WO2021187851A1 - 표적화 압타머 접합체를 캡슐화한 입자 및 이의 용도 - Google Patents

표적화 압타머 접합체를 캡슐화한 입자 및 이의 용도 Download PDF

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    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates generally to the field of aptamers, targeting conjugates thereof and particles thereof for drug delivery.
  • Nano and micro particles have the capability to satisfy the necessary conditions for such an effective drug delivery system.
  • Particulate drug delivery systems are attractive for systemic drug delivery, which prolongs drug circulating half-life, reduces non-specific absorption, and improves their accumulation in tumors through enhanced permeation and retention (EPR) effects. because of the ability.
  • EPR permeation and retention
  • Patent Document 1 KR10-1653451 B
  • Patent Document 2 KR10-1759209 B
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical use for administering the formulation to a patient in need of treatment or prevention of cancer or infectious disease, in order to treat or prevent cancer or infectious disease.
  • Particles including nanoparticles and microparticles containing conjugates in which an aptamer and an active agent (e.g., therapeutic, prophylactic, or diagnostic agent) are linked, and pharmaceutical formulations thereof, have been devised, which improve the active agent. spatiotemporal delivery and/or improved biodistribution.
  • Methods for preparing the conjugates, particles and formulations thereof are provided. Methods are provided for administering the formulation to a patient in need thereof, for example for treating or preventing cancer or an infectious disease.
  • the conjugate is released after administration of the particle.
  • the conjugates have improved permeability and retention effects (EPR) and improved overall biodistribution of the particles, and with the conjugates inside the particles, greater compared to administration of targeted particles or encapsulated non-targeted drugs outside the particles. It provides efficacy and tolerability.
  • the conjugate comprises an aptamer and an active agent, wherein the conjugate has the formula:
  • A is an aptamer
  • B is an active agent
  • C is a linker
  • D is a polymer
  • n is an integer of 1 or more.
  • One aptamer may be conjugated to two or more active agents, for example, Formulas 2, 4 and 6.
  • the active agents are therapeutic, prophylactic, nutraceutical, and diagnostic agents. Preferably, it is a chemotherapeutic agent, an anti-infective agent, or a combination thereof.
  • the active agent may be DM1, doxorubicin, a nucleoside therapeutic agent, or an analog or derivative thereof.
  • the aptamer is an oligonucleotide capable of specifically binding to a specific cell/tissue and may be chemically synthesized.
  • the aptamer binds to the target material by various bonding methods such as ionic bonding using the negative charge of a phosphate group, hydrophobic bonding and hydrogen bonding using ribose, hydrogen bonding or stacking bonding using a nucleic acid base.
  • the conjugate may be prepared by enzymatic and organic synthesis by a functional group in each of the activator and the aptamer, or a conjugate may be formed by using a linker consisting of a functional group and a spacer for the activator and the aptamer, and may be pegylated at one end. may be The linker may release the active agent at the desired release site.
  • a method for preparing particles encapsulating the conjugate using a polymer matrix is provided. It is characterized in that one or more types of heterozygotes are embedded in the particle.
  • the polymeric matrix may be a hydrophobic polymer, a hydrophilic polymer, and copolymers thereof, and the polymeric matrix may be a polymer linked to a ligand that specifically binds to a specific cell/tissue.
  • any one or more selected from the group consisting of trehalose, chitosan-glycolide, chondroitin sulfate, or a combination thereof may be added to protect the conjugate.
  • the particles include lymphoma, renal carcinoma, leukemia, prostate cancer, lung cancer, pancreatic cancer, melanoma, colorectal cancer, ovarian cancer, breast cancer, glioblastoma multiforme, gastric cancer, liver cancer, sarcoma, bladder cancer, testicular cancer, esophageal cancer, head and neck cancer, endometrial cancer Targets cancer or proliferative diseases, including cancer and leptomeningeal carcinomatosis.
  • the present invention relates to a targeting conjugate, a particle therein, and a pharmaceutical composition comprising the same, a drug delivery system and a drug delivery method.
  • the particles of the present invention contain a targeting conjugate to have a hydrodynamic size and uniformly distribute in an aqueous environment.
  • the particle formulation of the present invention is capable of protecting the targeting conjugate from nucleases abundant in the physiological environment (eg, serum nucleases) through the formation of a stable monocomplex, and the particle is continuously Emitting conjugates may provide targeting capability
  • the particles of the present invention and compositions and systems comprising the same can stably deliver an active agent to specific cells/tissues, and are effective in the treatment or detection of various diseases (specifically, cancer) depending on the active ingredient. can be applied.
  • 1 is a particle with a targeting conjugate inside and no ligand outside (a) or particle on the outside (b)
  • 3 is a result of measuring the fluorescence intensity of Dox in the reaction group while adding a DNA-HER2 aptamer construct to Dox.
  • FIG. 5 is a photomicrograph of dFdCMP-HER2 aptamer and dFdCMP-EpCAM aptamer MP.
  • 6 is a release profile of dFdCTP-HER2 aptamer conjugate and dFdCMP-EpCAM aptamer conjugate from dFdCMP-HER2 aptamer and FddCMP-EpCAM aptamer MP.
  • FIG. 10 shows dFdCMP-HER2 aptamer and dFdCMP-EpCAM aptamer MP-treated HER-2 and MDA-MB-453 (a) overexpressing EpCAM, MCF-7 (b) overexpressing HER2 negative and EpCAM. and HER2 and EpCAM negative MDA-MB-231(c) are the results of MTT analysis.
  • 11 is a result of MTT analysis of HER-2 overexpressing MDA-MB-453 and HER-2 negative MCF-7 treated with DOX/DNA-HER2 aptamer NP.
  • the present inventors have sought to develop particles for effective delivery of a drug or drug candidate to specific diseased cells and tissues in a spatiotemporal controlled manner in a specific organ or tissue, for example to cancer cells.
  • particles including nanoparticles and microparticles
  • an active agent eg, therapeutic, prophylactic, or diagnostic agent
  • the present invention has been completed by confirming that it can provide improved spatiotemporal delivery and/or improved biodistribution of an active agent.
  • the present invention provides particles in which a conjugate in which an aptamer and an active agent are linked is encapsulated into a polymeric matrix.
  • the aptamer is preferably a Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) aptamer represented by SEQ ID NO: 2 or an Epidermal cell adhesion molecule (EpCAM) aptamer represented by SEQ ID NO: 4.
  • HER2 Human epidermal growth factor receptor 2
  • EpCAM Epidermal cell adhesion molecule
  • the active agent is preferably dFdCTP or DM1 (mertansine).
  • the dFdCTP is integrated into the aptamer sequence.
  • oligonucleotide capable of binding to the active agent between the aptamer and the active agent.
  • the active agent is doxorubicin
  • the single-stranded oligonucleotide is represented by SEQ ID NO: 5.
  • trehalose chitosan-glycolide
  • chondroitin sulfate or a combination thereof to the conjugate.
  • the polymeric matrix preferably comprises at least one polymer selected from the group consisting of hydrophobic polymers, hydrophilic polymers, and copolymers thereof.
  • the polymeric matrix comprises polyhydroxy acids, polyhydroxyalkanoates, olicaprolactones, poly(orthoesters), polyanhydrides, poly(phosphazenes), poly(lactide-co-caprolactone), polycarbonates, Polyesteramide, polyester, polyalkylene glycol, polyalkylene oxide, poly(oxyethylated polyol), poly(olefinic alcohol), polyvinylpyrrolidone), poly(hydroxyalkylmethacrylamide), poly (hydroxyalkyl methacrylate), poly(saccharide), poly(hydroxy acid), poly(vinyl alcohol), poly(lactic acid), poly(glycolic acid), poly(lactic acid-co-glycolic acid), poly(lactic acid-co-glycolic acid) It is preferably selected from the group consisting of (ethylene oxide), poly(ethylene glycol), poly(propylene glycol), and copolymers thereof.
  • the polymer matrix is preferably linked to a ligand that specifically binds to a specific cell/tissue.
  • the ligand is preferably an EpCAM aptamer represented by SEQ ID NO: 4.
  • the conjugate is preferably present in an amount of 0.1% to 10% (w/w) based on the total weight of the particles.
  • the particles are preferably micro particles or nanoparticles.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the particles described in the present invention as an active ingredient.
  • the cancer is caused by overexpression of HER2 or EpCAM.
  • the present invention comprises the steps of (a) preparing a conjugate in which an aptamer and an active agent are linked; and (b) encapsulating the conjugate into a polymeric matrix.
  • the terms “subject” or “patient” refer to any organism to which particles may be administered, for example, for experimental, therapeutic, diagnostic and/or prophylactic purposes. Typical subjects include animals (eg, mice, rats, rabbits, non-human primates, and mammals such as humans) and/or plants.
  • animals eg, mice, rats, rabbits, non-human primates, and mammals such as humans
  • treating refers to a disease, disorder or condition that occurs in an animal that may be predisposed to the disease, disorder and/or condition but has not yet been diagnosed with the disease, disorder, and/or condition. prevention of; inhibiting the disease, disorder or condition, eg, delaying its progression; and alleviation of a disease, disorder or condition, eg, inducing amelioration of a disease, disorder and/or condition.
  • Treatment of a disease, disorder, or condition may not affect the underlying pathophysiology of a particular disease, disorder, or condition, such as treating pain in a subject by administration of an analgesic, although the analgesic does not treat the cause of the pain. ameliorating at least one symptom of the condition.
  • target shall mean the site to which the targeted construct binds.
  • the target may be in vivo or in vitro.
  • the target may be a cancer cell found in a leukemia or a tumor (eg, a tumor of the brain, lung (small and non-small cell), ovary, prostate, breast and colon, as well as other carcinomas and sarcomas).
  • the target can be a site of infection (eg, bacterial, viral (eg, HIV, herpes, hepatitis)) and pathogenic fungi (eg, Candida sp.).
  • target infecting organisms are those that are drug resistant (e.g., Enterobacteriaceae, Enterococus, Haemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis), Neisseria gonorrhoeae, Plasmodium falciparum, Pseudomonas aeruginosa, Shigella dysenteriae, Staphylococcus au Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae
  • the target binds to an aptamer or aptamer binding, such as a hapten, epitope, receptor, dsDNA fragment, carbohydrate or enzyme.
  • the target may be a type of tissue, for example, neuronal tissue, intestinal tissue, pancreatic tissue, and the like.
  • Target cells that can serve as targets for the methods or coordination complexes include prokaryotes and eukaryotes including yeast, plant cells and animal cells.
  • the cell forms part of, or is otherwise present in, plant tissue or animal tissue, in vitro, i.e. in cell culture or in vivo, to alter the cellular function of a living cell.
  • target cells include, for example, blood, lymphoid tissue, cells lining the digestive tract such as oral and pharyngeal mucosa, cells forming the villi of the small intestine, cells lining the large intestine, ( cells lining the animal's respiratory tract (nasal/lung), dermal/epithelial cells, vaginal and rectal cells, cells of internal organs including placental cells and the so-called blood/brain barrier, etc. have.
  • therapeutic effect refers to a local or systemic effect in an animal, particularly a mammal, more particularly a human, caused by a pharmacologically active substance. Accordingly, the term means any substance intended for use in the diagnosis, cure, alleviation, treatment or prevention of disease and for the amelioration of the desired physical or mental development and condition in an animal or human. .
  • modulation is art-recognized and refers to up-regulation (ie, activation or stimulation), down-regulation (ie, inhibition or repression) of a response, or a combination or individual of the two.
  • active agent includes, without limitation, a physiologically or pharmacologically active substance that acts locally or systemically in the body.
  • a bioactive agent may be a substance used for treatment (eg, a therapeutic agent), a substance used for prophylaxis (eg, a prophylactic agent), a substance used for diagnosis (eg, a diagnostic agent), a disease or condition.
  • prodrug refers to an agent comprising a nucleic acid or protein that is converted to a biologically active form in vitro and/or in vivo.
  • Prodrugs can be useful because, in some cases, they are easier to administer than the parent compound. For example, a prodrug is bioavailable by oral administration, whereas the parent compound is not. The prodrug may also have improved solubility in the pharmaceutical composition compared to the parent drug.
  • a prodrug can be converted to the parent drug by a variety of mechanisms, including enzymatic processes and metabolic hydrolysis.
  • biocompatible refers to a substance having any metabolites or degradation products thereof that are generally nontoxic to recipients and do not cause significant adverse side effects to recipients. Generally speaking, a biocompatible material is one that does not induce a significant inflammatory or immune response when administered to a patient.
  • biodegradable generally refers to smaller units or substances to be chemically degraded or eroded that can be metabolized, eliminated, or secreted by a subject under physiological conditions.
  • Disintegration time is a function of composition and morphology. Decomposition times can range from several hours to several weeks.
  • pharmaceutically acceptable means, within the scope of sound medical judgment, suitable for use in contact with tissues of humans and lower animals without undue toxicity, irritation, allergic reaction or other problems or complications and In accordance with guidelines, such as the US Food and Drug Administration, compounds, substances, compositions and/or dosage forms corresponding to a reasonable benefit/risk ratio are indicated.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to any component of a pharmaceutical formulation that facilitates delivery of the composition in vivo.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, diluents, preservatives, binders, lubricants, disintegrants, swelling agents, fillers, stabilizers, and combinations thereof.
  • the term “molecular weight” generally refers to the mass or average mass of a substance. In the case of polymers or oligomers, the molecular weight may refer to the relative average chain length or the chain mass of the relative bulk polymer. Indeed, the molecular weight of polymers and oligomers can be estimated or characterized in a variety of ways, including gel permeation chromatography (GPC) or capillary viscometry. GPC molecular weight is reported as weight average molecular weight (Mw) as opposed to number average molecular weight (Mn). Capillary viscometry provides an estimate of molecular weight as the intrinsic viscosity measured from a diluted polymer solution using specific settings of concentration, temperature, and solvent conditions.
  • GPC gel permeation chromatography
  • Mn number average molecular weight
  • small molecule generally refers to an organic molecule having a molecular weight of less than 2000 g/mol, less than 1500 g/mol, less than 1000 g/mol, less than 800 g/mol, or less than 500 g/mol. Small molecules are non-polymeric and/or non-oligomeric.
  • hydrophilic refers to a substance having a strongly polar group that readily interacts with water.
  • hydrophobic refers to a lack of affinity for water; It refers to a substance that not only repels and does not absorb water, but also does not tend to dissolve in or mix with water.
  • lipophilic refers to a compound that has an affinity for a lipid.
  • amphoteric refers to a molecule that combines hydrophilic and lipophilic (hydrophobic) properties.
  • Amphoteric material refers to materials containing hydrophobic or more hydrophobic oligomers or polymers (eg, biodegradable oligomers or polymers) and hydrophilic or more hydrophilic oligomers or polymers.
  • reactive coupling group refers to any chemically functional group capable of reacting with a second functional group to form a covalent bond.
  • reactive coupling groups include primary amines (-NH2) and amine-reactive linking groups such as isothiocyanates, isocyanates, acylates, NHS esters, sulfonyl chlorides, aldehydes, glyoxal, epoxides , oxirane, carbonate, aryl halide, imidoester, carbodiamide, anhydride, and fluorophenyl ester.
  • reactive coupling groups may include aldehydes (-COH) and aldehyde reactive linking groups such as hydrazides, alkoxyamines, and primary amines.
  • examples of the reactive coupling group may include a thiol group (-SH) and a sulfhydryl reactive group such as maleimide, haloacetyl, and pyridyl disulfide.
  • examples of the reactive coupling group may include a photoreactive coupling group such as an aryl azide or diazirine.
  • the coupling reaction may include the use of a catalyst, heat, pH buffer, light, or a combination thereof.
  • copolymer generally refers to a single polymeric material composed of two or more different monomers.
  • the copolymer may be in any form, for example, random, block, graft, and the like.
  • the copolymer can have any end-groups that are capped or include acid end groups.
  • the term “average particle size” generally refers to the statistically average particle size (diameter) of the particles in a composition.
  • the diameter of an essentially spherical particle can be expressed as a physical or hydrodynamic diameter.
  • the diameter of the non-spherical particle may preferentially represent the hydrodynamic diameter.
  • the diameter of a non-spherical particle may represent the maximum linear distance between two points on the surface of the particle.
  • the average particle size can be determined using methods known in the art, for example, dynamic light scattering.
  • homogeneous size distribution describes a population of particles, microparticles, or nanoparticles that all have the same or approximately the same size.
  • a monodisperse distribution refers to a distribution of particles in which 90% of the distribution is within 5% of the average particle size.
  • polypeptide generally refer to a polymer of amino acid residues.
  • the term as used herein also applies to amino acid polymers in which one or more amino acids are chemical analogs or modified derivatives of the corresponding naturally-occurring amino acids.
  • protein refers to a polymer of amino acids linked together by peptide bonds to form a polypeptide of sufficient chain length to produce tertiary and/or quaternary structures.
  • protein excludes by definition small peptides that lack the essential higher-order structures necessary to be considered proteins.
  • nucleic acid refers to a polymer of deoxyribonucleotides or ribonucleotides in linear or circular arrangement, and in single- or double-stranded form. These terms are not to be construed as limiting with respect to the length of the polymer.
  • the terms may include natural nucleotides as well as known analogs of nucleotides modified at base, sugar and/or phosphate moieties (eg, phosphorothioate backbone). In general and unless otherwise specified, analogs of a particular nucleotide will have the same base pair specificity, ie, analogs of A will base pair with T.
  • nucleic acid is a term in the art representing a series of at least two base-sugar-phosphate monomer units. Nucleotides are the monomer units of nucleic acid polymers. The term includes deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA) in the form of messenger RNA, antisense, plasmid DNA, part of plasmid DNA or genetic material derived from a virus. Antisense is a polynucleotide that interferes with DNA and/or RNA function.
  • nucleic acid refers to a series of at least two base-sugar-phosphate combinations.
  • Natural nucleic acids have a phosphate backbone, and artificial nucleic acids can include different types of backbones, but contain the same base.
  • the term also includes PNA (peptide nucleic acids), phosphorothioates, and other variants of the phosphate backbone of native nucleic acids.
  • a "fragment" of a protein, polypeptide or nucleic acid is a protein, polypeptide or nucleic acid that is not identical in sequence to the full-length protein, polypeptide or nucleic acid but retains at least one function as the full-length protein, polypeptide or nucleic acid. Fragments may have more, fewer, or the same number of residues and/or may have one or more amino acid or nucleotide substitutions as the corresponding native molecule.
  • Methods for determining the function of a nucleic acid eg, its coding function, its ability to hybridize to another nucleic acid
  • methods for measuring protein function are well known. For example, the DNA binding function of a polypeptide can be measured, for example, by filter-binding, electrophoretic mobility shift, or immunoprecipitation assays.
  • DNA cleavage can be analyzed by gel electrophoresis.
  • the ability of a protein to interact with another protein can be determined, for example, by co-immunoprecipitation, a two-hybrid assay or complementarity, for example, genetics or biochemistry.
  • linker is a molecule having two or more functional groups, one for binding to or otherwise associating with a biological molecule or fragment thereof, such as a ligand comprising an aptamer, and the other for conjugation to an active agent.
  • a “linker” may include heteroatoms (eg, nitrogen, oxygen, sulfur, etc.) and may have a carbon chain that may be 1 to 50 atoms in length.
  • Linkers can be hydrogen atom, alkyl, alkenyl, alkynyl, amino, alkylamino, dialkylamino, trialkylamino, hydroxyl, alkoxy, halogen, aryl, heterocyclic, aromatic heterocyclic, cyano, amide, carba may be substituted with a variety of substituents including, but not limited to, moyl, carboxylic acid, ester, thioether, alkylthioether, thiol, and ureido groups. Those skilled in the art will recognize that each of these groups may again be substituted.
  • linkers include pH-sensitive linkers, protease cleavable peptide linkers, nuclease-sensitive nucleic acid linkers, lipase-sensitive lipid linkers, glycosidase-sensitive carbohydrate linkers, hypoxia-sensitive linkers, light-cleavable linkers, thermal -labile linkers, enzymatically cleavable linkers (eg, esterase cleavable linkers), ultrasound-sensitive linkers, and x-ray cleavable linkers.
  • pharmaceutically acceptable counterion refers to a pharmaceutically acceptable anion or cation.
  • pharmaceutically acceptable counterion is a pharmaceutically acceptable ion.
  • pharmaceutically acceptable salt(s) refers to salts of acidic or basic groups that may be present in the compounds used in the compositions of the present invention.
  • Compounds included in the compositions of the present invention that are basic in nature are capable of forming a wide variety of salts with a variety of inorganic and organic acids.
  • the free base can be obtained by basifying a solution of the acid salt.
  • the addition salt in particular a pharmaceutically acceptable addition salt, is prepared by dissolving the free base in a suitable organic solvent, in accordance with conventional procedures for preparing acid addition salts from base compounds, and the solution It can be prepared by treating with an acid.
  • One of ordinary skill in the art will recognize a variety of synthetic methods that can be used to prepare non-toxic, pharmaceutically acceptable addition salts.
  • bioavailability refers to a form of the invention in which the administered form or a portion of its dosage is absorbed, incorporated, or otherwise physiologically available to the subject or patient to which it is administered.
  • targeting drug' used in the present invention refers to a "targeting conjugate" that can alleviate or cure some or all of a biological disease through a chemical or biochemical reaction when injected into a living body, or can prevent aggravation of a disease means
  • the targeting conjugate was initially attempted to produce particles in the form of a drug directly attached to an antibody, and it was expected that an immunoconjugate having such a simple structure would show an effective tumor suppression effect through an active target by an antibody.
  • clinical trials conducted so far have not yielded very effective results.
  • One of the reasons is that there is a limit to the amount of drug that can be attached to the antibody while maintaining the activity of the target antibody.
  • a triple structure (a ligand or antibody as a targeting moiety, a polymer or lipid as a carrier, and an active chemotherapeutic drug) is selected.
  • a triple structure a ligand or antibody as a targeting moiety, a polymer or lipid as a carrier, and an active chemotherapeutic drug.
  • tumor cell surface antigens and receptors are ideal when they have the following characteristics. First, it should be expressed only in tumor cells, not in normal cells. However, in reality, most antigens are expressed in normal cells and only relatively overexpressed in tumor cells. Therefore, the density of receptors located on the surface of target tumor cells is important. Second, it must be expressed homogenously in all target tumor cells. However, as is well known, tumor cells often show different phenotypes even within the same tumor because they show histological, genetic, and molecular heterogeneity. Therefore, the expression of the antigen is also not homogeneous. Finally, it must not be released into the blood.
  • the free antigen competes with the cell surface antigen and binds to the target nanoparticles, thereby reducing the effect of the drug.
  • the present invention aims to overcome the problem of tumor heterogeneity by using one or more heterologous targeting conjugates at the same time.
  • Whether the target particle can enter the cell after binding to the target cell surface is an important criterion in selecting an appropriate targeting ligand.
  • an antibody or ligand that does not flow into a cell there may be a case where the released drug cannot flow into the cell because the drug is released on the cell surface or near the outside. Therefore, the intracellular drug concentration is inevitably lower than when the drug is released from the cytoplasm after being introduced into the cell.
  • Intracellular entry is often achieved through receptor mediated endocytosis.
  • receptor mediated endocytosis For example, when nanoparticles linked to folic acid that target this receptor bind to a receptor on the cell surface, the cell membrane collapses and surrounds the nanoparticles bound to the receptor to form an endosome. do.
  • the drug is released from the folate-drug conjugate into the cytoplasm through acidification or activation of the enzyme (lysozyme) in the endocytoplasmic entrapment, and then exerts an effect in the cell according to the mechanism of action of each drug.
  • the folate receptor moves back to the cell membrane surface and is re-expressed, so that it binds to a new folate-drug conjugate, and the same process is repeated.
  • the intracellular recycling rate of these folate receptors seen in the receptor-mediated encapsulation process varies depending on the type of tumor cells, and is an important indicator in determining the frequency of drug administration. If the drug is administered more frequently than the turnover of the receptor, the drug conjugate that cannot bind to the receptor eventually accumulates outside the cell, thereby reducing the effectiveness of the treatment and may cause only side effects. In addition to the turnover of receptors, the type, density, and affinity of the receptor or antigen can also affect this intracellular entry process.
  • Ligands are natural substances such as folic acid, transferrin, and growth factors, and mainly bind to cell surface receptors. Compared to antibodies, the molecular weight is small and the immune response is small. Receptor-targeting conjugates prepared using these ligands are mainly introduced into cells through receptor-mediated entrapment. Thanks to the recent development of antibody manufacturing engineering, various types of antibodies are being applied to active targeting mechanisms. In the case of a whole monoclonal antibody (mAb) or a divalent engineered antibody fragment, it has at least two binding sites with high binding affinity. However, on the other hand, there is a disadvantage that the antibody Fc domain (antibody Fc domain) is rapidly removed from the blood circulation by macrophages by inducing an immune response.
  • antibody fragments [antibody fragments: F(ab)2, Fab, scFv], because there is no Fc region, the immune response is reduced and can remain in the bloodstream for a long time. It has the advantage of penetrating and accumulating in the organization. However, there is a problem in the weakening of the binding force with the antigen due to the loss of the multivalent binding site. In this case, the binding force of the antibody can be improved by attaching several antibody fragments to the surface of the carrier at the same time or by making bivalent or multivalent antibody fragments.
  • the folate receptor is the most well-known tumor marker, and it binds with high affinity to the vitamins folic acid and folate-drug conjugate, and enters the cell through receptor-mediated entrapment. However, although it is overexpressed in tumor cells, it is also found in some normal cells.
  • the expression frequency of the folate receptor was investigated using tumor tissues of patients with primary and metastatic cancer of the head and neck, and the expression of the receptor was observed in 53% of tumor tissues, whereas no expression was observed in the normal bone marrow, a control group.
  • a folate receptor-targeting Taxol conjugate [Heparin-Folate-Taxol TM :HFT] using heparin as a vehicle, and conducted in vitro and animal experiments.
  • Transferrin is a serum glycoprotein that binds to its receptor and flows into the cell through receptor-mediated encapsulation, thereby serving as a carrier for transporting iron in the blood into the cell.
  • This transferrin receptor has been studied as a target for tumor-specific drug delivery since it is overexpressed in tumor cells compared to normal cells.
  • Transferrin-conjugated paclitaxel-loaded (PLGA polymer) nanoparticles showed stronger inhibition of the growth of MCF-7 and MCF-7/Adr cells compared to free paclitaxel. Liposomal nanoparticles using transferrin were also more easily integrated into tumor cells and tissues in vitro and in animal experiments compared to simple liposomes, and showed a higher survival rate.
  • Lectin is a protein substance capable of recognizing and binding to a carbohydrate site (glycan) attached to a protein located on the outer surface of the cell membrane.
  • the cell surface glycosylated protein (glycan) which is the binding site of lectin, shows different chemical structures depending on the cell type and the binding ratio of sugars.
  • lectin can be used as a targeting moiety that can selectively deliver a specific drug to a target cell or tissue.
  • Two types of lectin-carbohydrate interaction can be used in the preparation of nanoparticles. One is to use lectin as a target molecule targeting the carbohydrate site on the cell surface (direct lectin targeting), and the other is to target the lectin on the cell surface with nanoparticles linked to carbohydrates (reverse lectin-targeting).
  • PK2 drug conjugate using reverse lectin-targeting
  • galactosamine was used as a target molecule by using the phenomenon in which the asialoglycoprotein receptor expressed on the surface of hepatocytes specifically binds to terminal beta-D-galactose or N-acetyl-galactosamine-residues.
  • PK2 was observed to effectively target the liver in images using a gamma camera.
  • Drug resistance is the main cause of limiting the therapeutic effect of anticancer drugs.
  • the environment around the tumor such as insufficient blood vessel distribution, acidic environment, and high interstitial pressure, is an obstacle for the drug to reach the tumor.
  • Tumor cells themselves avoid the action of drugs through various resistance mechanisms such as increased drug excretion to the outside world, decreased drug inflow into cells, activation of DNA reconstruction, and inhibition of apoptosis.
  • p-glycoprotein is the most widely known and studied mechanism.
  • Glycoprotein is a transmembrane glycoprotein with a molecular weight of 170-kDa, which is a product of the MDR1 gene. .
  • nanoparticles such as polymers, liposomes, and micelles
  • Efforts have been made to overcome drug resistance using various types of nanoparticles such as polymers, liposomes, and micelles, and the following two mechanisms have shown the potential to overcome glucoprotein-mediated resistance.
  • the first is that when nanoparticles are introduced into the cell, they can escape from the recognition of the glycoprotein by being wrapped in an envelope or entering the cell in a form that the glycoprotein cannot recognize (masking).
  • the second mechanism is to deplete or inhibit ATP, which is the energy required, for the glucoprotein to pump the drug out of the cell, which requires energy.
  • the method using a receptor-targeting ligand has the potential to overcome drug resistance because the receptor-ligand conjugate enters the cell through receptor-mediated entrapment as described above. Therefore, in the case of folate receptor-targeted pH sensitive polymeric micelle containing DOX and transferrin-conjugated paclitaxel-loaded NPs, the growth inhibitory effect on drug resistant MCF-7 cells and/or xenografts is superior to that of free drugs.
  • 'conjugate' refers to a compound or polymer in which a ligand and a drug are connected to each other through a covalent bond.
  • the concentration of the drug in the aqueous solution of the conjugate is not particularly limited, but it is preferably higher than the concentration capable of exerting an effect in vivo when released from the particle formulation, and excessive aggregation or inactivation occurs between the conjugates during dissolution or particle formulation It is preferable that the concentration is less than or equal to the For example, it may be 0.01 mg/ml or more and 1000 mg/ml. It provides a nano-sized nucleic acid complex comprising the amphipathic nucleic acid molecule.
  • the ligand may be a molecule specific to a target cell to which a drug is to be delivered.
  • the targeting ligand is a cancer cell, a cancer stem cell, or a ligand that specifically reacts to a cancer marker is a target-directed ligand. It means a cancer-specific binding component that gives The ligand is a compound that binds to the cell surface, an aptamer, an antibody, a peptide, and the like.
  • the cancer-targeting ligand may be a cancer-targeting aptamer such as HER2, a compound such as folate, a cancer-targeting peptide such as Arg-Gly-Asp (RGD) peptide, or a cancer-targeting antibody.
  • the ligand is an aptamer, and more preferably, the DNA-ligand conjugate may be formed by binding the terminal -SH group of the adapter to the terminal -SH group of the DNA. More preferably, the DNA consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the conjugate includes an aptamer-attached active agent or a prodrug thereof.
  • the conjugate is a conjugate between a single active agent and a single aptamer, e.g., structures AB and A-(B)n, wherein A is an aptamer, B is a nucleic acid and a nucleotide therapeutic agent, and (B)n is one or more drugs. It is a loaded single-stranded nucleic acid or a continuum activator of nucleotide analogues, n is an integer from 1 to 50, 2 to 20, more preferably 1 to 5).
  • the active agent B is a prodrug wherein at least one of a nucleoside or a nucleoside analog or a heterocyclic derivative thereof is pharmaceutically active, and a chain of a monomeric nucleoside, a nucleoside analog, or a basic nucleoside.
  • Useful polymeric compounds are disclosed wherein nucleosides, nucleoside analogs or abasic nucleosides are linked by phosphodiester groups, phosphorothioate groups or H, alkyl or alkenyl phosphonate groups.
  • Formula AB conjugates may be derived from a chain of pharmaceutically active or therapeutic monomeric nucleosides or nucleoside analogs linked by phosphodiester (pO), phosphorothionate (pS) or H- or alkyl or alkenyl phosphonates. formed polynucleotide compounds.
  • the chain comprises 2 to 100 (more preferably 2 to 35) therapeutic monomeric nucleosides, nucleoside analogs or unsubstituted nucleosides.
  • the present invention contemplates polynucleotides containing mixed phosphodiester and phosphorothioate linkages, as shown below. Oligomers with pS linkages are more stable than oligomers with pO linkages, and consequently pS oligomers degrade at a slower rate than oligomers with pO linkages. S. T. Crooke, Oligonucleotide Therapeutics, Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th ed., Ed. M. E. Wolff 863-900, 1995) and further documents cited therein.
  • the conjugate comprises an active agent or a prodrug thereof attached to the aptamer by a linker.
  • the conjugate is a conjugate between a single active agent and a single aptamer, eg, a conjugate having the structure A-C-B, wherein A is the aptamer, B is the active agent, and C is the linker.
  • the conjugate comprises a structure in which the polymer is attached by a linker in addition to the active agent or prodrug thereof attached to the aptamer by a linker.
  • the conjugate is a single active agent, a conjugate between a single aptamer and a homopolymer, e.g., a conjugate having the structure A-C-B-C-D, wherein A is an aptamer, B is an activator, C is a linker, and D is a polymer.
  • the conjugate comprises one or more aptamers, one or more linkers, one or more active agents, or any combination thereof.
  • the conjugate can have any number of aptamers, linkers, and active agents.
  • the conjugate has the structure ACBCA, (AC)nZ, A-(CB)n, AC-(B)n, (ACB)n, (ACBC)nB, wherein A is an aptamer, C is a linker, and B is activator, and n is an integer from 1 to 50, 2 to 20, more preferably 1 to 5).
  • Each of A, B, and C may be the same or different, for example, the conjugate may comprise one or more types of aptamers, one or more types of linkers, and/or one or more types of active agents.
  • the conjugate may comprise one or more aptamers attached to a single active agent.
  • the conjugate may comprise an active agent with multiple aptamers each attached to a different linker.
  • the conjugate may have the structure A-C-B-C-A, wherein each A is an aptamer, which may be the same or different, each C is a linker, which may be the same or different, and B is an active agent.
  • the conjugate may comprise one or more active agents attached to a single aptamer.
  • the conjugate may comprise an aptamer having multiple active agents, each attached via a different linker.
  • the conjugate may have the structure B-C-A-C-B, wherein A is an aptamer, each C is a linker, which may be the same or different, and each B is an active agent, which may be the same or different.
  • Aptamers refer to oligonucleotides or peptides that can bind target antigens with high specificity and affinity, and have a unique three-dimensional structure. It has been used as a diagnostic and therapeutic agent itself, and also as a specific ligand to increase selectivity in drug delivery systems.
  • docetaxel-incorporated nanoparticles prepared using an aptamer capable of targeting prostate specific membrane antigen, free drug (docetaxel) or double structure nanoparticles (PLGA-Docetaxel) On the other hand, the tumor growth inhibitory effect was more excellent, and the toxicity such as leukocyte reduction or weight loss was less.
  • Aptamers are specific ligands for target compounds or molecules that have high specific binding to target molecules.
  • the "SELEXTM” Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment
  • the SELEX method relates to the in vitro development of a nucleic acid molecule having high specific binding ability to a target molecule.
  • the SELEX method by increasing the number of rounds or using a competitive substance, an aptamer having a stronger binding force to the target substance is concentrated and selected. Therefore, by adjusting the number of rounds of SELEX and/or changing the competition state, aptamers with different binding strength, aptamers with different binding forms, and aptamers with the same binding force or binding form but different nucleotide sequences may be obtained.
  • the SELEX method includes an amplification process by PCR, and in the process, SELEX with more diversity can be performed by adding a mutation such as using a manganese ion.
  • the aptamer obtained from SELEX is a nucleic acid having high affinity for the target substance, and it does not mean binding to the active site of the target substance. Therefore, the aptamer obtained from SELEX does not necessarily act on the function of the target substance.
  • SELEX can also be performed by changing the primer in order to obtain an aptamer having a higher activity.
  • a specific method is to prepare a template in which a part of an aptamer whose sequence has been determined as a random sequence or a template doped with about 10 to 30% of a random sequence, and perform SELEX again.
  • the aptamer obtained by SELEX has a length of about 80 nucleotides, and it is difficult to use it as a drug as it is. Therefore, it is necessary to repeat trial and error to shorten it to a length of about 50 nucleotides or less that can be easily chemically synthesized.
  • the aptamer obtained by SELEX changes the ease of subsequent minimization according to the primer design. If the primer is not well designed, even if an active aptamer can be selected by SELEX, subsequent development becomes impossible.
  • SELEX methods allow nucleic acids to act as ligands (i.e., to form specific binding pairs) with virtually any chemical compound (whether monomer or polymer), with sufficient ability to form a variety of two-dimensional and three-dimensional structures. It is based on the fact that it has sufficient chemical versatility in the monomer. Molecules of any size or composition can be used as targets.
  • Aptamers are nucleic acid molecules that exhibit a high degree of specific binding affinity for the molecule through interactions other than classical Watson-Crick base pairing.
  • the aptamer is capable of modulating the activity of the target by specifically binding to the selected target, for example, it can block the action ability of the target through aptamer binding.
  • Aptamers corresponding to proteins including growth factors, transcription factors, enzymes, immunoglobulins and receptors have been generated from a pool of random sequence oligonucleotides by an in vitro selection process.
  • a typical aptamer is 10-15 kDa (30-45 nucleotides) in size, binds its target with sub-nanomolar affinity, and exhibits differentiation against closely related targets (eg, aptamers are typically in the same gene family) does not bind to other proteins belonging to
  • aptamers have the same types of binding interactions (e.g., hydrogen bonding, electrostatic complementarity, hydrophobic contact, steric exclusion) that confer affinity and high selective binding in antibody-antigen complexes. appeared to be available. Aptamers possess a number of characteristics that make them desirable for use as therapeutics and diagnostics, including high selectivity and affinity, biological efficacy and good pharmacokinetic properties. In addition, aptamers have specific competitive advantages over antibodies and other biological proteins, as exemplified below.
  • Aptamers are produced by ex vivo methods that allow for early, rapid leads, including therapeutic leads. In vitro selection can tightly control the selectivity and affinity of aptamers, and allows generation of leads, including leads to both toxic and non-immunogenic targets.
  • aptamer group demonstrated therapeutically acceptable toxicity and lacked immunogenicity.
  • Administration of high doses of aptamer (10 mg/kg per day for 90 days) to rats or woodchucks does not show any toxicity by any clinical, cellular or biochemical measures.
  • aptamers cannot be presented by T-cells via the Major Histocompatibility Complex (MHC), and the immune response is usually Since nucleic acid fragments are adapted not to be recognized, it appears extremely difficult to elicit antibodies against aptamers.
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • aptamers can be administered by subcutaneous injection (monkey studies have shown that The biocompatibility was >80% (Tucker et al., J. Chromatography B. 732: 203-212, 1999). This difference is primarily due to the fact that the solubility is relatively low and the volume required for most therapeutic mAbs is large. Since the aptamer has good solubility (>150 mg/ml) and relatively low molecular weight (aptamer: 10-50 kDa; antibody: 150 kDa), it can be administered by weekly injection in a dose of less than 0.5 ml.
  • the small size of the aptamer is impenetrable in the case of an antibody or antibody fragment, and can also penetrate into a conformational constriction site, which is suggested as another advantage of the treatment or prophylaxis method by the aptamer.
  • Aptamers are chemically robust. Since aptamers essentially regain activity after exposure to factors such as heat and denaturants, they can be stored for a long period of time (more than 1 year) at room temperature in the form of a lyophilized powder.
  • the aptamer Since the aptamer is chemically synthesized, it is easy to modify.
  • the aptamer predicts the secondary structure using the MFOLD program or predicts the three-dimensional structure by X-ray analysis or NMR analysis. have.
  • An aptamer of a predicted new sequence can be easily chemically synthesized, and whether the aptamer maintains activity can be confirmed by an existing assay system.
  • an important part for binding of the obtained aptamer to the target substance can be specified by repeating trial and error as described above, even if new sequences are added to both ends of the sequence, the activity does not change in many cases.
  • the length of the new sequence is not particularly limited.
  • the aptamer of the present invention is an important part in inhibiting binding to HER2 by binding to HER2, even if new sequences are added to both ends of these sequences, activity does not change in many cases.
  • the modification can be highly designed or modified.
  • the aptamer can be highly designed or modified.
  • the present invention also provides an aptamer comprising a predetermined sequence (e.g., a sequence corresponding to a portion selected from a stem portion, an inner loop portion, a hairpin loop portion and a single chain portion: hereinafter omitted as a fixed sequence if necessary)
  • a predetermined sequence e.g., a sequence corresponding to a portion selected from a stem portion, an inner loop portion, a hairpin loop portion and a single chain portion: hereinafter omitted as a fixed sequence if necessary.
  • the present invention also provides a conjugate comprising an aptamer of the present invention and an active agent bound thereto.
  • the bond between the aptamer and the active agent in the conjugate of the present invention may be a covalent bond or a non-covalent bond.
  • the conjugate of the present invention may be a combination of the aptamer of the present invention and one or more (eg, two or three) homologous or heterogeneous active agents.
  • the active agent is not particularly limited as long as it can newly add any function to the aptamer of the present invention or change (eg, improve) any property that the aptamer of the present invention can maintain.
  • the aptamers and conjugates of the present invention can be used as, for example, pharmaceuticals or diagnostic drugs, test drugs, reagents, additives in beverages or foods, enhancers, and emollients.
  • the conjugate comprises at least one active agent.
  • the conjugates may comprise one or more active agents, which may be the same or different.
  • the active agent may be a therapeutic agent, a prophylactic agent, a diagnostic agent, or a nutritional agent.
  • a variety of active agents are known in the art and can be used in conjugates.
  • the active agent may be a protein or peptide, a nucleotide analog, a small molecule, a nucleic acid or nucleic acid molecule, a lipid, a sugar, a glycolipid, a glycoprotein, a lipoprotein, or a combination thereof.
  • the active agent is an antigen or adjuvant, a radioactive or imaging agent (eg, a fluorescent molecule) or a polynucleotide.
  • the active agent is an organometallic compound.
  • the active agent examples include proteins, peptides, amino acids, lipids, carbohydrates, monosaccharides, polynucleotides, and nucleotides.
  • the activator also includes, for example, an affinity substance (eg, biotin, streptavidin, a polynucleotide having affinity for a target complementary sequence, an antibody, glutathione sepharose, histidine), a labeling substance (eg, a fluorescent substance, a luminescent substance).
  • an affinity substance eg, biotin, streptavidin, a polynucleotide having affinity for a target complementary sequence, an antibody, glutathione sepharose, histidine
  • a labeling substance eg, a fluorescent substance, a luminescent substance.
  • radioisotopes examples include radioisotopes, enzymes (eg horseradish peroxidase, alkaline phosphadase), drug delivery media (eg liposomes, microspheres, peptides, polyethylene glycols), drugs (eg, calicheamicin or duo) Calmycin, etc.
  • enzymes eg horseradish peroxidase, alkaline phosphadase
  • drug delivery media eg liposomes, microspheres, peptides, polyethylene glycols
  • drugs eg, calicheamicin or duo
  • Nitrogen mustard analogues such as cyclophosphamide, melphalan, ifosfamide or troposphamide; , alkylating agents such as temozolomide or dacarbazine, folate-like metabolites such as methotrexate or raltitrexed, purine analogues such as thioguanine, cladribine or fludarabine, fluorouracil, tegafur or gemcitabine pyrimidine analogues, vinca alkaloids and analogues such as vinblastine, vincristine or vinorelbine, podophyllotoxin derivatives such as etoposide, taxane, docetaxel or paclitaxel, doxorubicin, epirubicin, idarubicin and mitoxantrone anthracyclines and analogs such as, other cytotoxic antibiotics such as bleomycin and mitomycin, platinum compounds such as c
  • peptides that can be recognized and cleaved by enzymes such as thrombin, matrix-metalloproteinase (MMP), and FactorX
  • polynucleotides that can be cleaved by nucleases or restriction enzymes may be used.
  • nucleotide refers to a cyclic nitrogen-containing base (also known as aglycone) consisting of carbon, hydrogen, oxygen and nitrogen (pyrimidine or purine), pentose (deoxyribose, ribose, arabinose), xylose or redoxin) or a hexose sugar moiety and a phosphate group (phosphorous acid).
  • aglycone also known as aglycone
  • pentose deoxyribose, ribose, arabinose
  • xylose or redoxin a hexose sugar moiety
  • phosphate group phosphorous acid
  • polynucleotide refers to a chain of nucleotides and nucleoside compounds, and is used interchangeably with the terms “polymer”, “oligonucleotide” and “oligo”.
  • oligomer refers to an oligonucleotide of progressively shorter length relative to the starting oligonucleotide. Oligomers can be generated in vitro and in vivo as a result of partial degradation or cleavage of oligonucleotides.
  • nucleoside includes a pentose (deoxyribose, ribose, arabinose, xylose or redoxin) or nitrogen-containing base moiety (purine or pyrimidine base) linked to a hexose sugar moiety. means molecules. Typical purine or pyrimidine bases that form nucleosides include adenine, guanine, cytosine, 5-methyl cytosine, uracil and thymine. As used herein, the term “nucleoside” includes nucleosides substituted with optionally substituted nucleosides, eg, halogens, eg, fluorine. As used herein, the term “nucleoside” also includes molecules having optionally substituted heterocyclic and sugar moieties substituted with halogens such as fluorine.
  • nucleoside analog refers to a non-naturally occurring molecule or synthetically produced compound that has been modified independently or together with the sugar and base moieties of a "nucleoside” as defined above.
  • exemplary nucleoside analogs include acyclovir, valacyclovir, fenchlor, pacicyclovir, ganciclovir, cidofovir, adefovir, robukavir and ribavirin and the carbacil group and the L-nucleoside class. .
  • unsubstituted nucleoside refers to a nucleoside lacking a nucleobase attached at the 1′-carbon atom of the sugar moiety.
  • the sugar hydroxyl group of an unsubstituted nucleoside can be variably derivatized, i.e., the hydroxyl group can be esterified or substituted with a desired functional group or protecting group.
  • Suitable substituents include C1-35 straight or branched chain, substituted or unsubstituted alkoxy or alkyl; C3-35 substituted or unsubstituted cycloalkyl or cycloalkoxy; C2-35 substituted or unsubstituted alkenyl or alkenyl oxy group; or halogen.
  • An alkoxy, alkyl, alkeneoxy, alkenyl, cycloalkoxy or cycloalkyl group may be substituted with one or more hydroxyl, amino or alkoxy groups, or may be substituted with one or more O, N or S atoms in the hydrocarbon chain.
  • Preferred alkyl groups are substituted or unsubstituted C1-20 alkyl groups, more preferably C1-12 alkyl groups such as substituted or unsubstituted methyl, ethyl and isopropyl.
  • Preferred alkoxy groups are substituted or unsubstituted C1-20 alkoxy groups more preferably C1-12 alkoxy groups such as substituted or unsubstituted methoxy, ethoxy and isopropyl oxy.
  • Exemplary substituents include methoxy ethyl and dimethyl amino ethyl.
  • Preferred alkenyl and alkenyl oxy groups have 2 to 10 carbon atoms rather than 2 to 20 carbon atoms.
  • heterocyclic derivative refers to a derivative of a nucleoside or nucleoside analog.
  • exemplary heterocyclic derivatives include “nucleoside bases,” which are basic molecules comprising a nitrogen-containing base moiety (purine or pyrimidine). The term includes optionally substituted nucleoside bases such as those substituted with halogen, for example fluorine.
  • exemplary heterocyclic derivatives having therapeutic activity include 6-mercaptopurine, azathioprine, 5-fluorouracil and thioguanine.
  • pharmaceutically active agent refers to a compound or molecule having demonstrated therapeutic or pharmaceutical activity, such as, but not limited to, antiviral, antibacterial or anticancer activity.
  • Suitable pharmaceutically active agents are those having a polymerizable moiety such as a hydroxyl, amino, carboxylic acid or alkenyl group.
  • nucleoside therapeutic agent refers to a nucleoside or nucleoside analog having demonstrated therapeutic or pharmaceutical activity, such as antiviral, antibacterial or anticancer activity.
  • Suitable nucleoside therapeutics are those having a polymerizable moiety such as a hydroxyl group.
  • the pentose moiety may be substituted with a hydroxyl group at the 3' or 5' position.
  • Exemplary monomeric nucleoside therapeutics contemplated by the present invention are adefovir, cidofivir, cladribine (also known as leustatin), cytarabine, dosifluridine, enocytabine (benoylcytosine arabicidro also known), floxurin, fludarabine phosphate, gemcitabine and pentostatin; These include antiviral agents such as bioxin and ribavirin.
  • phosphodiester refers to the bond -PO4 used to link nucleoside monomers.
  • a phosphodiester bond (“PO”) contemplated herein is a bond found in naturally occurring DNA. Examples of nucleic acids linked by phosphodiester bonds are shown in Formula 4 below.
  • phosphorothioate refers to the bond -PO3(S) used to link the nucleoside monomer.
  • the phosphorothioate (“pS”) linkage contains a sulfur atom instead of an oxygen atom on the phosphoester linkage as shown in formula (4).
  • H-, alkyl or alkenyl phosphonate refers to a bond -PO3R- used to link a nucleoside, nucleoside analog, or enucleated nucleoside monomer.
  • the H-phosphonate bond contains a hydrogen atom bonded to phosphorus instead of an oxygen atom like the phosphodiester bond described above.
  • An alkyl phosphonate bond (R-pO) contains a carbon atom bonded to a phosphorus atom instead of an oxygen atom.
  • Suitable alkyl groups are C1-35 linear or branched chain alkyl groups, preferably C1-20, more preferably C1-5 linear or branched alkyl groups.
  • Suitable alkenyl groups are C2-35 linear or branched chain alkenyl, preferably C2-20, more preferably C1-5 linear or branched chain alkenyl.
  • homopolymer refers to a polynucleotide compound in which both the nucleotide and the linker are identical.
  • HO-[dN-PO2X]n-OH is equal to each nucleotide "dN" and each X equal.
  • heteropolymer refers to a polynucleotide compound in which each of the nucleotides or linkers within a chain is not identical.
  • HO-[dN-PO2X]n-OH has different nucleotide "dN” or bond "PO2X” along the chain.
  • the present invention may also include polymeric compounds formed from chains of pharmaceutically active molecules linked by pharmaceutically inactive bonds.
  • the pharmaceutically active molecule is a therapeutic monomeric nucleoside, nucleoside analog, enucleated nucleoside, or heterologous, separated along the chain by a nuclease resistant moiety such as 2'O-methyl ribonucleoside. It is a cyclic derivative.
  • Monomer groups may be linked along the chain by phosphodiester (pO), phosphorothionate (pS) or alkyl or alkenyl phosphonate (R-pO) groups.
  • the chain comprises 2 to 100 (more preferably 2 to 35) therapeutic monomeric nucleosides, nucleoside analogs, enucleated nucleosides or heterocyclic derivatives thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutically active or therapeutic monomeric nucleoside or nucleoside analog linked by a phosphodiester (pO), phosphorothionate (pS) or H- or alkyl or alkenyl phosphonate. It relates to a polynucleotide compound formed from a chain of In a preferred embodiment, the chain comprises 2 to 100 (more preferably 2 to 35) therapeutic monomeric nucleosides, nucleoside analogs or unsubstituted nucleosides.
  • the present invention contemplates polynucleotides containing mixed phosphodiester and phosphorothioate linkages, as shown below. Oligomers with pS linkages are more stable than oligomers with pO linkages, and consequently pS oligomers degrade at a slower rate than oligomers with pO linkages.
  • the present invention uses alternating chains of therapeutically active nucleosides or nucleoside analogs and nuclease resistant moieties (eg, demineralized 2'O-methyl nucleosides) to modulate the release rate of nucleoside therapeutics. It is contemplated to form polynucleotides containing the ability to The structure of alternating segments of a therapeutically active nucleoside or nucleoside analog and a nuclease resistant moiety (eg, a basic 2'O-methyl nucleoside) can be modified to achieve the desired release of the therapeutic agent. .
  • nuclease resistant moieties eg, demineralized 2'O-methyl nucleosides
  • the active agent may be an anti-infective agent.
  • Certain therapeutic agents can inhibit the establishment or growth (systemic or local) of a tumor or infection. Examples include boron-containing compounds (eg, carborane), chemotherapeutic nucleotides, drugs (eg, antibiotics, antiviral agents, antifungal agents), endoynes (eg, calicheamicin, esperamicin, poly inemisin, neocarzinostatin chromophore, and kedarcidin chromophore), heavy metal complexes (eg cisplatin), hormone antagonists (eg tamoxifen), nonspecific (non-antibody) proteins (eg sugar oligomers) , oligonucleotides (eg, antisense oligonucleotides that bind to a target nucleic acid sequence (eg, mRNA sequence)), peptides, photodynamic agents (eg, rhodamine 123), radion
  • the therapeutic agent may be a small molecule, a radionuclide, a toxin, a hormone antagonist, a heavy metal complex, an oligonucleotide, a chemotherapeutic agent nucleotide, a peptide, a non-specific (non-antibody) protein, a boron compound, or an endoyne.
  • the active agent may treat or prevent the establishment or growth of a bacterial infection.
  • the therapeutic agent may be an antibiotic, a radionuclide or an oligonucleotide.
  • the active agent may treat or prevent the establishment or growth of a viral infection, for example, the active agent may be an antibiotic compound, a radionuclide or an oligonucleotide.
  • the active agent may treat or prevent the establishment or growth of a fungal infection, for example, the active agent may be an antifungal compound, a radionuclide or an oligonucleotide.
  • the active agent may be a cancer therapeutic agent.
  • the cancer therapeutic agent is a death receptor agonist, such as a TNF-associated apoptosis-inducing aptamer (TRAIL) or Fas aptamer, or any aptamer or antibody that binds or activates a death receptor or otherwise induces apoptosis.
  • TRAIL TNF-associated apoptosis-inducing aptamer
  • Fas aptamer Fas aptamer
  • Suitable death receptors include, but are not limited to, TNFR1, Fas, DR3, DR4, DR5, DR6, LT ⁇ R, and combinations thereof.
  • Typical cancer therapeutics such as chemotherapeutic agents, cytokines, chemokines, and radiotherapeutic agents, can be used as active agents.
  • Most chemotherapeutic drugs can be divided into alkylating agents, antimetabolites, anthracyclines, plant alkaloids, topoisomerase inhibitors, and other antitumor agents. All of these drugs affect cell division or DNA synthesis and function in some way.
  • Additional therapeutic agents that may be used as active agents include monoclonal antibodies and tyrosine kinase inhibitors such as imatinib mesylate (GLEEVEC® or GLIVEC®), which are molecularly abnormal in certain types of cancer (chronic myeloid leukemia, gastrointestinal stromal tumors). directly target
  • chemotherapeutic agents include cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, mechlorethamine, cyclophosphamide, chlorambucil, vincristine, vinblastine, vinorelbine, vindesine, taxol and derivatives thereof, irinotecan, topotecan, Amsacrine, etoposide, etoposide phosphate, teniposide, epipodophyllotoxin, trastuzumab (HERCEPTIN®), cetuximab, and rituximab (RITUXAN® or MABTHERA®), bevacizumab (AVASTIN®) , and combinations thereof. Any of these can be used as the active agent in the conjugate.
  • the active agent is DM1, doxorubicin, a nucleoside therapeutic agent, or a pharmaceutically acceptable salt.
  • conjugates are a class of therapeutic agents that combine the specificity of a ligand comprising an aptamer with the potential of active agents.
  • Conjugates take advantage of the properties of both components and significantly broaden the therapeutic index of active agents by maximizing delivery of active agents to the target lesion, thereby increasing therapeutic efficacy, while minimizing toxicity associated with systemic exposure.
  • Target molecule selection, conjugate internalization by tumor cells and the potential of activator drugs are parameters for conjugate development (Carter 2008, Teicher 2009).
  • the design of chemical linkers to covalently attach to these building blocks to form conjugates also plays a major role in the development of conjugates (Ducry 2010).
  • linkers must be stable in the bloodstream to limit damage to healthy tissue. Degradation or disruption of the conjugate may release the active agent prior to delivery to the target sites. However, once the conjugate has reached the target sites, the conjugate must efficiently release the active agent in its active form. The balance between intraplasmic stability and efficient drug release in target cells has not yet been elucidated, but may depend on linker design.
  • linkers are applied in the design of the conjugate: chemically-variable linkers, enzyme-variable linkers and non-cleavable linkers.
  • the linker is preferably cleaved in vivo by the biological environment. Separation can be from any process without limitation, eg, enzymatic, reductive, pH, and the like.
  • the cleavable group is selected such that activation occurs at the desired site of action, which may be a site in or near a target cell (eg, carcinoma cell) or tissue, such as a site of therapeutic action or marker activity.
  • cleavage may be enzymatic, and exemplary enzymatically cleavable groups include nucleotide sequences that end with a native nucleotide and are attached to a linker at its phosphate end.
  • cleavable linkers are those in which at least about 10%, most preferably at least about 35% of the cleavable groups are cleaved from the bloodstream within 24 hours of administration.
  • Enzyme-variable linkers take an alternative approach to achieve control of active agent release - the different activities of proteases inside and outside the cell. Proteases normally do not act outside the cell due to unfavorable pH conditions and the presence of serum protease inhibitors.
  • the active agent may be conjugated via binding to a ligand. Active agents can be specifically cleaved from antibodies by the action of lysosomal proteases present inside cells and at elevated levels in certain types of tumors (Koblinsk et al). Compared to conjugates with chemically-variable linkers, enzyme-variable linkers can achieve better control of the release of the active agent. However, the associated increased hydrophobicity of some enzyme-variable linkers can lead to aggregation of the conjugates, particularly with strongly hydrophobic active agents.
  • a third class of linkers are non-cleavable linkers. Release of the active agent is believed to occur through internalization of the conjugate and subsequent degradation of the ligand component in the lysosome, resulting in release of the active agent still attached to the linker. Although these non-cleavable linkers are stable in serum, compared to enzyme-variable linkers, no bystander effect can be induced due to the fact that the released active agent is charged and cannot diffuse into neighboring cells. In addition, since internalization of the conjugate is a factor for the release of the active agent, the efficiency is target molecule- (and thus ligand-) dependent.
  • a “linker” is a molecule having two functional ends, one for binding or otherwise associating to a biological molecule or fragment thereof, such as a ligand comprising an aptamer, and the other for conjugation to an active agent.
  • a linker may be connected between the ligand and the active agent.
  • the linker may include a spacer moiety and a functional group. If the spacer portion is too long, it cannot be used due to its high hydrophobicity, so a C1-C6 straight-chain or branched alkylene group, preferably a C1-C6 straight-chain alkylene group, is suitable as the spacer portion.
  • the spacer may be methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, or hexylene.
  • a functional group is introduced to connect the active agent and the aptamer, and the functional group is a group that connects the aptamer and the active agent, and includes all functional groups capable of binding the aptamer and the active agent.
  • the functional group may be an amine group (-NH2) or a sulfhydryl group (-SH, sulfhydryl), and the functional group may form a covalent bond between the aptamer and the activator.
  • Conjugates include one or more linkers that attach the active agent and the aptamer.
  • the linker may bind to an active agent and an aptamer to form a conjugate, wherein the conjugate releases at least one active agent upon delivery to a target cell.
  • a particle comprising one or more conjugates may be a polymeric particle, a lipid particle, a solid lipid particle, an inorganic particle, or a combination thereof (eg, a lipid stabilized polymeric particle).
  • the particles are polymeric particles or comprise a polymeric matrix.
  • the particles may comprise any of the polymers described herein or derivatives or copolymers thereof.
  • the particles will generally comprise one or more biocompatible polymers.
  • the polymer may be a biodegradable polymer.
  • the polymer may be a hydrophobic polymer, a hydrophilic polymer, or an amphoteric polymer.
  • the particles comprise one or more polymers having additional aptamers attached thereto.
  • the size of the particles can be adjusted for the intended application.
  • the particles may be nanoparticles or microparticles, but nanoparticles are preferred.
  • the particles may have a diameter of from about 10 nm to about 10 ⁇ m, from about 10 nm to about 1 ⁇ m, from about 10 nm to about 500 nm, from about 20 nm to about 500 nm, or from about 25 nm to about 250 nm. In a preferred embodiment, the particles are nanoparticles having a diameter of about 25 nm to about 250 nm.
  • the particle may be a nanoparticle, ie, the particle has a characteristic dimension of less than about 1 ⁇ m, wherein the characteristic dimension of the particle is the diameter of a perfect sphere having the same volume as the particle.
  • the plurality of particles may be characterized by an average diameter (eg, an average diameter for the plurality of particles).
  • the particle diameter may have a Gaussian-type distribution.
  • the particles have a zeta potential close to 0 mV, a zeta potential value of +5 to -5 mV, and a zero/neutral or small -ve surface charge at low to zero ionic strengths (1 to 10 mM), from 40 to 120 has a size of nm.
  • nanoparticles are small, that is, large enough to not pass through normal blood vessels during blood circulation, and small enough to avoid macrophage phagocytosis.
  • the size of the fenestra of Kupffer cells located in the liver and sinusoid of the spleen is between 150 and 200 nm, and the distance between endothelial cells of blood vessels distributed in the tumor is between 100 and 600 nm. Therefore, the size of nanoparticles must be less than 100 nm in order to reach the tumor through these two types of characteristic vascular structures.
  • nanoparticles having a non-modified surface that is, having a hydrophobic surface
  • macrophages located in the reticulo-endothelial system such as the liver and spleen.
  • the fate of the administered nanoparticles depends on how to optimize their size and surface properties to cross these immunological barriers.
  • nanoparticles In addition to size, surface properties are also important factors influencing the fate and lifespan of nanoparticles during blood circulation.
  • Plasma proteins such as fibronectin, complements, and IgG are attached to nanoparticles with a hydrophobic surface in the bloodstream (opsonization), and these (opsonins) are recognized by macrophages of the reticuloendothelial system.
  • opsonins are recognized by macrophages of the reticuloendothelial system.
  • the nanoparticles are phagocytosed and removed. will become Therefore, it is essential to make the surface of nanoparticles hydrophilic in order to escape from the predation of these macrophages.
  • nanoparticles that avoid predation of the reticuloendothelial system can remain in the blood circulation for a long time, giving them the opportunity to reach the target tumor tissue. Due to the unique pathological characteristics of blood vessels distributed in the tumor tissue, polymers including nanoparticles can be selectively integrated only in the tumor tissue.
  • a rapidly growing tumor requires a large amount of nutrients and oxygen to maintain its metabolic function, thus causing the creation of new blood vessels to supply the nutrients and oxygen and rearrangement of existing blood vessels.
  • an imbalance between growth factors and angiogenesis regulators such as matrix metalloproteinases (MMPs) is caused, resulting in the formed tumor blood vessels expanding and showing an incomplete shape with multiple pores. Therefore, the gap between the endothelial cells is widened and lymphatic drainage is impaired.
  • MMPs matrix metalloproteinases
  • tumor cells mainly use glycolysis as a metabolic function in a hypoxic environment to supplement additional energy, resulting in an acidic environment.
  • Tumor-activated pro-drug therapy is an example of a nanoparticle made by linking albumin, a carrier, and doxorubicin, an anticancer drug, with an octapeptide sequence (linker) that is specifically degraded by MMP-2.
  • linker an octapeptide sequence that is specifically degraded by MMP-2.
  • MMP-2 octapeptide sequence
  • the form of liposomes using a substance sensitive to acidity is also an example of a passive targeting mechanism. As described above, acid-sensitive liposomes show stability within the physiological acidity range of pH 7.4, but are designed to be decomposed to liberate the active drug in the case of acidity such as the surrounding environment of tumor tissue.
  • passive targeting mechanisms using “permeation increase and retention effects” and “peri-tumor specific microenvironment” are obviously mechanisms that can selectively target tumor tissues, but only specifically target tumor cells at the cellular level. There is a limit to targeting.
  • drugs that have escaped blood vessels due to lymphatic drainage disorders can be retained in the tumor stroma, while on the other hand, increase the osmotic pressure in the interstitium. As a result, an outward flow occurs within the cell, preventing the influx of the drug released from the interstitium into the cell.
  • the enzyme to activate the drug is actually expressed in sufficient amount from the tumor. or that it is not secreted. Therefore, it is clear that drug delivery systems that rely only on passive targeting mechanisms inevitably have limitations in terms of specificity.
  • target nanoparticle in which a target ligand or antibody is bound to a carrier-drug dual structure nanoparticle has been attempted.
  • These target nanoparticles can recognize and selectively bind receptors or antigens that are overexpressed or expressed only in tumor cells compared to normal cells.
  • Particles are microparticles and microspheres, which are microscopic round spheres containing a specific drug and generally have a size of 1 mm or less (1,000 ⁇ m).
  • the drug is absorbed or chemically bound to the surface of the polymer matrix, or encapsulated in a hole or channel in the matrix.
  • microsphere preparation method is o / w emulsification solvent evaporation method is used.
  • organic solvent that is immiscible with an aqueous solution is used, and this organic phase is dispersed in an aqueous solution containing an emulsifier (o/w). The resulting mixed solution is stirred and freeze-dried.
  • the emulsifier used at this time is gelatin, methyl cellulose (MC), polyvinyl alcohol (PVA), cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB), sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium lauryl sulfate (SLS), and sodium oleate. and the like, and their size decreases as their concentration increases during manufacture. Also, at the same concentration of 1%, the size of microspheres appears in the order of gelatin>MC>SDS>PVA>CTAB. As the concentration of PLGA increases, the size of microspheres decreases and a narrow distribution appears. The solubility of the drug in aqueous solution must be 0.02 mg/mL or less to produce reproducible microspheres with controlled sustained release. Among them, the widely used emulsifier is PVA.
  • the o/o emulsification solvent evaporation method is liquid paraffin or mineral oil containing an emulsifier such as DCM or acetonitrile as a solvent for dissolving PLGA and drugs (internal oil phase) and Span 40 as a continuous phase (external oil phase).
  • an emulsifier such as DCM or acetonitrile
  • Span 40 as a continuous phase (external oil phase).
  • the release shows a zero-order release behavior with or without excessive release in the initial stage.
  • the control of this sustained release profile is dependent on the stability of the polymer, the size of the microparticles, the initial inclusion amount of the drug, and the hydrophilic-hydrophobic ratio of the drug.
  • a multi-emulsification solvent evaporation method has been developed.
  • An aqueous drug solution containing gelatin and Tween 80 is mixed with aluminum stearate and Soybean containing Span 80 to make a w/o emulsion solution.
  • This w/o emulsion solution is poured into the PLGA/acetonitrile solution to make a w/o/o emulsion solution.
  • These two emulsions are added to the mineral oil containing span 80 using a narrow nozzle, and the acetonitrile is evaporated while stirring continuously.
  • polyphasic microspheres with high inclusion efficiency in water-soluble drugs such as phenylamine maleate chloride, procaine hydrochloride and promazine hydrochloride could be prepared.
  • the particles comprise one or more conjugates as described above.
  • the conjugate may be present inside the particle.
  • the particles may include one or more of the following polyesters. glycolic acid units (collectively referred to herein as “PGA”), and lactic acid units such as poly-L-lactic acid, poly-D-lactic acid, poly-D,L-lactic acid, poly-L-lactide, poly-D-lactide, and poly-D,L-lactide (collectively referred to herein as “PLA”), and caprolactone units such as poly(e-caprolactone) (collectively herein “ PCL”); and various forms of poly(lactic acid-co-glycolic acid) and poly(lactide-co-glycolide) characterized by lactic acid and glycolic acid units, such as the ratio of lactic acid:glycolic acid (collectively herein " PLGA”); and polyacrylates, and derivatives thereof.
  • PGA glycolic acid units
  • PLA lactic acid units
  • PCL poly(e-caprolactone)
  • PCL poly(e-caprolactone)
  • PCL poly(e-
  • Exemplary polymers are also copolymers of polyethylene glycol (PEG) and the aforementioned polyesters, such as various forms of PLGA-PEG or PLA-PEG copolymers (collectively referred to herein as “PEGylated polymers”). shown) are included.
  • PEGylated polymers such as various forms of PLGA-PEG or PLA-PEG copolymers (collectively referred to herein as “PEGylated polymers”). shown) are included.
  • the PEG moiety can be covalently associated with a polymer to yield a "pegylated polymer" by a cleavable linker.
  • the particles may include one or more hydrophilic polymers.
  • Hydrophilic polymers include cellulosic polymers such as starches and polysaccharides; hydrophilic polypeptides; poly(amino acids) such as poly-L-glutamic acid (PGS), gamma-polyglutamic acid, poly-L-aspartic acid, poly-L-serine, or poly-L-lysine; polyalkylene glycols and polyalkylene oxides such as polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol (PPG), and poly(ethylene oxide) (PEO); poly(oxyethylated polyol); poly(olefinic alcohols); polyvinylpyrrolidone); poly(hydroxyalkylmethacrylamide); poly(hydroxyalkyl methacrylate); poly(saccharide); poly(hydroxy acids); poly(vinyl alcohol), and copolymers thereof.
  • the particles may include one or more hydrophobic polymers.
  • suitable hydrophobic polymers include polyhydroxy acids such as poly(lactic acid), poly(glycolic acid), and poly(lactic acid-co-glycolic acid); polyhydroxyalkanoates such as poly3-hydroxybutyrate or poly4-hydroxybutyrate; polycaprolactone; poly(orthoester); polyanhydrides; poly(phosphazene); poly(lactide-co-caprolactone); polycarbonates such as tyrosine polycarbonate; polyamides (including synthetic and natural polyamides), polypeptides, and poly(amino acids); polyesteramide; Polyester; poly(dioxanone); poly(alkylene alkylates); hydrophobic polyethers; Polyurethane; polyether esters; polyacetal; polycyanoacrylate; polyacrylate; polymethyl methacrylate; polysiloxane; poly(oxyethylene)/poly(oxypropylene) copolymers; polyketal; polyphosphate; poly
  • the hydrophobic polymer is an aliphatic polyester.
  • the hydrophobic polymer is poly(lactic acid), poly(glycolic acid), or poly(lactic-co-glycolic acid).
  • the particles may comprise one or more biodegradable polymers.
  • Biodegradable polymers may include water-insoluble or poorly water-soluble polymers that are converted chemically or enzymatically into water-soluble substances in the body.
  • Biodegradable polymers may include soluble polymers crosslinked by hydrolysable crosslinking groups that render the crosslinked polymer insoluble or poorly water soluble.
  • the biodegradable polymer in the particle may be polyamide, polycarbonate, polyalkylene, polyalkylene glycol, polyalkylene oxide, polyalkylene terephthalate, polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, polyvinyl ester, polyvinyl halide, poly Vinylpyrrolidone, polyglycolide, polysiloxane, polyurethane and copolymers thereof, alkyl celluloses such as methyl cellulose and ethyl cellulose, hydroxyalkyl celluloses such as hydroxypropyl cellulose, hydroxy-propyl methyl cellulose, and hydroxybutyl methyl cellulose, cellulose ethers, cellulose esters, nitro cellulose, cellulose acetate, cellulose propionate, cellulose acetate butyrate, cellulose acetate phthalate, carboxyethyl cellulose, cellulose triacetate, cellulose sulfate sodium salt, acrylic acid and Polymers of methacrylic acid esters such as
  • the particles may include one or more amphoteric polymers.
  • the amphiphilic polymer may be a polymer comprising a hydrophobic polymer block and a hydrophilic polymer block.
  • the hydrophobic polymer block may include at least one of the hydrophobic polymer or a derivative or copolymer thereof.
  • the hydrophilic polymer block may include at least one of the hydrophilic polymer or a derivative or copolymer thereof.
  • the amphiphilic polymer is a di-block polymer comprising a hydrophobic end formed from a hydrophobic polymer and a hydrophilic end formed from a hydrophilic polymer.
  • a component may be attached to the hydrophobic end, to the hydrophilic end, or both.
  • the nanoparticles may include two or more amphoteric polymers.
  • a ligand that specifically binds to a specific cell/tissue may be bound to the polymer.
  • the particles may comprise one or more lipids or amphoteric compounds.
  • the particles can be liposomes, lipid micelles, solid lipid particles, or lipid-stabilized polymeric particles.
  • the lipid particles may be prepared from one lipid or a mixture of different lipids. Lipid particles are formed from one or more lipids and may be neutral, anionic, or cationic at physiological pH.
  • the lipid particles are preferably prepared from one or more biocompatible lipids.
  • the lipid particle may be formed from a combination of more than one lipid, for example, a charged lipid may be combined with a non-ionic or uncharged lipid at physiological pH.
  • the particles may be lipid micelles.
  • Lipid micelles for drug delivery are known in the art.
  • Lipid micelles can be formed, for example, as water-in-oil emulsions with a lipid surfactant.
  • An emulsion is a blend of two immiscible phases in which a surfactant is added to stabilize the dispersed droplets.
  • the lipid micelles are microemulsions.
  • Microemulsions are thermodynamically stable consisting of at least water, oil, and lipid surfactants that produce a transparent, thermodynamically stable system having a droplet size of less than 1 ⁇ m, from about 10 nm to about 500 nm, or from about 10 nm to about 250 nm. it is a system
  • Lipid micelles are generally useful for encapsulating hydrophobic active agents, including hydrophobic therapeutics, hydrophobic prophylactics, or hydrophobic diagnostics.
  • the particle may be a liposome.
  • Liposomes are small vesicles composed of an aqueous medium surrounded by lipids arranged in spherical bilayers. Liposomes can be classified as small unilamellar vesicles, large unilamellar vesicles, or multi-lamellar vesicles. Multilamellar liposomes contain multiple concentric lipid bilayers. Liposomes can be used to encapsulate agents by trapping a hydrophilic agent in an aqueous interior or between bilayers, or by trapping a hydrophobic agent within the bilayer.
  • the lipid micelles and liposomes typically have an aqueous center.
  • the aqueous core may comprise water or a mixture of water and alcohol.
  • Suitable alcohols include methanol, ethanol, propanol (eg isopropanol), butanol (eg n-butanol, isobutanol, sec-butanol, tert-butanol), pentanol (eg amyl alcohol, isobutyl carbinol), hexanol (eg 1-hexanol, 2-hexanol, 3-hexanol), heptanol (eg 1-heptanol, 2-heptanol, 3-heptanol) and 4-heptanol) or octanol (eg, 1-octanol) or combinations thereof.
  • Suitable neutral and anionic lipids include, but are not limited to, sterols and lipids such as cholesterol, phospholipids, lysolipids, lysophospholipids, sphingolipids or pegylated lipids.
  • Suitable cationic lipids include N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethyl ammonium salts, such as methylsulfate salts, also referred to as TAP lipids, It is not limited thereto.
  • Suitable solid lipids include, but are not limited to, highly saturated alcohols, higher fatty acids, sphingolipids, synthetic esters, and mono-, di-, and triglycerides of highly saturated fatty acids.
  • the solid lipid may comprise an aliphatic alcohol having from 10 to 40, preferably from 12 to 30 carbon atoms, for example cephotearyl alcohol.
  • the solid lipid may comprise higher fatty acids of 10 to 40, preferably 12 to 30 carbon atoms, such as stearic acid, palmitic acid, decanoic acid, and behenic acid.
  • the solid lipids are glycerides, including monoglycerides, diglycerides, and triglycerides of highly saturated fatty acids having from 10 to 40, preferably from 12 to 30 carbon atoms, such as glyceryl monostearate, glycerol behenate. , glycerol palmitostearate, glycerol trilauret, tricaprine, trilaurin, trimyristine, tripalitine, tristearin, and hydrogenated castor oil.
  • Suitable solid lipids may include cetyl palmitate, beeswax, or cyclodextrin.
  • the amphoteric compound is a phospholipid, such as 1,2 distearoyl-sn-, incorporated in a ratio of 0.01 to 60 (weight lipid/w polymer), most preferably 0.1 to 30 (weight lipid/w polymer).
  • Glycero-3-phosphoethanolamine DSPE
  • DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
  • DSPC distearoylphosphatidylcholine
  • DAPC diarachidoylphosphatidylcholine
  • DBPC dibehenoylphosphatidylcholine
  • DTPC ditricho sanoylphosphatidylcholine
  • DLPC dilignoseroylphatidylcholine
  • Phospholipids that can be used include phosphatidic acid, phosphatidyl choline with both saturated and unsaturated lipids, phosphatidyl ethanolamine, phosphatidylglycerol, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, lysophosphatidyl derivatives, cardiolipin, and ⁇ -acyl-y- alkyl phospholipids.
  • the particles may comprise one or more additional active agents in addition to those in the conjugate.
  • the additional active agent may be a therapeutic, prophylactic, diagnostic, or nutritional agent described above.
  • the additional active agent may be present in any amount by weight of the particle, e.g., 1% to 90%, 1% to 50%, 1% to 25%, 1% to 20%, 1% to 10% , or 5% to 10% (w/w). In one embodiment, the agent is incorporated in a 1% to 10% loading w/w.
  • the particle may include, in addition to the aptamer of the conjugate, one or more aptamers that target the particle to a specific organ, tissue, cell type, or subcellular compartment.
  • the additional aptamer may be present on the surface of the particle, inside the particle, or both. Additional aptamers may be immobilized on the surface of the particle, for example covalently bound to a polymer or lipid within the particle.
  • an additional aptamer is covalently linked to the amphoteric polymer or lipid such that the aptamer is oriented to the surface of the particle.
  • the particles may comprise a polysaccharide additive, preferably a polysaccharide additive having an ionizing group in the molecule, more preferably chitosan-glycolide, chondroitin sulfate or a combination thereof.
  • the particle according to the present invention contains a polysaccharide additive, preferably a polysaccharide additive having an ionizing group in the molecule, thereby forming an ionic complex by ionic bonding with the targeting drug, thereby buffering effect or neutralization.
  • a polysaccharide additive preferably a polysaccharide additive having an ionizing group in the molecule, thereby forming an ionic complex by ionic bonding with the targeting drug, thereby buffering effect or neutralization.
  • the ionizing group may exhibit basicity in an aqueous environment.
  • glycol chitosan or chondroitin sulfate may be used, but the present invention is not limited thereto.
  • glycol chitosan (hereinafter, also referred to as 'CS') added to prepare the particles according to the present invention.
  • the glycol chitosan includes a chitosan moiety having high biocompatibility, biodegradability and low immunity.
  • many studies have been conducted using the property of glycol chitosan to form self-aggregates for anticancer drugs.
  • such glycol chitosan changes the environment in the particles to an environment with high viscosity to prevent burst release of the targeted drug, thereby imparting sustained-release properties of drug delivery to the particles.
  • This sustained-release property can be very advantageously used in the field of drug delivery, because when the drug is rapidly released in the dosage form, the concentration of the targeted drug in the body rises rapidly, which causes an immune response in the body to cause side effects of the drug. Because the possibility exists.
  • Chondroitin sulfate added to the preparation of the particles according to the present invention is an acidic mucopolysaccharide present in cartilage, skin, cornea and placenta, and is a type of glycosaminoglycan (GAG).
  • GAG glycosaminoglycan
  • the form of chondroitin sulfate may be any, for example, chondroitin-4-sulfate or chondroitin-6-sulfate.
  • chondroitin sulfate D-glucuronic acid, N-acetylgalactosamine and chondroitin sulfate A (hereinafter also referred to as 'CSA') in which the sulfate residues are present in equal molar amounts are used. .
  • aqueous solution of chitosan-glycolide, chondroitin sulfate or a combination thereof it is preferable to add a buffer to the aqueous solution so that they are not hydrolyzed even under a harsh pH environment, for example, chitosan- with phosphate buffered saline.
  • Aqueous solutions of glycolide, chondroitin sulfate, or combinations thereof may be prepared.
  • the concentration of chitosan-glycolide or chondroitin sulfate in the aqueous solution of the targeting drug is not particularly limited, but is appropriate to a concentration capable of providing stabilization through buffering effect or neutralization to the targeting drug in the particle formulation. can choose to For example, it may be 0.01 mg/ml or more and 1000 mg/ml.
  • the effect of releasing the drug in a controlled sustained-release form while controlling the aggregate formation of the drug in the containing particles may be high.
  • the targeting drug and chitosan glycol or chondroitin sulfate it is preferable to dissolve the targeting drug and chitosan glycol or chondroitin sulfate slowly without stirring because there is a possibility of forming an inclusion body during the solution preparation process or the mixing process thereof.
  • the mixing ratio of the concentration of the targeting drug obtained in the above step and the concentration of chitosan-glycolide or chondroitin sulfate in the aqueous solution obtained in the above step is not particularly limited, but insoluble aggregates of the drug are produced in the final particles to a minimum
  • the higher the concentration of chitosan-glycolide or chondroitin sulfate in the solution obtained in the above step the higher it is preferable.
  • the present invention is not limited by theory, the reason that the higher the concentration of chitosan-glycolide or chondroitin sulfate in the solution is, the better is the formation of an ionic complex between the negative charge of chitosan-glycolide or chondroitin sulfate and the positive charge of the targeting drug.
  • a binding force between the drug and chitosan-glycolide or chondiroitin sulfate is formed by non-covalent bonding, so that insoluble aggregates that do not exhibit activity in vivo are not formed.
  • chitosan-glycolide or chondiroitin sulfate is a basic substance and can prevent acid-hydrolysis acceleration of PLGA by acidic substances generated by neutralizing acidic substances accumulated inside PLGA during particle disintegration.
  • the above-described effect of chitosan-glycolide or chondroitin sulfate can be viewed as a buffering effect on acid of chitosan-glycolide or chondroitin sulfate.
  • the particle comprises an aptamer and a biocompatible polymer, wherein the amount of aptamer in the particle is 0.1% to 30% (w/w), 0.1% to 10% (w/w) or preferably 0.5% to 5% ( w / w) of particles.
  • Nucleic acids undergo dehydrogenation and are susceptible to free radical oxidation in aqueous solution (Lindahl (1993) NATURE 362:709-715; Demple et al. (1994) ANNU REV BIOCHEM. 63:915-948). This effect can be reduced, minimized or eliminated by the addition of stabilizers such as sugar.
  • An effective stabilizer is sugar, trehalose.
  • the mass ratio of aptamer to trehalose in the particle is 1:3 or more.
  • the formulations described herein contain an effective amount of nanoparticles in a pharmaceutical carrier suitable for administration to a subject in need thereof.
  • the formulations are generally administered parenterally (eg, by injection or infusion).
  • the formulation or variant thereof may be administered in any manner, including enterally, topically (eg, to the eye), or via pulmonary administration. In some embodiments, the formulation is administered topically.
  • Nanoparticles may be formulated for parenteral delivery, such as injection or infusion, in the form of solutions, suspensions or emulsions.
  • the formulation may be administered systemically, regionally, or directly to the organ or tissue to be treated.
  • Parenteral formulations can be prepared as aqueous compositions using techniques known in the art.
  • the composition is formulated as an injectable formulation, for example, a solution or suspension; solid forms suitable for use in the manufacture of solutions or suspending agents upon addition of a reconstitution medium prior to injection; emulsions, such as water-in-oil (w/o) emulsions, oil-in-water (o/w) emulsions, and microemulsions, liposomes, or emulsions thereof.
  • injectable formulation for example, a solution or suspension
  • solid forms suitable for use in the manufacture of solutions or suspending agents upon addition of a reconstitution medium prior to injection emulsions, such as water-in-oil (w/o) emulsions, oil-in-water (o/w) emulsions, and microemulsions, liposomes, or emulsions thereof.
  • emulsions such as water-in-oil (w/o) e
  • the carrier may be, for example, water, ethanol, one or more polyols (eg, glycerol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol), oils such as vegetable oils (eg, peanut oil, corn oil, sesame oil, etc.), and combinations thereof.
  • polyols eg, glycerol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol
  • oils such as vegetable oils (eg, peanut oil, corn oil, sesame oil, etc.), and combinations thereof.
  • Proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersion and/or by the use of surfactants.
  • isotonic agents for example, sugars or sodium chloride.
  • Solutions and dispersions of nanoparticles may be prepared in water or another solvent or dispersion medium suitably mixed with one or more pharmaceutically acceptable excipients, including, but not limited to, surfactants, dispersants, emulsifiers, pH modifiers, and combinations thereof. can be manufactured.
  • pharmaceutically acceptable excipients including, but not limited to, surfactants, dispersants, emulsifiers, pH modifiers, and combinations thereof.
  • Suitable surfactants may be anionic, cationic, amphoteric or nonionic surfactants.
  • Suitable anionic surfactants include, but are not limited to, those containing carboxylate, sulfonate and sulfate ions.
  • anionic surfactants include sodium, potassium, ammonium of long chain alkyl sulfonates and alkyl aryl sulfonates, such as sodium dodecylbenzene sulfonate; dialkyl sodium sulfosuccinates such as sodium dodecylbenzene sulfonate; dialkyl sodium sulfosuccinates such as sodium bis-(2-ethylthioxyl)-sulfosuccinate; and alkyl sulfates such as sodium lauryl sulfate.
  • Cationic surfactants include, but are not limited to, quaternary ammonium compounds such as benzalkonium chloride, benzethonium chloride, cetrimonium bromide, stearyl dimethylbenzyl ammonium chloride, polyoxyethylene and coconut amine.
  • nonionic surfactants include ethylene glycol monostearate, propylene glycol myristate, glyceryl monostearate, glyceryl stearate, polyglyceryl-4-oleate, sorbitan acylate, sucrose acylate, PEG- 150 Laureth, PEG-400 Monolaureth, Polyoxyethylene Monolaureth, Polysorbate, Polyoxyethylene Octylphenyl Ether, PEG-1000 Cetyl Ether, Polyoxyethylene Tridecyl Ether, Polypropylene Glycol Butyl Ether, Poloxamer ® 401, stearoyl monoisopropanolamide, and polyoxyethylene hydrogenated tallow amide.
  • amphoteric surfactants include sodium N-dodecyl- ⁇ -alanine, sodium N-lauryl- ⁇ -iminodipropionate, myristoamphoacetate, lauryl betaine and lauryl sulfobetaine.
  • the formulation may contain a preservative to prevent the growth of microorganisms. Suitable preservatives include, but are not limited to, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, and thimerosal.
  • the formulation may also contain antioxidants to prevent degradation of the active agent(s) or nanoparticles.
  • the formulations are typically buffered to a pH of 3-8 for parenteral administration upon reconstitution.
  • Suitable buffers include, but are not limited to, phosphate buffers, acetate buffers, and citrate buffers. When using 10% sucrose or 5% dextrose, a buffer may not be needed.
  • Water-soluble polymers are often used in formulations for parenteral administration. Suitable water-soluble polymers include, but are not limited to, polyvinylpyrrolidone, dextran, carboxymethylcellulose, and polyethylene glycol.
  • Sterile injectable solutions can be prepared by incorporating the nanoparticles in the required amount in an appropriate solvent or dispersion medium having one or more excipients described above as required, followed by sterile filtration.
  • dispersions are prepared by incorporating the various sterile nanoparticles into a sterile vehicle that contains a basic dispersion medium and the required other ingredients from those described above.
  • the preferred methods of preparation are vacuum-drying and freeze-drying techniques which yield a powder of nanoparticles and any additional required ingredients from a previously sterile-filtered solution thereof. am.
  • the powder can be prepared in such a way that the particles are porous in nature, thereby increasing dissolution of the particles. Methods of making porous particles are well known in the art.
  • compositions for parenteral administration may be in the form of sterile aqueous solutions or suspensions of particles formed from one or more polymer-drug conjugates.
  • Acceptable solvents include, for example, water, Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS), and isotonic sodium chloride solution.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the formulation may also be a sterile solution, suspension, or emulsion in a non-toxic parenterally acceptable diluent or solvent, for example, 1,3-butanediol.
  • formulations for parenteral administration may be packaged as a solid obtained, for example, by lyophilization of a suitable liquid formulation.
  • the solid may be reconstituted with an appropriate carrier or diluent prior to administration.
  • Solutions, suppositories, or emulsions for parenteral administration may be buffered with an effective amount of buffer necessary to maintain a pH suitable for ocular administration.
  • Suitable buffers are well known to those skilled in the art, and some examples of useful buffers are acetate, borate, carbonate, citrate, and phosphate buffers.
  • Solutions, suppositories, or emulsions for parenteral administration may also contain one or more tonicity agents to adjust the tonicity range of the formulation.
  • Suitable tonicity agents are well known in the art, and some examples include glycerin, sucrose, dextrose, mannitol, sorbitol, sodium chloride, and other electrolytes.
  • Solutions, suppositories, or emulsions for parenteral administration may also contain one or more preservatives to prevent bacterial contamination of the ophthalmic preparations.
  • Suitable preservatives include polyhexamethylenebiguanidine (PHMB), benzalkonium chloride (BAK), stabilized oxychloro complex (otherwise known as Purite®), phenylmercuric acetate, chlorobutanol, sorbic acid , chlorhexidine, benzyl alcohol, parabens, thimerosal, and mixtures thereof.
  • Solutions, suppositories, or emulsions for parenteral administration may also contain one or more excipients known in the art, for example, dispersing, wetting and suspending agents.
  • the nanoparticles may be formulated for topical administration to mucosal surfaces. Dosage forms suitable for topical administration include creams, ointments, salves, sprays, gels, lotions, emulsions, solutions, and transdermal patches.
  • the formulation is transmucosal. may be formulated for transepithelial, or transendothelial administration.
  • the composition contains one or more chemical penetration enhancers, membrane permeation agents, membrane transport agents, emollients, surfactants, stabilizers, and combinations thereof.
  • the nanoparticles may be administered in a liquid formulation, such as a solution or suspension, a semi-solid formulation, such as a lotion or ointment, or a solid formulation.
  • the nanoparticles are formulated as liquids, such as eye drops, or semi-solid formulations, including solutions and suspensions, into mucous membranes, such as ophthalmically or vaginally or rectally.
  • a “surfactant” is a surfactant that lowers surface tension to increase the emulsifying, foaming, dispersing, diffusing, and wetting properties of a product.
  • Suitable nonionic surfactants are emulsifying waxes, glyceryl monooleate, polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyethylene castor oil derivatives, polysorbates, sorbitan esters, benzyl alcohol, benzyl benzoate, cyclodextrin, glycerin monostearate. , poloxamers, povidone, and combinations thereof.
  • the nonionic surfactant is stearyl alcohol.
  • An “emulsifier” is a surfactant that promotes the suspension of one liquid in another and the formation of a safe mixture or emulsion of oil and water.
  • Common emulsifiers are metallic soaps, certain animal and vegetable oils, and various polar compounds.
  • Suitable emulsifiers include acacia, anionic emulsifying wax, calcium stearate, carbomer, cetostearyl alcohol, cetyl alcohol, cholesterol, diethanolamine, ethylene glycol palmitostearate, glycerin monostearate, glyceryl monooleate, hydrate Roxypropyl cellulose, hypromellose, lanolin, hydrate, lanolin alcohol, lecithin, medium chain triglycerides, methylcellulose, mineral oil and lanolin alcohol, monobasic sodium phosphate, monoethanolamine, nonionic emulsifying wax, oleic acid, poloxamer, poloxamer
  • Suitable classes of penetration enhancers include fatty alcohols, fatty acid esters, fatty acids, fatty alcohol ethers, amino acids, phospholipids, lecithins, cholate salts, enzymes, amines and amides, complexing agents (liposomes, cyclodextrins, modified celluloses, and diimides), macrocyclics such as macrocyclic lactones, ketones, and anhydrides and cyclic ureas, surfactants, N-methyl pyrrolidone and derivatives thereof, DMSO and related compounds, ionic compounds, azones and related compounds, and solvents such as alcohols, ketones, amides, polyols (eg, glycols). Examples of these classes are known in the art.
  • the conjugates can be prepared by a number of different synthetic procedures.
  • the conjugates may be prepared from an aptamer with a functional group and an activator, from a linker having one or more reactive coupling groups, or at least one capable of reacting with a functional group on the activator or aptamer to form a covalent bond. It can be prepared from a linker precursor. It may also be pegylated to the conjugate.
  • the primary spacer is a nucleic acid spacer comprising about 1 to 20 contiguous nucleotides, preferably 1 to 5 contiguous nucleotides, more preferably 2 contiguous nucleotides, said primary spacer and/or secondary spacer comprising: It includes one or more ethylene glycol moieties or a plurality of such ethylene glycol moieties.
  • an aptamer and a nucleotide analogue, siRNA, decoy, and a nucleic acid drug including antisense can be linked by the following various methods.
  • spacer is a nucleic acid spacer comprising about 1 to 20 contiguous nucleotides, preferably 1 to 5 contiguous nucleotides, more preferably 2 contiguous nucleotides.
  • the above ethylene glycol moieties or those having a plurality of such ethylene glycol moieties are included.
  • phosphodiester refers to the bond -PO4 used to link the nucleoside monomer.
  • a phosphodiester bond (“PO”) contemplated herein is a bond found in naturally occurring DNA. Examples of nucleic acids linked by phosphodiester bonds are shown below.
  • phosphorothioate refers to the bond -PO3(S) used to link the nucleoside monomer.
  • Phosphorothioate (“pS”) bond galaxies contain a sulfur atom instead of an oxygen atom on the phosphoester bond, as shown below.
  • H-, alkyl or alkenyl phosphonate refers to a bond -PO3R- used to link a nucleoside, nucleoside analog, or enucleated nucleoside monomer.
  • the H-phosphonate bond contains a hydrogen atom bonded to phosphorus instead of an oxygen atom like the phosphodiester bond described above.
  • An alkyl phosphonate bond (R-pO) contains a carbon atom bonded to a phosphorus atom instead of an oxygen atom.
  • Suitable alkyl groups are C1-35 linear or branched chain alkyl groups, preferably C1-20, more preferably C1-5 linear or branched alkyl groups.
  • Suitable alkenyl groups are C2-35 linear or branched chain alkenyl, preferably C2-20, more preferably C1-5 linear or branched chain alkenyl.
  • homopolymer refers to a polynucleotide compound in which both the nucleotide and the spacer are identical.
  • FdUMP10 may be added to one end of the aptamer.
  • HO-[dN-PO2X]n-OH is equal to each nucleotide "dN" and each X equal.
  • the aptamers include gemcitabine triphosphate (dFdCTP) and 5-fluorouracil (5-FU) and 5-F-2'-UTP triphosphate (5FdUTP).
  • dFdCTP gemcitabine triphosphate
  • 5-FU 5-fluorouracil
  • 5FdUTP 5-F-2'-UTP triphosphate
  • the active metabolites of the drug, dFdCMP and 5FdUMP can be enzymatically incorporated into the aptamer.
  • the structures of P19 conjugated with dFdCMP and 5FdUMP are depicted in Formula 7, and inclusion of these drugs only slightly increased the molecular weight of P19-dFdCMP (up to 1,862 g/mol) compared to P19 due to excess fluorine residues, whereas P19 - 5FdUMP did not change.
  • heteropolymer refers to a polynucleotide compound in which each of the nucleotides or linkers in the chain is not identical.
  • an activator may be loaded as in the case where the aptamer is prepared by adding the activator 5-FdU.
  • HO-[dN-PO2X]n-OH has different nucleotide "dN" or bond "PO2X” along the chain.
  • the present invention may also include polymeric compounds formed from chains of pharmaceutically active molecules linked by pharmaceutically inactive bonds.
  • the pharmaceutically active molecule is a therapeutic monomeric nucleoside, nucleoside analog, enucleated nucleoside, or heterologous, separated along the chain by a nuclease resistant moiety such as 2'O-methyl ribonucleoside. It is a cyclic derivative.
  • Monomer groups may be linked along the chain by phosphodiester (pO), phosphorothionate (pS) or alkyl or alkenyl phosphonate (R-pO) groups.
  • the chain comprises 2 to 100 (more preferably 2 to 35) therapeutic monomeric nucleosides, nucleoside analogs, enucleated nucleosides or heterocyclic derivatives thereof.
  • the present invention relates to polymorphs formed from chains of phosphodiester (pO), phosphorothionate (pS) or pharmaceutically active or therapeutic monomeric nucleosides or nucleoside analogs linked by H- or alkyl or alkenyl phosphonates. It relates to nucleotide compounds.
  • the chain comprises 2 to 100 (more preferably 2 to 35) therapeutic monomeric nucleosides, nucleoside analogs or unsubstituted nucleosides.
  • the present invention contemplates polynucleotides containing mixed phosphodiester and phosphorothioate linkages, as shown below. Oligomers with pS linkages are more stable than oligomers with pO linkages, and consequently pS oligomers degrade at a slower rate than oligomers with pO linkages. S. T. Crooke, Oligonucleotide Therapeutics, Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th ed., Ed. M. E. Wolff 863-900, 1995) and further documents cited therein.
  • the present invention uses alternating chains of therapeutically active nucleosides or nucleoside analogs and nuclease resistant moieties (eg, demineralized 2'O-methyl nucleosides) to modulate the release rate of nucleoside therapeutics. It is contemplated to form polynucleotides containing the ability to The structure of alternating segments of a therapeutically active nucleoside or nucleoside analog and a nuclease resistant moiety (eg, a basic 2'O-methyl nucleoside) can be modified to achieve the desired release of the therapeutic agent. .
  • nuclease resistant moieties eg, demineralized 2'O-methyl nucleosides
  • the conjugate of the present invention can deliver a drug to a specific target due to the targeting ligand, for example, when the targeting ligand is HER2, it provides a target-directed conjugate that selectively delivers the drug to cancer cells in which the HER2 receptor is overexpressed will be.
  • the present invention provides a single structure in which double-stranded DNA and a ligand are covalently linked and a targeting conjugate in which one or more drugs (chemotherapeutic agent) form a specific structure by self-assembly.
  • drugs chemotherapeutic agent
  • the DNA polymer unit includes a sense strand nucleic acid sequence and an antisense strand nucleic acid sequence capable of complementary binding to the sense strand nucleic acid sequence sequentially from the 5' end to the 3' end.
  • the sense strand nucleic acid sequence is a sequence rich in GC bases, and ideally, GC units may be repetitive.
  • the number of bases of the sense strand nucleic acid sequence may be appropriately adjusted for the preparation of a nucleic acid complex, for example, the sense strand nucleic acid sequence may consist of 5 to 100, preferably 10 to 100 bases.
  • the number of bases of the antisense strand nucleic acid sequence may also be appropriately adjusted for the preparation of a nucleic acid complex, for example, the antisense sequence nucleic acid molecule may consist of 5 to 100, preferably 10 to 100 bases.
  • DNA interacts with many other biological molecules such as proteins and lipids. These interactions are the recognition of DNA shape, primarily DNA grooves and DNA twists. All types of nucleic acids have different hydrogen donors and acceptors at their bases. H bond donors and acceptors serve as anchors to which other molecules can bind. Ligands differentiate their binding sites based on groove size. Hydrogen bonding and conformational recognition are the main mechanisms of binding site recognition by ligands.
  • the ligand binding to the double-stranded DNA is classified into an intercalator and a groove binder.
  • the insert means a ligand inserted between the planar bases of DNA.
  • Known examples are ethidium bromide (EtBr), berberine, proflavine and doxorubicin. They are applied in chemotherapy treatments to inhibit DNA replication in cancer cells. Because the insert inserts between base pairs, the DNA molecule must unwind and extend to open space for the insert. These structural changes in DNA depend on the size and shape of the insert. Thus, the insert binds to DNA and inhibits replication, transcription and DNA repair processes. This mechanism also increases the mutagenic potential. It also has functional changes induced by structural modifications of DNA with the binding of inserts.
  • the groove bonding material can be divided into a major groove bonding material and a minor groove bonding material. Due to the large dimensions of the major grooves, large proteins are common major groove binding agents. However, small DNA binding agents such as triplex forming oligonucleotides (TFO), peptide nucleic acids (PNA), pluramycins, aflatoxins and azinomycins bind to the major groove. Groove binders interact with DNA non-covalently. Groove binding materials may form covalent bonds with DNA such as aminoglycosides. The electrophilic group of the aminoglycoside reacts with the nucleophilic N7 position of the purine base.
  • minor groove binding material Since the minor groove binding material is smaller than the major groove binding material of large proteins, it is suitable for narrow and deep minor grooves in DNA. However, their structures and shapes vary widely, from simple crescent-like structures such as netropsin and distamycin A (Dst.A) to complex structures such as trabetin.
  • the minor groove binding material interacts with DNA through two types of forces, covalent or non-covalent.
  • One example that forms a covalent bond with DNA is CC1065, which belongs to the duocarmycin family.
  • Anthramycin also forms covalent bonds with DNA. It has a carbon-nitrogen double bond on the diazepine ring, which reacts with the amino group of the base.
  • Other synthetic compounds such as DAPI and pentamidine have also been well studied.
  • the drug used in the embodiment of the present invention is an anthracycline drug having the property of being intercalated into the hairpin structure DNA is one selected from the group consisting of doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, and idarubicin or more, preferably doxorubicin.
  • doxorubicin can be inserted by using the property that a drug, particularly doxorubicin, is inserted between bases constituting DNA.
  • Doxorubicin doxorubicin hydrochloride
  • doxorubicin hydrochloride is one of the most widely used cytotoxic anthracycline antibiotics in cancer chemotherapy, and is known to exhibit activity against various tumors.
  • the doxorubicin is useful for the treatment of numerous solid cancers and leukemias, and is particularly effective for the treatment of breast cancer related to combination therapy.
  • doxorubicin is a protocol treatment for AIDS-associated Kaposi's sarcoma and shows excellent activity against ovarian cancer, lung cancer, testicular cancer, prostate cancer, uterine cancer, head and neck cancer, estrogenic sarcoma and Ewing's sarcoma. .
  • DOX is classified as a topoisomerase II inhibitor because it binds to DNA-related enzymes such as topoisomerase I and II, it can perturb several other biochemical processes that affect anticancer activity.
  • doxorubicin Since doxorubicin has a property of binding to DNA, it is known that doxorubicin permeated into cells moves to the nucleus and binds to DNA, thereby inhibiting various biosynthetic processes.
  • cell proliferation or death can be induced by interfering with the topoisomerase II enzyme, which functions to release the DNA supercoil structure during DNA transcription. Inhibition of topoisomerase II can lead to apoptosis if not restored.
  • Dox interacts with DNA through insertion of a tetracene ring system between the planar base pairs of double-stranded DNA and the minor groove by the daunosamine sugar moiety.
  • the non-covalent binding of Dox to DNA is easily reversible, and the non-covalent conjugate shows a relatively short half-life (t 1/2 ⁇ min).
  • Dox also forms covalent adducts with more stable DNA, but requires an aldehyde precursor to link the daunosamine sugar of Dox to the exocyclic.
  • Dox-DNA covalent adducts are more cytotoxic than non-covalent adducts and are widely used in anthracycline cytotoxicity studies because covalent adducts are synthesized. It forms covalently attached DNA adducts, and the toxicity of these lesions to cells is higher than that induced by topoisomerase II damage. The resulting DNA adduct predominantly induces toxicity of the lesion.
  • Formaldehyde is used for the formation of Dox-DNA adducts, and exogenous formaldehyde promotes Dox covalent adduct formation to genomic DNA.
  • the Dox-formaldehyde complex is being used for delivery of an activated form of Dox that aids in the formation of covalent adducts to genomic DNA.
  • Formaldehyde plays a central role in DNA adduct generation by DOX because it provides a methylene group that connects the 3'-amino group of DOX to the 2-amino group of dGuo in DNA via Schiff base chemistry.
  • the specificity of these adducts is that they form covalent bonds to one DNA strand and resist thermal denaturation due to their stabilization to local sites of DNA.
  • a linker may be connected between the ligand and the active agent.
  • the linker may include a spacer moiety and a functional group. If the spacer portion is too long, it cannot be used due to its high hydrophobicity, so a C1-C6 straight-chain or branched alkylene group, preferably a C1-C6 straight-chain alkylene group, is suitable as the spacer portion.
  • the linker may be methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, or hexylene.
  • a functional group is introduced to connect the spacer portion and the target peptide, and the functional group is a group that connects the target peptide and includes all functional groups capable of binding to the peptide.
  • the functional group may be an amine group (-NH2) or a sulfhydryl group (-SH, sulfhydryl), and the functional group may form an amide bond with a target peptide.
  • the conjugate can be prepared from a linker capable of reacting with a reactive coupling group on the activator or aptamer to form a spacer that is covalently attached to the activator or aptamer.
  • the linker may be a diacid or a substituted diacid.
  • diacid is a substituted or unsubstituted alkyl, heteroalkyl having 2 or more carboxylic acid groups, preferably 2 to 50, 2 to 30, 2 to 12, or 2 to 8 carbon atoms. , aryl, or heteroaryl compounds.
  • Suitable diacids may include oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, suberic acid, azelaic acid, sebacic acid, phthalic acid, iso-phthalic acid, terephthalic acid, and derivatives thereof.
  • the linker may be an activated diacid derivative, such as a diacid anhydride, diacid ester, or diacid halide.
  • the diacid anhydride may be a cyclic anhydride obtained from intramolecular dehydration of diacids or diacid derivatives, for example those described above.
  • the diacid anhydride may include malonic anhydride, succinic anhydride, glutaric anhydride, adipic anhydride, pimelic anhydride, phthalic anhydride, diglycolic anhydride, or derivatives thereof; Preferably, it may be succinic anhydride, diglycolic anhydride, or a derivative thereof.
  • the diacid ester may be an activated ester of any of the diacids described above, including oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, suberic acid, azelaic acid, sebacic acid, phthalic acid, iso -methyl and butyl diesters or bis-(p-nitrophenyl) diesters of phthalic acid, terephthalic acid, and derivatives thereof.
  • the diacid halide may comprise the corresponding acid fluoride, acid chloride, acid bromide, or acid iodide of the diacids described above.
  • the diacid halide is succinyl chloride or diglycolyl chloride.
  • a conjugate having a disuccinate linker according to the following scheme using a therapeutic agent having a reactive (-OH) coupling group and an aptamer having a reactive (-NH2) coupling group. can be manufactured.
  • a conjugate can be prepared by providing an active agent having a hydroxyl group and reacting it with a succinic anhydride linker to form a conjugate of the active agent-succinate-SSPy.
  • An aptamer having an available -NH2 group is reacted with a coupling reagent and activator-succinate-SSPy to form an aptamer-spacer-activator conjugate.
  • the coupling reaction is carried out under esterification conditions known to those skilled in the art, for example, with an activator, for example, a carbodiimide (for example, diisopropoylcarbodiimide ( DIPC) in the presence or absence of a catalyst such as dimethylaminopyridine (DMAP).
  • an activator for example, a carbodiimide (for example, diisopropoylcarbodiimide ( DIPC) in the presence or absence of a catalyst such as dimethylaminopyridine (DMAP).
  • a suitable solvent such as dichloromethane, chloroform or ethyl acetate at a temperature from about 0° C. to the reflux temperature of the solvent (eg, ambient temperature).
  • the coupling reaction is generally carried out in the presence of a catalyst such as DMAP or pyridine in a solvent such as pyridine or in a chlorinated solvent at about 0° C. to the reflux temperature of the solvent (eg ambient temperature).
  • a catalyst such as DMAP or pyridine
  • the coupling reagent is in a chlorinated, etherified or amide solvent (e.g., N,N-dimethylformamide) in the presence of a catalyst, e.g., DMAP, at about 0 °C to the reflux temperature of the solvent ( for example, at a temperature of ambient temperature) 4-(2-pyridyldithio)-butanoic acid, and a carbodiimide coupling reagent such as DCC.
  • the conjugate couples the coupling activator and/or aptamer having one or more reactive coupling groups to a linker having a complementary reactive group capable of reacting with a reactive coupling group on the activator or aptamer to form a covalent bond.
  • a linker having a complementary reactive group capable of reacting with a reactive coupling group on the activator or aptamer to form a covalent bond can be prepared by Sikkim.
  • an activator or aptamer having a primary amine group can be coupled to a linker having an isothiocyanoate group or another amine-reactive coupling group.
  • the linker comprises a first reactive coupling group capable of reacting with a complementary functional group on the active agent and a different agent than the first reactive coupling group capable of reacting with a complementary functional group on the aptamer. 2 reactive coupling groups.
  • One or both of the reactive coupling groups on the linker may be protected with suitable protecting groups during part of the synthesis.
  • the method for producing the particles comprises: providing a conjugate; providing a basic component such as PLA-PEG or PLGA-PEG to form particles; combining the conjugate and the base component in an organic solution to form a first organic phase; combining the first organic phase with the first aqueous solution to form a second phase; emulsifying the second phase to form an emulsion phase; and recovering the particles.
  • the emulsion phase is further homogenized.
  • the first phase comprises about 5% to about 50% by weight, such as about 1% to about 40% solids, or about 5% to about 30% solids, such as about 5%, 10%, 15%, and 20% solids. It contains conjugates and basic components of In certain embodiments, the first phase comprises about 5% by weight of the conjugate and the base component.
  • the organic phase is acetonitrile, tetrahydrofuran, ethyl acetate, isopropyl alcohol, isopropyl acetate, dimethylformamide, methylene chloride, dichloromethane, chloroform, acetone, benzyl alcohol, TWEEN® 80, SPAN® 80, or combinations thereof. In some embodiments, the organic phase comprises benzyl alcohol, ethyl acetate, or a combination thereof.
  • the aqueous solution includes water, sodium cholate, ethyl acetate, or benzyl alcohol.
  • a surfactant is added to the first phase, the second phase, or both.
  • Surfactants can act as emulsifiers or stabilizers for the compositions described herein.
  • Suitable surfactants may be cationic surfactants, anionic surfactants, or nonionic surfactants.
  • surfactants suitable for preparing the compositions described herein include sorbitan fatty acid esters, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, and polyoxyethylene stearate. Examples of such fatty acid ester nonionic surfactants are ICI's TWEEN® 80, SPAN® 80, and MYJ® surfactants.
  • SPAN® surfactants contain C12-C18 sorbitan monoesters.
  • TWEEN® surfactants include poly(ethylene oxide) C12-C18 sorbitan monoesters.
  • MYJ® surfactants include poly(ethylene oxide) stearate.
  • the aqueous solution also includes a surfactant (eg, an emulsifier) including polysorbate.
  • the aqueous solution may include polysorbate 80.
  • Suitable surfactants include lipid-based surfactants.
  • the composition comprises 1,2-dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, pegylated 1,2 -distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (including PEG5000-DSPE), pegylated 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (1,2- dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (including ammonium salts)).
  • Emulsifying the second phase to form an emulsion phase may be performed in one or two emulsification steps.
  • a primary emulsion may be prepared and then emulsified to form a fine emulsion.
  • the initial emulsion can be formed using, for example, simple mixing, a high pressure homogenizer, a probe sonicator, a stir bar, or a rotor calibrator homogenizer.
  • the initial emulsion can be formed into a fine emulsion, for example through the use of a probe sonicator or high pressure homogenizer, for example by passing through a homogenizer.
  • the pressure used may be from about 4000 to about 8000 psi, from about 4000 to about 5000 psi, or 4000 or 5000 psi.
  • Solvent evaporation or dilution may be necessary to complete solvent extraction and solidify the particles.
  • solvent dilution via aqueous quenching can be used.
  • the emulsion can be diluted in cold water to a concentration sufficient to dissolve all of the organic solvent to form a quenched phase.
  • the quenching may be performed at least partially at a temperature of about 5° C. or less.
  • the water used for quenching may be at a temperature below room temperature (eg, from about 0 to about 10 °C, or from about 0 to about 5 °C).
  • the particles are recovered by filtration.
  • an ultrafiltration membrane may be used.
  • Exemplary filtration may be performed using a tangent flow filtration system.
  • Nanoparticles can be selectively separated, for example, by using a membrane having a suitable pore size to retain the nanoparticles while allowing passage of solutes, micelles, and organic solvents.
  • Exemplary membranes having a molecular weight cutoff of about 300 to 500 kDa (-5-25 nm) can be used.
  • the particles are freeze-dried or freeze-dried to prolong their shelf life.
  • the composition also includes a lyoprotectant.
  • the lyoprotectant is selected from sugars, polyalcohols, or derivatives thereof.
  • the lyoprotectant is selected from monosaccharides, disaccharides, or mixtures thereof.
  • the lyoprotectant may be sucrose, lactulose, trehalose, lactose, glucose, maltose, mannitol, cellobiose, or a mixture thereof.
  • the particles may be polymeric particles, lipid particles, or a combination thereof.
  • the various methods described herein can be controlled by controlling the size and composition of the particles, for example, some methods are best suited for making microparticles, while others are more suitable for making nanoparticles.
  • the selection of methods for preparing particles having the described characteristics can be made by one of ordinary skill in the art without undue experimentation.
  • polymeric particles may be prepared using any suitable method known in the art.
  • Common microencapsulation techniques include spray drying, interfacial polymerization, hot melt encapsulation, phase separation encapsulation (spontaneous emulsion microencapsulation, solvent evaporation microencapsulation, and solvent removal microencapsulation), coacervation, low temperature microsphere formation, and phase transfer nanoencapsulation. including, but not limited to, encapsulation (PIN).
  • the lipid particle may be a lipid micellar, liposome, or solid lipid particle prepared using any suitable method known in the art.
  • Conventional techniques for lipid particles encapsulating active agents include, but are not limited to, high pressure homogenization techniques, supercritical fluid methods, emulsion methods, solvent diffusion methods, and spray drying.
  • the formulation may be administered, where appropriate, to treat any proliferative, metabolic, infectious, or cancer.
  • the formulation can be used for immunity.
  • Formulations are typically administered by injection, orally or topically to mucosal surfaces (pulmonary, nasal, oral, buccal, sublingual, vaginal, intrarectal) or ocular (transocularly).
  • the conjugate-containing particle formulations described herein can be used for the selective tissue delivery of therapeutic, prophylactic, or diagnostic agents to a subject or patient in need thereof.
  • Dosage regimens can be adjusted to provide the optimal desired response (eg, a therapeutic or prophylactic response). For example, a single bolus may be administered, several divided doses may be administered over time, or the dose may be proportionally decreased or increased according to the exigencies of the therapeutic situation.
  • Dosage unit form as used herein refers to physically discrete units suitable as a single dose for the mammalian subject to be treated; Each unit contains a predetermined quantity of active compound calculated to prepare a therapeutic agent.
  • Conjugates contained within the particles are released in a controlled manner. Release may be in vitro or in vivo. For example, a subject may be tested for release of particles under certain conditions, including those prescribed in the United States Pharmacopeia and its amendments.
  • less than about 90%, less than about 80%, less than about 70%, less than about 60%, less than about 50%, less than about 40%, less than about 30%, less than about 20% of the conjugate contained within the particle releases the particle. Released in the first hour after exposure to the test conditions. In some embodiments, less than about 90%, less than about 80%, less than about 70%, less than about 60%, or less than about 50% of the conjugate contained within the particle is present in the first hour after exposing the particle to the release test conditions. is emitted to Less than about 50% of the conjugate contained within the particles is released in the first hour after exposing the particles to the release test conditions.
  • conjugates released in vivo for example, a conjugate contained within a particle administered to a subject may be protected from the body of the subject, and the body may be isolated from the conjugate until the conjugate is released from the particle. .
  • the conjugate may be substantially contained in the particle until the particle is delivered into the body of the subject.
  • less than about 90%, less than about 80%, less than about 70%, less than about 60%, less than about 50%, less than about 40%, less than about 30%, less than about 20%, less than about 15%, about Less than 10%, less than about 5%, or less than about 1% of the total conjugate is released from the particle before the particle is delivered to the body, eg, a treatment site in a subject.
  • the conjugate may be released over an extended period of time or intensively (eg, an amount of conjugate is released in a short time, followed by substantially no conjugate release for a period of time).
  • the conjugate can be released over 6 hours, 12 hours, 24 hours, or 48 hours.
  • the conjugate from the particles is released over a period of one week or one month.
  • dFdCTP gemcitabine-5'-triphosphate
  • DuraScribe T7 Transcription Kit Epicenter Biotechnologies
  • 2' F-Pyrimidine-modified HER2 and EpCAM aptamer conjugates termed "dFdCTP-HER2 aptamer conjugate” and "dFdCTP-EpCAM aptamer conjugate"
  • the dFdCTP was purchased from Sierra Bioresearch.
  • Each template DNA for the preparation of the dFdCTP-HER2 aptamer conjugate and the dFdCTP-EpCAM aptamer conjugate was custom-made by Bioneer.
  • dFdCTP-HER2 aptamer conjugate and dFdCTP-EpCAM aptamer conjugate were prepared using double-stranded DNA template and mutant T7 RNA polymerase (Y639F). synthesized. The base sequence of the template DNA and the synthesized aptamer conjugate is shown below.
  • EpCAM template DNA (SEQ ID NO: 3)
  • the dark underlined portion in the template DNA is the T7-promoter sequence, and the dFdCTP introduced into the aptamer conjugate is indicated by C.
  • a 6 nmol DNA template and a complementary DNA strand were hybridized in an equimolar ratio. It was dissolved in a total volume of 90 ⁇ l of annealing buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl 2 ). The sample was heated at 95 °C for 5 min and cooled to room temperature for 2 h.
  • annealing buffer 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl 2
  • dFdCTP-HER2 aptamer conjugates and dFdCTP-EpCAM aptamer conjugates were prepared using 5 ⁇ g of double-stranded DNA template in a total volume of 90 ⁇ l of 1x transcription buffer (40 mM Tris-HCL pH7.5, 6 mM MgCl2, 5 mM NaCl and 10 mM spermidine). It was prepared by transcription.
  • the DNA template was digested by reacting it with RQ1 RNase-free DNase (1U/mL) at 37°C for 15 minutes. Unbound NTPs were removed with a G25 spin column (GE Healthcare). The final product was precipitated with ethanol, washed, resuspended in sterile distilled water treated with diethylpyrocarbonate (DEPC), and quantified using an ultraviolet Nanoodrop spectrometer.
  • RQ1 RNase-free DNase (1U/mL) at 37°C for 15 minutes. Unbound NTPs were removed with a G25 spin column (GE Healthcare). The final product was precipitated with ethanol, washed, resuspended in sterile distilled water treated with diethylpyrocarbonate (DEPC), and quantified using an ultraviolet Nanoodrop spectrometer.
  • DEPC diethylpyrocarbonate
  • the quality and size of the prepared dFdCTP-HER2 aptamer conjugate and dFdCTP-EpCAM aptamer conjugate were analyzed on a 10% (19:1) polyacrylamide gel containing 7M urea (Fig. 2).
  • the prepared dFdCTP-HER2 aptamer conjugate and dFdCTP-EpCAM aptamer conjugate were subjected to pegylation according to a conventional method.
  • a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 5) containing a small DNA fragment having a hairpin structure d (GCG AAA GC) to which doxorubicin (Dox) can specifically bind 5'-GCG CGC GCG AAA GC G CGC GC-3' (Bioneer, Korea) and HER-2 aptamer (SEQ ID NO: 2) 5'-GGG AGG ACG AUG CGG GAC UGU ACG GGG CUC UGU GCA GAC GAC UCG CCC GA-3' (Biosynthesis, USA) at the end of thiol
  • the oligonucleotides introduced therein were custom-made.
  • the aptamer has increased stability with 2' F-Pyrimidine RNA.
  • the synthesized hairpin DNA and aptamer were reacted with 10 ⁇ L of 1.0 M dithiothreitol (DTT) in 0.1 M triethylammonium acetate (TEAA) buffer at room temperature for 15 minutes to perform 3' thiol activation.
  • DTT dithiothreitol
  • TEAA triethylammonium acetate
  • extraction was performed three or more times using ethyl acetate to remove excess DTT.
  • hairpin DNA and HER-2 aptamer were formed in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 50% DMSO and 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), and the ratio of activated aptamer to hairpin DNA was 1:1 and reacted at room temperature for 48 hours. A complex was formed under mild conditions through gentle shaking.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the hairpin DNA-HER2 aptamer construct was purified by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Separation was carried out using Eclipse XDB-C18 column, and the complex was separated through the gradient of binding buffer (95% 0.1 M TEAA, 5% Acetonitrile) and elution buffer (50% 0.1 M TEAA, 50% Acetonitrile). HPLC of the complex was performed, and peaks of HPLC were analyzed through mass spectroscopy, and only peaks consistent with the molecular weight of the hairpin DNA-aptamer structure were taken. In addition, freeze-drying was performed for use in the experiment.
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • Dox 500 ⁇ M
  • hairpin DNA-aptamer construct 20 ⁇ M
  • formaldehyde 0.37%
  • reaction buffer 20 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, 0.5 mM, EDTA, pH 7.0
  • Dox/DNA-HER2 aptamer conjugate was prepared at 10° C. for 12 hours.
  • Dox/DNA-HER2 aptamer conjugate was subjected to reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC) on a C-18 column using 0.1 M trithylamine acetate (trithylamine acetate, TEAA, Glen Research Corp. Glen Research Corp.) and acetonitrile. (ProStar, Varian, Walnut Creek, CA, USA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) was used as the eluent for purification.
  • HPLC reverse phase high performance liquid chromatography
  • the fluorescence intensity of Dox decreased as the amount of the hairpin DNA-HER2 aptamer structure increased ( FIG. 3 ). This is due to the quenching phenomenon between the bound Doxes.
  • the hairpin DNA-aptamer construct: Dox 1:1, no more Dox quenching occurred, so a Dox/DNA-aptamer conjugate was prepared by selecting a weight ratio of 1:1. Pegylation was performed on the Dox/DNA-aptamer conjugate.
  • HER-2 aptamer sequence (SEQ ID NO: 2) 5'-GGG AGG ACG AUG CGG GAC UGU ACG GGG CUC UGU GCA GAC GAC UCG CCC
  • An oligonucleotide was prepared by introducing thiol at the end of GA-3' (Biosynthesis, USA). ).
  • the aptamer has increased stability with 2' F-Pyrimidine RNA.
  • the synthesized aptamer was reacted with 10 ⁇ L of 1.0 M dithiothreitol (DTT) in 0.1 M triethylammonium acetate (TEAA) buffer at room temperature for 15 minutes to perform 3' thiol activation. In addition, extraction was performed three or more times using ethyl acetate to remove excess DTT.
  • DTT dithiothreitol
  • TEAA triethylammonium acetate
  • Maytansine (DM1) was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare a 10 mM stock.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the complex formation of HER-2 aptamer and DM1 was performed in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 50% DMSO and 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), and the ratio of aptamer to drug was 1:1000. and reacted at room temperature for 48 hours.
  • a DM1 and HER2 aptamer conjugate (hereinafter referred to as "DM1-HER2 aptamer conjugate”) was formed under mild conditions.
  • the DM1-HER2 aptamer conjugate was purified by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (FIG. 4). Separation was carried out using Eclipse XDB-C18 column, and the conjugate was isolated through the gradient of binding buffer (95% 0.1 M TEAA, 5% Acetonitrile) and elution buffer (50% 0.1 M TEAA, 50% Acetonitrile). HPLC of HER2 aptamer and DM1-HER2 aptamer conjugate was performed, and the peaks of HPLC were analyzed by mass spectroscopy. Among them, only peaks consistent with the molecular weight of the DM1-HER2 aptamer conjugate were taken. In addition, freeze-drying was performed for use in the experiment. Pegylation was performed on the DM1-HER2 aptamer conjugate.
  • a first solution is prepared by slowly dissolving 50 mg of the dFdCTP-HER2 aptamer conjugate or dFdCTP-EpCAM aptamer conjugate prepared in Example 1 in 0.25 ml of phosphate buffer saline (pH 7.0) with equimolar water. did. Then, a second solution was prepared by dissolving 20 mg of chitosan-glycolide (which may be substituted with trehalose, chondroitin sulfate or a combination thereof) in 0.25 ml of phosphate buffered saline (pH 7.0). Then, the first solution and the second solution were mixed and left for about 15 minutes to prepare a third solution.
  • chitosan-glycolide which may be substituted with trehalose, chondroitin sulfate or a combination thereof
  • PLGA 500 mg of RG 502H was dissolved in 3 ml of methylene chloride (MC) to prepare a fourth solution.
  • the third solution was added to the fourth solution and vigorously stirred and mixed (vortexed) for 15 seconds to prepare a W/O emulsion.
  • the W / O emulsion was injected with a syringe within 15 seconds into 1 L of PVA (20 wt%) / NaCl (0.9 wt%) solution as a dispersion solvent, and then stirred in a homomixer at 4,000 rpm and 4 minutes to prepare a solution of fine particles and examined with a scanning electron microscope (Tokyo, Japan) (FIG. 5).
  • a hardening process was performed by slowly stirring for 40 minutes, and then centrifuged at 2,500 rpm for 3 minutes to recover the fine particles. After centrifugation, 0.9wt% NaCl solution was added to the precipitate, redispersed, and centrifuged again to obtain a precipitate, and this process was repeated 3 times to perform a washing process.
  • dFdCTP-HER2 aptamer conjugate MP dFdCTP-EpCAM aptamer conjugate MP
  • Nano particles (NP)
  • PLGA nanoparticles were used to deliver the Dox/DNA-HER2 aptamer conjugate prepared in Example 2 or the DM1-HER2 aptamer conjugate prepared in Example 3 above.
  • the previously described water-in-oil-in-water (w/o/w) double emulsion method F, Danhier et al. Journal of Controlled release, vol.133(1), pp.11- 17, 2009
  • PLGA nanoparticles containing a targeting conjugate Dox/DNA-HER2 aptamer conjugate or DM1-HER2 aptamer conjugate
  • the targeting conjugate (1%, w/v), chitosan glycolide (1%, w/v) and PLGA (4%, w/v) were dissolved in dichloromethane, and deionized water was added to the solution in a 1:5 volume ratio.
  • a probe-type sonicator (Branson Digital Sonifier ® , Danbury, CT) was used to emulsify at room temperature for 60 seconds at 25 W output.
  • a single emulsion (w/o) was re-emulsified in an aqueous PVA solution (4%, w/v) and sonicated at 30 W for 120 seconds (w/o/w).
  • the double emulsion was poured into a PVA (1%, w/v) solution and stirred overnight to evaporate the solvent.
  • the nanoparticles containing the targeting conjugate were obtained by centrifugation at 16000 rpm, washed, and lyophilized to prepare nanoparticles from the prepared Dox/DNA-HER2 aptamer conjugate or DM1 and HER2 aptamer conjugate (hereinafter, The former is designated as "Dox/DNA-HER2 aptamer conjugate NP", the latter as “DM1-HER2 aptamer conjugate NP").
  • PLGA 50:50; intrinsic viscosity: 0.67 dl/g; molecular weight ⁇ 100 kDa
  • ACROS Absorbable Polymers
  • Pluronic ® F127 was purchased from Sigma-Aldrich (MO, USA).
  • PLGA NPs containing the dFdCTP-HER2 aptamer conjugate were prepared by solvent diffusion. Briefly, 0.8 ml of 18 mg/ml PLGA solution dissolved in 2,2,2-trifluoroethanol is mixed with 0.2 ml of a solution containing 200-500 ⁇ g dFdCTP-HER2 aptamer conjugate dissolved in TE buffer (pH 8.0). and mixed with The mixture was placed in 10 ml of 0.1% modified Pluronic ® F127-COOH (the hydroxyl groups of Pluronic ® F127 were changed to carboxyl groups) via a syringe pump (17.5 ml / h) while stirring the mixture at 250 rpm.
  • Pluronic ® F127-COOH the hydroxyl groups of Pluronic ® F127 were changed to carboxyl groups
  • a modified Pluronic ® F127 was used as a surfactant to impart reactive carboxyl groups to the particle surface.
  • PLGA NPs containing the produced dFdCTP-HER2 aptamer conjugate were dialyzed for 12-16 hours using a 1000 kDa molecular weight cut-off membrane, and the dialysate was washed twice.
  • the size and zeta potential of PLGA NPs containing the dFdCTP-HER2 aptamer conjugate were determined using a ZetaPALS dynamic light scattering system (ZetaPALS, Brookhaven Instruments Corp., NY, USA).
  • a suspension of PLGA NPs containing the dFdCTP-HER2 aptamer conjugate coated with Pluronic ® F127-COOH was prepared using 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, pH 6.5. buffered. Next, 100 mM 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) and 50 mM N-hydroxysulfosuccinimide and incubated with N-hydroxysulfosuccinimide for 15 minutes.
  • the activated carboxyl terminus of Pluronic ® F127-COOH on the surface of a PLGA NP containing a dFdCTP-HER2 aptamer conjugate was removed from the 2' F-Pyrimidine modified EpCAM aptamer sequence (SEQ ID NO: 4) 5' at room temperature for at least 6 hours.
  • -GGC GAC UGG UUA CCC GGU CG-3' (15 mM) was reacted with the amino terminus (Biosynthesis, USA).
  • the conjugated nanoparticles were dialyzed with purified water.
  • PLGA NP containing a dFdCTP-HER2 aptamer conjugate and nanoparticles with an external aptamer (PLGA containing a dFdCTP-HER2 aptamer conjugate having a 2' F-Pyrimidine-modified EpCAM aptamer as a ligand) NPs) were characterized using dynamic light scattering (ZetaPALS). After the reaction, the amount of free adapter was quantified over 30 minutes with a gradient of 5-90% acetonitrile by reverse-phase HPLC on a Vydac® Protein and Peptide C18 column. The peak was monitored by UV absorbance at 260 nm. The density of aptamer on the surface of the prepared nanoparticles was calculated from the total surface area assuming a general Guassian particle size distribution.
  • Example 4 In order to analyze the dFdCTP-HER2 aptamer conjugate release profile in the dFdCTP-HER2 aptamer conjugate MP prepared in 1. of Example 4, 100 mg of microparticles were used, and blank PLGA microparticles were used as a control. Specifically, the microparticles were placed in 1 ml PBS and placed on an orbital shaker. After collecting PBS at different time intervals, it was frozen, supplemented with 1 ml of PBS, and the concentration of the targeting conjugate was analyzed by Nanoodrop spectroscopy. The results are shown in FIG. 6 .
  • the average size of the Dox/DNA-HER2 aptamer conjugate NP and DM1-HER2 aptamer conjugate NP prepared in 2 of 4 above was measured with Malvern's Zetasizer Nano ZS (Malvern instruments, Worcestershire, UK). 1 mg of nanoparticles was dissolved in 1 mL of filtered deionized water. Five readings of mean size (nm), polydispersity (25°C, measuring angle 170°) were used. The surface morphology of nanoparticles was investigated with a scanning electron microscope (Tokyo, Japan) ( FIGS. 7 and 8 ).
  • the sizes of the Dox/DNA-HER2 aptamer conjugate NP and the DM1-HER2 aptamer conjugate NP prepared in Example 2, 2 were around 150-200 nm within an acceptable narrow size distribution.
  • the polydispersity index PDI ⁇ 0.1 was not significantly different before and after loading of the targeting conjugate. This result is consistent with previous studies that loading of the targeting conjugate in nanoparticles did not affect size compared to nanoparticles without drug. The same pattern was also observed in scanning electron microscopy analysis.
  • Dox/DNA-HER2 aptamer conjugate NP and DM1-HER2 aptamer conjugate NP were dissolved with 1N NaOH solution and then the NaOH solution was neutralized with 1N HCl solution.
  • Acetonitrile was added to the solution in which Dox/DNA-HER2 aptamer conjugate NP and DM1-HER2 aptamer conjugate NP were dissolved to dissolve Dox/DNA-HER2 aptamer conjugate NP and DM1-HER2 aptamer conjugate NP.
  • Dox/DNA-HER2 aptamer conjugate NP and DM1-HER2 aptamer conjugate NP were mixed with 5 mL of phosphate buffer (PBS). , pH 7.4) and incubated at 37° C. with stirring at the time of determination, and the solution was ultracentrifuged at 22000 g at 4° C. for 30 min. The supernatant was recovered, mixed with 5 mL of acetonitrile, the pellet was resuspended in 5 mL of PBS, and incubated again with stirring at 37°C. Each sample was injected in a volume of 50 ⁇ l and analyzed under the HPLC conditions described above.
  • PBS phosphate buffer
  • the content ratio of the Dox/DNA-HER2 aptamer conjugate and the DM1-HER2 aptamer conjugate loaded inside the nanoparticles was less than about 5.3%, and the encapsulation efficiency was about 40%.
  • the drug content ratio in the Dox/DNA-HER2 aptamer conjugate NP and the DM1-HER2 aptamer conjugate NP was reduced to a final less than 2.8%, and an encapsulation efficiency of 30%, suggesting that the loosely encapsulated drug was excreted.
  • a HER-2 negative breast cancer cell line MTT analysis was performed ( FIG. 9 ).
  • MDA-MB- a breast cancer cell line overexpressing HER-2 and EpCAM
  • MTT analysis was used in MCF-7, a HER2-negative and EpCAM-overexpressing breast cancer cell line, and MDA-MB-231, a HER2 and EpCAM-negative breast cancer cell line ( FIG. 10 ).
  • the results of processing the dFdCMP-HER2 aptamer conjugate MP and the dFdCMP-EpCAM aptamer conjugate MP (1 ⁇ M) and examining the proliferation level for 72 hours were MDA-MB overexpressing HER-2 and EpCAM.
  • Cell proliferation was significantly inhibited in -453, and HER2-negative and EpCAM-overexpressing, MCF-7, also significantly inhibited cell proliferation, but a decrease in proliferation of HER2 and EpCAM-negative breast cancer cell line MDA-MB-231 was not observed. .
  • the cancer cell killing effect of the DOX/DNA-HER2 aptamer conjugate NP was compared by MTT assay on MDA-MB-453, a breast cancer cell line overexpressing HER-2, and MCF-7, a HER-2 negative breast cancer cell line.
  • the IC 50 value of the DOX/DNA-HER2 aptamer conjugate NP was 0.34 ⁇ g/mL
  • the IC of doxorubicin (Dox) used as a control group was It showed similar cytotoxicity when compared with the value of 50, 0.29 ⁇ g/mL.
  • DOX/DNA-HER2 aptamer conjugate NP recognizes HER-2 in HER-2-positive breast cancer cells, and through endocytosis, doxorubicin is released into the cell and induces cancer cell death with strong toxicity. was verified.
  • DM1 or DM1-HER2 aptamer conjugate NPs were treated with 0, 0.1, 1. 3, 6, and 12 ⁇ g/mL, respectively, for 72 hours, and cell toxicity was compared through MTT assay. did.
  • the IC 50 value of the DM1-HER2 aptamer conjugate NP was 2.7 ⁇ g/mL, and the IC 50 value of DM1 used as a control group was 1.8 ⁇ g. It showed similar cytotoxicity when compared to /mL.
  • IC 50 value of DM1 was 1.8 ⁇ g/mL, whereas the IC 50 value of the DM1-HER2 aptamer conjugate NP could not be measured.
  • cytotoxicity results indicate that the drug carrier induces apoptosis by selectively delivering DM1 only to MDA-MB-453 overexpressing HER-2.
  • Mean ⁇ standard deviation (n 5).
  • DM1-HER2 aptamer conjugated NP recognizes HER-2 of HER-2-positive breast cancer cells, and DM1 is released into the cell through endocytosis and induces cancer cell death with strong toxic action. did.
  • DM1 0.1, 0.5, 2.5 mg/kg
  • DM1-HER2 aptamer conjugate NP 0.5 mg/kg

Abstract

압타머와 활성제(예를 들면, 치료제, 예방제, 또는 진단제)가 연결된 접합체(conjugates)를 내포하는 입자(나노입자 및 마이크로입자를 포함), 및 이의 약제학적 제형이 고안되었으며, 이들은 활성제의 개선된 시공간적 전달 및/또는 개선된 생체 분포를 제공할 수 있다. 상기 접합체, 입자 및 이의 제형의 제조방법이 제공된다. 예를 들면, 암 또는 감염성 질환을 치료 또는 예방하기 위해, 상기 제형을 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 방법이 제공된다.

Description

표적화 압타머 접합체를 캡슐화한 입자 및 이의 용도
본 발명은 일반적으로, 약물 전달을 위한 압타머, 이의 표적화 접합체(conjugate) 및 이들의 입자 분야에 관한 것이다.
약물 및 그 전달체계가 치료를 위하여 효과적으로 하기 위해 다음의 두 가지 조건을 갖추어야 이상적이다. 첫째, 투여 후 혈행(blood stream) 내에서 약물의 손실 없이 다양한 해부학적 또는 면역학적 장벽들을 뚫고 목표로 하는 표적 세포/조직조직에 도달할 수 있어야 하며, 둘째, 도달한 후에는 정상세포에는 영향을 미치지 않으면서 표적 세포만을 선택적으로 죽일 수 있어야 한다. 이러한 두 가지 기본 전략은 또한 약물의 세포 내 농도를 높이고 동시에 약물의 치료농도를 제약하는 독성을 줄임으로써 환자의 생존율과 삶의 질을 개선시키는데도 크게 작용한다. 이와 같은 효과 적인 약물전달체계가 갖추어야 할 구비 조건들을 만족시킬 수 있는 역량을 나노 및 마이크로 입자가 가지고 있다.
나노의학(nanomedicine)의 발달은 약물의 약제학적 성질을 향상시키고 세포-특이적 방식으로 표적화된 전달을 개선시키는 방향으로 나아간다. 몇몇 세포-특이적 약물은 문헌에 공지되어 있으며, 단클론 항체, 압타머, 펩티드, 및 소분자를 포함한다. 이들 약물의 몇몇 잠재적 이점들에도 불구하고, 크기, 안정성, 제조 비용, 면역원성, 불량한 약동학 및 기타 인자들을 포함하는 다수의 문제점은 이들의 임상 적용을 제한한다.
입자 약물 전달 시스템은 전신성 약물 전달에 매력적인데, 이는 약물 순환 반감기를 연장시키고, 비특이적 흡수를 감소시키고, 개선된 침투 및 체류(EPR: enhanced permeation and retention) 효과를 통해 종양에서 더 잘 축적시키는 이들의 능력 때문이다.
특정 기관 또는 조직에서 시공간적으로 조절되는 방식으로 약물 또는 약물 후보의 특정한 병든 세포 및 조직으로의, 예를 들면, 암 세포로의 효과적인 전달을 위한 나노기술의 발달은, 전신 독성과 같은 지금까지 직면하고 있는 치료학적 과제를 잠재적으로 극복할 수 있다. 그러나, 상기 전달 시스템의 표적화는 치료가 필요한 부위로 약물을 전달하지만, 방출되는 약물은 표적화된 세포 영역에서 효과적인 양으로 유지될 수 없다. 따라서, 개선된 약물 표적화 및 전달이 당업계에 필요하다.
따라서, 본 발명의 목적은, 시공간적 약물 전달을 위한 개선된 화합물, 조성물, 및 제형을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은, 개선된 화합물, 조성물, 및 제형을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 방법을 제공하는 것이다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) KR10-1653451 B
(특허문헌 2) KR10-1759209 B
본 발명의 목적은 상기 접합체, 입자 및 이의 제형의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 암 또는 감염성 질환을 치료 또는 예방하기 위해, 상기 제형을 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 약학적 용도를 제공하는데 있다.
압타머와 활성제(예를 들면, 치료제, 예방제, 또는 진단제)가 연결된 접합체(conjugates)를 내포하는 입자(나노입자 및 마이크로입자를 포함), 및 이의 약제학적 제형이 고안되었으며, 이들은 활성제의 개선된 시공간적 전달 및/또는 개선된 생체 분포를 제공할 수 있다. 상기 접합체, 입자 및 이의 제형의 제조방법이 제공된다. 예를 들면, 암 또는 감염성 질환을 치료 또는 예방하기 위해, 상기 제형을 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 방법이 제공된다.
상기 접합체는 입자의 투여 후에 방출된다. 상기 접합체는 상기 입자의 개선된 침투성 및 체류 효과(EPR) 및 개선된 전반적인 생체분포와 입자 내부에 있는 접합체를 사용하여, 입자 외부에 표적화된 입자 또는 캡슐화된 비표적화된 약물의 투여에 비해 더 큰 효능 및 내성을 제공한다.
상기 접합체는 압타머 및 활성제를 포함하고, 여기서, 상기 접합체는 하기 식을 갖는다:
A-B - (1)
A-(B)n - (2)
A-C-B - (3)
A-(C-B)n - (4)
A-C-B-C-D - (5)
A-(C-B)n-C-D - (6)
여기서, A는 압타머이고; B는 활성제이고; C는 링커이고; D는 중합체이며, n은 1 이상의 정수이다.
하나의 압타머는 2개 이상의 활성제에 접합될 수도 있는데, 예시적으로 식 2, 4 와 6일 수 있다.
상기 활성제는 치료제, 예방제, 약효 식품(nutraceutical), 및 진단제이다. 바람직하게는 화학치료제, 항감염제, 또는 이들의 병용물이다. 예를 들면, 상기 활성제는 DM1, 독소루비신, 뉴클레오사이드 치료제, 또는 이의 유사체 또는 유도체일 수 있다.
상기 압타머는 특정 세포/조직에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이며 화학 합성할 수 있다. 압타머는 인산기의 음전하를 이용한 이온 결합, 리보스를 이용한 소수 결합 및 수소 결합, 핵산 염기를 이용한 수소 결합이나 스태킹 결합 등 다양한 결합 양식에 의해 표적 물질과 결합한다.
상기 접합체는 활성제와 압타머 각각에 있는 관능기에 의해 효소 및 유기합성으로 제조할 수도 있고, 또한 활성제 및 압타머를 관응기와 스페이서로 구성된 링커를 사용하여 접합체를 형성할 수도 있으며 한 쪽 말단에 pegylation될 수도 있다. 상기 링커는 원하는 방출 부위에서 활성제를 방출시킬 수 있다.
상기 접합체를 중합체 매트릭스를 이용하여 캡슐화하는 입자의 제조방법이 제공된다. 상기 입자의 내부에는 한 종류 이상의 이종 접합체를 내재하는 것을 특징으로 한다. 상기 중합체성 매트릭스는 소수성 중합체, 친수성 중합체, 및 이들의 공중합체일 수 있으며 상기 중합체 매트릭스는 특정 세포/조직에 특이적으로 결합하는 리간드를 연결된 중합체일 수도 있다.
상기 입자를 제조하는 과정에서 트레할로오스(trehalose), 키토산-글리콜라이드, 콘드로이친 설페이트 또는 이의 조합물 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 접합체를 보호할 수도 있다.
상기 입자를 이용한 질환 또는 병태의 치료방법도 제공되는데, 상기 방법은 치료학적 유효량의 접합체 함유 입자를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함한다. 상기 입자는, 림프종, 신장암종, 백혈병, 전립선암, 폐암, 췌장암, 흑색종, 대장암, 난소암, 유방암, 다형성교모세포종, 위암, 간암, 육종, 방광암, 고환암, 식도암, 두경부암, 자궁내막암 및 연수막 암종증을 포함하는 암 또는 증식성 질환을 표적화한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 표적화 접합체, 이를 내재하는 입자, 그리고 이를 포함하는 약제학적 조성물, 약물 전달 시스템 및 약물 운반 방법에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 입자는 표적화 접합체를 내포하여 유체역학적 크기를 가지면서 수용성 환경에서 균일하게 분포한다.
(c) 또한, 본 발명의 입자 제형은 안정적인 단일복합체의 형성을 통해 생리학적 환경에 풍부한 뉴클레아제들(예컨대, 혈청 뉴클레아제들)로부터 표적화 접합체를 보호할 수 있고, 상기 입자에서 지속적으로 방출하는 접합체는 표적화 능력을 제공할 수 있다
(d) 따라서, 본 발명의 입자 및 이를 포함하는 조성물 및 시스템은 활성제를 안정적으로 특정 세포/조직에 운반할 수 있으며, 상기 활성 성분에 따라 다양한 질환(구체적으로, 암)의 치료 또는 검출에 효과적으로 적용될 수 있다.
도 1은 내부에 표적화 접합체가 있고 리간드가 외부에 없는 입자(a) 또는 외부에 있는 입자(b)이고
도 2는 dFdCTP-HER2 압타머 접합체와 dFdCMP-EpCAM 압타머 접합체를 전기영동한 결과이고
도 3은 Dox에 DNA-HER2 압타머 구조체를 부가하면서 반응구에서 Dox의 형광세기를 측정한 결과이고
도 4는 DM1-HER2 압타머 접합체를 HPLC로 분석한 결과이고
도 5는 dFdCMP-HER2 압타머와 dFdCMP-EpCAM 압타머 MP의 현미경 사진이고
도 6은 dFdCMP-HER2 압타머와 FddCMP-EpCAM 압타머 MP에서 dFdCTP-HER2 압타머 접합체와 dFdCMP-EpCAM 압타머 접합체 방출 프로파일이고
도 7은 Dox/DNA-HER2 압타머 NP의 현미경 이미지이고
도 8은 DM1-HER2 압타머 NP의 현미경 이미지이고
도 9는 dFdCMP-HER2 압타머와 dFdCMP-EpCAM 압타머 MP를 처리한 HER-2가 과다 발현하는 MDA-MB-453(a)과 HER-2 negative MCF-7(b)를 MTT 분석한 결과이고
도 10은 dFdCMP-HER2 압타머와 dFdCMP-EpCAM 압타머 MP를 처리한 HER-2와 EpCAM이 과다 발현하는 MDA-MB-453(a), HER2 negative이고 EpCAM가 과다 발현하는 MCF-7(b) 과 HER2와 EpCAM negative MDA-MB-231(c)을 MTT 분석한 결과이고
도 11은 DOX/DNA-HER2 압타머 NP를 처리한 HER-2가 과다 발현하는 MDA-MB-453과 HER-2 negative MCF-7를 MTT 분석한 결과이고
도 12는 DM1-HER2 압타머 접합체 NP 를 처리한 HER-2가 과다 발현하는 MDA-MB-453과 HER-2 negative MCF-7를 MTT 분석한 결과이고
도 13은 28일간 종양 부피(tumor volume)를 측정한 결과이고
도 14는 28일간 마우스의 체중을 측정한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 특정 기관 또는 조직에서 시공간적으로 조절되는 방식으로 약물 또는 약물 후보의 특정한 병든 세포 및 조직으로의, 예를 들면, 암 세포로의 효과적인 전달을 위한 입자를 개발하고자 노력하였다. 그 결과로 압타머와 활성제(예를 들면, 치료제, 예방제, 또는 진단제)가 연결된 접합체(conjugates)를 내포하는 입자(나노입자 및 마이크로입자를 포함), 및 이의 약제학적 제형이 고안하였으며, 이들은 활성제의 개선된 시공간적 전달 및/또는 개선된 생체 분포를 제공할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 압타머(aptamer)와 활성제가 연결된 접합체가 중합체성 매트릭스 내로 캡슐화된 입자를 제공한다.
상기 압타머는 서열번호 2로 표시되는 HER2(Human epidermal growth factor receptor 2) 압타머 또는 서열번호 4로 표시되는 EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule) 압타머인 것이 바람직하다.
상기 활성제는 dFdCTP 또는 DM1(mertansine)인 것이 바람직하다.
상기 dFdCTP는 상기 압타머 서열에 통합되는 것이 바람직하다.
상기 압타머와 활성제 사이에 상기 활성제에 결합할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는 것이 바람직하다.
상기 활성제는 독소루비신(Doxorubicin)이고, 상기 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 서열번호 5로 표시되는 것이 바람직하다.
상기 접합체에는 트레할로오스(trehalose), 키토산-글리콜라이드, 콘드로이친 설페이트 또는 이의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가하는 것이 바람직하다.
상기 중합체성 매트릭스는 소수성 중합체, 친수성 중합체, 및 이들의 공중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 중합체를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 중합체성 매트릭스는 폴리하이드록시산, 폴리하이드록시알카노에이트, 올리카프로락톤, 폴리(오르토에스테르), 폴리무수물, 폴리(포스파젠), 폴리(락티드-co-카프로락톤), 폴리카보네이트, 폴리에스테르아미드, 폴리에스테르, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀성 알콜), 폴리비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(하이드록시산), 폴리(비닐 알콜), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(락트산-co-글리콜산), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌글리콜), 및 이들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 중합체 매트릭스는 특정 세포/조직에 특이적 결합을 하는 리간드가 연결되는 것이 바람직하다.
상기 리간드는 서열번호 4로 표시되는 EpCAM 압타머인 것이 바람직하다.
상기 접합체는 상기 입자의 총 중량을 기준으로 하여, 0.1% 내지 10 % (w/w)의 양으로 존재하는 것이 바람직하다.
상기 입자는 미립자(micro particles) 또는 나노입자(nano particles)인 것이 바람직하다.
바람직한 구체예로서, 본 발명은 상기 본 발명에 기재된 입자를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 암은 HER2 또는 EpCAM 과발현에 의한 것이 바람직하다.
바람직한 구체예로서, 본 발명은 (a) 압타머와 활성제가 연결된 접합체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 접합체를 중합체성 매트릭스 내로 캡슐화하는 단계를 포함하는 입자의 제조방법을 제공한다.
이하에서는, 본 발명의 상기 입자, 약학적 조성물 및 그 제조방법에 따른 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다.
I. 정의
본원에 사용된 용어들 "대상체" 또는 "환자"는, 입자들이, 예를 들면, 실험, 치료, 진단 및/또는 예방 목적을 위해 투여될 수 있는 임의의 유기체를 나타낸다. 통상적인 대상체는 동물(예를 들면, 마우스, 래트, 래빗, 사람이 아닌 영장류, 및 사람과 같은 포유류) 및/또는 식물을 포함한다.
본원에 사용된 용어들 "치료하는" 또는 "예방하는"은, 질환, 장애 및/또는 병태에 걸리기 쉬울 수 있지만 질환, 장애 및/또는 병태를 아직 진단받지 않은 동물에서 발생하는 질환, 장애 또는 병태의 예방; 질환, 장애 또는 병태의 억제, 예를 들면, 이의 진행의 지연; 및 질환, 장애 또는 병태의 완화, 예를 들면, 질환, 장애 및/또는 병태의 경감 유도를 포함할 수 있다. 질환, 장애, 또는 병태의 치료는, 진통제가 통증의 원인은 치료하지 않을지라도 진통제의 투여에 의해 대상체의 통증을 치료하는 것과 같이, 기본 병리생리학에 영향을 미치지 않을지라도, 특정 질환, 장애, 또는 병태 중 적어도 하나의 징후를 개선시킴을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "표적"은, 표적화된 작제물이 결합하는 부위를 의미할 것이다. 표적은 생체내 또는 시험관내일 수 있다. 특정 양태에서, 표적은 백혈병 또는 종양(예를 들면, 뇌, 폐(소세포 및 비-소세포), 난소, 전립선, 유방 및 결장의 종양 뿐만 아니라 기타 암종 및 육종)에서 발견된 암 세포일 수 있다. 기타 양태에서, 표적은 감염 부위(예를 들면, 세균, 바이러스에 의한(예를 들면, HIV, 포진, 간염)) 및 병원성 균류(예를 들면, 칸디다속(Candida sp.))일 수 있다. 특정 표적 감염 유기체는 약물 내성인 것들(예를 들면, 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 엔테로코쿠스(Enterococus), 하에모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 나이세리아 고노르호에아에(Neisseria gonorrhoeae), 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 시겔라 다이젠테리아에(Shigella dysenteriae), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)를 포함한다. 기타 양태에서, 표적은 합텐, 에피토프, 수용체, dsDNA 단편, 탄수화물 또는 효소와 같은 압타머 또는 압타머 결합에 결합하는 분자 구조를 나타낼 수 있다. 추가로, 표적은 조직, 예를 들면, 뉴런 조직, 장 조직, 췌장 조직 등의 일종일 수 있다.
상기 방법 또는 배위 착물에 대한 표적으로서 기능할 수 있는 "표적 세포"는 효모균, 식물 세포 및 동물 세포를 포함하는 원핵생물 및 진핵생물을 포함한다. 본 발명의 방법을 사용하여, 세포가 식물 조직 또는 동물 조직의 일부를 형성하거나, 다르게는 식물 조직 또는 동물 조직에 존재하는, 시험관내, 즉 세포 배양에서 또는 생체내 살아 있는 세포의 세포 기능을 변경시킬 수 있다. 따라서, 표적 세포는, 예를 들면, 혈액, 림프 조직, 경구 및 인두 점막과 같은 소화관을 라이닝하는(lining) 세포, 소장의 융모를 형성하는 세포, 대장을 라이닝하는 세포, (본 발명의 흡입에 의해 접촉할 수 있는) 동물의 호흡 기관(비강/폐)을 라이닝하는 세포, 진피/상피 세포, 질및 직장 세포, 태반 세포를 포함하는 내부 장기의 세포 및 소위 혈액/뇌 장벽 등을 포함할 수 있다.
용어 "치료 효과"는 당업계에 인지되어 있으며, 약리학적으로 활성인 물질에 의해 초래된 동물, 특히 포유류, 보다 특히 사람에서의 국소 또는 전신 효과를 나타낸다. 따라서, 용어는, 질환의 진단, 처치(cure), 완화, 치료(treatment) 또는 예방에, 그리고 동물 또는 사람에서 바람직한 육체적 또는 정신적 발달 및 상태의 개선에 사용하기 위해 의도된 임의의 물질을 의미한다.
용어 "조절(modulation)"은 당업계에 인지되어 있으며, 반응의 상향 조절(즉, 활성화 또는 자극), 하향 조절(즉, 억제 또는 억압), 또는 두 가지의 조합 또는 개별을 나타낸다.
본원에 사용된 용어들 "활성제"는, 제한 없이, 체내에서 국부로 또는 전신으로 작용하는 생리학적으로 또는 약리학적으로 활성인 물질을 포함한다. 생체활성제는 치료를 위해 사용되는 물질(예를 들면, 치료제), 예방을 위해 사용되는 물질(예를 들면, 예방제), 진단을 위해 사용되는 물질(예를 들면, 진단제), 질환 또는 병의 치료 또는 완화를 위한 물질, 신체의 구조 또는 기능에 영향을 미치는 물질, 또는 프로드럭이며, 이들은 소정의 생리적 환경에 놓여진 후에 생물학적으로 활성화되거나 생물학적으로 보다 활성화된다.
용어 "프로드럭"은, 시험관내 및/또는 생체내 생물학적 활성 형태로 전환되는 핵산 또는 단백질을 포함하는 제제를 나타낸다. 프로드럭은, 몇몇 경우, 이들이 모(parent) 화합물보다 쉽게 투여될 있기 때문에, 유용할 수 있다. 예를 들면, 프로드럭은 경구 투여에 의해 생체이용 가능한 반면, 모 화합물은 생체이용 가능하지 않다. 프로드럭은 모 약물에 비해 약제학적 조성물에서의 개선된 용해도를 가질 수도 있다. 프로드럭을 효소 공정 및 대사성 가수분해를 포함하는 다양한 메카니즘에 의해 모 약물로 전환시킬 수 있다.
본원에 사용된 용어 "생체적합성(biocompatible)"은, 수용자에게 일반적으로 비독성이고 수용자에게 상당한 부작용을 초래하지 않는 임의의 대사물 또는 이의 분해 산물을 함께 갖는 물질을 나타낸다. 일반적으로 말하면, 생체적합성 물질은, 환자에게 투여되는 경우 상당한 염증성 또는 면역 반응을 유도하지 않는 물질이다.
본원에 사용된 용어 "생체분해성(biodegradable)"은 일반적으로, 생리적 상태하에 대상체에 의해 대사될 수 있거나, 제거될 수 있거나, 분비될 수 있는 더 작은 단위 또는 화학적으로 분해 또는 침식될 물질을 나타낸다. 분해 시간은 조성물 및 모폴로지의 함수이다. 분해 시간은 수시간 내지 수주일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은, 타당한 의학적 판단 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 사람과 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 대리인의 가이드라인, 예를 들면, 미국 식품의약국에 따라, 합리적인 유익성/위험성 비율에 상응하는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 용량형을 나타낸다. 본원에 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체"는, 생체내 조성물의 전달을 촉진시키는 약제학적 제형의 모든 성분들을 나타낸다. 약제학적으로 허용되는 담체는 희석제, 방부제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 팽윤제, 충전제, 안정화제, 및 이들의 배합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "분자량"은 일반적으로, 물질의 질량(mass) 또는 평균 질량을 나타낸다. 중합체 또는 올리고머인 경우, 분자량은 상대적 평균 쇄 길이 또는 상대적 벌크 중합체의 쇄 질량을 나타낼 수 있다. 실제로, 중합체 및 올리고머의 분자량은 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 또는 모세관 점도측정법을 포함하는 다양한 방식으로 추정하거나 특성확인할 수 있다. GPC 분자량은 수평균 분자량(Mn)과는 대조적인 중량 평균 분자량(Mw)으로 기록한다. 모세관 점도측정법은 농도, 온도, 및 용매 조건의 특정 설정을 사용하여 희석한 중합체 용액으로부터 측정된 고유 점도로서 분자량의 추정치를 제공한다.
본원에 사용된 용어 "소분자"는 일반적으로, 분자량이 2000 g/mol 미만, 1500 g/mol 미만, 1000 g/mol 미만, 800 g/mol 미만, 또는 500 g/mol 미만인 유기 분자를 나타낸다. 소분자는 비-중합체성 및/또는 비-올리고머성이다.
본원에 사용된 용어 "친수성"은, 물과 쉽게 상호작용하는 강한 극성 그룹을 갖는 물질을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "소수성"은, 물에 대한 친화도가 부족한; 물을 물리치고 흡수하지 않을 뿐만 아니라 물 중에 용해되지 않거나 물과 혼합되지 않는 경향이 있는 물질을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "친유성"은, 지질에 대한 친화도를 갖는 화합물을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "양쪽성"은, 친수성 및 친유성(소수성) 성질들을 조합한 분자를 나타낸다. 본원에 사용된 "양쪽성 물질"은, 소수성 또는 보다 소수성인 올리고머 또는 중합체(예를 들면, 생체분해성 올리고머 또는 중합체) 및 친수성 또는 보다 친수성인 올리고머 또는 중합체를 함유하는 물질을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "반응성 커플링 그룹"은, 제2 관능성 그룹과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 임의의 화학적 관능성 그룹을 나타낸다. 반응성 커플링 그룹의 선택은 당업자의 기량 내에 있다. 반응성 커플링 그룹의 예는 1급 아민(-NH2) 및 아민-반응성 연결 그룹, 예를 들면, 이소티오시아네이트, 이소시아네이트, 아실아지드, NHS 에스테르, 염화설포닐, 알데하이드, 글리옥살, 에폭사이드, 옥시란, 카보네이트, 아릴 할로겐화물, 이미도에스테르, 카보디아미드, 무수물, 및 플루오로페닐 에스테르를 포함할 수 있다. 이들 대부분은 아실화 또는 알킬화에 의해 아민으로 접합체된다. 반응성 커플링 그룹의 예는 알데하이드(-COH) 및 알데하이드 반응성 연결 그룹, 예를 들면, 하이드라지드, 알콕시아민, 및 1급 아민을 포함할 수 있다. 반응성 커플링 그룹의 예는 티올 그룹(-SH) 및 설프하이드릴 반응성 그룹, 예를 들면, 말레이미드, 할로아세틸, 및 피리딜 디설파이드를 포함할 수 있다. 반응성 커플링 그룹의 예는 광반응성 커플링 그룹, 예를 들면, 아릴 아지드 또는 디아지린을 포함할 수 있다. 커플링 반응은 촉매, 열, pH 완충액, 광, 또는 이들의 조합의 사용을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "공중합체"는 일반적으로, 2개 이상의 상이한 단량체로 이루어진 단일 중합체성 물질을 나타낸다. 상기 공중합체는 임의의 형태, 예를 들면, 램덤, 블록, 그래프트 등일 수 있다. 상기 공중합체는 캡핑된 또는 산 말단 그룹을 포함하는 임의의 말단-그룹(end-group)을 가질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "평균 입자 크기"는 일반적으로, 조성물 내의 입자의 통계상 평균 입자 크기(직경)를 나타낸다. 본질적으로 구형 입자의 직경은 물리적 또는 유체역학적 직경으로서 나타낼 수 있다. 비-구형 입자의 직경은 우선적으로 상기 유체역학적 직경을 나타낼 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 비-구형 입자의 직경은 입자의 표면 상의 두점 간의 최대 직선 거리를 나타낼 수 있다. 평균 입자 크기는 당업계에 공지된 방법, 예를 들면, 동적 광 산란을 사용하여 측정할 수 있다. 나노입자의 제1 집단의 통계상 평균 입자 크기가 나노입자의 제2 집단의 통계상 평균 입자 크기의 20% 이내, 보다 바람직하게는 15% 이내, 가장 바람직하게는 10% 이내인 경우, 두 집단은 "실질적으로 동등한 평균 입자 크기"를 갖는다고 할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "균질한 크기 분포"는, 모두가 동일하거나 거의 동일한 크기를 갖는 입자, 마이크로입자, 또는 나노입자의 집단을 기술한다. 본원에 사용된 바와 같이, 단분산성 분포는, 분포의 90%가 평균 입자 크기의 5% 이내에 있는 입자 분포를 나타낸다.
용어들 "폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"은 일반적으로, 아미노산 잔기의 중합체를 나타낸다. 본원에 사용된 용어는 또한, 하나 이상의 아미노산이 상응하는 천연-발생 아미노산의 화학적 유사체 또는 개질된 유도체인 아미노산 중합체에도 적용한다. 본원에 일반저으로 사용된 용어 "단백질"은, 펩티드 결합에 의해 서로 연결되어, 쇄 길이가 3급 및/또는 4급 구조를 생성하기에 충분한 폴리펩티드를 형성하는 아미노산의 중합체를 나타낸다.
용어 "단백질"은, 단백질로 간주되는데 필요한 필수 고차 구조가 부족 작은 펩티드는 정의상 제외된다.
용어들 "핵산," "폴리뉴클레오티드," 및 "올리고뉴클레오티드"는, 선형 또는 원형 배열, 및 단일- 또는 이중-가닥 형태로 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 나타낸다. 이들 용어들은, 중합체의 길이와 관련하여 제한하는 것으로 해석되지는 않는다. 상기 용어들은 천연 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티들(예를 들면, 포스포로티오에이트 골격)에서 개질된 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함할 수 있다. 일반적으로 그리고 달리 명시되지 않는 한, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기쌍 특이성을 갖는데, 즉 A의 유사체는 T와의 염기쌍일 것이다. 용어"핵산"은, 일련의 적어도 두 개의 염기-당-포스페이트 단량체 단위를 나타내는 당업계의 용어이다. 뉴클레오티드는 핵산 중합체의 단량체 단위이다. 상기 용어는 전령 RNA, 안티센스, 플라스미드 DNA, 플라스미드 DNA의 일부 또는 바이러스로부터 유도된 유전 물질의 형태로 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함한다. 안티센스는 DNA 및/또는 RNA 기능을 방해하는 폴리뉴클레오티드이다. 용어 핵산은, 일련의 적어도 두 개의 염기-당-포스페이트 조합을 나타낸다. 천연핵산은 포스페이트 골격을 가지며, 인공 핵산은 다른 유형의 골격을 포함할 수 있지만, 동일한 염기를 포함한다. 상기 용어는 PNA(펩티드 핵산), 포스포로티오에이트, 및 천연 핵산의 포스페이트 골격의 기타 변이체도 포함한다.
단백질, 폴리펩티드 또는 핵산의 "절편"은, 서열이 전장 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일하지 않지만 전장 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산으로서 적어도 하나의 기능을 보유하는 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산이다. 절편은, 상응하는 천연 분자로서 더 많거나, 더 적거나, 동일한 수의 잔기를 가질 수 있으며/있거나, 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환을 가질 수 있다. 핵산의 기능(예를 들면, 암호화 기능, 또 다른 핵산으로 혼성화시키는 능력)을 측정하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 유사하게는, 단백질 기능을 측정하는 방법도 익히 공지되어 있다. 예를 들면, 폴리펩티드의 DNA 결합 기능은, 예를 들면, 필터-결합, 전기영동 이동성 이동(electrophoretic mobility shift), 또는 면역침강 검정에 의해 측정할 수 있다.
DNA 절단은 겔 전기영동에 의해 분석될 수 있다. 단백질의 또 다른 단백질과의 상호작용 능력은, 예를 들면, 동시-면역침강, 두 하이브리드 검정(two-hybrid assay) 또는 상보성, 예를 들면, 유전학 또는 생화학에 의해 측정할 수 있다[참조예: Fields et al. (1989) Nature 340:245-246; U.S. Patent No. 5,585,245 및 PCT WO 98/44350]
본원에 사용된 용어 "링커"는 2개 이상의 관능기를 갖는 분자이고, 하나는 압타머를 포함하는 리간드 등의 생물학적 분자 또는 이의 단편에 결합하거나 달리는 회합하기 위한 것이고, 다른 하나는 활성제에 접합하기 위한 것이다. "링커"는 헤테로원자(예를 들면, 질소, 산소, 황 등)를 포함할 수 있고 1개 내지 50개 원자 길이일 수 있는 탄소 쇄를 갖을 수 있다. 링커는 수소 원자, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬아미노, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아릴, 헤테로사이클릭, 방향족 헤테로사이클릭, 시아노, 아미드, 카바모일, 카복실 산, 에스테르, 티오에테르, 알킬티오에테르, 티올, 및 우레이도 그룹을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 치환체로 치환될 수 있다. 당업자들은 이들 그룹 각각이 다시 치환될 수 있음을 인지할 것이다. 링커의 예는 pH-감작성 링커, 프로테아제 절단성 펩티드 링커, 뉴클레아제 감작성 핵산 링커, 리파제 감작성 지질 링커, 글리코시다제 감작성 탄수화물 링커, 저산소증 감작성 링커, 광-절단성 링커, 열-불안정성 링커, 효소 절단성 링커(예를 들면, 에스테라제 절단성 링커), 초음파-감작성 링커, 및 x-선 절단성 링커를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "약제학적으로 허용되는 짝이온"은 약제학적으로 허용되는 음이온 또는 양이온을 나타낸다. 다양한 양태에서, 상기 약제학적으로 허용되는 짝이온은 약제학적으로 허용되는 이온이다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염(들)"은 본 발명의 조성물에 사용된 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 그룹의 염을 나타낸다. 자연에서 염기성인 본 발명의 조성물에 포함된 화합물은 다양한 무기 및 유기산을 갖는 매우 다양한 염을 형성할 수 있다.
본원에 기재된 화합물을 산 부가염으로서 수득하는 경우, 유리 염기는 산 염의 용액을 염기성화시킴에 의해 수득할 수 있다. 반대로, 생성물이 유리 염기인 경우, 부가염, 특히 약제학적으로 허용되는 부가염은, 염기 화합물로부터 산 부가염을 제조하기 위한 통상적인 과정에 따라, 유리 염기를 적합한 유기 용매 중에 용해시키고, 상기 용액을 산으로 처리함에 의해 제조될 수 있다. 당업자는 비독성의 약제학적으로 허용되는 부가염을 제조하기 위해 사용될 수 있는 다양한 합성 방법을 인지할 것이다.
용어 "생체 이용율"은 당업계에서 인지되어 있으며, 투여되는 형태 또는 이의 투여량의 일부가 이것이 투여되는 대상체 또는 환자에게 흡수되거나 혼입되거나 다르게는 생리학적으로 가용하도록 하는 본 발명의 형태를 나타낸다.
II. 접합체
또한, 본 발명에서 사용된 용어 ‘표적화 약물’은 생체내에 투입시 화학적 또는 생화학적 반응을 통하여 생체 질환의 일부 또는 전부를 경감 또는 치유할 수 있거나, 질병의 악화 방지를 시킬 수 있는 “표적화 접합체”를 의미한다.
상기 표적화 접합체는 처음에는 항체에 약물을 직접 부착한 형태의 입자 제조가 시도되었으며 이러한 단순 구조의 면역접합체(immunoconjugate)가 항체에 의한 능동 표적을 통하여 효과적인 종양억제작용을 보이리라 기대했었다. 그러나 지금까지 진행된 임상 시험에서 그다지 효과적인 결과를 얻지 못하였다. 그 이유 중 하나는 표적 항체의 활성을 유지하면서 항체에 부착할 수 있는 약물의 양에 한계가 있다는 것이다.
최근 폴리머나 리포좀과 같은 다양한 종류의 약물 전달체들이 개발되고 소개됨에 따라 초기의 항체-약물 직접접합체와 달리 항체의 친화도에 영향을 주지 않으면서 보다 많은 약물을 표적 나노 입자에 결합할 수 있게 되었다.
최근에 개발된 능동 표적화 약물의 경우에는 삼중 구조(a ligand or antibody as a targeting moiety, a polymer or lipid as a carrier, and an active chemotherapeutic drug)를 택하고 있다. 이러한 삼중 구조의 나노입자를 만들 때에는 보다 효과적인 약물전달을 위하여 몇 가지 고려하여야 할 점들이 있다.
종양 특이 표적이 되기 위해서 종양세포 표면 항원 및 수용체들은 다음과 같은 특성을 갖추어야 이상적이다. 첫째, 정상세포에서는 발현되지 않고 종양세포에서만 발현되어야 한다. 그러나 실제로는 대부분의 항원들이 정상세포에서도 발현되고 다만 상대적으로 종양세포에서 과발현될 뿐이며 따라서 표적 종양세포 표면에 위치하는 수용체의 밀집도(density)가 중요하다. 둘째, 모든 표적 종양세포에서 균질(homogenous)하게 발현되어야 한다. 그러나 잘 알려진 대로 종양세포들은 조직학적, 유전자적, 분자생물학적으로 이질성(heterogeneity)을 보이기 때문에 같은 종양 내에서도 서로 다른 표현형(phenotype)을 보이는 경우가 많다. 따라서 항원의 발현 역시 균질하지 않다. 마지막으로 혈액 내로 유리되어서는 안 된다. 그럴 경우 유리된 항원이 세포표면 항원과 경쟁하여 표적 나노 입자와 결합함으로써 약물의 효과를 떨어뜨리게 된다. 본 발명은 한 종류 이상의 이종 표적화 접합체들을 동시에 사용하여 종양의 이질성에 따른 문제를 극복하고자한다.
표적 입자가 목표로 하는 세포표면에 결합한 후 세포 내로 유입될 수 있는가 하는 것은 적절한 표적 리간드를 선택하는 데 있어 중요한 기준이다. 세포 내로 유입되지 않는 항체 또는 리간드를 이용하여 접합체를 만든 경우 세포 표면 또는 바깥 근처에서 약물이 유리되기 때문에 유리된 약물이 세포 내로 유입되지 못하는 경우가 생길 수 있다. 따라서 세포 내로 유입된 후 세포질 내에서 약물이 유리되는 경우에 비하여 세포 내 약물 농도가 낮을 수 밖에 없다.
세포 내 유입은 흔히 수용체 매개 내포화(receptor mediated endocytosis)를 통하여 이루어진다. 엽산 수용체의 예를 들면, 이 수용체를 표적으로 하는 엽산(folic acid)과 연결된 나노 입자가 세포표면의 수용체와 결합하면 세포막이 함몰되면서 수용체와 결합된 나노 입자를 에워싸 내포(endosome)를 형성하게 된다. 세포질 내로 이동한 내포 내의 산성화 또는 효소(lysozyme)의 활성화를 통하여 엽산-약물접합체로부터 약물이 세포질 내로 유리되게 되고 이후 각 약물의 작용 기전에 따라 세포내에서 효과를 발휘하게 된다.
한편, 엽산 수용체는 다시 세포막 표면으로 이동하여 재발현됨으로써 새로운 엽산-약물접합체와 결합, 같은 과정이 반복되게 된다. 수용체 매개 내포화 과정에서 보이는 이러한 엽산 수용체의 세포 내 회전율(recycling rate)은 종양세포의 종류에 따라 다양하며, 약물 투여의 빈도를 결정하는 데 중요한 지표가 된다. 만일 수용체의 회전율보다 더 빈번하게 약물을 투여할 경우, 결국 수용체와 결합하지 못하는 약물접합체가 세포 외에 축적되어 치료의 효과는 떨어지고 부작용만을 야기할 수 있다. 수용체의 회전율 이외에도 수용체 또는 항원의 종류, 밀집도, 친화도 등도 이러한 세포 내 유입과정에 영향을 미칠 수있다.
리간드는 엽산, transferrin, 성장인자와 같은 자연 물질이며 주로 세포표면 수용체와 결합을 한다. 항체에 비하여 분자량이 작고 면역반응이 적은 장점이 있다. 이러한 리간드를 이용하여 제작된 수용체 표적 접합체들은 주로 수용체 매개 내포화를 통하여 세포 내로 유입된다. 최근 항체제작 공학의 발전에 힘입어 다양한 종류의 항체들이 능동표적기전에 적용되고 있다. whole monoclonal antibody(mAb) 또는 이가성 항체 절편(divalent engineered antibody fragment)의 경우에는 높은 결합력을 갖는 최소한 2개 이상의 결합 부위를 갖는다. 그러나 반면 항체 Fc 부위(antibody Fc domain)가 면역반응을 유발하여 대식세포에 의하여 혈행 내에서 급격히 제거되는 단점도 있다.
쥐 항체(murine antibody)를 암치료를 위하여 처음 사용하였을 때 심각한 면역반응이 문제였다. 그러나, 이후 chimeric mAb, humanized mAb, 마침내 full human mAb가 개발되면서 이러한 부작용은 점차 감소하였다.
항체 절편[antibody fragments：F(ab)2, Fab, scFv]의 경우에는 Fc 부위가 없기 때문에 면역반응이 줄어 혈행내에서 오랫동안 잔존할 수 있게 되었으며, whole monoclonal antibody에 비하여 크기가 작기 때문에 보다 효과적으로 종양조직 내로 침투, 축적될 수 있는 장점을 겸비하고 있다. 그러나 다가성(multivalent) 결합부위의 소실로 인한 항원과의 결합력 약화가 문제이다. 이런 경우 전달체의 표면에 여러 개의 항체절편을 동시에 부착하거나 이가성, 또는 다가성 항체절편을 만들어 항체의 결합력을 향상시킬 수 있다.
엽산 수용체는 가장 잘 알려진 종양 마커로 비타민인 엽산 및 엽산-약물접합체와 높은 친화도로 결합하며, 수용체 매개 내포화를 통하여 세포 내로 유입된다. 그러나 비록 종양세포에서 과발현되기는 하지만 일부 정상세포에서도 발견된다. 두경부 원발 및 전이암 환자의 종양조직을 이용하여 엽산 수용체의 발현빈도를 조사하여 보았는데, 대조군인 정상 골수에서는 전혀 발현이 되지않은 반면 53%의 종양조직에서 수용체의 발현이 관찰되었다. 또한 최근 헤파린을 전달체로 하는 엽산 수용체 표적 탁솔 접합체[Heparin-Folate-TaxolTM：HFT]를 개발하여 시험관 내 및 동물 실험을 시행하였다.
형광물질이 부착된 탁솔을 이용하여 제작된 HFT로 세포를 처리한 후 형광을 관찰하였다. 그 결과 엽산 수용체를 발현하는 KB-3-1세포에서는 세포 표면과 세포질 내에서 형광이 관찰된 반면, 항 엽산수용체 siRNA를 이용하여 만든 엽산 수용체 결핍 KB-3-1세포에서는 관찰되지 않아 HFT가 엽산 수용체에 특이적으로 결합하여 세포 내로 유입됨을 확인할 수 있었다. 또한 KB 세포 및 탁솔-저항 KB 세포(Taxol-resistant KB cell derivatives)를 이용한 이종이식 종양(xenograft) 동물 실험에서 유리약물(탁솔)이나 이중 구조 나노 입자(Heparin-Taxol)에 비하여 월등한 종양성장억제 효과를 보였다.
Transferrin은 혈청 당단백으로 그 수용체와 결합한 후 수용체 매개 내포화를 통하여 세포 내로 유입됨으로써 혈액 내의 철분을 세포 내로 운반하는 전달체 역할을 하는 물질이다. 이러한 transferrin 수용체는 정상세포에 비하여 종양세포에서 과발현되기 때문에 이전부터 종양특이 약물전달을 위한 표적으로 연구되어 왔다. Transferrin-conjugated paclitaxel-loaded(PLGA polymer) 나노 입자의 경우 free paclitaxel에 비하여 MCF-7 and MCF-7/Adr 세포의 성장을 더 강력하게 억제하는 결과를 보여 주었다. transferrin을 이용한 리포좀 형태의 나노 입자 또한 단순 리포좀에 비하여 시험관 내 및 동물 실험에서 더 용이하게 종양세포 및 조직으로 집적되었고 더 높은 생존율을 보였다.
Lectin은 세포막의 세포외면에 위치하는 단백에 부착된 탄수화물 부위(glycan)를 인지하고 결합할 수 있는 단백물질이다. 그런데 lectin의 결합부위인 세포표면의 당화 단백(glycosylated protein：glycan)은 세포 종류 및 당의 결합비율에 따라 서로 다른 화학적 구조를 보인다. 또한, 종양세포의 경우에도 정상세포와는 다른 구조의 glycan을 종종 발현한다. 따라서 lectin은 목표로 하는 세포나 조직으로 특정 약물을 선택적으로 운반할 수 있는 표적분자(targeting moiety)로 사용될 수 있다. 나노 입자의 제작 시 두 가지 형태의 lectin-carbohydrate interaction을 이용할 수 있다. 하나는 lectin을 세포표면 탄수화물 부위를 향하는 표적분자로 이용하는 것이며(direct lectin targeting), 다른 하나는 반대로 탄수화물과 연결된 나노입자로 세포표면의 lectin을 타겟하는 것이다(reverse lectin-targeting).
이 중 reverse lectin-targeting을 이용한 약물접합체의 한 예가 PK2이다. 이미 개발된 PK1의 능동 표적모델로, 간세포의 표면에서 발현되는 asialoglycoprotein 수용체가 특이적으로 terminal beta-D-galactose 또는 N-acetyl-galactosamine-residues와 결합하는 현상을 이용하여 galactosamine을 표적분자로 사용하였다. 감마카메라를 이용한 영상에서 PK1과 대조적으로 PK2는 효과적으로 간을 표적하는 것이 관찰되었다.
약물저항은 항암제의 치료효과를 제한하는 주된 원인이다. 첫째로는 불충분한 혈관분포, 산성환경, 높은 간질압력 과 같은 종양주위의 환경이 우선 약물이 종양에 도달하는 데 방해요소가 되며, 둘째로는 비록 이러한 난관을 뚫고 약물이 종양에 도달하였다 하더라도 세포 외로의 약물배출 증가, 세포 내로의 약물유입 감소, DNA 재건 활성화, 세포사멸 억제와 같은 다양한 저항 기전을 통하여 종양세포 자체가 약물의 작용을 피해간다. 이러한 세포에서 발생되는 다양한 약물저항 기전 중 피당단백(p-glycoprotein)이 가장 널리 알려지고 연구된 기전이다. 피당단백은 분자량 170-kDa의 경세포막(transmembrane) 당단백으로 MDR1유전자의 산물이며, 약물을 세포 외로 제거하는 배출펌프(efflux pump)역할을 함으로써 약물의 세포내 농도를 낮추는 결과를 초래하여 저항성을 보인다.
폴리머, 리포좀, 미셀 등 다양한 형태의 나노 입자들을 이용하여 약물저항을 극복하고자 하는 노력이 있어 왔으며, 다음의 두 가지 기전을 통하여 피당단백 매개 저항성을 극복할 수 있는 가능성을 보여주고 있다. 첫째는 나노 입자가 세포 내로 유입될 때 내포에 싸여서 또는 피당단백이 인지할 수 없는 형태(masking)로 세포 내로 들어감으로써 피당단백의 인지로부터 벗어날 수 있다는 것이다.
두 번째 기전은 피당단백이 약물을 세포 외로 퍼내는 펌프작용을 하기 위해서는 에너지가 필요한데 이 때 필요한 에너지인 ATP를 고갈시키거나 억제하는 것이다. 수용체 표적 리간드를 이용한 방법은 앞서 기술한 대로 수용체-리간드 결합체가 수용체 매개 내포화를 통하여 세포내로 들어 가기 때문에 약물 저항성을 극복할 수 있는 가능성을 가지고 있다. 따라서 folate receptor-targeted pH sensitive polymeric micelle containing DOX와 transferrin-conjugated paclitaxel-loaded NPs의 경우 drug resistant MCF-7 cells and/or xenografts에 대한 성장억제 효과가 유리 약물에 비하여 더 월등한 결과를 보여주고 있다.
본 발명에서 사용된 용어 ‘접합체’는 리간드와 약물들이 서로 간에 공유결합 결합을 통해 연결되어 있는 형태의 화합물 또는 고분자를 의미한다.
접합체의 수용액 중 약물의 농도는 특별하게 한정되지는 않지만, 입자 제형으로부터 방출되었을 때 생체내에서 효과를 발휘할 수 있을 농도 이상인 것이 바람직하고, 용해 또는 입자 제형화 동안 과도한 접합체 간에 응집 혹은 불활성화가 발생하는 농도 이하인 것이 바람직하다. 예를 들면, 0.01 mg/ml 이상 1000 mg/ml 일 수 있다. 상기 양친매성 핵산분자를 포함하는 나노크기의 핵산 복합체를 제공한다.
상기 리간드는 약물을 전달하고자 하는 표적세포에 특이적인 분자일 수 있으며, 예를 들면 암세포의 경우 상기 표적지향형 리간드는 암 세포, 암 줄기세포, 또는 암 표지인자에 특이적으로 반응하는 리간드는 표적지향성을 부여하는 암 특이적 결합성분을 의미한다. 상기 리간드는 세포표면에 결합하는 화합물, 압타머, 항체와 펩타이드 등이다.
상기 암표적 리간드는 HER2와 같은 암 표적 압타머, 폴레이트(folate)와 같은 화합물, RGD(Arg-Gly-Asp) peptide와 같은 암 표적 펩타이드, 혹은 암 표적 항체일 수 있다. 바람직하게는 상기 리간드는 압타머(aptamer)이고, 더욱 바람직하게는 상기 DNA-리간드 접합체는 상기 아댑터의 말단 -SH 기가 상기 DNA의 말단 -SH 기에 결합하여 이루어질 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 DNA는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이다.상기 접합체는 압타머가 부착된 활성제 또는 이의 프로드럭을 포함한다. 상기 접합체는 단일 활성제와 단일 압타머 간의 접합체, 예를 들면, 구조 A-B와 A-(B)n(여기서, A는 압타머이고, B는 핵산과 뉴클레오티드 치료제이고 (B)n은 하나이상의 약물이 탑재된 단일가닥 핵산이거나 뉴클레오티드 유사체의 연속체 활성제이며, n은 1 내지 50, 2 내지 20, 보다 바람직하게는 1 내지 5의 정수이다)를 갖는 접합체이다.
상기 활성제 B는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체 또는 이의 헤테로 환 유도체 중 하나 이상은 약학적으로 활성이고, 단량체 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체 또는 비염기성 뉴클레오시드의 사슬을 포함하는 전구 약물로서 유용한 중합체 화합물이 개시되고 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체 또는 비염기성 뉴클레오사이드는 포스포디에스테르 기, 포스포로티오에이트 기 또는 H, 알킬 또는 알케닐 포스포네이트기에 의해 연결된다.
상기 식 A-B 접합체는 포스포디에스테르(pO), 포스포로티오네이트(pS) 또는 H- 또는 알킬 또는 알케닐 포스포네이트에 의해 연결된 약학적 활성 또는 치료 모노머 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오시드 유사체의 사슬로부터 형성된 폴리 뉴클레오타이드 화합물일 수 있다. 바람직한 구체 예에서, 사슬은 2 내지 100 (보다 바람직하게는 2 내지 35)의 치료 학적 단량체 뉴클레오사이드, 뉴클레오시드 유사체 또는 무치환 뉴클레오시드를 포함한다.
본 발명은 아래에 나타낸 바와 같이, 혼합 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 폴리 뉴클레오타이드를 고려한다. pS 결합을 갖는 올리고머는 pO 결합을 갖는 올리고머보다 더 안정하며, 결과적으로 pS 올리고머는 pO 결합된 올리고머보다 느린 속도로 분해된다. S. T. Crooke, Oligonucleotide Therapeutics, Burger 's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th ed., Ed. M. E. Wolff 863-900, 1995) 및 그 안에 인용된 추가의 문헌들에 개시되어있다.
접합체는 링커에 의해 압타머에 부착된 활성제 또는 이의 프로드럭을 포함한다. 상기 접합체는 단일 활성제와 단일 압타머 간의 접합체, 예를 들면, 구조 A-C-B(여기서, A는 압타머이고, B는 활성제이고, C는 링커이다)를 갖는 접합체이다.
접합체는 링커에 의해 압타머에 부착된 활성제 또는 이의 프로드럭에 추가적으로 링커에 의해 중합체가 부착된 구조를 포함한다. 상기 접합체는 단일 활성제, 단일 압타머와 단일 중합체 간의 접합체, 예를 들면, 구조 A-C-B-C-D(여기서, A는 압타머이고, B는 활성제이고, C는 링커이고 D는 중합체이다)를 갖는 접합체이다.
상기 접합체는 하나 이상의 압타머, 하나 이상의 링커, 하나 이상의 활성제, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 상기 접합체는 임임의 수의 압타머, 링커, 및 활성제를 가질 수 있다. 상기 접합체는 구조 A-C-B-C-A, (A-C)n-Z, A-(C-B)n, A-C-(B)n, (A-C-B)n, (A-C-B-C)n-B(여기서, A는 압타머이고, C는 링커이고, B는 활성제이고, n은 1 내지 50, 2 내지 20, 보다 바람직하게는 1 내지 5의 정수이다)를 가질 수 있다. A, B, 및 C 각각은 동일하거나 상이할 수 있는데, 예를 들면, 상기 접합체는 한 가지 유형 이상의 압타머, 한가지 유형 이상의 링커, 및/또는 한 가지 유형 이상의 활성제를 포함할 수 있다.
상기 접합체는 단일 활성제에 부착된 하나 이상의 압타머를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 접합체는 상이한 링커에 각각 부착된 다중 압타머를 갖는 활성제를 포함할 수 있다. 상기 접합체는 구조 A-C-B-C-A(여기서, 각각의 A는 동일하거나 상이할 수 있는 압타머이고, 각각의 C는 동일하거나 상이할 수 있는 링커이고, B는 활성제이다)를 가질 수 있다.
상기 접합체는 단일 압타머에 부착된 하나 이상의 활성제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 접합체는 상이한 링커를 통해 각각 부착된 다중 활성제를 갖는 압타머를 포함할 수 있다. 상기 접합체는 구조 B-C-A-C-B(여기서, A는 압타머이고, 각각의 C는 동일하거나 상이할 수 있는 링커이고, 각각의 B는 동일하거나 상이할 수 있는 활성제이다)를 가질 수 있다.
A. 압타머
압타머는 표적항원과 높은 특이성과 친화도로 결합할 수 있으며, 독특한 3차원 구조를 가진 올리고 핵산 또는 펩티드를 말한다. 그 자체가 진단 및 치료제로서 쓰여 왔으며, 또한 약물전달체계에서는 선택성을 높이기 위 한 특이 리간드로도 사용되었다. 전립선 특이 막항원(prostate specific membrane antigen)을 표적할 수 있는 압타머를 이용하여 제작된 docetaxel 합입 나노 입자로 동물실험을 시행하였을 때, 유리 약물(docetaxel)이나 이중구조 나노 입자(PLGA-Docetaxel)에 비하여 종양성장 억제효과는 더 뛰어나면서 백혈구 감소나 체중 감소와 같은 독성은 더 적은 결과를 보여 주었다.
압타머는 표적 분자들에 대해 높은 특이적 결합성을 가지는, 표적 화합물 또는 분자에 대한 특이적 리간드이다.
압타머의 제조방법으로는, "SELEX™"(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)" 방법이 널리 사용되고 있다. SELEX 방법은 표적 분자에 높은 특이적 결합성을 가진 핵산 분자의 생체외 전개에 관한 방법으로, 1990. 6. 11 출원의 미국특허 출원 제07/536,428호(현재 포기), 미국특허 제5,475,096호(발명의 명칭: "Nucleic Acid Ligands") 및 미국특허 제5,270,163호(발명의 명칭: "Nucleic Acid Ligands") 등에 기재되어 있다.
SELEX법에서는 라운드 수를 늘리거나, 경합물질을 사용함으로써, 표적 물질에 대하여 보다 결합력이 강한 압타머가 농축되어, 선별되어 온다. 따라서, SELEX의 라운드 수를 조절하고/하거나 경합 상태를 변화시킴으로써, 결합력이 다른 압타머, 결합 형태가 다른 압타머, 결합력이나 결합 형태는 동일하지만 염기 서열이 다른 압타머를 얻을 수 있는 경우가 있다. 또한, SELEX법에는 PCR에 의한 증폭 과정이 포함되는데, 그 과정에서 망간 이온을 사용하는 등으로 변이를 넣음으로써 보다 다양성이 풍부한 SELEX를 행할 수 있게 된다.
SELEX에서 얻어지는 압타머는 표적 물질에 대하여 친화성이 높은 핵산이며, 그것은 표적 물질의 활성 부위에 결합하는 것을 의미하지 않는다. 따라서, SELEX에서 얻어지는 압타머는 반드시 표적 물질의 기능에 작용하는 것은 아니다.
이와 같이 하여 선택된 활성이 있는 압타머에 기초하여, 보다 높은 활성을 갖는 압타머를 획득하기 위해서 또한 프라이머를 바꿔 SELEX를 행할 수 있다. 구체적인 방법은, 어떤 서열이 정해져 있는 압타머의 일부를 랜덤 서열로 한 주형(template)이나 10∼30% 정도의 랜덤 서열을 도핑한 주형을 제작하여, 재차 SELEX를 행하는 것이다.
SELEX에 의해 얻어지는 압타머는 80개 뉴클레오티드 정도의 길이가 있으며, 이것을 그대로 의약으로 하기는 어렵다. 그래서, 시행 착오를 반복하여, 용이하게 화학 합성을 할 수 있는 50개 뉴클레오티드 정도 이하의 길이까지 짧게 할 필요가 있다. SELEX에 의해 얻어지는 압타머는 그 프라이머 설계에 따라서, 그후의 최소화 작업 용이성이 변한다. 잘 프라이머를 설계하지 않으면, SELEX에 의해서 활성이 있는 압타머를 선별할 수 있었다고 해도, 그후의 개발이 불가능하게 된다.
SELEX 방법은, 핵산이 다양한 2 차원 및 3 차원 구조를 형성하기에 충분한 능력과, 실질적으로 임의의 화학적 화합물과 함께(단량체 또는 중합체 상관없이) 리간드로서 작용(즉, 특이적 결합 쌍을 형성)하기에 충분한, 단량체 내에서 이용 가능한 화학적 다기능성(chemical versatility)을 보유한다는 것을 바탕으로 한다. 임의의 크기 또는 조성을 갖는 분자가 표적으로 이용될 수 있다.
압타머는 고전적인 왓슨-클릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성 이외의 상호작용을 통하여 분자에 대해 고도의 특이적 결합 친화도를 보이는 핵산 분자이다. 압타머는 선택된 표적에 특이적으로 결합하여 표적의 활성을 조정할 수 있는 것으로서, 예를 들면 압타머 결합을 통해 표적의 작용 능력을 차단할 수 있다. 무작위 서열 올리고뉴클레오티드의 풀(pool)로부터 생체외 선별 과정에 의해, 성장 인자, 전사 인자, 효소, 면역글로불린 및 수용체 등을 포함한 단백질에 대응하는 압타머가 생성된 바 있다.
전형적인 압타머는 크기가 10∼15 kDa(30∼45 뉴클레오티드)으로서, 나노 몰 이하의 친화도로 그 표적에 결합하며, 밀접하게 관련된 표적들에 대해 차별성을 나타낸다(일례로, 압타머는 통상적으로 동일한 유전자군에 속하는 다른 단백질에 결합하지 않는다).
일련의 구조학적 연구 결과, 압타머는 항체-항원 복합체에서 친화도와 높은 선택적 결합을 부여하는 동일한 유형의 결합 상호작용(예를 들면, 수소 결합, 정전기적 상보성, 소수성 접촉, 입체적 배제(steric exclusion))을 이용할 수 있는 것으로 나타났다. 압타머는 높은 선택성 및 친화도, 생물학적 효능 및 우수한 약동학적 특성을 포함하여, 치료제 및 진단제로서 사용하기에 바람직한 다수의 특징들을 가지고 있다. 또한, 압타머는 항체 및 기타 생물학적 단백질을 능가하는, 다음에 예시한 바와 같은 특이적인 경쟁적 이점이 있다.
(1) 속도 및 제어
압타머는 치료학적 리드를 포함하여, 초기의 신속한 리드를 가능하게 하는 생체외 방법에 의해 생산된다. 생체외 선별은 압타머의 선택성 및 친화도를 엄격하게 제어할 수 있으며, 독성 및 비-면역원성 표적 양자 모두에 대한 리드를 비롯하여 리드의 발생을 가능하게 한다.
(2) 독성 및 면역원성
압타머 군은 치료학적으로 허용 가능한 독성을 나타내며, 면역원성은 결여된 것으로 입증되었다. 랫 또는 우드척(woodchucks)에게 다량의 압타머(90 일간 1 일 10 mg/kg씩)를 투여하면, 어떠한 임상적, 세포적 또는 생화학적 측정에 의해서도 독성이 전혀 목격되지 않는다. 대다수의 모노클로날 항체 효능은 항체 자체에 대한 면역 반응에 의하여 엄격하게 제한될 수 있는 반면에, 압타머는 MHC(Major Histocompatibility Complex)를 통해 T-세포에 의해 제시될 수 없고, 면역반응이 일반적으로 핵산 단편은 인지하지 못하도록 적응되어 있기 때문에, 압타머에 대하여 항체를 유도하는 것은 극도로 어려운 것으로 보인다.
(3) 투여
최근에 승인된 항체 치료제 대부분은 정맥내 주입(통상적으로 2∼4 시간에 걸침)에 의해 투여되는 반면에, 압타머는 피하 주사에 의해 투여할 수 있다(원숭이 연구 결과, 피하 투여에 의한 압타머의 생체적합성은 > 80 % 이었다(Tucker et al., J. Chromatography B. 732: 203-212, 1999)). 이러한 차이는 일차적으로 용해도가 비교적 낮고 대부분의 치료용 mAb 에 필요한 용적이 크다는 사실에 기인한다. 압타머는 용해도가 양호하고(>150 ㎎/㎖) 분자량이 비교적 낮기 때문에(압타머 : 10∼50 kDa ; 항체 : 150 kDa), 0.5 ㎖ 미만의 용량으로 매주 주사에 의해 투여할 수 있다. 또한, 소형의 압타머는 항체 또는 항체 단편의 경우 침투가 불가능한, 형태적 협착 부위로의 침투도 가능하다는 점도, 압타머에 의한 치료법 또는 예방법의 또 다른 이점으로 제시된다.
(4) 생산규모 및 비용
압타머는 화학적으로 합성되므로, 결과적으로 대량 생산 요구에 부합하도록 필요에 따라 용이하게 확장 가능하다. 현재는 확장 생산시의 난점들이 몇몇 생물학적 물질의 이용가능성을 제한하고 대규모 단백질 생산 플랜트에 막대한 자본금이 드는 상황이지만, 단일의 대규모 올리고뉴클레오티드 합성기는 매년 100㎏씩 증량 생산할 수 있어 비교적 적절한 초기 투자를 필요로 한다.
(5) 안정성
압타머는 화학적으로 견고하다. 압타머는 본질적으로 열과 변성제 같은 인자로의 노출 후에 활성을 재획득되므로, 동결 건조된 분말의 형태로 실온에서 장기간동안(1 년 이상) 보관 가능하다.
압타머는 화학 합성이 가능하기 때문에 개변이 용이하다. 압타머는 MFOLD 프로그램을 이용하여 이차 구조를 예측하거나, X선 해석이나 NMR 해석에 의해서 입체 구조를 예측함으로써, 어떤 뉴클레오티드를 치환 또는 결손하는 것이 가능한지, 또 어디에 새로운 뉴클레오티드를 삽입할 수 있는지 어느 정도 예측할 수 있다. 예측된 새로운 서열의 압타머는 용이하게 화학 합성할 수 있으며, 그 압타머가 활성을 유지하고 있는지 어떤지 기존의 분석계에 의해 확인할 수 있다.
얻어진 압타머의 표적 물질과의 결합에 중요한 부분을, 상기와 같은 시행착오를 반복함으로써 특정할 수 있었던 경우, 그 서열의 양단에 새로운 서열을 부가하더라도, 많은 경우 활성은 변화하지 않는다. 새로운 서열의 길이는 특별히 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 압타머가 HER2에 결합하여, HER2와의 결합을 저해하는 데에 있어서 중요한 부분이지만, 이들 서열의 양단에 새로운 서열을 부가하더라도, 많은 경우 활성은 변화하지 않는다.
수식에 관해서도 서열과 마찬가지로 고도로 설계 또는 개변 가능하다. 이상과 같이, 압타머는 고도로 설계 또는 개변 가능하다. 본 발명은 또한 소정의 서열(예컨대, 스템 부분, 내부 루프 부분, 헤어핀 루프 부분 및 단일쇄 부분에서 선택되는 부분에 대응하는 서열: 이하, 필요에 따라서 고정서열로 생략함)을 포함하는 압타머를 고도로 설계 또는 개변 가능한 압타머의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 압타머 및 그것에 결합한 활성제를 포함하는 접합체를 제공한다. 본 발명의 접합체에서 압타머와 활성제 사이의 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 본 발명의 접합체는 본 발명의 압타머와 1개 이상(예컨대, 2개 또는 3개)의 동종 또는 이종의 활성제이 결합한 것일 수 있다. 활성제는 본 발명의 압타머에 어떠한 기능을 새롭게 부가하는 것, 또는 본 발명의 압타머가 유지할 수 있는 어떠한 특성을 변화(예컨대, 향상)시킬 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 압타머 및 접합체는 예컨대, 의약 또는 진단약, 검사약, 시약, 음료수나 식품의 첨가제, 증강제, 완화제로서 사용될 수 있다.
B. 활성제
상기 접합체는 적어도 하나의 활성제를 포함한다. 상기 접합체는 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 활성제를 포함할 수 있다. 상기 활성제는 치료제, 예방제, 진단제, 또는 영양제일 수 있다. 다양한 활성제가 당업계에 공지되어 있으며, 접합체에 사용될 수 있다. 상기 활성제는 단백질 또는 펩티드, 뉴클레오티드 유사체, 소분자, 핵산 또는 핵산 분자, 지질, 당, 당지질, 당단백질, 지단백질, 또는 이들의 조합일 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 활성제는 항원 또는 보조제, 방사능제 또는 영상 제제(예를 들면, 형광 분자) 또는 폴리뉴클레오티드이다. 상기 활성제는 유기금속 화합물이다.
활성제로서는, 예컨대, 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 당질, 단당, 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오티드를 들 수 있다. 활성제로서는 또한 예컨대, 친화성 물질(예컨대, 비오틴, 스트렙타아비딘, 표적 상보 서열에 대하여 친화성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 항체, 글루타치온 세파로오스, 히스티딘), 표지용 물질(예컨대, 형광 물질, 발광 물질, 방사성 동위체), 효소(예컨대, 서양 고추냉이 페록시다아제, 알칼리 포스파다아제), 약물 송달 매체(예컨대, 리포좀, 마이크로스페어, 펩티드, 폴리에틸렌 글리콜류), 약물(예컨대, 칼리키아마이신이나 듀오칼마이신 등 미사일 요법(missile therapy)에 사용되고 있는 것, 시클로포스파미드, 멜팔란, 이포스파미드 또는 트로포스파미드 등의 질소 머스타드 유사체, 티오테파 등의 에틸렌이민류, 카무스틴 등의 니트로소우레아, 테모졸로마이드 또는 다카바진 등의 알킬화제, 메토트렉세이트 또는 랄티트렉세드 등의 엽산 유사 대사 길항제, 티오구아닌, 클라드리빈 또는 플루다라빈 등의 퓨린 유사체, 플루오로우라실, 테가푸르 또는 젬시타빈 등의 피리미딘 유사체, 빈블라스틴, 빈크리스틴 또는 비노렐빈 등의 빈카 알칼로이드 및 그 유사체, 에토포시드, 탁산, 도세탁셀 또는 파클리탁셀 등의 포도필로톡신 유도체, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신 및 미톡산트론 등의 안트라사이클린류 및 유사체, 블레오마이신 및 미토마이신 등의 다른 세포 독성 항생 물질, 시스플라틴, 카르보플라틴 및 옥잘리플라틴 등의 백금 화합물, 펜토스타틴, 밀테포신, 에스트라머스틴, 토포테칸, 이리노테칸 및 비칼루타미드), 독소(예컨대, 리신 독소, 리아독소 및 베로 독소)를 들 수 있다. 이들 활성제는 최종적으로 제거되는 경우가 있다. 더욱이, 트롬빈이나 매트릭스-메탈로프로테나아제(MMP), FactorX 등의 효소가 인식하여 절단할 수 있는 펩티드, 뉴클레아제나 제한 효소가 절단할 수 있는 폴리뉴클레오티드라도 좋다.
뉴클레오사이드 치료제
본원에서 사용된 용어 "뉴클레오타이드"는 탄소, 수소, 산소 및 질소 (피리미딘 또는 퓨린), 펜토오스 (데옥시리보스, 리보스, 아라비노스)로 이루어진 고리형 질소 함유 염기 (아글리콘으로도 알려짐) , 키실로오스 또는 리독소) 또는 육당 당 부분과 인산기 (아인산)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "폴리 뉴클레오타이드"는 뉴클레오티드 및 뉴클레오사이드 화합물의 사슬을 지칭하며, "중합체", "올리고 뉴클레오타이드"및 "올리고"라는 용어와 상호 교환 가능하게 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고머"는 출발 올리고뉴클레오타이드에 비례하여 점차적으로 더 짧은 길이의 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다. 올리고머는 올리고뉴클레오타이드의 부분적인 분해 또는 절단의 결과로서 시험관내 및 생체 내에서 생성될 수있다.
본원에서 사용된 용어 "뉴클레오시드"는 펜토스 (데옥시리보스, 리보스, 아라비노스, 크실로스 또는 리독소) 또는 헥 소스 설탕 잔기에 연결된 질소 함유 염기 잔기 (퓨린 또는 피리미딘 염기)를 포함하는 분자를 의미한다. 뉴클레오시드를 형성하는 전형적인 퓨린 또는 피리미딘 염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 5- 메틸 시토신, 우라실 및 티민을 포함한다. 본원에서 사용 된 용어 "뉴클레오시드"는 선택적으로 치환된 뉴클레오시드, 예를 들어 할로겐, 예를 들어 불소로 치환된 뉴클레오시드를 포함한다. 본원에서 사용 된 용어 "뉴클레오시드"는 할로겐, 예컨대 불소로 치환된 임의로 치환된 헤테로 사이클릭 및 당 잔기를 갖는 분자를 또한 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "뉴클레오시드 유사체"는 상기 정의된 바와 같이 "뉴클레오 사이드"의 당 및 염기 부분에 독립적으로 또는 함께 개질 된 비 천연 분자 또는 합성 생성 화합물을 나타낸다. 예시적인 뉴클레오시드 유사체는 아시클로비르, 발라 시클로비르, 펜클로르, 파시시클로비르, 간시클로비르, 시도포비르, 아데포비어, 로부카비 르 및 리바비린 및 카바 실기 및 L- 뉴클레오시드 부류를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "무치환 뉴클레오사이드"라는 용어는 당 잔기의 1'-탄소 원자에서 부착된 핵 염기가 없는 뉴클레오시드를 의미한다. 무치환 뉴클레오시드의 당 하이드록실 그룹은 가변적으로 유도체화될 수 있으며, 즉 히드록실기는 에스테르화되거나 목적하는 작용기 또는 보호기로 치환될 수 있다. 적합한 치환기는 C1-35 직쇄 또는 측쇄, 치환 또는 비치환 알콕시 또는 알킬; C3-35 치환 또는 비치환 시클로 알킬 또는 시클로 알콕시; C2-35 치환 또는 비치환 알케닐 또는 알케닐 옥시기; 또는 할로겐. 알콕시, 알킬, 알켄 옥시, 알 케닐, 시클로 알콕시 또는 시클로 알킬기는 하나 이상의 히드록실, 아미노 또는 알콕시기로 치환 될 수 있거나, 또는 탄화수소 사슬에서 하나 이상의 O, N 또는 S 원자로 치환 될 수 있다. 바람직한 알킬기는 치환 또는 비치 환 된 C1-20 알킬기, 보다 바람직하게는 C1-12 알킬기, 예컨대 치환 또는 비치환된 메틸, 에틸 및 이소프로필이다. 바람직한 알콕시기는 치환 또는 비치환된 C1-20 알콕시기 보다 바람직하게는 C1-12 알콕시기, 예컨대 치환 또는 비치환 메톡시, 에톡시 및 이소프로필 옥시이다. 예시적인 치환체는 메 톡시 에틸 및 디메틸 아미노 에틸을 포함한다. 바람직한 알케닐 및 알케닐 옥시 그룹은 2 내지 20 개의 탄소 원자보다 바람직하게는 2 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로 사이클릭 유도체"는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체의 유도체를 지칭한다. 예시적인 헤테로시 클릭 유도체는 질소 함유 염기 잔기(퓨린 또는 피리미딘)를 포함하는 기본 분자인 "뉴클레오시드 염기"를 포함한다. 이 용어는 임의로 치환된 뉴클레오사이드 염기, 예컨대 할로겐, 예를 들어 불소로 치환된 것들을 포함한다. 치료 활성을 갖는 예시적인 헤테로시 클릭 유도체 (예를 들어, 퓨린 또는 피리미딘 유도체)는 6- 메르캅토퓨린, 아자티오프린, 5- 플루오로우라실 및 티오구아닌을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약학적 활성제"라는 용어는 항바이러스, 항균 또는 항암 활성과 같은 (이에 한정되지 않음) 입증된 치료학적 또는 약학적 활성을 갖는 화합물 또는 분자를 의미한다. 적합한 약학적 활성제는 히드록실, 아미노, 카르복실 산 또는 알케닐 기와 같은 중합 가능 잔기를 갖는 것들이다.
본원에서 사용된 용어 "뉴클레오사이드 치료제"는 항바이러스, 항균 또는 항암 활성과 같은 입증된 치료학적 또는 약학적 활성을 갖는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오 사이드 유사체를 의미한다. 적합한 뉴클레오사이드 치료제는 하이드록실 그룹과 같은 중합 가능한 잔기를 갖는 것들이다. 예를 들어, 오탄당 부분은 3 '또는 5'위치에서 히드록 실기로 치환될 수있다.
본 발명에 의해 고려되는 예시적인 단량체 뉴클레오사이드 치료제는 아데포비어, 시도피비어, 클라드리빈(류스타틴으로도 공지 됨), 시타라빈, 도시플루리딘, 에노시타빈(베노일시토신 아라비 시드로도 공지됨), 플록스우린, 인산 플루다라빈, 젬시 타빈 및 펜토스타틴 ; 바이옥신, 리바비린과 같은 항 바이러스 제제를 포함한다.
본원에서 사용 된 용어 "포스포디에스테르"는 뉴클레오사이드 단량체를 연결시키는데 사용되는 결합 -PO4를 의미한다. 본원에서 고려되는 포스포디에스테르 결합("PO")은 자연 발생 DNA에서 발견되는 결합이다. 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 핵산의 예를 아래 화학식 4에 나타내었다.
본원에서 사용된 용어 "포스포로티오에이트"는 뉴클레오사이드 단량체를 연결시키는데 사용되는 결합 -PO3(S)를 나타낸다. 포스포로티오에이트 ("pS") 결합은 화학식 4에 나타낸 바와 같이 포스포 에스테르 결합상의 산소 원자 대신 황 원자를 포함한다.
본원에서 사용 된 "H-, 알킬 또는 알케닐 포스포네이트"라는 용어는 뉴클레오 시드, 뉴클레오사이드 유사체 또는 탈핵 뉴클레오 사이드 단량체를 연결시키는데 사용되는 결합 -PO3R-를 말한다. H-포스포네이트 결합은 상술한 포스 포디에스테르 결합과 같이 산소 원자 대신에 인에 결합된 수소 원자를 함유한다. 알킬 포스포네이트 결합(R-pO)은 산소 원자 대신 인 원자에 결합된 탄소 원자를 함유한다. 적합한 알킬기는 C1-35 선형 또는 분 지형 사슬 알킬기, 바람직하게는 C1-20, 보다 바람직하게는 C1-5 선형 또는 분지형 알킬이다. 적합한 알 케닐 그룹은 C2-35 선형 또는 분지형 사슬 알케닐, 바람직하게는 C2-20, 보다 바람직하게는 C1-5 선형 또는 분지형 알케닐이다.
본원에 사용된 용어 "호모 폴리머"는 뉴클레오타이드 및 링커가 모두 동일한 폴리 뉴클레오타이드 화합물을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 단일 중합체 폴리 뉴클레오타이드 전구 약물에서, HO-[dN-PO2X]n-OH는 각 뉴클레오티드 "dN"및 각 X가 동일하다.
본원에서 사용 된 바와 같이, 용어 "헤테로 폴리머"는 쇄 내의 뉴클레오타이드 또는 링커의 각각이 동일하지 않은 폴리 뉴클레오타이드 화합물을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 헤테로 폴리머 폴리 뉴클레오타이드 전구 약물에서 HO- [dN-PO2X]n-OH는 뉴클레오타이드 "dN"또는 결합 "PO2X"가 사슬을 따라 상이하다.
본 발명은 약학적으로 비활성인 결합에 의해 연결된 약학적으로 활성인 분자의 사슬로부터 형성된 중합체성 화합물을 포함할 수도 있다. 한 실시 양태에서, 약학적 활성 분자는 2'O- 메틸 리보뉴클레오사이드와 같은 뉴클레아제 내성 잔기에 의해 사슬을 따라 분리된 치료 모노머 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체, 탈핵 뉴클레오사이드 또는 헤테로 사이클릭 유도체이다. 단량체 그룹은 포스포디에스테르(pO), 포스포로티오네이트(pS) 또는 알킬 또는 알케닐 포스포네이트(R-pO) 그룹에 의해 사슬을 따라 연결될 수 있다. 바람직한 구체 예에서, 사슬은 2 내지 100 (보다 바람직하게는 2 내지 35)의 치료적 모노머 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체, 탈핵 뉴클레오시드 또는 이의 헤테로 사이 클릭 유도체를 포함한다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 포스포디에스테르(pO), 포스포로티오네이트(pS) 또는 H- 또는 알킬 또는 알케닐 포스포네이트에 의해 연결된 약학적 활성 또는 치료 모노머 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오시드 유사체의 사슬로부터 형성된 폴리 뉴클레오타이드 화합물에 관한 것이다. 바람직한 구체 예에서, 사슬은 2 내지 100 (보다 바람직하게는 2 내지 35)의 치료 학적 단량체 뉴클레오사이드, 뉴클레오시드 유사체 또는 무치환 뉴클레오시드를 포함한다.
본 발명은 아래에 나타낸 바와 같이, 혼합 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 폴리 뉴클레오타이드를 고려한다. pS 결합을 갖는 올리고머는 pO 결합을 갖는 올리고머보다 더 안정하며, 결과적으로 pS 올리고머는 pO 결합된 올리고머보다 느린 속도로 분해된다.
본 발명은 치료학적으로 활성인 뉴클레오시드 또는 뉴클레오사이드 유사체 및 뉴클레아제 내성 부분 (예컨대, 탈회 2 'O- 메틸 뉴클레오시드)의 교대 체인을 사용하여 뉴클레오사이드 치료제의 방출 속도를 조절할 수 있는 능력을 함유하는 폴리 뉴클레오타이드를 형성하는 것을 고려한다. 치료적 활성 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체 및 뉴클레아제 내성 잔기 (예컨대, 무 - 염기성 2'O- 메틸 뉴클레오시드)의 교대하는 세그먼트의 구조는 치료제의 원하는 방출을 달성하도록 변형될 수 있다.
항감염제
상기 활성제는 항감염제일 수 있다. 특정 치료제는 종양 또는 감염의 확립 또는 성장(전신 또는 국부)을 억제할 수 있다. 예는 붕소-함유 화합물(예를 들면, 카르보란), 화학치료제 뉴클레오티드, 약물(예를 들면, 항생제, 항바이러스제, 항진균제), 엔다이인(예를 들면, 칼리키아마이신, 에스페라마이신, 다이네미신, 네오카르지노스타틴 발색단, 및 케다르시딘 발색단), 중금속 착물(예를 들면, 시스플라틴), 호르몬 길항제(예를 들면, 타목시펜), 비특이적 (비항체) 단백질(예를 들면, 당 올리고머), 올리고뉴클레오티드(예를 들면, 표적 핵산 서열(예를 들면, mRNA 서열)에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드), 펩티드, 광동력제(photodynamic agent)(예를 들면, 로다민 123), 방사성핵종(예를 들면, I-131, Re-186, Re-188, Y-90, Bi-212, At-211, Sr-89, Ho-166, Sm-153, Cu-67 및 Cu-64), 독소(예를 들면, 리신), 및 전사 기저 약제를 포함한다. 상기 치료제는 소분자, 방사성핵종, 독소, 호르몬 길항제, 중금속 착물, 올리고뉴클레오티드, 화학치료제 뉴클레오티드, 펩티드, 비특이적(비항체) 단백질, 붕소 화합물 또는 엔다이인일 수 있다.
상기 활성제는 세균 감염의 확립 또는 성장을 치료 또는 예방할 수 있다. 상기 치료제는 항생제, 방사성핵종 또는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 상기 활성제는 바이러스 감염의 확립 또는 성장을 치료 또는 예방할 수 있는데, 예를 들면, 상기 활성제는 항생제 화합물, 방사성핵종 또는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 상기 활성제는 진균 감염의 확립 또는 성장을 치료 또는 예방할 수 있는데, 예를 들면, 상기 활성제는 항진균 화합물, 방사성핵종 또는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
항암제
상기 활성제는 암 치료제일 수 있다. 상기 암 치료제는 사멸 수용체 작용제, 예를 들면, TNF-관련 아포토시스-유도 압타머(TRAIL) 또는 Fas 압타머, 또는 사멸 수용체를 결합 또는 활성화시키거나, 달리 아포토시스를 유도하는 임의의 압타머 또는 항체를 포함할 수 있다. 적합한 사멸 수용체는 TNFR1, Fas, DR3, DR4, DR5, DR6, LTβR 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
전형적인 암 치료제, 예를 들면, 화학치료제, 사이토카인, 케모카인 및 방사선 치료제가 활성제로서 사용될 수 있다. 대부분의 화학요법 약물은 알킬화제, 항대사물, 안트라사이클린, 식물 알칼로이드, 토포이소머라제 억제제, 및 기타 항종양제로 나눌 수 있다. 이들 약물 모두는 몇몇 방식으로 세포 분열 또는 DNA 합성 및 기능에 영향을 미친다. 활성제로서 사용될 수 있는 추가 치료제는 단클론 항체 및 티로신 키나제 억제제, 예를 들면, 이마티닙 메실레이트(GLEEVEC® 또는 GLIVEC®)를 포함하는데, 이는 특정 유형의 암(만성 골수성 백혈병, 위장관 기질 종양)에서 분자 이상을 직접 표적화한다.　
대표적인 화학치료제는 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 클로람부실, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신, 택솔 및 이들의 유도체, 이리노테칸, 토포테칸, 암사크린, 에토포사이드, 에토포사이드 포스페이트, 테니포시드, 에피포도필로톡신, 트라스투주맙(HERCEPTIN®), 세툭시맙, 및 리툭시맙(RITUXAN® 또는 MABTHERA®), 베바시주맙(AVASTIN®), 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 중 어느 것이라도 접합체에서 활성제로서 사용될 수 있다.
바람직한, 상기 활성제는 DM1, 독소루비신, 뉴클레오사이드 치료제, 또는 약제학적으로 허용되는 염이다.
C. 링커
상기 접합체는 압타머를 포함하는 리간드의 특이성을 활성제들의 잠재력과 조합시키는 치료제 부류이다. 접합체는 두 성분의 특성들의 장점을 가지며 전신적인 노출과 관련된 독성을 최소화하는 동시에 표적 병변으로의 활성제의 전달을 최대화시키고, 그로써 치료 효율을 증가시킴으로써 활성제들의 치료 지수를 상당히 확대시킨다.
표적분자 선택, 종양 세포에 의한 접합체 내재화 및 활성제 약물의 잠재력은 접합체 개발에 대한 매개변수이다(Carter 2008, Teicher 2009). 또한, 접합체를 형성하기 위하여 이들 빌딩 블록에 공유적으로 결합시키기 위한 화학적 링커의 디자인 또한 접합체의 개발에 커다란 역할을 한다(Ducry 2010).
예를 들어 링커는 건강한 조직에 대한 손상을 제한하기 위해 혈류 내에서 안정해야 한다. 접합체의 분해 또는 붕괴는 표적 부위들에 활성제이 전달되기 전에 그것을 방출시킬 수 있다. 그러나 일단 접합체가 표적 부위들에 도달하게 되면, 접합체는 활성제을 그것의 활성 형태로 효율적으로 방출해야 한다. 표적 세포에서 원형질내 안정성과 효율적인 약물 방출 사이의 균형은 아직 밝혀지지 않았지만, 링커 디자인에 좌우될 수 있다.
적어도 3가지 유형의 링커가 접합체 디자인에 적용되는데, 즉 화학적-가변성 링커, 효소-가변성 링커 및 비-절단성 링커이다.
링커는 바람직하게는 생물학적 환경에 의해 생체 내에서 분리된다. 분리는 제한없이 임의의 공정, 예를 들면, 효소적, 환원적, pH 등으로부터 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 분리가능한 기는 원하는 작용 자리에서 활성화가 일어나도록 선택되는데, 이 자리는 치료적 작용 또는 마커 활성의 자리와 같은 표적 세포(예컨대, 암종 세포)나 조직 내의 또는 근처의 자리가 될 수 있다. 그러한 분리는 효소적일 수 있으며, 예시적인 효소적으로 분리가능한 기는 천연 뉴클레오티드으로 끝나고 그의 인산기 말단에서 링커에 부착되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 분리 비율 증진의 정도가 본 발명에 중요한 것은 아니지만, 분리가능한 링커의 바람직한 예는 분리가능한 기의 적어도 약 10%, 가장 바람직하게는 적어도 약 35%가 투여의 24 시간 이내에 혈류에서 분리되는 것들이다.
화학적 가변성 링커, 예컨대 Mylotarg에 대한 히드라존 링커 및 DM1/DM4에 대한 이황화물-함유 4-메르캅토펜타노에이트 링커에 대해, 링커의 선택적 절단 및 접합체에 대한 하중 방출은 원형질과 일부 세포내 구획 사이의 링커의 상이한 특성들을 토대로 한다. 링커는 혈액의 중성 pH 환경에서는 비교적 안정하지만 세포 내부의 더 낮은 pH 환경에 접합체가 들어간 후에는 절단될 수 있다. 생체 내 실험으로 화학적-가변성 링커들은 자주 제한된 원형질 안정성을 경험하는 것으로 증명되었다.
효소-가변성 링커는 활성제 방출의 제어를 이루기 위해 대체 접근법 - 세포의 내부 및 외부에서의 프로테아제의 상이한 활성을 취한다. 프로테아제는 정상적으로는 바람직하지 못한 pH 조건과 혈청 프로테아제 억제제의 존재로 인해 세포 외부에서는 작용하지 않는다. 활성제는 리간드에 결합을 통해 포합될 수 있다. 활성제은 세포 내부에 존재하는 리소좀성 프로테아제의 작용에 의해, 그리고 특정 유형의 종양에서 상승된 수준에서 항체로부터 특이적으로 절단될 수 있다(Koblinsk et al). 화학적-가변성 링커를 가지는 접합체와 비교하면, 효소-가변성 링커는 활성제 방출의 더 나은 제어를 이룰 수 있다. 그러나, 일부 효소-가변성 링커의 증가된 관련 소수성은 접합체의 응집, 특히 강력하게 소수성인 활성제와의 응집을 유도할 수 있다.
세 번째 부류의 링커는 비-절단성 링커이다. 활성제의 방출은 접합체의 내재화 및 이어서 리소좀에서 리간드 성분의 분해를 통해서 일어나고, 그 결과 여전히 링커에 부착된 활성제이 방출되는 것으로 여겨진다. 이들 비-절단성 링커는 혈청에서는 안정하지만, 효소-가변성 링커에 비교하면, 방출된 활성제이 충전되고 이웃 세포 안으로 확산될 수 없다는 사실로 인해 방관자 효과가 유발될 수 없다. 또한, 접합체의 내재화가 활성제 방출에 대한 요인이기 때문에, 효율은 표적분자-(및 그로써 리간드-) 의존적이다.
"링커"는 2개의 관능기 말단을 갖는 분자이고, 하나는 압타머를 포함하는 리간드 등의 생물학적 분자 또는 이의 단편에 결합하거나 달리는 회합하기 위한 것이고, 다른 하나는 활성제에 접합하기 위한 것이다.
표적으로 하는 암세포 또는 암조직에 효율적으로 전달되기 위하여, 상기 리간드와 활성제 사이에 링커가 연결될 수 있다. 상기 링커는 스페이서(spacer) 부분과 관능기(functional group)를 포함할 수 있다. 상기 스페이서 부분이 너무 긴 경우에는 소수성 성질이 높아 사용될 수 없으므로, C1 내지 C6의 직쇄형 또는 분지형 알킬렌기, 바람직하게는 C1 내지 C6의 직쇄형 알킬렌기가 스페이서 부분으로서 적합하다. 예컨대, 상기 스페이서는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 또는 헥실렌일 수 있다. 상기 스페이서 부분은 활성제와 압타머를 연결시켜 주기 위하여 관능기가 도입되며, 상기 관능기는 압타머와 활성제를 연결시켜 주는 기로서 압타머와 활성제를 결합할 수 있는 모든 작용기를 포함한다. 예컨대 상기 관능기는 아민기(-NH2), 설프히드릴기(-SH, sulfhydryl) 일수 있으며, 상기 관능기는 압타머와 활성제 사이에 공유 결합을 할 수 있다.
접합체는 활성제와 압타머를 부착시키는 하나 이상의 링커를 포함한다. 상기 링커는 활성제 및 압타머에 결합하여 접합체를 형성할 수 있으며, 여기서, 상기 접합체는 표적 세포로의 전달시 적어도 하나의 활성제를 방출한다.
III. 입자
하나 이상의 접합체를 포함하는 입자는 중합체성 입자, 지질 입자, 고형 지질 입자, 무기 입자, 또는 이들의 조합(예를 들면, 지질 안정화된 중합체성 입자)일 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 입자는 중합체성 입자이거나 또는 중합체성 매트릭스를 포함한다. 상기 입자는 본원에 기재된 중합체 또는 이의 유도체 또는 공중합체 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 상기 입자는 일반적으로 하나 이상의 생체적합성 중합체를 포함할 것이다.
상기 중합체는 생체분해성 중합체일 수 있다. 상기 중합체는 소수성 중합체, 친수성 중합체, 또는 양쪽성 중합체일 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 입자는 이에 부착된 추가의 압타머를 갖는 하나 이상의 중합체를 포함한다.
<나노입자>
상기 입자의 크기는 의도하는 적용을 위해 조절할 수 있다. 상기 입자는 나노입자 또는 마이크로입자일 수 있지만, 나노입자가 바람직하다. 상기 입자는 약 10 nm 내지 약 10 ㎛, 약 10 nm 내지 약 1 ㎛, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 20 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 25 nm 내지 약 250 nm의 직경을 가질 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 입자는 약 25 nm 내지 약 250 nm의 직경을 갖는 나노입자이다.
입자는 나노입자일 수 있는데, 즉, 입자는 약 1 ㎛ 미만의 특징적인 치수를 가지며, 이때, 입자의 특징적인 치수는 입자와 동일한 용적을 갖는 완전한 구의 직경이다. 복수 개의 입자는 평균 직경(예를 들면, 복수 개의 입자에 대한 평균 직경)을 특징으로 할 수 있다. 상기 입자의 직경은 가우시안-타입(Gaussian-type) 분포를 가질 수 있다. 상기 입자는, 낮은 내지 제로의 이온 강도(1 내지 10 mM)에서 0 mV에 가까운 제타 전위, + 5 내지 -5 mV의 제타 전위 값, 및 제로/중성 또는 작은 -ve 표면 전하를 갖는 40 내지 120 nm의 크기를 갖는다.
나노 입자의 장점 중 하나는 제작 시 그 크기를 쉽게 조절할 수 있다는 것이다. 예를 들면 20 nm 이하의 크기로 만든 초자성(supermagnetic) 나노 입자의 경우에는 정상 혈관벽을 통과하여 림프관으로 배액(drainage)될 수 있기 때문에 림프절로의 종양전이를 진단 및 영상화할 수 있다. 그러나 약물 전달체로서의 나노 입자는 이와 같이 너무 작으면 안되며, 즉 혈행 중 정상혈관을 통과할 수 없을 정도로 커야 하며 동시에 대식세포의 포식을 피할 수 있을 만큼 작아야 한다. 비장의 sinusoid와 간에 위치하는 Kupffer 세포의 fenestra의 크기는 150~200 nm 사이이며, 종양에 분포하는 혈관의 내피세포 간의 간격은 100~600 nm 사이이다. 따라서 이러한 특징적인 두 가지 종류의 혈관 구조를 통과하여 종양에 도달하기 위해서는 나노 입자의 크기가 100 nm 미만이어야 한다.
목표로 하는 표적 종양조직으로 약물을 효과적으로 전달하기 위해서는 우선 제거되지 않고 상당 기간 혈행 내에 잔존할 수 있는 나노 입자의 능력이 필수적이다. 일반적으로 표면을 변형시키지 않은, 즉 소수성 표면을 갖는 나노입자는 간, 비장과 같은 세망내피계(reticulo-endothelial system)에 위치하는 대식세포(macrophage)에 잡혀 제거된다. 따라서 투여된 나노 입자의 운명은 이러한 면역학적 장벽을 통과할 수 있도록 어떻게 그 크기와 표면 특성을 최적화하느냐에 달려있다.
크기와 더불어 표면특성 또한 혈행 중 나노 입자의 운명과 수명을 좌우하는 중요한 요소이다. 혈행 내에서 소수성 표면을 가진 나노 입자에는 fibronectin, complements, IgG 등과 같은 혈장단백들이 달라붙게 되며(opsonization) 이들(opsonins)은 다시 세망내피계의 대식세포에 의하여 인지되어 결과적으로 나노 입자는 포식, 제거되게 된다. 따라서 이러한 대식세포의 포식으로부터 벗어나기 위해서는 나노 입자의 표면을 친수성으로 만드는 것이 필수적이다. 두 가지 방법이 있으며, PEG와 같은 친수성 폴리머로 나노 입자의 표면을 덮어주거나, 소수성 및 친수성을 가진 양친성 블록 copolymer를 이용하여 micelle형태의 나노 입자를 만들어 표면에 친수성 폴리머가 위치하도록 하는 것이다.
이와 같이 그 크기와 표면특성을 최적화함으로써 세망내피계의 포식을 피한 나노 입자는 혈행 내에서 오랫동안 잔존할 수 있게 됨에 따라 그만큼 표적 종양조직에 다다를 수 있는 기회를 갖게 된다. 종양조직에 분포하는 혈관의 독특한 병리조직적 특성으로 인하여 나노 입자를 포함한 고분자들이 종양조직에만 선택적으로 집적될 수 있게 된다.
급격히 빠른 속도로 성장하는 종양은 그만큼 그 대사기능을 유지하기 위한 많은 양의 영양분 및 산소를 필요로 하며 따라서 그 영양분과 산소를 공급해 줄 새로운 혈관의 생성 및 기존 혈관의 재배열을 유발한다. 이러한 과정에서 성장인자 및 matrix metalloproteinases(MMPs)와 같은 혈관형성 조절인자들 간의 불균형이 초래되어, 형성된 종양 혈관은 확장되고 여러 개의 구멍이 생기는 불완전한 형태를 보이게 된다. 따라서, 내피세포 간의 간격이 넓어지고 림프계 배액에 장애가 생기게 된다. 이러한 현상을“투과상승 및 저류효과”라 부르며, 나노 입자를 포함한 분자량 50-kDa 이상의 고분자들이 종양조직 간질에만 선택적으로 집적될 수 있는 중요한 기전이 된다.
수동 표적의 또 다른 기전으로 정상세포에서는 볼 수 없는, 종양세포 주위의 독특한 주위 미세환경을 이용하는 것이다. 빠르게 성장하는 과증식 암세포들의 높은 대사율을 유지하기에 산소와 영양분의 공급은 늘 충분치 않다. 따라서 종양세포들은 추가적인 에너지의 보충을 위하여 저 산소 환경의 대사기능으로 당 분해(glycolysis)를 주로 이용하며 결과적으로 산성(acidic) 환경을 초래하게 된다.
또한 암세포들은 그들의 전이 및 침윤과 관련된 MMPs와 같은 독특한 효소를 발현 및 분비한다. 종양에 의하여 활성화 되는 전구 약물 치료(tumor-activated pro-drug therapy)가 그 일례로 운반체인 알부민과 항암제인 doxorubicin을 MMP-2에 의하여 특이적으로 분해되는 octapeptide sequence(linker)로 연결하여 만들어진 나노 입자의 경우, 시험관 내 실험에서 약물이 MMP-2에 의하여 특이적이고도 효과적으로 분리, 유리됨이 관찰되었다. 또한 MMP-2를 과발현하는 피부 흑색종(melanoma)을 이용한 동물실험에서 유리 약물에 비하여 더 탁월한 종양성장억제 효과를 보였다. 산성도에 민감한 물질을 이용한 리포좀의 형태도 수동 표적 기전의 한 예이다. 이와 같이 산성도에 민감한 리포좀들은 pH 7.4의 생리적 산성도의 범위 내에서는 안정성을 보이나 종양조직 주위환경과 같이 산성을 띄는 경우에는 분해되어 활성약물을 유리하도록 고안되어 있다.
앞에서 언급된 대로 “투과상승 및 저류효과”와 “종양주위 특이 미세환경” 등을 이용한 수동 표적 기전은 분명 종양조직을 선택적으로 표적할 수 있는 기전이나, 세포 단계에서 볼 때 종양세포만을 특이적으로 표적하기에는 한계가 있다.“투과상승 및 저류효과”의 경우를 보면, 림프관 배액 장애로 인하여 혈관을 빠져 나온 약물이 종양의 간질에 저류될 수 있는 반면 또 한편으로는 간질 내 삼투압을 높이는 결과를 초래하여 세포 내에서 외로의 흐름이 생겨 간질에서 유리된 약물의 세포 내 유입을 방해하게 된다.“종양에 의하여 활성화되는 전구약물 치료”의 경우에도 약물을 활성화시킬 효소가 실제로는 종양으로부터 충분한 양이 발현 또는 분비되지 않는다는 것이다. 따라서 분명한 것은 수동 표적 기전에만 의존한 약물전달체계는 불가피하게 특이성의 제한이라는 한계점을 가질 수 밖에 없다.
이러한 특이성의 한계점을 극복하기 위한 노력의 일환으로 운반체-약물의 이중 구조 나노 입자에 표적 리간드나 항체를 결합시킨 표적 나노 입자가 시도되었다. 이러한 표적 나노 입자들은 정상세포에 비하여 과 발현 또는 종양세포에서만 발현되는 수용체나 항원을 인지하고 선택적으로 결합할 수 있다.
<마이크로입자>
입자는 마이크로입자, 미립구으로 특정한 약물을 포함한 미세한 원형구로서 일반적으로 크기가 1㎜ 이하(1,000 ㎛)인 것을 지칭하는데 다음 두 가지로 대별된다. (1) 약이 중합체 매트릭스 내에 용해되거나 분산되어 있는 균일상 또는 모노리틱 미립구와 (2) 약이 중합체 매트릭스내에 단핵 또는 다핵으로 둘러싸인 저장 형태의 미립구 또는 미세캡슐이다. 이때 약물은 고분자 매트릭스의 표면에 흡수 또는 화학적으로 결합되었거나 매트릭스내의 구멍이나 채널내에 포접되어 있다.
이들의 형태는 약물의 물성, 약물의 원하는 방출 형태, 투여형태, 환자의 상태등에 의해서 결정된다. 이들의 형태학적인 구조는 이들의 단독형태 또는 혼합형이 대부분이다. 일례로 하이드로코티손이나 시스플라틴과 같은 지용성 약물을 폴리락타이드(PLA)와 락타이드-글리콜라이드 공중합체(PLGA)의 고분자 매트릭스로 하는 미립구인 경우에, 일부분의 약은 고분자가 녹아 있으나 대부분의 약은 고분자 용액으로부터 결정석출되어 결과적으로 고분자 매트릭스 내에 고체상으로 분산이 되어있거나 미립구를 제조하는 과정에서 표면으로 석출되어 나온다.최근에 미립구보다 더 작은 즉 나노크기(서브미코론 1㎛ 이하)의 극세미립구에 대한 연구가 널리 진행되고 있는데 이는 의약 투여방법 및 약의 종류에 따라서 적용범위가 달라진다. 원하는 미립구의 형태, 약물의 포접 등에 의해서 가장 적절한 형태의 것을 사용하면 될 것이다.
최근 연구가 진행되어 온 비수용성 저분자량 미립구의 제법으로는 (1) 분쇄방법, (2) 유화 (o/w,o/o)용매 증발법, (3) 용매증발 추출방법 및 (4) 분무건조방법 등이 사용되었다. 대부분의 미립구 제조법은 o/w유화용매 증발법이 사용되고 있다. 사용되는 의약과 생분해성 고분자는 수용액과 섞이지 않는 유기용매가 사용되며 이 유기상이 유화제가 들어있는 수용액상에서 분산된다(o/w). 이 혼합용액을 교반하며 생성되는 미립구를 동결건조한다. 이때 사용되는 유화제는 젤라틴,메틸셀룰로오스(MC), 폴리비닐알코올(PVA), 세틸트리메틸브롬화 암모니움(CTAB), 소듐도데실 셀페이트(SDS), 소듐 라우릴 설페이트(SLS), 및 소듐 올레이트 등이며, 제조시 이들의 농도가 증가할수록 크기는 감소한다. 또한 동일한 1%의 농도에서 미립구의 크기는 젤라틴>MC>SDS>PVA>CTAB 순으로 나타난다. PLGA의 농도가 증가하면 미립구의 크기는 감소하고 좁은 분포도를 나타낸다. 약의 수용액에 대한 용해도는 0.02mg/mL이하이어야 재연성이 있고 조절된 서방성을 갖는 미립구가 제조된다. 이중에서 널리 사용되는 유화제는 PVA이다.
o/o유화용매 증발방법은 PLGA와 의약(내부 oil상)을 용해하는 용매로는 DCM 또는 아세토니트릴과 연속상(외부 oil상)으로는 스판 40과 같은 유화제를 포함하는 액체 파라핀 또는 미네랄오일로 되어있다. 일례로 o/o계로 제조되어진 페노바비톤의 PLA 미립구는 o/w계에 의해서 제조된 것에 비하여 높은 약의 초기 포접뿐만 아니라, 큰 미립구 크기 그리고 높은 다공성 표면을 가지고 있음이 보고되었다. 흐르는 미네랄 오일 내에 약과 고분자가 용해된 용액의 연속적인 분무에 의해 미립구가 제조되는 유화용매 증발방법이 하이드로코티손/PLA 미립구의 제조에서 시도되었는데 이의 장점은 원하는 미립구의 크기, 크기분포,약의 포접량을 조절할 수 있다는 것이다. 또한 이 제조법으로 만들어진 클라리스로마이신의 PLA 미립구가 실험용 개에 근육주사를 통하여 주사한 후 일반주사 방법과 비교하여 국부발진과 세포조직에 대한 피해가 적은 것으로 나타났다. 분무건조방법은 단 한번의 공정단계라서 아주 좋은 생산회수율을 보이고 있어 상용화 측면에서 많은 관심을 보이고 있다. 이 비수용성 저분자량 의약을 함유한 의약제제에 있어서 방출은 초기에 과다 방출이 있는 또는 없이 영차방출의 방출거동을 보이고 있다. 이러한 지속상 방출 프로파일의 조절은 고분자 안정성, 미립자의 크기, 약의 초기 포접량 및 약물의 친수-소수성비에 의해 의존된다.
약물의 높은 초기 포접율과 조절이 잘된 방출거동을 갖는 수용성 약을 함유하는 미립구의 제조방법은 (1) 유화법과 (2) 상 분리법이다. 이 o/w 유화법이 PLA, PLGA 미립구를 제조하는 방법으로는 아주 유용하고 널리 쓰이지만 수용액상으로 빠져 나오는 약의 손실 때문에 수용성 의약의 높은 포접효율을 기대하기가 어렵다. 이 단점을 개선하기 위하여 퀴니딘/PLA 미립구를 제조하는데 있어 수용성 의약의 최소 용해도를 유지하고 약의 용액상에서 포화시키기 위하여 수용액상의 pH를 10이상으로 조절하였다. 이들의 이론적인 의약물의 초기 포접율은 80~90%에 이르는 것으로 나타났다. 또한 수용액상의 체적과 온도를 상승시키면 미립구내에 의약물의 포접량은 각각 증가 또는 감소하는 것으로 보고되고 있다.
또 다른 방법으로는 다중유화 용매증발법도 개발되었다. 젤라틴과 트윈 80을 함유하고 있는 약물수용액을 알미늄 스테아레이트와 스판 80이 들어있는 쏘이빈을 w/o유화용액을 만들기 위해 혼합한다. 이 w/o유화 용액을 PLGA/아세토니트릴 용액에 부어 w/o/o 유화용액을 만든다. 이 두 유화용액을 좁은 노즐을 이용하여 스판 80을 함유하고 있는 미네랄 오일에 첨가하며 계속 교반하면서 아세토니트릴을 증발시킨다. 이러한 방법을 이용하여 염화페닐아민 말레이트, 염산프로카인 아마이드 및 염산 프로마진과 같은 수용성 의약에 높은 포접 효율을 가진 다상 미립구를 만들 수 있었다.
A. 접합체
상기 입자는 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 접합체를 포함한다. 상기 접합체는 입자의 내부에 존재할 수 있다.
B. 중합체
상기 입자는 하기 폴리에스테르 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 글리콜산 단위(일괄하여 본원에 "PGA"로 나타냄), 및 락트산 단위, 예를 들면, 폴리-L-락트산, 폴리-D-락트산, 폴리-D,L-락트산, 폴리-L-락티드, 폴리-D-락티드, 및 폴리-D,L-락티드(일괄하여 본원에 "PLA"로 나타냄), 및 카프로락톤 단위, 예를 들면, 폴리(e-카프로락톤)(일괄하여 본원에 "PCL"로 나타냄)을 포함하는 단독중합체; 및 락트산 및 글리콜산 단위, 예를 들면, 락트산:글리콜산의 비를 특징으로 하는 다양한 형태의 폴리(락트산-co-글리콜산) 및 폴리(락티드-co-글리콜리드)(일괄하여 본원에 "PLGA"로 나타냄); 및 폴리아크릴레이트, 및 이들의 유도체. 예시적인 중합체로 또한 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 상기한 폴리에스테르의 공중합체, 예를 들면, 다양한 형태의 PLGA-PEG 또는 PLA-PEG 공중합체(일괄하여 본원에 "페길화된(PEGylated) 중합체"로 나타냄)를 포함한다. 특정 양태에서, 상기 PEG 영역은 중합체와 공유 회합하여, 절단성 링커에 의해 "페길화된 중합체"를 수득할 수 있다.
상기 입자는 하나 이상의 친수성 중합체를 포함할 수 있다. 친수성 중합체는 셀룰로스성 중합체, 예를 들면, 전분 및 폴리사카라이드; 친수성 폴리펩티드; 폴리(아미노산), 예를 들면, 폴리-L-글루탐산(PGS), 감마-폴리글루탐산, 폴리-L-아스파르트산, 폴리-L-세린, 또는 폴리-L-리신; 폴리알킬렌 글리콜 및 폴리알킬렌 옥사이드, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 및 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO); 폴리(옥시에틸화폴리올); 폴리(올레핀성 알콜); 폴리비닐피롤리돈); 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드); 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트); 폴리(사카라이드); 폴리(하이드록시산); 폴리(비닐 알콜), 및 이들의 공중합체를 포함한다.
상기 입자는 하나 이상의 소수성 중합체를 포함할 수 있다. 적합한 소수성 중합체의 예는 폴리하이드록시산, 예를 들면, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 및 폴리(락트산-co-글리콜산); 폴리하이드록시알카노에이트, 예를 들면, 폴리3-하이드록시부티레이트 또는 폴리4-하이드록시부티레이트; 폴리카프로락톤; 폴리(오르토에스테르); 폴리무수물; 폴리(포스파젠); 폴리(락티드-co-카프로락톤); 폴리카보네이트, 예를 들면, 티로신 폴리카보네이트; 폴리아미드(합성 및 천연 폴리아미드 포함), 폴리펩티드, 및 폴리(아미노산); 폴리에스테르아미드; 폴리에스테르; 폴리(디옥사논); 폴리(알킬렌 알킬레이트); 소수성 폴리에테르; 폴리우레탄; 폴리에테르에스테르; 폴리아세탈; 폴리시아노아크릴레이트; 폴리아크릴레이트; 폴리메틸메타크릴레이트; 폴리실록산; 폴리(옥시에틸렌)/폴리(옥시프로필렌) 공중합체; 폴리케탈; 폴리포스페이트; 폴리하이드록시발레레이트; 폴리알킬렌 옥살레이트; 폴리알킬렌 석시네이트; 폴리(말레산), 및 이들의 공중합체를 포함한다.
상기 소수성 중합체는 지방족 폴리에스테르이다. 상기 소수성 중합체는 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 또는 폴리(락트산-co-글리콜산)이다.
상기 입자는 하나 이상의 생체분해성 중합체를 포함할 수 있다. 생체분해성 중합체는 체내에서 수용해성 물질로 화학적으로 또는 효소로 전환되는 수불용성 또는 수난용성인 중합체를 포함할 수 있다. 생체분해성 중합체는 가교결합된 중합체를 수불용성 또는 수난용성이도록 하는 가수분해성 가교결합 그룹에 의해 가교결합된 가용성 중합체를 포함할 수 있다.
입자 내의 생체분해성 중합체는 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리알킬렌, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 할로겐화물, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글리콜리드, 폴리실록산, 폴리우레탄 및 이들의 공중합체, 알킬 셀룰로스, 예를 들면, 메틸 셀룰로스 및 에틸 셀룰로스, 하이드록시알킬 셀룰로스, 예를 들면, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시-프로필 메틸 셀룰로스, 및 하이드록시부틸 메틸 셀룰로스, 셀룰로스 에테르, 셀룰로스 에스테르, 니트로 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 프로피오네이트, 셀룰로스 아세테이트 부티레이트, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 카복시에틸 셀룰로스, 셀룰로스 트리아세테이트, 셀룰로스 설페이트 나트륨 염, 아크릴산 및 메타크릴산 에스테르의 중합체, 예를 들면, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸메타크릴레이트), 폴리(부틸메타크릴레이트), 폴리(이소부틸메타크릴레이트), 폴리(헥실메타크릴레이트), 폴리(이소데실메타크릴레이트), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(비닐 알콜), 폴리(비닐 아세테이트, 폴리비닐 클로라이드 폴리스티렌 및 폴리비닐피롤리돈, 이들의 유도체, 이들의 선형 및 분지형 공중합체 및 블록 공중합체, 및 이들의 블렌드를 포함할 수 있다. 예시적인 생체분해성 중합체는 폴리에스테르, 폴리(오르토 에스테르), 폴리(에틸렌 이민), 폴리(카프로락톤), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리(하이드록시발레레이트), 폴리무수물, 폴리(아크릴산), 폴리글리콜리드, 폴리(우레탄), 폴리카보네이트, 폴리포스페이트 에스테르, 폴리포스파젠, 이들의 유도체, 이들의 선형 및 분지형 공중합체 및 블록 공중합체, 및 이들의 블렌드를 포함한다. 특히 바람직한 양태에서, 상기 나노입자는 생체분해성 폴리에스테르 또는 폴리무수물, 예를 들면, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 및 폴리(락트산-co-글리콜산)을 포함한다.
상기 입자는 하나 이상의 양쪽성 중합체를 포함할 수 있다. 양쪽성 중합체는 소수성 중합체 블록 및 친수성 중합체 블록을 포함하는 중합체일 수 있다. 상기 소수성 중합체 블록은 상기 소수성 중합체 또는 이의 유도체 또는 공중합체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 친수성 중합체 블록은 상기 친수성 중합체 또는 이의 유도체 또는 공중합체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 양쪽성 중합체는, 소수성 중합체로부터 형성된 소수성 말단 및 친수성 중합체로부터 형성된 친수성 말단을 포함하는 디-블록 중합체이다. 구성성분을 상기 소수성 말단에, 상기 친수성 말단에, 또는 이들 둘 다에 부착시킬 수 있다. 상기 나노입자는 두개 이상의 양쪽성 중합체를 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 중합체에 특정 세포/조직에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합할 수도 있다.
C. 지질
상기 입자는 하나 이상의 지질 또는 양쪽성 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 입자는 리포솜, 지질 미쉘, 고형 지질 입자, 또는 지질-안정화된 중합체성 입자일 수 있다. 상기 지질 입자는 하나의 지질 또는 상이한 지질들의 혼합물로부터 제조될 수 있다. 지질 입자는 하나 이상의 지질로부터 형성되며, 생리적 pH에서 중성, 음이온성, 또는 양이온성일 수 있다. 상기 지질 입자는 바람직하게는 하나 이상의 생체적합성 지질로부터 제조된다. 상기 지질 입자는 하나 초과의 지질의 배합물로부터 형성될 수 있는데, 예를 들면, 하전된 지질은 생리적pH에서 비이온성 또는 하전되지 않은 지질과 조합될 수 있다.
상기 입자는 지질 미쉘일 수 있다. 약물 전달용 지질 미쉘이 당업계에 공지되어 있다. 지질 미쉘은, 예를 들면, 지질 계면활성제를 갖는 유중수 에멀젼으로서 형성될 수 있다. 에멀젼은 두 개의 불혼화성 상의 블렌드이고, 여기서 계면활성제를 첨가하여 분산된 액적을 안정화시킨다. 몇몇 양태에서, 상기 지질 미쉘은 마이크로에멀젼이다. 마이크로에멀젼은, 액적 크기가 1 ㎛ 미만, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 250 nm인 투명하고 열역학적으로 안정한 시스템을 제조하는 적어도 물, 오일 및 지질 계면활성제로 구성된 열역학적으로 안정한 시스템이다. 지질 미쉘은 일반적으로, 소수성 치료제, 소수성 예방제, 또는 소수성 진단제를 포함하여 소수성 활성제를 캡슐화하는데 유용하다.
상기 입자는 리포솜일 수 있다. 리포솜은 구형 이중층으로 배열된 지질로 둘러싸인 수성 매질로 구성된 작은 소낭이다. 리포솜은 작은 단일층상(unilamellar) 소낭, 큰 단일층상 소낭, 또는 다중층상(multi-lamellar) 소낭으로 분류될 수 있다. 다중층상 리포솜은 다중 동심성 지질 이중층을 포함한다. 리포솜은, 친수성 제제를 수성 내부에서 또는 이중층 사이에 트랩핑함에 의해, 또는 소수성 제제를 상기 이중층 내에 트랩핑함에 의해 제제를 캡슐화하는데 사용될 수 있다.
상기 지질 미쉘 및 리포솜은 통상적으로 수성 중심을 갖는다. 상기 수성 중심은 물 또는 물과 알콜과의 혼합물을 포함할 수 있다. 적합한 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올(예를 들면, 이소프로판올), 부탄올(예를 들면, n-부탄올, 이소부탄올, 2급-부탄올, 3급-부탄올), 펜탄올(예를 들면, 아밀 알콜, 이소부틸 카비놀), 헥산올(예를들면, 1-헥산올, 2-헥산올, 3-헥산올), 헵탄올(예를 들면, 1-헵탄올, 2-헵탄올, 3-헵탄올 및 4-헵탄올) 또는 옥탄올(예를 들면, 1-옥탄올) 또는 이들의 배합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
적합한 중성 및 음이온성 지질은 스테롤 및 지질, 예를 들면, 콜레스테롤, 인지질, 라이소지질, 라이소인지질, 스핑고지질 또는 페길화된 지질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
적합한 양이온성 지질은 TAP 지질로도 언급되는 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸 암모늄 염, 예를 들면, 메틸설페이트 염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
적합한 고형 지질은 고도로 포화된 알콜, 고급 지방산, 스핑고지질, 합성 에스테르, 및 고도로 포화된 지방산의 모노-, 디-, 및 트리글리세리드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 고형 지질은 10 내지 40개, 바람직하게는 12 내지 30개의 탄소원자를 갖는 지방족 알콜, 예를 들면, 세포스테아릴 알콜을 포함할 수 있다. 상기 고형 지질은 10 내지 40개, 바람직하게는 12 내지 30개의 탄소원자의 고급 지방산, 예를 들면, 스테아르산, 팔미트산, 데칸산, 및 베헨산을 포함할 수 있다. 상기 고형 지질은 10 내지 40개, 바람직하게는 12 내지 30개의 탄소원자를 갖는 고도로 포화된 지방산의 모노글리세리드, 디글리세리드, 및 트리글리세리드를 포함하는 글리세리드, 예를 들면, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세롤 베헤네이트, 글리세롤 팔미토스테아레이트, 글리세롤 트리라우레트, 트리카프린, 트리라우린, 트리미리스틴, 트리팔리틴, 트리스테아린, 및 수소화된 피마자유를 포함할 수 있다. 적합한 고형 지질은 세틸 팔미테이트, 밀랍, 또는 사이클로덱스트린을 포함할 수 있다.
양쪽성 화합물은 0.01 내지 60(중량 지질/w 중합체), 가장 바람직하게는 0.1 내지 30(중량 지질/w 중합체)의 비로 혼입된, 인지질, 예를 들면, 1,2 디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디아르아키도일포스파티딜콜린(DAPC), 디베헤노일포스파티딜콜린(DBPC), 디트리코사노일포스파티딜콜린(DTPC), 및 디리그노세로일파티딜콜린(DLPC)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 인지질은 포스파티딘산, 포화 지질과 불포화 지질 둘 다를 갖는 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 포스파티딜리노시톨, 리소포스파티딜 유도체, 카르디올리핀, 및 β-아실-y-알킬 인지질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
D. 추가의 활성제
상기 입자는 접합체 내의 것 이외에 하나 이상의 추가의 활성제를 포함할 수 있다. 상기 추가의 활성제는 상기 기재된 치료제, 예방제, 진단제, 또는 영양제일 수 있다. 상기 추가의 활성제는 입자의 중량을 기준으로 하여, 임의의 양, 예를 들면, 1% 내지 90%, 1% 내지 50%, 1% 내지 25%, 1% 내지 20%, 1% 내지 10%, 또는 5% 내지 10% (w/w)으로 존재할 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 제제는 1% 내지 10% 부하량 w/w으로 혼입된다.
E. 추가의 압타머
상기 입자는, 접합체의 압타머 이외에, 입자를 특정 기관, 조직, 세포 유형, 또는 세포하 구획에 표적화하는 하나 이상의 압타머를 포함할 수 있다. 추가의 압타머는 입자의 표면에, 입자의 내부에 또는 이 둘 다에 존재할 수 있다. 추가의 압타머를 입자의 표면상에 고정시킬 수 있는데, 예를 들면, 입자 내의 중합체 또는 지질에 공유 결합시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, 압타머가 입자의 표면에 배향되도록 추가의 압타머를 양쪽성 중합체 또는 지질에 공유 결합시킨다.
F. 첨가제
상기 입자는, 다당류 첨가제, 바람직하게는 분자 내에 이온화 그룹을 갖는 다당류 첨가제, 더욱 바람직하게는 키토산-글리콜라이드, 콘드로이친 설페이트 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 입자는 그의 내부에 다당류 첨가제, 바람직하게는 분자 내에 이온화 그룹을 갖는 다당류 첨가제를 함유함으로써 표적화 약물과 함께 이온결합에 의한 이온 복합체를 형성하여 완충화 (buffering effect) 혹은 중성화 (neutralization) 효과를 통해 표적화 약물 간의 응집 또는 활성 감소를 효과적으로 막을 수 있을 뿐만 아니라, 다당류 특유의 증점 효과로 인해 PLGA 미립구 내부에서 더욱 안정적으로 약물의 활성을 유지할 수 있다. 여기에서 상기 분자내에 이온화 그룹을 갖는 다당류 첨가제에서 상기 이온화 그룹은 수성 환경하에서 염기성을 나타내도록 하는 것일 수 있다. 이러한 다당류 첨가제로는 글리콜 키토산 또는 콘드로이친 설페이트를 사용할 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 입자를 제조하기 위해 첨가되는 글리콜 키토산(glycol chitosan 이하, ‘CS' 라고도 언급함)이다. 상기 글리콜 키토산은 생체 적성합성이 높고, 생분해성이며 낮은 면역성을 갖는 키토산 부분 포함한다. 또한, 약물전달시스템에서는 글리콜 키토산은 항암제용 자기 응집체(self aggregate)를 형성하는 특성을 이용하여 많은 연구가 진행되고 있다.
본 발명에 따르면, 이러한 글리콜 키토산이 입자 내의 환경을 점도가 높은 환경으로 바꾸어서 표적화 약물의 순간적 방출 (burst release)을 막아 입자에 약물 전달의 서방성 특성을 부여한다.
이러한 서방성 특성은 약물전달 분야에서 매우 이롭게 이용될 수 있는데, 그 이유는 제형 내에서 약물의 빠른 방출이 일어날 경우 체내 표적화 약물 농도는 급격히 올라가게 되고 이로 인해 체내 면역반응이 일어나 약물의 부작용이 일어날 가능성이 존재하기 때문이다.
본 발명에 따른 입자의 제조에 첨가되는 콘드로이친 설페이트는 연골, 피부, 각막 및 태반에 존재하는 산성 무코폴리사카이드(mucopolysaccharide)로서, 글리코사미노글리칸(GAG)의 일종이다. 특히, 본 발명에 따른 입자의 제조에 있어서 콘드로이친 설페이트의 형태는 어떠한 것이든 상관 없으며, 예를 들면 콘드로이친-4-설페이트 또는 콘드로이친-6-설페이트일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 콘드로이친 설페이트로는 D-글루쿠론산, N-아세틸갈락토사민 및 술페이트 잔기가 동등 몰량으로 존재하는 콘드로이친 설페이트 A (이하, ‘CSA’라고도 언급함)를 사용한다.
한편, 키토산-글리콜라이드, 콘드로이친 설페이트 또는 이의 조합물의 수용액을 준비함에 있어서, 이들이 가혹한 pH 환경하에서도 가수분해되지 않도록 하기 위하여 수용액에 완충제를 첨가하는 것이 바람직하며, 예를 들면 인산 완충 식염수로 키토산-글리콜라이드, 콘드로이친 설페이트 또는 이의 조합물의 수용액을 준비할 수 있다.
표적화 약물의 수용액 중 키토산-글리콜라이드 또는 콘드로이친 설페이트의 농도는 특별하게 한정되지는 않지만, 입자 제형에서 표적화 약물에 완충화 (buffering effect) 혹은 중성화 (neutralization)를 통한 안정화를 제공할 수 있는 농도로 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 0.01 mg/ml 이상 1000 mg/ml 일 수 있다.키토산-글리콜라이드 또는 콘드로이친 설페이트의 농도가 높을수록, 입자 제형에서 표적화 약물에 완충화 (buffering effect) 혹은 중성화 (neutralization)를 통한 약물 함유 입자에서 약물의 응집체 형성을 제어하면서도 제어된 서방성 형태로 약물을 방출시키는 효과가 높을 수 있다.
본 발명에 따르면, 표적화 약물 및 키토산 글리콜 또는 콘드로이친 설페이트는 용액 준비 과정 또는 이들의 혼합과정에서 응집체 (inclusion body)를 형성할 가능성이 있기 때문에 교반 없이 서서히 녹이는 것이 바람직하다.
또한, 두 용액이 균일하게 혼합되도록 하기 위하여 혼합 후 일정시간, 예를 들면 약 10~20분, 바람직하게는 15분가량 방치해 두는 것이 바람직하다.
한편, 상기 단계에서 얻어진 표적화 약물의 농도와 상기 단계에서 얻어진 수용액 중의 키토산-글리콜라이드 또는 콘드로이친 설페이트의 농도의 혼합비는 특별히 한정되지는 않지만, 최종적으로 생성되는 입자 내부에서 약물의 불용성 응집체가 최소한으로 생성되도록 하기 위해서는 상기 단계에서 얻어진 용액 중의 키토산-글리콜라이드 또는 콘드로이친 설페이트의 농도가 높으면 높을수록 바람직하다.
이론에 의해서 본 발명이 특별히 한정되는 바는 아니지만, 용액 중의 키토산-글리콜라이드 또는 콘드로이친 설페이트의 농도가 높을수록 좋은 이유는, 키토산-글리콜라이드 또는 콘드로이친 설페이트의 음전하와 표적화 약물의 양전하 간에 이온 복합체를 형성함과 동시에 고분자 사슬기의 존재로 비공유 결합에 의해서 약물과 키토산-글리콜라이드 또는 콘디로이친 설페이트 간의 결합인력이 형성되어 생체 내에서 활성을 나타내지 못하는 불용성 응집체를 형성하지 않기 때문이다.
또한 키토산-글리콜라이드 또는 콘디로이친 설페이트는 염기성의 물질로서 입자의 붕괴 동안 PLGA 내부에 축적되는 산성물질을 중화시킴으로써 생성되는 산성 물질에 의한 PLGA 의 산-가수분해 가속화를 막을 수 있다. 다시 설명하면, 키토산-글리콜라이드 또는 콘드로이친 설페이트의 상기한 효과는 키토산-글리콜라이드 또는 콘디로이친 설페이트의 산에 대한 완충효과로 볼 수 있다.
상기 입자는 압타머 및 생체 적합성 폴리머를 포함하며, 입자 내의 압타머의 양은 0.1 % 내지 30 % (w / w), 0.1 % 내지 10 % (w / w) 또는 바람직하게는 0.5 % 내지 5 % (w / w)의 입자를 포함 할 수 있다. 핵산은 탈수소 (depurination)를 겪고 수용액에서 유리 라디칼 산화를 받기 쉽다(Lindahl (1993) NATURE 362 : 709-715; Demple 등 (1994) ANNU REV BIOCHEM. 63 : 915-948). 이 효과는 설탕과 같은 안정제의 첨가로 감소, 최소화 또는 제거 될 수 있습니다. 효과적인 안정제는 설탕, 트레할로스이다. 일 구체 예에서, 상기 입자 내의 트레할로오스에 대한 압타머의 질량비는 1 : 3 이상이다.
IV. 제형
본원에 기재된 제형은 이를 필요로 하는 개체에게 투여하기에 적절한 약제학적 담체에 유효량의 나노입자를 함유한다. 상기 제형은 일반적으로 비경구(예를 들면, 주사 또는 주입에 의해) 투여된다. 상기 제형 또는 이의 변이체는 장내, 국소(예를 들면, 눈에)를 포함하거나, 또는 폐 투여를 통해 임의의 방식으로 투여될 수 있다. 몇 몇 양태에서, 상기 제형은 국소 투여된다.
A. 비경구 제형
나노입자는 용액, 현탁액 또는 에멀젼 형태로 비경구 전달, 예를 들면, 주사 또는 주입을 위해 제형화될 수 있다. 상기 제형은 치료될 기관 또는 조직으로 전신 투여, 부위 투여 또는 직접 투여될 수 있다.
비경구 제형은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 수성 조성물로서 제조될 수 있다. 통상적으로, 상기 조성물은 주사 제형, 예를 들면, 용제 또는 현탁제; 주사 전에 재구성 매질의 첨가시에 용제 또는 현탁제를 제조에 사용하기에 적합한 고체 형태; 에멀젼, 예를 들면, 유중수(w/o) 에멀젼, 수중유(o/w) 에멀젼, 및 이의 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 에멀젼으로서 제조될 수 있다.
상기 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 하나 이상의 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜), 오일, 예를 들면, 식물성 오일(예를 들면, 낙화생유, 옥수수유, 참기름 등), 및 이들의 배합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질이다. 적절한 유동성은, 예를 들면, 코팅, 예를 들면, 레시틴의 사용에 의해, 분산의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및/또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 다수의 경우, 등장성 제제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다.
나노입자의 용액 및 분산액은 계면활성제, 분산제, 유화제, pH 개질제, 및 이들의 배합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 적합하게 혼합된 물 또는 또 다른 용매 또는 분산 매질 중에서 제조될 수 있다.
적합한 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 양쪽성 또는 비이온성 계면 활성제일 수 있다. 적합한 음이온성 계면활성제는 카복실레이트, 설포네이트 및 설페이트 이온을 함유하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 음이온성 계면활성제의 예는 장쇄 알킬 설포네이트 및 알킬 아릴 설포네이트의 나트륨, 칼륨, 암모늄, 예를 들면, 나트륨 도데실벤젠 설포네이트; 디알킬 나트륨 설포석시네이트, 예를 들면, 나트륨 도데실벤젠 설포네이트; 디알킬 나트륨 설포석시네이트, 예를 들면, 나트륨 비스-(2-에틸티옥실)-설포석시네이트; 및 알킬 설페이트, 예를 들면, 나트륨 라우릴 설페이트를 포함한다. 양이온성 계면활성제는 4급 암모늄 화합물, 예를 들면, 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 세트리모늄 브로마이드, 스테아릴 디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 폴리옥시에틸렌 및 코코넛 아민을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 비이온성 계면활성제의 예는 에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 프로필렌 글리콜 미리스테이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 스테아레이트, 폴리글리세릴-4-올레에이트, 소르비탄 아실레이트, 수크로스 아실레이트, PEG-150 라우레트, PEG-400 모노라우레트, 폴리옥시에틸렌 모노라우레트, 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐에테르, PEG-1000 세틸 에테르, 폴리옥시에틸렌 트리데실 에테르, 폴리프로필렌 글리콜 부틸 에테르, 폴록사머® 401, 스테아로일 모노이소프로판올아미드, 및 폴리옥시에틸렌 수소화된 우지 아미드를 포함한다. 양쪽성 계면활성제의 예는 나트륨 N-도데실-β-알라닌, 나트륨 N-라우릴-β-이미노디프로피오네이트, 미리스토암포아세테이트, 라우릴 베타인 및 라우릴 설포베타인을 포함한다.
상기 제형은 미생물의 성장을 방지하기 위해 방부제를 함유할 수 있다. 적합한 방부제는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 및 티메로살을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 제형은 또한 활성제(들) 또는 나노입자의 분해를 방지하기 위해 산화방지제를 함유할 수 있다.
상기 제형은 통상적으로 재구성시 비경구 투여를 위해 3 내지 8의 pH로 완충시킨다. 적합한 완충액은 포스페이트 완충액, 아세테이트 완충액 및 시트레이트 완충액을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 10% 수크로스 또는 5% 덱스트로스를 사용하는 경우, 완충액이 필요하지 않을 수 있다.
수용해성 중합체는 종종 비경구 투여용 제형에 사용된다. 적합한 수용해성 중합체는 폴리비닐피롤리돈, 덱스트란, 카복시메틸셀룰로스, 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
멸균 주사 용액은, 나노입자를 필요한 양으로 요구되는 바와 같이 상기 기재된 하나 이상의 부형제를 갖는 적절한 용매 또는 분산 매질 중에 혼입시키고, 이어서 멸균 여과시킴에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 나노입자를 기본 분산 매질 및 상기 기재된 것들로부터 요구되는 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴에 의해 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은, 이전에 이의 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 요구되는 성분과 나노입자의 분말을 수득하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다. 상기 분말은, 입자가 자연에서 다공성이어서 입자의 용해를 증가시킬 수 있는 방식으로 제조될 수 있다. 다공성 입자의 제조 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다.
비경구 투여용 약제학적 제형은 하나 이상의 중합체-약물 접합체로부터 형성된 입자의 멸균 수용액 또는 현탁액 형태일 수 있다. 허용되는 용매는, 예를 들면, 물, 링거액, 포스페이트 완충 염수(PBS), 및 등장성 염화나트륨 용액을 포함한다. 상기 제형은 또한 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용제, 예를 들면, 1,3-부탄디올 중에서 멸균 용제, 현탁제, 또는 에멀젼제일 수 있다.
몇몇 예에서, 상기 제형은 액체 형태로 분포 또는 패키징된다. 또는, 비경구 투여용 제형은, 예를 들면, 적합한 액체 제형의 동결 건조에 의해 수득된 고체로서 패키징될 수 있다. 상기 고체는 투여 전에 적절한 담체 또는 희석액으로 재구성될 수 있다.
비경구 투여용 용제, 좌제, 또는 에멀젼제는 안구 투여에 적합한 pH를 유지하는데 필요한 유효량의 완충액으로 완충시킬 수 있다. 적합한 완충액은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 유용한 완충액의 몇몇 예는 아세테이트, 보레이트, 카보네이트, 시트레이트, 및 포스페이트 완충액이다.
비경구 투여용 용제, 좌제, 또는 에멀젼제는 또한 제형의 등장성 범위를 조절하기 위해 하나 이상의 긴장성 제제(tonicity agent)를 함유할 수 있다. 적합한 긴장성 제제는 당업계에 익히 공지되어 있으며, 몇몇 예는 글리세린, 수크로스, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨, 및 기타 전해질을 포함한다.
비경구 투여용 용제, 좌제, 또는 에멀젼제는 또한 안구용 제제의 세균 오염을 방지하기 위해 하나 이상의 방부제를 함유할 수 있다. 적합한 방부제는 당업계에 공지되어 있으며, 폴리헥사메틸렌바이구아니딘(PHMB), 벤잘코늄 클로라이드(BAK), 안정화된 옥시클로로 복합체(달리 Purite®로도 공지되어 있음), 아세트산 페닐수은, 클로로부탄올, 소르브산, 클로르헥시딘, 벤질 알콜, 파라벤, 티메로살, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
비경구 투여용 용제, 좌제, 또는 에멀젼제는 또한 당업계에 공지된 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 분산제, 습윤제 및 현탁화제를 함유할 수 있다
B. 점막 국소 제형
상기 나노입자는 점막 표면에 국소 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 국소 투여하기에 적합한 용량형은 크림제, 연고제(ointment), 연고제(salve), 분무제, 겔제, 로션제, 에멀젼제, 액제, 및 경피 패치제를 포함한다. 상기 제형은 경점막. 경상피, 또는 경내피 투여를 위해 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 하나 이상의 화학 침투 개선제, 막 투과성 제제, 막 수송 제제, 연화제, 계면활성제, 안정화제, 및 이들의 배합물을 함유한다. 몇몇 양태에서, 나노입자는 액상 제형, 예를 들면, 용제 또는 현탁제, 반고체 제형, 예를 들면, 로션제 또는 연고제, 또는 고체 제형으로 투여될 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 나노입자는, 점막, 예를 들면, 눈으로 또는 질내로 또는 직장내로 용제 및 현탁제를 포함하는 액체, 예를 들면, 점안제로서, 또는 반고체 제형으로서 제형화된다.
"계면활성제"는 표면 장력을 낮추어 생성물의 에멀젼화, 발포화, 분산, 확산 및 습윤화 성질을 증가시키는 계면 활성제이다. 적합한 비이온성 계면활성제는 유화 왁스, 글리세릴 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체, 폴리소르베이트, 소르비탄 에스테르, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 사이클로덱스트린, 글리세린 모노스테아레이트, 폴록사머, 포비돈 및 이들의 배합물을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 비이온성 계면활성제는 스테아릴 알콜이다.
"유화제"는 또 다른 하나의 액체의 현탁액을 촉진시키고 오일과 물의 안전한 혼합물 또는 에멀젼의 형성을 촉진시키는 계면활성 물질이다. 통상의 유화제는 금속성 비누, 특정 동물 및 식물성 오일, 및 다양한 극성 화합물이다. 적합한 유화제는 아카시아, 음이온성 유화 왁스, 칼슘 스테아레이트, 카보머, 세토스테아릴 알콜, 세틸 알콜, 콜레스테롤, 디에탄올아민, 에틸렌 글리콜 팔미토스테아레이트, 글리세린 모노스테아레이트, 글리세릴 모노올레에이트, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이프로멜로스, 라놀린, 수화물, 라놀린 알콜, 레시틴, 중쇄 트리글리세리드, 메틸셀룰로스, 광유 및 라놀린 알콜, 제1 나트륨 포스페이트, 모노에탄올아민, 비이온성 유화 왁스, 올레산, 폴록사머, 폴록사머들, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 프로필렌 글리콜 유사체, 자가-유화 글리세릴 모노스테아레이트, 시트르산나트륨 탈수화물, 나트륨 라우릴 설페이트, 소르비탄 에스테르, 스테아르산, 해바라기유, 트라가칸트, 트리에탄올아민, 크산탄 검 및 이들의 배합물을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 유화제는 글리세롤 스테아레이트이다.
적합한 부류의 피부흡수 개선제(penetration enhancer)는 당업계에 공지되어 있으며, 지방 알콜, 지방산 에스테르, 지방산, 지방 알콜 에테르, 아미노산, 인지질, 레시틴, 콜레이트 염, 효소, 아민 및 아미드, 착화제(리포솜, 사이클로덱스트린, 개질된 셀룰로스, 및 디이미드), 매크로사이클릭, 예를 들면, 매크로사이클릭 락톤, 케톤, 및 무수물 및 사이클릭 우레아, 계면활성제, N-메틸 피롤리돈 및 이들의 유도체, DMSO 및 관련 화합물, 이온성 화합물, 아존 및 관련 화합물, 및 용매, 예를 들면, 알콜, 케톤, 아미드, 폴리올(예를 들면, 글리콜)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 부류의 예는 당업계에 공지되어 있다.
V. 접합체 제조 방법
상기 접합체는 다수의 상이한 합성 과정에 의해 제조될 수 있다. 상기 접합체는 관능기가 있는 압타머와 활성제로부터 제조할 수 있거나, 하나 이상의 반응성 커플링 그룹을 갖는 링커로부터 제조될 수 있거나, 공유 결합을 형성하기 위해 활성제 또는 압타머 상에 관능기과 반응할 수 있는 하나 이상의 링커 전구체로부터 제조될 수 있다. 또한 접합체에 pegylation될 수도 있다.
A. 관능기가 있는 압타머와 활성제로부터 제조하는 접합체
관능기가 있는 압타머와 활성제로부터 제조하는 접합체, 상기 식 A-B의 반응식에 따르며 링커 사용없이 A 단위와 B 단위 각각 하나 이상의 관능기가 있어 용이하게 효소합성 또는 화학 합성을 할 수 있다.
1차 스페이서는 약 1 내지 20개의 연속적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 2개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 스페이서인 상기 1차 스페이서 및/또는 2차 스페이서는 하나 이상의 에틸렌 글리콜 부위 또는 이러한 에틸렌 글리콜 부위가 다수인 것을 포함하는 것이다.
바람직하게, 압타머와 뉴클레오티드 유사체, siRNA, decoy 와 안티센스을 포함하는 핵산 약물간에 하기의 다양한 방법으로 연결할 수 있다. 화학식 6과 압타머와 핵산 약물 사이에 스페이서(spacer)가 있을 수 있으며 하기의 다양한 방법으로 단량체가 연결되는 형태일 수 있다.
상기 스페이서는 약 1 내지 20개의 연속적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 2개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 스페이서인 상기 1차 스페이서 및/또는 2차 스페이서는 하나 이상의 에틸렌 글리콜 부위 또는 이러한 에틸렌 글리콜 부위가 다수인 것을 포함하는 것이다.
본원에서 사용된 용어 "포스포디에스테르"는 뉴클레오사이드 단량체를 연결시키는데 사용되는 결합 -PO4를 의미한다. 본원에서 고려되는 포스포디에스테르 결합("PO")은 자연 발생 DNA에서 발견되는 결합이다. 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 핵산의 예를 아래에 나타내었다.
본원에서 사용된 용어 "포스포로티오에이트"는 뉴클레오사이드 단량체를 연결시키는데 사용되는 결합 -PO3(S)를 나타낸다. 포스포로티오에이트 ("pS") 결합은하 기에 나타낸 바와 같이 포스포에스테르 결합상의 산소 원자 대신 황 원자를 포함한다.
본원에서 사용 된 "H-, 알킬 또는 알케닐 포스포네이트"라는 용어는 뉴클레오 시드, 뉴클레오사이드 유사체 또는 탈핵 뉴클레오 사이드 단량체를 연결시키는데 사용되는 결합 -PO3R-를 말한다. H-포스포네이트 결합은 상술한 포스 포디에스테르 결합과 같이 산소 원자 대신에 인에 결합된 수소 원자를 함유한다. 알킬 포스포네이트 결합(R-pO)은 산소 원자 대신 인 원자에 결합된 탄소 원자를 함유한다. 적합한 알킬기는 C1-35 선형 또는 분 지형 사슬 알킬기, 바람직하게는 C1-20, 보다 바람직하게는 C1-5 선형 또는 분지형 알킬이다. 적합한 알 케닐 그룹은 C2-35 선형 또는 분지형 사슬 알케닐, 바람직하게는 C2-20, 보다 바람직하게는 C1-5 선형 또는 분지형 알케닐이다.
본원에 사용된 용어 "호모 폴리머"는 뉴클레오타이드 및 스페이서가 모두 동일한 폴리 뉴클레오타이드 화합물을 지칭한다. 경우에 따라 압타머의 한쪽 말단에 FdUMP10를 부가할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 단일 중합체 폴리 뉴클레오타이드 전구 약물에서, HO-[dN-PO2X]n-OH는 각 뉴클레오티드 "dN"및 각 X가 동일하다.
압타머에 겜시타빈 트리포스페이트 (dFdCTP)와 5-플루오로 우라실 (5-FU)와 5-F-2'-UTP 트리 포스페이트 (5FdUTP)가 포함된다. 약물의 활성 대사물인 dFdCMP와 5FdUMP는 압타머에 효소적으로 도입할 수 있다. dFdCMP 및 5FdUMP와 접합된 P19의 구조는 화학식 7에 묘사되어 있으며, 이들 약물의 포함은 과량의 불소 잔기로 인해 P19에 비해 P19-dFdCMP (1,862g / 몰까지)의 분자량을 단지 약간 증가시켰지만, P19- 5FdUMP는 변하지 않았다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로 폴리머"는 쇄 내의 뉴클레오타이드 또는 링커의 각각이 동일하지 않은 폴리 뉴클레오타이드 화합물을 나타낸다. 화학식 8과 같이 압타머를 활성제인 5-FdU을 첨가하여 제작하는 경우처럼 활성제를 탑재할 수도 있다. 따라서 본 발명의 헤테로 폴리머 폴리 뉴클레오타이드 전구 약물에서 HO- [dN-PO2X]n-OH는 뉴클레오타이드 "dN" 또는 결합 "PO2X"가 사슬을 따라 상이하다.
본 발명은 약학적으로 비활성인 결합에 의해 연결된 약학적으로 활성인 분자의 사슬로부터 형성된 중합체성 화합물을 포함할 수도 있다. 한 실시 양태에서, 약학적 활성 분자는 2'O- 메틸 리보뉴클레오사이드와 같은 뉴클레아제 내성 잔기에 의해 사슬을 따라 분리된 치료 모노머 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체, 탈핵 뉴클레오사이드 또는 헤테로 사이클릭 유도체이다. 단량체 그룹은 포스포디에스테르(pO), 포스포로티오네이트(pS) 또는 알킬 또는 알케닐 포스포네이트(R-pO) 그룹에 의해 사슬을 따라 연결될 수 있다. 바람직한 구체 예에서, 사슬은 2 내지 100 (보다 바람직하게는 2 내지 35)의 치료적 모노머 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체, 탈핵 뉴클레오시드 또는 이의 헤테로 사이 클릭 유도체를 포함한다.
본 발명은 포스포디에스테르(pO), 포스포로티오네이트(pS) 또는 H- 또는 알킬 또는 알케닐 포스포네이트에 의해 연결된 약학적 활성 또는 치료 모노머 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오시드 유사체의 사슬로부터 형성된 폴리 뉴클레오타이드 화합물에 관한 것이다. 바람직한 구체 예에서, 사슬은 2 내지 100 (보다 바람직하게는 2 내지 35)의 치료 학적 단량체 뉴클레오사이드, 뉴클레오시드 유사체 또는 무치환 뉴클레오시드를 포함한다.
본 발명은 아래에 나타낸 바와 같이, 혼합 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 폴리 뉴클레오타이드를 고려한다. pS 결합을 갖는 올리고머는 pO 결합을 갖는 올리고머보다 더 안정하며, 결과적으로 pS 올리고머는 pO 결합된 올리고머보다 느린 속도로 분해된다. S. T. Crooke, Oligonucleotide Therapeutics, Burger 's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th ed., Ed. M. E. Wolff 863-900, 1995) 및 그 안에 인용된 추가의 문헌들에 개시되어있다.
본 발명은 치료학적으로 활성인 뉴클레오시드 또는 뉴클레오사이드 유사체 및 뉴클레아제 내성 부분 (예컨대, 탈회 2'O- 메틸 뉴클레오시드)의 교대 체인을 사용하여 뉴클레오사이드 치료제의 방출 속도를 조절할 수 있는 능력을 함유하는 폴리 뉴클레오타이드를 형성하는 것을 고려한다. 치료적 활성 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체 및 뉴클레아제 내성 잔기 (예컨대, 무 - 염기성 2'O- 메틸 뉴클레오시드)의 교대하는 세그먼트의 구조는 치료제의 원하는 방출을 달성하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 접합체는 표적지향형 리간드로 인해 특정 표적으로 약물을 전달할 수 있으며, 예를 들면 표적지향형 리간드가 HER2인 경우, HER2 수용체가 과발현되어 있는 암세포에 선택적으로 약물을 전달하는 표적 지향형 접합체를 제공하는 것이다.
본 발명은 이중가닥 DNA와 리간드가 공유결합으로 연결된 단일구조체와 하나 이상의 약물(chemotherapeutic agent)이 자기 조립으로 특이 구조를 형성하는 표적화 접합체를 제공한다.
상기 DNA 폴리머 단위는, 5'말단에서 3'말단 방향으로 순차적으로 센스가닥 핵산 서열, 센스가닥 핵산 서열과 상보적으로 결합 가능한 안티센스 가닥 핵산 서열을 포함한다. 상기 센스 가닥 핵산서열은 GC 염기가 풍부한 서열로 이상적으로 GC 단위가 반복적으로 있을 수 있다.
상기 센스가닥 핵산 서열의 염기 개수는 핵산 복합체 제조를 위해 적절히 조절될 수 있으며, 예컨대, 상기 센스 가닥 핵산 서열은 5 내지 100개, 바람직하게는 10 내지 100개의 염기로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 안티센스 가닥 핵산 서열의 염기 개수도 핵산 복합체 제조를 위해 적절히 조절될 수 있으며, 예컨대, 상기 안티센스 서열 핵산분자는 5 내지 100개, 바람직하게는 10 내지 100개의 염기로 이루어질 수 있다.
DNA는 단백질 및 지질과 같은 많은 다른 생물학적 분자와 상호 작용한다. 이러한 상호 작용은 DNA 모양, 주로 DNA 그루브 및 DNA 꼬임의 인식이다. 모든 유형의 핵산은 핵산 염기에 다양한 수소 공여체와 수용체를 가지고 있다. H 결합 공여체와 수용체는 다른 분자가 결합할 수 있는 앵커로 사용된다. 리간드는 groove 크기에 기초하여 이들의 결합 부위를 구별한다. 수소 결합 및 형태 인식은 리간드에 의한 결합 부위 인식의 주요 메카니즘이다.
major 그루브는 더 많은 수소 결합 공여체와 수용체를 가지고 있기 때문에, 수소 결합은 major 그루브 결합 (Groove Binding) 현상에서 결합 특이성에 더 많은 기여를 한다. minor 그루브에서 소수의 수소 결합 공여체와 수용체로 인해 많은 리간드가 T : A 염기쌍을 A : T 또는 G : C 염기쌍을 C : G와 구별 할 수 없다. 결합 특이성은 수소 결합 공여체와 수용체의 수에 의존할 뿐만 아니라 수소 결합 구조에도 의존한다. 리간드는 상이한 DNA 염기서열은 상이한 수소 결합 패턴을 가지므로 특정 표적과 결합한다. 물은 또한 홈 내에 수소 결합을 형성할 수 있다. 따라서, 수화의 정도를 변화시킴으로써 리간드와 DNA 사이의 수소 결합을 중재하는 것이 가능하다.
상기 이중가닥 DNA에 결합하는 리간드는 삽입물질(intercalator) 및 그루브 결합물질(Groove binder)로 분류한다.
상기 삽입물질은 DNA의 평면 기저부 사이에 삽입되는 리간드를 의미한다. 알려진 예로 ethidium bromide (EtBr), berberine, proflavine 및 doxorubicin이 있다. 그들은 암 세포에서 DNA 복제를 억제하기 위해 화학요법 치료에 적용된다. 삽입물질은 염기 쌍 사이에 삽입하기 때문에, DNA 분자는 삽입물질을 위한 공간을 열기 위해 풀림(unwind)과 연장(extend)해야 한다. 이러한 DNA의 구조적 변화는 삽입물질의 크기와 모양에 달려있다. 따라서 삽입물질은 DNA와 결합하여 복제, 전사 및 DNA 복구 과정을 억제한다. 이 메커니즘은 또한 돌연변이 유발 가능성을 증가시킨다. 그것은 또한 삽입물질의 결합으로 DNA의 구조적 변형에 의해 유도된 기능적 변화가 있다.
그루브 결합물질은 major 그루브 결합물질와 minor 그루브 결합물질로 나눌 수 있다. major 그루브의 큰 치수로 인해 대형 단백질은 공통적인 major 그루브 결합물질이다. 그러나 triplex 형성 올리고 뉴클레오타이드 (TFO), 펩티드 핵산 (PNA), 플루마이신(pluramycins), 아플라톡신(aflatoxins) 및 아지노마이신(azinomycins)과 같은 작은 DNA 결합물질은 major 그루브에 결합한다. 그루브 바인더는 비공유적으로 DNA와 상호 작용한다. 그루브 결합물질은 아미노글리코시드(aminoglycosides) 와 같은 DNA와 공유 결합을 형성 할 수도 있다. 아미노글리코시드의 친전자성 그룹은 퓨린 염기의 친핵성 N7 위치와 반응한다.
minor 그루브 결합물질은 커다란 단백질의 major 그루브 결합물질보다 작기 때문에 DNA에 있는 좁고 깊은 minor그루브에 적합하다. 그러나 netropsin과 distamycin A (Dst.A)와 같은 단순한 초승달 모양에서부터 trabectedin과 같은 복잡한 구조에 이르기까지 그들의 구조와 모양은 매우 다양하다. minor 그루브 결합물질은 공유 또는 비공유의 두 가지 유형의 힘을 통해 DNA와 상호 작용한다. DNA와 공유 결합을 형성하는 한 가지 예는 duocarmycin 계열에 속하는 CC1065이다. 안트라마이신 Anthramycin 은 또한 DNA와 공유 결합을 형성한다. 그것은 디아제핀 diazepine 고리에 탄소 - 질소 이중 결합을 가지고 있으며, 이는 염기의 아미노기와 반응한다. DAPI와 펜타미딘(pentamidine)과 같은 다른 합성 화합물들도 잘 연구되어 있다.
본 발명의 실시례에서 사용한 약물은 헤어핀 구조 DNA에 삽입(intercalation)되는 성질을 가지는 안트라사이클린계(anthracycline) 약물은 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 및 이다루비신으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상일 수 있고, 바람직하게는 독소루비신이다.
상기 접합체에서 약물, 특히 독소루비신이 DNA를 구성하는 염기 사이에 삽입되는 성질을 이용하여 독소루비신을 삽입할 수 있다. 독소루비신(doxorubicin, 독소루비신 염산염)은 암 화학요법에서 가장 광범위하게 사용되는 세포독성 안트라사이클린 항생제 중의 하나이며, 다양한 종양에 대해 활성을 나타낸다고 알려져 있다. 상기 독소루비신은 수많은 고형암과 백혈병의 치료에 유용하며, 특히 복합치료와 관계있는 유방암의 치료에 효과적이다. 또한, 독소루비신은 AIDS와 연관된 카포시 육종(Kaposi's sarcoma)에 대한 프로토콜 치료제이며 난소암, 폐암, 정소암, 전립샘암, 자궁암, 두경부암, 에스트로겐성 육종 및 에윙 육종(Ewing's sarcoma)에 대해 탁월한 활성을 보인다.
DOX는 토포아이소머라제 I 및 II와 같은 DNA 관련 효소에 결합하기 때문에 토포이소머라제 II 저헤제로 분류되지만 항암 활성에 영향을 미치는 다른 여러 생화학적 과정을 교란시킬 수 있다. 독소루비신은 DNA에 결합되는 성질을 지니고 있으므로 세포 내에 투과된 독소루비신은 핵으로 이동하여 DNA에 결합됨으로써 각종 생합성과정을 저해한다고 알려져 있다.
대표적으로는 DNA 전사과정에서 DNA supercoil 구조를 풀어주는 기능을 하는 topoisomerase II 효소의 작용을 방해함으로써 세포의 증식 혹은 사멸을 유도할 수 있다. topoisomerase II의 억제는 회복되지 않으면 세포 자멸사를 일으킬 수 있다.
Dox는 이중가닥 DNA의 평면 염기쌍과 daunosamine 당단 부분에 의한 minor groove 사이의 tetracene 고리 시스템의 삽입을 통해 DNA와 상호 작용한다. 그러나 DNA에 대한 Dox의 비공유 결합은 쉽게 가역적이며 비공유 결합체는 상대적으로 짧은 반감기(t1/2 ~ 분)를 보인다.
Dox는 또한 더 안정한 DNA와 공유 결합 부가물을 형성하지만 Dox의 daunosamine sugar을 exocyclic에 연결시키는 알데히드 전구체를 필요로 한다. Dox-DNA 공유 결합 부가물은 비공유 결합체보다 세포 독성이 크고 공유 결합 부가물이 합성되어 안트라사이클린 세포 독성 연구에서 많이 사용된다. 공유 결합 DNA 부가물을 형성하며, 세포로의 이러한 병변의 독성은 토포이소머라아제 II 손상에 의해 유도된 것보다 높다. 생성된 DNA 부가물이 병변의 독성을 우세하게 유도한다.
포름 알데히드는 Dox-DNA 부가물의 형성에 사용되며, 외인성 포름알데히드는 Dox 공유 결합 부가물 형성을 게놈 DNA로 촉진시킨다. Dox-포름알데히드 복합체는 게놈 DNA에 공유 결합 부가물 형성을 돕는 Dox의 활성화된 형태의 전달을 위해 사용하고 있다.
포름알데히드는 DOX의 3'- 아미노기를 DNA에 있는 dGuo의 2- 아미노기에 Schiff 염기 화학(Schiff base chemistry) 을 통해 연결시키는 메틸렌기를 제공하기 때문에 DOX에 의한 DNA 부가 생성에 중심적인 역할을 한다. 이들 부가물의 특이성은 하나의 DNA 가닥에 공유 결합으로 형성하고 DNA의 국소 부위에 대한 안정화로 인해 열 변성에도 저항한다.
B. 링커에 의해 활성제와 압타머로부터 제조되는 접합체.
표적으로 하는 암세포 또는 암조직에 효율적으로 전달되기 위하여, 상기 리간드와 활성제 사이에 링커가 연결될 수 있다. 상기 링커는 스페이서(spacer) 부분과 관능기(functional group)를 포함할 수 있다. 상기 스페이서 부분이 너무 긴 경우에는 소수성 성질이 높아 사용될 수 없으므로, C1 내지 C6의 직쇄형 또는 분지형 알킬렌기, 바람직하게는 C1 내지 C6의 직쇄형 알킬렌기가 스페이서 부분으로서 적합하다. 예컨대, 상기 링커는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 또는 헥실렌일 수 있다. 상기 스페이서 부분과 표적 펩타이드를 연결시켜 주기 위하여 관능기가 도입되며, 상기 관능기는 표적 펩타이드와 연결시켜 주는 기로서 펩타이드와 결합할 수 있는 모든 작용기를 포함한다. 예컨대 상기 관능기는 아민기(-NH2), 설프히드릴기(-SH, sulfhydryl) 일수 있으며, 상기 관능기는 표적 펩타이드와 아미드 결합을 할 수 있다.
상기 접합체는, 활성제 또는 압타머 상에서 반응성 커플링 그룹과 반응시켜 활성제 또는 압타머에 공유 결합하는 스페이서를 형성할 수 있는 링커로부터 제조될 수 있다.
상기 링커는 이산(diacid) 또는 치환된 이산일 수 있다. 본원에 사용된 이산은, 2개 이상의 카복실산 그룹을 갖는, 바람직하게는 2 내지 50개, 2 내지 30개, 2 내지 12개, 또는 2 내지 8개의 탄소원자를 갖는 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 헤테로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 화합물을 나타낼 수 있다. 적합한 이산은 옥살산, 말론산, 석신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 세박산, 프탈산, 이소-프탈산, 테레프탈산, 및 이들의 유도체를 포함할 수 있다.
상기 링커는 활성화된 이산 유도체, 예를 들면, 이산 무수물, 이산 에스테르, 또는 이산 할로겐화물일 수 있다. 상기 이산 무수물은 이산 또는 이산 유도체, 예를 들면, 상기 기재된 것들의 분자내 탈수로부터 수득된 사이클릭 무수물일 수 있다. 상기 이산 무수물은 말론산 무수물, 석신산 무수물, 글루타르산 무수물, 아디프산 무수물, 피멜산 무수물, 프탈산 무수물, 디글리콜산 무수물, 또는 이들의 유도체; 바람직하게는 석신산 무수물, 디글리콜산 무수물, 또는 이들의 유도체일 수 있다. 상기 이산 에스테르는 상기 기재된 이산 중 어느 하나 의 활성화된 에스테르일 수 있으며, 옥살산, 말론산, 석신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 세박산, 프탈산, 이소-프탈산, 테레프탈산, 및 이들의 유도체의 메틸 및 부틸 디에스테르 또는 비스-(p-니트로페닐) 디에스테르를 포함한다. 상기 이산 할로겐화물은 상기 기재된 이산의 상응하는 산 불화물, 산염화물, 산 브롬화물, 또는 산 요오드화물을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 이산 할로겐화물은 석시닐 클로라이드 또는 디글리콜릴 클로라이드이다. 예를 들면, 화학식 12에 제시한 바와 같이, 반응성(-OH) 커플링 그룹을 갖는 치료제 및 반응성(-NH2) 커플링 그룹을 갖는 압타머를 사용하여 하기 반응식에 따라 디석시네이트 링커를 갖는 접합체를 제조할 수 있다.
상기 반응식 I을 참조하여, 접합체는 하이드록실 그룹을 갖는 활성제를 제공하고, 이를 석신산 무수물 링커와 반응시켜 활성제-석시네이트-SSPy의 접합체를 형성함에 의해 제조될 수 있다. 이용가능한 -NH2 그룹을 갖는 압타머를 커플링 시약 및 활성제-석시네이트 -SSPy와 반응시켜 압타머-스페이서-활성제 접합체를 형성한다.
연결될 수 있는 기타 관능성 그룹은 -CH, -COOH, 알케닐, 포스페이트, 설페이트, 헤테로사이클릭 NH, 알킨 및 케톤을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 커플링 반응은 당업자들에게 공지된 에스테르화 조건하에, 예를 들면, 활성화제, 예를 들면, 화학식 13에 제시한 바와 같이, 카보디이미드(예를 들면, 디이소프로포일카보디이미드(DIPC))의 존재하에 촉매, 예를 들면, 디메틸아미노피리딘(DMAP)의 존재하에 또는 부재하에 수행될 수 있다. 이러한 반응은 적절한 용매, 예를 들면, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 에틸 아세테이트 중에서, 약 0 ℃ 내지 용매의 환류 온도(예를 들면, 주위 온도)의 온도에서 수행될 수 있다.
상기 커플링 반응은 일반적으로 용매, 예를 들면, 피리딘 중에서 또는 염소화 용매 중에서 촉매, 예를 들면, DMAP 또는 피리딘의 존재하에 약 0 ℃ 내지 용매의 환류 온도(예를 들면, 주위 온도)에서 수행된다. 바람직한 양태에서, 상기 커플링 시약은, 염소화, 에테르화 또는 아미드 용매(예를 들면, N,N-디메틸포름아미드) 중에서 촉매, 예를 들면, DMAP의 존재하에 약 0 ℃ 내지 용매의 환류 온도(예를 들면, 주위 온도)의 온도에서 4-(2-피리딜디티오)-부탄산, 및 카보디이미드 커플링 시약, 예를 들면, DCC로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
상기 접합체는, 활성제 또는 압타머 상에서 반응성 커플링 그룹과 반응시켜 공유 결합을 형성할 수 있는 상보적 반응성 그룹을 갖는 링커에 하나 이상의 반응성 커플링 그룹을 갖는 커플링 활성제 및/또는 압타머를 커플링시킴에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 1급 아민 그룹을 갖는 활성제 또는 압타머를 이소티오시아노에이트 그룹 또는 또 다른 아민-반응성 커플링 그룹을 갖는 링커에 커플링시킬 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 링커는, 활성제 상에서 상보적 관능성 그룹과 반응시킬 수 있는 제1 반응성 커플링 그룹과, 압타머 상에서 상보적 관능성 그룹과 반응시킬 수 있는 제1 반응성 커플링 그룹과 상이한 제2 반응성 커플링 그룹을 포함할 수 있다. 링커 상에서 반응성 커플링 그룹 중 하나 또는 둘 다를 합성의 일부 동안 적합한 보호 그룹으로 보호할 수 있다.
VI. 입자 제조 방법
상기 입자의 제조 방법은, 접합체를 제공하고; 입자를 형성하기 위해 기본 성분, 예를 들면, PLA-PEG 또는 PLGA-PEG를 제공하고; 상기 접합체와 기본 성분을 유기 용액 중에서 결합시켜 제1 유기상을 형성하고; 제1 유기 상을 제1 수용액과 결합시켜 제2 상을 형성하고; 상기 제2 상을 유화시켜 에멀젼 상을 형성하고; 입자를 회수하는 것을 포함한다. 다양한 양태에서, 상기 에멀젼 상은 추가로 균질화시킨다.
상기 제1 상은 약 5 내지 약 50중량%, 예를 들면, 약 1 내지 약 40% 고체, 또는 약 5 내지 약 30% 고체, 예를 들면, 약 5%, 10%, 15%, 및 20%의 접합체 및 기본 성분을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 제1 상은 약 5중량%의 접합체 및 기본 성분을 포함한다. 다양한 양태에서, 상기 유기 상은 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란, 에틸 아세테이트, 이소프로필 알콜, 이소프로필 아세테이트, 디메틸포름아미드, 메틸렌 클로라이드, 디클로로메탄, 클로로포름, 아세톤, 벤질 알콜, TWEEN® 80, SPAN® 80, 또는 이들의 배합물을 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 유기 상은 벤질 알콜, 에틸 아세테이트, 또는 이들의 배합물을 포함한다.
상기 수용액은 물, 나트륨 콜레이트, 에틸 아세테이트, 또는 벤질 알콜을 포함한다. 계면활성제를 제1 상, 제2 상, 또는 이 둘 다에 첨가한다. 계면활성제는 본원에 기재된 조성물에 대한 유화제 또는 안정화제로서 작용할 수 있다. 적합한 계면활성제는 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 또는 비이온성 계면활성제일 수 있다. 몇몇 양태에서, 본원에 기재된 조성물을 제조하기에 적합한 계면활성제는 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 스테아레이트를 포함한다. 상기 지방산 에스테르 비이온성 계면활성제의 예는 ICI의 TWEEN® 80, SPAN® 80, 및 MYJ® 계면활성제이다. SPAN® 계면활성제는 C12-C18 소르비탄 모노에스테르를 포함한다. TWEEN® 계면활성제는 폴리(에틸렌 옥사이드) C12-C18 소르비탄 모노에스테르를 포함한다. MYJ® 계면활성제는 폴리(에틸렌 옥사이드) 스테아레이트를 포함한다. 상기 수용액은 또한 폴리소르베이트를 포함하는 계면활성제(예를 들면, 유화제)를 포함한다. 예를 들면, 상기 수용액은 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다. 적합한 계면활성제는 지질계 계면활성제를 포함한다. 예를 들면, 상기 조성물은 1,2-디헥사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 페길화 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(PEG5000-DSPE 포함), 페길화 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-5000](암모늄 염) 포함)을 포함할 수 있다.
상기 제2 상을 유화시켜 에멀젼 상을 형성하는 것은 하나의 또는 두 개의 유화 단계로 수행될 수 있다. 예를 들면, 최초(primary) 에멀젼을 제조한 다음, 유화시켜 미세 에멀젼을 형성할 수 있다. 상기 최초 에멀젼은, 예를 들면, 단순 혼합, 고압 균질화기, 프로브 초음파기, 교반 바, 또는 로터 교정자 균질화기를 사용하여 형성할 수 있다. 최초 에멀젼은, 예를 들면, 프로브 초음파기 또는 고압 균질화기의 사용을 통해, 예를 들면, 균질화기를 통과시킴으로써 미세 에멀젼으로 형성할 수 있다. 예를 들면, 고압 균질화기를 사용하는 경우, 사용된 압력은 약 4000 내지 약 8000 psi, 약 4000 내지 약 5000 psi, 또는 4000 또는 5000 psi일 수 있다.
용매 증발 또는 희석은 용매 추출을 완료하고 입자를 고화시키는 데 필요할 수 있다. 추출 동력학 및 보다 확장 가능한 공정을 더 잘 조절하기 위해, 수성 급냉을 통한 용매 희석이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 에멀젼을 냉수 중에서 유기 용매 모두를 용해시키기에 충분한 농도로 희석시켜, 급냉시킨 상을 형성할 수 있다. 급냉은 약 5 ℃ 이하의 온도에서 적어도 부분적으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 급냉시 사용된 물은 실온(예를 들면, 약 0 내지 약 10 ℃, 또는 약 0 내지 약 5 ℃) 미만의 온도일 수 있다.
상기 입자는 여과에 의해 회수된다. 예를 들면, 한외여과 막이 사용될 수 있다. 예시적인 여과는 탄젠트 유동 여과 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 용질, 미쉘, 및 유기 용매가 통과되도록 허용하면서 나노입자를 보유하기에 적합한 기공 크기를 갖는 막을 사용함으로써, 나노입자를 선택적으로 분리할 수 있다. 약 300 내지 500 kDa(-5-25 nm)의 분획 분자량을 갖는 예시적인 막이 사용될 수 있다.
상기 입자를 냉동 건조 또는 동결 건조시킨다, 이들의 저장 수명을 연장시킬 수 있다. 상기 조성물은 또한 동결건조 보호제(lyoprotectant)를 포함한다. 특정 양태에서, 동결건조 보호제는 당, 다가알콜, 또는 이들의 유도체로부터 선택된다. 특정 양태에서, 동결건조 보호제는 모노사카라이드, 다이사카라이드, 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다. 예를 들면, 동결건조 보호제는 수크로스, 락툴로오스, 트레할로스, 락토스, 글루코스, 말토스, 만니톨, 셀로비오스, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
하나 이상의 접합체를 포함하는 입자 제조방법이 제공된다. 상기 입자는 중합체성 입자, 지질 입자, 또는 이들의 조합일 수 있다. 본원에 기재된 다양한 방법들은 입자의 크기 및 조성을 제어하여 조절할 수 있는데, 예를 들면, 몇몇 방법들은 마이크로입자를 제조하기에 최고로 적합하지만, 다른 방법은 나노입자를 제조하기에 더 적합하다. 기재된 특징을 갖는 입자를 제조하는 방법의 선택은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 수행될 수 있다.
A. 중합체성 입자
중합체성 입자를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 중합체성 입자는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 통상의 마이크로캡슐화 기술은 분무 건조, 계면 중합, 고온 용융 캡슐화, 상 분리 캡슐화(자발적 에멀젼 마이크로캡슐화, 용매 증발 마이크로캡슐화, 및 용매 제거 마이크로캡슐화), 코아세르베이션, 저온 마이크로구체 형성, 및 상 전이 나노캡슐화(PIN)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
B. 지질 입자
지질 입자의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 지질 입자는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조된 지질 미쉘, 리포솜, 또는 고형 지질 입자일 수 있다. 활성제를 캡슐화하는 지질 입자를 위한 통상의 기술은 고압 균질화 기술, 초임계 유체 방법, 에멀젼 방법, 용매 확산 방법, 및 분무 건조를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
VI. 접합체 및 입자의 사용 방법
제형은, 적절한 경우, 임의의 증식성 질환, 대사성 질환, 감염성 질환, 또는 암을 치료하기 위해 투여될 수 있다. 상기 제형은 면역에 대해 사용될 수 있다. 제형은 통상적으로 점막 표면(폐, 비강, 경구, 협측, 설하, 질내, 직장내)으로 또는 눈으로(안구경유로(transocularly)) 주사, 경구 또는 국소 투여된다. 본원에 기재된 접합체 함유 입자 제형은, 이를 필요로 하는 개체 또는 환자에게 치료제, 예방제, 또는 진단제의 선택적 조직 전달을 위해 사용될 수 있다. 투여 요법은 최적의 원하는 반응(예를 들면, 치료 또는 예방 반응)을 제공하기 위해 조절할 수 있다. 예를 들면, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 수회 분할된 용량으로 경시적으로 투여될 수 있거나, 상기 용량은 치료 상황의 긴급 사태에 따라 비례하여 감소하거나 증가할 수 있다. 본원에 사용된 용량 단위 형태는 치료될 포유류 대상체에 단일 용량으로 적합한 물리적 개별 단위를 나타낸다; 각 단위는 치료제를 제조하기 위해 산출된 소정량의 활성 화합물을 함유한다.
입자 내에 함유된 접합체는 제어된 방식으로 방출된다. 시험관내 또는 생체내 방출될 수 있다. 예를 들면, 대상체를 미국 약전 및 이의 개정판에 규정된 것을 포함하는 특정 조건하에 입자를 방출 시험할 수 있다.
입자 내에 함유된 약 90% 미만, 약 80% 미만, 약 70% 미만, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만의 접합체는, 입자를 방출 시험 조건으로 노출시킨 후 첫 1시간 째에 방출된다. 몇몇 양태에서, 입자 내에 함유된 약 90% 미만, 약 80% 미만, 약 70% 미만, 약 60% 미만, 또는 약 50% 미만의 접합체는, 입자를 방출 시험 조건으로 노출시킨 후 첫 1시간 째에 방출된다. 입자 내에 함유된 약 50% 미만의 접합체는, 입자를 방출 시험 조건으로 노출시킨 후 첫 1시간 째에 방출된다.
생체내 방출된 접합체와 관련하여, 예를 들면, 대상체에 투여된 입자 내부에 함유된 접합체는 대상체의 체내로부터 보호될 수 있으며, 상기 체내는 접합체가 입자로부터 방출될 때까지 접합체로부터 단리될 수도 있다.
따라서, 상기 접합체는, 입자가 대상체의 체내로 전달될 때까지 입자 내에 실질적으로 함유될 수 있다. 예를 들면, 약 90% 미만, 약 80% 미만, 약 70% 미만, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 또는 약 1% 미만의 총 접합체는, 입자가 체내, 예를 들면, 대상체의 치료 부위로 전달되기 전에 입자로부터 방출된다. 상기 접합체는 연장된 시간에 걸쳐 또는 집중적으로 방출될 수 있다(예를 들면, 접합체의 양이 단시간에 방출되고, 이어서 일정 시간 실질적으로 접합체가 방출되지 않는다). 예를 들면, 상기 접합체는 6시간, 12시간, 24시간, 또는 48시간에 걸쳐 방출될 수 있다. 상기 입자에서 접합체는 1주 또는 1개월에 걸쳐 방출된다.
[실시예]
실시예 1. dFdCTP-HER2 압타머 접합체 및 dFdCTP-EpCAM 압타머 접합체의 제조
DuraScribe T7 Transcription Kit (Epicenter Biotechnologies)를 사용하여 겜시타빈-5'-트리포스페이트(Gemcitabine-5'-triphosphate, dFdCTP)가 도입되고, 2' F-Pyrimidine 변형된 HER2 및 EpCAM 압타머 접합체(이하, 각각 "dFdCTP-HER2 압타머 접합체" 및 "dFdCTP-EpCAM 압타머 접합체"라 명명함)를 제조하였다. 상기 dFdCTP는 Sierra Bioresearch로부터 구입하였다. dFdCTP-HER2 압타머 접합체 및 dFdCTP-EpCAM 압타머 접합체 제조를 위한 각각의 주형 DNA는 바이오니아 사에서 주문 제작하였다.
dFdCTP-HER2 압타머 접합체 및 dFdCTP-EpCAM 압타머 접합체 제조 공정을 구체적으로 살펴보면, dFdCTP-HER2 압타머 접합체 및 dFdCTP-EpCAM 압타머 접합체는 이중가닥 DNA 주형과 돌연변이 T7 RNA 중합 효소 (Y639F)를 사용하여 합성하였다. 주형 DNA 및 합성된 압타머 접합체의 염기서열은 아래에 나타내었다.
HER2 주형 DNA (서열번호 1)
5'- AAT TTA ATA CGA CTC ACT ATA GG G AGG ACG ATG CGG GAC TGT ACG GGG CTC UGT GCA GAC GAC TCG CCC GA-3'
dFdCTP-HER2 압타머 접합체 (서열번호 2)
5'-GGG AGG A C G AUG C GG GA C UGU A C G GGG C U C UGU G C A GA C GA C U C G CCC GA-3'
EpCAM 주형 DNA (서열번호 3)
5'- AAT TTA ATA CGA CTC ACT ATA GG CGA CTG GTT ACC CGG TC G-3′
dFdCTP-EpCAM 압타머 접합체 (서열번호 4)
5'-GG C GA C UGG UUA CCC GGU C G-3′
상기 염기서열 중, 주형 DNA에 있는 진하게 밑줄친 부분은 T7-프로모터 서열이고, 압타머 접합체에 도입된 dFdCTP는 C 로 표시하였다.
먼저, 6 nmol DNA 주형과 상보적 DNA 가닥을 동 몰비로 혼성화하였다. 어닐링 완충액 (10mM 트리스-HCl pH 7.5, 10mM MgCl2)의 총 부피 90㎕에 용해시켰다. 샘플을 95 ℃에서 5 분 동안 가열하고 2 시간 동안 실온으로 냉각시켰다.
dFdCTP-HER2 압타머 접합체 및 dFdCTP-EpCAM 압타머 접합체는 1x전사 완충액 (40mM Tris-HCL pH7.5, 6mM MgCl2, 5mM NaCl 및 10mM spermidine)의 총 부피 90㎕에서 이중 가닥 DNA 주형 5㎍을 사용하여 전사하여 제조하였다.
반응 혼합물에 5mM 또는 2mM NTP 혼합물 (ATP, 2’F-dUTP, GTP, 및 dFdCTP 또는 2' F-CTP)을 갖는 돌연변이 T7 효소를 함유하는 Durascribe T7 효소 믹스(Epicentre)의 10㎕을 첨가하여 37 ℃에서 12시간 반응시켰다.
DNA 주형을 RQ1 RNase-free DNase (1U / mL)를 사용하여 37 ℃에서 15 분 동안 반응시켜 분해하였다. 미결합 NTP는 G25 스핀 컬럼 (GE Healthcare)으로 제거하였다. 최종 생성물을 에탄올 침전시키고, 세척하고, 디에틸피로카보네이트(diethylpyrocarbonate, DEPC) 처리한 멸균 증류수에 재현탁시키고 자외선 Nanoodrop 분광기를 사용하여 정량하였다.
제조된 dFdCTP-HER2 압타머 접합체 및 dFdCTP-EpCAM 압타머 접합체의 품질과 크기는 7M 우레아가 함유된 10 % (19:1) 폴리아크릴아미드 겔에서 분석되었다(도 2).
제조된 dFdCTP-HER2 압타머 접합체 및 dFdCTP-EpCAM 압타머 접합체에 통상의 방법에 따라 pegylation을 수행하였다.
실시예 2. Dox/DNA-HER2 압타머 접합체의 제조
독소루비신(Dox)이 특이적으로 결합할 수 있는 헤어핀 구조인 d(GCG AAA GC)를 갖는 작은 DNA 단편을 함유한 염기서열(서열번호 5) 5'-GCG CGC GCG AAA GC G CGC GC-3'(한국 바이오니아사)의 말단과 HER-2 압타머(서열번호 2) 5'-GGG AGG ACG AUG CGG GAC UGU ACG GGG CUC UGU GCA GAC GAC UCG CCC GA-3'(미국 Biosynthesis 사)의 말단에 thiol을 도입한 올리고뉴클레오티드를 주문 제작하였다.
상기 압타머는 2' F-Pyrimidine RNA로 안정성을 높였다. 합성한 헤어핀 DNA와 압타머는 0.1 M triethylammonium acetate (TEAA) buffer에서 1.0 M Dithiothreitol (DTT) 10 μL와 상온에서 15분 동안 반응시킴으로써, 3' thiol의 activation을 실시하였다. 또한, 과량의 DTT를 제거하기 위하여 ethyl acetate를 이용하여 3회 이상 추출을 실시하였다.
헤어핀 DNA와 HER-2 압타머의 구조체 형성은 50% DMSO와 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)를 포함하는 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) 내에서 이루어졌으며, 활성화된 압타머와 헤어핀 DNA의 비율은 1:1으로 하여 상온에서 48 시간 반응시켰다. Gently shaking을 통해서 mild한 조건으로 복합체를 형성하였다.
헤어핀 DNA-HER2 압타머 구조체는 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)를 통하여 정제하였다. Eclipse XDB-C18 column을 이용하여 분리를 진행하였고, binding buffer (95% 0.1 M TEAA, 5% Acetonitrile)와 elution buffer (50% 0.1 M TEAA, 50% Acetonitrile)의 gradient를 통해 복합체를 분리하였다. 상기 복합체의 HPLC를 실시하였으며, HPLC의 피크들은 mass spectroscopy 방법을 통해서 분석하였고, 그 중에서 헤어핀 DNA-압타머 구조체의 분자량과 일치하는 피크들만 취하였다. 또한, 실험에 사용을 위하여 동결건조를 실시하였다.
Dox (500 μM), 헤어핀 DNA-압타머 구조체 (20 μM), 포름 알데히드 (0.37 %)를 반응 완충액 (20 mM 인산 나트륨, 150 mM NaCl, 0.5 mM,EDTA, pH 7.0))에 배양하여 Dox가 탑재된 DNA-HER2 압타머 접합체(이하, "Dox/DNA-HER2 압타머 접합체"라고 명명함)을 10 ℃에서 12시간 동안 제조하였다.
생성된 Dox/DNA-HER2 압타머 접합체를 0.1M 트리틸아민 아세테이트 (trithylamine acetate, TEAA, Glen Research Corp.글렌 리서치 코포레이션) 및 아세토 니트릴을 사용하여 C-18 컬럼상에서 역상 고속 액체 크로마토 그래피(HPLC) (ProStar, Varian, Walnut Creek, CA, USA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)를 용리액으로 사용하여 정제하였다.
정제된 샘플을 Dulbecco's 완충액(Sigma Aldrich)에서 동결 건조, 탈염 및 처리한 후 향후 사용을 위해 -20 ℃에서 보관하였다. UV-Vis spectrometry에 의한 약물 정량화를 위해 free Dox의 경우, 480 nm에서 11,500 M-1cm-1의 몰 흡광 계수가, Dox/DNA-압타머 접합체의 공유 결합 Dox의 경우, 506 nm에서 7,677 M-1cm-1의 몰 흡광 계수가 사용되었다.
480 nm에서 여기시킨 후 500 ~ 750 nm 구간에서 방출 스펙트럼을 측정하였을 때, 헤어핀 DNA-HER2 압타머 구조체의 양이 증가할수록 Dox의 형광세기는 감소하였다(도 3). 이것은 결합된 Dox 사이의 소광현상 때문이다. 헤어핀 DNA-압타머 구조체:Dox=1:1일 때 더 이상의 Dox 소광현상이 발생하지 않았으므로 중량비 1:1을 선택하여 Dox/DNA-압타머 접합체를 제조하였다. 상기 Dox/DNA-압타머 접합체에 pegylation을 수행하였다.
실시예 3. DM1-HER2 압타머 접합체의 제조
HER-2 압타머 서열(서열번호 2) 5'-GGG AGG ACG AUG CGG GAC UGU ACG GGG CUC UGU GCA GAC GAC UCG CCC GA-3'의 말단에 thiol을 도입하여 올리고뉴클레오티드를 제작하였다(미국 Biosynthesis 사). 상기 압타머는 2' F-Pyrimidine RNA로 안정성을 높였다.
합성한 압타머는 0.1 M triethylammonium acetate (TEAA) buffer에서 1.0 M Dithiothreitol (DTT) 10 μL와 상온에서 15분 동안 반응시킴으로써, 3' thiol의 activation을 실시하였다. 또한, 과량의 DTT를 제거하기 위하여 ethyl acetate를 이용하여 3회 이상 추출을 실시하였다.
Maytansine (DM1)은 Dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 10 mM stock으로 제조하였다. HER-2 압타머와 DM1의 복합체 형성은 50% DMSO와 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)를 포함하는 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) 내에서 이루어졌으며, 압타머와 약물의 비율은 1:1000으로 하여 상온에서 48 시간 반응시켰다. Gently shaking을 통해서 mild한 조건으로 DM1과 HER2 압타머 접합체(이하, "DM1-HER2 압타머 접합체"라고 명명함)를 형성하였다.
DM1-HER2 압타머 접합체는 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)를 통하여 정제하였다(도 4). Eclipse XDB-C18 column을 이용하여 분리를 진행하였고, binding buffer (95% 0.1 M TEAA, 5% Acetonitrile)와 elution buffer (50% 0.1 M TEAA, 50% Acetonitrile)의 gradient를 통해 접합체를 분리하였다. HER2 압타머 및 DM1-HER2 압타머 접합체의 HPLC를 실시하였으며, HPLC의 피크들은 mass spectroscopy 방법을 통해서 분석하였고, 그 중에서 DM1-HER2 압타머 접합체의 분자량과 일치하는 피크들만 취하였다. 또한 실험에 사용을 위하여 동결건조를 실시하였다. 상기 DM1-HER2 압타머 접합체에 pegylation을 수행하였다.
실시예 4. 입자의 제조
1. 미립구(Micro particles, MP)
0.25 ml의 인산완충식염수 (phosphate buffer saline) (pH 7.0)에 50 mg의 상기 실시예 1에서 제조된 dFdCTP-HER2 압타머 접합체 또는 dFdCTP-EpCAM 압타머 접합체를 동몰수로 서서히 녹여 제1 용액을 준비하였다. 이어서, 0.25 ml 의 인산완충식염수 (pH 7.0)에 20 mg의 키토산-글리콜라이드(트레할로오스(trehalose), 콘드로이친 설페이트 또는 이의 조합물로 대체할 수도 있음)에 녹여 제2 용액을 준비하였다. 그 다음, 상기 제1 용액과 상기 제2 용액을 혼합하고 15분가량 방치하여 제3 용액을 준비하였다. 이어서, PLGA 로서 500 mg의 RG 502H를 3 ml 의 메틸렌 클로라이드(MC)에 녹여 제4 용액을 제조하였다. 상기 제4 용액에 제3 용액을 넣고 15초간 격렬하게 교반 혼합(vortex)하여 W/O 에멀젼을 준비하였다. 상기 W/O 에멀젼을 분산 용매로서 PVA(20wt%)/NaCl(0.9wt%) 용액 1L에 15초 이내에 주사기로 주입한 다음, 호모믹서내에서 4,000 rpm 및 4분간 교반하여 미세입자를 용액을 제조하고 주사 전자 현미경(Tokyo, Japan)으로 조사하였다(도 5).
미세입자 제조 후 40 분간 서서히 교반하여 경화(hardening) 과정을 수행한 다음, 2,500 rpm에서 3분간 원심분리하여 미세입자를 회수하였다. 원심분리 후, 침전물에 0.9wt% NaCl 용액을 넣어 재분산 후 다시 원심분리하여 침전물을 얻고, 이 과정을 3회 반복하여 세척과정을 수행하였다. 이어서, 생성물을 3일간 동결건조하여 dFdCTP-HER2 압타머 접합체 또는 dFdCTP-EpCAM 압타머 접합체가 함유된 PLGA 미립구(이하, 각각 "dFdCTP-HER2 압타머 접합체 MP" 및 "dFdCTP-EpCAM 압타머 접합체 MP"라고 명명함)를 수득하였다(수득율: > 90%).
2. 나노입자(Nano particles, NP)
상기 실시예 2에서 제조된 Dox/DNA-HER2 압타머 접합체 또는 상기 실시예 3에서 제조된 DM1-HER2 압타머 접합체를 전달하기 위해 PLGA 나노입자를 이용하였다. 이미 기술된 수중유중수형(water-in-oil-in-water, w/o/w) 이중 에멀젼 방법(F, Danhier et al. Journal of Controlled release, vol.133(1), pp.11-17, 2009)에 따라 표적화 접합체(Dox/DNA-HER2 압타머 접합체 또는 DM1-HER2 압타머 접합체)가 함유된 PLGA 나노입자를 제조하였다.
표적화 접합체(1%, w/v), 키토산 글리콜라이드(1%, w/v) 및 PLGA(4%, w/v)를 디클로로메탄에 녹이고, 탈이온수를 1:5 부피비로 용액에 첨가하여 프로브-타입 소니케이터(Branson Digital Sonifier®, Danbury, CT)를 사용하여 25W 출력으로 60초 동안 실온에서 유화시켰다. 단일 에멀젼(w/o)을 수용성 PVA 용액(4%, w/v)에 다시 유화시키고, 30W로 120초 동안 소니케이션하였다(w/o/w). 이중 에멀젼을 PVA(1%, w/v) 용액에 붓고, 밤새 교반하여 용매를 증발시켰다. 표적화 접합체가 함유된 나노입자는 16000 rpm에서 원심분리하여 수득하여, 세척하고, 동결건조하여 상기 제조된 Dox/DNA-HER2 압타머 접합체 또는 DM1과 HER2 압타머 접합체로부터 나노입자를 제조하였다(이하, 전자는 "Dox/DNA-HER2 압타머 접합체 NP"로, 후자는 "DM1-HER2 압타머 접합체 NP"라고 명명함).
3. 외부에 리간드가 있는 나노입자
PLGA (50:50; 고유 점도 : 0.67 dl / g; 분자량 ~ 100 kDa)는 Absorbable Polymers (AL, USA)에서 구입하였다. 2,2,2-트리 플루오로-에탄올(2,2,2-trifluoro-ethanol)은 ACROS (NJ, USA)로부터 구입하였다. Pluronic® F127은 Sigma-Aldrich (MO, USA)에서 구입하였다.
dFdCTP-HER2 압타머 접합체를 포함하는 PLGA NP는 용매 확산법에 의해 제조하였다. 간단히, 2,2,2-트리 플루오로 에탄올에 용해된 18 mg/ml PLGA 용액 0.8 ml를 TE 완충액 (pH 8.0)에 용해된 200-500 μg dFdCTP-HER2 압타머 접합체를 함유하는 0.2 ml의 용액과 혼합하였다. 혼합물을 250 rpm에서 교반하면서 시린지 펌프(syringe pump, 17.5 ml / h)를 통해 0.1 % 변형 Pluronic® F127-COOH (Pluronic® F127의 수산기(hydroxyl groups)를 카르복실기로 변경) 10 ml에 넣었다. 수정된 Pluronic® F127은 입자 표면에 반응성 카르복실기를 부여하기 위해 계면 활성제로 사용하였다. 생산된 dFdCTP-HER2 압타머 접합체를 포함하는 PLGA NP는 1000 kDa 분자량 컷오프 멤브레인을 사용하여 12-16 시간 투석하였고, 투석액을 2 회 세척하였다.
dFdCTP-HER2 압타머 접합체를 포함하는 PLGA NP의 크기 및 제타 전위는 ZetaPALS 동적 광산란 시스템 (ZetaPALS, Brookhaven Instruments Corp., NY, USA)을 사용하여 결정하였다.
Pluronic® F127-COOH로 코팅된 dFdCTP-HER2 압타머 접합체를 포함하는 PLGA NP의 현탁액을 2-(N-모르폴리노) 에탄 술폰산(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid), pH 6.5를 사용하여 완충시켰다. 다음으로, dFdCTP-HER2 압타머 접합체를 포함하는 PLGA NP를 100 mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드 (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) 및 50 mM N-히드록시술포숙신이미드(N-hydroxysulfosuccinimide)와 함께 15 분 동안 배양하였다. dFdCTP-HER2 압타머 접합체를 포함하는 PLGA NP 표면에서 Pluronic® F127-COOH의 활성화된 카르복실 말단을 실온에서 적어도 6 시간 동안 상기 2' F-Pyrimidine 변형된 EpCAM 압타머 서열(서열번호 4) 5'-GGC GAC UGG UUA CCC GGU CG-3′(15 mM)의 아미노 말단(미국 Biosynthesis 사)과 반응시켰다. 접합된 나노입자는 정제수로 투석되었다. 제조된 나노입자(dFdCTP-HER2 압타머 접합체를 포함하는 PLGA NP) 및 압타머가 외부에 있는 나노입자(2' F-Pyrimidine 변형된 EpCAM 압타머를 리간드로 갖는 dFdCTP-HER2 압타머 접합체를 포함하는 PLGA NP)의 크기 및 충전량은 동적 광산란 (ZetaPALS)을 사용하여 특성화하였다. 반응 후 유리 아답터의 양을 Vydac® Protein 및 Peptide C18 컬럼에서 역상 HPLC로 5-90 % 아세토 니트릴(acetonitrile)의 구배로 30 분에 걸쳐 정량화하였다. 피크는 260 nm에서의 UV 흡광도에 의해 모니터하였다. 제조된 나노입자 표면에서의 aptamer의 밀도는 일반적인 Guassian 입자 크기 분포를 가정한 총 표면적으로부터 계산하였다.
실시예 5. 입자의 물리화학적 특징 조사
1. 미립자(Micro particles)
상기 실시예 4의 1.에서 제조된 dFdCTP-HER2 압타머 접합체 MP에서 dFdCTP- HER2 압타머 접합체 방출 프로파일을 분석하기 위해 100 mg의 미립자를 사용하였고, 블랭크(blank) PLGA 미립자를 대조군으로 사용하였다. 구체적으로, 상기 미립자를 1 ml PBS에 넣고, 오비탈 진탕기(orbital shaker)에 두었다. 상이한 시간 간격으로 PBS 채취 후 동결시키고, 1 ml의 PBS를 보충하였고, 표적화 접합체의 농도는 Nanoodrop 분광기로 분석하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
2. 나노입자
상기 4의 2.에서 제조된 Dox/DNA-HER2 압타머 접합체 NP 및 DM1-HER2 압타머 접합체 NP의 평균 크기는 Malvern's Zetasizer Nano ZS(Malvern instruments, Worcestershire, UK)로 측정하였다. 1mg의 나노입자를 1mL의 여과된 탈이온수에 녹였다. 평균 크기(nm), 다 분산도(25℃, 측정각 170°)의 5 가지 판독 값이 사용되었다. 나노입자의 표면 형태는 주사 전자 현미경(Tokyo, Japan)으로 조사하였다(도 7과 도 8).
상기 실시예 4의 2.에서 제조된 Dox/DNA-HER2 압타머 접합체 NP 및 DM1-HER2 압타머 접합체 NP의 크기는 수용 가능한 좁은 크기 분포 내에서 150-200nm 근처였다. 다분산도 지수 PDI≥0.1이며, 표적화 접합체의 로딩 전후 크게 달라지지는 않았다. 이 결과는 나노입자에서 표적화 접합체의 로딩이 약물이 없는 나노입자와 비교하여 크기에 영향을 주지 않는다는 기존의 연구와 일치한다. 같은 패턴이 주사전자현미경 분석에서도 관찰하였다.
다음으로, HPLC(Waters HPLC 모델)로 Dox/DNA-HER2 압타머 접합체 NP 및 DM1-HER2 압타머 접합체 NP의 약물 로딩 효율 및 방출 프로파일을 측정하였다. 컬럼은 대칭 C18 컬럼, 100Å, 5㎛, 4.6mm×250mm이었다. 이동상은 아세토니트릴/물(75/25 v/v)이었고 유속은 1mL/min으로 유지되었고 파장 227nm에서 검출되었다. 로딩 효율을 결정하기 위해 50㎕의 Dox/DNA-HER2 압타머 접합체 NP 및 DM1-HER2 압타머 접합체 NP를 1N NaOH 용액으로 용해시킨 다음 1N HCl 용액으로 NaOH 용액을 중화시켰다. 아세토니트릴을 Dox/DNA-HER2 압타머 접합체 NP 및 DM1-HER2 압타머 접합체 NP가 용해된 용액에 첨가하여 Dox/DNA-HER2 압타머 접합체 NP 및 DM1-HER2 압타머 접합체 NP를 용해시켰다. Dox/DNA-HER2 압타머 접합체 NP 및 DM1-HER2 압타머 접합체 NP의 로딩 효율 측정 후, 0.5mg의 Dox/DNA-HER2 압타머 접합체 NP 및 DM1-HER2 압타머 접합체 NP를 5mL의 인산 완충액(PBS, pH 7.4)에 분산시키고, 결정 시점에서 교반하면서 37℃에서 배양하고, 그 용액을 4℃에서 30분 동안 22000g에서 초원심분리하였다. 상등액을 회수하여 5mL의 아세토니트릴과 혼합하고 펠렛을 5mL의 PBS로 재현탁하고 37℃에서 교반하면서 다시 인큐베이션 하였다. 각 샘플을 50㎕의 부피로 주입하고 전술한 HPLC 조건으로 분석하였다.
나노입자 내부에 로딩된 Dox/DNA-HER2 압타머 접합체 및 DM1-HER2 압타머 접합체의 함량비율은 약 5.3% 미만이었고, 캡슐화 효율은 약 40% 였다. 그러나, Dox/DNA-HER2 압타머 접합체 NP 및 DM1-HER2 압타머 접합체 NP에서 약물 함량 비율은 최종 2.8% 미만, 그리고, 30%의 캡슐화 효율로 줄어들어, 느슨하게 캡슐화된 약물이 배출됨을 시사한다.
실시예 6. 입자의 암세포 표적성 확인
1. dFdCMP-HER2 압타머 접합체 MP
HER2 발현 정도에 따른 세포 증식에 대한 dFdCMP-HER2 압타머 접합체 MP의 효과를 평가하기 위해, HER-2가 과다 발현하는 유방세포주인 MDA-MB-453과 HER-2 negative 유방암 세포주인 MCF-7에서 MTT 분석을 수행하였다(도 9).
도 9에 제시한 바 처럼, HER-2가 과다 발현하는 MDA-MB-453 세포에서는 dFdCMP-HER2 압타머 접합체 MP의 IC50 값은 4.2 μg/mL이었고, 비교군으로 사용한 dFdCMP의 IC50 값인 2.9 μg/mL과 비교시에 유사한 세포독성을 나타내었다. HER-2 negative MCF-7에서는 dFdCMP의 IC50 값이 2.8 μg/mL 인 반면, dFdCMP-HER2 압타머 접합체 MP의 IC50 값은 측정할 수 없었다. 이러한 세포독성 결과는 약물 전달체가 HER-2가 과다 발현하는 MDA-MB-453에만 선택적으로 전달하여 세포사멸을 유도한다는 것을 나타낸다. 평균 ± 표준편차 (n = 5).
2. dFdCMP-HER2 압타머 접합체 MP 및 dFdCMP-EpCAM 압타머 접합체 MP
HER2와 EpCAM의 발현정도에 따른 세포 증식에 대한 dFdCMP-HER2 압타머 접합체 MP와 dFdCMP-EpCAM 압타머 접합체 MP의 효과를 평가하기 위해, HER-2와 EpCAM이 과다 발현하는 유방암 세포주인 MDA-MB-453, HER2 negative이고 EpCAM가 과다 발현하는 유방암 세포주인 MCF-7과 HER2와 EpCAM negative 유방암 세포주인 MDA-MB-231에서 MTT 분석을 사용하였다(도 10).
도 10에 제시한 바 처럼, dFdCMP-HER2 압타머 접합체 MP와 dFdCMP-EpCAM 압타머 접합체 MP(1μM)를 처리하고 72시간 동안 증식정도를 조사한 결과는 HER-2와 EpCAM이 과다 발현하는 MDA-MB-453에서 세포 증식을 유의하게 억제하였고, HER2 negative이고 EpCAM가 과다 발현하는, MCF-7에서도 세포 증식을 유의하게 억제하였으나, HER2와 EpCAM negative 유방암 세포주 MDA-MB-231 증식의 감소는 관찰되지 않았다.
3. DOX/DNA-HER2 압타머 접합체 NP
DOX/DNA-HER2 압타머 접합체 NP의 암세포 사멸 효과를 HER-2가 과다발현하는 유방암 세포주인 MDA-MB-453와 HER-2 negative 유방암 세포주인 MCF-7에 대한 MTT assay를 통해 비교하였다.
HER-2가 과다 발현하는 MDA-MB-453 세포 혹은 HER-2 negative MCF-7 세포에 Dox/DNA-HER2 압타머 접합체 NP 혹은 독소루비신(Dox)를 0, 0.1, 0.3, 0.6, 0.9, 1.2μg/mL로 처리하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, HER-2가 과다 발현하는 MDA-MB-453 세포에서는 DOX/DNA-HER2 압타머 접합체 NP의 IC50 값은 0.34 μg/mL이었고 비교군으로 사용한 독소루비신(Dox)의 IC50 값인 0.29 μg/mL과 비교시에 유사한 세포독성을 나타내었다.
HER-2 negative MCF-7에서는 독소루비신(Dox)의 IC50 값이 0.27 μg/mL 인 반면, DOX/DNA-HER2 압타머 접합체 NP의 IC50 값은 측정할 수 없었다. 이러한 세포독성 결과는 약물 전달체가 HER-2가 과다 발현하는 MDA-MB-453에만 선택적으로 독소루비신을 전달하여 세포사멸을 유도한다는 것을 나타낸다. 평균 ± 표준편차 (n = 5).
이를 통하여 DOX/DNA-HER2 압타머 접합체 NP는 HER-2-positive 유방암 세포의 HER-2를 인식하며, 내포작용(Endocytosis)을 통하여 독소루비신이 세포 내부로 유리되어 강력한 독성작용과 함께 암세포사멸을 유도함을 검증하였다.
상기 결과는 Dox 단독 처리군은 모든 유방암 세포주에 독성 반응을 나타내었으나, DOX/DNA-HER2 압타머 접합체 NP는 오직 HER-2가 과다 발현된 유방암 세포에서만 HER-2 수용체를 인지하여 세포내로 유입된 후, 유리된 Dox가 암세포사멸을 유도한다는 것을 다시 한번 확인하였다.
4. DM1-HER2 압타머 접합체 NP
DM1-HER2 압타머 접합체 NP가 유도하는 세포독성이 HER-2-positive 세포들에만 특이적으로 반응하는지를 조사하기 위하여, HER-2가 과다 발현하는 유방암 세포주인 MDA-MB-453과 HER-2 negative 유방암 세포주인 MCF-7에서 DM1 또는 DM1-HER2 압타머 접합체 NP를 각각 0, 0.1, 1. 3, 6, 12 μg/mL로 72 시간 동안 처리한 후, 세포의 독성여부를 MTT assay를 통해 비교하였다.
도 12에 나타난 바와 같이, HER-2가 과다 발현하는 MDA-MB-453 세포에서는 DM1-HER2 압타머 접합체 NP의 IC50 값은 2.7 μg/mL로 나타나서 비교군으로 사용한 DM1의 IC50 값인 1.8 μg/mL과 비교시에 유사한 세포독성을 나타내었다.
HER-2 negative MCF-7에서는 DM1의 IC50 값이 1.8 μg/mL인 반면, DM1-HER2 압타머 접합체 NP의 IC50 값은 측정할 수 없었다. 이러한 세포독성 결과는 약물 전달체가 HER-2가 과다 발현하는 MDA-MB-453에만 선택적으로 DM1을 전달하여 세포사멸을 유도한다는 것을 나타낸다. 평균 ± 표준편차 (n = 5).
이를 통하여 DM1-HER2 압타머 접합체 NP는 HER-2-positive 유방암 세포의 HER-2를 인식하며, 내포작용(Endocytosis)을 통하여 DM1이 세포 내부로 유리되어 강력한 독성작용과 함께 암세포사멸을 유도함을 검증하였다.
상기 결과는 DM1 단독 처리군은 모든 유방암 세포주에 독성 반응을 나타내었으나, DM1-HER2 압타머 접합체 NP는 오직 HER-2가 과다 발현된 유방암 세포에서만 HER-2 수용체를 인지하여 세포내로 유입된 후, 유리된 DM1이 암세포사멸을 유도한다는 것을 다시 한번 확인하였다.
실시예 7. 유방암 질환 동물 모델에서 입자의 항암 효과 확인
면역결핍된 6주령의 암컷 BALB/c 누드 마우스에 HER-2가 과다발현 되어있는 유방암 세포주 MDA-MB-453(3×106 cells)을 이식한 후, 10일부터 주 3회 DM1(0.1, 0.5, 2.5 mg/kg), DM1-HER2 압타머 접합체 NP(0.5mg/kg)를 근육 내 투여하였다. 이후, 28일 동안 종양 부피(tumor volume)를 측정하여 그 결과를 도 13에 나타내었고, 28일간 마우스의 체중을 측정하여 그 결과를 도 14에 나타내었다. 종양부피(V)는 caliper의 의해 측정되고, V=(length×width2)/2의 식을 이용하여 계산하였다.
도 13을 보면, 0.5 mg/kg의 DM1-HER2 압타머 접합체 NP 투여군은 종양의 성장을 유의하게 감소시켰을 뿐만 아니라, DM1 단독 투여군에서는 0.1 mg/kg 투여군에서 종양의 성장을 억제하는 것을 확인하였고, 0.5와 2.5 mg/kg 투여군은 모두 사망하였다. 또한, 도 14을 보면, 대조군과 비교하여 생존한 모든 실험군에서 약물 투여에 따른 체중 변화가 관찰되지 않음을 확인하였다. 이를 통해, 동물모델에서 DM1-HER2 압타머 접합체 NP은 HER2가 과다 발현하는 유방암에 대해 항암 효과를 가지고 마우스에 부작용이 상대적으로 작을 가능성을 암시하고 있음을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (16)

  1. 압타머(aptamer)와 활성제가 연결된 접합체가 중합체성 매트릭스 내로 캡슐화된 입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 서열번호 2로 표시되는 HER2(Human epidermal growth factor receptor 2) 압타머 또는 서열번호 4로 표시되는 EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule) 압타머인 것을 특징으로 하는 입자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 활성제는 dFdCTP 또는 DM1(mertansine)인 것을 특징으로 하는 입자.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 dFdCTP는 상기 압타머 서열에 통합되는 것을 특징으로 하는 입자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 압타머와 활성제 사이에 상기 활성제에 결합할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 입자.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 활성제는 독소루비신(Doxorubicin)이고, 상기 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 서열번호 5로 표시되는 것을 특징으로 하는 입자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 업합체에는 트레할로오스(trehalose), 키토산-글리콜라이드, 콘드로이친 설페이트 또는 이의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가하는 것을 특징으로 하는 입자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 중합체성 매트릭스는 소수성 중합체, 친수성 중합체, 및 이들의 공중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 중합체를 포함하는 입자.
  9. 제1항에 있어서, 상기 중합체성 매트릭스는 폴리하이드록시산, 폴리하이드록시알카노에이트, 올리카프로락톤, 폴리(오르토에스테르), 폴리무수물, 폴리(포스파젠), 폴리(락티드-co-카프로락톤), 폴리카보네이트, 폴리에스테르아미드, 폴리에스테르, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀성 알콜), 폴리비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(하이드록시산), 폴리(비닐 알콜), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(락트산-co-글리콜산), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌글리콜), 및 이들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 입자.
  10. 제1항에 있어서, 상기 중합체 매트릭스는 특정 세포/조직에 특이적 결합을 하는 리간드가 연결되는 것을 특징으로 하는 입자.
  11. 제10항에 있어서, 상기 리간드는 서열번호 4로 표시되는 EpCAM 압타머인 것을 특징으로 하는 입자.
  12. 제1항에 있어서, 상기 접합체는 상기 입자의 총 중량을 기준으로 하여, 0.1% 내지 10 % (w/w)의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 입자.
  13. 제1항에 있어서, 상기 입자는 미립자(micro particles) 또는 나노입자(nano particles)인 것을 특징으로 하는 입자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 입자를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 암은 HER2 또는 EpCAM 과발현에 의한 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. (a) 압타머와 활성제가 연결된 접합체를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 접합체를 중합체성 매트릭스 내로 캡슐화하는 단계;
    를 포함하는 입자의 제조방법.
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