WO2021101258A2 - 압타머 기반 표적화 복합 항암제 - Google Patents

압타머 기반 표적화 복합 항암제 Download PDF

Info

Publication number
WO2021101258A2
WO2021101258A2 PCT/KR2020/016330 KR2020016330W WO2021101258A2 WO 2021101258 A2 WO2021101258 A2 WO 2021101258A2 KR 2020016330 W KR2020016330 W KR 2020016330W WO 2021101258 A2 WO2021101258 A2 WO 2021101258A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
aptamer
anticancer agent
targeting complex
based targeting
nucleic acid
Prior art date
Application number
PCT/KR2020/016330
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2021101258A3 (ko
Inventor
김성천
Original Assignee
주식회사 바이오이즈
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 바이오이즈 filed Critical 주식회사 바이오이즈
Publication of WO2021101258A2 publication Critical patent/WO2021101258A2/ko
Publication of WO2021101258A3 publication Critical patent/WO2021101258A3/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A61K9/5153—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)

Abstract

본 발명은 2종 이상의 항암제를 복합으로 포함함으로써 복합 투여가 가능하고 또 표적 암세포에만 선택적으로 작용함으로써 항암제의 부작용은 줄일 수 있는 압타머 기반 표적화 복합 항암제를 개시한다.

Description

압타머 기반 표적화 복합 항암제
본 발명은 압타머 기반 표적화 복합 항암제에 관한 것이다.
현대사회는 경제가 발전하고 의료기술이 발전함에 따라 감염성 질환이나 급성질환은 감소하고 있으나, 암, 비반, 당뇨, 고혈압 등 만성질환의 발병은 증가하고 있다. 이 중 암은 고령화, 서구화된 식생활 습관, 운동 부족 등으로 사망률이 매년 지속적으로 증가하고 있는 질환이다. 2019년 우리나라의 사망원인 통계에 따르면, 사망 원인 1위인 암에 의한 사망률(인구 10만 명당 158.2명)은 2위인 심장질환에 의한 사망률(인구 10만 명당 60.4명)의 2.5배 수준으로 생존율 향상을 위한 효과적인 항암 치료법 개발이 필요하다.
암은 비정상적인 생리환경으로 인하여 무분별한 세포 증식에 의하여 세포괴가 생기고 이것이 주변 조직을 침범하거나 혈관을 통해 몸의 다른 조직으로 전이됨으로써 일어나는 질병을 말한다. 이러한 암을 치료하는 방법으로는 수술 요법, 방사선 요법, 화학 요법 등이 있으며, 암의 재발과 전이 방지를 위하여 화학 요법이 기본적으로 사용된다. 화학 요법은 국소적인 다른 치료법과 달리 세포독성 항암제을 경구나 주사로 투여하여 전신에 퍼져 있는 암세포에 작용하도록 하는 전신적인 치료법이다.
세포독성 항암제는 직·간접적으로 DNA 복제, 전사, 번역을 차단하거나 핵산 합성의 대사 경로에 개입하여 핵산 합성을 방해하거나 미세소관(microtuble)에 작용하여 세포분열을 저해함으로써 암세포에 대한 세포독성을 나타내는 약제를 총칭한다.
대부분의 세포독성 항암제는 암세포가 정상세포보다 빨리 자란다는 특징을 이용하여 개발되었기 때문에 암세포 뿐만 아니라 세포분열이 활발한 골수 조직 세포, 위장관의 상피세포, 모근 상피세포 등의 정상세포에도 작용하여 골수 기능 저하, 면역 기능 저하, 식욕 부진, 구토, 설사, 탈모증 등의 부작용을 유발한다.
또한 세포독성 항암제는 그 투여횟수가 증가할수록 암세포가 항암제에 대한 내성을 획득하게 되므로 항암제 투여량을 늘리거나 다른 항암제와 복합적으로 사용하여야 항암 효과를 유지시킬 수 있다.
따라서 세포독성 항암제의 부작용을 줄이면서 항암제 내성을 극복하기 위한 복합 투여가 가능한 약물의 개발이 요구된다.
본 발명은 항암제의 복합 투여가 가능하고 그 부작용은 줄일 수 있는 압타머 기반 표적화 복합 항암제를 개시한다.
압타머에 뉴클레오시드 유사 항암제(nucleoside analog drugs)가 통합된(incorporated) 경우 압타머가 압타머에 의한 표적화가 가능하고 또 항암 활성을 나타낸다는 것이 알려져 있지만 이 경우는 1종의 항암제만 포함하고 있을 뿐이다(Molecular Therapy: Nucleic Acids, 2008, 12:543-553; Mol Ther Nucleic Acids. 2017 Mar 17; 6: 80-88).
본 발명의 목적은 2종 이상의 항암제를 복합으로 포함(또는 탑재, 포획)함으로써 복합 투여가 가능하고 또 표적 암세포에만 선택적으로(또는 특이적으로) 작용함으로써 항암제의 부작용은 줄일 수 있는 압타머 기반 표적화 복합 항암제를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명자들은 아래의 실시예에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따른 압타머 기반 표적화 복합 항암제가 표적분자를 발현하는 암세포에만 선택적으로 작용함으로써 항암제 부작용은 경감되고 2종 이상의 항암제를 복합으로 탑재함으로써 항암 효과는 높일 수 있는가를 평가하기 위하여, 표적분자를 HER2(Human epidermal growth factor receptor 2) 또는 EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)으로 하여 이에 특이적인 결합능을 가진 압타머에, 뉴클레오시드 유사 항암제(nucleoside analog drugs)인 젬시타빈(gemcitabine)이 일인산(monophoshpate) 형태로 통합되도록(incorporated) 하고 그 압타머에 다른 항암제인 메르타신(Mertansine, DM1)을 결합시켜 압타머 기반 표적화 복합 항암제를 제조하고(구체적으로 아래 실시예 1의 A 또는 B의 압타머 기반 표적화 복합 항암제임), 이를 HER2와 EpCAM이 모두 과다 발현하는 MDA-MB-453 유방암 세포주, HER2는 발현하지 않고 EpCAM만 과다 발현하는 MCF-7 유방암 세포주, HER2와 EpCAM을 모두 발현하지 않는 MDA-MB-231 유방암 세포주에 처리한 경우에, 표적분자를 발현하지 않는 세포주에 대해서는 세포독성을 보이지 않으면서 표적분자를 발현하는 세포주에 대해서는 뚜렷한 세포독성을 보임을 확인하였다(첨부된 도면의 도 12에서 A 항목과 B 항목 참조).
또 본 발명자들은 상기 2종의 항암제가 탑재된 압타머 기반 표적화 복합 항암제에, 1종의 다른 항암제를 추가로 탑재한 압타머 기반 표적화 복합 항암제를 제조하기 위하여, 스템 루프(stem-loop) 구조를 형성하는 단일가닥 핵산을 상기 압타머에 결합시켜 도입하고, 이 단일가닥 핵산에서 형성된 이중가닥의 스템 영역에 인터칼레이터 항암제(intercalators as anticaner drug)인 독소루비신(doxorubicin, DOX)을 추가로 탑재한 압타머 기반 표적화 복합 항암제를 제조하고(아래 실시예 1의 D 또는 E의 압타머 기반 표적화 복합 항암제임), 상기에서와 같이 표적분자를 발현하거나 발현하지 않는 유방암 세포주에 처리한 결과, 상기에서와 마찬가지로 표적분자를 발현하지 않는 유방암 세포주에 대해서는 세포독성을 보이지 않으면서 표적분자를 발현하는 유방암 세포주에 대해서는 뚜렷한 세포독성을 보임을 확인하였다(첨부된 도면의 도 12에서 D 항목과 E 항목 참조).
또 본 발명자들은 2종의 표적분자인 HER2와 EpCAM를 동시에 표적화하고 4종의 항암제가 탑재된 압타머 기반 표적화 복합 항암제를 제조하기 위하여, 젬시타빈이 통합된 HER2에 대한 압타머, 독소루비신이 탑재된 스템 루프 구조를 갖는 단일가닥 핵산, 그리고 뉴클레오시드 유사 항암제인 5-플루오로우라실이 일인산 형태로 통합된 EpCAM에 대한 압타머가 결합되고 이 결합체의 EpCAM에 대한 압타머 말단에 메르타신(Mertansine, DM1), 파크리탁셀(Paclitaxel, PTX), 모노에틸 아우리스타틴 E(Monomethyl auristatin E, MMAE) 또는 모노에틸 아우리스타틴 F(Monomethyl auristatin F, MMAF)가 결합된 압타머 기반 표적화 복합 항암제를 제조하고(아래 실시예 1의 G, H, I 및 J의 압타머 기반 표적화 복합 항암제임), 상기에서와 같이 2종의 표적분자를 모두 발현하는 MDA-MB-453 유방암 세포주, 1종의 표적분자만을 발현하는 MCF-7 유방암 세포주 및 2종의 표적분자를 모두 발현하지 않는 MDA-MB-231 유방암 세포주에 처리한 결과, 상기와 마찬가지로 2종의 표적분자를 모두 발현하지 않는 MDA-MB-231 유방암 세포주에 대해서는 전혀 세포독성을 보이지 않으면서, 2종의 표적분자를 모두 발현하는 MDA-MB-453 유방암 세포주와 1종의 표적분자만을 발현하는 MCF-7 유방암 세포주에 대해서는 세포독성을 보임을 확인하였다. 또 이러한 세포독성은 상기 2종 또는 3종의 항암제가 탑재된 압타머 기반 표적화 복합 항암제보다 더 높게 나타났다(첨부된 도면의 도 13에서 G, H, I 및 J 항목 참조). 이러한 결과는 특히 본 발명의 상기 압타머 기반 표적화 복합 항암제가 다중 표적 기능을 가지는 경우 다중 표적분자를 지닌 암세포주에만 작용하여 부작용은 낮추면서 그 암세포에 대해 더 유효한 세포독성을 나타낼 수 있음을 보여주는 것으로 볼 수 있다. 전술한 바와 같이, 아래 실시예는 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제가 항암제 복합 투여를 가능하게 하면서 압타머에 의해 표적화 기능에 의해 해당 표적분자를 가진 암세포에만 작용함으로써 항암제의 부작용은 줄일 수 있음을 의미한다.
전술한 바를 고려할 때, 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 (i) 암세포의 표면에서 발현되는 표적분자(아래에서 문맥에 따라 "제1의 표적분자"로 언급될 수도 있음)를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 암세포에 대한 표적화가 가능하고 뉴클레오시드 유사 항암제(아래에서 문맥에 따라 "제1의 뉴클레오시드 유사 항암제"로 언급될 수도 있음)가 일 분자(one or more molecules) 이상 통합됨으로써(incorporated) 그 자체로 항암 활성을 나타낼 수 있는 압타머(아래에서 문맥에 따라 "제1의 압타머"로 언급될 수도 있음)와 (ii) 상기 뉴클레오시드 유사 항암제와 다른 제2의 항암제가 상기 압타머와 결합된 구성을 갖는다.
본 명세서에서, 항암제는 달리 의미를 정하여 사용한 경우를 제외하고 뉴클레오시드 유사 항암제, 인터칼레이터 항암제, 그루브 결합 항암제, 제2의 항암제를 포함하여 모두 세포독성 항암제를 의미한다. 이 세포독성 항암제는 당업계에서 주지되고 앞서 언급된 바와 같이 암세포의 세포분열을 억제함으로써 암세포에 대한 세포독성을 나타내는 항암제를 총칭하는 의미이다.
본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제에서, 스템 루프(stem-loop) 구조를 형성하는 단일가닥 핵산이 상기 압타머의 5' 또는 3' 말단이나 및/또는 상기 제2의 항암제와 결합하여 도입되고, 이 단일가닥 핵산의 이중가닥 영역인 스템 영역에 인터칼레이터 항암제 또는 그루브 결합 항암제가 일 분자 이상 끼어들어가 탑재(또는 포획)될 수 있다. 여기서 탑재되는 것의 의미는 인터칼레이터 항암제 또는 그루브 결합 항암제가 스템 영역의 이중가닥 핵산과 공유결합을 형성하는 항암제인 경우에는 공유결합으로 탑재되는 것이고 공유결합을 형성하지 않는 경우에는 정전기적 상호작용(electrostatic interaction)이나 반 더 왈스 상호작용(van der Waals interactions)에 의해 비공유결합으로 탑재되는 것을 의미한다.
인터칼레이터 항암제 또는 그루브 결합 항암제가 탑재된 스템 루프 구조를 형성하는 단일가닥 핵산이 도입될 경우, 그 결합 순서는 임의의 결합 순서일 수 있는데, 구체적으로 (i) 압타머, 인터칼레이터 항암제 또는 그루브 결합 항암제가 탑재된 스템 루프 구조를 형성하는 단일가닥 핵산, 제2의 항암제 순이거나, (ii) 인터칼레이터 항암제 또는 그루브 결합 항암제가 탑재된 스템 루프 구조를 형성하는 단일가닥 핵산, 압타머, 제2의 항암제 순이거나, (iii) 압타머, 제2의 항암제, 인터칼레이터 항암제 또는 그루브 결합 항암제가 탑재된 스템 루프 구조를 형성하는 단일가닥 핵산 순일 수 있다.
여기서 압타머와 단일가닥 핵산이 공간적으로 인접해 구성될 경우 압타머의 표적분자와의 결합 부위나 단일가닥 핵산의 스템 루프 영역이 그 기능(즉 표적분자와의 결합능 또는 인터칼레이터 항암제나 그루브 결합 항암제의 탑재능)을 발휘하는 형태(comformaton)(또는 secondary structure)에서 영향을 받아 그 의도한 기능이 영향을 받을 수 있다. 압타머와 단일가닥 핵산을 적정하게 이격시키기 위하여 압타머와 단일가닥 핵산 사이에(본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제가 압타머, 항암제, 단일가닥 핵산 순일 경우에는 압타머, 항암제 사이 또는 항암제, 단일가닥 핵산 사이에) 올리고뉴클레오티드가 스페이서(spacer)로 게재되어 결합될 수 있다. 이러한 스페이서는 압타머와 단일가닥 핵산을 서로 이격시킴으로써 이들 기능이 서로 영향을 받지 않도록 할 수 있는 한 그 길이는 특별한 제한이 없다. 통상은 3~20bp 길이일 수 있다. 이러한 올리뉴클레오티드 스페이서는 하나 이상의 뉴클레오티드로 구성된 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드, 또는 뉴클레아제나 열에 안정한 PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid), HNA(Hexitol Nucleic Acids), ANA(Altritol Nucleic Acids), MNA(Mannitol Nucleic Acids) 등일 수 있다.
또 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제에서, 상기 표적분자와 다른 제2의 표적분자를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 암세포에 대한 추가적인 표적화가 가능하고 상기 압타머에 통합된 뉴클레오시드 유사 항암제와 다른 뉴클레오시드 유사 항암제(아래에서 문맥에 따라 "제2의 뉴클레오시드 유사 항암제"로 언급될 수도 있음)가 일 분자 이상 통합됨으로써 그 자체로 항암 활성을 나타낼 수 있는 제2의 압타머가 상기 압타머의 5' 또는 3' 말단이나 상기 제2의 항암제 또는 상기 인터칼레이터 항암제 또는 그루브 결합 항암제가 탑재된 스템 루프(stem-loop) 구조를 형성하는 단일가닥 핵산의 5' 또는 3' 말단에 결합되어 도입될 수 있다.
상기 제2의 압타머가 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제에 도입될 경우, 그 결합 순서는 임의의 결합 순서일 수 있는데, 구체적으로 (i) 제1의 압타머, 제2의 압타머, 제2의 항암제 순이거나, (ii) 제1의 압타머, 제2의 항암제, 제2의 압타머 순일 수 있다. 여기서도 제1의 압타머와 제2의 압타머를 이격시키기 위하여 제1의 압타머와 제2의 압타머 사이에(본 발명이 압타머 기반 표적화 복합 항암제가 제1의 압타머, 제2의 항암제, 제2의 압타머 순일 경우 제1의 압타머와 제2의 항암제 사이 또는 제2의 항암제와 제2의 압타머 사이) 올리고뉴클레오티드가 스페이서(spacer)로 게재되어 결합될 수 있다. 이는 제1의 압타머와 제2의 압타머가 공간적으로 인접해 서로 그 기능(해당 표적분자와의 특이적 결합능)을 발휘하지 못하는 것을 방지하기 위한 것이다. 이 올리고뉴클레오티드의 길이, 그 구성 등에 대해서는 전술한 바를 참조할 수 있다.
또 상기 제2의 압타머가 인터칼레이터 항암제 또는 그루브 결합 항암제가 탑재된 스템 루프 구조를 형성하는 단일가닥 핵산이 도입되어 있는 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제에 도일될 경우, 그 결합 순서도 임의의 순서일 수 있는데, 구체적으로 (i) 제1의 압타머, 단일가닥 핵산, 제2의 항암제, 제2의 압타머 순이거나, (ii) 제1의 압타머, 단일가닥 핵산, 제2의 압타머, 제2의 항암제 순이거나, (iii) 제1의 압타머, 제2의 압타머, 단일가닥 핵산, 제2의 항암제 순이거나, (iv) 단일가닥 핵산, 제1의 압타머, 제2의 항암제, 제2의 압타머 순이거나, (v) 단일가닥 핵산, 제1의 압타머, 제2의 압타머, 제2의 항암제 순이거나, (vi) 제1의 압타머, 제2의 항암제, 단일가닥 핵산, 제2의 압타머 순이거나, (vii) 제1의 압타머, 제2의 항암제, 제2의 압타머, 단일가닥 핵산 순이거나 또는 (viii) 제1의 압타머, 제2의 압타머, 제2의 항암제, 단일가닥 핵산 순일 수 있다.
이 경우에도 제1의 압타머와 제2의 압타머 그리고 단일가닥 핵산 사이를 공간적으로 이격시키기 위하여 올리고뉴클레오티드인 스페이서가 게재되어 결합될 수 있다.
한편 본 발명의 발명자들은 아래의 실시예에서, 뉴클레오시드 유사 항암제인 젬시타빈이 통합된 HER2에 대한 압타머와 뉴클레오시드 유사 항암제인 5-플루오로우라실이 일인산 형태로 통합된 EpCAM에 대한 압타머가 결합한 형태인, 2종의 표적분자인 HER2와 EpCAM를 동시에 표적화하면서 2종의 항암제가 탑재된 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제(아래 실시예 1의 F의 압타머 기반 표적화 복합 항암제임)를, 2종의 표적분자를 모두 발현하는 MDA-MB-453 유방암 세포주, 1종의 표적분자만을 발현하는 MCF-7 유방암 세포주 및 2종의 표적분자를 모두 발현하지 않는 MDA-MB-231 유방암 세포주에 처리한 결과, 상기와 마찬가지로 2종의 표적분자를 모두 발현하지 않는 MDA-MB-231 유방암 세포주에 대해서는 전혀 세포독성을 보이지 않으면서, 2종의 표적분자를 모두 발현하는 MDA-MB-453 유방암 세포주와 1종의 표적분자만을 발현하는 MCF-7 유방암 세포주에 대해서는 세포독성을 보임을 확인하였다(첨부된 도면의 도 13의 F 항목 참조).
전술한 바를 고려할 때, 다른 측면에 있어서 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 (i) 암세포의 표면에서 발현되는 제1의 표적분자를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 암세포에 대한 표적화가 가능하고 제1의 뉴클레오시드 유사 항암제가 통합됨으로써(incorporated) 그 자체로 항암 활성을 나타낼 수 있는 제1의 압타머와 (ii) 상기 암세포의 표면에서 발현되는 상기 제1의 표적분자와 다른 제2의 표적분자를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 암세포에 대한 추가적인 표적화가 가능하고, 상기 제1의 뉴클레오시드 유사 항암제와 다른 제2의 뉴클레오시드 유사 항암제가 통합됨으로써(incorporated) 그 자체로 항암 활성을 나타낼 수 있는 제2의 압타머가 상기 제1의 압타머에 결합된 구성을 갖는 압타머 기반 표적화 복합 항암제로 이해될 수도 있다.
이 경우에 있어서도 제1압타머와 제2압타머 사이를 공간적으로 이격시키기 위하여 올리고뉴클레오티드인 스페이서가 게재되어 결합될 수 있다.
또 한편 본 발명자들은 아래의 실시예에서 뉴클레오시드 유사 항암제인 젬시타빈이 통합된 HER2에 대한 압타머와 인터칼레이터 항암제인 독소루비신인 탑재된 스템 루프(stem-loop) 구조를 형성하는 단일가닥 핵산이 결합된 형태인 표적분자인 HER2를 표적화하면서 2종의 항암제가 탑재된 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제(아래 실시예 1의 C의 압타머 기반 표적화 복합 항암제임)를, HER2와 EpCAM이 모두 과다 발현하는 MDA-MB-453 유방암 세포주, HER2는 발현하지 않고 EpCAM만 과다 발현하는 MCF-7 유방암 세포주, HER2와 EpCAM을 모두 발현하지 않는 MDA-MB-231 유방암 세포주에 처리한 결과, 표적분자인 HER2가 발현되는 MDA-MB-453 유방암 세포주에 대해서는 세포독성을 보이지만 표적분자인 HER2가 발현되지 않는 MCF-7 유방암 세포주와 MDA-MB-231 유방암 세포주에서는 세포독성 효과를 보이지 않음을 확인하였다(첨부된 도면의 도 12에서 C 항목 참조).
전술한 바를 고려할 때, 또 다른 측면에 있어서, 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 (i) 암세포의 표면에서 발현되는 표적분자(아래에서 문맥에 따라 "제1의 표적분자"로 언급될 수도 있음)를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 암세포에 대한 표적화가 가능하고 뉴클레오시드 유사 항암제(아래에서 문맥에 따라 "제1의 뉴클레오시드 유사 항암제"로 언급될 수도 있음)가 통합됨으로써(incorporated) 그 자체로 항암 활성을 나타낼 수 있는 압타머(아래에서 문맥에 따라 "제1의 압타머"로 언급될 수도 있음)와 (ii) 스템 루프 구조를 형성하는 단일가닥 핵산이 상기 압타머의 5' 또는 3' 말단와 결합하여 도입되고, 이 단일가닥 핵산의 이중가닥 영역인 스템 영역에 인터칼레이터 항암제나 그루브 결합 항암제가 끼어들어가 탑재된 구성을 갖는 것으로 이해될 수 있다.
상기 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제에 있어서, 상기 암세포의 표면에서 발현되는 상기 제1의 표적분자와 다른 제2의 표적분자를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 암세포에 대한 추가적인 표적화가 가능하고, 상기 제1의 뉴클레오시드 유사 항암제와 다른 제2의 뉴클레오시드 유사 항암제가 통합됨으로써(incorporated) 그 자체로 항암 활성을 나타낼 수 있는 제2의 압타머가 상기 제1의 압타머 또는 상기 단일가닥 핵산에 결합되어 도입될 수 있다.
이 경우 그 결합 순서도 임의의 순서일 수 있는데, 구체적으로 (i) 제1의 압타머, 단일가닥 핵산, 제2의 압타머 순이거나, (ii) 제1의 압타머, 제2압타머, 단일가닥 핵산 순일 수 있다.
이 경우에도 제1압타머와 제2압타머 그리고 단일가닥 핵산 사이를 공간적으로 이격시키기 위하여 올리고뉴클레오티드인 스페이서가 게재되어 결합될 수 있다.
본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제에 있어서, 스템 루프(stem-loop) 구조를 형성하는 단일가닥 핵산이나 제2의 압타머가, 그 압타머 기반 복합 항암제의 단부(예컨대 압타머와 제2의 항암제가 결합된 구성에 있어서 그 압타머의 5' 말단이나 제2의 항암제를 말함)가 아닌 그 구성요소 사이(예컨대 압타머와 제2의 항암제가 결합된 구성에 있어서 그 압타머의 3' 말단이나 제2의 항암제 사이)에 도입될 경우, 그 단일가닥 핵산이나 그 제2의 압타머가 앞의 구성요소(상기 예에서 압타머의 3' 말단)와 후의 구성요소(상기 예에서 제2의 항암제)와 모두 결합하여 도입된다는 것을 의미한다.
본 발명에서, 암세포는 치료 목적으로 제거 또는 사멸의 필요성을 가진 임의의 암세포(또는 암 줄기세포)이다. 암세포라면 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁 경부암, 자궁 내막체암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종, 다발성 골수종혈액암 등 암종을 불문한다.
또 본 발명에서, 표적분자는 암세포의 표면에 존재하는 임의의 항원 또는 임의의 수용체이다.
이러한 항원 또는 수용체는 바람직하게는 암세포에서만 발현되거나 정상세포에 비해 암세포에서 과발현되는 항원 또는 수용체를 말한다. 예컨대 교모세포종(glioblastoma)에서 발현되는 EGFRvⅢ(epidermal growth factor receptor variantⅢ), 역형성 갑상선암이나 유방암, 폐암, 신경교종(glioma) 등에 과발현되는 EGFR(Epidermal growth factor receptor), 유두성 갑상선 암(papillary thyroid cancer) 등에서 과발현 메타스틴 수용체(Metastin receptor), 유방암 등에서 과발현되는 ErbB 계열의 수용체 타이로신 카이나제(Receptor tyrosine kinases), 유방암, 방광암, 담낭암(Gallbladder cancers), 담관암(Cholangiocarcinomas), 위식도접합부암(esophagogastric junction cancers) 등에서 과발현되는 HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), 육두성 신암종 등에서 과발현되는 타이로신 카이나제-18-수용체(c-Kit), 식도 선암 등에 과발현되는 HGF 수용체 c-Met, 유방암 등에서 과발현되는 CXCR4 또는 CCR7, 전림선암에서 과발현되는 엔도테린-A 수용체, 직장암 등에서 과발현되는 PPAR-δ(peroxisome proliferator activated receptor δ), 난소암 등에서 과발현되는 PDGFR-α(Platelet-derived growth factor receptor α), 간암, 다발성 골수종 등에서 과발현되는 CD133, 폐암, 대장암, 위암, 췌장암, 유방암, 직장암, 결장암, 갑상선 수질암 등에서 과발현되는 CEA(carcinoembryonic antigen), 간암, 위암, 대장암, 췌장암, 유방암 등에서 과발현되는 EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), 신경모세포종 등에서 과발현되는 GD2(disialoganglioside), 간세포암 등에서 과발현되는 GPC3(Glypican 3), 전립선암 등에서 과발현되는 PSMA(Prostate Specific Membrane Antigen), 난소암, 유방암, 결장암, 폐암, 췌장암 등에서 과발현되는 TAG-72(tumor-associated glycoprotein 72), 흑색종 등에서 과발현되는 GD3(disialoganglioside), 혈액암, 고형암 등에서 과발현되는 HLA-DR(human leukocyte antigen-DR), 진행성 고형암 등에서 과발현되는 MUC1(Mucin 1), 진행성 폐암(advanced non-small-cell lung cancer) 등에서 과발현되는 NY-ESO-1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1), 비인두종양(Nasopharyngeal neoplasms) 등에서 과발현되는 LMP1(Latent membrane protein 1), 폐암, 비호지킨 림프종, 난소암, 결장암, 대장암, 췌장암 등에서 과발현되는 TRAILR2(tumor-necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor), 혈관 신생 인자 수용체인 VEGFR2(vascular endothelial growth factor receptor 2), 간세포암 등에서 과발현되는 HGFR(hepatocyte growth factor receptor) 등이 표적분자일 수 있다. 또한 암 줄기세포의 표면 항원인 CD44, CD166 등이 또한 표적분자일 수 있으며, 면역 관문 인자(immune checkpoint)인 PD-1, PD-L1, PD-L2 등이 표적분자일 수 있다.
당업계에는 정상세포에 비해 암세포에서 과발현되는 많은 표적분자가 알려져 있으며, 상기 예시된 것 이외의 기타의 표적분자와 관련해서 더 구체적인 것은 문헌Anne T Collins et al. Prospective Identification of Tumorigenic Prostate Cancer Stem Cells. Cancer Res. 2005 Dec 1;65(23):10946-51, 문헌Chenwei Li et al. Identification of Pancreatic Cancer Stem Cells. Cancer Res. 2007 Feb 1;67(3):1030-7, 문헌Shuo Ma et al. Current Progress in CAR-T Cell Therapy for Solid Tumors. Int J Biol Sci. 2019 Sep 7;15(12):2548-2560, 문헌Dhaval S Sanchala et al. Oncolytic Herpes Simplex Viral Therapy: A Stride Toward Selective Targeting of Cancer Cells. Front Pharmacol. 2017 May 16;8:270 등을 참조할 수 있다.
특히 본 발명에서 표적분자는 바람직하게는 HER2 또는 EpCAM이다.
본 발명에서 압타머는 단일가닥 DNA 압타머 또는 단일가닥 RNA 압타머일 수 있다. 압타머는 항체와 마찬가지로 표적 항원 등 표적분자에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 리간드를 의미하는데, 표적분자와 특이적으로 결합할 수 있다면, 압타머는 이중가닥 DNA 또는 RNA 압타머일 수도 있다. 이러한 표적분자와의 특이적 결합할 수 있는 압타머의 제조, 선별 방법 등은 모두 당업계에 공지되어 있으며, 특히 SELEX 기술이나 이 SELEX 기술을 개량한 기술 예컨대 표적분자와의 특이성을 높이기 위한 Counter-SELEX 기술(Science 263(5152):1425-1429, 1994), 표적분자와 압타머의 거울상 이성질체를 이용하는 Spiegelmer 기술(Chem Biol 9(3):351-359, 2002) 등을 이용할 수 있다. 상기 SELEX 기술은 "Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment"의 준말로 이름 붙여진 기술로, 해당 기술에 대해서는 문헌Science 249 (4968):505-510, 1990, 미국 등록특허 제5,475,096, 미국 특허등록 제5,270,163호, 국제특허공개 WO 91/19813 등을 참조할 수 있으며, 압타머의 선별을 위한 구체적인 방법이나 적절한 시약, 재료 등의 사용에 대해서는 문헌Methods Enzymol 267:275-301, 1996, 문헌Methods Enzymol 318:193-214, 2000 등을 참조할 수 있다. 압타머는 생체 내 반감기 향상을 위하여 당, 포스페이트 및/또는 염기에서 변형된 것일 수 있다. 이러한 당, 포스페이트 및/또는 염기에서 변형된 뉴클레오티드는 당업계에 그 제조방법을 포함하여 구체적으로 공지되어 있다. 예컨대 당에서 변형된 뉴클레오티드는, 그 당의 하이드록실 기(2'-OH group)가 할로겐 기(특히 불소(F)), 지방족 기, 에테르 기, 아민 기로 수식되거나 특히 OMe, O-알킬, O-알릴, S-알킬, S-알릴 또는 할로겐 등으로 수식된 것, 당인 리보스 또는 디옥시 리보오스 자체가 이를 대신할 수 있는 당 유사체 α-아노머 당(α-anomeric sugars), 아라비노스(arabinose), 자일로스(xyloses) 또는 릭소오스(lyxoses)와 같은 에피머 당(epimeric sugars), 피라노오스 당(pyranose sugars), 퓨라노오스 당(furanose sugars) 등으로 치환된 것을 들 수 있다. 또한 예컨대 포스페이트에서의 변형은 포스페이트가 P(O)S(thioate), P(S)S(dithioate), P(O)NR2(amidate), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2(formacetal)로의 변형된 것 등을 들 수 있다. 여기서 상기 R 또는 R'는 H 또는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 등이며, 포스페이트에서 변형될 경우 그 연결기는 -O-, -N-, -S- 또는 -C-가 되어, 이러한 연결기를 통해 인접 뉴클레오티드가 서로 결합하게 된다.
압타머는 그것이 표적분자와 결합하는 부위나 그 결합 부위 이외의 다른 부위에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 치환이나 결손되더라도 또 그 압타머 양단(兩端)에서 화학적으로 수식되거나 다른 서열이 부가되더라도 그것의 표적분자와의 결합능은 변하지 않거나, 결합능이 낮아지더라도 유지될 수 있음이 당업계에 잘 알려져 있다(Molecules. 2020 Jan; 25(1):3; Int J Mol Sci. 2017 Aug; 18(8):1683).
이러한 압타머는 SELEX 기술 등 당업계에 공지된 방법에 따라 임의의 표적분자에 대해 새로이 선별, 증폭, 분리·정제하거나 화학적으로 합성하여 사용할 수 있고, 필요에 따라서는 아래 표 1과 제시된 바의, 기존에 알려진 공지 서열의 압타머를 이용할 수도 있다.
표적분자와 RNA 압타머의 서열
표적분자 Aptamer sequence(5’ → 3’) 서열번호
AMPA receptor GluR2Qflip GGGCGAAUUCAACUGCCAUCUAGGCAGUAACCAGGAGUUAGUAGGACAAGUUUCGUCC 1
CD4 CUCAGACAGAGCAGAAACGACAGUUCAAGCCGAA 2
CTLA-4 GGGAGAGAGGAAGAGGGAUGGGCCGACGUGCCGCAACUUCAACCCUGCACAACCAAUCCGCCCAUAACCCAGAGGUCGAUAGUACUGGAUCCCCCC 3
EGFR(E07) UGCCGCUAUAAUGCACGGAUUUAAUCGCCGUAGAAAAGCAUGUCAAAGCCG 4
GCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGCp3 5
EGFR(J18) GGCGCUCCGACCUUAGUCUCUGCAAGAUAAACCGUGCUAUUGACCACCCUCAACACACUUAUUUAAUGUAUUGAACGGACCUACGAACCGUGUAGCACAGCAGA 6
EGFRvIII(E17) ACCAAAAUCAACGCAAAGAGCGCGCCUGCACGUCACCUCA 7
Erythrocyte membrane protein1(PfEMP1) GGGAAUUCGACCUCGGUACCAACAAUACGACUACACCAUCAAAAGUAUUAUCUUGCAUCGAAGGUUGGCGUAGCAAGCUCUGCAGUCG 8
gp120 GGGAGACAAGACUAGACGGUGAAUGUGGGCCACGCCCGAUUUUACGCUUUUACCCGCACGCGAUUGGUUUGUUUCCC 9
HER2 AGCCGCGAGGGGAGGGAAGGGTAGGGCGCGGCT 10
HER3 GGGAAUUCCGCGUGUGCCAGCGAAAGUUGCGUAUGGGUCACAUCGCAGGCACAUGUCAUCUGGGCGGUCCGUUCGGGAUCCUC 11
Human keratinocyte growth factor CCCAGGACGAUGCGGUGGUCUCCCAAUUCUAAACUUUCUCCAUCGUAUCUGGG 12
GGGAGGACGAUGCGGUGGUCUCCCAAUUCUAAACUUUCUCCAUCGUAUCUGGGCAGACGACUCGCCCGA 13
L-selectin UAACAACAAUCAAGGCGGGUUCACCGCCCCAGUAUGAGUA 14
Neruotensin-1(NTS-1) ACAGATACGGAACTACAGAGGTCAATTACGGTGGCCACGC 15
NF-κB CAUACUUGAAACUGUAAGGUUGGCGUAUG 16
Phosphatidylcholine: cholesterol liposomes GGGAUCUACACGUGACUGACUUACGAGACUGUCUCGCCAAUUCCAGUGGGCCUGCGGAUCCU 17
PSMA(A10) GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCAGACUCGCCCGA 18
Raf-1 GGGAGAUCGAAUAAACGCUCAAUUUGCCUCGACGGUCUGCGAAUAGAACGCGAACCGUGAUUAGUGUACAAGGAUUCGGUUUUCGACAUGAGGCCCCUGCAGGGCG 19
RET receptor tyrosine kinase GCGCGGGAATAGTATGGAAGGATACGTATACCGTGCAATCCAGGGCAACG 20
TCF-1 GGGGAGCUCGGUACCGGUGCGAUCCCCUGUUUACAUUGCAUGCUAGGACGACGCGCCCGAGCGGGUACCGAUUGUGUCGUCGGAAGCUUUGCAGAGGAUC 21
Tenascin-C(AptamerTTA1) GGGAGGACGCGUCGCCGUAAUGGAUGUUUUGCUCCCUG 22
TGF-β type III receptor GGGCCAGGCAGCGAGAGAUAAGCAGAAGAAGUAUGUGACCAUGCUCCAGAGAGCAACUUCACAUGCGUAGCCAAACCGACCACACGCGUCCGAGA 23
Tumor necrosis factor superfamily member 4-1BB GGGAAGAGAGGAAGAGGGAUGGGCGACCGAACGUGCCCUUCAAAGCCGUUCACUAACCAGUGGCAUAACCCAGAGGUCGAUAGUACUGGUCCCCCC 24
Tumor necrosis factor superfamily member OX40 GGGAGGACGATGCGGCAGUCUGCAUCGUAGGAAUCGCCACCGUAUACUUUCCCACCAGACGACUCGCUGAGGAUCCGAGA 25
VEGF CGGAAUCAGUGAAUGCUUAUACAUCCG 26
Wilms tumor protein(WT1) GAUAUGGUGACCACCCCGGC 27
αvβ3 integrin GGGAGACAAGAAUAAACGCUCAAUUCAACGCUGUGAAGGGCUUAUACGAGCGGAUUACCCUUCGACAGGAGGCUCACAAAAGGC 28
β-catenin GGACGCGUGGUACCAGGCCGAUCUAUGGACGCUAUAGGCACACCGGAUACUUUAACGAUUGGCUAAGCUUCCGCGGGGAUC 29
MUC1(DNA) GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG 30
EpCAM GCGACUGGUUACCCGGUCG 31
BAFF GGGAGGACGAUGCGGGAGGCUCAACAAUGAUAGAGCCCGCAAUGUUGAUAGUUGUGCCCAGUCUGCAGACGACUCGCCCGA′ 32
Endothelial Integrin Alpha-V Beta-3 UUCAACGCUGUGAAGGGCUUAUACGAGCGGAUUACCC 33
Osteopontin CGGCCACAGAAUGAAAAACCUCAUCGAUGUUGCAUAGUUG 34
Receptor Tyrosine Kinase(RET) Mutant(D4) GCGCGGGAAUAGUAUGGAAGGAUACGUAUACCGUGCAAUCCAGGGCAACG 35
PSMA Aptamer(A10-3) GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGC 36
P-Selectin ACGCUCAACGAGCCAGGAACAUCGACGUCAGCAAACGCGAGCGCAACCAGUAACACC' 37
Carcinoembryonic Antigen Aptamer GCGGAAGCGUGCUGGGCUAGAAUAAUAAUAAGAAAACCAGUACUUUCGU' 38
본 발명에서, 뉴클레오시드 유사 항암제는 대사길항제(antimetabolites)로 분류되는 항암제로, 생체 내에서 그 삼인산 형태로 변형되어 뉴클레오티드와 같이 RNA나 DNA에 통합됨으써 그 RNA나 DNA 합성 효소의 활성을 저해할 수 있는 항암제를 말한다. 이러한 항암제로서 젬시타빈(Gemcitabine), 플루다라빈(Fludarabine), 시타라빈(Cytarabine), 클라드리빈(Cladribine), 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil), 카페시타빈(Capecitabine), 펜토스타틴(Pentostatin), 아데포비어(Adefovir), 시도피비어(Cidofovir), 도시플루리딘(Doxifluridine), 에노시타빈(Enocitabine), 플록스유리딘 (Floxuridine), 인산 플루다라빈(Fludarabine Phosphate) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이러한 뉴클레오시드 유사 항암제는 본 발명에서 표적분자를 특이적으로 인식하여 결합하는 압타머에, 그 압타머의 표적분자에 대한 특이적 결합능을 저해하지 않는 한, 한 분자 이상(one or more moleculs) 본래의 뉴클레오티드를 대체하거나 대체하지 않고 부가 삽입되어 통합될 수 있다. 압타머의 표적분자에 대한 특이적 결합능을 저해하지 않으면서 그 압타머에 통합되는 예로, 한 분자 이상의 젬시타빈이, 일인산 형태로 압타머의 표적분자와의 결합 부위 또는 비결합 부위의 하나 이상의 CTP를 대체하여 통합되거나, 한 분자 이상의 5-플루오로우라실이 일인산 형태로 압타머의 표적분자와의 결합 부위 또는 비결합 부위의 하나 이상의 UTP를 대체하여 통합되거나, 또 여타 뉴클레오시드 유사 항암제가 일인산 형태로 한 분자 이상 압타머의 표적분자와의 결합 부위 또는 비결합 부위에서 본래의 뉴클레오티드를 대체하거나 본래의 뉴클레오티드를 대체하지 않고 부가 삽입되는 경우를 들 수 있다.
당업계에서 젬시타빈은 CTP를 대체하여 DNA나 RNA에 통합될 수 있고, 5-플루오로우라실은 TTP나 UTP를 대체하여 DNA나 RNA에 통합될 수 있으며(Mol Ther Nucleic Acids. 2017;6:80-88), 또 플루다라빈(Fludarabine), 시타라빈(Cytarabine), 클라드리빈(Cladribine) 등도 각각 ATP, CTP, ATP를 대체하여 DNA나 RNA에 통합될 수 있음이 알려져 있다(Oncogene 22, 7524-7536, 2003; Oncogene 27, 6522-6537, 2008).
이러한 뉴클레오시드 유사 항암제의 압타머에의 통합은 압타머를 화학적으로 합성하는 과정을 통해 이루어지거나 변형 뉴클레오티드를 압타머에 통합시킬 수 있는 돌연변이 폴리머라제를 이용하여 이루어질 수 있다. 그러한 돌연변이 폴리머라제로서 RNA 압타머 합성에 이용될 수 있는 돌연변이 T7 폴리머라제 Y639F, 돌연변이 T7 폴리머라제 Y639F/H784A, 돌연변이 T7 폴리머라제 H784A 등이 당업계에 공지되어 있으며(Science, 286:2305-2308, 1999; Nucleic Acids Res30(24):e138, 2002; Nucleic Acids Res. 2015 Sep 3; 43(15):7480-7488), 이러한 돌연변이 T7 폴리머라제를 이용한 키트 예컨대 DuraScribe® T7 transcription kit(Epicentre Biotechnologies), T7 R&DNA™ Polymerase(Lucigen), MAXIscript™ T7 Transcription Kit(ThermoFisher Scientific) 등이 시판되고 있다.
본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제에 있어서, 스템 루프 구조를 형성하는 단일가닥 핵산은 평면 염기(planer base) 사이에 한 분자 이상의 인터칼레이터 항암제를 탑재하거나 그 이중가닥의 마이너(minor) 또는 메이저(major) 그루브(groove)에 결합할 수 있는 그루브 결합 항암제(groove binders as anticancer drugs)를 탑재할 수 있다.
인터칼레이터 항암제로서 대표적으로 안트라사이클린 계열의 항암제(anthracycline compound)를 들 수 있는데, 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 닥티노마이신(dactinomycin), 악티노마이신(actinomycin), 마이토잔트론(mitoxantrone), 에피루비신(epirubicin) 등이 이러한 안트라사이클린 계열의 항암제이다. 인터칼레이터 항암제는 이중가닥의 평면 염기 사이에 삽입되어 DNA의 구조적 변화를 일으킴으로써 DNA 복제, 전사, DNA 수복 과정을 억제하여 암세포 사멸을 억제하는 기전을 갖는다.
이러한 인터칼레이터 항암제는 특히 GC가 반복되는 서열 부위에 잘 끼어들어 가는 특성을 갖기 때문에, 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제에서 스템 루프 구조를 형성하는 단일가닥 핵산은 d(GC)-L-d(CG)로 일반화될 수 있는 서열을 가진다. 여기서 스템 구조를 형성하는 GC 영역인 d(GC) 또는 d(CG)에서 d는 1 이상, 바람직하게는 2 이상의 정수이며, 더 바람직하게는 2 이상 50 이하의 정수이다. 루프 영역을 형성하는 L은 2개 이상의 뉴클레오티드로 구성되며, 바람직하게는 3~10개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 상기 스템 루프 구조를 형성하는 단일가닥 핵산은 DAN 단일가닥 핵산, RNA 단일가닥 핵산일 수 있고, 상기 올리고뉴클레오티드의 스페이서와 같이 뉴클레아제나 열에 안정한 PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid), HNA(Hexitol Nucleic Acids), ANA(Altritol Nucleic Acids), MNA(Mannitol Nucleic Acids) 등일 수 있으며, 또 상기 압타머에서와 같이 생체 내 반감기 향상을 위하여 당, 포스페이트 및/또는 염기에서 변형된 것일 수도 있다.
그루브 결합 항암제는 마이너 그루브 결합 항암제와 메이저 그루브 결합 항암제로 구분될 수 있는데, 이 중 마이너 그루브 결합 항암제로서는 디스타마이신 A(Distamycin A), 탈리머스틴(Tallimustine), PNU-145156E, 브로스탈린(Brostallicin) 등의 디스타마이신 유도체, CC-1065, 아도젤레신(Adozelesin), 카르젤레신(Carzelesin), 비젤레신(Bizelesin) 등의 CC-1065의 유도체, 두카마이신 A(Ducarmycin A), 두카마이신 SA(Ducarmycin SA), KW-2189 등의 두카마이신 유도체, 이로풀벤(Irofulven), 트라벡데딘(Trabectedin, ET-743) 등을 들 수 있으며, 이러한 마이너 그루브 결합 항암제 중 디스타마이신 A 등 대부분은 정전기적 상호작용(electrostatic interaction)이나 반 더 왈스 상호작용(van der Waals interactions)에 의해 비공유결합으로 DNA와 결합하지만, 친전자성 그룹을 갖는 CC-1065, 두카마이신 A, 이로풀벤, 트라벡데딘 등 일부는 DNA 알킬화(DNA alkylation)에 의해 공유결합으로 DNA와 결합한다. 마이너 그루브 결합 항암제와 관련해서 더 구체적인 것은 문헌Cancer Treatment Reviews 35 (2009) 437-.450, 문헌Medchemcomm, 12 Dec 2018, 10(1):26-40, 문헌Beilstein J Org Chem. 2018; 14: 1051-1086, 문헌Arh Hig Rada Toksikol 2013;64:593-602, 문헌Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1996, 35, 1438-1474 등을 참조할 수 있다.
메이저 그루브 결합 항암제로서는 노갈마이신(nogalamycin), 디터칼니늄 비스-나프탈리미드(ditercalinium bis-naphthalimides), 아미노글리코시드(Aminoglycoside) 등을 들 수 있으며, 이들도 비공유결합 또는 공유결합으로 DNA와 결합한다. 예컨대 아미노글리코시드는 그 친전자성 그룹을 가지고 있어 DNA의 퓨린 염기의 친핵성 N-7와 반응하여 공유결합을 형성한다.
본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 생체 내 안정성, 반감기의 향상을 위하여 페길화(PEGylation)될 수 있다. 페길화되는 부위는 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제에서 그 한쪽 단부 또는 양쪽 단부에 압타머가 위치한 경우 그 압타머의 노출된 말단(즉 5' 말단 및/또는 3' 말단)일 수 있다.
페길화는 그 화화식이 H(OCH2CH2)nOH(n은 4이상인 정수)인 폴리에틸렌글리콜이나 그 유도체에 의해 이루어질 수 있다.
페길화에 이용되는 폴리에틸렌글리콜이나 그 유도체는 의도한 생체 내 안정성, 반감기를 나타낼 수 있는 한 그 분자량에 특별한 제한이 없다. 페길화는 일반적으로는 0.2-50 kDa, 0.5-50 kDa 또는 10-45 kDa 범위의 분자량를 갖는 폴리에틸렌글리콜이나 그 유도체에 의해 이루어질 것이다.
본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제는, 그 한쪽 단부 또는 양쪽 단부 압타머가 위치한 경우 그 압타머의 생체 내 뉴클레아제에 의한 분해를 방지함으로써 생체 내 안정성을 향상시키기 위하여 그 압타머의 5' 말단 또는 3' 말단의 뉴클레오티드가 LNA(Locked Nucleic Acid 또는 bridged nucleic acid, 말단 뉴클레오티드의 2'O와 4C가 연결된 형태의 핵산)이거나 idT(inverted deoxythymidine) 형태이거나, 2'-메톡시 뉴클레오시드, 2'-아미노 뉴클레오시드 또는 2'F-뉴클레오시드를 갖는 형태이거나 아민 링커, 티올 링커, 콜레스테롤 등으로 화학적 수식된 것일 수 있다.
본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제에서, 제1 또는 제2의 압타머, 세포독성 항암제, 스템 루프 구조를 형성하는 단일가닥 핵산은 아민기(amine group), 카르복시기(carboxyl group), 티올기(sulfhydryl group), 인산기(phosphate group), 히드록시기(hydroxyl group) 등을 통해 공유적으로 결합할 수 있다. 이러한 결합은 압타머, 세포독성 항암제, 스템 루프 구조가 본래 가지고 있던 작용기를 통해 이루어지거나 이러한 작용기와 결합할 수 있는 링커를 매개로 이루어질 수 있다. 예컨대 뉴클레오시드 유사 항암제가 압타머에 통합될 때 이 항암제의 압타머에의 통합은 링커의 매개없이 이들이 본래 가지고 있던 작용기를 통해 통합된다. 또 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제가 압타머와 스템 루프 구조를 형성하는 단일가닥 핵산이 결합된 형태를 가질 경우 압타머와 스템 루프 구조를 형성하는 단일가닥 핵산은 링커의 매개없이 이들이 본래 가지고 있던 작용기를 통해 결합될 수도 있다.
본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제에 있어서, 제1 또는 제2의 압타머, 세포독성 항암제, 스템 루프 구조를 형성하는 단일가닥 핵산은, 이들이 본래 가지고 있던 작용기를 통해 결합할 수도 있지만 링커를 매개로 결합할 수도 있다.
이러한 링커의 작용기는 아이소티오시아네이트(isothiocyanate), 아이소시아네이트(isocyanates), 아실 아자이드(acyl azide), NHS 에스터(NHS ester), 설포닐 클로라이드(sulfonyl chloride), 알데하이드(aldehyde), 글리옥살(glyoxal), 에폭사이드(epoxide), 옥시레인(oxirane), 칼보네이트(carbonate), 아릴 할라이드(aryl halide), 이미도에스터(imidoester), 카보이미드(carbodiimide), 안하이드라이드(anhydride), 플루오로페닐 에스터(fluorophenyl ester), 히드록시메틸포스핀(hydroxymethyl phosphine), 말레이미드(maleimide), 할로아세틸(haloacetyl), 피리딜디설파이드(pyridyldisulfide), 티오술포네이트(thiosulfonate), 또는 비닐술폰(vinylsulfone) 등일 수 있다.
링커는 프로테아제에 의해서 절단 가능하거나, 산이나 염기 조건에서 절단 가능하거나, 고온이나 광조사에 의해서 절단 가능하거나 또는 환원 또는 산화 조건에서 절단 가능한 링커일 수 있고, 또는 이러한 조건들에서 절단 가능하지 않은 링커일 수도 있다.
절단 가능한 링커로서는 예컨대 산성 조건에서 절단되는 히드라존(hydrazone) 링커, 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 링커, 환원 조건에서 절단되는 디설파이드(disulfide) 작용기를 갖는 링커 등을 들 수 있고, 절단 가능하지 않은 링커로서는 MCC(Maleimidomethyl cyclohexane-1-carboxylate) 링커, MC(maleimidocaproyl) 링커, 또는 그 유도체로서 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(sMCC) 링커나 설포석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(sulfo-sMCC)를 들 수 있다.
또한 링커는 자가 희생 링커(self-immolative linker) 또는 절단 후 흔적을 남기지 않는 링커(traceless linker)일 수 있다. 자가 희생 링커는 예컨대 발명의 명칭이 "Hydrophilic self-immolative linkers and conjugates thereof "인 미국 특허 제9,089,614호에 개시된 링커, 명칭이 "SELF-IMMOLATIVE LINKERS CONTAINING MANDELIC ACID DERIVATIVES, DRUG-LIGAND CONJUGATES FOR TARGETED THERAPIES AND USES THEREOF"인 국제공개 제WO2015038426호에 개시된 링커를 들 수 있으며, 절단 후 흔적을 남기지 않는 링커로서는 페닐하이드라지드 링커, 아릴-트리아젠 링커, 문헌Blaney, et al., "Traceless solid-phase organic synthesis," Chem Rev. 102: 2607-2024 (2002)에 개시된 링커 등일 수 있다.
또한 링커는 동종 이작용성 링커(둘 이상의 동일한 반응성 작용기를 갖는 링커) 또는 이종 이작용성 링커(둘 이상의 서로 다른 반응성 작용기를 갖는 링커)일 수도 있다.
동종 이작용성 링커는 예컨대 3'3'-디티오비스(설포석신이미딜 프로피오네이트(DTSSP), 디석신이미딜 수베레이트(DSS), 비스(설포석신이미딜)수베레이트(BS), 디석신이미딜 타르트레이트(DST), 디설포석신이미딜 타르트레이트(설포 DST), 에틸렌 글리코비스(석신이미딜석시네이트)(EGS), 디석신이미딜 글루타레이트(DSG), N,N'-디석신이미딜 카보네이트(DSC), 디메틸 아디피미데이트(DMA), 디메틸 피멜리미데이트(DMP), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 1,4-디-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도)부탄(DPDPB), 비스말레이미도헥산(BMH), 아릴 할로겐화물 함유 화합물(DFDNB), 비스말레이미도헥산(BMH), 아릴 할로겐화물 함유 화합물(DFDNB), 비스-β-(4-아지도살리실아미도)에틸디설파이드(BASED), 포름알데하이드, 글루타르알데하이드, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르, 아디프산 디하이드라지드, 카르보하이드라지드, o-톨루이딘, 3,3'-디메틸벤지딘, 벤지딘, α,α'-p-디아미노디페닐, 디아이오도-p-자일렌 설폰산, N,N'-에틸렌-비스(아이오도아세트아미드), N,N'-헥사메틸렌-비스(아이오도아세트아미드) 등을 들 수 있다.
이종 이작용성 링커는 아민 반응성 및 설프하이드릴 반응성 교차-링커, 카르보닐 반응성 및 설프하이드릴 반응성 교차 링커, 아민 반응성 및 광반응성 교차 링커, 설프하이드릴 반응성 및 광반응성 교차 링커 등을 들 수 있는데, 아민 반응성 및 설프하이드릴 반응성 교차-링커로서는 예컨대 N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(sPDP), 장쇄 N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(LC-sPDP), 수용성-장쇄 N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(설포-LC-sPDP), 석신이미딜옥시카르보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔(sMPT), 설포석신이미딜-6-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루아미도헥사노에이트(설포-LC-sMPT), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(sMCC), 설포석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(설포-sMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르(MBs), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포석신이미드 에스테르(설포-MBs), N-석신이미딜(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(sIAB) 등을 들 수 있고, 카르보닐 반응성 및 설프하이드릴 반응성 교차 링커로서는 예컨대 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 하이드라지드(MPBH), 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실-하이드라지드-8(M2C2H), 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 하이드라지드(PDPH) 등을 들 수 있고, 아민-반응성 및 광반응성 교차-링커로서는, 예컨대 N-하이드록시석신이미딜-4-아지도살리실산(NHs-AsA), N-하이드록시설포석신이미딜-4-아지도살리실산(설포-NHs-AsA), 설포석신이미딜-(4-아지도살리실아미도)헥사노에이트(설포-NHs-LC-AsA), 설포석신이미딜-2-(ρ-아지도살리실아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAsD), N-하이드록시석신이미딜-4-아지도벤조에이트(HsAB), N-하이드록시설포석신이미딜-4-아지도벤조에이트(설포-HsAB), N-석신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(sANPAH), 설포석신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(설포-sANPAH), N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시석신이미드(ANB-NOs) 등을 들 수 있으며, 설프하이드릴 반응성 및 광반응성 교차 링커로서는 예컨대, 1-(ρ-아지도살리실아미도)-4-(아이오도아세트아미도)부탄(AsIB), N-4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미드(APDP), 벤조페논-4-아이오도아세트아미드, 벤조페논-4-말레이미드 등을 들 수 있다.
일부 양태에 있어서, 링커는 수지 유형(dendritic type)의 링커이다. 수지 유형 링커는 분지형, 다기능성 연결부를 가지며, 그러한 링커로서는 예컨대 PAMAM 덴드리머를 들 수 있다.
당업계에서는 상기 예시한 바의 링커 이외에도 본 발명에 적용 가능한 수많은 링커가 상당한 수의 문헌을 통해 공지되어 있다. 그러한 문헌으로서 구체적으로 문헌Castaneda, et al, "Acid-cleavable thiomaleamic acid linker for homogeneous antibodydrug conjugation," Chem Commun. 49: 8187-8189 (2013), 문헌Lyon, et al, "Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates," Nat Biotechnol. 32(10):1059-1062 (2014), 문헌Dawson, et al "Synthesis of proteins by native chemical ligation," Science 1994, 266, 776-779, 문헌Dawson, et al "Modulation of Reactivity in Native Chemical Ligation through the Use of Thiol Additives," J Am Chem Soc. 1997, 119, 4325-4329 문헌Hackeng, et al "Protein synthesis by native chemical ligation: Expanded scope by using straightforward methodology," Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96, 10068-10073, 문헌Wu, et al "Building complex glycopeptides: Development of a cysteine-free native chemical ligation protocol," Angew Chem Int Ed 2006, 45, 4116-4125, 문헌Geiser et al "Automation of solid-phase peptide synthesis" in Macromolecular Sequencing and Synthesis, Alan R Liss, Inc, 1988, pp 199-218, 문헌Fields, G and Noble, R (1990) "Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids", Int J Peptide Protein Res 35:161-214 등이나, 미국 특허 제6,884,869호, 미국 특허 제7,498,298호, 미국 특허 제8,288,352호, 미국 특허 제8,609,105호, 미국 특허 제8,697,688호, 미국 특허공개 제2014/0127239호, 미국 특허공개 제2013/028919호, 미국 특허공개 제2014/286970호, 미국 특허공개 제2013/0309256호, 미국 특허공개 제2015/037360호, 미국 특허공개 제2014/0294851호, 국제 특허공개 WO2015057699, 국제 특허공개 WO2014080251, 국제 특허공개 제WO2014197854, 국제 특허공개 WO2014145090, 국제 특허공개 WO2014177042 등을 참조할 수 있다.
본 발명에서 세포독성 항암제는 대사길항제(Antimetabolites), 미세관(microtubulin) 표적화제(Tubulin polymerase inhibitor 및 Tubulin depolymerisation), 알킬화제(Alkylating agents), 유사분열 억제제(Antimitotic Agents), DNA 절단제(DNA cleavage agent), DNA 가교제(DNA cross-linker agent), DNA 인터컬레이터제(DNA intercalator agents), DNA 토포아이소머라아제 억제제(DNA topoisomerase inhibitor) 등으로 대별될 수 있는데, 대사길항제로서는 메토트렉세이트(Methotrexate) 등의 폴산(Folic acid) 유도체, 클라드리빈(Cladribine) 등의 퓨린(Purine) 유도체, 아자시티딘(Azacitidine) 등의 피리미딘(pyrimidine) 유도체, 독시플루리딘(Doxifluridine), 플루오로우라실(Fluorouracil) 등이 당업계에 공지되어 있고, 미세관 표적화제로서는 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE), 모노메틸아우리스타틴 F(MMAF), 돌라스타틴 등의 아우리스타틴 계열의 약물, 메이탄신(Maytansines) 등이 당업계에 공지되어 있으며, 알킬화제로서는 부설판(Busulfan), 트레오설판(Treosulfan) 등의 알킬 설포네이트(Alkyl Sulfonate) 제제, 벤다머스틴(Bendamustine) 등의 니트로젠 머스타드(Nitrogen Mustard) 유도체, 시스플라틴(Cisplatin), 헵타플라틴(Heptaplatin) 등의 플라티늄(Platinum) 제제 등이 당업계에 공지되어 있다. 또 유사분열 억제제(Antimitotic Agents)로서는 도세탁셀(Docetaxel), 파크리탁셀(Paclitaxel) 등의 탁산(Taxane) 제제, 빈플루닌(Vinflunine) 등의 빈카 알칼리드(Vinca alkalids), 에토포시드(Etoposide) 등의 포도필로톡신(Podophyllotoxin) 유도체 등이 당업계에 공지되어 있고, DNA 절단제(DNA cleavage agent)로서는 칼리채미신(Calicheamicins) 등이 공지되어 있으며, DNA 가교제(DNA cross-linker agent)로서는 PBD 이중체 등이 공지되어 있다. 또 DNA 인터컬레이터제로서는 독소루비신 등이 당업계에 공지되어 있으며 DNA 토포아이소머라아제 억제제로서는 SN-28 등이 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 이를 포함하는 입자 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제가 입자 형태로 제조될 경우, 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제가 포함된 입자는 중합체성 입자(polymeric particles), 지질 입자(lipid particles), 고형 지질 입자(solid lipid particles), 무기 입자(inorganic particles), 또는 이들의 조합(예컨대, 지질 안정화된 중합체성 입자(lipid stabilized polymeric particles))일 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 입자는 중합체성 입자이거나 또는 중합체성 매트릭스(polymeric matrix)를 포함한다.
상기 입자는 하나 이상의 생체분해성 중합체를 포함할 수 있다. 생체분해성 중합체는 체내에서 수용해성 물질로 화학적으로 또는 효소로 전환되는 수불용성 또는 수난용성인 중합체일 수 있다.
입자 내의 생체분해성 중합체는 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리알킬렌, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리비닐 할로겐화물, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글리콜리드, 폴리실록산, 폴리우레탄, 이들의 공중합체 등일 수 있다.
또 입자 내의 생체분해성 중합체는 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 등의 알킬 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스 등의 하이드록시알킬 셀룰로스, 셀룰로스 에테르, 셀룰로스 에스테르, 니트로 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 설페이트 나트륨 염 등일 도 있다.
또 입자 내의 생체분해성 중합체는 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸메타크릴레이트, 폴리부틸메타크릴레이트, 폴리이소부틸메타크릴레이트 등의 아크릴산 및 메타크릴산 에스테르의 중합체, 이들의 선형 또는 분지형 공중합체, 블록 공중합체 등일 수도 있다.
또 입자 내의 생체분해성 중합체는 폴리에스테르, 폴리오르토에스테르, 폴리에틸렌이민, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시알카노에이트, 폴리하이드록시발레레이트, 폴리아크릴산, 폴리글리콜리드 등일 수도 있다.
상기 입자는 하나 이상의 친수성 중합체를 포함할 수 있다. 친수성 중합체는 전분, 폴리사카라이드, 친수성 폴리펩티드, 폴리-L-글루탐산(PGS), 폴리-L-아스파르트산 등의 폴리아미노산, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 등의 폴리알킬렌글리콜, 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 등의 폴리알킬렌옥사이드, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리올레핀성 알콜 등일 수 있다.
상기 입자는 하나 이상의 소수성 중합체를 포함할 수 있다. 소수성 중합체는 폴리락트산, 폴리글리콜산 등의 폴리하이드록시산, 폴리3-하이드록시부티레이트 등의 리하이드록시알카노에이트, 폴리카프로락톤, 티로신 폴리카보네이트 등의 폴리카보네이트, 폴리아미드, 폴리펩티드, 폴리에스테르아미드, 폴리우레탄 등일 수 있다. 바람직하게는 상기 소수성 중합체는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 또는 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic acid-co-glycolic acid)) 등이다.
상기 입자는 하나 이상의 양쪽성 중합체를 포함할 수 있다. 양쪽성 중합체는 소수성 중합체 블록 및 친수성 중합체 블록으 구성될 수 있다. 상기 소수성 중합체 블록은 상기 소수성 중합체 또는 이의 유도체 또는 공중합체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 친수성 중합체 블록은 상기 친수성 중합체 또는 이의 유도체 또는 공중합체 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 입자는 하나 이상의 중성이나 음이온성 지질, 양이온성 지질, 고형 지질 또는 양쪽성 화합물을 포함할 수 있다.
상기 중성이나 음이온성 지질로서는 콜레스테롤, 인지질, 라이소지질, 페길화된 지질일 수 있으며, 1,2-디아실-글리세로-3-포스포콜린을 포함하는 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 스핑고미엘린, 세라미드 갈락토피라노사이드, 강글리오사이드, 1,2-디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 1,2-디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC), 1,2-디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC) 등일 수 있다.
상기 양이온성 지질로서는 디메틸디옥타데실 암모늄 브로마이드(DDAB), 1,2-디아실옥시-3-트리메틸암모늄 프로판, N-1-(2,3-디올로일옥시)프로필-N,N-디메틸 아민(DODAP), 1,2-디아실옥시-3-디메틸암모늄 프로판, N-1-(2,3-디올레일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 1,2-디알킬옥시-3-디메틸암모늄 프로판, 디옥타데실아미도글리실스페르민(DOGS) 등일 수 있다.
상기 고형 지질로서는 고도로 포화된 알콜, 지방족 알콜, 스테아르산, 팔미트산, 데칸산 등의 고급 지방산, 스핑고지질, 합성 에스테르, 고도로 포화된 지방산의 모노-, 디-, 트리글리세리드일 수 있다.
상기 양쪽성 화합물은 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 포스파티딜리노시톨, 리소포스파티딜 유도체, 카르디올리핀 등일 수 있다.
상기 지질 입자는 이중층으로 배열된 지질로 둘러싸인 수성 매질로 구성된 구형의 작은 소낭인 리포좀일 수 있다. 리포좀은 친수성 약물을 수성 내부에서 또는 소수성 제제를 상기 이중층 내에 포함한다.
상기 지질 입자는 지질 미셀(lipid micelles)일 수 있다. 약물 전달용 지질 미셀이 당업계에 공지되어 있다. 지질 미셀은, 예를 들면, 지질 계면활성제를 갖는 유중수 에멀젼으로서 형성될 수 있다. 지질 미셀은 일반적으로, 소수성 약물을 전달하는데 유용하다.
상기 지질 입자는 고형 지질 입자일 수 있다. 고형 지질 입자는 실온에서 고형인 지질로 형성되며, 이 고형 지질 입자는 고형 지질을 사용하여 수중유 에멀젼으로부터 얻어질 수 있다.
이러한 중합체성 입자, 지질 입자는 당업계에 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 예컨대 중합체성 입자는 분무 건조, 계면 중합, 고온 용융 캡슐화, 상 분리 캡슐화(자발적 에멀젼 마이크로캡슐화, 용매 증발 마이크로캡슐화, 및 용매 제거 마이크로캡슐화), 코아세르베이션, 저온 마이크로구체 형성, 상 전이 나노캡슐화, 에멀젼, 나노 침전 등의 방법으로 제조될 수 있다. 또 예컨대 지질 입자는 고압 균질화 기술, 초임계 유체 방법, 에멀젼 방법, 용매 확산 방법, 분무 건조 등의 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 입자의 제조 방법과 관련하여 구체적인 것은 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.(ed.),(1980) 등을 참조할 수 있다.
상기 입자의 크기는 의도하는 효과를 위해 조절할 수 있다. 상기 입자는 나노입자 또는 마이크로입자일 수 있지만, 나노입자가 바람직하다. 상기 입자는 약 10 nm 내지 약 10 ㎛, 약 10 nm 내지 약 1 ㎛, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 20 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 25 nm 내지 약 250 nm의 직경을 가질 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 입자는 약 25 nm 내지 약 250 nm의 직경을 갖는 나노입자이다.
특히 약물 전달체로서의 나노 입자는 혈행 중 정상혈관을 통과할 수 없을 정도로 커야 하며 동시에 대식세포의 포식을 피할 수 있을 만큼 작아야 한다. 비장의 동양혈관(sinusoid)와 간에 위치하는 쿠퍼세포(Kupffer's cell)의 페네스트라(fenestra)의 크기는 150~200 nm 사이이며, 종양에 분포하는 혈관의 내피세포 간의 간격은 100~600 nm 사이이다. 따라서 이러한 특징적인 두 가지 종류의 혈관 구조를 통과하여 종양에 도달하기 위해서는 나노 입자의 크기가 100 nm 미만인 것이 바람직하다.
또 입자는 소수성 표면을 가질 경우 혈액에서 피브로넥틴(fibronectin), 보체(complement), IgG 등과 같은 혈장단백들이 달라붙게 되며(opsonization) 이들(opsonins)은 다시 세망내피계(reticulo-endothelial system)의 대식세포에 의하여 인지되어 결과적으로 나노 입자는 포식, 제거되게 된다. 따라서 입자 표면을 친수성으로 만드는 것이 바람직한데, 친수성으로 만드는 방법에 두 가지 방법이 있ㄷ다. 하나는 폴리에틸렌글리콜(PEG)와 같은 친수성 폴리머로 나노 입자의 표면을 덮어주거나, 소수성 및 친수성을 가진 양친성 블록 공중합체(copolymer)를 이용하여 마이셀(micelle) 형태의 나노 입자를 만들어 표면에 친수성 폴리머가 위치하도록 하는 것이다.
본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합되어 동결건조된 형태 또는 수용액의 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 본 발명의 제형에 포함되는 함량 또는 농도에서 그 유효성분인 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제의 약효나 생물학적 활성 또는 특성을 저해하지 않은 성분으로, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 등의 유기산을 포함하는 완충액, 아스코르브산 및 메티오닌 등의 항산화제, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 시클로헥사놀, 3-펜타놀, m-크레졸 등의 보존제, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린 등의 단백질, 폴리비닐피롤리돈 등의 중합체, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 라이신 등의 아미노산, 글루코오스, 만노오스, 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스, 소르비톨, 덱스트린 등의 당류, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 등의 킬레이트제, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 계면활성제 등일 수 있다. 특히 액상 용액으로 제제화되는 주사제 등의 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등일 수 있다.
상기 담체는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제, 바람직하게는 펩타이드 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여 방법을 이용하여 경구, 또는 피부, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 수막강 내, 심실 내, 폐, 경피, 피하, 복 내, 비강 내, 소화관 내, 국소, 설하, 질 내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구 투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산 (ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제 (antioxidants), 킬레이팅 물질 (chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제 (stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995) 등을 참조할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 2종 이상의 항암제를 복합으로 포함함으로써 복합 투여가 가능하고 또 표적 암세포에만 선택적으로 작용함으로써 항암제의 부작용은 줄일 수 있는 압타머 기반 표적화 복합 항암제를 제공할 수 있다.
도 1은 40k PEG-ApGemHER2-S-S-DM1(A) 반응용액을, HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 실시하여 Eclipse XDB-C18 column을 이용하여 분리를 진행하였고, binding buffer(95% 0.1M TEAA, 5% Acetonitrile)와 elution buffer(50% 0.1M TEAA, 50% Acetonitrile)의 gradient를 통해 분리한 결과(a)이고, 그 중에서 40k PEG-ApGemHER2-S-S-DM1(A) 구조체와 일치하는 피크(Fraction 6~9)를 분리하는 과정(b)를 나타낸 것이다.
도 2는 제조한 40k PEG-ApGemHER2-SH 및 정제된 40k PEG-ApGemHER2-S-S-DM1를 10 % (19:1) 폴리아크릴아미드 겔에서 분석한 결과(a)와 제조한 40k PEG-ApGemHER2-SH 및 정제된 40k PEG-ApGemHER2-S-S-DM1(A)의 각각 1mg를 UV/Vis 스펙트럼한 결과(b)를 나타낸 것이다.
도 3은 제조한 40k PEG-ApFdUEpCAM-SH 및 정제된 0k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-DM1(B)의 품질과 크기를 7M 우레아가 함유된 10 % (19:1) 폴리아크릴아미드 겔에서 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 40k PEG-ApGemHER2-SH 및 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-NH2(C)의 품질과 크기를 7M 우레아가 함유된 10 % (19:1) 폴리아크릴아미드 겔에서 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 HS-SL 영역-NH2와 40k PEG-ApFdUEpCAM-SH을 반응하여 제조한 복합체 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-SL 영역-NH2의 High Performance Liquid Chromatography(HPLC)를 실시한 결과이다.
도 6은 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-SH와 정제된 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-DM1(D)의 품질과 크기를 7M 우레아가 함유된 10% (19:1) 폴리아크릴아미드 겔에서 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-SH와 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-DM1(E)의 품질과 크기는 7M 우레아가 함유된 10% (19:1) 폴리아크릴아미드 겔에서 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 40k PEG-ApFdUEpCAM-SH, 40k PEG-ApGemHER2-SH 및 40k PEG-ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM-40k PEG(F)와 또 ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM 및 40k PEG-ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM-40k PEG(F)를 7M 우레아가 함유된 10 % (19:1) 폴리아크릴아미드 겔에서 분석한 결과이다.
도 9는 40K PEG, ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM 및 40k PEG-ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM-40k PEG(F) 반응용액을 High Performance Liquid Chromatography(HPLC)를 실시하여 Eclipse XDB-C18 column을 이용하여 분리를 진행하고, binding buffer(95% 0.1M TEAA, 5% Acetonitrile)와 elution buffer(50% 0.1M TEAA, 50% Acetonitrile)의 gradient를 통해 분리한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 분리 정제한 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-DM1(G), 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-PTX(H), 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAE(I) 및 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAF(J)의 HPLC를 수행하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAE(H)를 사용하여 DOX의 양에 따른 소광 현상을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 HER-2와 EpCAM이 과다 발현하는 MDA-MB-453 세포에 A, B, C, D와 E의 맞춤치료분자를 처리하여 세포 생존율을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 HER-2와 EpCAM이 과다 발현하는 MDA-MB-453 세포에서는 F, G, H, I와 J의 맞춤치료분자를 처리하여 세포 생존율을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 14 및 도 15은 약물 투여 시간 계획(도 14의 a)에 따라 대조군으로 DM1 및 비교군으로 단독 투여는 40k PEG-ApGemHER2-S-S-DM1(A)와 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-DM1(B), 그리고 혼합 투여는 A와 B의 혼합 약물을 HER-2와 EpCAM이 과다 발현하는 MDA-MB-453(도 14의 b), HER2와 EpCAM을 발현하지 않는 MDA-MB-231(도 15의 a) 및 HER2를 발현하지 않고 EpCAM이 과다 발현하는 MCF-71(도 15의 b)를 이식한 마우스에 투여하여 종양의 성장을 관찰한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 압타머 기반 표적화 복합 항암제 제조를 위한 구성분자의 제조
본 실시예에서 아래의 10개의 압타머 기반 표적화 복합 항암제를 제조하였다.
(1) 40k PEG-ApGemHER2-S-S-DM1(A),
(2) 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-DM1(B),
(3) 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역(C),
(4) 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-DM1(D),
(5) 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-SL 영역-S-S-DM1(E),
(6) 40k PEG-ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM-40k PEG(F),
(7) 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-DM1(G),
(8) 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-PTX(H),
(9) 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAE(I) 및
(10) 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAF(J)
상기 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 먼저 아래와 같이 그 구성분자들을 제조하고, 이들 구성분자를 결합시켜 제조하였다.
(i) 2'F-피리미딘(2'F-Pyrimidine)과 젬시타빈(Gemcitabine)이 구성요소로 포함하는 HER2 RNA 압타머로서 그 5' 말단에 40k PEG, 그 3' 말단에 티올기(-SH기)가 부가된 '40k PEG-ApGemHER2-SH', (ii) 헤어핀 구조(stem-loop 구조)를 갖는 작은 크기의 DNA 단편(SL 영역)의 한쪽 말단에 티올기, 다른 한쪽에 NH2이 부가된 'SH-SL 영역-NH2', (iii) 2'F-피리미딘과 5-FdU(5-Fluorouracil)을 구성요소로 포함하는 EpCAM RNA 압타머로서, 그 5' 말단에 40k PEG, 그 3'말단에 티올기가 부가된 'SH-ApFdUEpCAM-NH2', (iv) 2'F-피리미딘과 5-FdU(5-Fluorouracil)을 구성요소로 포함하는 EpCAM RNA 압타머로서, 그 5' 말단에 티올기, 그 3'말단에 -NH2가 부가된 'SH-ApFdUEpCAM-NH2'를 주문 제조하였다(미국 Biosynthesis 사).
상기 4가지 구성분자들의 화학 구조식을 아래에 나타내었다.
(i) 40k PEG-ApGemHER2-SH:
5'-PEG-AGC CGC GAG GGG AGG GAA GGG TAG GGC GCG GCT-SH-3'
상기 서열은 서열번호 39임
젬시타빈은 상기 모든 위치의 C 대신 삽입되어 있음
(ii) SH-SL 영역-NH2:
5'-SH-GCG CGC GCG AAA GCG CGC GC-NH2-3'
상기 서열은 서열번호 40임
(iii) 40k PEG-ApFdUEpCAM-SH:
5'-PEG-GGC GAC UGG UUA CCC GGU CG-SH-3'
상기 서열은 서얼번호 41임
5-FdU는 상기 모든 위치의 U 대신 삽입되어 있음
(iv) SH-ApFdUEpCAM-NH2:
5'-SH-GGC GAC UGG UUA CCC GGU CG-NH2-3'
상기 서열은 서열번호 42임
5-FdU는 상기 모든 위치의 U 대신 삽입되어 있음
상기 제조된 각 구성분자 100μmol를 0.1M triethylammonium acetate(TEAA) buffer에서 1.0M Dithiothreitol(DTT) 10μL와 상온에서 15분 동안 반응시켜, 5' 또는 3' 말단 티올기를 활성화시켰고, 또한 과량의 DTT를 제거하기 위하여 ethyl acetate를 이용하여 3회 이상 추출하였다. 상기 주문 제조한 구성분자들은 Dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 10mM stock으로 제조하였다.
본 실시예에서 HER2 압타머와 EpCAM 압타머는 상기 표 2에서 개시된, HER2를 표적분자로 하는 HER2 압타머(Varmira K. et al., Nucl Med Biol. 2013 Nov;40(8):980-6)와 EpCAM를 표적분자로 하는 EpCAM 압타머(Subramanian N, et al.(2015). PLoS ONE 10(7): e0132407. doi:10.1371/journal.pone.0132407)를 사용하였다.
본 실시예에서 압타머에 통합되는 뉴클레오시드 유사 항암제는 젬시타빈(Gemcitabine)과 5-FdU(2'-deoxy-5-fluoro-uridine)를 사용하였고, 인터칼레이터 항암제는 독소루비신(Doxorubicin)을 사용하였으며, 일반 세포독성 항암제는 PTX(Paclitaxel) MMAE(monomethyl auristatin E), MMAF(monomethyl auristatin F)와 DM1(Mertansine)를 사용하였다.
젬시타빈(Gemcitabine)은 유방암, 난소 암, 비소 세포 폐암, 췌장암 및 방광암 등 여러 종류의 암 치료에 사용되는 화학 요법 약물로서 친수성이며 세포 내로 운반되어 뉴클레오시드(nucleosides)가 된다. 세포에 들어간 후, 젬시타빈은 DCK(deoxycytidine kinase) 효소 작용에 의하여 인산염이 부가됨으로써 젬시타빈 일인산(gemcitabine monophosphate, dFdCMP)가 되고 이어서 2 개의 다른 인산염이 다른 효소 작용에 의해 부가된다. 이렇게 3 개의 인산염이 부가된 젬시타빈(gemcitabine triphosphate, dFdCTP)로 약리학적으로 활성화된 형태이다.
젬시타빈은 3 번 인산화된 후 시티딘(cytidine)으로 기능하여 세포 복제시 합성되는 새로운 DNA 가닥에 통합될 수 있게 된다. 젬시타빈이 DNA에 통합되면 하나의 뉴클레오티드가 더 부가된 후 DNA 중합효소의 진행이 멈추게 된다(이러한 작용을 "masked chain termination"라 함). 젬시타빈은 결함있는 염기이기 때문에 세포의 정상적인 수복 시스템에 이상이 발생하고, 따라서 젬시타빈이 세포의 DNA에 통합되면 회복 불가능한 오류가 생겨 더 많은 DNA 합성이 억제되어 세포 사멸을 일으킨다.
2 개의 인산염이 부착된 젬시타빈(dFdCDP)의 형태는 또한 활성을 갖는다. 그것은 새로운 뉴클레오티드를 생성하는데 필요한 효소 리보뉴클레오티드 환원 효소(RNR)를 억제한다.
젬시타빈의 부작용으로는 골수 억제, 간 및 신장 문제, 메스꺼움, 발열, 발진, 호흡 곤란, 구강 염증, 설사, 신경 병증 및 탈모가 있다. 임신 중에 사용하면 아기에게 해로울 수 있다. 후가역성 뇌증 증후군을 유발하여 모세 혈관 누출 증후군을 유발할 수 있으며, 폐부종, 폐렴 및 성인 호흡 곤란 증후군과 같은 심각한 폐 상태를 유발할 수 있으며, 정자를 해할 수도 있다.
플록스유리딘(Floxuridine 또는 5-fluorodeoxyuridine)은 항대사제(antimetabolites)로 디옥시우리딘(deoxyuridine)으로 분류되는 피리미딘 유사체이다. 플록스우리딘은 생체 내에서 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil)로 빠르게 대사되는 프로드럭이다.
플록스유리딘은 티미딜레이트 합성효소(thymidylate synthase)(EC50 = 0.6 nM))를 억제하여 세포주기의 S 단계 동안 DNA 합성을 저해한다. 플록스우리딘은 세포주기의 S-단계의 억제제로서 작용하기 때문에 빠르게 분열하는 세포를 선택적으로 사멸시킨다.
플록스우리딘은 약물의 활성 형태인 5-플루오로우라실로 분해되어 DNA 합성의 저해와 부분적으로 RNA 합성을 억제한다. 5-플루오로우라실은 우라실 리보시드 퍼스퍼릴라제(uracil riboside phosphorylase)를 억제하여 RNA 합성에서 예비 형성된 우라실의 이용을 방지한다. 뿐만 아니라, FUDR-MP(5-fluoro-2'-deoxyuridine-5-phosphate)의 플록스우리딘 일인산(floxuridine monophosphat)e는 티미딜레이트 합성효소(thymidylate synthase)를 저해하여 디옥시우리딜산(deoxyuridylic acid)의 티미딜산(thymidylic acid)으로의 메틸화를 억제하여 DNA 합성을 방해한다.
플록스우리딘은 주로 암세포의 특징인 새롭고 빠르게 성장하는 세포들의 성장을 저해하여 암세포를 사멸시킨다.
플록스우리딘은 대장암 치료에 가장 많이 사용되는데, 대장암 전이에 대한 플록스우리딘의 지속적인 간동맥 주입을 받는 환자의 삶의 질과 생존율은 대조군보다 유의하게 높았다. 플록스우리딘은 또한 신장암, 위암 치료에도 사용된다.
본 실시예에서 스템 루프 구조를 가진 단일가닥 핵산의 이중가닥의 스템 영역에 끼어들어가는 인터칼레이터 항암제는 독소루비신을 사용하였다.
독소루비신(Doxorubicin)은 암 치료에 사용되는 화학 요법 약물로 유방암, 방광암, 카포시 육종, 림프종 및 급성 림프 구성 백혈병에 사용된다.
독소루비신은 안트라사이클린 계열의 약물로 DNA에 끼어들어가 DNA의 슈퍼 코일을 이완시키는 효소인 토포아이소머라 Ⅱ의 활성을 억제함으로써 궁극적으로 DNA 복제 과정을 저해한다. 독소루비신은 또한 퀴논(quinone) 형태의 자유 라디칼 생성을 증가시켜 세포독성을 유발한다.
독소루비신의 부작용으로는 탈모, 골수 억제, 구토, 뾰루지, 염증 등이 있다. 다른 심각한 부작용으로는 아나필락시스, 심장 손상, 주사 부위의 조직 손상, 방사선 회수 및 치료 관련 백혈병과 같은 알레르기 반응이 있을 수 있으며 수일 동안 소변의 붉은 변색을 경험할 수도 있다. 독소루비신의 가장 위험한 부작용은 확장된 심근 병증으로 울혈성 심부전을 초래하며, 4 개의 모든 심실이 확장된다. 이것은 수축기 및 이완기 기능 장애 모두를 초래한다. 결과적으로 50 %의 사망률을 보이는 심장 마비가 발생할 수 있다.
본 실시예에서 뉴클레오시드 유사 항암제, 인터칼레이터 항암제 이외에 암세포에 대한 세포독성을 높이기 위한 항암제로서는 메르탄신(Mertansine, DM1), 파크리탁셀(Paclitaxel, PTX), 모노메틸 아우리스타틴 E(Monomethyl auristatin E, MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 F(Monomethyl auristatin F, MMAF)를 사용하였다.
메르탄신(Mertansine, DM1)은 튜불린(tubulin) 억제제로서 튜불린의 리조신 결합 부위(rhizoxin binding site)에 결합하여 미세소관의 집합(assembly of microtubules)을 억제한다. 메르탄신은 티올기를 함유하고 있어(thiol-containing maytansinoid)로서 링커를 통해 단일클론항체에 부착되어 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate, ADC)의 생성에 이용된다. 이러한 ADC로서 T-DM1(Trastuzumab emtansine), IMGN901(Lorvotuzumab mertansine), huC242-DM1(Cantuzumab mertansine) 등이 있다. 이러한 ADC는 트라스트주맙(Trastuzumab) 등 항체가 인식하는 표적분자를 가진 암세포를 표적하여 선택적으로 메르탄신이 세포독성을 나타내도록 유도한다.
파크리탁셀(Paclitaxel, PTX)은 식물성 알칼로이드(plant alkaloids)로서 도세탁셀(Docetaxel)과 함께 탁센(Taxane)으로 분류되는 항미세소관 제제이다. 이 약물은 세포분열 과정 중, 세포분열의 결정적인 미세소관(microtubule)이 분리되는 과정을 방해함으로써 암세포의 증식을 저해한다. 현재 난소암, 유방암, 비소세포성폐암, 피부상피세포암 등의 치료에 사용되고 있다.
파크리탁셀의 부작용으로는 메스꺼움과 구토, 식욕 상실, 맛의 변화, 간질 또는 부서지기 쉬운 모발, 팔이나 다리의 관절에 2 ~ 3 일 동안 지속되는 통증, 손톱 색깔의 변화, 손의 따끔거림, 비정상적인 멍이나 출혈, 주사 부위의 통증, 발적 또는 부종, 손 발 증후군, 2 일 이상 정상적인 배변 습관의 변화, 발열, 오한, 기침, 아픈 발병과 같은 심각한 부작용, 인후통, 삼키기 어려움, 현기증, 호흡 곤란, 심한 피로, 피부 발진, 안면 홍조, 난소 손상에 의한 여성 불임, 가슴 통증 등이 발생할 수 있다. 또 신경 병증이 발생할 수도 있다.
MMAE(Monomethyl auristatin E)는 desmethyl-auristatin E로 합성 항종양제로 튜불린의 중합을 차단하여 세포 분열을 억제하는 항 세포분열 약물(Antimitotic Agent)이다. 단클론 항체(MAb)에 링커를 통해 접합된 MMAE는 세포 외액에서 안정하지만, 일단 접합체가 종양 세포에 들어가면 카텝신에 의해 절단되어 항 세포분열 기전을 활성화시킨다.
MMAF(Monomethyl auristatin F)는 합성 항종양제로, SGN-75(Vorsetuzumab mafodotin)와 SGN-CD19A(Denintuzumab Mafodotin)와 같은 실험용 항체 약물 접합체를 이루는 약물이다. MMAF는 튜뷸린의 중합을 차단함으로써 세포 분열을 억제하는 항 세포분열 제제이다. 이것은 암세포의 구조에 높은 친화성을 갖는 항체와 연결되어 MMAF가 그러한 세포에 축적되도록 한다.
<실시예 2> 40k PEG-ApGemHER2-S-S-DM1(A)와 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-DM1(B) 그리고 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역(C)의 압타마 기반 표적화 복합 항암제의 제조
상기에서 주문 제조한 구성분자인 40k PEG-ApGemHER2-SH 또는 40k PEG-ApFdUEpCAM-SH와 DM1은 50% DMSO와 2mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)를 포함하는 100mM potassium phosphate buffer(pH 7.0) 내에서 1:1 몰비로 혼합하여 상온에서 48시간 반응시켜 복합체를 형성시켰다.
이렇게 제조된 40k PEG-ApGemHER2-S-S-DM1반응용액을 High Performance Liquid Chromatography(HPLC)를 실시하여 정제하였다. Eclipse XDB-C18 column을 이용하여 분리를 진행하였고, binding buffer(95% 0.1M TEAA, 5% Acetonitrile)와 elution buffer(50% 0.1M TEAA, 50% Acetonitrile)의 gradient를 통해 분리하였다(도 1의 a). HPLC의 피크들은 mass spectroscopy 방법을 통해서 분석하였고, 그 중에서 40k PEG-ApGemHER2-S-S-DM1 구조체와 일치하는 피크들만 취하여 하기 실시예의 실험에서 사용하였다(도 1의 b).
제조한 40k PEG-ApGemHER2-SH 및 정제된 40k PEG-ApGemHER2-S-S-DM1(A)의 품질과 크기는 7M 우레아가 함유된 10 % (19:1) 폴리아크릴아미드 겔에서 분석되었다(도 2의 a). 또한, 제조한 40k PEG-ApGemHER2-SH 및 정제된 40k PEG-ApGemHER2-S-S-DM1의 각각 1mg를 UV / Vis 스펙트럼하였다(도 2의 b).
40k PEG-ApFdUEpCAM-SH와 제조한 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-DM1는 7M 우레아가 함유된 10% (19:1) 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하였다(도 3).
40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-NH2(C)는 상기 주문 제조한 40k PEG-ApGemHER2-SH와 SH-SL 영역-NH2을 상기와 동일한 반응 조건에서 반응시켜 양 물질의 티올기(-SH)들 사이에 이황화 결합을 유도하여 제조하고 7M 우레아가 함유된 10 % (19:1) 폴리아크릴아미드 겔에서 분석되었다(도 4).
<실시예 3> 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-DM1(D)와 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-SL 영역-S-S-DM1(E)의 제조
(1) 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-NH2와 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-SL 영역-NH2의 제조
40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-NH2는 상기 실시예 2에서와 같이 준비하였다.
40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-SL 영역-NH2의 제조를 위해서, 상기에서 주문 제조한 40k PEG-ApFdUEpCAM-SH와 SH-SL 영역-NH2을, 50% DMSO와 2mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)를 포함하는 100mM potassium phosphate buffer(pH 7.0) 내에서 1:1으로 하여 상온에서 48시간 반응시켜 복합체를 형성시켰다.
이렇게 제조된 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-SL 영역-NH2 반응용액을 High Performance Liquid Chromatography(HPLC)를 실시하여 정제하였다. Eclipse XDB-C18 column을 이용하여 분리를 진행하였고, binding buffer(95% 0.1M TEAA, 5% Acetonitrile)와 elution buffer(50% 0.1M TEAA, 50% Acetonitrile)의 gradient를 통해 분리하였다. HPLC의 피크들은 mass spectroscopy 방법을 통해서 분석되었고, 그 중에서 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-SL 영역-NH2 구조체와 일치하는 피크들만 취하여 하기 실시예의 실험에서 사용하였다(도 5).
(2) 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-SH와 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-SL 영역-SH의 제조
40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-NH2 또는 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-SL 영역-NH2로부터 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-SH와 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-SL 영역-SH의 제조는 아민기(-NH2)를 티올기(-SH)로 전환시켜주는 링커인 SPDP((succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate))와 DTT(dithiothreitol)를 사용하여 아래와 같이 수행하였다.
구체적으로 상기 제조된 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-NH2또는 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-SL 영역-NH2를 사용 직전에, 2mg SPDP(미국, Pierce Biotechnology사)을 320μL DMSO에 녹여 20mM SPDP 시약 용액을 준비하였다. 1.0mL PBS-EDTA에 2~5mg의 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-NH2 또는 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-SL 영역-NH2을 용해시키고 여기에 25μL의 20mM SPDP 용액을 첨가하여 상온에서 30 분 동안 반응시켰다. 탈염 칼럼을 PBS-EDTA로 평형화하고, 완충액을 교환하여 반응 부산물 및 과량의 비반응 SPDP시약을 제거하였다.
23mg DTT를 PBS-EDTA에 용해시켜 150mM DTT 용액을 만들었다. SPDP로 개질된 반응용액 1mL 당 0.5mL DTT 용액을 첨가하여(최종 농도 50mM DTT) 30분 동안 반응시켜 티올기를 도입하였다. 탈염 컬럼을 PBS-EDTA로 평형화하고 DTT를 제거하기 위해 반응용액을 탈염하였다.
상기 탈염된 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-SH 또는 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-SL 영역-SH 구조체를 Dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 10mM stock으로 제조하였다.
(3) 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-DM1(D)와 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-SL 영역-S-S-DM1(E)의 제조
상기 제조된 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-SH 또는 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-SL 영역-SH 구조체와 상기 DM1을 상기 실시예 2에서와 같이 반응시켜 이황화 결합을 유도하여 복합체를 형성하였다. 최종적으로 얻은 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-DM1(D) 또는 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-SL 영역-S-S-DM1(E) 반응용액을 상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 분리와 정제하였다.
제조한 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-SH 및 정제된 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-DM1(D)의 품질과 크기는 7M 우레아가 함유된 10 % (19:1) 폴리아크릴아미드 겔에서 분석되었다(도 6).
제조한 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-SL 영역-SH 및 정제된 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-SL 영역-S-S-DM1(E)의 품질과 크기는 7M 우레아가 함유된 10 % (19:1) 폴리아크릴아미드 겔에서 분석되었다(도 7).
<실시예 4> 40k PEG-ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM-40k PEG(F)의 제조
상기에서 주문 제조한 40k PEG-ApGemHER2-SH와 40k PEG-ApFdUEpCAM-SH는 50% DMSO와 2mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)를 포함하는 100mM potassium phosphate buffer(pH 7.0) 내에서 1:1의 몰비으로 하여 상온에서 48시간 반응시켜 40k PEG-ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM-40k PEG(F) 복합체를 형성시켰다.
이렇게 제조한 40k PEG-ApGemHER2-SH, 40k PEG-ApFdUEpCAM-SH 및 40k PEG-ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM-40k PEG(F)는 7M 우레아가 함유된 10 % (19:1) 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하였다(도 8의 a). 주문 제조한 ApGemHER2-SH(Biosynthesis 사, 미국)와 주문 제조한 ApFdUEpCAM-SH(Biosynthesis 사, 미국)을 상기와 같은 반응 조건에서 반응시켜 이황화 결합을 유도하여 얻은 ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM 및 40k PEG-ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM-40k PEG(F)는 7M 우레아가 함유된 10 % (19:1) 폴리아크릴아미드 겔에서 분석되었다(도 8의 b). 40K PEG(SigmaAldrich사, 미국), ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM 및 40k PEG-ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM-40k PEG(F) 반응용액을 High Performance Liquid Chromatography(HPLC)를 실시하여 정제하였다. Eclipse XDB-C18 column을 이용하여 분리를 진행하였고, binding buffer(95% 0.1M TEAA, 5% Acetonitrile)와 elution buffer(50% 0.1M TEAA, 50% Acetonitrile)의 gradient를 통해 분리하였다(도 9).
<실시예 5> 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-DM1(G)의 제조
본 실시예에서 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-DM1(G)의 제조를 위해서, SH-ApFdUEpCAM-NH2의 아민기(NH2)를 티올기(SH)로 전환시키고 이를 DM1과 반응시켜 SH-ApFdUEpCAM-S-S-DM1를 제조한 후, 이를 상기 실시예 3에서 준비한 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-SH와 반응시켜 제조하였다.
상기에서 주문 제조한 SH-ApFdUEpCAM-NH2에 SPDP((succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate))와 DTT(dithiothreitol)를 사용하여 상기 실시예 3에서 기술한 방법으로 SH-ApFdUEpCAM-SH을 제조하고 이를 DM1과, 상기 실시예 2에서와 같이 반응시켜 이황화 결합을 유도하여 SH-ApFdUEpCAM-S-S-DM1 제조하였다.
이를 상기 실시예 3에서 제조한 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-SH와 상기 실시예 2에서와 같이 반응시켜 이황화 결합을 유도하여 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-DM1(G)복합체를 형성하였다. 최종적으로 얻은 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-DM1(G) 반응용액을 상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 분리하고 정제하였다(도 10의 a).
<실시예 6> 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-PTX(H)의 제조
본 실시예에서 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-PTX(G)의 제조를 위하여, 먼저 상기 주문 제조한 SH-ApFdUEpCAM-NH2로부터 PTX-S-S-ApFdUEpCAM-NH2를 제조하고, 이어서 PTX-S-S-ApFdUEpCAM-SH를 제조한 후, 그 다음으로 상기 PTX-S-S-ApFdUEpCAM-SH를 상기 실시예 3에서 제조한 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-SH와 반응시켰다.
(1) PTX-S-S-ApFdUEpCAM-NH2의 제조
상기 PTX-S-S-ApFdUEpCAM-NH2는, 먼저 링커(4-Maleimidobutyric acid)를 사용하여 PTX(Paclitaxel, Sigma-Aldrich Inc.,미국)에 티올(Thiol)기와 반응성이 있는 말레이미드 작용기를 도입하고 그 다음 상기 주문 제조한 SH-ApFdUEpCAM-NH2와 반응시켜 제조하였다.
① 말레이미드(Maleimide)가 도입된 PTX의 합성
PTX 1g(1.17mmol, 1 eq), 4-Maleimidobutyric acid 210 mg(1.17mmol, 1eq), 디메칠아미노피리딘(DMAP) 140mg(2.34mmol, 2eq), 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 480mg(1.17mmol, 1eq)을 100ml 둥근 플라스크(Round flask)에 담고, 메틸렌 클로라이드(Methylene chloride) 50ml를 넣은 후, 상온에서 교반하여 반응시켰다.
반응의 진행은 TLC(Thin Layer Chromatography)법을 이용하여 관찰하고 반응이 끝나면, 증류수(DW) 50ml를 넣어 흔들어 섞었다(Work up).(Rf Value = 0.43, Hexane : Ethyl acetate = 1 : 1)
유기용매 층을 모아 마그네슘 설파이드(Magnesium sulfide)로 수분을 제거한 후, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(Silica gel column chromatography)를 이용하여 분리하였다.(Hexane : Ethyl acetate = 1 : 1) 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 얻은 물질을 농축하여 말레이미드가 도입된 PTX의 화합물 620mg을 얻었다.
② PTX-S-S-ApFdUEpCAM-NH2의 제조
상기 합성한 말레이미드가 도입된 PTX을 1ml DMSO에 20mM로 녹인 후, 1:1.5~5 몰비로 상기 주문 제조한 SH-ApFdUEpCAM-NH2을 혼합하였다. 여기에 DIPEA(Diisopropyl ethyl amine) 2~3 방울을 넣은 후, Vortex에서 5분간 반응시켰다. 반응의 종결은 Elman 시약으로 확인하고, 노란빛이 사라지면, 얻어진 혼합물에 냉각 디에틸에테르(Cooling diethyl ether)를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 화합물을 침전시켰다. Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 분말(powder)로 만들었다.
(2) PTX-S-S-ApFdUEpCAM-SH의 제조
PTX-S-S-ApFdUEpCAM-NH2에서 PTX-S-S-ApFdUEpCAM-SH의 제조는 상기 실시예 3에서와 같이 아민기(-NH2)를 티올기(-SH)로 전환시켜주는 링커인 SPDP((succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate))를 DTT(dithiothreitol)와 함께 사용하여 아래와 같이 수행하였다.
구체적으로 2mg SPDP(미국, Pierce Biotechnology사)을 320μL DMSO에 녹여 20mM SPDP 시약 용액을 준비하였다. 1.0mL PBS-EDTA에 2-5mg의 PTX-ApFdUEpCAM-NH2를 용해시키고 여기에 25μL의 20mM SPDP 용액을 첨가하여 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 탈염 칼럼을 PBS-EDTA로 평형화하고, 완충액을 교환하여 반응 부산물 및 과량의 비반응 SPDP 시약을 제거하였다.
23mg DTT를 PBS-EDTA에 용해시켜 150mM DTT 용액을 만들었다. SPDP로 개질된 반응용액 1mL 당 0.5mL DTT 용액을 첨가하여(최종 농도 50mM DTT) 30분 동안 반응시켜 티올기를 도입하였다. 탈염 컬럼을 PBS-EDTA로 평형화하고 DTT를 제거하기 위해 반응용액을 탈염하였다.
(3) 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-PTX(H)의 제조
상기 제조한 PTX-S-S-ApFdUEpCAM-SH를, 상기 실시예 3에서 제조한 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-SH와 상기 실시예 2에서와 같이 반응시켜 이황화 결합을 유도하여 복합체를 형성시켰다. 최종적으로 얻은 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-PTX(H) 구조체를 상기 실시예 2에서와 같이 동일한 방법으로 분리와 정제하였다(도 10의 b).
<실시예 7> 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAE(I)와 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAF(J)의 제조
본 실시예에서 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAE(I)와 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAF(J)의 제조를 위하여, 먼저 상기 상기 주문 제조한 HS-ApFdUEpCAM-NH2로부터 MMAE-S-S-ApFdUEpCAM-NH2 및 MMAF-S-S-ApFdUEpCAM-NH2를 제조하고, 이어서 MMAE-S-S-ApFdUEpCAM-SH 및 MMAF-S-S-ApFdUEpCAM-SH를 제조한 후, 그 다음으로 상기 MMAE-S-S-ApFdUEpCAM-SH 및 MMAF-S-S-ApFdUEpCAM-SH를 상기 실시예 3에서 제조한 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-SH와 반응시켰다.
(1) MMAE-S-S-ApFdUEpCAM-NH2 및 MMAF-S-S-ApFdUEpCAM-NH2의 제조
아우리 스타틴 말레이미드카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질카바메이트-MMAE(maleimidecaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzylcarbamate-MMAE) 또는 말레이미도카프로일-MMAF(maleimidocaproyl-MMAF)(Levena Biopharma, San Diego, CA)를 1ml DMSO에 20mM의 농도로 첨가하고, 1.5-5 배의 2mM EDTA이 있는 PBS를, 상기 주문 제조한 SH-ApFdUEpCAM-NH2에 첨가하였다.
여기에 DIPEA(Diisopropyl ethyl amine) 2~3 방울을 넣은 후, Vortex에서 5분간 반응시켰다. 반응의 종결은 Elman 시약으로 확인하고, 노란빛이 사라지면, 얻어진 혼합물에 냉각 디에틸에테르(Cooling diethyl ether)를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 화합물을 침전시켰다. 과량의 약물을 Amicon Ultra 10k 스핀 컬럼을 사용하여 PBS로 탈염시킴으로써 제거하고 Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 분말(powder)로 만들었다. 분석 효율은 분석 HPLC에 의해 확인되었고, 99 % 순도로 진행되었다.
(2) MMAE-S-S-ApFdUEpCAM-SH 및 MMAF-S-S-ApFdUEpCAM-SH의 제조
MMAE-S-S-ApFdUEpCAM-NH2 및 MMAF-S-S-ApFdUEpCAM-NH2에서 MMAE-S-S-ApFdUEpCAM-SH 및 MMAF-S-S-ApFdUEpCAM-SH의 제조는 상기 실시예 3에서와 같이 아민기(-NH2)를 티올기(-SH)로 전환시켜주는 링커인 SPDP((succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate))를 DTT(dithiothreitol)를 함께 사용하여 아래와 같이 수행하였다.
구체적으로 2mg SPDP(미국, Pierce Biotechnology사)을 320μL DMSO에 녹여 20mM SPDP 시약 용액을 준비하였다. 1.0mL PBS-EDTA에 용해된 2-5mg의 상기 제조된 MMAE 또는 MMAF-S-S-ApFdUEpCAM-NH2에 25μL의 20mM SPDP 용액을 첨가하여 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 탈염 칼럼을 PBS-EDTA로 평형화하고, 완충액을 교환하여 반응 부산물 및 과량의 비반응 SPDP 시약을 제거하였다.
23mg DTT를 PBS-EDTA에 용해시켜 150mM DTT 용액을 만들었다. SPDP로 개질된 반응용액 1mL 당 0.5mL DTT 용액을 첨가하여(최종 농도 50mM DTT) 30분 동안 반응시켜 티올기를 도입하였다. Amicon Ultra 10kD 스핀 컬럼(Millipore, Billerica, MA)을 사용하여 PBS + 2mM EDTA로 교환하여 PBS-EDTA로 평형화하고 DTT를 제거하기 위해 반응용액을 탈염하였다.
(3) 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAE(I) 및 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAF(J)의 제조
상기 실시예 3에서 얻은 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-SH 구조체와 상기에서 제조한 MMAE-S-S-ApFdUEpCAM-SH 및 MMAF-S-S-ApFdUEpCAM-SH를 상기 실시예 2에서와 같이 수행하여 복합체를 형성시켰다. 최종적으로 얻은 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAE(I) 구조체와 k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAE 또는 MMAF(J) 구조체를 상기 실시예 2에서 같이 동일한 방법으로 분리와 정제하였다(도 10의 c 및 d).
<실시예 8> 독소루비신이 결합한 압타머 기반 표적화 복합 항암제의 제조
상기에서 제조한, 헤어핀 구조(SL 영역)를 갖는 40k PEG-ApGemHER2-S-S-SL 영역-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAE(I)에 독소루비신(DOX)을 탑재시켰다.
독소루비신(DOX, 500μM), 상기 제조된 구조체(H)(20μM), 포름 알데히드(0.37%)를 반응 완충액(20mM 인산 나트륨, 150mM NaCl, 0.5mM,EDTA, pH 7.0))에 배양하여 독소루비신이 탑재된 압타머 기반 표적화 복합 항암제("DOX/I")을 10℃에서 12시간 동안 제조하였다.
생성된 DOX/I를 0.1M 트리틸아민 아세테이트(trithylamine acetate, TEAA, Glen Research Corp.) 및 아세토 니트릴을 사용하여 C-18 컬럼상에서 역상 고속 액체 크로마토 그래피(HPLC)(ProStar, Varian, Walnut Creek, CA, USA)(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)를 용리액으로 사용하여 정제하였다.
정제된 시료를 Dulbecco's 완충액(Sigma Aldrich)에서 동결 건조, 탈염 및 처리한 후 향후 사용을 위해 -20℃에서 보관하였다. UV-Vis spectrometry에 의한 약물 정량화를 위해 free DOX의 경우 480 nm에서 11,500 M-1cm-1의 몰 흡광 계수와 DOX/H의 비공유 결합의 경우 506nm에서 7,677 M-1cm-1의 몰 흡광 계수가 사용되었다.
상기 제조된 구조체(I)에 독소루비신이 탑재된 양을, 480 nm에서 여기시킨 후 500 ~ 750 nm 구간에서 방출 스펙트럼을 측정하였여 관찰하였으며, 독소루비신의 양이 증가할수록 또 상기 제조된 구조체(I)의 양이 증가할수록 독소루비신의 형광세기는 감소하였다(도 11).
이것은 결합된 독소루비신 사이의 소광현상 때문이다. 상기 제조된 구조체(H):독소루비신=1:30(몰비)일 때 더 이상의 독소루비신 소광현상이 거의 발생하지 않았으며, 따라서 몰비 1:20을 약물봉입으로 선택하여 약물 전달체를 제조하였다(도 11).
이와 같은 방법으로 상기 SL 영역을 포함하는 실시예의 다른 약물에도 독소루비신을 탑재시켰다.
<실시예 9> 압타머 기반 표적화 복합 항암제의 나노 입자화
상기 제조된 압타머 기반 표적화 복합 항암제를 전달하기 위해 PLGA(poly lactide-co-glycolic acid) 나노입자를 이용하였다. 수중유중수형(water-in-oil-in-water, w/o/w) 이중 에멀젼 방법(F, Danhier et al. Journal of Controlled release, vol.133(1), pp.11-17, 2009)에 따라 상기에서 제조된 압타머 기반 표적화 복합 항암제가 함유된 PLGA 나노입자를 제조하였다.
압타머 기반 표적화 복합 항암제(1%, w/v), 키토산 글리콜라이드(1%, w/v) 및 PLGA(4%, w/v)를 디클로로메탄에 녹이고, 탈이온수를 1:5 부피비로 용액에 첨가하여, 프로브-타입 소니케이터(Branson Digital Sonifier®, Danbury, CT)를 사용하여 25W 출력으로 60초 동안 실온에서 유화시켰다. 단일 에멀젼(w/o)을 수용성 PVA 용액(4%, w/v)에 다시 유화시키고, 30W로 120초 동안 소니케이션하였다(w/o/w). 이중 에멀젼을 PVA(1%, w/v) 용액에 붓고, 밤새 교반하여 용매를 증발시켰다. 압타머 기반 표적화 복합 항암제가 함유된 나노입자는 16000 rpm에서 원심분리하여 수득하여, 세척하고, 동결건조하여 상기 압타머 기반 표적화 복합 항암제가 함유된 나노입자를 제조하였다.
<실시예 10> 압타머 기반 표적화 복합 항암제의 암세포 표적성 확인
상기에서 제조된 10가지 압타머 기반 표적화 복합 항암제가 HER2와 EpCAM의 발현정도에 따른 세포독성에 미치는 영향을 평가하기 위해, HER-2와 EpCAM이 과다 발현하는 유방암 세포주 MDA-MB-453(ATCC® HTB-131™), HER2 발현하지 않고 EpCAM를 과다 발현하는 유방암 세포주 MCF-7(ATCC® HTB-22™)과 HER2와 EpCAM 모두 발현하지 않는 유방암 세포주 MDA-MB-231(ATCC® HTB-26™)을 사용하였다.
각 압타머 기반 표적화 복합 항암제를 상기 세포 배양용액에 첨가하고 4시간 동안 배양하고 세척한 후, 72시간 동안 배양하여 MTT 분석을 실시하였다.
HER2와 EpCAM 중 하나를 표적화하는 A, B, C, D 및 E 압타머 기반 표적화 복합 항암제의 세포독성을 도 12에 나타내었다.
도 12의 a에 제시한 바처럼, HER-2와 EpCAM이 과다 발현하는 MDA-MB-453 세포주에서는 A, B, C, D 및 E의 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 모두 농도 의존적으로 뚜렷하게 세포독성을 나타내었고, 그 IC50 값은 모두 대략 1.8 ㎍/mL 전후의 값을 나타내었다.
도 12의 b에 제시한 바처럼, HER2 발현하지 않고 EpCAM을 과다 발현하는 MCF-7 세포주에서는 B와 E의 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 농도 의존적으로 뚜렷하게 세포독성을 나타내었고, 그 IC50 값은 대략 2.5 ㎍/mL 전후의 값을 나타낸 반면, A와 C 그리고 D의 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 모든 처리 농도에서 세포독성을 나타내지 않았으며, C는 수동적으로 방출된 DOX의 항암 효과를 부분적으로 관찰할 수 있었다.
HER2와 EpCAM을 모두 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포주에서는 A, B, C, D 및 E 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 모두 세포독성을 나타내지 않았다(결과 미제시).
HER2와 EpCAM 모두를 표적화하는 F, G, H, I 및 J의 압타머 기반 표적화 복합 항암제의 세포독성을 도 13에 나타내었다.
도 13의 a에 제시한 바처럼, HER-2와 EpCAM를 과다 발현하는 MDA-MB-453 세포주에서는 F, G, H, I 및 J의 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 모두 농도 의존적으로 뚜렷하게 세포독성을 보였으며, 그 IC50 값은 모두 대략 0.182 ㎍/mL 전후로 나타났다.
도 13의 b에서 제시한 내용처럼, HER2를 발현하지 않고 EpCAM이 과다 발현하는 MCF-7 세포주에서는 F, G, H, I 및 J의 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 모두 농도 의존적으로 뚜렷하게 세포독성을 보였으며, 그 IC50 값은 모두 대략 0.285 ㎍/mL 전후로 나타났다.
HER2와 EpCAM를 모두 발현하지 않는 MDA-MB-231에서는 F, G, H, I 및 J의 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 모두 세포독성을 나타내지 않았다(결과 미제시).
이러한 세포독성 결과는 암세포의 HER2와 EpCAM 표적 분자 발현 유무에 따라 선택적으로 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제가 세포독성을 나타냄으로써 정상세포에의 안전성을 높이는 한편 또 항암제가 2종 이상 다중으로 탑재됨으로써 세포독성 효과도 높일 수 있음을 의미한다.
도 12 및 도 13의 결과는 모두 5회 반복 실험 결과이다(n = 5).
<실시예 11> 유방암 질환 동물 모델에서 압타머 기반 표적화 복합 항암제 항암 효과 확인
면역 결핍된 6주령의 암컷 BALB/c 누드 마우스에 HER-2와 EpCAM이 과다 발현하는 유방암 세포주 MDA-MB-453(ATCC　 HTB-131™), HER2를 발현하지 않고 EpCAM를 과다 발현하는 유방암 세포주 MCF-7(ATCC　 HTB-22™)과 HER2와 EpCAM 모두 발현하지 않는 유방암 세포주 MDA-MB-231(ATCC　 HTB-26™)을 각각 3×106 cells을 이식한 후, 도 14의 a에 제시한 바와 같은 스케줄에 따라 3회(2일, 9일, 16일) DM1(15 mg/kg), 압타머 기반 표적화 복합 항암제(0.5mg/kg)를 근육 내 투여하였다. 이후 24일 동안 종양 부피(tumor volume)를 측정하여 그 결과를 도 15에 나타내었다. 종양부피(V)는 caliper의 의해 측정되고, V=(length×width2)/2의 식을 이용하여 계산하였다(평균 ± 표준편차(n = 5)).
본 실시예에서 사용한 압타머 기반 표적화 복합 항암제는, 단독 투여군으로는 40k PEG-ApGemHER2-S-S-DM1(A)와 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-DM1(B), 그리고 혼합 투여군(A*B)으로는 A와 B의 혼합 약물을 사용하였다. 본 실시예에서 약물은 상기 실시예 9에서 얻어진 나노 입자 형태의 약물을 사용하였다.
도 14의 b을 보면, HER-2와 EpCAM을 과다 발현하는 MDA-MB-453 세포주를 각각 이식한 마우스에서 0.5 mg/kg의 압타머 기반 표적화 복합 항암제 모든 투여군 종양의 성장을 유의하게 감소시켰다.
도 15의 a를 보면, HER2와 EpCAM를 모두 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포주를 이식한 마우스에서 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 모두 종양의 성장을 감소시키지 못하였다.
도 15의 b를 보면, HER2 발현하지 않고 EpCAM을 과다 발현하는 MCF-71 세포주를 이식한 마우스에서 단독 투여한 40k PEG-ApGemHER2-S-S-DM1(A)에서는 종양의 성장을 감소시키지 못 하였으나 40k PEG-ApFdUEpCAM-S-S-DM1(B), 그리고 혼합 투여는 A와 B의 혼합 약물을 사용한 군에서는 종양의 성장을 유의하게 감소시켰다.
또한 대조군과 비교하여 생존한 모든 실험군에서 약물 투여에 따른 체중 변화가 관찰되지 않음을 확인하였다(결과 미제시).
이러한 동물모델에서의 결과도 본 발명의 압타머 기반 표적화 복합 항암제가 HER2와 EpCAM의 발현 유무에 따라 항암 효과를 가지고 또 부작용은 상대적으로 적을 가능성을 암시하고 있음을 보여준다.
본 발명은 그의 일부 특별한 구체예들을 참고하여 설명 및 예시되며, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 방법 또는 프로토콜의 다양한 개조(adaption), 변화, 변형, 치환, 삭제 또는 부가가 이루어질 수 있는 것으로 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 청구항들의 범위에 의해 정의되며, 그와 같은 청구항들은 합리적인 범위에서 넓게 해석되어야 하는 것으로 의도된다.

Claims (51)

  1. (i) 암세포의 표면에서 발현되는 표적분자를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 암세포에 대한 표적화가 가능하고 뉴클레오시드 유사 항암제가 일 분자 이상 통합됨으로써 그 자체로 항암 활성을 나타낼 수 있는 압타머, (ii) 상기 압타머와 결합되어 있는, 상기 뉴클레오시드 유사 항암제와 다른 제2의 항암제를 포함하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 압타머 기반 표적화 복합 항암제는, 스템 루프 구조를 형성하는 단일가닥 핵산을 추가로 포함하고, 그 단일가닥 핵산은 상기 압타머의 5' 또는 3' 말단이나 또는 상기 제2의 항암제에 결합 결합되어 있고, 상기 스템 영역에 인터칼레이터 항암제 또는 그루브 결합 항암제가 일 분자 이상 끼어들어 탑재된 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 (i) 압타머, 인터칼레이터 항암제 또는 그루브 결합 항암제가 탑재된 스템 루프 구조를 형성하는 단일가닥 핵산, 제2의 항암제 순이거나, (ii) 인터칼레이터 항암제 또는 그루브 결합 항암제가 탑재된 스템 루프 구조를 형성하는 단일가닥 핵산, 압타머, 제2의 항암제 순이거나, (iii) 압타머, 제2의 항암제, 인터칼레이터 항암제 또는 그루브 결합 항암제가 탑재된 스템 루프 구조를 형성하는 단일가닥 핵산 순으로 결합되어 구성된 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  4. 제2항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드가 스페이서로 상기 압타머와 상기 단일가닥 핵산을 이격시키기 위하여 상기 압타머와 상기 단일가닥 핵산 사이에 게재된 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 표적분자와 다른 제2의 표적분자를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 암세포에 대한 추가적인 표적화가 가능하고 상기 압타머에 통합된 뉴클레오시드 유사 항암제와 다른 제2의 뉴클레오시드 유사 항암제가 일 분자 이상 통합됨으로써 그 자체로 항암 활성을 나타낼 수 있는 제2의 압타머가 상기 압타머의 5' 또는 3' 말단이나 상기 제2의 항암제에 추가로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 (i) 압타머, 제2의 압타머, 제2의 항암제 순이거나, 또는 (ii) 압타머, 제2의 항암제, 제2의 압타머 순으로 결합되어 구성된 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  7. 제5항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드가 스페이서로 상기 압타머와 상기 제2의 압타머를 이격시키기 위하여 상기 압타머와 상기 제2의 압타머 사이에 게재된 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 표적분자와 다른 제2의 표적분자를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 암세포에 대한 추가적인 표적화가 가능하고 상기 압타머에 통합된 뉴클레오시드 유사 항암제와 다른 제2의 뉴클레오시드 유사 항암제가 일 분자 이상 통합됨으로써 그 자체로 항암 활성을 나타낼 수 있는 제2의 압타머가 상기 압타머의 5' 또는 3' 말단이나 상기 제2의 항암제 또는 상기 단일가닥 핵산의 5' 또는 3' 말단에 추가로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 (i) 압타머, 단일가닥 핵산, 제2의 항암제, 제2의 압타머 순이거나, (ii) 압타머, 단일가닥 핵산, 제2의 압타머, 제2의 항암제 순이거나, (iii) 압타머, 제2의 압타머, 단일가닥 핵산, 제2의 항암제 순이거나, (iv) 단일가닥 핵산, 압타머, 제2의 항암제, 제2의 압타머 순이거나, (v) 단일가닥 핵산, 압타머, 제2의 압타머, 제2의 항암제 순이거나, (vi) 압타머, 제2의 항암제, 단일가닥 핵산, 제2의 압타머 순이거나, (vii) 압타머, 제2의 항암제, 제2의 압타머, 단일가닥 핵산 순이거나 또는 (viii) 압타머, 제2의 압타머, 제2의 항암제, 단일가닥 핵산 순인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  10. 제8항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드가 스페이서로 상기 압타머와 상기 단일가닥 핵산을 이격시키기 위하여 또는 상기 압타머와 상기 제2의 압타머를 이격시키기 위하여 또는 상기 제2의 압타머와 상기 단일가닥 핵산을 이격시키기 위하여 그 사이에 게재된 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  11. 제1항 또는 제5항에 있어서,
    상기 표적분자는 암세포 표면에 존재하는 항원 또는 수용체인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  12. 제1항 또는 제5항에 있어서,
    상기 표적분자는 EGFRvⅢ, EGFR, 메타스틴 수용체(Metastin receptor), 타이로신 카이나제, HER2, c-Kit, c-Met, CXCR4, CCR7, 엔도테린-A 수용체, PPAR-δ, PDGFR-α, CEA, EpCAM, GD2, GPC3, PSMA, TAG-72, GD3, HLA-DR, MUC1, NY-ESO-1, LMP1, TRAILR2, VEGFR2, HGFR, CD44, CD166, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  13. 제1항 또는 제5항에 있어서,
    상기 압타머는 DNA 압타머 또는 RNA 압타머인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  14. 제1항 또는 제5항에 있어서,
    상기 압타머는 RNA 압타머이고,
    그 RNA 압타머는 변형된 RNA 압타머이며, 그 변형된 RNA 압타머는 리보뉴클레오타이드의 당 위치, 포스페이트 위치, 염기 위치, 5' 말단 위치 및 3' 말단 위치 중 어느 하나 이상의 위치에서 화학적으로 변형된 압타머인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 변형된 RNA 압타머는 당의 2'-OH 기에서 OMe, O-알킬, O-알릴, S-알킬, S-알릴 및 할로겐 중 하나로 변형된 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  16. 제1항 또는 제5항에 있어서,
    상기 뉴클레오시드 유사 항암제는 젬시타빈(Gemcitabine), 플루다라빈(Fludarabine), 시타라빈(Cytarabine), 클라드리빈(Cladribine), 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil), 카페시타빈(Capecitabine), 펜토스타틴(Pentostatin), 아데포비어(Adefovir), 시도피비어(Cidofovir), 도시플루리딘(Doxifluridine), 에노시타빈(Enocitabine), 플록스유리딘 (Floxuridine) 또는 인산 플루다라빈(Fludarabine Phosphate)인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  17. 제2항에 있어서,
    상기 인터칼레이터 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 닥티노마이신(dactinomycin), 악티노마이신(actinomycin), 마이토잔트론(mitoxantrone) 또는 에피루비신(epirubicin)인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  18. 제2항에 있어서,
    상기 그루브 결합 항암제는 디스타마이신 A(Distamycin A), 탈리머스틴(Tallimustine), PNU-145156E, 브로스탈린(Brostallicin), CC-1065, 아도젤레신(Adozelesin), 카르젤레신(Carzelesin), 비젤레신(Bizelesin), 두카마이신 A(Ducarmycin A), 두카마이신 SA(Ducarmycin SA), KW-2189, 이로풀벤(Irofulven), 트라벡데딘(Trabectedin, ET-743), 노갈마이신(nogalamycin), 디터칼니늄 비스-나프탈리미드(ditercalinium bis-naphthalimides) 또는 아미노글리코시드(Aminoglycoside)인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  19. 제1항 또는 제5에 있어서,
    상기 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 그 압타머의 노출된 말단이 페길화된 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 압타머와 제2의 항암제는 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 압타머와 제2의 항암제는 링커를 매개로 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  22. 제2항에 있어서,
    상기 압타머, 상기 제2의 항암제 및 상기 단일가닥 핵산은 서로 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 압타머, 상기 제2의 항암제 및 상기 단일가닥 핵산은 링커를 매개로 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  24. 제5항에 있어서,
    상기 압타머, 상기 제2의 항암제 및 제2의 압타머는 서로 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 압타머, 상기 제2의 항암제 및 제2의 압타머는 링커를 매개로 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  26. 제8항에 있어서,
    상기 압타머, 상기 제2의 항암제, 제2의 압타머 및 상기 단일가닥 핵산은 서로 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 압타머, 상기 제2의 항암제, 제2의 압타머 및 상기 단일가닥 핵산은 링커를 매개로 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  28. 제1항에 있어서,
    상기 제2의 항암제는 세포독성 항암제이고,
    상기 세포독성 항암제는 대사길항제(Antimetabolites), 미세관(microtubulin) 표적화제(Tubulin polymerase inhibitor 및 Tubulin depolymerisation), 알킬화제(Alkylating agents), 유사분열 억제제(Antimitotic Agents), DNA 절단제(DNA cleavage agent), DNA 가교제(DNA cross-linker agent), DNA 인터컬레이터제(DNA intercalator agents) 또는 DNA 토포아이소머라아제 억제제(DNA topoisomerase inhibitor)인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  29. (i) 암세포의 표면에서 발현되는 제1의 표적분자를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 암세포에 대한 표적화가 가능하고 제1의 뉴클레오시드 유사 항암제가 통합됨으로써(incorporated) 그 자체로 항암 활성을 나타낼 수 있는 제1의 압타머와 (ii) 상기 제1의 압타머에 결합되어 있으면서 상기 암세포의 표면에서 발현되는 상기 제1의 표적분자와 다른 제2의 표적분자를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 암세포에 대한 추가적인 표적화가 가능하고, 상기 제1의 뉴클레오시드 유사 항암제와 다른 제2의 뉴클레오시드 유사 항암제가 통합됨으로써(incorporated) 그 자체로 항암 활성을 나타낼 수 있는 제2의 압타머를 포함하는 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 뉴클레오시드 유사 항암제는 젬시타빈(Gemcitabine), 플루다라빈(Fludarabine), 시타라빈(Cytarabine), 클라드리빈(Cladribine), 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil), 카페시타빈(Capecitabine), 펜토스타틴(Pentostatin), 아데포비어(Adefovir), 시도피비어(Cidofovir), 도시플루리딘(Doxifluridine), 에노시타빈(Enocitabine), 플록스유리딘 (Floxuridine) 또는 인산 플루다라빈(Fludarabine Phosphate)인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  31. 제29항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드가 스페이서로 상기 제1의 압타머와 제2의 압타머를 이격시키기 위하여 그 사이에 게재된 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  32. 제29항에 있어서,
    상기 표적분자는 암세포 표면에 존재하는 항원 또는 수용체인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  33. 제29항에 있어서,
    상기 표적분자는 EGFRvⅢ, EGFR, 메타스틴 수용체(Metastin receptor), 타이로신 카이나제, HER2, c-Kit, c-Met, CXCR4, CCR7, 엔도테린-A 수용체, PPAR-δ, PDGFR-α, CEA, EpCAM, GD2, GPC3, PSMA, TAG-72, GD3, HLA-DR, MUC1, NY-ESO-1, LMP1, TRAILR2, VEGFR2, HGFR, CD44, CD166, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  34. 제29항에 있어서,
    상기 압타머는 DNA 압타머 또는 RNA 압타머인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  35. 제29항에 있어서,
    상기 압타머는 RNA 압타머이고,
    그 RNA 압타머는 변형된 RNA 압타머이며, 그 변형된 RNA 압타머는 리보뉴클레오타이드의 당 위치, 포스페이트 위치, 염기 위치, 5' 말단 위치 및 3' 말단 위치 중 어느 하나 이상의 위치에서 화학적으로 변형된 압타머인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  36. 제29항에 있어서,
    상기 변형된 RNA 압타머는 당의 2'-OH 기에서 OMe, O-알킬, O-알릴, S-알킬, S-알릴 및 할로겐 중 하나로 변형된 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  37. 제29항에 있어서,
    상기 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 그 압타머의 노출된 말단이 페길화된 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  38. 제29항에 있어서,
    상기 제1의 압타머와 제2의 압타머는 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 제1의 압타머와 제2의 압타머는 링커를 매개로 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  40. (i) 암세포의 표면에서 발현되는 표적분자를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 암세포에 대한 표적화가 가능하고 뉴클레오시드 유사 항암제가 통합됨으로써(incorporated) 그 자체로 항암 활성을 나타낼 수 있는 압타머와 (ii) 스템 루프 구조를 형성하는 단일가닥 핵산이 상기 압타머의 5' 또는 3' 말단와 결합하여 도입되고, 상기 스템 영역에 인터칼레이터 항암제나 그루브 결합 항암제가 끼어들어가 탑재된 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 암세포의 표면에서 발현되는 상기 표적분자와 다른 제2의 표적분자를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 암세포에 대한 추가적인 표적화가 가능하고, 상기 뉴클레오시드 유사 항암제와 다른 제2의 뉴클레오시드 유사 항암제가 통합됨으로써(incorporated) 그 자체로 항암 활성을 나타낼 수 있는 제2의 압타머가 상기 제1의 압타머 또는 상기 단일가닥 핵산에 추가로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 압타머, 상기 단일가닥 핵산 및 상기 제2의 압타머의 결합 순서는 (i) 압타머, 단일가닥 핵산, 제2의 압타머 순이거나, (ii) 압타머, 제2압타머, 단일가닥 핵산 순인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  43. 제40항에 있어서,
    상기 인터칼레이터 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 닥티노마이신(dactinomycin), 악티노마이신(actinomycin), 마이토잔트론(mitoxantrone) 또는 에피루비신(epirubicin)인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  44. 제40항에 있어서,
    상기 그루브 결합 항암제는 디스타마이신 A(Distamycin A), 탈리머스틴(Tallimustine), PNU-145156E, 브로스탈린(Brostallicin), CC-1065, 아도젤레신(Adozelesin), 카르젤레신(Carzelesin), 비젤레신(Bizelesin), 두카마이신 A(Ducarmycin A), 두카마이신 SA(Ducarmycin SA), KW-2189, 이로풀벤(Irofulven), 트라벡데딘(Trabectedin, ET-743), 노갈마이신(nogalamycin), 디터칼니늄 비스-나프탈리미드(ditercalinium bis-naphthalimides) 또는 아미노글리코시드(Aminoglycoside)인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  45. 제40항 또는 제41항에 있어서,
    상기 뉴클레오시드 유사 항암제는 젬시타빈(Gemcitabine), 플루다라빈(Fludarabine), 시타라빈(Cytarabine), 클라드리빈(Cladribine), 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil), 카페시타빈(Capecitabine), 펜토스타틴(Pentostatin), 아데포비어(Adefovir), 시도피비어(Cidofovir), 도시플루리딘(Doxifluridine), 에노시타빈(Enocitabine), 플록스유리딘 (Floxuridine) 또는 인산 플루다라빈(Fludarabine Phosphate)인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  46. 제40항 또는 제41항에 있어서,
    상기 압타머과 상기 단일가닥 핵산 또는 상기 압타머와 상기 단일가닥핵산 그리고 상기 제2의 압타머는 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  47. 제46항에 있어서,
    상기 공유결합은 링커를 매개로 한 공유결합인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  48. 제40항 또는 제41항에 있어서,
    상기 압타머는 DNA 압타머 또는 RNA 압타머인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  49. 제40항 또는 제41항에 있어서,
    상기 압타머는 RNA 압타머이고,
    그 RNA 압타머는 변형된 RNA 압타머이며, 그 변형된 RNA 압타머는 리보뉴클레오타이드의 당 위치, 포스페이트 위치, 염기 위치, 5' 말단 위치 및 3' 말단 위치 중 어느 하나 이상의 위치에서 화학적으로 변형된 압타머인 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  50. 제49항에 있어서,
    상기 변형된 RNA 압타머는 당의 2'-OH 기에서 OMe, O-알킬, O-알릴, S-알킬, S-알릴 및 할로겐 중 하나로 변형된 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
  51. 제40항 또는 제41항에 있어서,
    상기 압타머 기반 표적화 복합 항암제는 그 말단이 페길화된 것을 특징으로 하는, 압타머 기반 표적화 복합 항암제.
PCT/KR2020/016330 2019-11-19 2020-11-19 압타머 기반 표적화 복합 항암제 WO2021101258A2 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2019-0148279 2019-11-19
KR20190148279 2019-11-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2021101258A2 true WO2021101258A2 (ko) 2021-05-27
WO2021101258A3 WO2021101258A3 (ko) 2021-07-22

Family

ID=75980938

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2020/016330 WO2021101258A2 (ko) 2019-11-19 2020-11-19 압타머 기반 표적화 복합 항암제

Country Status (2)

Country Link
KR (4) KR20210061293A (ko)
WO (1) WO2021101258A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023160354A1 (zh) * 2022-02-22 2023-08-31 成都中医药大学 新型酸敏感性适配体雷公藤甲素偶联物及应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101337684B1 (ko) * 2011-10-17 2013-12-30 성균관대학교산학협력단 표적지향 및 치료가 가능한 다기능성 핵산 기반 항암제, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 항암제 조성물
KR101900878B1 (ko) * 2016-10-10 2018-11-08 주식회사 바이오이즈 TNF-α 결합 압타머 및 그것의 치료적 용도
KR102015524B1 (ko) * 2016-12-26 2019-08-29 인터올리고 주식회사 압타머-약물 콘쥬게이트 및 그 용도

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023160354A1 (zh) * 2022-02-22 2023-08-31 成都中医药大学 新型酸敏感性适配体雷公藤甲素偶联物及应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210148987A (ko) 2021-12-08
KR20210061300A (ko) 2021-05-27
KR20210061301A (ko) 2021-05-27
KR20210061293A (ko) 2021-05-27
WO2021101258A3 (ko) 2021-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2916671C (en) Polymeric carriers of therapeutic agents and recognition moieties for antibody-based targeting of disease sites
JP5022911B2 (ja) ゲムシタビンのアミドプロドラック、組成物、及びそれらの使用
JP2016538878A (ja) 糖鎖工学的に操作された抗体、抗体コンジュゲート、及びそれらの調製方法
CA2700267A1 (en) Azacytidine analogues and uses thereof
WO2000006771A9 (en) Nucleic acid labeling compounds
US20100151001A1 (en) Ethynylated heterodinucleoside phosphate analogs, method for the production thereof, and use thereof
WO2021101258A2 (ko) 압타머 기반 표적화 복합 항암제
Daumar et al. Design, synthesis and in vitro drug release investigation of new potential 5-FU prodrugs
CN115997016A (zh) 包含具有模块化官能团的核酸纳米颗粒的组合物
US7291463B2 (en) Nucleic acid labeling compounds
CN112955434B (zh) 包含喹啉衍生物的药物偶联物
US7282327B2 (en) Nucleic acid labeling compounds
JP5225271B2 (ja) ゲムシタビンアミドプロドラッグの結晶形、その組成物および使用
CN102083847A (zh) 新型核酸转移系统
US6864059B2 (en) Biotin containing C-glycoside nucleic acid labeling compounds
US6965020B2 (en) Nucleic acid labeling compounds
WO2021187902A1 (ko) 핵산 기반 항암제
ES2201805T3 (es) Nuevos gliceril-nucleotidos, su procedimiento de preparacion y las composiciones farmaceuticas que los contienen.
CN114306634A (zh) 包含可裂解接头的化合物及其用途
KR20220069143A (ko) 압타머 기반 표적화 복합 항암제
US7419965B2 (en) Nucleotide lipid ester derivatives
WO2018084562A1 (ko) 타겟분자를 선택적으로 포획하는 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체의 제조방법
KR20210116861A (ko) 압타머기반 입자 및 이의 제조방법
WO2021187851A1 (ko) 표적화 압타머 접합체를 캡슐화한 입자 및 이의 용도
JPH07504900A (ja) 二重作用の２′，５′−オリゴアデニレート抗ウィルス誘導体およびその使用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20890654

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20890654

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2