｃ～１Ｅは、光学顕微鏡１Ｂと同様に共焦点蛍光顕微鏡の構成とすることもできる。すなわち、励起光集光位置に対して共役の位置に小径の開口を有するピンホール板を光検出器３３の受光面の前に配置して、対象物２で生じた蛍光のうちピンホール板の開口を通過した蛍光を光検出器３３により受光してもよい。
　ＳＡＸ顕微鏡において、励起光の２光子吸収過程を経て発生する蛍光の基本波成分の強度をＰ１とし、第２高調波成分の強度をＰ２とし、第３高調波成分の強度をＰ３とすると、これらＰ１～Ｐ３は、主として下記（６）式で表される領域で発生した蛍光の強度を表す。ＰＳＦ２は２光子吸収過程のときのＰＳＦに相当するものであり、ＰＳＦ４は４光子吸収過程のときのＰＳＦに相当するものであり、ＰＳＦ６は６光子吸収過程のときのＰＳＦに相当するものである。ＰＳＦ４成分は、第３高調波成分を検出することで求めることができる。ＰＳＦ６成分は、基本波成分、第２高調波成分および第３高調波成分を検出して、下記（７）式により求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
　ＳＡＸ顕微鏡である光学顕微鏡１Ｃ～１Ｅにおいては、マスク１４として用いる多重リングマスクのパターンを適切に設計することにより、ＰＳＦ２観測、ＰＳＦ４観測またはＰＳＦ６観測をすることができる。図２９は、光学顕微鏡１Ｃ～１ＥにおいてＰＳＦ２観測時に用いられる多重リングマスクのパターンの例を示す図である。図３０は、光学顕微鏡１Ｃ～１ＥにおいてＰＳＦ４観測時に用いられる多重リングマスクのパターンの例を示す図である。図３１は、光学顕微鏡１Ｃ～１ＥにおいてＰＳＦ６観測時に用いられる多重リングマスクのパターンの例を示す図である。
　図３２は、２光子励起の場合のＰＳＦ２の例を示す図である。図３２（ａ）はマスク不使用時のＰＳＦ２を示し、図３２（ｂ）は単リングマスク使用時のＰＳＦ２を示し、図３２（ｃ）は８重リングマスクマスク使用時のＰＳＦ２を示す。図３３は、２光子励起の場合のＰＳＦ４の例を示す図である。図３３（ａ）はマスク不使用時のＰＳＦ４を示し、図３３（ｂ）は単リングマスク使用時のＰＳＦ４を示し、図３３（ｃ）は８重リングマスクマスク使用時のＰＳＦ４を示す。図３４は、２光子励起の場合のＰＳＦ６の例を示す図である。図３４（ａ）はマスク不使用時のＰＳＦ６を示し、図３４（ｂ）は単リングマスク使用時のＰＳＦ６を示し、図３４（ｃ）は８重リングマスクマスク使用時のＰＳＦ６を示す。
　図３５は、様々な場合におけるＰＳＦの径方向および軸方向の大きさを纏めた表である。ここでは、倍率が６０倍であり、ＮＡが１.３であり、ワーキングディスタンスが３００μｍである対物レンズ１６を用いた場合のＰＳＦの径方向および軸方向の大きさ（単位ｎｍ）を示す。また、左から順に、ＳＡＸ顕微鏡によるＰＳＦ２観測時（マスク不使用）、ＳＡＸ顕微鏡によるＰＳＦ２観測時（４重リングマスク使用）、ＳＡＸ顕微鏡によるＰＳＦ４観測時（マスク不使用）、ＳＡＸ顕微鏡によるＰＳＦ４観測時（４重リングマスク使用）、ＳＡＸ顕微鏡によるＰＳＦ６観測時（マスク不使用）、および、ＳＡＸ顕微鏡によるＰＳＦ６観測時（４重リングマスク使用）、それぞれの場合を示す。
　図３２～図３５に示されるとおり、ＰＳＦ２よりＰＳＦ４は小さく、ＰＳＦ４よりＰＳＦ６は小さい。また、ＰＳＦ２，ＰＳＦ４，ＰＳＦ６は、マスク不使用時より単リングマスク使用時の方が小さく、単リングマスク使用時より多重リングマスク使用時の方が小さい。
　図３６は、対象物２の内部の集光領域における光強度分布を示す図である。観察対象物は、０.２μｍサイズの複数の蛍光ビーズを内包するエポキシ樹脂である。この光強度分布は、２光子励起蛍光顕微鏡で観察されたものであり、ｘｚ面上のものである。ＮＡが１.０５であるシリコーン浸対物レンズを用いた。図３６（ａ）は、マスク不使用時に観察された光強度分布を示し、図３６（ｂ）は、６重リングマスク使用時に観察された光強度分布を示す。この図に示されるとおり、２光子励起蛍光顕微鏡において、本実施形態の多重リングマスクを用いることにより、集光領域を小さくすることができる。
　図３７は、２光子励起蛍光顕微鏡により取得された画像の例を示す図である。観察対象物は、０.２μｍサイズの複数の蛍光ビーズを内包するエポキシ樹脂である。図３７（ａ）は、マスク不使用時に取得された画像を示し、図３７（ｂ）は、３重リングマスク使用時に取得された画像を示す。この図に示されるとおり、２光子励起蛍光顕微鏡において本実施形態の多重リングマスクを用いることにより、高い空間分解能を有する蛍光像を取得することができる。
　次に、光音響顕微鏡の実施形態について説明する。図３８および図３９は光音響顕微鏡の構成例を示す。これらの光音響顕微鏡は、本実施形態の多重リングマスクを含み対象物２の表面または内部にパルス光を集光照射する光照射装置１（図１）、および、この光照射装置１による対象物２へのパルス光照射に応じて対象物２で生じた音波を検出する音波検出装置を備える。
　図３８は、光音響顕微鏡１Ｆの構成を示す図である。光音響顕微鏡１Ｆは、レーザ光源１１、レンズ１２、レンズ１３、マスク１４、波長板１５および対物レンズ１６を備える。これらは、対象物２の表面または内部にパルス光を集光照射する光照射装置（図１）を構成する。
　レーザ光源１１から出力されたパルス光は、レンズ１２，１３によりビーム径が拡大されるとともにコリメートされ、マスク１４によりビーム断面において空間的に強度変調されて出力される。マスク１４から出力されたパルス光は、波長板１５により偏光が操作された後、対物レンズ１６により対象物２の表面または内部に集光される。
　また、光音響顕微鏡１Ｆはトランスデューサ３８を備える。トランスデューサ３８は、対象物２へのパルス光照射に応じて対象物２で生じた音波を検出する音波検出装置である。対象物２の表面または内部にパルス光が集光照射されると、その集光位置において衝撃波が発生する。トランスデューサ３８は、この衝撃波（音波）の大きさに応じたパルス高さを有する電気パルスをコンピュータ４１へ出力する。コンピュータ４１は、トランスデューサ３８から出力された電気パルス信号を入力する。
　更に、光音響顕微鏡１Ｆは、光学顕微鏡１Ａの構成（図２４）等と同様に、対象物２をｘ方向，ｙ方向およびｚ方向それぞれに移動させるステージ（または、パルス光集光位置を走査する走査部、対物レンズ１６をｚ方向に移動させるアクチュエータ）を備える。なお、図３８ではステージは示されていない。
　コンピュータ４１は、ステージ（または、走査部、アクチュエータ）を駆動することにより対象物２におけるパルス光の集光位置を走査するとともに、その走査によりパルス光集光位置が対象物２の各位置に設定されたときのトランスデューサ３８による音波検出結果を表す電気パルス信号を入力する。これにより、コンピュータ４１は、対象物２の３次元像を取得することができる。
　光音響顕微鏡１Ｆは、マスク１４として本実施形態の多重リングマスクを用いることにより、より小さいＰＳＦを実現することができるとともに、サイドローブやセカンドローブの発生を抑制することができるので、より高い空間分解能を有する３次元像を取得することができる。また、光音響顕微鏡１Ｆは、多光子吸収過程を経て衝撃波を発生させる場合に好適なパターンを有する多重リングマスクをマスク１４として用いることにより、更に高い空間分解能を有する３次元像を取得することができる。
　また、光音響顕微鏡１Ｆは、対象物２へ照射されるパルス光のパルス幅を調整する調整部を備えるのが好適である。この調整部はレーザ光源１１と一体とされたものであってもよい。パルス光のパルス幅が短いほど、対象物２においてパルス光の非線形吸収が生じ易く、単光子吸収過程によって衝撃波が発生するだけでなく、２光子吸収過程によっても衝撃波が発生する。逆に、パルス光のパルス幅が長いほど、対象物２においてパルス光の非線形吸収が生じ難く、単光子吸収過程によって衝撃波が発生するものの、２光子吸収過程によっては衝撃波が発生し難い。
　このことを利用すれば、パルス幅を短く設定したときに発生した衝撃波（単光子吸収過程および２光子吸収過程の双方に因る衝撃波）を検出したトランスデューサ３８からの電気パルス信号と、パルス幅を長く設定したときに発生した衝撃波（主に単光子吸収過程に因る衝撃波）を検出したトランスデューサ３８からの電気パルス信号とに基づいて、主に２光子吸収過程に因る衝撃波の成分（すなわち、２光子吸収過程が生じ得る狭い領域の情報）を取得することができる。これにより、高い空間分解能を有する３次元像を取得することができる。
　図３９は、光音響顕微鏡１Ｇの構成を示す図である。光音響顕微鏡１Ｆの構成（図３８）と比較すると、光音響顕微鏡１Ｇの構成（図３９）は、光検出器３６、ロックインアンプ４３、ＡＯＭ３５Ａ、ＡＯＭ３５Ｂ、ビームスプリッタ５１、ビームスプリッタ５２、ミラー５３およびミラー５４を備える点で相違する。これらは、光学顕微鏡１Ｄの構成（図２７）における物と同様の物である。
　ＡＯＭ３５Ａ、ＡＯＭ３５Ｂ、ビームスプリッタ５１、ビームスプリッタ５２、ミラー５３およびミラー５４は、対象物２へのパルス光照射の強度を時間的に変調する変調部を構成する。光検出器３６は、ビームスプリッタ５２から出力されるパルス光を受光して、そのパルス光の変調周波数ωと同じ周波数を有する参照信号をロックインアンプ４３へ出力する。
　ロックインアンプ４３は、トランスデューサ３８が検出した衝撃波強度の時間的変化を表す衝撃波強度信号を入力するとともに、光検出器３６から出力された変調周波数ωの参照信号を入力する。そして、ロックインアンプ４３は、入力した衝撃波強度信号のうち変調周波数ωのｎ倍の周波数ｎωの成分を選択的に検出してコンピュータ４１へ出力する。ｎは正の整数である。ｎ≧２であれば、ロックインアンプ４３は、衝撃波強度信号のうち第ｎ高調波成分を選択的に検出して出力する。
　衝撃波強度信号のうち周波数ｎωの第ｎ高調波成分は、対象物２におけるパルス光のｎ光子吸収過程を経て生じた衝撃波に基づくものである。パルス光集光領域において中心位置に近いほどパルス光強度は大きいから、衝撃波強度信号のうちの第ｎ高調波成分は、パルス光集光領域のうちでも中心位置近傍で発生した衝撃波の強度を表す。
　光音響顕微鏡１Ｇは、マスク１４として本実施形態の多重リングマスクを用いることにより、より小さいＰＳＦを実現することができるとともに、サイドローブやセカンドローブの発生を抑制することができるので、より高い空間分解能を有する３次元像を取得することができる。また、光音響顕微鏡１Ｇは、衝撃波強度信号のうちの第ｎ高調波成分を求めることにより、更に高い空間分解能を有する３次元像を取得することができる。
　本実施形態の多重リングマスク、これを備える光照射装置、および、この光照射装置を備える顕微鏡は、次のような効果を奏する。
　生体内部計測では、浸液や対象物が収差要因となる場合がある。例えば、浸液については、温度ムラに起因する浸液の対流や、対象物からの浸液への内容物の溶け出し等により、屈折率不均一となるシュレ―リン現象などにより収差が生じる。また、対象物については、対象物表面と浸液との間の屈折率差や、対象物内部の構造による屈折率のバラツキにより、収差が生じる。計測可能な収差については補正することができる。しかし、予期せぬ短時間の収差などには補正により対応することは容易でない。また、対象物の想定される屈折率や観測深さが実際の場合と異なっていることにより、わずかに収差が発生する場合がある。したがって、収差の影響を受けにくいリングマスクが望まれる。単リングマスクは、収差の影響を顕著に受けやすいので、収差によって観測結果が悪化する。これに対して、本実施形態の多重リングマスクは、ＰＳＦの改善率をさらに高めることができるだけなく、収差によって生じるセカンドローブを考慮して設計することで収差の影響を低減して良好な観察を実現することができる。
　本実施形態の多重リングマスクは、これらの効果により、解像度が高い観測が可能である。本実施形態の５重リングマスクを用いることにより、横（光軸に垂直な方向）および縦（光軸方向）の何れについて１.２倍程度の改善が見込まれる。これは、対物レンズのＮＡを１.０５倍向上させたものと同様である。加工においても加工痕の小さい内部加工が期待できる。また、ＰＳＦを小さくするために対物レンズのＮＡを大きくすることは物理的な制約があるが、本実施形態の多重リングマスクを用いることにより、その制約を超えてＰＳＦを小さくすることができる。
　本実施形態の多重リングマスクにおいてリング形状の遮光部の個数は、２以上であればよく、上限については特に規定されないが２８程度で十分であり、好適には３以上１６以下の程度である。リング形状の遮光部の個数が多いと、光利用効率が低下するので好ましくなく、また、透過部の径方向の幅が小さくなることにより表現能力が低下する点でも好ましくない。ただし、リング形状の遮光部の個数が多い場合には、生体内部観察時における収差の影響によるバックグランドノイズの増加量を抑えることができ、質のよい画像を得ることができる。また、リング形状の遮光部の個数が多い場合に、リング形状における極限まで解像度が小さくなることはないが、回折限界を超え且つ光利用効率が高くなるような多重リングマスクも実現可能である。したがって、本実施形態の多重リングマスクにおいてリング形状の遮光部の個数の上限は２８程度である。
　本実施形態の多重リングマスクを光照射装置が備えることにより、励起光の集光領域を小さくすることができ、解像度の高い計測が可能となり、或いは、加工痕の小さい加工が可能となる。特に、本実施形態の多重リングマスクを備える光照射装置は、メインローブとサイドローブとの強度比が大きくなる多光子吸収を利用した顕微鏡観察や加工において好適に用いられ得る。
　解像度が高い顕微鏡としてレーザ走査型の共焦点顕微鏡が知られている。この共焦点顕微鏡は、励起光の単光子励起を利用して蛍光像を取得することができる。共焦点顕微鏡では主に可視域の励起光が用いられることから、対象物（生体）における励起光の吸収や散乱が大きい。また、共焦点顕微鏡では、対象物内の励起光が照射された全ての領域から蛍光が生じる可能性があり、分解能を高めるための局所検出素子としてピンホールが用いられる。対象物の深部の観察においては、対象物に起因する収差や散乱が大きくなるので、このピンホールの効果は小さくなる。このようなことから、共焦点顕微鏡では光学分解能が低いといったデメリットがある。ただし、対象物の表面を観察する場合には、共焦点顕微鏡は有効である。
　これに対して、本実施形態の多重リングマスクを備える光照射装置を用いた顕微鏡は、対象物の表面だけでなく内部においても、収差の影響を抑制して高解像度の蛍光像を取得することができる。また、多光子吸収を利用する場合には、近赤外域の励起光を用いることができるので、対象物（生体）における励起光の吸収や散乱が小さい。この点でも、本実施形態の光照射装置は、対象物の内部の観察に好適に用いられ得る。
　多重リングマスク、光照射装置および顕微鏡は、上記実施形態および構成例に限定されるものではなく、様々な変形が可能である。
　上記実施形態の多重リングマスクは、入力される光のビーム断面において空間的に強度変調して当該変調後の光を出力する多重リングマスクであって、中心位置の周りに設けられたリング形状の複数の遮光部と、複数の遮光部のうちの隣り合う二つの遮光部の間に設けられた透過部と、複数の遮光部のうちの最内層の遮光部の内側に設けられた最内層の透過部と、複数の遮光部のうちの最外層の遮光部の外側に設けられた最外層の透過部と、を有し、複数の遮光部のうちの隣り合う二つの遮光部それぞれの径方向の幅が、これら二つの遮光部の間に設けられた透過部の径方向の幅より大きい構成としている。
　この多重リングマスクは、振幅変調型または位相変調型の空間光変調器を含み、この空間光変調器に提示されたパターンに応じて遮光部および透過部を有するのが好適である。多重リングマスクは、トロイダルレンズを含み、このトロイダルレンズのパターンに応じて遮光部および透過部を有するのが好適である。また、多重リングマスクは、中心位置の周りに設けられたリング形状の１または複数の遮光部を各々有する複数のマスクが積層された構成を有するのが好適である。
　上記実施形態の光照射装置は、コヒーレントな光を出力する光源と、光源から出力される光を集光する集光光学系と、光源と集光光学系による集光位置との間の光路上に設けられた上記の多重リングマスクと、を備える構成としている。
　上記実施形態の光学顕微鏡は、対象物の表面または内部に光を集光照射する上記の光照射装置と、光照射装置による対象物への光照射に応じて対象物で生じた光を検出する光検出装置と、を備える構成としている。
　この光学顕微鏡において、光検出装置は、光照射装置による集光位置に対して共役の位置に開口を有するピンホール板と、対象物で生じた光のうち開口を通過した光を受光する光検出器と、を含む構成とするのが好適である。光照射装置において、対象物への光照射の強度を時間的に変調する変調部を含み、光検出装置は、対象物で生じた光のうち変調部による光照射強度変調の際の変調周波数のｎ倍（ｎは１以上の整数）の周波数の成分を求める構成とするのも好適である。また、光照射装置は、対象物への光照射の強度を調整する調整部を含み、光検出装置は、調整部により対象物への光照射強度が複数の値それぞれに設定されたときに対象物で生じた光を検出し、これらの検出結果に基づいて、対象物で生じた光に含まれる非線形成分を求める構成とするのも好適である。
　上記実施形態の光音響顕微鏡は、対象物の表面または内部にパルス光を集光照射する上記の光照射装置と、光照射装置による対象物へのパルス光照射に応じて対象物で生じた音波を検出する音波検出装置と、を備える構成としている。
　この光音響顕微鏡において、光照射装置は、対象物へ照射されるパルス光のパルス幅を調整する調整部を含み、音波検出装置は、調整部によりパルス幅が複数の値それぞれに設定されたときに対象物で生じた音波を検出し、これらの検出結果に基づいて、対象物で生じた音波のうち多光子吸収過程により生じた音波の成分を求める構成とするのも好適である。また、光照射装置は、対象物へのパルス光照射の強度を時間的に変調する変調部を含み、音波検出装置は、対象物で生じた音波のうち変調部によるパルス光照射強度変調の際の変調周波数のｎ倍（ｎは１以上の整数）の周波数の成分を求める構成とするのも好適である。
　本発明は、回折限界より小さい領域に効率よく光を集光することができる装置として利用可能である。また、高空間分解能の画像を取得することができる顕微鏡として利用可能である。
　１…光照射装置、１Ａ～１Ｅ…光学顕微鏡、１Ｆ，１Ｇ…光音響顕微鏡、２…対象物、１１…レーザ光源、１２，１３…レンズ、１４…マスク、１５…波長板、１６…レンズ、３１…ダイクロイックミラー、３２…レンズ、３３…光検出器、３４…ピンホール板、３５，３５Ａ，３５Ｂ…音響光学素子（ＡＯＭ）、３６…光検出器、３７…調整部、３８…トランスデューサ、４１…コンピュータ、４２…ステージ、４３…ロックインアンプ、５１，５２…ビームスプリッタ、５３，５４…ミラー。

Claims (12)

  1. 　入力される光のビーム断面において空間的に強度変調して当該変調後の光を出力する多重リングマスクであって、
    　中心位置の周りに設けられたリング形状の複数の遮光部と、前記複数の遮光部のうちの隣り合う二つの遮光部の間に設けられた透過部と、前記複数の遮光部のうちの最内層の遮光部の内側に設けられた最内層の透過部と、前記複数の遮光部のうちの最外層の遮光部の外側に設けられた最外層の透過部と、を有し、
    　前記複数の遮光部のうちの隣り合う二つの遮光部それぞれの径方向の幅が、これら二つの遮光部の間に設けられた透過部の径方向の幅より大きい、
    　多重リングマスク。
  2. 　振幅変調型または位相変調型の空間光変調器を含み、この空間光変調器に提示されたパターンに応じて前記遮光部および前記透過部を有する、
    　請求項１に記載の多重リングマスク。
  3. 　トロイダルレンズを含み、このトロイダルレンズのパターンに応じて前記遮光部および前記透過部を有する、
    　請求項１または２に記載の多重リングマスク。
  4. 　中心位置の周りに設けられたリング形状の１または複数の遮光部を各々有する複数のマスクが積層された構成を有する、
    　請求項１～３の何れか１項に記載の多重リングマスク。
  5. 　コヒーレントな光を出力する光源と、
    　前記光源から出力される光を集光する集光光学系と、
    　前記光源と前記集光光学系による集光位置との間の光路上に設けられた請求項１～４の何れか１項に記載の多重リングマスクと、
    　を備える光照射装置。
  6. 　対象物の表面または内部に光を集光照射する請求項５に記載の光照射装置と、
    　前記光照射装置による前記対象物への光照射に応じて前記対象物で生じた光を検出する光検出装置と、
    　を備える光学顕微鏡。
  7. 　前記光検出装置は、前記光照射装置による集光位置に対して共役の位置に開口を有するピンホール板と、前記対象物で生じた光のうち前記開口を通過した光を受光する光検出器と、を含む、
    　請求項６に記載の光学顕微鏡。
  8. 　前記光照射装置は、前記対象物への光照射の強度を時間的に変調する変調部を含み、
    　前記光検出装置は、前記対象物で生じた光のうち前記変調部による光照射強度変調の際の変調周波数のｎ倍（ｎは１以上の整数）の周波数の成分を求める、
    　請求項６または７に記載の光学顕微鏡。
  9. 　前記光照射装置は、前記対象物への光照射の強度を調整する調整部を含み、
    　前記光検出装置は、前記調整部により前記対象物への光照射強度が複数の値それぞれに設定されたときに前記対象物で生じた光を検出し、これらの検出結果に基づいて、前記対象物で生じた光に含まれる非線形成分を求める、
    　請求項６または７に記載の光学顕微鏡。
  10. 　対象物の表面または内部にパルス光を集光照射する請求項５に記載の光照射装置と、
    　前記光照射装置による前記対象物へのパルス光照射に応じて前記対象物で生じた音波を検出する音波検出装置と、
    　を備える光音響顕微鏡。
  11. 　前記光照射装置は、前記対象物へ照射されるパルス光のパルス幅を調整する調整部を含み、
    　前記音波検出装置は、前記調整部によりパルス幅が複数の値それぞれに設定されたときに前記対象物で生じた音波を検出し、これらの検出結果に基づいて、前記対象物で生じた音波のうち多光子吸収過程により生じた音波の成分を求める、
    　請求項１０に記載の光音響顕微鏡。
  12. 　前記光照射装置は、前記対象物へのパルス光照射の強度を時間的に変調する変調部を含み、
    　前記音波検出装置は、前記対象物で生じた音波のうち前記変調部によるパルス光照射強度変調の際の変調周波数のｎ倍（ｎは１以上の整数）の周波数の成分を求める、
    　請求項１０に記載の光音響顕微鏡。
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