KR20100110458A

KR20100110458A - 압타머 표적화 복합체

Info

Publication number: KR20100110458A
Application number: KR1020090028789A
Authority: KR
Inventors: 김성천
Original assignee: 김성천
Priority date: 2009-04-03
Filing date: 2009-04-03
Publication date: 2010-10-13
Also published as: KR101893011B1

Abstract

본 발명에 따라, 압타머에 위치하는 반응성 그룹 N에, 링커 없이, 하나 이상의 화학적 제제 및/또는 하나 이상의 생물학적 제제가 결합된 것을 특징으로 하는 압타머 표적화 복합체가 제공된다. 본 발명의 복합체는 상기 압타머와 상기 표적화제를 목적에 맞게 다양하게 선택 및 변형시킬 수 있고, 표적과의 특이적으로 결합을 통해 상기 표적화제가 가지는 고유의 효능을 더욱 향상시킨다. 바람직하게 본 발명의 압타머 표적화 복합체에서 상기 압타머는 반응성 그룹 N, 단일가닥핵산 Y 및 표적분자 인지부의 C의 N-Y-C로 구성된다.

Description

압타머 표적화 복합체{Targetable Complexes Using Aptamer}

본 발명은 압타머를 이용한 압타머 표적화 복합체 및 그 다양한 용도에 관한 것이다.

종래의 개발된 각종 '화학적 제제'와 '생물학적 제제'는 그 높은 독성으로 인하여 치료요법에 있어 종종 그 적용이 제한되며, 그러한 화학적 제제 또는 생물학적 제제의 치료율을 향상시키기 위하여 다양한 연구가 진행되어 왔다.

관련 연구 중 하나는 화학적 제제 또는 생물학적 제제를 항체와 같은 리간드와 결합시키는 것이며, 이 경우 항체는 더 많은 화학적 제제 또는 생물학적 제제가 이들을 생체 내에서 가장 필요로 하는 장소를 찾아낼 수 있도록 화학적 제제 또는 생물학적 제제의 분포를 변화시키는 작용을 한다.

소분자량의 화학적 제제 또는 생물학적 제제의 향상된 표적화는, 화학적 제제 또는 생물학적 제제를 분자량이 큰 복합체로 형성함으로써 달성되어 왔다. 예를 들면, 항체와 제제(화학적 제제 또는 생물학적 제제)를 링커를 이용하여 표적화 복합체를 형성하여 목적을 달성하고 있다(Ravi V. J. C., Acc. Chem. Res., 2008; 41 (1), 98-107). 이런 항체 표적화 복합체는 투여된 환자의 혈류 중으로 순환하고, 순환하는 복합체는 환자 내의 타깃이 되는 표적분자에 의해 인지되고 결합된다.

또한, 소분자량의 화학적 제제 또는 생물학적 제제의 특이적 전달을 위한 더욱 간단한 접근법으로 압타머(aptamer)의 특성만을 이용한 기술을 활용하고 있다.

SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)로, 높은 친화성과 특이성(specificity)으로 다양한 단백질에 결합할 수 있는 단일가닥핵산(이를 통상 압타머라고 한다)이 확인될 수 있다(Tuerk C. and Gold L.; Science, 1990; 249, 505-510).

소분자량의 화학적 제제 또는 생물학적 제제를 특정 세포-표면 수용체 및 결과로써 특이적 세포 유형으로 표적시키는 압타머의 구조적 잠재력을 이용하여 효과적인 전달방법들이 개발되고 있다.

최근에, 제안된 압타머를 이용한 표적화 복합체 전달방법으로서는, 소분자량의 화학적 제제 또는 생물학적 제제와 압타머를 '선형 링커'를 이용하여 압타머 표적화 복합체를 합성하는 방법(Hung et al., Chembiochem. 2009;10(5), 862-868), 압타머에서 이중가닥으로 구성된 부위에 약제(화학적 제제 또는 생물학적 제제)를 끼어 넣는 방법(Bagalkot et. al., Angew Chem Int Ed Engl. 2006;45(48), 8149-52), 및 siRNA-압타머 키메라(McNamara et al., Nat Biotechnol. 2006;24(8), 1005-15) 등이 있다.

본 발명의 목적은 링커를 사용하지 아니하는 압타머를 이용한 압타머 표적화 복합체, 그 수용체에의 전달방법 및 그 이를 이용한 다양한 용도를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명에 따라, 압타머 표적화 복합체가 제공된다.

본 발명에 따른 압타머 표적화 복합체는, 압타머에 위치하는 반응성 그룹 N에, 링커 없이, 하나 이상의 화학적 제제 및/또는 하나 이상의 생물학적 제제가 결합되어 있다.

바람직하게, 상기 화학적 제제와 상기 생물학적 제제는, 표적에 대한 결합 능력을 보유하거나 생물학적 활성을 나타내도록 결합되어 있다.

바람직하게, 상기 반응성 그룹 N이 아미노그룹, 카르복실그룹, 치올그룹, 알킬, 알케닐, 알키닐, 옥소알킬, 옥소알케닐, 옥소알키닐, 아미노알킬, 아미노알케닐, 아미노알키닐, 설포알킬, 설포알케닐, 설포알키닐 그룹, 포스포알킬, 포스포알케닐, 및 포스포알키닐 중에서 선택된 하나 이상의 그룹을 포함한다.

바람직하게, 하나 이상의 상기 생물학적 제제 중 적어도 하나는 치료용 약제이다.

바람직하게, 상기 화학적 제제 및 상기 생물학적 제제 중 적어도 하나는 생체분자에 특이적이다.

바람직하게, 상기 생체분자가 세포 표면 발현되거나 입자 표면 발현된 리간드 또는 수용체이다.

바람직하게, 상기 압타머와 상기 화학적 제제 및 상기 생물학적 제제의 결합 은 불안정성 결합이고, 상기 불안정성 결합은 pH 민감성 결합, 또는 방사선에 의한 분해에 대한 감수성 결합이다.

본 발명에 따라, 링커 없이 화학적 제제 또는 생물학적 제제를 압타머의 반응성 그룹 N에 결합시키는 단계를 포함하고, 상기 결합이 상기 화학적 제제 또는 생물학적 제제의 적어도 하나의 생물학적 특징을 변화시키는 것을 특징으로 하는, 상기 화학적 제제 또는 상기 생물학적 제제의 적어도 하나의 생물학적 특징을 변화시키는 방법이 제공된다.

본 발명에 따라, 표적분자에 특이적이고 질환 또는 상태에 대해 효과적인 생물학적 활성을 가지는 치료적 유효량의 상기 압타머 표적화 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 표적분자를 발현하는 세포, 조직 또는 유체를 포함하는 개체 내 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위한 약제가 제공된다.

바람직하게, 상기 약제에서 상기 생물학적 제제는 사이토카인, 독소, 약제, 핵산 또는 동위 원소이다.

바람직하게, 상기 역제에서 상기 질환 또는 상태가 감염이고, 상기 표적분자가 미생물체 또는 바이러스에 의해 발현되는 것이다.

본 발명에 따라, 미생물 세포 또는 바이러스 입자상의 수용체에 특이적인 화학적 제제 또는 생물학적 제제를 포함하는 상기 압타머 표적화 복합체를 상기 수용체의 표면에 접촉함으로써 상기 표면상에 존재하는 상기 미생물 세포 또는 상기 바이러스 입자의 감염력을 감소시키는 약제가 제공된다.

본 발명에 따라, (A) 압타머에 위치하는 반응성 그룹 N에, 링커 없이 결합 된, 하나 이상의 화학적 제제 및/또는 하나 이상의 생물학적 제제를 포함하고, 하나 이상의 상기 화학적 제제 및/또는 상기 생물학적 제제가 세포 수용체에 결합하여 내재화를 매개하고, 세포내에서 활성인 약제를 포함하는 압타머 표적화 복합체를 제조하는 단계; 및 (B) 상기 수용체 발현 세포를 상기 압타머 표적화 복합체와 접촉시키는 단계; 를 포함하며, 상기 접촉에 의해 상기 압타머 표적화 복합체의 내재화 및 상기 약제의 세포내 전달이 일어나도록 하는 것을 특징으로 하는, 세포내 활성인 약제의 세포내 전달을 매개하는 방법이 제공된다.

바람직하게 상기 약제 전달 매개 방법에서, 상기 약제는 상기 약제가 세포내 구획과 접촉할 경우 활성이 되는 프로드러그이다.

바람직하게, 상기 약제 전달 매개 방법에서, 상기 압타머 표적화 복합체는 내재화된 상기 압타머 표적화 복합체를 특정의 세포내 구획으로 지시하기 위한 트래피킹 시그널을 추가로 포함한다.

바람직하게, 상기 약제 전달 매개 방법에서, 2개 이상의 상기 화학적 제제 및/또는 2개 이상의 상기 생물학적 제제가 상기 압타머의 상기 반응성 그룹 N에 결합되고, 상기 압타머 표적화 복합체와 상기 세포 수용체 간의 결합 활성을 증가시킴으로써, 수용체 매개 내재화와 약제 전달을 증가시킨다.

본 발명에 따라, (A) 하나 이상의 화학적 제제 및/또는 하나 이상의 생물학적 제제가 자체의 반응성 그룹을 통해, 인지부위 C를 갖고 있는 압타머에 링커 없이 결합된 압타머 표적화 복합체를 제조하는 단계; (B) 상기 압타머의 단일가닥핵산의 화학적 특징을 변형시키는 단계; 및 (C) 상기 압타머 표적화 복합체의 물리적 또는 생물학적 성질의 변형 여부를 측정하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 압타머 표적화 복합체의 물리적 또는 생물학적 성질의 변형 방법이 제공된다.

바람직하게, 상기 물리적 또는 상기 생물학적 성질이 약동학, 약력학, 면역원성, 결합 친화성, 분해 감수성, 용해도, 친지성, 친수성, 소수성, 안정성 및 강도 중에 선택되는 적어도 하나이다.

본 발명에 따라, 검출성 표지물이 결합된 제1항 내지 제7항 중에 어느 한 항에 따른 상기 압타머 표적화 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 압타머 표적화 복합체는 생체 내에서 상기 압타머의 반응성 그룹 N과 비-공유적으로 결합하며, 상기 압타머 표적화 복합체는 세포 또는 조직 중의 표적에 특이적인 것을 특징으로 하는, 표적분자를 발현하는 개체 내 세포 또는 조직을 이미지화하는 방법이 제공된다.

본 발명에 따라, 그 자신은 세포막을 통과하지 않는 압타머의 반응성 그룹 N을 링커 없이 화학적 제제 및/또는 생물학적 제제와 결합시킴으로써 압타머 표적화 화합물을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 압타머, 상기 화학적 제제 또는 상기 생물학적 제제의 결합이 상기 제제의 세포막 통과 능력을 감소시키거나 억제시키는 것을 특징으로 하는, 세포 침투성 상기 화학적 제제 또는 상기 생물학적 제제의 세포막 통과 능력을 억제하거나 감소시키는 방법이 제공된다.

이상에서의 본 발명에 따른 압타머 표적화 복합체는, 압타머에 위치하는 반응성 그룹 N에 결합된 하나 이상의 화학적 제제 및/또는 생물학적 제제(이하, 양자 모두를 포함하는 의미로 '표적화제'라 한다)를 포함한다.

본 발명에서 사용되는 '표적화제'란 예를 들면, 세포, 조직(예를 들면, 세포외 매트릭스), 유체, 유기체, 또는 이들의 서브세트에 위치한 표적분자의 표적 잔기를 인지하고, 이에 결합하거나 부착되는 화학적 및/또는 생물학적 잔기를 말한다.

본 발명의 압타머 표적화 복합체는, 링커를 사용하지 않고 유도하는 가역적 혹은 비가역적인 공유 또는 비공유 결합이 바람직하게 사용된다.

본 발명의 압타머 표적화 복합체의 압타머 특이성은, 주위 환경에 따라, 표적화제와의 공유 결합 뒤에 변형되거나 제거될 수도 있다.

본 발명의 압타머 표적화 복합체는, 일부 예에 있어서는, 공유 결합전 압타머의 표적 결합 특이성이 공유 결합 후에도 실질적으로 보유될 수 있다.

본 발명의 압타머 표적화 복합체는 자체 성분 이상의 다양한 이점을 제공한다. 예를 들면, 본 발명에 따른 복합체의 압타머 부분은 보편적으로 생체 내에서 비교적 크기가 작은 표적화제의 반감기를 연장시킬 수 있다.

본 발명에 따른 압타머 표적화 복합체는, 특정 화학적 제제 또는 생물학적 제제의 생물학적 효능이나 다른 생물학적 특징도 상기 복합체의 압타머 부분에 의해 제공되는 생물학적 제제 기능의 부가에 의하여 변형시킬 수 있다.

본 발명의 압타머 표적화 복합체를 적용하면, 압타머와의 결합에 의해 부여된 증가된 크기를 통해 상기 표적화제로 하여금 새로운 역량으로 기능할 수 있게 한다.

본 발명에 따른 압타머 표적화 복합체는, 압타머의 반응성 그룹 N과 표적화 제에 존재하는 반응성 그룹을 결합시킴으로써 제조된다.

이런 반응성 그룹들 간의 결합은, 반응성 아미노그룹 혹은 치올그룹, 카르복실그룹에 의해 수행될 수 있다.

상기 반응성 그룹은 케톤, 디케톤, 베타 락탐, 석신이미드 활성 에스테르, 할로케톤, 락톤, 무수물, 에폭사이드, 알데하이드, 할라이드, 설포네이트, 포스포네이트, 구아니딘, 아미딘, 이민, 엔아민, 케탈, 아세탈 또는 말레이미드 등이다.

본 발명의 압타머 표적화 복합체는, 압타머의 하나 이상의 화학적 특징을 변형시킴으로써 해당 복합체의 하나 이상의 물리적 또는 생물학적 성질을 변형시킬 수 있다. 이 경우, 변형되는 물리적 또는 생물학적 성질에는 약동학, 약력학, 표적분자에 대한 결합성질, 결합 친화성, 분해 감수성, 용해도, 친지성, 친수성, 소수성, 안정성 및 강도 등이 포함된다.

본 발명에 따른 압타머 표적화 복합체에서 상기 표적화제의 생물학적 활성은 세포, 세포외 매트릭스 생체분자 또는 개체의 유체 생체분자에 전달할 수 있다. 그 전달방법으로서는, 생물학적으로 활성이고 세포, 세포외 매트릭스 생체분자 또는 유체 생체분자에 특이적인 본 발명의 압타머 표적화 복합체를 개체에 투여하는 것으로 달성된다.

본 발명에 따른 압타머 표적화 복합체의 치료적 유효량을, 질환이나 상태가 표적분자를 발현하는 세포, 조직 또는 유체를 포함하는 개체에 투여함으로써, 개체의 질환 또는 증상의 치료 또는 예방할 수 있다.

본 발명의 압타머 표적화 복합체는, 타깃이 되는 표적분자에 특이적이며, 상 기 복합체 또는 그 압타머는 질환이나 증상에 대해 효과적인 생물학적 활성을 가진다.

본 발명에 따른 압타머 표적화 복합체는, 세포 또는 세포외 매트릭스가 표적분자를 발현하는 개체에서 세포 또는 세포외 매트릭스를 이미지화 하는 것에 사용되며, 이런 이미지화는 본 발명의 압타머 표적화 복합체는 검출성 표지물에 결합한 상태로 개체에 투여하는 것으로 달성되며, 상기 표지물은 본 발명의 압타머 표적화 복합체에서 화학적 제제 및/또는 생물학적 제제에 결합될 수 있다.

본 발명의 압타머 표적화 복합체는, 표면상에 존재하는 미생물 세포 또는 바이러스 입자의 감염력을 감소시키는 것에 이용되며, 상기 감염력 감소는 유효량의 본 발명의 압타머 표적화 복합체를 상기 표면과 접촉하는 것에 의해 달성되며, 여기에서 본 발명의 복합체는 상기 미생물 세포 또는 바이러스 입자상의 수용체에 특이적인 표적화제를 포함한다.

본 발명의 압타머 표적화 복합체는, 세포내에서 활성인 약제(표적화제)의 세포내 전달을 매개하는 것에 이용된다. 여기에서, 본 발명의 압타머 표적화 복합체는 압타머의 반응성 그룹 N에 링커가 없이 결합된 하나 이상의 약학적으로 유효한 표적화제(화학적 제제 및/또는 생물학적 제제)를 포함한다.

본 발명의 복합체에 결합된 표적화제는, 압타머에 의해 세포 수용체에 결합하여 해당 제제의 내재화를 매개한다.

본 발명의 압타머 표적화 복합체에서 상기 표적화제는 세포 내에서 약학적으로 활성인 약제이다. 세포내 약제 전달은 수용체를 발현하는 세포가 본 발명의 압 타머 표적화 복합체와 접촉될 때 일어난다. 이러한 접촉에 따라 표적화제의 내재화 및 상기 약제의 세포내 전달이 일어나게 된다. 일부 예에서, 세포 내에서 활성인 약제는 상기 약제가 세포내 구획과 접촉할 때 활성을 띠게 되는 프로드러그이다.

본 발명의 압타머 표적화 복합체는 특정 세포내 구획으로 지시하는 세포내 트래핑킹(trafficking) 시그널을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 압타머 표적화 복합체는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 또는 약제로서 제공될 수 있다.

본 발명의 압타머 표적화제 복합체에 포함된 하나 이상의 표적화제는, 표적화제 중 적어도 하나는 자신의 표적과 결합할 수 있도록 상기 압타머에 결합된다(도1 참조). 이는 표적에 대한 결합 특이성을 발휘하는 방식으로 표적화제를 결합시키고, 압타머에 의한 입체적 방해 없이 자신의 표적과 결합할 수 있도록 표적화제를 압타머의 인지부위로부터 충분히 이격시킴으로써 달성될 수 있다. 이는 앞서 설명한 적당한 반응성 그룹 및 결합 전략을 이용함으로써 달성될 수 있다.

널리 알려진 바와 같이, 단일가닥핵산인 압타머는 단백질을 포함하는 표적분자에 대하여 하나의 리간드(ligand)로서 작용하는 바, 다양한 염기순서로 배열된 단일가닥핵산이 조합된 라이브러리로부터 일정한 선별과정과 염기서열결정을 통하여 높은 결합력과 특이성으로 표적분자와 결합하는 단일가닥핵산들을 선별할 수 있다.

압타머의 표적분자는 유기물, 무기물, 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 등을 포함하여 임의 유형의 분자일 수 있다.

표적분자는 단백질, 탄수화물, 지질 또는 핵산 같은 생체분자일 수 있다.

표적분자는 세포(세포 표면 발현), 또는 바이러스와 같은 기타 입자('입자 표면 발현')와 결합될 수 있거나, 세포외일 수 있다.

세포 또는 입자와 결합될 경우, 표적분자는 본 발명의 압타머 표적화 복합체의 표적화제가 체액 상으로 부터의 표면 수용체와 접촉하도록 하는 방식으로 세포 또는 입자의 표면상에서 발현된다.

바람직하게, 표적분자는 주로 또는 배타적으로 병증 또는 질병에 걸린 세포, 조직 또는 체액과 결합된다. 따라서, 본 발명의 압타머 표적화 복합체의 표적화제는 세포, 세포외 매트릭스 생체분자 또는 유체 생체분자를 표적화 함으로써 상기 복합체를 질병에 걸린 조직으로 전달하는 데 사용될 수 있다.

압타머에 대한 표적분자는 미생물 세포의 표면상에 또는 바이러스 입자의 표면상에 발현된다. 세포 표면에 발현되거나 입자 발현된 감염체에 결합할 수 있는 본 발명의 압타머 표적화 복합체는, 체내 또는 개체의 표면(예를 들면, 피부) 상에서 미생물체를 표적화 함으로써 그 자체로 항-미생물제로서 사용될 수 있다. 개체 표면의 경우에, 본 발명 복합체는 국소 적용될 수 있다.

미생물계 표적분자에 특이적인 본 발명의 압타머 표적화 복합체는 또한 체내에서서 항-미생물제로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 복합체에 의하면, 표면상에 존재하는 미생물 세포 또는 바이러스 입자의 감염력을 감소시키는 용도에 적용될 수 있다. 이때 미생물 세포 또는 바이러스 입자의 표면을 유효량의 본 발명 복합체와 접촉시킬 수 있다. 그러한 방법에서의 본 발명의 복합체는 미생물 세포 또는 바이러스 입자상의 수용체에 특이적인 표적화제를 포함한다.

본 발명에 따른 복합체의 표적분자로서는 전립선암, 유방암 및 골 전이를 포함한 각종 질병 상태에 연루된 세린 프로테아제인 전립선 특이성 표적분자(PSA)이다. PSA의 활성 부위에 결합하는 PSA의 특이성 억제제가 공지되어 있다(참고문헌: Adlington et al., J. Med. Chem., 2001; 44, 1491-1508).

본 발명의 압타머 표적화 복합체를 구성하는 압타머의 일반적 형태는 도1 및 도2와 같다. 도1에서 'FG'는 반응성을 가지는 부분을 의미한다.

도2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 복합체에서 표적화제를 제외한 단일가닥핵산인 압타머는 N-Y-C로 구성된다(N은 반응성 그룹, Y는 단일가닥핵산, C는 표적분자의 인지부위).

인지부위C는 표적분자를 인지하여 결합하는 부위이고, 표적분자마다 그 표적분자에 특이적으로 결합하는 특정한 염기서열로 구성된다. 인지부위 C와 표적분자는 이온 결합, 소수성 결합, 반데르발스 결합, 및 수소 결합을 포함한 각종 분자력을 통해 상호 간에 상호작용하는 분자들의 결합쌍을 형성한다.

단일가닥핵산 Y는 전체 압타머에서 인지부위 C를 제외한 부위로서 임의적 서열로 존재하며 압타머의 인지부위 C와 반응성 그룹 N사이에 위치한다. 단일가닥핵산 Y는 기본적으로 1 내지 20개 염기의 선형이지만, 더 긴 핵산가닥을 사용할 수도 있다.

하나 이상의 표적화제가 반응성 그룹 N을 통해 단일가닥핵산 Y에 연결될 수 있다. 분지형 단일가닥핵산 Y가 사용되는 예에서, 표적화제의 일부는 분지된 핵산 가닥의 상이한 가지에 있는 반응성 그룹 N에 연결될 수 있다.

인지부위 C에 바로 반응성 그룹 N이 연결될 경우, 단일가닥핵산 Y는 필수적인 요소는 아니지만, 이상적으로 표적화제가 그의 표적분자에 결합할 수 있도록 표적화제와 압타머의 인지부위 C 사이에 충분한 거리를 제공하기에 적합하게 단일가닥핵산 Y를 적용하는 것이 바람직하다. 상기 거리는 예를 들면 압타머 결합부위의 최외측 표면으로부터 결합 부위까지의 거리, 및 표적화제의 성질을 포함한 몇 가지 인자에 따라 달라진다.

일반적으로 링커는 길이가 약 5 내지 10옹스트롬(0.5 내지 1㎚), 바람직하게는 10옹스트롬(1.0㎚) 이상이지만, 결합 부위의 최외측 부분과 매우 가깝고(거나) 표적화제(또는 생물학적 제제)가 링커 부분으로서 기능할 수 있는 절편을 포함하는 경우에는 길이가 약 3옹스트롬(0.3㎚) 정도로 더 짧아도 충분할 수 있다.

단일가닥핵산 Y의 길이는 선형 염기수에 의해서도 관찰될 수 있다. 이 측정을 통한 단일가닥핵산 Y의 길이는 일반적으로 약 1 내지 20개 염기, 적어도 2개 이상의 염기의 선형 신장물을 갖는 단일가닥핵산이면 충분하다.

단일가닥핵산 Y에 대한 기타의 고려 사항은, 본 발명의 복합체 전체 또는 표적화제의 물리적 또는 약동학적 특성에 미치는 특성, 용해도, 친지성, 친수성, 소수성, 안정성(안정한 것뿐만 아니라 계획된 분해), 강도, 유연성, 면역원성, 압타머 결합의 조절, 표적화제와의 화학적 혼화성, 미셀 또는 리포좀 내로의 혼입 능력 등이다.

반 발명에서의 압타머는 표적화제의 적합한 화학 잔기와 공유 반응을 일으키 는 하나 이상의 반응성 그룹 N을 포함하도록 압타머를 합성함으로써 제조할 수 있다.

표적화제는 반응성 그룹 N과 반응하기 위한 적합한 잔기를 제공하도록 변형될 필요가 있을 수 있다. 압타머의 반응성 그룹 N이 표적화제와 공유 결합을 형성하는 조건하에서, 압타머와 표적화제가 결합된다.

압타머의 반응성 그룹 N은 표적화제의 반응성 그룹과 선택적으로 커플링하기에 적합한 임의의 친핵성 또는 친전자성 그룹을 포함하며, 바람직한 반응성 그룹 N은 아미노그룹, 카르복실그룹, 치올그룹 등을 포함한다.

압타머의 반응성 그룹 N은 반응성 친핵성 그룹인 디케톤, 아실 베타-락탐, 활성 에스테르, 할로케톤, 사이클로헥실 디케톤 그룹, 알데하이드 또는 말레이미드를 형성하기 위해 배열되는 하나 이상의 C=O 그룹을 포함한다. 다른 그룹은 락톤, 무수물, 및 알파-할로아세트아미드 또는 에폭사이드 및 기타의 공지된 친전자성 그룹이 포함된다.

압타머의 표적인자 인지부위 C의 표적분자에 대한 결합의 실질적 감소는, 표적분자가 압타머 결합 부위와 접촉하는 것을 입체적으로 방해하는 표적화제에 의해 유발될 수 있다.

또한, 공유 결합에 의해 변형된 압타머의 반응성 그룹 N이 표적분자와의 결합에 중요할 경우에 표적분자와의 결합의 실질적 감소가 발생할 수 있다.

표적분자가 압타머의 결합 부위(인지부위 C)와 접촉하는 것을 표적화제가 입체적으로 방해하지 않고 공유 결합에 의해 변형된 압타머의 반응성 그룹 N이 표적 분자와의 결합에 중요할 경우에 표적분자에 대한 실질적으로 증가된 압타머 결합이 일어날 수 있다.

본 발명의 복합체의 제조에 사용되는 압타머의 일반적 형태(C-Y-N)는 당해 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 전형적으로, 기능 성분이기도 한 압타머를 합성하고, 이어서, 압타머(이 경우 기능 성분이기도 함)에 반응성 그룹N을 유도시켜 압타머의 일반적 형태(C-Y-N)를 완성할 수 있으며, 해당 기술분야에 알려진 기술에 의해 사용된 특이적 합성 단계를 쉽게 행할 수 있다.

본 발명에 사용되는 표적화제와 그 표적분자는 결합쌍이 상호간에 특이적으로 결합하는 성질을 지니도록, 예를 들면, 이온 결합, 공유 결합, 소수성 결합, 반데르발스 결합, 및 수소 결합을 포함한 각종 분자력을 통해 상호 간에 상호작용하는 분자들의 결합쌍을 나타낸다. 상기 특이적 결합이란 결합쌍이 이들이 또 다른 분자에는 결합하지 않는 조건하에 상호간에 결합함을 의미한다. 결합쌍의 예로는 바이오틴-아비딘, 호르몬-수용체, 수용체-리간드, 효소-기질, IgG-단백질 A, 표적분자-압타머 등이 있다.

표적화제와 그에 대응하는 동류 표적분자는 상호간에 상당한 결합을 나타낸다. 이러한 결합은 당해 기술분야에 익히 공지된 방법에 따라 평형결합상수(또는 결합상수)를 측정함으로써 평가될 수 있다.

표적화제로는 약제, 단백질, 펩티드, 펩티드 모사체, 당단백질, 프로테오글리칸, 지질 당단백질, 인지질, 리포폴리사카라이드, 핵산, 프로테오글리칸, 탄수화물 등과 같이 5,000달톤 이하의 소분자 유기 복합체가 포함되지만 이에 한정되지 않는다.

표적화제는 항-신생물제를 포함하여 익히 공지된 치료 복합물질을 포함할 수 있다. 항-신생물 표적화제는 타그파클리탁셀, 다우노루비신, 독소루비신, 메이탠시노이드, 카미노마이신, 4'-에피아드리아마이신, 4-디메톡시-다우노마이신, 11-디옥시다우노루비신, 13-디옥시다우노루비신, 아드리아마이신-14-벤조에이트, 아드리아마이신-14-옥타노에이트, 아드리아마이신-14-나프탈렌아세테이트, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 미토마이신 C, N-메틸 미토마이신 C, 블레오마이신 A 2 , 디데아자테트라하이드로폴산, 아미노프테린, 메토트렉세이트, 콜키신 및 시스플라틴 등을 포함할 수 있다.

항-미생물제로는 젠타마이신을 포함한 아미노글리코사이드, 리팜피신, 3'-아지도-3'-데옥시티미딘(AZT) 및 아실로비어와 같은 항-바이러스 복합체, 플루코나졸을 포함한 아졸류와 같은 항진균제, 암포테리신 B 및 칸디시딘과 같은 플라이어(plyre) 마크로라이드, 안티모니얼과 같은 구충 복합체 등이 포함된다.

호르몬 표적화제로는 디프테리아 독소와 같은 독소류, CSF, GSF, GMCSF, TNF 같은 사이토카인류, 에리트로포이에틴, 면역조절제 또는 인터페론 또는 인터루킨과 같은 사이토카인류, 뉴로펩티드, HGH, FSH 또는 LH 같은 생식 호르몬, 갑상선 호르몬, 아세틸콜린 같은 신경전달물질 및 에스트로겐 수용체 같은 호르몬 수용체 등이 포함된다.

다만, 표적화제는 압타머 및 금속 킬레이트가 아니다. 바람직하게는, 표적화제는 본 발명의 복합체에 적용된 압타머에 비하여 소형 분자이다. 상기 압타머의 반응성 그룹 N에 결합시키는 데 필요한 결합 잔기를 포함하고 있는 표적화제는 바람직하게는 약 300달톤 이상의 크기이고, 바람직하게는 약 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, 1,200, 1,300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500 또는 5,000달톤 이상의 크기일 수 있으며, 더욱 큰 크기도 가능하다.

본 발명의 복합체에 적용되는 적당한 표적화제는 단백질(폴리펩티드) 또는 펩티드일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 펩티드 등의 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 아미노산의 인위적인 화학적 동족체인 아미노산 중합체도 포함하고, 또한 천연 아미노산 중합체도 포함된다.

아미노산은 펩티드의 결합 기능이 유지되는 한은 L 또는 D형으로 존재할 수 있다. 펩티드는 길이가 가변적일 수 있지만, 일반적으로는 약 4 내지 200개 아미노산 길이이다. 펩티드는 펩티드 내의 2개의 비-인접 아미노산 간의 분자내 결합, 예를 들면, 주쇄-주쇄, 측쇄-주쇄 및 측쇄-측쇄 폐환을 갖는 사이클릭 형태일 수 있다. 사이클릭 펩티드는 당해 기술분야에 익히 공지된 방법으로 제조될 수 있다(미국 특허 제6,013,625호 참조).

표적분자에 대한 결합 활성을 보이는 단백질 또는 펩티드 표적화제는 당해 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들면, 이런 표적화제는 바이러스 펩티드 세포 융합 억제제일 수 있다. 이러한 것들에는 HIV 감염 세포 상의 융합 수용체를 표적화하는 T-20 HIV-1 gp41 융합 억제제(T-20에 대해서는, 미국 특허 제6,281,331호 및 제6,015,881호; Nagashima et al., J. Infectious Diseases (2001) 183.1121. ; 기 타 HIV 억제제에 대해서는, 미국특허 제6020459호 및 WO 제0151673A2호), RSV 세포 융합 억제제(WO 제0164013A2호 및 McKimm-Breschkin, Curr. Opin. Invest. Drugs (2000) 1:425-427(VP-14637)), 뉴모바이러스 속 세포 융합 억제제(WO 제9938508A1호) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에 적용되는 표적화제는 또한 각종 난소암, 유방암, 폐의 전립선 소세포암, 직결장암, 위암 및 췌장암의 표적화에 사용될 수 있는, LHRH, 봄베신/가스트린 방출 펩티드, 소마타스타틴(예를 들면, RC-121 옥타펩티드) 등과 같은 펩티드 호르몬 또는 펩티드 호르몬 동족체를 포함한다(Schally et al., Eur. J. Endocrinology, (1999) 141:1-14).

상기 표적화제는 표적분자에의 결합 능력 외에도, 하나 이상의 생물학적 활성을 보유할 수 있으며, 각각의 활성은 세포 기관 또는 유기체의 기능 발휘에 미치는 검출 가능한 생물학적 영향으로서 특징 지워진다.

본 발명의 압타머 표적화 복합체는 그 복합체와 연관된 하나 이상의 생물학적 활성을 지닐 수 있다. 생물학적 활성은 본 발명에 적용된 표적화제로서의 화학적 제제의 고유 특징일 수 있거나, 표적화제로서 결합한 생물학적 제제에 의하여 제공될 수도 있다. 표적화제일 수 있는 생물학적 제제는 본 발명의 복합체의 기타 분자 또는 부분과 공유 또는 비-공유 결합될 수 있지만, 공유 결합이 바람직하다.

따라서 본 발명의 압타머 표적화 복합체는 고유한 생물학적 활성을 보유하는 표적화제 형태로 기능성 성분을 포함할 수 있고, 표적화제는 압타머 또는 압타머 단편의 결합 부위에 결합되며, 이때의 표적화제는 생물학적 활성을 보이는 기능성 성분이다.

다른 예에서, 본 발명의 압타머 표적화 복합체는 압타머의 반응성 그룹 N에 결합된 표적화제를 포함하고, 여기에 다른 결합을 통해 복합체에 부착되거나 결합되는 별도의 기능성 성분을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 복합체에서 상기 압타머는 하나 이상의 생물학적 제제와의 결합 뒤에도 적어도 약간의 표적분자와의 결합 특이성은 보유하는 것이 바람직하다. 하나 이상의 생물학적 제제가 압타머 반응성 그룹 N에 결합된 경우의 본 발명의 복합체는, 그러한 생물학적 제제가 압타머에 결합된 채로 생물학적으로 활성인 경우 결합된 생물학적 제제에 기인하여 생물학적 활성을 보일 수 있다. 이는 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 생물학적 제제 상의 위치에 압타머 반응성 그룹 N을 결합시키는 등의 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 또한, 생물학적 제제가 압타머에 의한 입체적 방해 없이 활성에 필요한 또 다른 분자에 결합할 수 있도록 생물학적 제제를 압타머로부터 떨어져 위치시킬 수 있다. 압타머의 반응성 그룹 N에 결합된 하나 이상의 생물학적 제제의 생물학적 활성을 얻기 위한 다른 방법들도 해당 기술분야에 알려져 있다.

두 개 이상의 화학적 제제 및/또는 두 개 이상의 생물학적 제제를 포함하는 본 발명의 복합체를 제조하는 방법은, 압타머의 일단의 반응성 그룹 N에 분지형 핵산가닥을 도입하여 가능할 것이다(Mickey S. U.., Bio/Technology (1994) 12, 926 - 928). 즉 분지형 핵산가닥의 각 반응성 그룹 N에 표적화제를 결합시킨 후 이를 압타머의 단일가닥핵산 Y에 결합시킴으로써 달성할 수 있다. 분지형 핵산가닥의 제 조방법에 대해서는 당해 기술분야에 알려져 있다.

본 발명의 압타머 표적화 복합체의 표적화제로 사용하기 위한 생물학적 제제 기능성 성분은 천연 또는 합성 성분일 수 있다. 생물학적 제제는 이의 천연 상태에서 생물학적으로 활성이거나, 생물학적으로 불활성이거나 잠복성 전구체 상태에 있다가 생물학적 제제의 일부가 가수분해, 절단 또는 변형될 때 생물학적 또는 치료 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 압타머 표적화 복합체를 사용하여 세포 표면 또는 세포내에 전달되어 거기에서 활성화될 수 있다. 이와 관련하여, 생물학적 제제는 '프로드러그'일 수 있으며, 이는 프로드러그 분자들이 이들 구조의 화학적 또는 효소적 변형에 의해 치료 활성 약제로 전환될 수 있음을 의미한다.

프로드러그의 적용에서, 부위-특이성 전달은 프로드러그의 조직-특이성 활성화로부터 달성될 수 있으며, 이러한 활성화는 다른 조직에 비해 특정 조직에 대한 고유한 또는 고농도로 존재하는 효소에 의한 대사 결과이며, 따라서 프로드러그를 더욱 효율적으로 활성화시킨다.

광역학적 치료는 감광성 링커를 절단하거나 또는 광반응성 효소를 활성화함으로써(아실 효소 가수분해) 프로드러그를 활성화시키는 데에 사용될 수 있다(미국 특허 제5,114,851호 및 제5,218,137호 참조). 광역학적 치료는 약물 활성을 원치 않는 부위(예: 비-표적 조직)에서 약물을 신속하게 불활성화시키는 데에도 사용될 수 있다. 프로드러그를 형성하기 위하여 약물을 공유적으로 변형시키는 다양한 수단이 당해 기술분야에 공지되어 있다.

표적화제로서의 생물학적 제제는 당해 기술분야에 익히 공지된 수단에 의하여 다른 표적화제 및/또는 압타머에 결합할 수 있다. 예를 들면, 펩티드 호르몬 표적화제와 독소루비신 간의 다양한 복합체가 알려져 있다(Kiaris et al., Eur. J. Cancer (2001) 37:620-62 8 and Schally et al. Eur. J. Endocrin. (1989) 141:1-14; Canevari et al., Ann Oncol (1994) 5(8):698-701; Rihova, Folia Microbiol (Praha) (1995) 40(4):367-84; Vitetta, Princess Takamatsu Symp (1988) 19:333-40; and Ghose et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst (1987) 3(4):263-359).

표적화제(화학적 제제 또는 생물학적 제제)는 특정 조건하에서 불안정성 결합을 이용하여 본 발명의 압타머 표적화 복합체에 결합시킬 수 있다. 불안정성 결합은 압타머와 표적화제 간에 이루어질 수 있다. 생물학적 제제의 생물학적 활성은 제제가 압타머 반응성 그룹 N으로부터 방출될 때까지 실현되지 않을 수도 있다. 이는 일부의 예에서 불안정성 결합을 통해 달성될 수 있다. 불안정성 결합은 가역성 공유 결합, pH 민감성 결합(산 또는 염기 민감성), 효소 민감성 결합, 분해 민감성 결합, 감광성결합 등 및 이들의 배합이 포함된다.

이러한 특징은 또한 불안정성 결합의 유형으로서 고려될 수 있는 프로드러그의 특징이다. 다양한 불안정성 결합이 이전에 고안되었다. 예를 들면, 프로드러그은 미국 특허 제5,498,729호에 기재된 바와 같이 가수분해에 의해 서서히 분해되는 카복실산 잔기를 지닌 복합체를 사용하여 형성시킬 수 있다. 불안정성 결합의 특정 디자인을 이용하여 생물학적 제제가 의도하는 표적에 도달한 후 방출되도록 지시할 수 있다.

예를 들면, 불완전성 결합은 특정의 세포내 구획 또는 본 발명의 압타머 표적화 복합체가 축적될 수 있는 세포외 구획에서의 방출을 지시하도록 디자인될 수 있다. 산-불안정성 결합은 수용체 매개 세포이입 중에 직면하는 엔도솜 및 라이소솜 같은 상이한 세포내 구획의 산성 환경을 이용할 수 있다(Shen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1981) 102:1048-1054; Yang et al., J. Natl. Canc. Inst. (1988) 80: 1154-1159).

특정의 표적화제는 이의 사용 맥락에 따라 생물학적 활성을 보유할 수도 있고 보유하지 않을 수도 있다. 예를 들면, DNA에 작용하는 치료용 약제 독소루비신은 이것이 압타머와 공유 결합되고 무세포 형태로 DNA에 적용될 때 이중가닥인 DNA에 대한 표적화제일 수 있다. 그러나, 독소루비신은 복합체가 세포에 의해 섭취될 수 없을 때까지 표적화제가 압타머에 공유 결합되어 있는 동안 세포에 관하여 표적화제로 고려되지 않도록 할 수 있다. 후자의 경우에, 독소루비신은 약제가 세포핵내의 DNA에 접근할 수 있으면 흡수 뒤에 생물학적 활성을 보유할 수도 있다.

생물학적 제제 기능성 성분으로는 소분자 약제(약 5,000달톤 이하의 약제학적 유기 복합체), 유기 분자, 단백질, 펩티드, 펩티드 모사체, 당단백질, 프로테오글리칸, 지질 당지질, 인지질, 리포폴리사카라이드, 핵산, 프로테오글리칸, 탄수화물 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.

생물학적 제제는 항신생물제, 항미생물제, 호르몬, 이펙터 등일 수 있다. 그러한 생물학적 제제로서는 항신생물제인 파클리탁셀, 다우노루비신, 독소루비신, 카미노마이신, 4'-에피아드리아마이신, 4-디메톡시-다우노마이신, 11-디옥시다우노 루비신, 13-디옥시다우노루비신, 아드리아마이신-14-벤조에이트, 아드리아마이신-14-옥타노에이트, 아드리아마이신-14-나프탈렌아세테이트, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 미토마이신 C, N-메틸 미토마이신 C, 블레오마이신 A 2 , 디데아자테트라하이드로폴산, 아미노프테린, 메토트렉세이트, 콜키신 및 시스플라틴 등과 같은 익히 공지된 치료 복합제가 포함된다.

생물학적 제제로서의 항-미생물제로는 젠타마이신을 포함한 아미노글리코사이드, 리팜피신, 3'-아지도-3'-디옥시티미딘(AZT) 및 아실로비어와 같은 항-바이러스 복합제, 플루코나졸을 포함한 아졸류와 같은 항진균제, 암포테리신 B 및 칸디시딘과 같은 플라이어 마크로라이드, 안티모니얼과 같은 구충 복합제 등이 포함된다.

생물학적 제제로서의 호르몬으로는 디프테리아 독소와 같은 독소류, CSF, GSF, GMCSF, TNF 같은 사이토카인류, 에리트로포이에틴, 면역조절제 또는 인터페론 또는 인터루킨과 같은 사이토카인류, 뉴로펩티드, HGH, FSH 또는 LH 같은 생식 호르몬, 갑상선 호르몬, 아세틸콜린 같은 신경전달물질 및 에스트로겐 수용체 같은 호르몬 수용체가 포함될 수 있다.

또한, 인도메타신, 살리실산 아세테이트, 이부프로펜, 설린닥, 피록시캄, 및 나프록센 같은 비-스테로이드성 소염제, 및 마취제 또는 진통제가 포함된다.

또한 본 발명에 따른 복합체에는 이미지화 및 치료요법에 유용한 것들과 같은 방사선 동위원소가 포함된다.

본 발명에서 표적화제의 반응성 그룹은 압타머의 반응성 그룹 N에 선택적으로 결합하기에 적합한 임의의 친핵성 또는 친전자성 그룹을 포함하거나 인위적으로 포함시킬 수 있다. 바람직한 반응성 그룹은 아미노그룹, 카르복실그룹, 치올그룹 등을 포함한다(도3 내지 도6 참조).

표적화제의 반응성 그룹은 반응성 친핵성 그룹인 디케톤, 아실 베타-락탐, 활성 에스테르, 할로케톤, 사이클로헥실 디케톤 그룹, 알데하이드 또는 말레이미드를 형성하기 위해 배열되는 하나 이상의 C=O 그룹을 포함한다. 다른 그룹은 락톤, 무수물, 및 알파-할로아세트아미드 또는 에폭사이드 및 기타의 공지된 친전자성 그룹이 포함된다. 또한, 압타머 한쪽의 티올 그룹에 선택적으로 커플링하기에 적합한 티올 선택성 말단을 가진 수용성, 중합체 유도체로 표적화제를 변형시킬 수 있다.

본 발명은 표적화제를 구성하는 화학적 제제 및/또는 생물학적 제제의 하나 이상의 물리적 또는 생물학적 특성을 변형시키는 방법을 포함한다. 이 방법은 표적화제를 상기와 같은 압타머의 반응성 그룹 N에 공유 결합시키는 것을 포함한다.

특정 예에서, 표적화제는 그 반응성 그룹을 통해 압타머 반응성 그룹 N에 결합되며, 이들의 특성은 앞서 기재한 바와 같다. 이 방법은 5Kd 이하의 소형 표적화제를 결합시키기에 특히 유용하다. 그러나 이 방법은 또한, 대형의 이러한 분자에도 작용한다.

표적화제의 특성에는 결합 친화성, 프로테아제에 의한 것과 같은 분해에 대한 감수성, 약동학, 약력학, 면역원성, 용해성, 친지성, 친수성, 소수성, 안정성(다소 안정할 뿐만 아니라 계획된 분해), 강도, 유연성, 압타머 결합의 조절 등을 포함할 수 있다 .

본 발명을 설명함에 있어서 '약동학'이란 시간 경과에 따라 혈청에 투여된 본 발명의 복합체의 농도를 의미하고, '약력학'이란 시간 경과에 따라 표적 및 비표적 조직에 투여된 본 발명의 복합체의 농도 및 표적 조직에 대한 효과(효능) 및 비표적 조직에 대한 효과(독성)를 나타낸다. 예를 들어, 약동학 및 약력학에서의 개선은 불안정한 결합을 사용하거나 압타머의 화학적 특성을 변형시킴(용해성, 전하 등의 변화)으로써, 특정 표적화제에 대해 고안될 수 있다.

본 발명의 압타머 표적화 복합체의 생물학적 특성을 변형시켜 개선된 약제학적 또는 다른 특성을 얻을 수 있다. 이는 표적화제 또는 압타머의 하나 이상의 화학적 특성을 변형시킴으로써 달성할 수 있다. 바람직한 예는 핵산가닥의 하나 이상의 화학적 특성을 화학적으로 변형시키는 것이다. 압타머를 포함하는 복합체의 화학적 특성을 변화시킴으로써, 본 발명자는 개선된 특징(예: 약동학, 약력학, 용해성, 면역원성 등의 개선)을 수득할 수 있다.

본 발명의 압타머 표적화 복합체는 또 다른 용도를 갖는다. 예를 들어, 복합체의 압타머 부분은 일반적으로 생체내에서 소형 표적화제의 반감기를 연장시킬 수 있다. 또한, 표적화제는 압타머와의 결합에 의해 제공된 증가된 크기를 통해, 표적화제가 달리는 그렇게 하지 못하는 상황에서 경쟁적 억제제로서 작용하게 할 수 있다. 따라서, 하나의 예에서, 본 발명은 표적화제의 유효 순환 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다.

다른 예에서, 본 발명은 압타머를 특이적 표적에 대해 재지시하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 질병 또는 상태가 표적분자를 발현시키는 세포, 조직 또는 체액과 관련된 개체에서 질병 또는 상태를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 이 방법은 환자에게, 치료학적 유효량의 본 발명의 복합체를 투여하는 것으로 이루어진다. 환자는 동물(예: 포유동물)일 수 있고, 특정 예에서는 사람이다.

본 발명은 또한, 환자의 체액 중의 세포, 조직(예: 세포외 매트릭스 생체분자) 또는 생체분자에 대해 생물학적 활성을 표적화하는 방법을 제공한다. 이 방법은 환자에게, 세포, 조직, 세포외 매트릭스 생체분자 또는 체액 생체분자에 특이적인 표적화제를 포함하는 본 발명의 복합체를 투여하는 것을 포함한다. 표적화제는 압타머가 아니다. 특정 예에서, 복합체는 생물학적 활성을 갖는 한편, 다른 예에서, 표적화제가 아닌 생물학적 활성 분자는 복합체의 성분으로서 포함된다.

본 발명의 복합체는 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 제형화하여 본 발명의 복합체를 포함하는 의약으로서 투여할 수 있다. 따라서, 복합체를 의약 또는 약제학적 조성물의 제조에 사용할 수 있다.

본 발명의 복합체를 포함한 약제학적 조성물은, 비경구 투여용 액제 또는 동결건조된 분말로서 제형화시킬 수 있다. 분말은, 사용하기 전에 적합한 희석제 또는 다른 약제학적으로 허용되는 담체를 부가하여 재구성할 수 있다. 액상 제형은 완충된, 등장성 수용액일 수 있다. 분말은 무수 형태로 분무할 수 있다. 적합한 희석제의 예는 표준 등장성 식염수 용액, 수중 표준 5% 덱스트로스, 또는 완충된 나트륨 또는 암모늄 아세테이트 용액이다. 이러한 제형은 비경구 투여에 특히 적합하지만, 또한 경구 투여에 사용하거나 흡입하기 위하여 계량된 용량 흡입기 또는 분무기에 함유될 수 있다. 부형제(예: 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 하이드록시 셀룰로 스, 아카시아, 폴리에틸렌 글리콜, 만니톨, 염화나트륨, 시트르산나트륨 등)를 부가하는 것이 바람직할 수 있다.

대안으로, 본 발명의 복합체는 경구 투여하기 위해서 캡슐, 정제 또는 에멀젼제 또는 시럽제로 제형화할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 고형 또는 액상 담체를 첨가하여 조성물을 개선시키거나 안정화시키거나 조성물의 제조를 용이하게 할 수 있다.

고형 담체는 전분, 락토스, 황산칼슘 이수화물, 백토, 마그네슘 스테아레이트 또는 스테아르산, 활석, 펙틴, 아카시아, 한천 또는 젤라틴을 포함한다. 액상 담체는 시럽, 땅콩유, 올리브유, 식염수 및 물을 포함한다. 담체는 또한, 서방성 물질(예: 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트)을 단독 또는 왁스와 함께 포함할 수 있다. 고형 담체의 양은 다양하지만, 바람직하게는 용량 단위당 약 20mg 내지 약 1g이다.

본 발명의 복합체를 포함한 약제학적 제제는 필요한 경우, 정제 형태를 위해 밀링, 혼합, 과립화 및 압축, 또는 경질 젤라틴 캡슐 형태를 위해 밀링, 혼합 및 충전을 포함하는 통상적인 제약 기술에 따라 제조한다. 액상 담체를 사용하는 경우, 제제는 시럽제, 엘릭서제, 에멀젼제, 또는 수성 또는 비수성 현탁제의 형태일 수 있다. 직장 투여용으로, 본 발명의 복합체는 부형제(예: 코코아 버터, 글리세린, 젤라틴 또는 폴리에틸렌 글리콜)와 배합하고, 좌제로 성형시킬 수 있다.

본 발명의 복합체는 다른 의약적으로 유용한 약물 또는 생물학적 제제를 포함하도록 제형화할 수 있다. 본 발명의 복합체는 본 발명의 복합체가 관련된 질병 또는 상태에 유용한 다른 약물 또는 생물학적 제제의 투여와 함께 투여할 수 있다.

본 발명에서 '유효량'이란 수혜자에게 유리한 효과를 제공하기에 충분히 높은 농도를 제공하기에 충분한 용량을 나타낸다. 특정한 환자에게 특정한 치료학적 유효량 수준은 치료될 질병, 질병의 중증도, 특이적 복합체의 활성, 투여 경로, 본 발명의 복합체의 클리어런스 비율, 치료 기간, 본 발명의 복합체와 함께 또는 동시에 사용되는 약물, 연령, 체중, 성별, 식이요법 및 피검자의 일반적 건강, 및 의약 분야 및 과학에 익히 공지된 유사 인자를 포함하는 다양한 인자에 따라 다르다.

'치료학적 유효량'을 측정하는 데에 고려되는 다양한 일반적 사항은 당해 기술분야에 알려져 있다(Gilman et al., eds., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990; and Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990).

본 발명의 복합체를 포함하는 약학적 제제의 용량 수준은 그 약학적 특성에 따라 정해지며, 전형적으로 약 0.001 내지 100mg/kg/일의 범위에 해당되며, 약 0.05 내지 10mg/kg/일 범위의 수준이 일반적으로 적용가능하다.

본 발명의 복합체는 비경구(예: 혈관내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하 등) 투여할 수 있다. 또한, 경구, 비내, 직장, 경피 또는 에어로졸을 통해 흡입으로 투여할 수 있다. 조성물은 일시주사로서 또는 서서히 주입하여 투여할 수 있다.

본 발명의 복합체는 사람의 의학 요법에서 뿐만 아니라 수의학, 농업, 환경 및 다른 분야에서의 용도도 사용할 수 있다. 또한, 표적화제가 세포막을 통과하는 능력을 억제하거나 감소시키는 방법이 제공된다. 이들 방법에서, 본 발명의 압타머 표적화 복합체는 스스로 세포막을 통과하지 않는 압타머의 반응성 그룹 N을 표적화제에 결합시킴으로써 형성되며, 여기에 상기 표적화제에 대한 상기 압타머의 결합은 세포막을 통과하는 제제의 능력을 감소시키거나 억제한다. 세포 표면 내재화 수용체로 지시되지 않은 압타머는 세포막을 통과하지 않은 압타머의 바람직한 공급원이다.

추가로, 본 발명의 복합체에 의하면 세포내 활성 약물의 세포내 전달을 매개하는 방법이 제공된다. 복합체의 표적화제는 이들이 세포 수용체에 결합하고 제제의 내재화를 매개한다. 이때 본 발명의 압타머 표적화 복합체는, 세포내 활성인 약물을 포함한다. 세포내 약물 전달은 수용체를 발현시키는 세포가 압타머 표적화 복합체와 접촉하는 경우에, 일어난다. 접촉은 압타머 표적화제의 내재화 및 상기 약물의 세포내 전달을 야기한다.

이러한 방법은 수용체 매개된 세포내 이입(즉, 수용체 매개된 내재화)을 이용하여 본 발명의 압타머 표적화 복합체를 세포내 전달한다. 결합 리간드의 내재화를 매개하는 세포 표면 수용체는 당해 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어, PSMA, 인테그린, HER2, EGF 수용체, 엽산 수용체 등을 포함한다.

내재화 검정은 용이하게 사용 가능하며, 형광 검출 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 특정 예에서, 세포내 활성 약물은, 상기 약물이 세포내 구획물과 접촉하는 경우, 활성으로 되는 프로드러그이다. 본 발명의 압타머 표적화 복합체는 세포내 트래피킹 시그널을 포함하여 내재화된 압타머 표적화 복합체를 특정한 세포내 구획으로 배양할 수 있다.

본 발명에 따른 압타머 표적화 복합체는, 압타머에 위치하는 반응성 그룹 N에, 링커 없이 결합된, 하나 이상의 화학적 제제 및/또는 하나 이상의 생물학적 제제(즉, 표적화제)를 포함함으로써, 상기 압타머와 상기 표적화제를 목적에 맞게 다양하게 선택 및 변형시킬 수 있고, 표적과의 특이적으로 결합을 통해 상기 표적화제가 가지는 고유의 효능을 더욱 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

본 발명에 따른 표적화 복합체는, 그 타깃이 되는 표적과의 특이성을 통해, 생체 내의 분포를 변화시켜서 상기 표적화제를 가장 필요로 하는 생체 내 장소를 찾아낼 수 있도록 함으로써, 상기 표적화제의 목적하는 효과를 더욱 향상시킨다.

본 발명에 따른 복합체는 상기 표적화제로서 질병 등에 약학적 효과가 있는 약제를 적용할 경우 그 치료 및 예방 효율을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

본 발명에 따른 복합체는 세포 또는 세포외 매트릭스가 표적분자를 발현하는 개체에서 세포 또는 세포외 매트릭스를 이미지화 하는 것에 사용될 수 있다.

이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 설명한다.

실시예

1. 시약 및 재료

본 발명의 표적화제 압타머 복합체 제조에 사용하는 압타머는 전립선 특이 세포막 당단백질인 PSMA의 세포외부 부분을 인지하는 A10 2-fluoropyrimidine RNA 압타머(A10 PSMA Apt) (Lupold et al., Cancer Res 2002; 62:4029-4033.)이며, 이를 공지된 방법에 의해 이를 제조하였다(Integrated DNA Technology 사).

상기 RNA 압타머의 염기서열은 5-NH2- GGG AGG ACG AUG CGG AUC AGC CAU GUU UAC GUC ACU CCU UGU CAA UCC UCA UCG GC-3로 공지되어 있으며, 2-fluoro pyrimidines를 갖고 있다.

표적화제인 독소루비신[Doxorubicin hydrochloride(Mr 580,000)]은 Sigma사에 구입하였으며, LNCaP 세포주 (ATCC CRL-1740) 및 PC3 세포주 (ATCC CRL1435)은 ATCC로부터 구입하였다.

2. 세포배양

LNCaP(ATCC CRL-1740)는 PSMA가 과다 발현되는 전립선암 세포주이고 PC3(ATCC CRL1435)는 PSMA가 발현되지 않는 전립선암 세포주이다. LNCaP 세포주는 2 mM l-glutamine, 1.5 g/L glucose, 10 mM Hepes, 1.0 mM sodium pyruvate, and 10% FBS이 보충된 RPMI 1640 media(Gibco) 에서 배양하였다.

PC3 세포주 (ATCC CRL1435)는 2 mM l-glutamine, 1.5 g/L sodium bicarbonate, and 10% FBS가 보충된 HAM's F12K media(ATCC사에 구입)에서 배양하였다. 이들 세포는 10 mL 배지에서 37 ℃로 2 내지 3일간 배양하였다. 이들 세포는 트립신을 처리하여 1:6 내지 1:10비율로 나누어 계대배양을 하였다.

3. 압타머 표적화 복합체의 제조

독소루비신(5 mg, 8.62 umol)과 A10 PSMA Apt의 공유결합은 기존 공지된 방법(David et al., Bioconjugate Chem., 1993, 4 (6), pp 521-527)을 사용하였다.

독소루비신(5 mg, 8.62 umol) 및 A10 PSMA Apt(10 mg, 44.4 umol)을 메탄올(4 mL)에 녹였다. Trifluoroacetic acid(3 uL)을 첨가하고 빛을 차단하고 실온에서 24시간 교반하였다. 이 methanolic solution을 실온에서 압력을 줄여주면 0.25mL로 농축하였다. Acetonitile (2.5mL)을 첨가하고 이 현탁액을 4℃에서 48시간 동안 방치하여 결정체를 얻었다. 원심분리로 결정체를 수확하고 새로운 methanol/acetonitrile(1:10)으로 세척하고 진공상태에 건조시켜 Dox-Apt (2.9 mg, 3.85 umol, 44.6% yield)를 얻었다.

4. 압타머 표적화 복합체가 암세포주의 생장에 미치는 영향

PSMA가 과다 발현되는 LNCaP 세포주 및 PSMA가 발현되지 않는 PC3 세포주을 대상으로 DMSO(디메틸 술폭사이드)에 녹인 압타머 표적화 복합체인 Dox-Apt 및 Free Dox 을 도7 내지 도8과 같이 2μmol 이하의 여러 가지 농도로 처리하여 72시간동안 배양하면서 암세포의 생장률을 측정함으로써 압타머 표적화 복합체가 정상세포 및 암세포주들의 생장에 미치는 효과를 평가하였다.

구체적으로, 먼저 상기 LNCaP 세포주와 PC3 세포주을 각각 10% 우태아혈청(fetal bovine serum)이 액체 배양하여 10⁴-10⁵의 양으로 6-웰 플레이트에 깔아준 후에, 24 시간동안 37℃에서 5% CO₂ 조건하에 배양하였다. 다음에 이들 각각의 배양 배지에 압타머 표적화 복합체를 도7과 도8에 그래프로 표시된 바와 같은 여러 가지 다양한 농도로 처리하여 72시간동안 37℃에서 5% CO₂ 조건하에 배양한 후, MTT 분석으로 세포증식을 조사하였다. MTT 분석은 5mg/ml MTT를 배양 부피의 1/10이 되도록 각 암세포에 처리하여 37℃에서 4 시간동안 방치한 후 배지를 제거하였다. 0.05M HCl의 이소프로판올 용액을 이용하여 살아있는 세포만을 염색하고 있는 보라색의 MTT 색소를 녹인 후, 색소의 흡광도를 570nm에서 읽었다. 이때, 기저치(background) 파장인 630nm에서의 흡광도를 570nm의 값으로부터 빼준 후 데이터를 처리하였다.

이상의 테스트 결과는 도7 및 도8과 같으며, 도시된 바와 같이 LNCaP 세포주는 표적화제-압타머 복합체인 Dox-Apt 및 Free Dox에 대한 반응성은 투여한 농도의 범위에서 대략 농도 비례적으로 독성을 보이지만 PC3 세포주는 Free Dox에 대한 반응성은 LNCaP 세포주와 유사한 경향이 있으나 Dox-Apt에 대한 반응성은 두 세포주간 매우 상이하였다.

본 발명은 이상의 대표적 실시예를 통해 광범위하게 기술 및 예시하고 있지만, 당해 기술분야의 숙련자라면, 앞서 예시한 다양한 방법들을 상기 실시예의 원리에 따라 적용할 수 있을 것이며, 앞서 예시한 방법 이외의 방법들도 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명을 다양하게 변형시킬 수 있음은 당연하다.

도1은 본 발명에 따른 압타머 표적화 복합체가 표적화 약물로 사용되는 일반적인 반응 모식도,

도2는 본 발명의 복합체에서 표적화제에 결합되는 압타머의 일반적인 구성도,

도3은 링커 없이, 항 PSMA의 압타머와 독소루비신의 표적화제에 의해 본 발명에 따른 예시적인 복합체를 제조하는 도면,

도4는 링커 없이, 항 PSMA의 압타머와 메이탠시노이드(DM1)의 표적화제에 의해 본 발명에 따른 다른 예시적인 복합체를 제조하는 도면,

도5는 본 발명에 따른 예시적인 독소루비신-항 PSMA 복합체의 구조도,

도6은 본 발명에 따른 다른 예시적인 메이탠시노이드-항 PSMA 압타머 복합체의 구조도,

도7은 본 발명에 따른 독소루비신-항 PSMA 압타머 복합체와 단독 독소루비신에 대한 LNCaP 세포주의 반응성 그래프 도면,

도면8은, 본 발명에 따른 독소루비신-항 PSMA 압타머 복합체와 단독 독소루비신에 대한 PC3 세포주의 반응성 그래프 도면.

Claims

압타머에 위치하는 반응성 그룹 N에, 링커 없이, 하나 이상의 화학적 제제 및/또는 하나 이상의 생물학적 제제가 결합된 것을 특징으로 하는, 압타머 표적화 복합체.
제1항에 있어서, 상기 화학적 제제와 상기 생물학적 제제는, 표적에 대한 결합 능력을 보유하거나 생물학적 활성을 나타내도록 결합된 것을 특징으로 하는, 압타머 표적화 복합체.
제1항에 있어서, 상기 반응성 그룹 N이 아미노그룹, 카르복실그룹, 치올그룹, 알킬, 알케닐, 알키닐, 옥소알킬, 옥소알케닐, 옥소알키닐, 아미노알킬, 아미노알케닐, 아미노알키닐, 설포알킬, 설포알케닐, 설포알키닐 그룹, 포스포알킬, 포스포알케닐, 및 포스포알키닐 중에서 선택된 하나 이상의 그룹을 포함하는 것을 특징으로 하는, 압타머 표적화 복합체.
제1항에 있어서, 하나 이상의 상기 생물학적 제제 중 적어도 하나는 치료용 약제인 것을 특징으로 하는, 압타머 표적화 복합체.
제1항에 있어서, 상기 화학적 제제 및 상기 생물학적 제제 중 적어도 하나는 생체분자에 특이적인 것을 특징으로 하는, 압타머 표적화 복합체.
제5항에 있어서, 상기 생체분자가 세포 표면 발현되거나 입자 표면 발현된 리간드 또는 수용체인 것을 특징으로 하는, 압타머 표적화 복합체.
제1항에 있어서, 상기 압타머와 상기 화학적 제제 및 상기 생물학적 제제의 결합은 불안정성 결합이고, 상기 불안정성 결합은 pH 민감성 결합, 또는 방사선에 의한 분해에 대한 감수성 결합인 것을 특징으로 하는, 압타머 표적화 복합체.
링커 없이 화학적 제제 또는 생물학적 제제를 압타머의 반응성 그룹 N에 결합시키는 단계를 포함하고, 상기 결합이 상기 화학적 제제 또는 생물학적 제제의 적어도 하나의 생물학적 특징을 변화시키는 것을 특징으로 하는, 상기 화학적 제제 또는 상기 생물학적 제제의 적어도 하나의 생물학적 특징을 변화시키는 방법.
표적분자에 특이적이고 질환 또는 상태에 대해 효과적인 생물학적 활성을 가지는 치료적 유효량의 제1항 내지 제7항 중에 어느 한 항에 따른 상기 압타머 표적화 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 표적분자를 발현하는 세포, 조직 또는 유체를 포함하는 개체 내 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위한 약제.
제9항에 있어서, 상기 생물학적 제제가 사이토카인, 독소, 약제, 핵산 또는 동위 원소인 것을 특징으로 하는 약제.
제9항에 있어서, 상기 질환 또는 상태가 감염이고, 상기 표적분자가 미생물체 또는 바이러스에 의해 발현되는 것인 것을 특징으로 하는 약제.
미생물 세포 또는 바이러스 입자상의 수용체에 특이적인 화학적 제제 또는 생물학적 제제를 포함하는 유효량의 제1항 내지 제7항 중에 어느 한 항에 따른 상기 압타머 표적화 복합체를 상기 수용체의 표면에 접촉함으로써 상기 표면상에 존재하는 상기 미생물 세포 또는 상기 바이러스 입자의 감염력을 감소시키는 것을 특징으로 하는 약제.
(A) 압타머에 위치하는 반응성 그룹 N에, 링커 없이 결합된, 하나 이상의 화학적 제제 및/또는 하나 이상의 생물학적 제제를 포함하고, 하나 이상의 상기 화학적 제제 및/또는 상기 생물학적 제제가 세포 수용체에 결합하여 내재화를 매개하고, 세포내에서 활성인 약제를 포함하는 압타머 표적화 복합체를 제조하는 단계; 및

(B) 상기 수용체 발현 세포를 상기 압타머 표적화 복합체와 접촉시키는 단계; 를 포함하며,

상기 접촉에 의해 상기 압타머 표적화 복합체의 내재화 및 상기 약제의 세포내 전달이 일어나도록 하는 것을 특징으로 하는, 세포내 활성인 약제의 세포내 전 달을 매개하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 약제는 상기 약제가 세포내 구획과 접촉할 경우 활성이 되는 프로드러그인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 압타머 표적화 복합체는 내재화된 상기 압타머 표적화 복합체를 특정의 세포내 구획으로 지시하기 위한 트래피킹 시그널을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 2개 이상의 상기 화학적 제제 및/또는 2개 이상의 상기 생물학적 제제가 상기 압타머의 상기 반응성 그룹 N에 결합되고, 상기 압타머 표적화 복합체와 상기 세포 수용체 간의 결합 활성을 증가시킴으로써, 수용체 매개 내재화와 약제 전달을 증가시키는 방법.
(A) 하나 이상의 화학적 제제 및/또는 하나 이상의 생물학적 제제가 자체의 반응성 그룹을 통해, 인지부위 C를 갖고 있는 압타머에 링커 없이 결합된 압타머 표적화 복합체를 제조하는 단계;

(B) 상기 압타머의 단일가닥핵산의 화학적 특징을 변형시키는 단계; 및

(C) 상기 압타머 표적화 복합체의 물리적 또는 생물학적 성질의 변형 여부를 측정하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는,

압타머 표적화 복합체의 물리적 또는 생물학적 성질의 변형 방법.
제17항에 있어서, 상기 물리적 또는 상기 생물학적 성질이 약동학, 약력학, 면역원성, 결합 친화성, 분해 감수성, 용해도, 친지성, 친수성, 소수성, 안정성 및 강도 중에 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
검출성 표지물이 결합된 제1항 내지 제7항 중에 어느 한 항에 따른 상기 압타머 표적화 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 압타머 표적화 복합체는 생체 내에서 상기 압타머의 반응성 그룹 N과 비-공유적으로 결합하며, 상기 압타머 표적화 복합체는 세포 또는 조직 중의 표적에 특이적인 것을 특징으로 하는, 표적분자를 발현하는 개체 내 세포 또는 조직을 이미지화하는 방법.
그 자신은 세포막을 통과하지 않는 압타머의 반응성 그룹 N을 링커 없이 화학적 제제 및/또는 생물학적 제제와 결합시킴으로써 압타머 표적화 화합물을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 압타머, 상기 화학적 제제 또는 상기 생물학적 제제의 결합이 상기 제제의 세포막 통과 능력을 감소시키거나 억제시키는 것을 특징으로 하는, 세포 침투성 상기 화학적 제제 또는 상기 생물학적 제제의 세포막 통과 능력을 억제하거나 감소시키는 방법.