WO2021215356A1 - 魚類における他家卵子および異種配偶子の製造方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for producing an allogeneic egg and a heterologous gamete in a fish, specifically, a method for producing an allogeneic egg and a heterologous gamete by transplantation into an immunodeficient adult fish.
- the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2020-074968 filed in Japan on April 20, 2020, the contents of which are incorporated herein by reference.
- the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a method for efficiently engrafting and growing an ovarian tissue of a transplanted individual of the same species or a reproductive tissue of a heterogeneous fish to produce an allogeneic egg or a heterologous gamete. do.
- the present invention includes the following aspects.
- a method for producing reproductive tissue which comprises a step of transplantation.
- a method for producing a reproductive tissue comprising a step of transplanting an allogeneic fish reproductive tissue for an immunodeficient fish into an ovary of an immunodeficient fish and a step of removing a corresponding host germ cell in the immunodeficient fish.
- the present invention it is possible to efficiently engraft and grow the reproductive tissues of transplanted individuals of the same type or fish of different species to produce gametes of individuals of the same type or fish of different species.
- Oocytes of the 254A :: ttr line (a line obtained by crossing a 254A line expressing GAL4 in the early oocyte and a line expressing nitroreductase (ntr) in the UAS promoter) by changing the concentration of Meterodinazole in Experimental Example 2). This is the result of examining the removal efficiency of.
- A An image of GAL4 expressed in the 254A strain confirmed by the expression of EGFP.
- 254A :: ovary image after treating the trr strain with 10 mM, 5 mM, 2.5 mM Meterodinazole for 3 days and repeating normal breeding for 4 days twice.
- the upper row is an image of the zebrafish opened and the ovaries confirmed, and the lower row is the image of the removed ovaries. It was found that mature oocytes were removed in a concentration-dependent manner. It is a figure which shows that the immunodeficiency 254A :: ntr strain obtained the transplanted zebrafish ovary-derived reproductive stem cell or oogonia, and the fertilized embryo (indicated by the arrow) derived from the early oocyte by the Meterodinazole treatment in Example 2. ..
- the honmoroko ovary tissue and zebrafish vas were isolated into cell units and then mixed to prepare an aggregate, which was then transplanted subcutaneously into immunodeficient zebrafish to obtain honmoroko sperm. It is a figure which shows that.
- A Image of aggregate 2 months after transplantation.
- B The section image. GFP-negative honmoroko spermatogonia, spermatocytes, and sperms are observed.
- the zebrafish meioc mutant testis tissue in which the honmoroko testis tissue and the spermatogonial stem cells in Example 5 are not differentiated are isolated into cell units and then mixed to prepare an aggregate, which is then transplanted subcutaneously to the immunodeficient zebrafish. It is a figure which shows that the differentiation into the sperm and the testis cell of Honmoroko was confirmed.
- A Section image of the aggregate 2 months after transplantation.
- B The enlarged view shows honmoroko spermatogonia, spermatocytes, and sperms.
- C The enlarged view shows the honmoroko oocyte.
- the method for producing a reproductive tissue of the present embodiment is a step 1 in which an allogeneic reproductive tissue for an immunodeficient fish and a heterologous fish reproductive tissue are isolated into cell units and then mixed to obtain an aggregate, and the aggregate is obtained as described above. It has step 2 of transplanting immunodeficient fish subcutaneously or intraovally.
- the method for producing germ tissue and heterologous gametes of the present embodiment further preferably includes step 3 of removing the corresponding host germ cells in the immunodeficient fish.
- Step 1 After isolating allogeneic reproductive tissues and heterologous reproductive tissues for immunodeficient fish into cell units, preferably in a ratio of 10: 1, more preferably in a ratio of 5: 1, heterogeneous. This is a process of obtaining an aggregate by mixing the allogeneic reproductive tissues in an excess ratio with respect to the fish reproductive tissues.
- heterologous fish germ cells are wrapped in cells of the allogeneic germ tissue.
- Immunodeficient fish (rag1 variants) reject estranged heterologous fish tissues, which can prevent contact between host immune cells and heterologous fish germ cells and avoid immune rejection of heterologous fish germ cells. NS.
- the immunodeficient fish is not particularly limited as long as it does not cause immunorejection when an individual tissue of the same type is transplanted, and the immune system is destroyed by immunosuppressive agent-treated fish and ⁇ -ray irradiation.
- Examples include fish, genetically modified fish in which the function of genes involved in the immune system is suppressed or lost.
- examples of the genetically modified fish include fish in which the function of the rag1 gene or its homolog, or the function of the Rag1 protein or its homolog is suppressed or lost.
- the function of the Rag1 protein is suppressed means that the function originally possessed by the Rag1 protein is partially lost.
- the loss of the function of the Rag1 protein means a state in which the original function of the Rag1 protein is completely lost.
- Suppression or loss of Rag1 protein function can also occur due to suppression or loss of rag1 gene expression.
- Suppressing the expression of the rag1 gene means that the amount of the rag1 gene product is suppressed in immunodeficient fish as compared with the control wild-type fish.
- Suppression of the expression of the rag1 gene can be caused by introducing a nucleic acid sequence that causes expression of RNAi-inducible nucleic acid, antisense nucleic acid, aptamer, ribozyme, etc. to the rag1 gene into fish and knocking down the gene.
- Loss of expression of the rag1 gene means loss of the rag1 gene product in fish.
- Loss of function of the Rag1 protein which is a gene product, can be caused by, for example, introducing a mutation into the rag1 gene and disrupting the rag1 gene. Mutations can be caused by deletion, substitution, insertion of arbitrary sequences, etc. of the rag1 gene or a part or all of the expression regulatory region of the gene. These mutations can be introduced by using methods such as treatment with a mutagenic substance, ultraviolet irradiation, gene targeting by a homologous recombination technique, gene knockout, and conditional knockout. In addition, genome editing technology may be used for gene targeting and gene knockout.
- rag1 mutants have been isolated and it has been reported that mature T cells and B cells are not formed (BMC Immunol. 2009 Feb 3; 10: 8. doi: 10.1186 / 1471-2172. -10-8. Debug of rag1 mutant zebrafish leukocytes. Petrie-Hanson L1, Hohn C, Hanson L.).
- the target fish for immunodeficiency is not particularly limited, and is selected from the viewpoints of easy genetic manipulation, a closely related species of fish that retains the reproductive tissue to be transplanted, and the like. Examples include zebrafish, killifish, goldfish, rainbow trout, grass puffer, mackerel, anchovy and the like.
- the allogeneic reproductive tissue used in step 1 may be a reproductive tissue of the same strain or a reproductive tissue of a different strain as long as it can wrap the germ cells of different fish and protect it from the host immune cells.
- Examples of the reproductive tissue in the allogeneic fish reproductive tissue include testis, testis epithelium, ovary, and ovarian epithelium.
- the heterologous fish reproductive tissue used in step 1 is a reproductive tissue derived from a fish belonging to a species different from the host immunodeficient fish, and is a source of gametes to be produced in the present embodiment. From the viewpoint of transplantation efficiency, it is preferable that the heterologous fish from which the heterologous fish reproductive tissue is derived and the host immunodeficient fish are closely related species. Examples of the reproductive tissue in the heterologous fish reproductive tissue include testis, testis epithelium, ovary, and ovarian epithelium.
- step 1 individual reproductive tissues of the same type and reproductive tissues of heterogeneous fish for immunodeficient fish are isolated into cell units and then mixed.
- Examples of the method for isolating the reproductive tissue into cell units include collagenase treatment and the like according to a conventional method.
- Examples of the cells obtained by isolation include undifferentiated germ cells such as spermatogonia and oogonia, differentiated germ cells such as spermatogonia and oocytes, and somatic cells derived from germ foci.
- undifferentiated germ cells obtained by isolating heterologous fish reproductive tissues and germ cell somatic cells obtained by isolating individual reproductive tissues of the same type are mixed.
- the transplanted undifferentiated germ cells derived from the heterologous fish germ cells undergo differentiation induction by the mixed somatic cells derived from the same species germ cells and the transplantation site.
- the undifferentiated germ cells obtained by isolating the heterologous fish germ cells are ovarian-derived germ stem cells
- the cells obtained by isolating the same type of individual germ cells are subcutaneously transplanted with testicular somatic cells. If so, germ cells derived from the ovary are induced to differentiate into sperm after transplantation.
- step 1 after mixing the cells, the cells are brought into contact with each other by centrifugation or the like, and the cells are adhered to each other by culturing the cells to obtain an aggregate.
- Step 2 is a step of transplanting the aggregate subcutaneously or into the ovary of an immunodeficient fish.
- Adult fish can be used as a graft host in immunodeficient fish.
- a zebrafish having a body length of 3 cm or more or 60 days or later after birth.
- a method of subcutaneous transplantation for example, a method of cutting the epidermis on the side of the anesthetized host with a scalpel, inserting tweezers from the cut end between the epidermis and the muscle to make a space, and transplanting the aggregate.
- a method of transplanting to the ovary for example, it is preferable to use a method having a body length of 3 cm or more and the abdomen swelling due to the growth of the ovary.
- a method of inserting an aggregate or ovarian tissue from the incision with tweezers can be mentioned.
- immunodeficient fish transplanted with aggregates are bred in a buffer solution containing antibiotics in a dark place for a certain period of time without feeding to repair wounds. After repairing the wound, it may be bred by the usual breeding method.
- Step 3 is a step of removing the corresponding host germ cells in the immunodeficient fish.
- the "corresponding host germ cell” means the host germ cell corresponding to the germ cell to be produced in the present embodiment.
- the reproductive tissue to be produced is the testis
- the host spermatogonia, spermatocytes, and spermatocytes are removed in step 3.
- the reproductive tissue to be produced is an ovary
- the host oogonia and oocytes are removed in step 3.
- the method for removing the host germ cell is not particularly limited, and examples thereof include a method for conditionally inducing cell death specifically in a specific cell of the host by genetic modification.
- the Meterodinazole is decomposed and exhibits toxicity.
- Examples include methods for removing germ cells.
- the same type of individual reproductive tissue for producing the aggregate which is a fish that expresses Germ cell-specific Nitroleductase, gametes of different fish reproductive tissues can be efficiently obtained from the aggregate. ..
- a method for removing the host germ cell a method of injecting deadend morpholino into a single cell embryo to prevent the host germ cell from being generated in advance, and a method of surgically removing the host germ cell can be mentioned.
- the corresponding host germ cells are preferably removed by 10% or more, more preferably 20% or more, further preferably 50% or more, and 100% removed. It is particularly preferable that it is. If the number of host germ cells corresponding to the transplanted cells is large, the transplanted cells may lose the growth competition and be eliminated. Therefore, by reducing the number of host germ cells in step 3, transplantation is performed. It can promote cell engraftment and growth and produce heterologous gametes.
- the method for producing a germ cell of the present embodiment includes a step 4 of transplanting a germ cell of the same species to an immunodeficient fish into the ovary of the immunodeficient fish, and a step 5 of removing the corresponding host germ cell in the immunodeficient fish.
- Step 4 is a step of transplanting an individual reproductive tissue of the same species for an immunodeficient fish into the ovary of an immunodeficient fish.
- the procedure is the same as in step 2 except that the transplant target is an individual reproductive tissue of the same species for immunodeficient fish.
- Step 5 is a step of removing the corresponding host germ cells in the immunodeficient fish. Step 5 is the same as in Step 3, and by reducing the number of host germ cells, the engraftment and growth of the allogeneic fish germ tissue to be transplanted can be promoted, and an egg derived from the transplanted cells can be produced.
- gametes are obtained from the reproductive tissue obtained by the above-mentioned method for producing reproductive tissue.
- examples of gametes include eggs and sperms.
- the immunodeficient fish of the present embodiment is a fish having a transplanted fish reproductive tissue.
- the fish reproductive tissue to be transplanted include a heterogeneous fish reproductive tissue and an individual reproductive tissue of the same type.
- the corresponding host germ cells are preferably removed by 10% or more, more preferably 20% or more, and 50% or more removed. It is more preferable that the cells are removed, and it is particularly preferable that the cells are 100% removed.
- the immunodeficient fish of the present embodiment preferably has 90% or less, more preferably 80% or less, and 50% of the corresponding host germ cells as compared with those before transplantation.
- the immunodeficient fish of the present embodiment suppresses or loses the function of the rag1 gene or its homolog, or the Rag1 protein or its homolog.
- the method for producing an immunodeficient fish of the present embodiment is not particularly limited, and examples thereof include the method of the first embodiment or the second embodiment of the above-mentioned ⁇ Method for producing reproductive tissue >>.
- FIG. 1 shows the experimental procedure. Tissue pieces containing oogonia and early oocytes were isolated from the ovary of individual sox17 :: egfp expressing GFP in early germ cells and transplanted into the ovary of a female of an immunodeficient rag1 mutant line. After 6 weeks, grown oocytes derived from sox17 :: egfp oogonia transplanted into the ovary were confirmed (Fig. 2). However, ovulation of oocytes derived from these cells was not confirmed. It is possible that the transplanted cells could not grow sufficiently due to competition with the endogenous host oocytes.
- a 254A line expressing GAL4 specifically in early oocytes was isolated (Fig. 3A).
- Meterodinazole is degraded by Nitroleductase and is toxic. That is, when Meterodinazole is added to the breeding aquarium, the degradation product is toxic due to the nitroreductase that is specifically expressed in the early oocytes, and the oocytes are removed.
- the efficiency of oocyte removal in the 254A line was examined by changing the concentration of the added Meterodinazole. As shown in FIG. 3B, the removal of oocytes was confirmed in a concentration-dependent manner.
- the above 254A :: ntr strain was crossed with the immunodeficient rag1 mutant strain to establish a host individual for transplantation. Similar to Experimental Example 1, a tissue fragment containing oogonia and early oocytes was isolated from the ovary of sox17 :: egfp and transplanted into the female ovary of the 254A :: ttr + rag1 variant. From 7 days later, after 3 days treatment of 10 mM Metrodinazole and 2 times of normal breeding for 4 days, they were mated with males and GFP-positive embryos were confirmed in 2 out of 147 animals (see FIG. 4).
- FIG. 5 shows the experimental procedure.
- the hypertrophied testis of vas :: egfp zebrafish was isolated to the cell unit using collagenase.
- testes were isolated from honmoroko and isolated into cell units using collagenase.
- These two types of testis-constituting cells were mixed at a ratio of 5: 1 (zebrafish: honmoroko), centrifuged, and then cultured to obtain an aggregate.
- This aggregate was subcutaneously transplanted into a male of the rag1 mutant.
- the transplanted host was bred in 0.4 ⁇ PBS containing 10 ⁇ g / mL gentamicin in the dark for 4 days without feeding.
- Testes were isolated from meioc mutant zebrafish in which germline stem cells did not differentiate, and were isolated to cell units using collagenase.
- testes were isolated from honmoroko and isolated into cell units using collagenase. These two types of cells were mixed at a ratio of 5: 1 (zebrafish: honmoroko), centrifuged, and then cultured to obtain an aggregate. This aggregate was subcutaneously transplanted into a male of the rag1 mutant (see FIG. 5).
- the transplanted host was bred in 0.4 ⁇ PBS containing 10 ⁇ g / mL gentamicin in the dark for 4 days without feeding. After that, it was bred in normal breeding water. Two months after transplantation, the transplanted mass was collected and histological observation was performed. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 8, it was confirmed that the sperm and oocytes of Honmoroko were differentiated.
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Abstract
免疫不全魚類に対する同種生殖組織、及び異種魚類生殖組織をそれぞれ細胞単位にまで単離した後混ぜ合わせて集合塊を得る工程と、前記集合塊を前記免疫不全魚類の皮下又は卵巣内に移植する工程と、を有する、生殖組織の製造方法。
Description
本発明は、魚類における他家卵子および異種配偶子の製造方法、具体的には、免疫不全成魚体内への移植による他家卵子および異種配偶子の製造法に関する。
本願は、２０２０年４月２０日に、日本に出願された特願２０２０－０７４９６８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０２０年４月２０日に、日本に出願された特願２０２０－０７４９６８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
天然漁業資源の減少を踏まえ、代理親魚を用いた生殖組織の製造技術が求められている。
しかし、代理親魚に同種の別個体又は異種の魚類由来の生殖組織を移植しても、免疫拒絶により代理親魚の生体内で、移植組織が生着・生育しにくいという問題があった。
しかし、代理親魚に同種の別個体又は異種の魚類由来の生殖組織を移植しても、免疫拒絶により代理親魚の生体内で、移植組織が生着・生育しにくいという問題があった。
このような問題に対し、発明者は、ｒａｇ１遺伝子が機能しない魚類の皮下に同種の他家組織を移植することで、移植組織が免疫拒絶されることなく生着し生育すること、移植精巣組織からは他家精子を製造できることを見出した（例えば、特許文献１参照。）。
特許文献１に開示された技術に加えて、移植した同種別個体の卵巣組織、更に、異種の魚類の生殖組織の生着・生育の効率化が求められている。
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、移植した同種別個体の卵巣組織又は異種の魚類の生殖組織を効率よく生着・生育させて他家卵子又は異種配偶子を製造する方法提供する。
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、移植した同種別個体の卵巣組織又は異種の魚類の生殖組織を効率よく生着・生育させて他家卵子又は異種配偶子を製造する方法提供する。
本発明は以下の態様を含む。
［１］免疫不全魚類に対する同種生殖組織、及び異種魚類生殖組織をそれぞれ細胞単位にまで単離した後混ぜ合わせて集合塊を得る工程と、前記集合塊を前記免疫不全魚類の皮下又は卵巣内に移植する工程と、を有する、生殖組織の製造方法。
［２］更に、前記免疫不全魚類内の対応する宿主生殖細胞を除去する工程を有する、［１］に記載の生殖組織の製造方法。
［３］免疫不全魚類に対する同種魚類生殖組織を免疫不全魚類の卵巣に移植する工程と、前記免疫不全魚類内の対応する宿主生殖細胞を除去する工程と、を有する、生殖組織の製造方法。
［４］前記免疫不全魚類は、ｒａｇ１遺伝子又はそのホモログ、又は、Ｒａｇ１タンパク質又はそのホモログの機能が抑制若しくは喪失している、［１］～［３］のいずれか一つに記載の生殖組織の製造方法。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載の生殖組織の製造方法により得られた生殖組織から配偶子を得る、配偶子の製造方法。
［１］免疫不全魚類に対する同種生殖組織、及び異種魚類生殖組織をそれぞれ細胞単位にまで単離した後混ぜ合わせて集合塊を得る工程と、前記集合塊を前記免疫不全魚類の皮下又は卵巣内に移植する工程と、を有する、生殖組織の製造方法。
［２］更に、前記免疫不全魚類内の対応する宿主生殖細胞を除去する工程を有する、［１］に記載の生殖組織の製造方法。
［３］免疫不全魚類に対する同種魚類生殖組織を免疫不全魚類の卵巣に移植する工程と、前記免疫不全魚類内の対応する宿主生殖細胞を除去する工程と、を有する、生殖組織の製造方法。
［４］前記免疫不全魚類は、ｒａｇ１遺伝子又はそのホモログ、又は、Ｒａｇ１タンパク質又はそのホモログの機能が抑制若しくは喪失している、［１］～［３］のいずれか一つに記載の生殖組織の製造方法。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載の生殖組織の製造方法により得られた生殖組織から配偶子を得る、配偶子の製造方法。
本発明によれば、移植した同種別個体又は異種の魚類の生殖組織を効率よく生着・生育させ、同種別個体又は異種魚類の配偶子を製造することができる。
＜＜生殖組織の製造方法＞＞
＜第１実施形態＞
本実施形態の生殖組織の製造方法は、免疫不全魚類に対する同種生殖組織、及び異種魚類生殖組織をそれぞれ細胞単位にまで単離した後混ぜ合わせて集合塊を得る工程１と、前記集合塊を前記免疫不全魚類の皮下又は卵巣内に移植する工程２と、を有する。
本実施形態の生殖組織、さらに異種配偶子の製造方法は、更に、前記免疫不全魚類内の対応する宿主生殖細胞を除去する工程３を有することが好ましい。
＜第１実施形態＞
本実施形態の生殖組織の製造方法は、免疫不全魚類に対する同種生殖組織、及び異種魚類生殖組織をそれぞれ細胞単位にまで単離した後混ぜ合わせて集合塊を得る工程１と、前記集合塊を前記免疫不全魚類の皮下又は卵巣内に移植する工程２と、を有する。
本実施形態の生殖組織、さらに異種配偶子の製造方法は、更に、前記免疫不全魚類内の対応する宿主生殖細胞を除去する工程３を有することが好ましい。
［工程１］
工程１は、免疫不全魚類に対する同種生殖組織、及び異種魚類生殖組織をそれぞれ細胞単位にまで単離した後、好ましくは、１０：１の割合で、より好ましくは、５：１の割合で、異種魚類生殖組織に対して同種生殖組織が過剰となる比率で混ぜ合わせて集合塊を得る工程である。この工程において異種魚類生殖細胞が同種生殖組織の細胞に包まれる。免疫不全魚（rag1変異体）は系統が離れた異種魚類組織を拒絶するが、これにより、宿主免疫細胞と異種魚類生殖細胞の接触を防ぐことができ、異種魚類生殖細胞に対する免疫拒絶が回避される。
工程１は、免疫不全魚類に対する同種生殖組織、及び異種魚類生殖組織をそれぞれ細胞単位にまで単離した後、好ましくは、１０：１の割合で、より好ましくは、５：１の割合で、異種魚類生殖組織に対して同種生殖組織が過剰となる比率で混ぜ合わせて集合塊を得る工程である。この工程において異種魚類生殖細胞が同種生殖組織の細胞に包まれる。免疫不全魚（rag1変異体）は系統が離れた異種魚類組織を拒絶するが、これにより、宿主免疫細胞と異種魚類生殖細胞の接触を防ぐことができ、異種魚類生殖細胞に対する免疫拒絶が回避される。
免疫不全魚類としては、同種別個体組織を移植した際に、免疫拒絶反応を起こさないものであれば特に限定されず、免疫抑制剤処理を施された魚類、γ線照射により免疫系を破壊された魚類、免疫系に関与する遺伝子の機能を抑制又は喪失させた遺伝子改変魚類等が挙げられる。遺伝子改変魚類としては、例えば、ｒａｇ１遺伝子又はそのホモログ、又は、Ｒａｇ１タンパク質又はそのホモログの機能が抑制若しくは喪失している魚類が挙げられる。
Ｒａｇ１タンパク質の機能が抑制されているとは、Ｒａｇ１タンパク質が本来有する機能が部分的に失われている状態のことをいう。Ｒａｇ１タンパク質の機能が喪失しているとは、Ｒａｇ１タンパク質が本来有する機能が完全に失われている状態のことをいう。
Ｒａｇ１タンパク質の機能の抑制又は喪失は、ｒａｇ１遺伝子の発現が抑制されることによって、又は喪失することによっても生じ得る。
ｒａｇ１遺伝子の発現が抑制しているとは、免疫不全魚類において、コントロールとなる野生型の魚類と比較して、ｒａｇ１遺伝子産物の量が抑制されていることをいう。
ｒａｇ１遺伝子の発現の抑制は、ｒａｇ１遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイムなどの発現を生じさせる核酸配列を、魚類に導入し、遺伝子ノックダウン等により生じさせることができる。
ｒａｇ１遺伝子の発現の抑制は、ｒａｇ１遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイムなどの発現を生じさせる核酸配列を、魚類に導入し、遺伝子ノックダウン等により生じさせることができる。
ｒａｇ１遺伝子の発現が喪失しているとは、魚類において、ｒａｇ１遺伝子産物が喪失していることをいう。
遺伝子産物である、Ｒａｇ１タンパク質の機能の喪失は、例えばｒａｇ１遺伝子に変異を導入し、ｒａｇ１遺伝子を破壊することにより生じさせることができる。
変異は、ｒａｇ１遺伝子、又は遺伝子の発現調節領域における一部又は全部の欠失、置換、任意の配列の挿入等により生じさせることができる。これらの変異の導入は、例えば、変異原性物質による処理、紫外線照射、相同組み換え技術等による遺伝子ターゲッティング、遺伝子ノックアウト、条件的ノックアウト等の手法を用いて行うことができる。また、遺伝子ターゲティング、遺伝子ノックアウトについては、ゲノム編集技術を用いてもよい。
遺伝子産物である、Ｒａｇ１タンパク質の機能の喪失は、例えばｒａｇ１遺伝子に変異を導入し、ｒａｇ１遺伝子を破壊することにより生じさせることができる。
変異は、ｒａｇ１遺伝子、又は遺伝子の発現調節領域における一部又は全部の欠失、置換、任意の配列の挿入等により生じさせることができる。これらの変異の導入は、例えば、変異原性物質による処理、紫外線照射、相同組み換え技術等による遺伝子ターゲッティング、遺伝子ノックアウト、条件的ノックアウト等の手法を用いて行うことができる。また、遺伝子ターゲティング、遺伝子ノックアウトについては、ゲノム編集技術を用いてもよい。
ゼブラフィッシュにおいては、ｒａｇ１突然変異体が単離されており、成熟Ｔ細胞やＢ細胞が形成されないことが報告されている（BMC Immunol. 2009 Feb 3;10:8. doi: 10.1186/1471-2172-10-8. Characterization of rag1 mutant zebrafish leukocytes. Petrie-Hanson L1, Hohn C, Hanson L.）。
免疫不全にする対象の魚類としては、特に限定されず、遺伝子操作が容易である、移植対象の生殖組織を保持する魚類の近縁種である等の観点から選択される。一例として、ゼブラフィッシュ、メダカ、金魚、ニジマス、クサフグ、サバ、カタクチイワシ等が挙げられる。
工程１において用いられる同種生殖組織としては、異種魚類生殖細胞を包みこみ、宿主免疫細胞から守ることができれば、同系統の生殖組織でもよく異系統の生殖組織でもよい。
同種魚類生殖組織における生殖組織としては、精巣、精巣上皮、卵巣、卵巣上皮等が挙げられる。
同種魚類生殖組織における生殖組織としては、精巣、精巣上皮、卵巣、卵巣上皮等が挙げられる。
工程１において用いられる異種魚類生殖組織は、宿主となる免疫不全魚類とは異なる種に属する魚類由来の生殖組織であり、本実施形態において製造対象の配偶子の素となるものである。移植効率の観点から、係る異種魚類生殖組織の由来する異種魚類と宿主の免疫不全魚類とは近縁種の関係にあることが好ましい。
異種魚類生殖組織における生殖組織としては、精巣、精巣上皮、卵巣、卵巣上皮等が挙げられる。
異種魚類生殖組織における生殖組織としては、精巣、精巣上皮、卵巣、卵巣上皮等が挙げられる。
工程１において、免疫不全魚類に対する同種別個体生殖組織、及び異種魚類生殖組織をそれぞれ細胞単位にまで単離した後混ぜ合わせる。
生殖組織を細胞単位にまで単離する方法としては、定法に従い、例えば、コラゲナーゼ処理等が挙げられる。単離して得られた細胞としては、精原細胞、卵原細胞等の未分化の生殖細胞、精母細胞、卵母細胞等の分化した生殖細胞や生殖巣由来の体細胞が挙げられる。
実施例にて後述するように、異種魚類生殖組織を単離して得られた未分化生殖細胞と、同種別個体生殖組織を単離して得られた生殖巣体細胞とを混ぜ合わせた場合には、移植された異種魚類生殖組織由来の未分化生殖細胞は、混ぜ合わされた同種別個体生殖組織由来の体細胞や移植場所によって分化誘導を受ける。例えば、異種魚類生殖組織を単離して得られた未分化生殖細胞が、卵巣由来の生殖幹細胞であっても、同種別個体生殖組織を単離して得られた細胞が精巣体細胞で皮下に移植した場合には、卵巣由来の生殖幹細胞は、移植後に精子に分化誘導される。
工程１において、細胞を混ぜ合わせた後、遠心分離等によって細胞を接触させ、これを培養することによって細胞同士を接着させて集合塊を得る。
生殖組織を細胞単位にまで単離する方法としては、定法に従い、例えば、コラゲナーゼ処理等が挙げられる。単離して得られた細胞としては、精原細胞、卵原細胞等の未分化の生殖細胞、精母細胞、卵母細胞等の分化した生殖細胞や生殖巣由来の体細胞が挙げられる。
実施例にて後述するように、異種魚類生殖組織を単離して得られた未分化生殖細胞と、同種別個体生殖組織を単離して得られた生殖巣体細胞とを混ぜ合わせた場合には、移植された異種魚類生殖組織由来の未分化生殖細胞は、混ぜ合わされた同種別個体生殖組織由来の体細胞や移植場所によって分化誘導を受ける。例えば、異種魚類生殖組織を単離して得られた未分化生殖細胞が、卵巣由来の生殖幹細胞であっても、同種別個体生殖組織を単離して得られた細胞が精巣体細胞で皮下に移植した場合には、卵巣由来の生殖幹細胞は、移植後に精子に分化誘導される。
工程１において、細胞を混ぜ合わせた後、遠心分離等によって細胞を接触させ、これを培養することによって細胞同士を接着させて集合塊を得る。
［工程２］
工程２は、集合塊を免疫不全魚類の皮下又は卵巣内に移植する工程である。免疫不全魚類では移植宿主として成魚を用いることができる。例えば、ゼブラフィッシュの場合、体長３ｃｍ以上、又は生後６０日以降のものを用いることが好ましい。皮下への移植方法としては、例えば、麻酔した宿主の側部の表皮をメスで切り、その切り口から表皮と筋肉の間にピンセットを差し込んでスペースを作り、集合塊を移植する方法が挙げられる。卵巣への移植方法としては、例えば、体長３ｃｍ以上で卵巣の成長によって腹部が膨らんだものを用いることが好ましく、麻酔した宿主の腹部を切開して卵巣を露出させ、卵巣の表面に切り込みを入れ、その切り口から集合塊や卵巣組織をピンセットで挿入する方法が挙げられる。
工程２は、集合塊を免疫不全魚類の皮下又は卵巣内に移植する工程である。免疫不全魚類では移植宿主として成魚を用いることができる。例えば、ゼブラフィッシュの場合、体長３ｃｍ以上、又は生後６０日以降のものを用いることが好ましい。皮下への移植方法としては、例えば、麻酔した宿主の側部の表皮をメスで切り、その切り口から表皮と筋肉の間にピンセットを差し込んでスペースを作り、集合塊を移植する方法が挙げられる。卵巣への移植方法としては、例えば、体長３ｃｍ以上で卵巣の成長によって腹部が膨らんだものを用いることが好ましく、麻酔した宿主の腹部を切開して卵巣を露出させ、卵巣の表面に切り込みを入れ、その切り口から集合塊や卵巣組織をピンセットで挿入する方法が挙げられる。
集合塊を移植された免疫不全魚類は、抗生物質を含む緩衝液中で、暗所で餌を与えずに一定期間飼育して傷口を修復させることが好ましい。傷口修復後は、通常の飼育方法で飼育すればよい。
［工程３］
工程３は、前記免疫不全魚類内の対応する宿主生殖細胞を除去する工程である。「対応する宿主生殖細胞」とは、本実施形態において製造対象の生殖組織に対応する宿主生殖細胞を意味する。例えば、製造対象の生殖組織が精巣である場合には、工程３において宿主精原細胞、精母細胞、精細胞を除去する。製造対象の生殖組織が卵巣である場合には、工程３において宿主卵原細胞、卵母細胞を除去する。
宿主生殖細胞を除去する方法としては、特に限定されず、例えば、遺伝子改変により、宿主の特定細胞特異的にコンディショナルに細胞死を誘導させる方法が挙げられる。詳細には、例えば、実施例で後述するように、生殖細胞特異的にＮｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅを発現する魚類を構築し、Ｍｅｔｒｏｄｉｎａｚｏｌｅを含む水槽中で個体を飼育することにより、Ｍｅｔｒｏｄｉｎａｚｏｌｅが分解されて毒性を示し、生殖細胞を除去する方法が挙げられる。さらに、集合塊を作製する際の同種別個体生殖組織を、生殖細胞特異的にＮｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅを発現する魚類のものを用いることで、集合塊から効率よく異種魚類生殖組織の配偶子を得ることができる。
また、宿主生殖細胞を除去する方法としてはdeadendモルフォリノを１細胞胚にインジェクションしてあらかじめ宿主生殖細胞を発生させない方法、及び外科的に宿主生殖巣を取り除く方法も挙げられる。
本実施形態において、対応する宿主生殖細胞は、１０％以上除去されていることが好ましく、２０％以上除去されていることがより好ましく、５０％以上除去されていることが更に好ましく、１００％除去されていることが特に好ましい。
移植した細胞に対して、対応する宿主生殖細胞の数が多いと、移植細胞が増殖競争に負け、淘汰されてしまうおそれがあるため、工程３により、宿主生殖細胞の数を減らすことにより、移植細胞の生着・生育を促進させ、異種配偶子を製造することができる。
工程３は、前記免疫不全魚類内の対応する宿主生殖細胞を除去する工程である。「対応する宿主生殖細胞」とは、本実施形態において製造対象の生殖組織に対応する宿主生殖細胞を意味する。例えば、製造対象の生殖組織が精巣である場合には、工程３において宿主精原細胞、精母細胞、精細胞を除去する。製造対象の生殖組織が卵巣である場合には、工程３において宿主卵原細胞、卵母細胞を除去する。
宿主生殖細胞を除去する方法としては、特に限定されず、例えば、遺伝子改変により、宿主の特定細胞特異的にコンディショナルに細胞死を誘導させる方法が挙げられる。詳細には、例えば、実施例で後述するように、生殖細胞特異的にＮｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅを発現する魚類を構築し、Ｍｅｔｒｏｄｉｎａｚｏｌｅを含む水槽中で個体を飼育することにより、Ｍｅｔｒｏｄｉｎａｚｏｌｅが分解されて毒性を示し、生殖細胞を除去する方法が挙げられる。さらに、集合塊を作製する際の同種別個体生殖組織を、生殖細胞特異的にＮｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅを発現する魚類のものを用いることで、集合塊から効率よく異種魚類生殖組織の配偶子を得ることができる。
また、宿主生殖細胞を除去する方法としてはdeadendモルフォリノを１細胞胚にインジェクションしてあらかじめ宿主生殖細胞を発生させない方法、及び外科的に宿主生殖巣を取り除く方法も挙げられる。
本実施形態において、対応する宿主生殖細胞は、１０％以上除去されていることが好ましく、２０％以上除去されていることがより好ましく、５０％以上除去されていることが更に好ましく、１００％除去されていることが特に好ましい。
移植した細胞に対して、対応する宿主生殖細胞の数が多いと、移植細胞が増殖競争に負け、淘汰されてしまうおそれがあるため、工程３により、宿主生殖細胞の数を減らすことにより、移植細胞の生着・生育を促進させ、異種配偶子を製造することができる。
＜第２実施形態＞
本実施形態の生殖組織の製造方法は、免疫不全魚類に対する同種魚類生殖組織を免疫不全魚類の卵巣に移植する工程４と、前記免疫不全魚類内の対応する宿主生殖細胞を除去する工程５と、を有する。
本実施形態の生殖組織の製造方法は、免疫不全魚類に対する同種魚類生殖組織を免疫不全魚類の卵巣に移植する工程４と、前記免疫不全魚類内の対応する宿主生殖細胞を除去する工程５と、を有する。
［工程４］
工程４は、免疫不全魚類に対する同種別個体生殖組織を免疫不全魚類の卵巣に移植する工程である。移植対象が、免疫不全魚類に対する同種別個体生殖組織である以外は、工程２と同様である。
工程４は、免疫不全魚類に対する同種別個体生殖組織を免疫不全魚類の卵巣に移植する工程である。移植対象が、免疫不全魚類に対する同種別個体生殖組織である以外は、工程２と同様である。
［工程５］
工程５は、前記免疫不全魚類内の対応する宿主生殖細胞を除去する工程である。工程５は、工程３と同様であり、宿主生殖細胞の数を減らすことにより、移植対象の同種魚類生殖組織の生着・生育を促進させ、移植細胞由来の卵子を製造することができる。
工程５は、前記免疫不全魚類内の対応する宿主生殖細胞を除去する工程である。工程５は、工程３と同様であり、宿主生殖細胞の数を減らすことにより、移植対象の同種魚類生殖組織の生着・生育を促進させ、移植細胞由来の卵子を製造することができる。
＜＜配偶子の製造方法＞＞
本実施形態において、上述した生殖組織の製造方法により得られた生殖組織から配偶子を得る。配偶子としては、卵子、精子が挙げられる。
本実施形態において、上述した生殖組織の製造方法により得られた生殖組織から配偶子を得る。配偶子としては、卵子、精子が挙げられる。
＜＜免疫不全魚類＞＞
本実施形態の免疫不全魚類は、移植された魚類生殖組織を有する魚類である。移植対象の魚類生殖組織としては、異種魚類生殖組織、同種別個体生殖組織が挙げられる。
移植対象の生殖細胞の生着・生育を促進させる観点から、対応する宿主生殖細胞は、１０％以上除去されていることが好ましく、２０％以上除去されていることがより好ましく、５０％以上除去されていることが更に好ましく、１００％除去されていることが特に好ましい。言い換えると、本実施形態の免疫不全魚類は、移植前と比較して、対応する宿主生殖細胞を９０％以下有していることが好ましく、８０％以下有していることがより好ましく、５０％以下有していることが更に好ましく、全く有していないことが特に好ましい。
また、本実施形態の免疫不全魚類は、ｒａｇ１遺伝子又はそのホモログ、又は、Ｒａｇ１タンパク質又はそのホモログの機能が抑制若しくは喪失していることが好ましい。
本実施形態の免疫不全魚類の製造方法としては、特に限定されないが、例えば、上述した＜＜生殖組織の製造方法＞＞の第１実施形態又は第２実施形態の方法が挙げられる。
本実施形態の免疫不全魚類は、移植された魚類生殖組織を有する魚類である。移植対象の魚類生殖組織としては、異種魚類生殖組織、同種別個体生殖組織が挙げられる。
移植対象の生殖細胞の生着・生育を促進させる観点から、対応する宿主生殖細胞は、１０％以上除去されていることが好ましく、２０％以上除去されていることがより好ましく、５０％以上除去されていることが更に好ましく、１００％除去されていることが特に好ましい。言い換えると、本実施形態の免疫不全魚類は、移植前と比較して、対応する宿主生殖細胞を９０％以下有していることが好ましく、８０％以下有していることがより好ましく、５０％以下有していることが更に好ましく、全く有していないことが特に好ましい。
また、本実施形態の免疫不全魚類は、ｒａｇ１遺伝子又はそのホモログ、又は、Ｒａｇ１タンパク質又はそのホモログの機能が抑制若しくは喪失していることが好ましい。
本実施形態の免疫不全魚類の製造方法としては、特に限定されないが、例えば、上述した＜＜生殖組織の製造方法＞＞の第１実施形態又は第２実施形態の方法が挙げられる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
図１に実験手順を示す。初期の生殖細胞でＧＦＰを発現する個体ｓｏｘ１７：：ｅｇｆｐの卵巣から卵原細胞や初期卵母細胞を含む組織片を単離し、免疫不全rag1変異系統の雌の卵巣内に移植した。６週間後、卵巣内に移植したｓｏｘ１７：：ｅｇｆｐ卵原細胞に由来する成長した卵母細胞を確認した（図２）。しかしながら、この細胞に由来する卵母細胞の排卵は確認されなかった。内在する宿主卵母細胞との競合により、移植した細胞が十分に成長できなかった可能性が考えられる。
図１に実験手順を示す。初期の生殖細胞でＧＦＰを発現する個体ｓｏｘ１７：：ｅｇｆｐの卵巣から卵原細胞や初期卵母細胞を含む組織片を単離し、免疫不全rag1変異系統の雌の卵巣内に移植した。６週間後、卵巣内に移植したｓｏｘ１７：：ｅｇｆｐ卵原細胞に由来する成長した卵母細胞を確認した（図２）。しかしながら、この細胞に由来する卵母細胞の排卵は確認されなかった。内在する宿主卵母細胞との競合により、移植した細胞が十分に成長できなかった可能性が考えられる。
［実験例２］
ゼブラフィッシュ遺伝子・エンハンサートラップ系統から、初期卵母細胞特異的にＧＡＬ４を発現する２５４Ａ系統を単離した（図３Ａ）。２５４Ａ系統と、ＵＡＳプロモーターの下流にｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ(ｎｔｒ)遺伝子を有する系統を掛け合わせて得られた系統（２５４Ａ：：ｎｔｒ系統）は、初期卵母細胞特異的にＮｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅタンパク質を発現する。ＭｅｔｒｏｄｉｎａｚｏｌｅはＮｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅによって分解され毒性を示す。即ち、飼育水槽中にＭｅｔｒｏｄｉｎａｚｏｌｅを添加すると、初期卵母細胞特異的に発現しているＮｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅによって分解物が毒性を示し、卵母細胞が除去される。添加するＭｅｔｒｏｄｉｎａｚｏｌｅの濃度を変えて、２５４Ａ系統における卵母細胞の除去効率を検討した。図３Ｂに示すように、濃度依存的に卵母細胞の除去が確認された。
ゼブラフィッシュ遺伝子・エンハンサートラップ系統から、初期卵母細胞特異的にＧＡＬ４を発現する２５４Ａ系統を単離した（図３Ａ）。２５４Ａ系統と、ＵＡＳプロモーターの下流にｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ(ｎｔｒ)遺伝子を有する系統を掛け合わせて得られた系統（２５４Ａ：：ｎｔｒ系統）は、初期卵母細胞特異的にＮｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅタンパク質を発現する。ＭｅｔｒｏｄｉｎａｚｏｌｅはＮｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅによって分解され毒性を示す。即ち、飼育水槽中にＭｅｔｒｏｄｉｎａｚｏｌｅを添加すると、初期卵母細胞特異的に発現しているＮｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅによって分解物が毒性を示し、卵母細胞が除去される。添加するＭｅｔｒｏｄｉｎａｚｏｌｅの濃度を変えて、２５４Ａ系統における卵母細胞の除去効率を検討した。図３Ｂに示すように、濃度依存的に卵母細胞の除去が確認された。
上記２５４Ａ：：ｎｔｒ系統と免疫不全ｒａｇ1変異系統を交配して、移植用宿主個体を樹立した。実験例１と同様に、ｓｏｘ１７：：ｅｇｆｐの卵巣から卵原細胞や初期卵母細胞を含む組織片を単離し、２５４Ａ：：ｎｔｒ＋ｒａｇ１変異体の雌の卵巣内に移植した。７日後から、１０ｍＭ Ｍｅｔｒｏｄｉｎａｚｏｌｅの３日間処理と４日通常飼育を２回行った後に、オスと交配し、１４７匹中２匹でＧＦＰ陽性胚を確認した（図４参照）。
［実験例３］
図５に実験手順を示す。ｖａｓ：：ｅｇｆｐゼブラフィッシュの肥大化精巣を、コラゲナーゼを用いて細胞単位にまで単離した。また、ホンモロコから精巣を単離し、コラゲナーゼを用いて細胞単位にまで単離した。この２種類の精巣構成細胞を５：１（ゼブラフィッシュ：ホンモロコ）で混ぜ合わせて遠心分離後、培養して集合塊を得た。この集合塊をｒａｇ１変異体の雄に皮下移植した。移植を受けた宿主は、１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含む０．４×ＰＢＳ中で餌を与えず暗所にて４日日飼育した。その後は、通常の飼育水中で飼育した。
移植２か月後、移植塊を回収し、抗ＧＦＰ抗体を用いて免疫染色を行った。結果を図６に示す。図６に示すように、ＧＦＰシグナルが陰性のホンモロコ精原細胞、精母細胞が存在し、同一ロビュール内に精子が存在することから、ホンモロコ精巣生殖系幹細胞から精子が形成されていることが確認された。
図５に実験手順を示す。ｖａｓ：：ｅｇｆｐゼブラフィッシュの肥大化精巣を、コラゲナーゼを用いて細胞単位にまで単離した。また、ホンモロコから精巣を単離し、コラゲナーゼを用いて細胞単位にまで単離した。この２種類の精巣構成細胞を５：１（ゼブラフィッシュ：ホンモロコ）で混ぜ合わせて遠心分離後、培養して集合塊を得た。この集合塊をｒａｇ１変異体の雄に皮下移植した。移植を受けた宿主は、１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含む０．４×ＰＢＳ中で餌を与えず暗所にて４日日飼育した。その後は、通常の飼育水中で飼育した。
移植２か月後、移植塊を回収し、抗ＧＦＰ抗体を用いて免疫染色を行った。結果を図６に示す。図６に示すように、ＧＦＰシグナルが陰性のホンモロコ精原細胞、精母細胞が存在し、同一ロビュール内に精子が存在することから、ホンモロコ精巣生殖系幹細胞から精子が形成されていることが確認された。
［実験例４］
ｖａｓ：：ｅｇｆｐゼブラフィッシュから肥大化精巣を単離し、コラゲナーゼを用いて細胞単位にまで単離した。また、ホンモロコから卵巣上皮を単離し、コラゲナーゼを用いて細胞単位にまで単離した。この２種類の細胞を５：１（ゼブラフィッシュ：ホンモロコ）で混ぜ合わせて遠心分離後、培養して集合塊を得た。この集合塊をｒａｇ１変異体の雄に皮下移植した（図５参照）。移植を受けた宿主は、１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含む０．４×ＰＢＳ中で餌を与えず暗所にて４日日飼育した。その後は、通常の飼育水中で飼育した。
移植２か月後、移植塊を回収し、抗ＧＦＰ抗体を用いて免疫染色を行った。結果を図７に示す。図７に示すように、ＧＦＰシグナルが陰性のホンモロコ精原細胞、精母細胞が存在し、同一ロビュール内に精子が存在することから、ホンモロコ卵巣生殖系幹細胞から精子が形成されていることが確認された。
ｖａｓ：：ｅｇｆｐゼブラフィッシュから肥大化精巣を単離し、コラゲナーゼを用いて細胞単位にまで単離した。また、ホンモロコから卵巣上皮を単離し、コラゲナーゼを用いて細胞単位にまで単離した。この２種類の細胞を５：１（ゼブラフィッシュ：ホンモロコ）で混ぜ合わせて遠心分離後、培養して集合塊を得た。この集合塊をｒａｇ１変異体の雄に皮下移植した（図５参照）。移植を受けた宿主は、１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含む０．４×ＰＢＳ中で餌を与えず暗所にて４日日飼育した。その後は、通常の飼育水中で飼育した。
移植２か月後、移植塊を回収し、抗ＧＦＰ抗体を用いて免疫染色を行った。結果を図７に示す。図７に示すように、ＧＦＰシグナルが陰性のホンモロコ精原細胞、精母細胞が存在し、同一ロビュール内に精子が存在することから、ホンモロコ卵巣生殖系幹細胞から精子が形成されていることが確認された。
［実験例５］
生殖系幹細胞が分化しないmeioc変異体ゼブラフィッシュから精巣を単離し、コラゲナーゼを用いて細胞単位にまで単離した。また、ホンモロコから精巣を単離し、コラゲナーゼを用いて細胞単位にまで単離した。この２種類の細胞を５：１（ゼブラフィッシュ：ホンモロコ）で混ぜ合わせて遠心分離後、培養して集合塊を得た。この集合塊をｒａｇ１変異体の雄に皮下移植した（図５参照）。移植を受けた宿主は、１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含む０．４×ＰＢＳ中で餌を与えず暗所にて４日日飼育した。その後は、通常の飼育水中で飼育した。
移植２か月後、移植塊を回収し、組織観察を行った。結果を図８に示す。図８に示すように、ホンモロコの精子および卵母細胞が分化していることが確認された。
生殖系幹細胞が分化しないmeioc変異体ゼブラフィッシュから精巣を単離し、コラゲナーゼを用いて細胞単位にまで単離した。また、ホンモロコから精巣を単離し、コラゲナーゼを用いて細胞単位にまで単離した。この２種類の細胞を５：１（ゼブラフィッシュ：ホンモロコ）で混ぜ合わせて遠心分離後、培養して集合塊を得た。この集合塊をｒａｇ１変異体の雄に皮下移植した（図５参照）。移植を受けた宿主は、１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含む０．４×ＰＢＳ中で餌を与えず暗所にて４日日飼育した。その後は、通常の飼育水中で飼育した。
移植２か月後、移植塊を回収し、組織観察を行った。結果を図８に示す。図８に示すように、ホンモロコの精子および卵母細胞が分化していることが確認された。
本発明により、移植した同種別個体の卵巣組織又は異種の魚類の生殖組織を効率よく生着・生育させて他家卵子又は異種配偶子を製造する方法を提供することができる。
Claims (5)
- 免疫不全魚類に対する同種生殖組織、及び異種魚類生殖組織をそれぞれ細胞単位にまで単離した後混ぜ合わせて集合塊を得る工程と、前記集合塊を前記免疫不全魚類の皮下又は卵巣内に移植する工程と、を有する、生殖組織の製造方法。
- 更に、前記免疫不全魚類内の対応する宿主生殖細胞を除去する工程を有する、請求項１に記載の生殖組織の製造方法。
- 免疫不全魚類に対する同種魚類生殖組織を免疫不全魚類の卵巣に移植する工程と、前記免疫不全魚類内の対応する宿主生殖細胞を除去する工程と、を有する、生殖組織の製造方法。
- 前記免疫不全魚類は、ｒａｇ１遺伝子又はそのホモログ、又は、Ｒａｇ１タンパク質又はそのホモログの機能が抑制若しくは喪失している、請求項１～３のいずれか一項に記載の生殖組織の製造方法。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載の生殖組織の製造方法により得られた生殖組織から配偶子を得る、配偶子の製造方法。
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|---|---|---|---|
| JP2022517015A JPWO2021215356A1 (ja) | 2020-04-20 | 2021-04-16 |
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|---|---|
| WO2021215356A1 true WO2021215356A1 (ja) | 2021-10-28 |
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|---|---|---|---|
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| WO (1) | WO2021215356A1 (ja) |
Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| JP2011200169A (ja) * | 2010-03-25 | 2011-10-13 | Tokyo Univ Of Marine Science & Technology | 分離生殖細胞の移植による生殖細胞系列への分化誘導法における生着能の向上 |
| WO2015146184A1 (ja) * | 2014-03-26 | 2015-10-01 | 国立大学法人東京海洋大学 | 他属魚種代理親魚への適用が可能な、代理親魚を用いた養殖魚生産のための魚類配偶子の生産方法 |
| JP2016036320A (ja) * | 2014-08-11 | 2016-03-22 | 大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 | 魚体内での他家組織の継代維持法 |
-
2021
- 2021-04-16 JP JP2022517015A patent/JPWO2021215356A1/ja active Pending
- 2021-04-16 WO PCT/JP2021/015669 patent/WO2021215356A1/ja active Application Filing
Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
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| JP2016036320A (ja) * | 2014-08-11 | 2016-03-22 | 大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 | 魚体内での他家組織の継代維持法 |
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