WO2021215894A1 - 세포 배양 장치 - Google Patents

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WO2021215894A1
WO2021215894A1 PCT/KR2021/005231 KR2021005231W WO2021215894A1 WO 2021215894 A1 WO2021215894 A1 WO 2021215894A1 KR 2021005231 W KR2021005231 W KR 2021005231W WO 2021215894 A1 WO2021215894 A1 WO 2021215894A1
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WO
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cell culture
well
groove
culture apparatus
cells
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/005231
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English (en)
French (fr)
Inventor
김진영
최홍수
김은희
Original Assignee
재단법인대구경북과학기술원
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/06—Tubular
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/10—Rotating vessel

Definitions

  • Embodiments of the present invention relate to a cell culture device.
  • the conventional two-dimensional cell culture apparatus is relatively easy to culture cells, but does not provide accurate biometric information due to poor bioreactivity.
  • the conventional two-dimensional cell culture apparatus is difficult to control the size and position of the formed spheroid (spheroid), the repeatability of the culture is poor.
  • the conventional three-dimensional cell culture apparatus has many variables such as the type and shape of the extracellular matrix for imitation of the living environment, cell culture factors, and the shape of the cell culture vessel, so that the configuration of the cell culture apparatus is too complicated. have.
  • a separate anti-cell adhesion coating is disposed on the bottom surface of the well to prevent cells from adhering to the well.
  • Such an anti-cell adhesion coating is weak in durability and can be easily damaged due to contact with a pipette during incubation. And the damaged and peeled off cell adhesion coating material may be adsorbed to the cell, and may affect the formation and observation of the cell.
  • Embodiments of the present invention provide a cell culture apparatus capable of culturing cells as spheroids having a uniform size and shape.
  • a cell culture apparatus is a cell culture apparatus for culturing cells to form a three-dimensional spheroid, and a plurality of plates and one surface of the plate are arranged at predetermined intervals, and Cells are cultured, and a fine pattern is disposed on the inner surface, and the inner surface and the cell are spaced apart from each other.
  • the well has a cylindrical guide wall and a culture groove extending from an end of the guide wall, and having a culture groove having a convex shape downward so that the cells are aggregated in the center;
  • the fine pattern may be repeatedly arranged with a plurality of projections and grooves on the inner surface of the culture groove.
  • the protrusion protrudes from the inner surface of the culture groove toward the center of the culture groove, and has a contact surface in contact with the cell, and the total area of the contact surface is It may be less than half of the total area of the inner surface of the culture groove.
  • the projection may have a shape that narrows toward the center of the culture groove.
  • the micropattern further includes a support disposed on the inner surface of the culture groove, and the protrusion extends from the support, toward the center of the culture groove. can protrude.
  • the well is disposed between the end of the guide wall and the end of the culture groove, and further comprises a stopper inclined at a preset angle toward the inside of the well.
  • the well is disposed at the upper end of the culture groove, and may further include a meniscus region in which the micro-pattern is not formed.
  • the micro-pattern may be formed integrally with the well.
  • the wells are arranged side by side in a plurality of rows and columns on the upper surface of the plate, the cell culture apparatus is arranged on the upper surface of the plate, a reservoir in which a liquid is stored; and a flow channel for supplying the liquid to the plurality of wells by connecting the reservoir and the plurality of wells in at least one of a row direction and a column direction.
  • the cell culture apparatus may rotate along a predetermined axis of rotation to form a flow of the liquid.
  • the cell culture apparatus can form a three-dimensional spheroid, and prevent the cells from adhering to the bottom surface of the well, so that the shape and size of the spheroid can be uniformly controlled.
  • the cell culture apparatus can prevent cells or spheroids from being damaged in a cell culture process such as replacement of a culture medium.
  • the cell culture apparatus may implement a multi-cell network by flowing a drug using a flow channel to different spheroids cultured in each well.
  • FIG. 1 is a view showing a cell culture apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along II-II' of FIG. 1 .
  • FIG. 6 is a diagram illustrating a state in which cells are cultured in the well of FIG. 1 .
  • FIG. 7 is a diagram illustrating a well according to another embodiment of the present invention.
  • 8A is a diagram illustrating a state in which a liquid is replaced in a well as a comparative example.
  • 8B is a diagram illustrating a state in which a liquid is replaced in the well of FIG. 7 .
  • FIG. 9 is a view showing a cell culture apparatus according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a cross-sectional view taken along line X-X' of FIG. 9 .
  • each component do not fully reflect the actual size or area.
  • Terms such as first, second, etc. may be used to describe various elements, but the elements should not be limited by the terms. The terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another.
  • the X-axis direction, the Y-axis direction, and the Z-axis direction may correspond to the width direction, the length direction, and the height direction of the cell culture apparatus or plate, respectively.
  • FIG. 1 is a view showing a cell culture apparatus 10 according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along II-II' of FIG. 1
  • FIG. 3 is an enlarged view of III of FIG. am.
  • a cell culture apparatus 10 may be a 96-well plate or a 384-well plate commonly used in cell culture experiments.
  • the number of wells 200 is not limited thereto, and may vary depending on the characteristics of the cells to be cultured or the purpose of the experiment. Hereinafter, for convenience of description, the number of wells 200 will be mainly described as 96.
  • the cell culture apparatus 10 may include a plate 100 and a well 200 .
  • the plate 100 is a body of the cell culture apparatus 10, and may be a flat plate having a rectangular parallelepiped shape, as shown in FIG. 1 .
  • the plate 100 is made of a plastic material such as polypropylene, and may be integrally manufactured through an injection process.
  • the material of the plate 100 is not limited to plastic, and may be made of quartz or the like.
  • the material of the plate 100 will be mainly described as being plastic.
  • a plurality of wells 200 are disposed on one surface of the plate 100 at predetermined intervals.
  • the well 200 is integrally formed with the plate 100 , and may be disposed on the upper surface of the plate 100 in a plurality of rows and columns.
  • 96 wells 200 are arranged side by side in 8 rows (Rows A to H) and 12 columns (columns 1 to 12) on the top surface of the plate 100 .
  • the number of rows and columns in which the well 200 is disposed is not particularly limited, and various combinations such as 12*8 and 6*16 are possible.
  • the wells 200 are arranged in an 8*12 matrix.
  • the micropattern 230 may be disposed on the inner surface of the well 200 so that the inner surface of the well 200 and the cells C may be spaced apart.
  • cells (C) may be cultured in the well 200 .
  • a liquid W1 necessary for culturing the cells (C) may be accommodated in the well 200, and the liquid (W1) may be a culture medium for culturing the cells (C).
  • the well 200 may be a U-shaped well for 3D cell culture.
  • the type and size of the cells (C) are not particularly limited. In one embodiment, the size of the cell (C) may be 10 ⁇ m to 20 ⁇ m.
  • the well 200 may include a guide wall 210 , a culture groove 220 , and a fine pattern 230 .
  • the guide wall 210 may extend from one surface of the plate 100 toward one side to form an outer wall of the well 200 .
  • the guide wall 210 may have a cylindrical shape extending downward along the Z axis from the upper surface of the plate 100 .
  • the guide wall 210 may have an internal space in which the liquid W1 is accommodated.
  • the culture groove 220 extends from the guide wall 210 and may have a space in which cells (C) or spheroids (S) are cultured.
  • the culture groove 220 is extended from one end of the guide wall 210, the cross-section may be provided with a U-shaped culture space convex downward. Accordingly, the cells (C) may naturally be located in a dense concentration in the center of the culture groove 220 by gravity or centrifugal force. And since the cells (C) grow in the center of the culture groove 220 to form a spheroid (S), the position at which the spheroid (S) is formed and the size and shape of the spheroid (S) can be uniformly controlled. can
  • the shape of the culture groove 220 is not necessarily U-shaped, but it is preferable that the cells (C) have a shape that can be concentrated in the center of the culture groove 220 .
  • the culture groove 220 may be provided with a V-shaped culture space convex downward.
  • the fine pattern 230 may be disposed on the inner surface of the culture groove 220 . More specifically, as shown in FIG. 2 , in the micropattern 230 , protrusions 231 and grooves 232 may be repeatedly disposed along the inner surface of the culture groove 220 . The fine pattern 230 may be disposed on all or part of the inner surface of the culture groove 220 .
  • the protrusion 231 may protrude from the inner surface of the culture groove 220 toward the center.
  • the protruding protrusion 231 may have a contact surface (not shown) in contact with the cell (C) or the spheroid (S).
  • the shape of the protrusion 231 is not particularly limited, and in an embodiment, the protrusion 231 may be a rectangular parallelepiped.
  • the size of the protrusion 231 is not particularly limited, but it is preferably smaller than the size of the cell (C).
  • the width, length, and height of the cuboid-shaped protrusion 231 may be 10 nm to 100 nm, respectively.
  • the size and shape of the grooves 232 disposed between the protrusions 231 are not particularly limited.
  • the size and shape of the groove 232 may correspond to the size and shape of the protrusion 231 , respectively.
  • the fine pattern 230 may be repeatedly disposed so that the protrusions 231 and the grooves 232 form a lattice structure with each other.
  • the contact area between the culture groove 220 and the cell (C) can be significantly reduced.
  • the area in which the culture groove 220 contacts the cells C may be A2.
  • the contact area between the cells (C) and the culture groove (220) is too large, so that the force of the cells (C) to adhere to the culture groove (220) becomes greater than the force for the cells (C) to aggregate with each other.
  • the cells (C) do not grow into a uniform spheroid (S) of a spherical shape, or grow into a plurality of spheroids (S) sporadically in various positions of the culture groove (220).
  • the cells (C) are in contact with the projections 231, and each projection (231) and the cell (C)
  • the sum of the areas of the contact surfaces of A1 is much smaller than that of A2. Accordingly, the cohesive force between the cells (C) becomes greater than the force of the cells (C) to adhere to the inner surface of the culture groove 220, and the cells (C) aggregate with each other and a single spheroid having a uniform shape ( S) can grow.
  • the spheroid (S) may be located in the center of the culture groove (220).
  • the projection 231 and the groove 232 may have a shape and size corresponding to each other, in this case, the total area of the contact surface between the projection 231 and the cell (C) is the inner surface of the culture groove (220) may be less than half of the total area of That is, A1 may be 0.5A2 or less.
  • FIG. 4 is an enlarged view of III of FIG. 2 . More specifically, FIG. 4 is a view showing a fine pattern 230' according to another embodiment of the present invention.
  • the fine pattern 230 ′ may include a protrusion 231 , a groove 232 , and a support 233 .
  • the support 233 is disposed along the inner surface of the culture groove 220 , and the bottom surface of the well 200 together with the culture groove 220 may be configured as a double layer.
  • the support 233 may be disposed on all or part of the inner surface of the culture groove 220 .
  • the protrusion 231 may protrude from the support 233 toward the center of the culture groove 220 .
  • the support 233 on the inner surface of the culture groove 220 , from the center of the culture groove 220 to the area where the protrusion 231 and the cell C are in contact.
  • the radius of curvature of can be reduced from R2 to R1.
  • the cells (C) are more densely concentrated in the center of the culture groove 220, a more uniform shape of the spheroid (S) can be formed.
  • the height of the support body 233 is not specifically limited. The greater the height of the support 233, the shorter the radius of curvature R1, the spheroid (S) can be cultured in a more uniform spherical shape. The height of the support 233 may be appropriately selected in consideration of the purpose of the experiment.
  • FIG. 5 is an enlarged view of III of FIG. 2 . More specifically, FIG. 5 is a diagram illustrating a fine pattern 230 ′′ according to another embodiment of the present invention.
  • the fine pattern 230 ′′ may include a protrusion 231 ′ and a groove 232 ′.
  • the protrusion 231 ′ protrudes from the inner surface of the culture groove 220 toward the center, and may be disposed to be inclined.
  • the protrusion 231 ′ may have a shape in which the width becomes narrower toward the center from the inner surface of the culture groove 220 .
  • the sidewall of the protrusion 231 ′ may be disposed to be inclined by an angle ⁇ with respect to a line perpendicular to the bottom surface of the groove 232 ′.
  • the protrusion 231 ′ may have a shape in which the width gradually decreases from d1 to d2 toward the center of the culture groove 220 .
  • A1' which is an area in which the protrusion 231 ' and the cell (C) are in contact, is further reduced, so that the cell (C) is more reliably prevented from adhering to the inner surface of the culture groove (220).
  • the cohesive force between the cells (C) is greater than the force of the cells (C) to adhere to the inner surface of the culture groove (220), and the cells (C) are denser in the center of the culture groove (220). become densely packed. Therefore, a single spheroid (S) having a more uniform shape can be cultured.
  • the other configuration of the fine pattern 230 ′′ is the same as that of the fine pattern 230 , and a description thereof will be omitted.
  • the guide wall 210, the culture groove 220, and the fine pattern 230 may be integrally formed. More specifically, the cell culture apparatus 10 according to an embodiment of the present invention may be manufactured by a plastic injection process. At this time, the plate 100 and the well 200 of the cell culture apparatus 10, and the guide wall 210 included in the well 200, the culture groove 220, and the micropattern 230 are formed by a plastic injection process. may be integrally formed in
  • the micropattern 230 is not formed separately from the culture groove 220 , but may be manufactured integrally with the cell culture apparatus 10 or the well 200 .
  • the time required for manufacturing the cell culture apparatus 10 can be reduced.
  • the cell culture apparatus 10 has a culture groove 220 and a micropattern 230. ) is integrally formed, and durability can be improved. Accordingly, there is no fear that the cell adhesion prevention coating is damaged by contact with the pipette P during the culture process. In addition, secondary contamination due to damaged cell adhesion prevention coating does not occur, thereby increasing the reliability of the experiment.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating a state in which cells are cultured in the well 200 of FIG. 1 .
  • a three-dimensional spheroid (S) can be obtained.
  • the cell culture apparatus 10 forms a fine pattern 230 on the inner surface of the culture groove 220, thereby reducing the contact area between the cell (C) and the culture groove 220 to reduce the cell (C) C) can be grown into three-dimensional spheroids (S) having a uniform size.
  • the cells (C) are not sporadically located in the culture groove 220, but one spheroid (S). ) by being aggregated, a single spheroid (S) can be located in the center of the culture groove (220).
  • FIG. 7 is a view showing a well 200' according to another embodiment of the present invention
  • FIG. 8a is a view showing a state in which the liquid W1 is replaced in the well 200' as a comparative example
  • FIG. 8b is FIG. 7 is a diagram illustrating a state in which the liquid W1 is replaced in the well 200 ′.
  • a well 200 ′ according to another embodiment of the present invention includes a guide wall 210 , a culture groove 220 , a fine pattern 230 , a stopper 240 , and a meniscus. region 250 may be included.
  • the stopper 240 is disposed to extend from the end of the guide wall 210 , and may be continuously disposed along the outer circumferential surface of the guide wall 210 . In an embodiment, the stopper 240 may be inclined by an angle ⁇ 1 from the lower end of the guide wall 210 to extend inside the well 200 ′.
  • the inclination angle ⁇ 1 of the stopper 240 is not particularly limited, it is preferable that the pipette P can be prevented from moving in the height direction, for example, the Z-axis direction. In one embodiment, the angle ⁇ 1 may be greater than or equal to 30°.
  • the angle ⁇ 1 may be less than or equal to 60°.
  • the angle ⁇ 2 is an angle between the stopper 240 and the inlet of the pipette P.
  • the angle ⁇ 2 may be equal to the angle ⁇ 1.
  • the angle ⁇ 2 may be different from the angle ⁇ 1 according to the shape of the inlet of the pipette P or the degree to which the pipette P is inclined.
  • the length of the stopper 240 is not particularly limited. Considering the size and location of the cell (C) or spheroid (S), even if the liquid (W1) is replaced with the pipette (P) located at the lowest end of the stopper (240), the cell (C) or spheroid (S) ) is preferably of such a length that it is not damaged.
  • the cell culture apparatus 10 can prevent the cells (C) or the spheroids (S) from being damaged in the process of replacing the culture medium.
  • the pipette P may be used to replace the liquid W1 accommodated in the inner space of the well 200 ′.
  • the reference position of the pipette P is not determined, and the inlet position of the pipette P may vary depending on the user's skill level and repetition of experiments. Accordingly, the amount of the replaced liquid W1 may vary according to the skill level of the user.
  • cells (C) or spheroids (S) may be damaged by contact with the pipette (P) in the process of manually controlling the pipette (P) by the user.
  • the cell (C) or the spheroid (S) may be damaged as the pipette (P) sucks the liquid (W1) from a position that is too close to the cell (C) or spheroid (S).
  • the well 200 ′ includes a stopper 240 extending from an end of the guide wall 210 . Accordingly, the user can stably position the inlet of the pipette P on the stopper 240 along the guide wall 210 .
  • the stopper 240 serves as a reference for the position of the pipette P, the pipette P can be positioned at a constant position regardless of the user's skill level or the number of repetitions of the experiment.
  • the liquid W1 can be replaced while the inlet of the pipette P is in contact with the stopper 240 , the amount of the replaced liquid W1 can be made constant.
  • the inlet of the pipette (P) and the cell (C) or spheroid (S) are in contact, or the inlet of the pipette (P) is too close to the cell (C) or spheroid (S)
  • the liquid (W1) inhalation can be prevented.
  • the meniscus region 250 may be a partial region of the culture groove 220 .
  • the meniscus region 250 may be a region in which the micro-pattern 230 is not disposed in the culture groove 220 .
  • the fine pattern 230 has a embossed pattern in which the protrusions 231 protrude. Therefore, the contact area with the liquid W1 is increased compared to the case in which the fine pattern 230 is not formed, and the hydrophobicity of the culture groove 220 is increased. Accordingly, as shown in FIG. 8A , when the fine pattern 230 is also disposed on the upper end of the culture groove 220, the surface of the liquid W1 forms a meniscus convex upward (indicated by the virtual line VC). ). At this time, when the edge of the liquid W1 is located at the upper end of the culture groove 220, the height of the meniscus formed by the liquid W1 may be L1.
  • the pipette P when the pipette P is positioned in the center of the well 200' to suck the liquid W1 remaining in the culture groove 220, the inlet of the pipette P and the spheroid S are too close. , while the pipette P sucks the liquid W1, the spheroid S may move. In particular, since the inlet size of the pipette P is generally larger than the size of the spheroid S, the spheroid S may be sucked into the pipette P.
  • the user should position the position of the pipette (P) to the edge of the meniscus of the liquid (W1). Accordingly, the replacement process of the liquid (W1) may become long and complicated, and the amount of the liquid (W1) remaining in the culture groove 220 without being replaced is relatively large.
  • the well 200 ′ includes a meniscus region 250 in which the fine pattern 230 is not disposed at the upper end of the culture groove 220 . Accordingly, as shown in Fig. 8B, the surface of the liquid W1 forms a downward convex meniscus (indicated by an imaginary line VC). In this case, when the edge of the liquid W1 is positioned at the upper end of the meniscus region 250 , the depth of the meniscus formed by the liquid W1 may be L2 .
  • the inlet of the pipette P is positioned at the meniscus edge of the liquid W1.
  • a large amount of liquid W1 can be replaced even in the In addition, it is possible to prevent a part of the cells (C) or spheroids (S) from being sucked into the pipette (P) in the process of replacing the liquid (W1).
  • the well 200 ′ may include both the stopper 240 and the meniscus region 250 . More specifically, as shown in FIG. 8B , the meniscus region 250 may be located at the upper end of the culture groove 220 , that is, at the boundary between the culture groove 220 and the stopper 240 . In addition, one end of the stopper 240 may be connected to one end of the guide wall 210 , and the other end of the stopper 240 may be connected to one end of the meniscus region 250 .
  • the position of the pipette P can be specified regardless of the user's skill level or the number of experiments, so that the amount of the liquid W1 replaced can be uniform.
  • FIG. 9 is a view showing a cell culture apparatus 10' according to another embodiment of the present invention, and FIG. 10 is a cross-sectional view taken along X-X' of FIG.
  • the cell culture apparatus 10 ′ may include a plate 100 , a well 200 , a reservoir 300 , and a flow channel 400 .
  • the reservoir 300 is disposed on the upper surface of the plate 100 and may be disposed adjacent to the well 200 .
  • the number of storage tanks 300 may be disposed on the left side of the well 200 located in the first column and on the right side of the well 200 located in the 12th column, respectively, in the same number as the number of columns.
  • the number of storage tanks 300 may be disposed above the well 200 located in row A and below the well 200 located in row H, respectively, in the same number as the number of rows.
  • the liquid W2 may be stored in the storage tank 300 .
  • the liquid W2 may be the same as or different from the liquid W1.
  • it may be a drug for applying a specific chemical stimulus to the cells (C) or spheroids (S) cultured inside the well 200 .
  • the flow channel 400 may be disposed on the lower inner side of the plate 100 to connect the well 200 and the reservoir 300 .
  • the flow channel may be arranged to connect the reservoir 300 and the plurality of wells 200 in at least one of a row direction and a column direction.
  • the flow channel 400 may be disposed to extend in the X-axis direction to connect the wells 200 and the reservoir 300 disposed in each row. Accordingly, the liquid W2 stored in the storage tank 300 may be delivered to each well 200 .
  • the flow channel 400 connects the well 200 and the reservoir 300 disposed in each row, but is not limited thereto.
  • the flow channel 400 may be disposed to extend in the Y-axis direction to connect the wells 200 and the reservoir 300 disposed in each row.
  • the flow channel 400 may be arranged to extend in the X-axis direction and the Y-axis direction to connect each well 200 and the reservoir 300 in a grid shape.
  • the cell culture apparatus 10 ′ may rotate along a predetermined rotation axis to form a flow of the liquid W2 . More specifically, the liquid W2 stored in the storage tank 300 may be introduced into each well 200 as the cell culture apparatus 10 ′ rotates about the rotation axis AX1 parallel to the Z axis.
  • This flow of the liquid (W2) can be formed simply by tilting the cell culture device (10'), and thus the culture of the spheroid (S), and the liquid (W2) and cultured in each well (200) The reaction of the spheroid (S) can be easily tested and observed in one cell culture device (10').
  • the cell culture apparatus 10 ′ in the cell culture apparatus 10 ′ according to an embodiment of the present invention, different spheroids S are cultured in each well 200 , and the spheroids S are connected to each other through the flow channel 400 . It is possible to implement a multi-cellular network formed by In particular, the cell culture apparatus 10 ′ according to an embodiment of the present invention can uniformly control the shape, size and position of the spheroids S cultured in each well 200 , so that the multi-cell network Easy to repeat.
  • the cell culture apparatus 10 ′ includes the well 200 , but is not limited thereto.
  • the cell culture apparatus 10' may include various types of plates and wells, and the well 200' of the above-described embodiment may be included.
  • Cell culture apparatus (10, 10') can form a three-dimensional spheroid (S), the cell (C) is attached to the bottom surface of the well (200, 200') By preventing, it is possible to uniformly control the shape and size of the spheroid (S).
  • Cell culture apparatus (10, 10') can prevent the cell (C) or the spheroid (S) from being damaged in the cell culture process, such as replacement of the culture medium.
  • Cell culture apparatus (10, 10') flows the drug using the flow channel (400) to different spheroids (S) cultured in each well (200, 200'), Multi-cell networks can be implemented.
  • Cell culture apparatus (10, 10 ') without using an extracellular matrix (extracellular matrix), without hydrogel (hydrogel) or chemical pretreatment without scaffold free type (scaffold free type) 3 It can form dimensional spheroids.

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Abstract

본 발명은 세포 배양 장치를 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치는 세포를 배양하여 3차원 스페로이드(spheroid)로 형성하는 세포 배양 장치로서, 플레이트 및 상기 플레이트의 일면에 기 설정된 간격으로 복수 개 배치되고, 내부에 세포가 배양되며, 내측면에 미세 패턴이 배치되어 상기 내측면과 상기 세포가 이격되는, 웰을 포함할 수 있다.

Description

세포 배양 장치
본 발명의 실시예들은 세포 배양 장치에 관한 것이다.
종래의 2차원 세포 배양 장치는 상대적으로 세포 배양이 쉬운 반면, 생체 대응성이 떨어져 정확한 생체 정보를 제공하지 못한다. 또한, 종래의 2차원 세포 배양 장치는 형성되는 스페로이드(spheroid)의 크기 및 위치를 조절하기 어렵기 때문에 배양의 반복 재현성이 떨어진다.
또한 종래의 3차원 세포 배양 장치는 생체 환경 모방을 위한 세포외 기질(extracellular matrix)의 종류 및 형상, 세포 배양 인자, 세포 배양 용기의 형상 등의 변수가 많아 세포 배양 장치의 구성이 지나치게 복잡한 문제가 있다.
특히, 종래의 3차원 세포 배양 장치는 세포가 웰에 부착되는 것을 방지하기 위해, 웰의 바닥면에 별도의 세포 부착 방지 코팅을 배치하고 있다. 이러한 세포 부착 방지 코팅은 내구성이 약하여 배양 도중에 피펫과의 접촉 등으로 인해 쉽게 손상될 수 있다. 그리고 손상되어 떨어져 나간 세포 부착 방지 코팅 물질이 세포에 흡착될 수 있으며, 세포의 형성 및 관찰에 영향을 미칠 수 있다.
전술한 배경 기술은 발명자가 본 발명의 도출을 위해 보유하고 있었거나, 본 발명의 도출 과정에서 습득한 기술 정보로서, 반드시 본 발명의 출원 전에 일반 공중에게 공개된 공지 기술이라 할 수는 없다.
본 발명의 실시예들은 세포를 균일한 크기와 형상을 갖는 스페로이드로 배양할 수 있는 세포 배양 장치를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치는, 세포를 배양하여 3차원 스페로이드(spheroid)로 형성하는 세포 배양 장치로서, 플레이트 및 상기 플레이트의 일면에 기 설정된 간격으로 복수 개 배치되고, 내부에 세포가 배양되며, 내측면에 미세 패턴이 배치되어 상기 내측면과 상기 세포가 이격되는 웰을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치에 있어서, 상기 웰은 원통형의 가이드벽 및 상기 가이드벽의 단부에서 연장되며, 상기 세포가 중심부에서 응집되도록 아래로 볼록한 형상의 배양홈을 구비하고, 상기 미세 패턴은 상기 배양홈의 내측면에 복수 개의 돌기와 홈이 반복하여 배치될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치에 있어서, 상기 돌기는 상기 배양홈의 내측면에서 상기 배양홈의 중심부를 향해 돌출되며, 상기 세포와 접촉하는 접촉면을 구비하고, 상기 접촉면의 전체 면적은 상기 배양홈의 내측면의 전체 면적의 절반 이하일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치에 있어서, 상기 돌기는 상기 배양홈의 중심부를 향해 좁아지는 형상을 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치에 있어서, 상기 미세 패턴은 상기 배양홈의 내측면 상에 배치되는 지지체를 더 포함하고, 상기 돌기는 상기 지지체에서 연장되어, 상기 배양홈의 중심부를 향해 돌출될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치에 있어서, 상기 웰은 상기 가이드벽의 단부와 상기 배양홈의 단부 사이에 배치되며, 상기 웰의 내측을 향해 기 설정된 각도로 경사진 스토퍼를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치에 있어서, 상기 웰은 상기 배양홈의 상단부에 배치되며, 상기 미세 패턴이 형성되지 않는 메니스커스 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치에 있어서, 상기 미세 패턴은 상기 웰과 일체로 형성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치에 있어서, 상기 웰은 상기 플레이트의 상면에 복수 개의 행 및 열로 나란히 배치되고, 상기 세포 배양 장치는 상기 플레이트의 상면에 배치되며, 액체가 저장되는 저장조 및 행 방향 또는 열 방향 중 적어도 어느 한 방향으로 상기 저장조와 상기 복수 개의 웰을 연결하여, 상기 액체를 상기 복수 개의 웰로 공급하는 유동 채널을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치에 있어서, 상기 세포 배양 장치는 소정의 회전축을 따라 회전하여 상기 액체의 유동을 형성할 수 있다.
전술한 것 외의 다른 측면, 특징, 이점은 이하의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 청구범위 및 도면으로부터 명확해질 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치는 3차원 스페로이드를 형성할 수 있으며, 세포가 웰의 바닥면에 부착되는 것을 방지하여, 스페로이드의 형상 및 크기를 균일하게 제어할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치는 배양액의 교체 등 세포 배양 과정에서 세포 또는 스페로이드가 손상되는 것을 방지할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치는 각각의 웰에서 배양되는 서로 다른 스페로이드에 유동 채널을 이용해 약물을 흘려주어, 다중 세포 네트워크를 구현할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치를 나타내는 도면이다.
도 2는 도 1의 Ⅱ-Ⅱ'를 따라 취한 단면도이다.
도 3, 도 4, 도 5는 도 2의 Ⅲ을 확대하여 나타내는 도면이다.
도 6은 도 1의 웰에서 세포가 배양되는 상태를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 다른 실시예에 따른 웰을 나타내는 도면이다.
도 8a는 비교예로서 웰에서 액체를 교체하는 상태를 나타내는 도면이다.
도 8b는 도 7의 웰에서 액체를 교체하는 상태를 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포 배양 장치를 나타내는 도면이다.
도 10은 도 9의 Ⅹ-Ⅹ'를 따라 취한 단면도이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 발명의 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시예로 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 다른 실시예에 도시되어 있다 하더라도, 동일한 구성요소에 대하여서는 동일한 식별부호를 사용한다.
도면에서 각 구성요소의 두께나 크기는 설명의 편의 및 명확성을 위하여 과장되거나 생략되거나 또는 개략적으로 도시되었다.
또한 각 구성요소의 크기와 면적은 실제크기나 면적을 전적으로 반영하는 것은 아니다. 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 구성요소들은 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, X축 방향, Y축 방향 및 Z축 방향은 각각 세포 배양 장치 또는 플레이트의 폭 방향, 길이 방향 및 높이 방향에 각각 대응될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치(10)를 나타내는 도면이고, 도 2는 도 1의 Ⅱ-Ⅱ'를 따라 취한 단면도이고, 도 3은 도 2의 Ⅲ을 확대하여 나타내는 도면이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치(10)는 세포 배양 실험 등에서 통상적으로 사용되는 96 웰 플레이트 또는 384 웰 플레이트일 수 있다. 다만 웰(200)의 개수는 이에 한정하지 않으며, 배양하고자 하는 세포의 특성 또는 실험의 목적 등에 따라 달라질 수 있다. 이하에서는 설명의 편의를 위해 웰(200)의 개수는 96개인 것을 중심으로 설명한다.
도 1 내지 도 3을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치(10)는 플레이트(100)와, 웰(200)을 포함할 수 있다.
플레이트(100)는 세포 배양 장치(10)의 몸체로서, 도 1에 나타낸 바와 같이 직육면체 형상의 평판일 수 있다. 일 실시예로, 플레이트(100)는 폴리프로필렌(polypropylene) 등의 플라스틱 재질로서, 사출 공정을 통해 일체로 제조될 수 있다. 다만, 플레이트(100)의 재질은 플라스틱에 한정하지 않으며, 석영(quartz) 등으로 이루어질 수 있다. 이하에서는 설명의 편의를 위해 플레이트(100)의 재질은 플라스틱인 것을 중심으로 설명한다.
웰(200)은 플레이트(100)의 일면에 기 설정된 간격으로 복수 개 배치된다. 일 실시예로, 웰(200)은 플레이트(100)와 일체로 형성되며, 플레이트(100)의 상면에 복수 개의 행과 열로 배치될 수 있다. 예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같이, 96개의 웰(200)은 플레이트(100)의 상면에 8개의 행(A행 내지 H행)과 12개의 열(1 열 내지 12 열)로 나란히 배치될 수 있다. 다만, 웰(200)이 배치되는 행 및 열의 개수는 특별히 한정하지 않으며, 12*8, 6*16 등 다양한 조합이 가능하다. 이하에서는 설명의 편의를 위해 웰(200)이 8*12의 행렬로 배치되는 것을 중심으로 설명한다.
일 실시예로, 웰(200)의 내측면에는 미세 패턴(230)이 배치되어, 웰(200)의 내측면과 세포(C)가 이격될 수 있다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 웰(200)의 내부에는 세포(C)가 배양될 수 있다. 이를 위해, 웰(200)의 내부에는 세포(C) 배양에 필요한 액체(W1)가 수용될 수 있으며, 액체(W1)는 세포(C)의 배양을 위한 배양액일 수 있다. 일 실시예로, 웰(200)은 3차원 세포 배양을 위한 U자형 웰일 수 있다.
세포(C)의 종류 및 크기 등은 특별히 한정하지 않는다. 일 실시예로, 세포(C)의 크기는 10 μm 내지 20 μm일 수 있다.
웰(200)은 가이드벽(210)과, 배양홈(220)과, 미세 패턴(230)을 포함할 수 있다.
가이드벽(210)은 플레이트(100)의 일면에서 일측을 향해 연장되어, 웰(200)의 외벽을 형성할 수 있다. 일 실시예로, 가이드벽(210)은 플레이트(100)의 상면에서 Z축을 따라 아래로 연장되는 원통 형상일 수 있다. 가이드벽(210)은 액체(W1)가 수용되는 내부 공간을 구비할 수 있다.
배양홈(220)은 가이드벽(210)에서 연장되며, 세포(C) 또는 스페로이드(S)가 배양되는 공간을 구비할 수 있다. 일 실시예로, 배양홈(220)은 가이드벽(210)의 일단에서 연장되며, 단면이 아래로 볼록한 U자형의 배양 공간을 구비할 수 있다. 이에 따라, 세포(C)들은 중력 또는 원심력에 의해 자연스럽게 배양홈(220)의 중심부에 밀집하여 위치할 수 있다. 그리고 세포(C)들은 배양홈(220)의 중심부에서 성장하여 스페로이드(S)를 형성하게 되므로, 스페로이드(S)가 형성되는 위치와 스페로이드(S)의 크기 및 형상도 균일하게 제어될 수 있다.
배양홈(220)의 형상은 반드시 U자형일 필요는 없으나, 세포(C)들이 배양홈(220)의 중심부에 밀집될 수 있는 형상인 것이 바람직하다. 다른 실시예로, 배양홈(220)은 아래로 볼록한 V자형의 배양 공간을 구비할 수 있다.
미세 패턴(230)은 배양홈(220)의 내측면에 배치될 수 있다. 보다 구체적으로, 도 2에 나타낸 바와 같이, 미세 패턴(230)은 배양홈(220)의 내측면을 따라 돌기(231)와 홈(232)이 반복하여 배치될 수 있다. 미세 패턴(230)은 배양홈(220)의 내측면 전부 또는 일부에 배치될 수 있다.
도 3을 참조하면, 돌기(231)는 배양홈(220)의 내측면에서 중심부를 향해 돌출될 수 있다. 돌출된 돌기(231)는 세포(C) 또는 스페로이드(S)와 접촉하는 접촉면(도면 부호 미도시)을 구비할 수 있다.
돌기(231)의 형상은 특별히 한정하지 않으며, 일 실시예로 돌기(231)는 직육면체일 수 있다.
돌기(231)의 크기는 특별히 한정하지 않으나, 세포(C)의 크기보다 작은 것이 바람직하다. 일 실시예로, 직육면체 형상의 돌기(231)의 폭, 길이 및 높이는 각각 10 nm 내지 100 nm일 수 있다.
돌기(231) 사이에 배치되는 홈(232)의 크기 및 형상은 특별히 한정하지 않는다. 바람직하게, 홈(232)의 크기 및 형상은 돌기(231)의 크기 및 형상에 각각 대응될 수 있다. 이에 따라, 미세 패턴(230)은 돌기(231)와 홈(232)이 서로 격자 구조를 이루도록 반복하여 배치될 수 있다.
이러한 구성을 통해 배양홈(220)과 세포(C)의 접촉 면적을 현저하게 줄일 수 있다.
보다 구체적으로, 도 3에 나타낸 바와 같이, 미세 패턴(230)이 형성되지 않은 경우에 배양홈(220)이 세포(C)와 접촉하는 면적은 A2일 수 있다. 이 경우, 세포(C)와 배양홈(220)이 접촉하는 면적이 지나치게 커, 세포(C)가 서로 응집하려는 힘보다 세포(C)가 배양홈(220)에 부착되는 힘이 더 커지게 된다. 이에 따라, 세포(C)가 균일한 구 형상의 스페로이드(S)로 성장하지 못하거나, 배양홈(220)의 여러 위치에 산발적으로 복수 개의 스페로이드(S)로 성장하게 된다.
반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치(10)의 경우, 도 3에 나타낸 바와 같이, 세포(C)들은 돌기(231)와 접촉하며, 각각의 돌기(231)와 세포(C)의 접촉면의 면적인 A1의 합은 A2보다 훨씬 작다. 이에 따라, 세포(C)가 배양홈(220)의 내측면에 부착하는 힘보다 세포(C) 간의 응집력이 더 커지게 되고, 세포(C)가 서로 응집하여 균일한 형상을 갖는 단일 스페로이드(S)로 성장할 수 있다. 또한, 스페로이드(S)는 배양홈(220)의 중심부에 위치할 수 있다.
일 실시예로, 돌기(231)와 홈(232)이 서로 대응되는 형상 및 크기를 가질 수 있고, 이때 돌기(231)와 세포(C)의 접촉면의 전체 면적은 배양홈(220)의 내측면의 전체 면적의 절반 이하일 수 있다. 즉, A1는 0.5A2 이하일 수 있다.
도 4는 도 2의 Ⅲ을 확대하여 나타내는 도면이다. 보다 구체적으로, 도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 미세 패턴(230')을 나타내는 도면이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 다른 실시예에 따른 미세 패턴(230')은 돌기(231)와, 홈(232)과, 지지체(233)를 포함할 수 있다.
지지체(233)는 배양홈(220)의 내측면을 따라 배치되어, 배양홈(220)과 함께 웰(200)의 바닥면을 이중 레이어로 구성할 수 있다. 지지체(233)는 배양홈(220)의 내측면의 전부 또는 일부에 배치될 수 있다.
또한, 돌기(231)는 지지체(233)로부터 배양홈(220)의 중심부를 향해 돌출될 수 있다.
이와 같은 구성을 통해, 세포(C)들이 응집하여 형성되는 스페로이드(S)의 위치 및 형상을 보다 균일하게 제어할 수 있다.
보다 구체적으로, 도 4에 나타낸 바와 같이, 배양홈(220)의 내측면에 지지체(233)를 배치함으로써, 배양홈(220)의 중심부에서 돌기(231)와 세포(C)가 접촉하는 영역까지의 곡률 반경이 R2에서 R1으로 감소될 수 있다.
이에 따라, 세포(C)들이 배양홈(220)의 중심부에 보다 조밀하게 밀집하게 되어, 보다 균일한 형상의 스페로이드(S)가 형성될 수 있다. 또한, 스페로이드(S)를 배양홈(220)의 중심부에 보다 확실하게 위치시킬 수 있다.
지지체(233)의 높이는 특별히 한정하지 않는다. 지지체(233)의 높이가 커질수록 곡률 반경 R1이 짧아져, 스페로이드(S)가 보다 균일한 구 형상으로 배양될 수 있다. 지지체(233)의 높이는 실험 목적 등을 고려하여 적절히 선택될 수 있다.
미세 패턴(230')의 다른 구성은 미세 패턴(230)의 구성과 동일하며, 이에 대한 설명은 생략한다.
도 5는 도 2의 Ⅲ을 확대하여 나타내는 도면이다. 보다 구체적으로, 도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따른 미세 패턴(230'')을 나타내는 도면이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 다른 실시예에 따른 미세 패턴(230'')은 돌기(231')와 홈(232')을 포함할 수 있다.
돌기(231')는 배양홈(220)의 내측면에서 중심부를 향해 돌출되되, 경사지도록 배치될 수 있다. 일 실시예로, 돌기(231')는 배양홈(220)의 내측면에서 중심부를 향할수록 폭이 좁아지는 형상을 가질 수 있다. 이에 따라, 돌기(231')의 측벽은 홈(232')의 바닥면에 수직인 선에 대해 각도 θ만큼 기울어지도록 배치될 수 있다. 또한, 돌기(231')는 폭이 배양홈(220)의 중심부를 향해 d1에서 d2로 점점 감소하는 형상을 가질 수 있다.
이러한 구성을 통해, 돌기(231')와 세포(C)가 접촉하는 면적인 A1'이 보다 감소하게 되어, 세포(C)가 배양홈(220)의 내측면에 부착되는 것을 보다 확실하게 방지할 수 있다. 이에 따라, 세포(C)가 배양홈(220)의 내측면에 부착하는 힘보다 세포(C) 간의 응집력이 보다 더 커지게 되고, 세포(C)들이 배양홈(220)의 중심부에 한층 더 조밀하게 밀집하게 된다. 따라서 한층 더 균일한 형상을 갖는 단일 스페로이드(S)가 배양될 수 있다.
미세 패턴(230'')의 다른 구성은 미세 패턴(230)의 구성과 동일하며, 이에 대한 설명은 생략한다.
일 실시예로, 가이드벽(210)과, 배양홈(220)과, 미세 패턴(230)은 일체로 형성될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치(10)는 플라스틱 사출 공정에 의해 제조될 수 있다. 이때, 세포 배양 장치(10)의 플레이트(100)와 웰(200), 그리고 웰(200)에 포함된 가이드벽(210)과, 배양홈(220)과, 미세 패턴(230)은 플라스틱 사출 공정에서 일체로 형성될 수 있다.
즉, 미세 패턴(230)은 배양홈(220)과 별도로 형성되는 것이 아니라, 세포 배양 장치(10) 또는 웰(200)과 일체로 제조될 수 있다.
이에 따라, 미세 패턴(230)을 형성하는 별도의 공정이 필요 없어 세포 배양 장치(10)의 제조에 소요되는 시간을 줄일 수 있다.
또한, 완성된 세포 배양 장치에 별도의 세포 부착 방지 코팅 처리를 하는 종래의 세포 배양 장치와 달리, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치(10)는 배양홈(220)과 미세 패턴(230)이 일체로 형성되어, 내구성이 향상될 수 있다. 이에 따라, 배양 과정에서 피펫(P)과의 접촉 등에 의해 세포 부착 방지 코팅이 손상될 우려가 없다. 또한, 손상된 세포 부착 방지 코팅으로 인한 2차 오염이 발생하지 않아, 실험의 신뢰성을 높일 수 있다.
도 6은 도 1의 웰(200)에서 세포가 배양되는 상태를 나타내는 도면이다.
도 6을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치(10)를 이용하여 세포(C)를 배양하는 경우, 3차원 스페로이드(S)를 얻을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치(10)는 배양홈(220)의 내측면에 미세 패턴(230)을 형성함으로써, 세포(C)와 배양홈(220)의 접촉 면적을 줄여 세포(C)들이 균일한 크기를 갖는 3차원 스페로이드(S)로 성장할 수 있다.
또한, 세포(C)들 간의 응집력이 세포(C)와 배양홈(220) 간의 부착력보다 강하기 때문에, 세포(C)들이 배양홈(220)에 산발적으로 위치하는 것이 아니라, 하나의 스페로이드(S)로 응집됨으로써, 단일 스페로이드(S)를 배양홈(220)의 중심부에 위치시킬 수 있다.
도 7은 본 발명의 다른 실시예에 따른 웰(200')을 나타내는 도면이고, 도 8a는 비교예로서 웰(200')에서 액체(W1)를 교체하는 상태를 나타내는 도면이고, 도 8b는 도 7의 웰(200')에서 액체(W1)를 교체하는 상태를 나타내는 도면이다.
도 7을 참조하면, 본 발명의 다른 실시예에 따른 웰(200')은 가이드벽(210)과, 배양홈(220)과, 미세 패턴(230)과, 스토퍼(240)와, 메니스커스 영역(250)을 포함할 수 있다.
스토퍼(240)는 가이드벽(210)의 단부에서 연장되도록 배치되며, 가이드벽(210)의 외주면을 따라 연속하여 배치될 수 있다. 일 실시예로, 스토퍼(240)는 가이드벽(210)의 하단부에서 각도 φ1만큼 기울어져 웰(200')의 내측으로 연장되도록 배치될 수 있다.
스토퍼(240)의 경사 각도 φ1은 특별히 한정하지 않으나, 피펫(P)이 높이 방향, 예를 들어 Z축 방향으로 이동하는 것을 방지할 수 있는 것이 바람직하다. 일 실시예로, 각도 φ1은 30° 이상일 수 있다.
또한, 스토퍼(240)의 경사 각도가 지나치게 클 경우, 피펫(P)의 입구가 스토퍼(240)에 의해 막혀, 액체(W1)의 교체가 원활하게 이루어지지 않을 수 있다. 일 실시예로, 각도 φ1은 60° 이하일 수 있다.
각도 φ2는 스토퍼(240)와 피펫(P)의 입구가 이루는 각도이다. 각도 φ2는 각도 φ1과 동일할 수 있다. 또는, 각도 φ2는 피펫(P)의 입구의 형상이나 피펫(P)이 기울어진 정도에 따라 각도 φ1과 상이할 수 있다.
스토퍼(240)의 길이는 특별히 한정하지 않는다. 세포(C) 또는 스페로이드(S)의 크기와 위치를 고려하여, 피펫(P)이 스토퍼(240)의 최하단부에 위치한 상태에서 액체(W1)를 교체하더라도, 세포(C) 또는 스페로이드(S)가 손상되지 않는 정도의 길이를 갖는 것이 바람직하다.
이와 같은 구성을 통해, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치(10)는 배양액을 교체하는 과정에서 세포(C) 또는 스페로이드(S)가 손상되는 것을 방지할 수 있다.
보다 구체적으로, 도 7에 나타낸 바와 같이, 웰(200')의 내부 공간에 수용된 액체(W1)를 교체하기 위해 피펫(P)이 이용될 수 있다. 이때, 스토퍼(240)가 없는 경우, 피펫(P)의 기준 위치가 정해지지 않아, 사용자의 숙련도 및 실험의 반복 등에 따라 피펫(P)의 입구 위치가 달라질 수 있다. 이에 따라, 사용자의 숙련도에 따라 교체되는 액체(W1)의 양이 달라질 수 있다.
또한, 피펫(P)의 길이 또는 웰(200')의 전체 깊이에 비해, 세포(C) 또는 스페로이드(S)의 크기나, 세포(C) 또는 스페로이드(S)가 위치하는 배양홈(220)의 깊이는 극히 작기 때문에, 사용자가 피펫(P)을 수작업으로 제어하는 과정에서 세포(C) 또는 스페로이드(S)가 피펫(P)과 접촉하여 손상될 수 있다. 또는, 피펫(P)이 세포(C) 또는 스페로이드(S)와 지나치게 가까운 위치에서 액체(W1)를 흡입함에 따라 세포(C) 또는 스페로이드(S)가 손상될 수 있다.
반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 웰(200')은 가이드벽(210)의 단부에서 연장되는 스토퍼(240)를 포함하고 있다. 이에 따라, 사용자는 가이드벽(210)을 따라 피펫(P)의 입구를 스토퍼(240) 상에 안정적으로 위치시킬 수 있다. 또한, 스토퍼(240)가 피펫(P) 위치의 기준이 되기 때문에, 사용자의 숙련도 또는 실험의 반복 횟수와 상관 없이 피펫(P)을 일정한 위치에 위치시킬 수 있다.
따라서, 피펫(P)의 입구가 스토퍼(240)와 접촉한 상태에서 액체(W1)를 교체할 수 있기 때문에 교체되는 액체(W1)의 양을 일정하게 할 수 있다. 또한, 피펫(P)의 입구와 세포(C) 또는 스페로이드(S)가 접촉하거나, 피펫(P)의 입구가 세포(C) 또는 스페로이드(S)와 지나치게 가까운 위치에서 액체(W1)를 흡입하는 것을 방지할 수 있다.
다시 도 7을 참조하면, 메니스커스 영역(250)은 배양홈(220)의 일부 영역일 수 있다. 일 실시예로, 메니스커스 영역(250)은 배양홈(220)에서 미세 패턴(230)이 배치되지 않은 영역일 수 있다.
보다 구체적으로, 전술한 바와 같이 미세 패턴(230)은 돌기(231)가 돌출된 양각 패턴을 가진자. 따라서 미세 패턴(230)이 형성되지 않은 경우에 비해 액체(W1)와의 접촉 면적이 늘어나, 배양홈(220)의 소수성이 더 커지게 된다. 이에 따라, 도 8a에 나타낸 바와 같이, 미세 패턴(230)이 배양홈(220)의 상단부에도 배치되는 경우, 액체(W1)의 표면은 위로 볼록한 메니스커스를 형성하게 된다(가상선 VC로 표시). 이때, 액체(W1)의 가장자리가 배양홈(220)의 상단부에 위치했을 때, 액체(W1)가 형성하는 메니스커스의 높이는 L1일 수 있다.
이때, 배양홈(220)에 잔존하는 액체(W1)를 흡입하기 위해 피펫(P)을 웰(200')의 중심부에 위치시킬 경우, 피펫(P)의 입구와 스페로이드(S)가 지나치게 가까워져, 피펫(P)이 액체(W1)를 흡입하는 과정에서 스페로이드(S)가 움직일 수 있다. 특히, 일반적으로 피펫(P)의 입구 크기가 스페로이드(S)의 크기보다 더 크기 때문에, 스페로이드(S)가 피펫(P)으로 흡입될 수 있다.
따라서 스페로이드(S)가 액체(W1)의 교체 과정에서 영향을 받는 것을 피하기 위해, 사용자는 피펫(P)의 위치를 액체(W1)의 메니스커스의 가장자리로 위치시켜야 한다. 이에 따라, 액체(W1)의 교체 과정이 길어지고 번잡해질 수 있으며, 교체되지 못하고 배양홈(220)에 잔존하는 액체(W1)의 양이 상대적으로 많아진다.
반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 웰(200')은 배양홈(220)의 상단부에 미세 패턴(230)이 배치되지 않은 메니스커스 영역(250)을 포함하고 있다. 이에 따라, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 액체(W1)의 표면은 아래로 볼록한 메니스커스를 형성하게 된다(가상선 VC로 표시). 이때, 액체(W1)의 가장자리가 메니스커스 영역(250)의 상단부에 위치했을 때, 액체(W1)가 형성하는 메니스커스의 깊이는 L2일 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치(10)는 메니스커스 영역(250)이 없는 경우에 비해, 피펫(P)의 입구를 액체(W1)의 메니스커스 가장자리에 위치시킨 상태에서도 많은 양의 액체(W1)를 교체할 수 있다. 또한, 액체(W1)의 교체 과정에서 세포(C) 또는 스페로이드(S)의 일부가 피펫(P)으로 흡입되는 것을 방지할 수 있다.
다른 실시예로, 웰(200')은 스토퍼(240)와 메니스커스 영역(250)을 모두 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 메니스커스 영역(250)은 배양홈(220)의 상단부, 즉 배양홈(220)과 스토퍼(240)의 경계에 위치할 수 있다. 또한 스토퍼(240)의 일단은 가이드벽(210)의 일단과 연결되고, 스토퍼(240)의 타단은 메니스커스 영역(250)의 일단과 연결될 수 있다.
이와 같은 구성을 통해, 사용자의 숙련도 또는 실험 횟수와 관계 없이 피펫(P)의 위치를 특정할 수 있어, 액체(W1)가 교체되는 양을 균일하게 할 수 있다. 또한, 액체(W1)의 교체 과정에서 스페로이드(S)가 영향 받는 것을 보다 확실하게 방지할 수 있다.
도 9는 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포 배양 장치(10')를 나타내는 도면이고, 도 10은 도 9의 Ⅹ-Ⅹ'를 따라 취한 단면도이다.
도 9를 참조하면, 세포 배양 장치(10')는 플레이트(100)와, 웰(200)과, 저장조(300)와, 유동 채널(400)을 포함할 수 있다.
저장조(300)는 플레이트(100)의 상면에 배치되며, 웰(200)과 인접하도록 배치될 수 있다. 일 실시예로, 도 9에 나타낸 바와 같이, 저장조(300)는 1열에 위치한 웰(200)의 좌측과, 12열에 위치한 웰(200)의 우측에 각각 열의 개수와 동일한 개수로 배치될 수 있다.
다른 실시예로, 저장조(300)는 A행에 위치한 웰(200)의 상측과, H행에 위치한 웰(200)의 하측에 각각 행의 개수와 동일한 개수로 배치될 수 있다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 저장조(300)에는 액체(W2)가 저장될 수 있다. 액체(W2)는 액체(W1)와 동일 또는 상이한 액체일 수 있다. 일 실시예로 웰(200)의 내부에서 배양되는 세포(C) 또는 스페로이드(S)에 특정한 화학 자극을 가하기 위한 약물일 수 있다.
유동 채널(400)은 플레이트(100)의 내측 하부에 배치되어, 웰(200)과 저장조(300)를 연결할 수 있다. 일 실시예로, 유동 채널은 행 방향 또는 열 방향 중 적어도 어느 한 방향으로 저장조(300)와 복수 개의 웰(200)을 연결하도록 배치될 수 있다.
보다 구체적으로 유동 채널(400)은 각각의 행에 배치된 웰(200)과 저장조(300)를 연결하도록 X축 방향으로 연장하여 배치될 수 있다. 이에 따라, 저장조(300)에 저장된 액체(W2)가 각각의 웰(200)로 전달될 수 있다.
도 9 및 도 10에는 유동 채널(400)이 각각의 행에 배치된 웰(200)과 저장조(300)를 연결하는 것으로 나타냈으나, 이에 한정하지 않는다. 예를 들어, 유동 채널(400)은 각각의 열에 배치된 웰(200)과 저장조(300)를 연결하도록 Y축 방향으로 연장하여 배치될 수 있다. 또는, 유동 채널(400)은 각각의 웰(200)과 저장조(300)를 격자 형태로 연결하도록 X축 방향 및 Y축 방향으로 각각 연장하여 배치될 수 있다.
일 실시예로, 세포 배양 장치(10')는 소정의 회전축을 따라 회전하여 액체(W2)의 유동을 형성할 수 있다. 보다 구체적으로, 저장조(300)에 저장된 액체(W2)는 세포 배양 장치(10')가 Z축과 평행한 회전축 AX1을 중심으로 회전함에 따라, 각각의 웰(200)로 유입될 수 있다. 이러한 액체(W2)의 유동은 세포 배양 장치(10')를 틸팅시킴으로써 간단하게 형성할 수 있으며, 이에 따라 스페로이드(S)의 배양과, 액체(W2)와 각각의 웰(200)에서 배양되는 스페로이드(S)의 반응을 하나의 세포 배양 장치(10')에서 용이하게 실험 및 관찰할 수 있다.
또한 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치(10')는 각각의 웰(200)에 서로 다른 스페로이드(S)를 배양하여, 유동 채널(400)을 통해 스페로이드(S)가 서로 연결되어 형성되는 다중 세포 네트워크를 구현할 수 있다. 특히, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치(10')는 각각의 웰(200)에서 배양되는 스페로이드(S)의 형상, 크기 및 위치를 균일하게 제어할 수 있어, 다중 세포 네트워크의 반복 재현이 용이하다.
도 9 및 도 10에는 세포 배양 장치(10')가 웰(200)을 포함하는 것으로 나타냈으나, 이에 한정하지 않는다. 세포 배양 장치(10')는 다양한 형태의 플레이트 및 웰을 포함할 수 있으며, 전술한 실시예의 웰(200')이 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치(10, 10')는 3차원 스페로이드(S)를 형성할 수 있으며, 세포(C)가 웰(200, 200')의 바닥면에 부착되는 것을 방지하여, 스페로이드(S)의 형상 및 크기를 균일하게 제어할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치(10, 10')는 배양액의 교체 등 세포 배양 과정에서 세포(C) 또는 스페로이드(S)가 손상되는 것을 방지할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치(10, 10')는 각각의 웰(200, 200')에서 배양되는 서로 다른 스페로이드(S)에 유동 채널(400)을 이용해 약물을 흘려주어, 다중 세포 네트워크를 구현할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치(10, 10')는 세포외 기질(extracellular matrix)를 사용하지 않고도, 하이드로겔(hydrogel) 또는 화학적 전처리 없이 스캐폴드 프리 타입(scaffold free type)의 3차원 스페로이드를 형성할 수 있다.
본 명세서에서는 본 발명을 한정된 실시예를 중심으로 설명하였으나, 본 발명의 범위 내에서 다양한 실시예가 가능하다. 또한 설명되지는 않았으나, 균등한 수단도 또한 본 발명에 그대로 결합되는 것이라 할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호범위는 아래의 청구범위에 의하여 정해져야 할 것이다.
본 발명을 활용하여 세포외 기질(extracelluar matrix)의 사용 없이 스캐폴드 프리 타입(scaffold free type)의 3D 세포배양모델 형성이 가능하고, 배양용 배지에도 젤 성분을 포함하지 않고 배양 가능하며, 배지 교환 등의 실험이 가능하므로 스페로이드 형성 및 실험이 쉽다. 또한, 각 웰 당 하나의 스페로이드를 형성하여 독립적인 배양 및 실험을 할 수 있다. 그리고, 중력에 의해 U 모양 바닥의 중심부에 주로 스페로이드가 형성되고, 균일한 크기의 3D 세포배양모델을 반복적으로 재현할 수 있게 하므로 광학 관찰 시 자동화시스템 등을 활용한 고속 분석이 가능하고 분석에도 용이하다. 또한 멀티 플레이트 형식으로 약물 반응 시험이 편리하여 High Throughput Screening (HTS)에 적합하므로 3D 세포배양모델 구현 및 연구개발, 약물 스크리닝 등의 다양한 관련 분야에 활용이 가능할 것으로 기대된다.

Claims (10)

  1. 세포를 배양하여 3차원 스페로이드(spheroid)로 형성하는 세포 배양 장치로서,
    플레이트; 및
    상기 플레이트의 일면에 기 설정된 간격으로 복수 개 배치되고, 내부에 세포가 배양되며, 내측면에 미세 패턴이 배치되어 상기 내측면과 상기 세포가 이격되는 웰;을 포함하는 세포 배양 장치.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 웰은
    원통형의 가이드벽; 및
    상기 가이드벽의 단부에서 연장되며, 상기 세포가 중심부에서 응집되도록 아래로 볼록한 형상의 배양홈;을 구비하고,
    상기 미세 패턴은
    상기 배양홈의 내측면에 복수 개의 돌기와 홈이 반복하여 배치되는, 세포 배양 장치.
  3. 제2 항에 있어서,
    상기 돌기는
    상기 배양홈의 내측면에서 상기 배양홈의 중심부를 향해 돌출되며, 상기 세포와 접촉하는 접촉면을 구비하고,
    상기 접촉면의 전체 면적은 상기 배양홈의 내측면의 전체 면적의 절반 이하인, 세포 배양 장치.
  4. 제3 항에 있어서,
    상기 돌기는
    상기 배양홈의 중심부를 향해 좁아지는 형상을 갖는, 세포 배양 장치.
  5. 제2 항에 있어서,
    상기 미세 패턴은
    상기 배양홈의 내측면 상에 배치되는 지지체를 더 포함하고,
    상기 돌기는
    상기 지지체에서 연장되어, 상기 배양홈의 중심부를 향해 돌출되는, 세포 배양 장치.
  6. 제2 항에 있어서,
    상기 웰은
    상기 가이드벽의 단부와 상기 배양홈의 단부 사이에 배치되며, 상기 웰의 내측을 향해 기 설정된 각도로 경사진 스토퍼를 더 포함하는, 세포 배양 장치.
  7. 제2 항에 있어서
    상기 웰은
    상기 배양홈의 상단부에 배치되며, 상기 미세 패턴이 형성되지 않는 메니스커스 영역을 더 포함하는, 세포 배양 장치.
  8. 제1 항에 있어서,
    상기 미세 패턴은
    상기 웰과 일체로 형성되는, 세포 배양 장치.
  9. 제1 항에 있어서,
    상기 웰은
    상기 플레이트의 상면에 복수 개의 행 및 열로 나란히 배치되고,
    상기 세포 배양 장치는
    상기 플레이트의 상면에 배치되며, 액체가 저장되는 저장조; 및
    행 방향 또는 열 방향 중 적어도 어느 한 방향으로 상기 저장조와 상기 복수 개의 웰을 연결하여, 상기 액체를 상기 복수 개의 웰로 공급하는 유동 채널;을 포함하는, 세포 배양 장치.
  10. 제9 항에 있어서,
    상기 세포 배양 장치는
    소정의 회전축을 따라 회전하여 상기 액체의 유동을 형성하는, 세포 배양 장치.
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