WO2021187748A1 - 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법 - Google Patents

뉴클레오티드의 선택적 변형 방법 Download PDF

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이양하
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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J23/00—Catalysts comprising metals or metal oxides or hydroxides, not provided for in group B01J21/00
    • B01J23/38—Catalysts comprising metals or metal oxides or hydroxides, not provided for in group B01J21/00 of noble metals
    • B01J23/40—Catalysts comprising metals or metal oxides or hydroxides, not provided for in group B01J21/00 of noble metals of the platinum group metals
    • B01J23/46—Ruthenium, rhodium, osmium or iridium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C243/00—Compounds containing chains of nitrogen atoms singly-bound to each other, e.g. hydrazines, triazanes
    • C07C243/24—Hydrazines having nitrogen atoms of hydrazine groups acylated by carboxylic acids
    • C07C243/26—Hydrazines having nitrogen atoms of hydrazine groups acylated by carboxylic acids with acylating carboxyl groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C243/30—Hydrazines having nitrogen atoms of hydrazine groups acylated by carboxylic acids with acylating carboxyl groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton
    • C07C243/32—Hydrazines having nitrogen atoms of hydrazine groups acylated by carboxylic acids with acylating carboxyl groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton the carbon skeleton containing rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical

Definitions

  • It relates to a method for selective modification of nucleotides.
  • oligonucleotides The ability for site-selective functionalization of oligonucleotides is dependent on replication (Cell , 15 , 317-325 (1978)), repair ( ACS Chem. Biol. , 13 , 1721-1733 (2016)), transcription ( Nat. Rev. Mol). DNA or RNA and proteins, such as Cell Biol. , 7 , 557-567 (2006)), translation ( Cell , 4 , 11-20 (1975)), gene silencing ( Gen , 72, 51-58 (1988)) It provides a powerful tool for the exploration of fundamental biological processes, including the interactions between In addition, methods that enable the introduction of orthogonal functionalities include immobilization of proteins by DNA ( Chem. Soc. Rev.
  • One aspect is to provide a method for selectively modifying nucleotides, comprising reacting the nucleotides with a compound of Formula 1 under a rhodium catalyst:
  • R 1 and R 2 are each independently H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted alkynyl, substituted or unsubstituted alkylaryl, substituted or unsubstituted alkoxy, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted heterocycle, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted acyl, substituted or unsubstituted aromatic, alcohol, alkoxy, amino , amido, nitro, ether, ester, halogen, ketone, cyano, carboxy, hydroxy, thiol, aldehyde, carbonyl, phosphorus, sulfur, phosphate, phosphat, phosphite, sulfate, disulfide, oxy, mer selected from the group consisting of
  • Another aspect comprises the steps of reacting a nucleotide with a compound of Formula 1 under a rhodium catalyst to obtain a first product;
  • a method for producing chemically linked nucleotides comprising reacting the first product with a compound of Formula 3,
  • the nucleotide forms a single-stranded nucleotide template and a duplex with the single-stranded nucleotide template, and consists of two or more single-stranded nucleotides having an overhanging guanosine, providing a manufacturing method :
  • R 1 and R 2 are each independently H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted alkynyl, substituted or unsubstituted alkylaryl, substituted or unsubstituted alkoxy, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted heterocycle, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted acyl, substituted or unsubstituted aromatic, alcohol, alkoxy, amino , amido, nitro, ether, ester, halogen, ketone, cyano, carboxy, hydroxy, thiol, aldehyde, carbonyl, phosphorus, sulfur, phosphate, phosphat, phosphite, sulfate, disulfide, oxy, mer selected from the group consisting of
  • n 1 to 10
  • Another aspect is to provide a method for preparing photocaged nucleotides, comprising reacting the nucleotides with a compound of Formula 1 under a rhodium catalyst:
  • R 1 and R 2 are each independently H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted alkynyl, substituted or unsubstituted alkylaryl, substituted or unsubstituted alkoxy, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted heterocycle, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted acyl, substituted or unsubstituted aromatic, alcohol, alkoxy, amino , amido, nitro, ether, ester, halogen, ketone, cyano, carboxy, hydroxy, thiol, aldehyde, carbonyl, phosphorus, sulfur, phosphate, phosphat, phosphite, sulfate, disulfide, oxy, mer selected from the group consisting of
  • Another aspect is to obtain a second product by reacting a double-stranded nucleotide in which one strand is guanosine bulged (G-bulged) with a compound of Formula 1 under a rhodium catalyst;
  • R 1 and R 2 are each independently H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted alkynyl, substituted or unsubstituted alkylaryl, substituted or unsubstituted alkoxy, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted heterocycle, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted acyl, substituted or unsubstituted aromatic, alcohol, alkoxy, amino , amido, nitro, ether, ester, halogen, ketone, cyano, carboxy, hydroxy, thiol, aldehyde, carbonyl, phosphorus, sulfur, phosphate, phosphat, phosphite, sulfate, disulfide, oxy, mer selected from the group consisting of
  • X is a fluorescent material
  • Another aspect is to provide a method for preparing a derivative of a modified nucleotide comprising the step of reacting a derivative of the nucleotide with a compound of Formula 1 under a rhodium catalyst:
  • R 1 and R 2 are each independently H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted alkynyl, substituted or unsubstituted alkylaryl, substituted or unsubstituted alkoxy, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted heterocycle, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted acyl, substituted or unsubstituted aromatic, alcohol, alkoxy, amino , amido, nitro, ether, ester, halogen, ketone, cyano, carboxy, hydroxy, thiol, aldehyde, carbonyl, phosphorus, sulfur, phosphate, phosphat, phosphite, sulfate, disulfide, oxy, mer selected from the group consisting of
  • One aspect relates to a method for selective modification of nucleotides comprising reacting the nucleotides with a compound of Formula 1 under a rhodium catalyst:
  • R 1 and R 2 are each independently H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted alkynyl, substituted or unsubstituted alkylaryl, substituted or unsubstituted alkoxy, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted heterocycle, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted acyl, substituted or unsubstituted aromatic, alcohol, alkoxy, amino , amido, nitro, ether, ester, halogen, ketone, cyano, carboxy, hydroxy, thiol, aldehyde, carbonyl, phosphorus, sulfur, phosphate, phosphat, phosphite, sulfate, disulfide, oxy, mer selected from the group consisting of
  • the nucleotide it is possible to deform the O 6 position of guanine with selective of the four bases of the nucleotide, it is possible to deform the O 6 position of guanine Specifically, unless paired (unpaired), More specifically, the modification may be that a carbonyl group is bonded to the O 6 position of an unpaired guanine.
  • the reaction is possible with a small amount of catalyst and a low reaction concentration, and it is kinetically fast, and the reaction is possible in air.
  • the rhodium catalyst is [Rh(COD)Cl] 2 , [Rh(OH)(COD)] 2 , Rh(COD)(acac), [Rh(COD)(MeCN) 2 ]BF 4 , [Rh(COD) 2 ]OTf, Rh(C 8 H 14 ) 2 (acac), Rh(C 2 H 4 ) 2 (acac), Rh(nbd)(acac), Rh(nbd) 2 BF 4 , Rh(nbd) 2 ( OTf), [Rh(nbd)Cl] 2 , Rh(COD) 2 SbF 6 , (CAAC-Cy)Rh(COD)Cl, [Rh(COD) 2 ]BARF, [Rh(COE) 2 Cl] 2 , [RhCl(C 6 H 10 )] 2 , (1,5-Cyclooctadiene)(8-quinolinolato)rhodium(I
  • the [Rh(COD)Cl] 2 may be specifically a compound of Formula 8:
  • the rhodium catalyst When the rhodium catalyst is a Rh(II) catalyst, it may not be able to cause nucleotide modification due to poor reactivity, and when the rhodium catalyst is a Rh(I) catalyst, a reaction may occur.
  • the rhodium catalyst is [Rh(OH)(COD)] 2 or Rh(COD)(acac)
  • the yield of modified nucleotides may be high, the reaction time may be small, and the rhodium catalyst is [Rh(COD)] )Cl] 2 , the yield of the modified nucleotide is highest and the reaction time may be short.
  • the amount of the rhodium catalyst is 0.01 to 1000 mol%, 0.01 to 500 mol%, 0.01 to 100 mol%, 0.1 to 1000 mol%, 0.1 to 500 mol%, relative to the total number of moles of the nucleotide, the compound of Formula 1 and the rhodium catalyst , 0.1 to 100 mol%, 1 to 1000 mol%, 1 to 500 mol% or 1 to 100 mol%, specifically 0.1 to 500 mol%, 0.1 to 100 mol%, %, 1 to 500 mol% or It may be 1 to 100 mol%, more specifically 1 to 100 mol%.
  • the reaction ratio of the rhodium catalyst is less than 0.01 mol% relative to the total number of moles of the nucleotides, the compound of Formula 1 and the rhodium catalyst, the reaction may not occur or the reaction time may be prolonged, and if it exceeds 1000 mol%, the yield may be poor have.
  • the reaction ratio of the rhodium catalyst is 0.01 to 1000 mol% relative to the total number of moles of the nucleotides, the compound of Formula 1 and the rhodium catalyst, the yield may be better or the reaction time may be reduced, and when it is 1 to 100 mol%, the most The yield is good, and the reaction time can be reduced.
  • the nucleotide may include a nucleotide having a guanine (G) base or a derivative of a nucleotide having a guanine (G) base, wherein the nucleotide is selected from the group consisting of single nucleotides, oligonucleotides and polynucleotides at least one nucleotide.
  • G guanine
  • G guanine
  • the method for selectively modifying a nucleotide selectively modifies the O 6 position of guanine in a nucleotide having a guanine base, and the nucleotide may be a single nucleotide, an oligonucleotide, or a polynucleotide, and the length of the nucleotide is not limited.
  • the nucleotide may include at least one structure selected from the group consisting of a hairpin structure, a duplex structure, a single-stranded structure, a double-stranded structure, and a guanosine bulged structure.
  • the guanosine bulged (G-bulged) structure refers to a structure that is good to participate in the reaction by protruding only the guanosine portion because guanosine is not paired among the linked nucleotides.
  • hairpin structure duplex structure, single-stranded structure, double-stranded structure, and guanosine bulged (G-bulged) structure, and may cause modification of unpaired guanosine in the structure.
  • the nucleotide derivative may be at least one compound selected from the group consisting of a compound of Formula 9, a compound of Formula 10, and a compound of Formula 12:
  • the compound of Formula 1 may be at least one compound selected from the group consisting of diazoacetone (DAX) and a compound of Formula 2 below, and specifically diazoacetone (DAX) may be:
  • the yield of the modified nucleotide may be higher and the reaction rate may be faster, and the compound of Formula 1 is diazoacetone In the case of (diazoacetone, DAX), the yield may be higher and the reaction rate may be faster.
  • the diazoacetone (DAX) may be a compound of Formula 14:
  • the reaction ratio of the compound of Formula 1 is 0.1 to 100 equivalents (equiv.), 0.1 to 50 equivalents, 0.1 to 30 equivalents, 0.5 to 100 equivalents, 0.5 to 50 equivalents, 0.5 to 30 equivalents, 1 to 100 equivalents relative to the nucleotides. , 1 to 50 equivalents or 1 to 30 equivalents, specifically 0.5 to 50 equivalents, 0.5 to 30 equivalents, 1 to 50 equivalents, or 1 to 30 equivalents, and more specifically 1 to 30 equivalents.
  • reaction ratio of the compound of Formula 1 When the reaction ratio of the compound of Formula 1 is less than 0.1 equivalents (equiv.) relative to the nucleotide, the reaction may not occur or the yield may be poor, and if it exceeds 100 equivalents, the reaction time may be prolonged or the yield may be poor, and the When the reaction ratio of the compound of Formula 1 is 0.1 to 100 equivalents, the yield may be better or the reaction time may be shortened. When the reaction ratio of the compound of Formula 1 is 1 to 30 equivalents, the yield is the best and the reaction time is short. can
  • the solvent of the reaction may be a cosolvent or water in which at least one compound selected from the group consisting of tetrahydrofuran (THF) and dimethyl sulfoxide (DMSO) and water are mixed, specifically, the reaction
  • the solvent may be a cosolvent in which tetrahydrofuran and water are mixed or water.
  • the solvent of the reaction is a cosolvent or water in which at least one compound selected from the group consisting of tetrahydrofuran (THF) and dimethyl sulfoxide (DMSO) and water are mixed
  • nucleotides may be selectively modified, and the reaction may not occur when a cosolvent containing other compounds or a solvent not containing water is used.
  • the concentration in the cosolvent of the at least one compound selected from the group consisting of tetrahydrofuran and dimethyl sulfoxide is 0.1 to 70% by volume, 0.1 to 60% by volume, 0.1 to 55% by volume, 1 to 70% by volume, 1 to 60% by volume, 1 to 55% by volume, 5 to 70% by volume, 5 to 60% by volume, or 5 to 55% by volume, specifically 1 to 60% by volume , 1 to 55% by volume, 5 to 60% by volume or 5 to 55% by volume, more specifically 5 to 55% by volume.
  • the solvent of the reaction is a cosolvent
  • concentration in the cosolvent of at least one compound selected from the group consisting of tetrohydrofuran and dimethyl sulfoxide exceeds 70% by volume
  • the reaction may not occur.
  • the yield of the modified nucleotides may be good or the reaction time may be shortened, and if it is 55 vol% or less, the yield may be better or the reaction time may be shorter.
  • the reaction is pH 3 to 10, pH 3 to 9, pH 3 to 8, pH 4 to 10, pH 4 to 9, pH 4 to 8, pH 5 to 10, pH 5 to 9 or It may be made under the conditions of pH 5 to 8, specifically, it may be made under the conditions of pH 4 to 9, pH 4 to 8, pH 5 to 9, or pH 5 to 8, and more specifically, conditions of pH 5 to 8 may be made in
  • the reaction proceeds under the conditions of less than 3 or more than 10, the reaction does not proceed, the yield of modified nucleotides is not good, the reaction time may be too long, and the reaction is carried out under the conditions of pH 4 to 9
  • the yield of the modified nucleotide may be better, the reaction time may be shortened, and when the reaction is carried out at pH 5 to 8, the yield of the modified nucleotide may be the best, and the reaction time may be shortened the most .
  • the reaction is a 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid (2-[N-morpholino]ethansulfonic acid, MES) buffered aqueous solution and 3-[N-morpholino]propanesulfonic acid (3-morpholinopropane -1-sulfonic acid, MOPS) may be formed from at least one buffered aqueous solution selected from the group consisting of buffered aqueous solutions.
  • the nucleotide modification yield may be poorer or the reaction may not proceed at all.
  • the reaction is sodium chloride (NaCl), magnesium chloride (MgCl 2 ), potassium chloride (KCl), sodium acetate (sodium acetate, NaOAc), magnesium acetate (magnesium aceate, Mg (OAc) 2 ) and potassium acetate (Potassium acetate, KOAc) may be formed by adding at least one additive selected from the group consisting of.
  • the cation of the additive masks the negative charge of the phosphate of the nucleotide to help form a secondary structure.
  • Another aspect comprises the steps of reacting a nucleotide with a compound of Formula 1 under a rhodium catalyst to obtain a first product;
  • the nucleotides form a single-stranded nucleotide template and a duplex with the single-stranded nucleotide template, and are composed of two or more single-stranded nucleotides with overhangs guanosine.
  • R 1 and R 2 are each independently H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted alkynyl, substituted or unsubstituted alkylaryl, substituted or unsubstituted alkoxy, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted heterocycle, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted acyl, substituted or unsubstituted aromatic, alcohol, alkoxy, amino , amido, nitro, ether, ester, halogen, ketone, cyano, carboxy, hydroxy, thiol, aldehyde, carbonyl, phosphorus, sulfur, phosphate, phosphat, phosphite, sulfate, disulfide, oxy, mer selected from the group consisting of
  • n 1 to 10
  • Chemically ligated nucleotides can be easily and quickly prepared by using the nucleotide modification method according to an aspect.
  • a method for producing a chemically ligated nucleotide according to an aspect includes the step of reacting the nucleotide with the compound of Formula 1 under a rhodium catalyst to obtain a first product, some of the steps of obtaining the first product are as described above It may be within the range, and the solvent, aqueous buffer solution, pH conditions, additives, etc. may also be within the above-mentioned range.
  • the compound of Formula 1 may be at least one compound selected from the group consisting of diazoacetone (DAX) and a compound of Formula 2 below:
  • DAX diazoacetone
  • the rhodium catalyst is [Rh(COD)Cl] 2 , [Rh(OH)(COD)] 2 , Rh(COD)(acac), [Rh(COD)(MeCN) 2 ]BF 4 , [Rh( COD) 2 ]OTf, Rh(C 8 H 14 ) 2 (acac), Rh(C 2 H 4 ) 2 (acac), Rh(nbd)(acac), Rh(nbd) 2 BF 4 , Rh(nbd) 2 (OTf), [Rh(nbd)Cl] 2 , Rh(COD) 2 SbF 6 , (CAAC-Cy)Rh(COD)Cl, [Rh(COD) 2 ]BARF, [Rh(COE) 2 Cl] 2 , [RhCl(C 6 H 10 )] 2 , (1,5-Cyclooctadiene)(8-quinolinolato)rhodium(
  • the [Rh(COD)Cl] 2 may be specifically a compound of Formula 8:
  • the first product forms a duplex with the single-stranded nucleotide template
  • the O 6 position of the guanine of guanosine of two or more single-stranded nucleotides having overhanged guanosine is modified may be one, the O 6 position of the unpaired guanine may be modified, and more specifically, the carbonyl group may be bonded to the O 6 position of the unpaired guanine.
  • the number of single-stranded nucleotides having the overhanging guanosine may be two.
  • the prepared nucleotide may be a total of three nucleotides with two chemically linked single-stranded nucleotides and a nucleotide template.
  • a method for preparing chemically ligated nucleotides according to an aspect includes reacting the first product with the compound of Formula 3;
  • the step of reacting the first product with the compound of Formula 3 forms a duplex with the single-stranded nucleotide template, and two or more single-stranded nucleotides having overhanging guanosine guanosine O of guanine
  • the carbonyl group present at the 6- position may react with the compound of Formula 3 as a linker to be connected in the form of oxime ether.
  • n may be 1 to 5, and more specifically, 2 to 3. When n is 0, there is no linker to be chemically connected, and when n is more than 10, too large a ring is formed and may be unstable.
  • Another aspect relates to a method for preparing photocaged nucleotides comprising reacting the nucleotides with a compound of Formula 1 under a rhodium catalyst:
  • R 1 and R 2 are each independently H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted alkynyl, substituted or unsubstituted alkylaryl, substituted or unsubstituted alkoxy, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted heterocycle, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted acyl, substituted or unsubstituted aromatic, alcohol, alkoxy, amino , amido, nitro, ether, ester, halogen, ketone, cyano, carboxy, hydroxy, thiol, aldehyde, carbonyl, phosphorus, sulfur, phosphate, phosphat, phosphite, sulfate, disulfide, oxy, mer selected from the group consisting of
  • nucleotide modification method it is possible to make photocaged nucleotides that have to undergo a complex synthesis process in a single step, thereby reducing the reaction time, excellent yield, and not wasting the compound for production.
  • the step of reacting the nucleotide with the compound of Formula 1 under the rhodium catalyst may be within the aforementioned range, and a solvent, aqueous buffer solution, pH conditions, additives, etc. may also be within the aforementioned range.
  • the compound of Formula 1 may be at least one compound selected from the group consisting of diazoacetone (DAX) and a compound of Formula 2 below:
  • DAX diazoacetone
  • the rhodium catalyst is [Rh(COD)Cl] 2 , [Rh(OH)(COD)] 2 , Rh(COD)(acac), [Rh(COD)(MeCN) 2 ]BF 4 , [Rh( COD) 2 ]OTf, Rh(C 8 H 14 ) 2 (acac), Rh(C 2 H 4 ) 2 (acac), Rh(nbd)(acac), Rh(nbd) 2 BF 4 , Rh(nbd) 2 (OTf), [Rh(nbd)Cl] 2 , Rh(COD) 2 SbF 6 , (CAAC-Cy)Rh(COD)Cl, [Rh(COD) 2 ]BARF, [Rh(COE) 2 Cl] 2 , [RhCl(C 6 H 10 )] 2 , (1,5-Cyclooctadiene)(8-quinolinolato)rhodium(
  • the [Rh(COD)Cl] 2 may be specifically a compound of Formula 8:
  • the nucleotide may be a nucleotide having a guanine (G) base, and the nucleotide may be at least one nucleotide selected from the group consisting of a single nucleotide, an oligonucleotide, and a polynucleotide.
  • G guanine
  • the method for producing a photocaged nucleotide according to an aspect may be to selectively modify the O 6 position of guanine in a nucleotide having a guanine base, specifically, the O 6 position of an unpaired guanine is modified It may be one, and more specifically, it may be to bond a carbonyl group to the O 6 position of an unpaired guanine.
  • the nucleotide may be a single nucleotide, an oligonucleotide, or a polynucleotide, and the length of the nucleotide is not limited.
  • Another aspect is to obtain a second product by reacting a double-stranded nucleotide in which one strand is guanosine bulged (G-bulged) with a compound of Formula 1 under a rhodium catalyst;
  • a method for preparing a conjugate of a fluorescent substance-labeled nucleotide and a protein comprising subjecting the sixth product to a reductive amination reaction with a protein having a lysine residue under a reducing agent:
  • R 1 and R 2 are each independently H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted alkynyl, substituted or unsubstituted alkylaryl, substituted or unsubstituted alkoxy, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted heterocycle, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted acyl, substituted or unsubstituted aromatic, alcohol, alkoxy, amino , amido, nitro, ether, ester, halogen, ketone, cyano, carboxy, hydroxy, thiol, aldehyde, carbonyl, phosphorus, sulfur, phosphate, phosphat, phosphite, sulfate, disulfide, oxy, mer selected from the group consisting of
  • X is a fluorescent material
  • a conjugate of a fluorescent substance-labeled nucleotide and a protein can be easily and quickly prepared.
  • Some of the steps of obtaining the second product and obtaining the sixth product may be within the above-described ranges, and solvents, aqueous buffer solutions, pH conditions, additives, and the like may also be within the above-described ranges.
  • the compound of Formula 1 may be at least one compound selected from the group consisting of diazoacetone (DAX) and a compound of Formula 2 below:
  • DAX diazoacetone
  • the rhodium catalyst is [Rh(COD)Cl] 2 , [Rh(OH)(COD)] 2 , Rh(COD)(acac), [Rh(COD)(MeCN) 2 ]BF 4 , [Rh( COD) 2 ]OTf, Rh(C 8 H 14 ) 2 (acac), Rh(C 2 H 4 ) 2 (acac), Rh(nbd)(acac), Rh(nbd) 2 BF 4 , Rh(nbd) 2 (OTf), [Rh(nbd)Cl] 2 , Rh(COD) 2 SbF 6 , (CAAC-Cy)Rh(COD)Cl, [Rh(COD) 2 ]BARF, [Rh(COE) 2 Cl] 2 , [RhCl(C 6 H 10 )] 2 , (1,5-Cyclooctadiene)(8-quinolinolato)rhodium(
  • the [Rh(COD)Cl] 2 may be specifically a compound of Formula 8:
  • the step of obtaining the second product may be one in which the O 6 position of the guanine of bulged guanosine in the guanosine bulged strand among the double-stranded nucleotides is selectively modified, specifically, the O 6 position of unpaired guanine.
  • the 6- position may be modified, and more specifically, a carbonyl group may be bonded to the O 6 position of an unpaired guanine.
  • the second product may be one in which the O 6 position of the guanine of the bulged guanosine is modified.
  • a method for preparing a conjugate of a fluorescent substance-labeled nucleotide and a protein includes reacting the second product with the compound of Formula 4 to obtain a third product.
  • the second product may be bound by reaction with an amine group of the compound of Formula 4, for example, the bound form may be an oxime form.
  • X of the compound of Formula 4 may be a fluorescent material, and the fluorescent material is fluorescein, BODIPY, Tetramethylrhodamine, Alexa, Cyanine, Allo. It may be at least one fluorescent material selected from the group consisting of phycocyanin, rhodamine B, and derivatives thereof, and specifically may be a derivative of rhodamine B represented by the compound of Formula 5 below. have:
  • the method for preparing a fluorescent substance-labeled nucleotide and protein conjugate includes the step of isolating the third product to obtain a fluorescent substance-labeled single-stranded fourth product.
  • the third product may be a modified double-stranded nucleotide in the form of a fluorescent substance and an oxime, and separation of the third product corresponds to denaturation as separating the double-stranded into a single-stranded. After that, only a single strand labeled with a fluorescent substance can be isolated and obtained.
  • the denaturation may be used without limitation as long as it is a known method, for example, it may be by applying heat.
  • the separation of the fourth product which is a single-stranded single-stranded fluorescent substance, can be used without limitation as long as it is a known separation method.
  • it may be separation using chromatography, specifically, separation using HPLC can
  • one strand is guanosine bulged (G-bulged) by binding a single-stranded nucleotide complementary to the fourth product to the fourth product. obtaining a fifth product of the strand.
  • Single-stranded nucleotides complementary to the fourth product may be prepared by designing from the base sequence of the fourth product.
  • the fifth product of the guanosine bulged double strand is not limited, as the guanosine bulged strand may be a fluorescent material-labeled strand or a complementary strand thereof.
  • the method for preparing a conjugate of a fluorescent substance-labeled nucleotide and a protein comprises the step of reacting the fifth product of the double strand with a compound of Formula 1 under a rhodium catalyst to obtain a sixth product, the specific method is It may be within the above-mentioned range.
  • the guanosine bulged double-stranded fifth product may be reacted with Formula 1 to selectively modify the O 6 position of the guanine of bulged guanosine to obtain a sixth product, specifically unpaired
  • the O 6 position of guanine may be modified, and more specifically, a carbonyl group may be bonded to the O 6 position of unpaired guanine.
  • the method for preparing a conjugate of a fluorescent substance-labeled nucleotide and a protein comprises the step of subjecting the sixth product to a reductive amination reaction with a protein having a lysine residue under a reducing agent.
  • the reducing agent may be used without limitation as long as it is a reducing agent capable of causing reductive amination, for example, NaBH 3 CN, NaBH 4 , LiBH 3 CN and NaBH(OCOCH 3 ) 3 Selected from the group consisting of It may be at least one reducing agent.
  • the sixth product may be a double-stranded nucleotide labeled with a fluorescent substance in which the O 6 position of the guanine of bulged guanosine is selectively modified, and the bulged guanine position is combined with a protein through a reductive amination reaction to fluoresce
  • a conjugate of a substance-labeled nucleotide and a protein may be prepared.
  • the protein must have lysine as an amino acid residue, and through this, the reductive amination reaction occurs well, so that a conjugate of a fluorescent substance-labeled nucleotide and a protein can be easily and quickly prepared.
  • Another aspect relates to a method for preparing a derivative of a modified nucleotide comprising the step of reacting the derivative of the nucleotide with a compound of Formula 1 under a rhodium catalyst:
  • R 1 and R 2 are each independently H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted alkynyl, substituted or unsubstituted alkylaryl, substituted or unsubstituted alkoxy, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted heterocycle, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted acyl, substituted or unsubstituted aromatic, alcohol, alkoxy, amino , amido, nitro, ether, ester, halogen, ketone, cyano, carboxy, hydroxy, thiol, aldehyde, carbonyl, phosphorus, sulfur, phosphate, phosphat, phosphite, sulfate, disulfide, oxy, mer selected from the group consisting of
  • nucleotide in the method for preparing a derivative of a modified nucleotide according to an aspect, “nucleotide”, “solvent”, “aqueous buffer solution”, “pH condition”, “additive”, etc. may be within the above-described range.
  • the nucleotide derivative may include a nucleotide derivative having a guanine (G) base, and specifically, the nucleotide derivative is a compound of Formula 9, a compound of Formula 10, and Formula It may be at least one compound selected from the group consisting of 12 compounds:
  • the derivative of the modified nucleotide may be one in which a guanine base portion in the structure of a derivative of a nucleotide having a guanine base is modified, and specifically, the derivative of the modified nucleotide is a compound of Formula 10 below, It may be at least one compound selected from the group consisting of a compound of Formula 11 and a compound of Formula 13 below:
  • the rhodium catalyst is [Rh(COD)Cl] 2 , [Rh(OH)(COD)] 2 , Rh(COD)(acac), [Rh(COD)(MeCN) 2 ]BF 4 , [Rh(COD) 2 ]OTf, Rh(C 8 H 14 ) 2 (acac), Rh(C 2 H 4 ) 2 (acac), Rh(nbd)(acac), Rh(nbd) 2 BF 4 , Rh (nbd) 2 (OTf), [Rh(nbd)Cl] 2 , Rh(COD) 2 SbF 6 , (CAAC-Cy)Rh(COD)Cl, [Rh(COD) 2 ]BARF, [Rh(COE) 2 Cl] 2 , [RhCl(C 6 H 10 )] 2 , (1,5-Cyclooctadiene)(8-quinolinolato)rhodium
  • the [Rh(COD)Cl] 2 may be specifically a compound of Formula 8:
  • a nucleotide modification method includes chemical ligation, preparation of photocaged nucleotides, preparation of a fluorescent substance-labeled nucleotide and protein conjugate (interaction between protein and nucleic acid), sequencing, It can be used in various fields such as DNA nanotechnology, DNA damage and repair, and development of a molecular beacon probe, and the application fields are the above-described chemical ligation, photo It is not limited to the preparation of the caged (photocaged) nucleotide and the preparation of the fluorescent substance-labeled nucleotide and the protein conjugate.
  • Selective deformation of the nucleotide it is possible to deform the O 6 position of guanine with selective of the four bases of the nucleotide, more specifically, (unpaired) that are paired, and can deform the O 6 position of guanine,
  • the reaction is possible with a small amount of catalyst and a low reaction concentration, and it is kinetically fast, and the reaction is possible in air.
  • chemically ligated nucleotides can be easily and quickly prepared, and photocaged nucleotides, which have to undergo a complex synthesis process, can be produced in a single step, and fluorescent material-labeled nucleotides and proteins can be prepared, and even derivatives of nucleotides can be modified, so it can be applied to various techniques using nucleotides with modified guanine.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a selective modification method according to an aspect of an oligonucleotide.
  • FIG. 2 is a view showing a selective modification method according to an aspect of guanosine bulged (G-bulged) nucleotides.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a method of chemically ligating ODN by applying a selective modification method according to an aspect.
  • FIG. 4 is a diagram showing denaturing PAGE analysis of ligation visualized using SYBR gold (Lanes; 1: before acetonylation, 2: after acetonylation, 3: after ligation, 4: 5a of FIG. 3, 5: 5b of FIG. 3) , 6: 5c of FIG. 3)
  • FIG. 5A is a diagram illustrating a photocaged oligonucleotide
  • FIG. 5B is a diagram illustrating a synthesis step according to an existing method of a photocaged oligonucleotide.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating the preparation of a photocaged oligonucleotide using a selective modification method according to an aspect.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating modification of various oligonucleotides by a selective modification method according to an aspect.
  • FIG. 8 is a schematic diagram illustrating cross-linking between modified DNA and a protein using a method for selectively modifying nucleotides according to an aspect.
  • FIG. 9 is a diagram schematically illustrating a process of fluorescent labeling and crosslinking with proteins using a method for selectively modifying nucleotides according to an aspect in whole cell lysate of E. coli.
  • FIG. 11 is a schematic diagram illustrating a method for selective modification of nucleotides according to an aspect.
  • FIG. 12 is a diagram showing the process and results of selective modification of nucleotides according to solvents.
  • reaction vessel was dried in an oven overnight and then cooled to room temperature before use.
  • Thin layer chromatography was performed using a plate coated with Kieselgel 60F254 (Merck), and for flash column chromatography, P60 silica gel (230 - 400 mesh) was used.
  • Nuclear magnetic resonance spectra ( 1 H and 13 C NMR) were recorded on an Agilent 400-MR DD2 Fourier-transform NMR spectrometer, and chemical shifts are described in parts per million (ppm). Resonance patterns are represented together by s (singlet), d (doublet), t (triplet), q (quartet), q (quintet), sext (sextet) and m (multiplet), and br represents a broad signal. used The coupling constant (J) is expressed in hertz (Hz).
  • IR spectra were recorded on a Perkin Elmer Spectrum Two infrared spectrophotometer and expressed in cm ⁇ 1 .
  • HRMS High-resolution mass spectra
  • HPLC-MS High performance liquid chromatography-mass spectrometry
  • a metal carbene complex including Cu(I, II), Fe(III), Ir(I), and Rh(I, II) is formed.
  • Metal catalysts (5 mol%) were screened for base-selectivity with DAX and four nucleobases in 50% THF-H 2 O as model substrates (Table 1, entry 1 to 7).
  • nucleoside 5 mM
  • catalyst 10 mol%
  • diazo compound 8 equiv.
  • 10% THF-H 2 O MES (20 mM)
  • pH 6.0 room temperature
  • the catalyst suitable for the reaction of the present invention should have a) the ability to form a metal carbene complex that balances the reactivity and selectivity to the target and the stability in the aqueous buffer solution, b) a high turnover number for a small amount of catalyst used did.
  • DAX diazoacetone
  • Example 3 as in the reaction shown in Figure 1, various types of oligonucleotides (ssODNs (single-stranded oligodeoxynucleotides), ssORNs (single-stranded oligoribonucleotides), hairpins and duplexes) are also guano with DAX and Rh(I) catalysts.
  • ssODNs single-stranded oligodeoxynucleotides
  • ssORNs single-stranded oligoribonucleotides
  • hairpins and duplexes are also guano with DAX and Rh(I) catalysts.
  • Example 4 as in the reaction shown in FIG. 2, it was attempted to check whether the selective acetonylation reaction of guanosine with DAX and Rh(I) catalysts is possible even in bulge G duplexes and hairpins.
  • FIG. 3 it was attempted to chemically link the ODN by the method of the present invention. Specifically, as shown in FIG. 3, it forms a duplex with the oligonucleotide template (5a (SEQ ID NO: 45) in FIG. 3), and two single-stranded oligonucleotides having an overhang guanosine (in FIG. 3) 5b (SEQ ID NO: 46) and 5c (SEQ ID NO: 47)) in the system, using a catalyst of [Rh(COD)Cl] 2 and diazoacetone (DAX) 5a, 6b (SEQ ID NO: 48) and 6c (SEQ ID NO: 48) and 6c (sequences No. 49) was formed, and a ligated oligodeoxyribonucleotide (ODN) was obtained by reacting a compound of Formula 6 (dialkoxyamine) as a linker.
  • DAX diazoacetone
  • FIG. 5A The basic synthesis of photocaged oligonucleotides starts from the synthesis of phosphoramidite monomolecules with photocleavable groups (FIG. 5A), which mainly involves a long synthesis process.
  • Woodson group reported a temporally controlled Hfq-promoting annealing study using photocaged oligoribonucleotides (ORNs).
  • ORNs photocaged oligoribonucleotides
  • oligonucleotides (7a (SEQ ID NO: 51), 7c (SEQ ID NO: 53) and 7e (SEQ ID NO: 55)) were mixed with [Rh(COD)Cl] 2 with a catalyst of Formula 2 Oligonucleotides (7b (SEQ ID NO: 52), 7d (SEQ ID NO: 54) and 7f (SEQ ID NO: 56) with external, internal and hairpin overhang) modified using the compound of formed.
  • Crosslinking was performed through reductive amination, and 14a of FIG. 9 was incubated with NaCNBH 3 in E. coli lysate mixed with T7 RNAP (lane 1 in Table 5).
  • Control experiments were also performed as follows: a) without T7 RNAP (lane 2 of Table 5), b) with only lysate (lane 3 of Table 5), c) without NaCNBH 3 (lane 4 of Table 5) ), d) without lysate (lane 5 of Table 5), e) with only T7 RNAP (lane 6 of Table 5), f) with only 14a of FIG. 9 (lane 7 of Table 5).
  • Example 1 a cosolvent of THF-H 2 O was used for nucleotide modification, but in Example 8, THF was not included and only H 2 O was used as a solvent to test whether nucleotide modification could occur.
  • the experimental conditions were the same as in FIG. 12A, and the oligonucleotide of a hairpin structure (SEQ ID NO: 57, compound 7b) was reacted with diazoacetone (DAX) under 10 mol% [Rh(COD)Cl] 2 catalyst to selectively modify guanine.
  • DAX diazoacetone
  • the solvent was reacted by comparison with H 2 O or 10% THF-H 2 O.
  • an oligonucleotide (SEQ ID NO: 59, compound 8b-OX) having oxime bound to guanine was formed through the subsequent oxime formation reaction, and it was confirmed whether the compounds 8b and 8b-OX were well formed.
  • Example 9 it was attempted to check whether the selective acetonylation of guanosine with DAX and Rh(I) catalysts is possible with nucleotide derivatives in addition to various types of nucleotides.
  • Cyclic diguanylate (c-di-GMP, cyclic diguanylate, CAS: 61093-23-0), which is a nucleotide derivative, was also subjected to an experiment as shown in Scheme 3 to see if selective modification was possible:

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Abstract

일 양상에 따르면, 로듐 촉매 하에서 뉴클레오티드와 화학식 1의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법에 관한 것으로, 뉴클레오티드의 4개의 염기 중 선택적으로 구아닌의 O6 위치를 변형시킬 수 있고, 구체적으로, 짝을 이루지 않는(unpaired) 구아닌의 O6 위치를 변형시킬 수 있으며, 적은 양의 촉매, 낮은 반응 농도에서 반응이 가능하며, 동역학적으로 빠르고, 공기 중에서도 반응이 가능하며, 뉴클레오티드라면 단일 뉴클레오티드, 올리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 모두 선택적 변형이 가능하다. 나아가, 상기 방법을 이용하여, 화학적으로 연결된(chemical ligated) 뉴클레오티드를 쉽고 빠르게 제조할 수 있고, 복잡한 합성 과정을 거쳐야 하는 포토케이지된(photocaged) 뉴클레오티드를 단일 단계로 가능하며, 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체를 제조할 수 있고, 뉴클레오티드의 유도체들까지도 변형이 가능하므로, 변형된 구아닌을 지닌 뉴클레오티드를 활용한 다양한 기술에 적용할 수 있다.

Description

뉴클레오티드의 선택적 변형 방법
뉴클레오티드의 선택적 변형 방법에 관한 것이다.
올리고뉴클레오티드의 위치 선택적인 기능화를 위한 능력은 복제(Cell, 15, 317-325 (1978)), 복구(ACS Chem. Biol., 13, 1721-1733 (2018)), 전사(Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 7, 557-567 (2006)), 번역(Cell, 4, 11-20 (1975)), 유전자 침묵(Gene, 72, 51-58 (1988))과 같은 DNA 혹은 RNA와 단백질 사이의 상호작용을 포함하는 근본적인 생물학적 과정의 탐구를 위한 강력한 도구를 제공한다. 또한, 직교적인 기능성(orthogonal functionalities)의 도입을 가능하게 하는 방법은 DNA에 의한 단백질의 고정(Chem. Soc. Rev., 40, 5910-5921 (2011)), DNA-templated synthesis (Angew. Chem. Int. Ed., 52, 6820-6843 (2013)), aptamer (Angew. Chem. Int. Ed., 56, 11954-11957 (2017)), 그리고 DNA origami(Angew. Chem. Int. Ed., 57, 10436-10448 (2018))를 기반으로 한 광범위한 생명기술과 DNA 나노기술의 개발을 촉진시킬 것으로 생각된다. 하지만, 제한적인 기능성과 부족한 반응성으로 인해, 화학적인 방법을 기반으로 한 핵산의 합성 후 변형방법은 매우 제한되어 있고, 위치 선택성 또한 그러하다.
기존의 올리고뉴클레오티드의 위치 선택적 변형 방법은 일반적으로 미리 기능화된 nucleoside phosphoramidite 단분자 제조에 의존하는데(Bioconjugate Chem., 1, 165-187 (1990)), 이 방법은 대부분 많은 시간과 노력이 필요한 합성을 포함한다. 한편, methyltransferase를 사용하는 효소를 기반으로 한 합성 후 변형 방법이 개발된 바 있고(Angew. Chem. Int. Ed., 56, 5182-5200 (2017)), 비록 norbornene 또는 allyl과 같은 유용한 기능성을 가진 올리고뉴클레오티드의 효율적인 제조 방법을 개시했지만, 이러한 방법들은 보통 효소와 보조인자들의 설계 과정에 오랜 시간이 걸린다는 단점이 있었다.
한편, metal carbene 복합체의 독특한 반응성을 바탕으로 bioconjugation을 포함한 다양한 합성 방법들이 개발되었으며, 몇몇 연구 그룹에서 단백질의 변형에 사용된 사례들이 보고된 바 있다(Dalton Trans., 47, 14855-14860 (2018)). 최근, Gillingham group에서 효율적인 Rh(II)-carbene을 바탕으로 한 phenylaceate의 유도를 위한 합성 후 방법을 개발했지만(Angew. Chem. Int. Ed., 51, 12000-12004 (2012)), base 선택성이 없다는 단점이 있었다. 그 후, 같은 group에서 Cu(I)-carbene을 사용하여 guanosine (G) O6 위치에 선택적인 알킬화가 가능한 것이 보고되었다(Chem Sci, 8, 499-506 (2017)). 이 방법의 주된 단점은 단일 가닥 핵산에만 적용가능하고, 위치 선택성이 부족하다는 것이다. 게다가, 구리의 산화 및 환원으로 한해 생성된 singlet oxygen으로 DNA나 RNA에 손상을 줄 수 있었다(Chem. Rev., 110, 1018-1059 (2010)).
이에, Rh(I)-carbene 촉매 반응을 이용한 위치 선택적인 올리고핵산의 합성 후 화학 변형 방법의 개발이 절실한 상황이었다.
일 양상은 로듐 촉매 하에서 뉴클레오티드와 하기 화학식 1의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000001
(상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택됨).
다른 양상은 로듐 촉매 하에서 뉴클레오티드와 하기 화학식 1의 화합물을 반응시켜 제1 생성물을 얻는 단계; 및
상기 제1 생성물과 하기 화학식 3의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 화학적으로 연결된 뉴클레오티드의 제조 방법으로서,
상기 뉴클레오티드는 단일 가닥의 뉴클레오티드 템플레이트(template) 및 상기 단일 가닥의 뉴클레오티드 템플레이트와 듀플렉스(duplex)를 형성하며, 오버행(overhang)된 구아노신을 가지는 2개 이상의 단일 가닥 뉴클레오티드로 이루어진, 제조 방법을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000002
[화학식 3]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000003
(상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
상기 n은 1 내지 10임).
또 다른 양상은 로듐 촉매 하에서 뉴클레오티드와 하기 화학식 1의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 포토케이지된(photocaged) 뉴클레오티드의 제조 방법을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000004
(상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택됨).
또 다른 양상은 로듐 촉매 하에서 한 쪽 가닥이 구아노신 벌지된(G-bulged) 이중 가닥의 뉴클레오티드와 하기 화학식 1의 화합물을 반응시켜 제2 생성물을 얻는 단계;
상기 제2 생성물과 하기 화학식 4의 화합물을 반응시켜 제3 생성물을 얻는 단계;
상기 제3 생성물을 분리하여 형광물질이 표지된 단일 가닥의 제4 생성물을 얻는 단계;
상기 제4 생성물에 제4 생성물과 상보적인 단일 가닥의 뉴클레오티드를 결합시켜 한 쪽 가닥이 구아노신 벌지된(G-bulged) 이중 가닥의 제5 생성물을 얻는 단계;
로듐 촉매 하에서 이중 가닥의 상기 제5 생성물과 하기 화학식 1의 화합물을 반응시켜 제6 생성물을 얻는 단계;
환원제 하에서 상기 제6 생성물을 라이신(Lysine) 잔기를 가진 단백질과 환원적 아민화 반응(Reductive amination reaction)을 일으키는 단계를 포함하는 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체 제조 방법을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000005
[화학식 4]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000006
(상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
상기 X는 형광물질임).
또 다른 양상은 로듐 촉매 하에서 뉴클레오티드의 유도체와 하기 화학식 1의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 변형된 뉴클레오티드의 유도체 제조 방법을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000007
(상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택됨).
일 양상은 로듐 촉매 하에서 뉴클레오티드와 하기 화학식 1의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000008
(상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택됨).
일 양상에 따른 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법은 뉴클레오티드의 4개의 염기 중 선택적으로 구아닌의 O6 위치를 변형시킬 수 있고, 구체적으로, 짝을 이루지 않는(unpaired) 구아닌의 O6 위치를 변형시킬 수 있고, 보다 구체적으로는 상기 변형은 짝을 이루지 않는(unpaired) 구아닌의 O6 위치에 카르보닐기가 결합되는 것일 수 있다. 또한, 적은 양의 촉매, 낮은 반응 농도에서 반응이 가능하며, 동역학적으로 빠르고, 공기 중에서도 반응이 가능하며, 뉴클레오티드라면 단일 뉴클레오티드, 올리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 모두 선택적 변형이 가능하다.
상기 로듐 촉매는 [Rh(COD)Cl]2, [Rh(OH)(COD)]2, Rh(COD)(acac), [Rh(COD)(MeCN)2]BF4, [Rh(COD)2]OTf, Rh(C8H14)2(acac), Rh(C2H4)2(acac), Rh(nbd)(acac), Rh(nbd)2BF4, Rh(nbd)2(OTf), [Rh(nbd)Cl]2, Rh(COD)2SbF6, (CAAC-Cy)Rh(COD)Cl, [Rh(COD)2]BARF, [Rh(COE)2Cl]2, [RhCl(C6H10)]2, (1,5-Cyclooctadiene)(8-quinolinolato)rhodium(I), RhCp*(CO)2, [Rh(OMe)(COD)]2, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [ferroceneRh(COD)]BF4 및 1,1’-Bis((2R,5R)-2,5-diethylphospholano)ferrocene(cyclooctadiene)rhodium(I) tetrafluoroborate로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 촉매일 수 있고, 구체적으로 [Rh(COD)Cl]2, [Rh(OH)(COD)]2 및 Rh(COD)(acac)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 촉매일 수 있고, 보다 구체적으로 [Rh(COD)Cl]2일 수 있다.
상기 [Rh(COD)Cl]2는 구체적으로 하기 화학식 8의 화합물일 수 있다:
[화학식 8]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000009
.
상기 로듐 촉매가 Rh(II) 촉매인 경우, 반응성이 떨어져 뉴클레오티드의 변형을 일으킬 수 없을 수 있고, 로듐 촉매가 Rh(I) 촉매인 경우, 반응이 일어날 수 있다. 또한, 상기 로듐 촉매가 [Rh(OH)(COD)]2 또는 Rh(COD)(acac)인 경우, 변형된 뉴클레오티드의 수율이 높고, 반응 시간이 적을 수 있고, 상기 로듐 촉매가 [Rh(COD)Cl]2인 경우, 변형된 뉴클레오티드의 가장 수율이 높고, 반응 시간이 적을 수 있다.
또한, 상기 로듐 촉매의 양은 상기 뉴클레오티드, 상기 화학식 1의 화합물 및 로듐 촉매 총 몰수 대비 0.01 내지 1000 mol%, 0.01 내지 500 mol%, 0.01 내지 100 mol%, 0.1 내지 1000 mol%, 0.1 내지 500 mol%, 0.1 내지 100 mol%, 1 내지 1000 mol%, 1 내지 500 mol% 또는 1 내지 100 mol%일 수 있고, 구체적으로 0.1 내지 500 mol%, 0.1 내지 100 mol%, %, 1 내지 500 mol% 또는 1 내지 100 mol%일 수 있고, 보다 구체적으로 1 내지 100 mol%일 수 있다.
상기 로듐 촉매의 반응 비율이 상기 뉴클레오티드, 상기 화학식 1의 화합물 및 로듐 촉매 총 몰수 대비 0.01 mol% 미만인 경우, 반응이 일어나지 않거나 반응 시간이 길어질 수 있고, 1000 mol% 초과인 경우, 수율이 좋지 않을 수 있다. 상기 로듐 촉매의 반응 비율이 상기 뉴클레오티드, 상기 화학식 1의 화합물 및 로듐 촉매 총 몰수 대비 0.01 내지 1000 mol%인 경우, 보다 수율이 좋거나 반응 시간이 줄어들 수 있으며, 1 내지 100 mol%인 경우, 가장 수율이 좋고, 반응 시간이 줄어들 수 있다.
또한, 상기 뉴클레오티드는 구아닌(Guanine, G) 염기를 가진 뉴클레오티드 또는 구아닌(Guanine, G) 염기를 가진 뉴클레오티드의 유도체를 포함할 수 있고, 상기 뉴클레오티드는 단일 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드일 수 있다.
일 양상에 따른 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법은 구아닌 염기를 가진 뉴클레오티드 내 구아닌의 O6 위치를 선택적으로 변형시키며, 뉴클레오티드는 단일 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 등이 가능하며, 뉴클레오티드의 길이에 제한되지 않는다.
상기 뉴클레오티드는 헤어핀(hairpin) 구조, 듀플렉스(duplex) 구조, 단일 가닥 구조, 이중 가닥 구조 및 구아노신 벌지된(G-bulged) 구조로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 구조를 포함할 수 있다.
상기 구아노신 벌지된(G-bulged) 구조는 연결된 뉴클레오티드 중 구아노신이 짝을 이루지 않음으로써 구아노신 부분만 튀어나옴으로써 반응에 참여하기 좋은 구조를 의미한다.
상기 헤어핀 구조, 듀플렉스 구조, 단일 가닥 구조, 이중 가닥 구조 및 구아노신 벌지된(G-bulged) 구조에 제한되지 않고, 해당 구조 내 짝을 이루지 않는(unpaired) 구아노신의 변형을 일으킬 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 유도체는 하기 화학식 9의 화합물, 하기 화학식 10의 화합물 및 하기 화학식 12의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물일 수 있다:
[화학식 9]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000010
[화학식 10]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000011
[화학식 12]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000012
.
상기 화학식 1의 화합물은 다이아조아세톤(diazoacetone, DAX) 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물일 수 있고, 구체적으로 다이아조아세톤(diazoacetone, DAX)일 수 있다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000013
.
상기 화학식 1의 화합물이 다이아조아세톤(diazoacetone, DAX) 또는 상기 화학식 2의 화합물인 경우, 변형된 뉴클레오티드의 수율이 보다 높을 수 있고, 반응 속도도 빠를 수 있으며, 상기 화학식 1의 화합물이 다이아조아세톤(diazoacetone, DAX)인 경우, 보다 더 수율이 높고, 반응 속도가 빠를 수 있다.
이 때, 상기 다이아조아세톤(diazoacetone, DAX)은 화학식 14의 화합물일 수 있다:
[화학식 14]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000014
.
상기 화학식 1의 화합물의 반응비는 상기 뉴클레오티드 대비 0.1 내지 100 당량(equiv.), 0.1 내지 50 당량, 0.1 내지 30 당량, 0.5 내지 100당량, 0.5 내지 50 당량, 0.5 내지 30 당량, 1 내지 100 당량, 1 내지 50 당량 또는 1 내지 30 당량일 수 있고, 구체적으로 0.5 내지 50 당량, 0.5 내지 30 당량, 1 내지 50 당량 또는 1 내지 30 당량일 수 있고, 보다 구체적으로 1 내지 30당량일 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물의 반응비가 상기 뉴클레오티드 대비 0.1 당량(equiv.) 미만인 경우, 반응이 일어나지 않거나 수율이 좋지 않을 수 있고, 100 당량 초과인 경우, 반응 시간이 길어지거나 수율이 좋지 않을 수 있고, 상기 화학식 1의 화합물의 반응비가 0.1 내지 100 당량인 경우, 보다 수율이 좋거나 반응시간이 단축될 수 있으며, 상기 화학식 1의 화합물의 반응비가 1 내지 30 당량인 경우, 가장 수율이 좋고 반응시간이 짧을 수 있다.
상기 반응의 용매는 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF) 및 다이메틸술폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물과 물이 혼합된 공용매 또는 물일 수 있고, 구체적으로 상기 반응의 용매는 테트라하이드로퓨란과 물이 혼합된 공용매 또는 물일 수 있다.
상기 반응의 용매가 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF) 및 다이메틸술폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물과 물이 혼합된 공용매 또는 물에서 이루어지는 경우, 일 양상에 따른 뉴클레오티드의 선택적 변형이 이루어질 수 있으며, 다른 화합물을 포함한 공용매 또는 물이 포함되지 않은 용매를 사용할 경우 상기 반응이 일어나지 않을 수 있다.
상기 반응의 용매가 공용매인 경우, 상기 테트로하이드로퓨란 및 다이메틸술폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물의 상기 공용매 내 농도는 0.1 내지 70부피%, 0.1 내지 60부피%, 0.1 내지 55부피%, 1 내지 70부피%, 1 내지 60부피%, 1 내지 55부피%, 5 내지 70부피%, 5 내지 60부피% 또는 5 내지 55부피%일 수 있고, 구체적으로 1 내지 60부피%, 1 내지 55부피%, 5 내지 60부피% 또는 5 내지 55부피%일 수 있고, 보다 구체적으로는 5 내지 55부피%일 수 있다.
상기 반응의 용매가 공용매인 경우, 상기 테트로하이드로퓨란 및 다이메틸술폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물의 상기 공용매 내 농도가 상기 70부피%를 초과하는 경우, 반응이 일어나지 않을 수 있고, 60부피% 이하인 경우, 변형된 뉴클레오티드의 수율이 좋거나 반응시간이 단축될 수 있으며, 55부피% 이하인 경우 보다 더 수율이 좋거나 반응 시간이 보다 단축될 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 반응은 pH 3 내지 10, pH 3 내지 9, pH 3 내지 8, pH 4 내지 10, pH 4 내지 9, pH 4 내지 8, pH 5 내지 10, pH 5 내지 9 또는 pH 5 내지 8의 조건에서 이루어지는 것일 수 있고, 구체적으로 pH 4 내지 9, pH 4 내지 8, pH 5 내지 9 또는 pH 5 내지 8의 조건에서 이루어지는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 pH 5 내지 8의 조건에서 이루어지는 것일 수 있다.
상기 반응이 pH 3 미만 또는 10 초과의 조건에서 진행되는 경우, 반응이 진행되지 않거나, 변형된 뉴클레오티드의 수율이 좋지 않거나, 반응 시간이 너무 길 수 있고, 상기 반응이 pH 4 내지 9 조건에서 이루어지는 경우 변형된 뉴클레오티드의 수율이 보다 좋을 수 있고, 반응 시간이 보다 단축될 수 있으며, 상기 반응이 pH 5 내지 8 조건에서 이루어지는 경우 변형된 뉴클레오티드의 수율이 가장 좋을 수 있고, 반응 시간이 가장 단축될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 반응은 2-[N-모르폴리노]에탄술폰산(2-[N-morpholino]ethansulfonic acid, MES) 완충 수용액 및 3-[N-모르폴리노]프로판술폰산(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid, MOPS) 완충 수용액으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 완충 수용액에서 이루어지는 것일 수 있다.
상기 MES 완충 수용액 또는 MOPS 완충 수용액이 아닌 다른 완충 수용액을 사용하는 경우, 보다 뉴클레오티드 변형 수율이 좋지 않거나 아예 반응이 진행되지 않을 수 있다.
또한, 상기 반응은 염화나트륨(NaCl), 염화마그네슘(MgCl2), 염화칼륨(KCl), 아세트산나트륨(sodium acetate, NaOAc), 아세트산마그네슘(magnesium aceate, Mg(OAc)2) 및 아세트산칼륨(Potassium acetate, KOAc)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 첨가제가 첨가되어 이루어지는 것일 수 있다.
상기 첨가제는 첨가제의 양이온이 상기 뉴클레오타이드의 포스페이트(phosphate)의 음전하를 가려주어 이차구조 형성에 도움을 줄 수 있다.
다른 양상은 로듐 촉매 하에서 뉴클레오티드와 하기 화학식 1의 화합물을 반응시켜 제1 생성물을 얻는 단계; 및
상기 제1 생성물과 하기 화학식 3의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 화학적으로 연결된(chemical ligated) 뉴클레오티드의 제조 방법으로서,
상기 뉴클레오티드는 단일 가닥의 뉴클레오티드 템플레이트(template) 및 상기 단일 가닥의 뉴클레오티드 템플레이트와 듀플렉스(duplex)를 형성하며, 오버행(overhang)된 구아노신을 가지는 2개 이상의 단일 가닥 뉴클레오티드로 이루어진, 제조 방법에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000015
[화학식 3]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000016
(상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
상기 n은 1 내지 10임).
일 양상에 따른 뉴클레오티드의 변형 방법을 이용하여 화학적으로 연결된(chemical ligated) 뉴클레오티드를 쉽고 빠르게 제조할 수 있다.
일 양상에 따른 화학적으로 연결된(chemical ligated) 뉴클레오티드의 제조 방법은 로듐 촉매 하에서 뉴클레오티드와 상기 화학식 1의 화합물을 반응시켜 제1 생성물을 얻는 단계를 포함하며, 제1 생성물을 얻는 단계 중 일부는 전술한 범위 내일 수 있고, 용매, 완충 수용액, pH 조건, 첨가제 등도 전술한 범위 내일 수 있다.
구체적으로, 상기 화학식 1의 화합물은 다이아조아세톤(diazoacetone, DAX) 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물일 수 있다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000017
.
또한, 상기 로듐 촉매는 [Rh(COD)Cl]2, [Rh(OH)(COD)]2, Rh(COD)(acac), [Rh(COD)(MeCN)2]BF4, [Rh(COD)2]OTf, Rh(C8H14)2(acac), Rh(C2H4)2(acac), Rh(nbd)(acac), Rh(nbd)2BF4, Rh(nbd)2(OTf), [Rh(nbd)Cl]2, Rh(COD)2SbF6, (CAAC-Cy)Rh(COD)Cl, [Rh(COD)2]BARF, [Rh(COE)2Cl]2, [RhCl(C6H10)]2, (1,5-Cyclooctadiene)(8-quinolinolato)rhodium(I), RhCp*(CO)2, [Rh(OMe)(COD)]2, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [ferroceneRh(COD)]BF4 및 1,1’-Bis((2R,5R)-2,5-diethylphospholano)ferrocene(cyclooctadiene)rhodium(I) tetrafluoroborate로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 촉매일 수 있고, 구체적으로 [Rh(COD)Cl]2, [Rh(OH)(COD)]2 및 Rh(COD)(acac)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 촉매일 수 있고, 보다 구체적으로 [Rh(COD)Cl]2일 수 있다.
상기 [Rh(COD)Cl]2는 구체적으로 하기 화학식 8의 화합물일 수 있다:
[화학식 8]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000018
.
일 양상에 있어서, 상기 제1 생성물은 상기 단일 가닥의 뉴클레오티드 템플레이트와 듀플렉스(duplex)를 형성하며, 오버행(overhang)된 구아노신을 가지는 2개 이상의 단일 가닥 뉴클레오티드의 구아노신의 구아닌의 O6 위치가 변형된 것일 수 있고, 짝을 이루지 않는(unpaired) 구아닌의 O6 위치가 변형된 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 짝을 이루지 않는(unpaired) 구아닌의 O6 위치에 카르보닐기가 결합된 것일 수 있다.
또한, 상기 오버행된 구아노신을 가지는 단일 가닥 뉴클레오티드는 2개일 수 있다. 상기 오버행된 구아노신을 가지는 단일 가닥 뉴클레오티드가 2개인 경우, 제조된 뉴클레오티드는 화학적으로 연결된 2개의 단일 가닥 뉴클레오티드와 뉴클레오티드 템플레이트 총 3개의 뉴클레오티드일 수 있다.
일 양상에 따른 화학적으로 연결된(chemical ligated) 뉴클레오티드의 제조 방법은 상기 제1 생성물과 상기 화학식 3의 화합물을 반응시키는 단계를 포함한다.
상기 제1 생성물과 상기 화학식 3의 화합물을 반응시키는 단계는 상기 단일 가닥의 뉴클레오티드 템플레이트와 듀플렉스(duplex)를 형성하며, 오버행(overhang)된 구아노신을 가지는 2개 이상의 단일 가닥 뉴클레오티드의 구아노신의 구아닌의 O6 위치에 존재하는 카르보닐기와 상기 화학식 3의 화합물이 링커로서 반응하여 oxime ether 형태로 연결되는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 n은 1 내지 5일 수 있고, 보다 구체적으로는 2 내지 3일 수 있다. 상기 n이 0이면 화학적으로 연결될 링커가 존재하지 않는 것이며, 상기 n이 10이 넘어가는 경우, 너무 큰 고리가 형성되어 불안정할 수 있다.
또 다른 양상은 로듐 촉매 하에서 뉴클레오티드와 하기 화학식 1의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 포토케이지된(photocaged) 뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000019
(상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택됨).
일 양상에 따른 뉴클레오티드의 변형 방법을 이용하여, 복잡한 합성 과정을 거쳐야 하는 포토케이지된(photocaged) 뉴클레오티드를 단일 단계로 가능하게 하여, 반응 시간의 단축, 우수한 수율, 제조를 위한 화합물을 낭비되지 않도록 할 수 있다.
상기 로듐 촉매 하에서 뉴클레오티드와 상기 화학식 1의 화합물을 반응시키는 단계는 전술한 범위 내일 수 있고, 용매, 완충 수용액, pH 조건, 첨가제 등도 전술한 범위 내일 수 있다.
구체적으로, 상기 화학식 1의 화합물은 다이아조아세톤(diazoacetone, DAX) 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물일 수 있다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000020
.
또한, 상기 로듐 촉매는 [Rh(COD)Cl]2, [Rh(OH)(COD)]2, Rh(COD)(acac), [Rh(COD)(MeCN)2]BF4, [Rh(COD)2]OTf, Rh(C8H14)2(acac), Rh(C2H4)2(acac), Rh(nbd)(acac), Rh(nbd)2BF4, Rh(nbd)2(OTf), [Rh(nbd)Cl]2, Rh(COD)2SbF6, (CAAC-Cy)Rh(COD)Cl, [Rh(COD)2]BARF, [Rh(COE)2Cl]2, [RhCl(C6H10)]2, (1,5-Cyclooctadiene)(8-quinolinolato)rhodium(I), RhCp*(CO)2, [Rh(OMe)(COD)]2, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [ferroceneRh(COD)]BF4 및 1,1’-Bis((2R,5R)-2,5-diethylphospholano)ferrocene(cyclooctadiene)rhodium(I) tetrafluoroborate로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 촉매일 수 있고, 구체적으로 [Rh(COD)Cl]2, [Rh(OH)(COD)]2 및 Rh(COD)(acac)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 촉매일 수 있고, 보다 구체적으로 [Rh(COD)Cl]2일 수 있다.
상기 [Rh(COD)Cl]2는 구체적으로 하기 화학식 8의 화합물일 수 있다:
[화학식 8]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000021
.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 뉴클레오티드는 구아닌(Guanine, G) 염기를 가진 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 뉴클레오티드는 단일 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드일 수 있다.
일 양상에 따른 포토케이지된 뉴클레오티드의 제조 방법은 구아닌 염기를 가진 뉴클레오티드 내 구아닌의 O6 위치를 선택적으로 변형시키는 것일 수 있고, 구체적으로는 짝을 이루지 않는(unpaired) 구아닌의 O6 위치가 변형시키는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 짝을 이루지 않는(unpaired) 구아닌의 O6 위치에 카르보닐기를 결합시키는 것일 수 있다.
상기 뉴클레오티드는 단일 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 등이 가능하며, 뉴클레오티드의 길이에 제한되지 않는다.
또 다른 양상은 로듐 촉매 하에서 한 쪽 가닥이 구아노신 벌지된(G-bulged) 이중 가닥의 뉴클레오티드와 하기 화학식 1의 화합물을 반응시켜 제2 생성물을 얻는 단계;
상기 제2 생성물과 하기 화학식 4의 화합물을 반응시켜 제3 생성물을 얻는 단계;
상기 제3 생성물을 분리하여 형광물질이 표지된 단일 가닥의 제4 생성물을 얻는 단계;
상기 제4 생성물에 제4 생성물과 상보적인 단일 가닥의 뉴클레오티드를 결합시켜 한 쪽 가닥이 구아노신 벌지된(G-bulged) 이중 가닥의 제5 생성물을 얻는 단계;
로듐 촉매 하에서 이중 가닥의 상기 제5 생성물과 하기 화학식 1의 화합물을 반응시켜 제6 생성물을 얻는 단계;
환원제 하에서 상기 제6 생성물을 라이신(Lysine) 잔기를 가진 단백질과 환원적 아민화 반응(Reductive amination reaction)을 일으키는 단계를 포함하는 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체 제조 방법:
[화학식 1]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000022
[화학식 4]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000023
(상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
상기 X는 형광물질임).
일 양상에 따른 뉴클레오티드의 변형 방법을 이용하여 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체를 쉽고 빠르게 제조할 수 있다.
상기 제2 생성물을 얻는 단계 및 제6 생성물을 얻는 단계 중 일부는 전술한 범위 내일 수 있고, 용매, 완충 수용액, pH 조건, 첨가제 등도 전술한 범위 내일 수 있다.
구체적으로, 상기 화학식 1의 화합물은 다이아조아세톤(diazoacetone, DAX) 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물일 수 있다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000024
.
또한, 상기 로듐 촉매는 [Rh(COD)Cl]2, [Rh(OH)(COD)]2, Rh(COD)(acac), [Rh(COD)(MeCN)2]BF4, [Rh(COD)2]OTf, Rh(C8H14)2(acac), Rh(C2H4)2(acac), Rh(nbd)(acac), Rh(nbd)2BF4, Rh(nbd)2(OTf), [Rh(nbd)Cl]2, Rh(COD)2SbF6, (CAAC-Cy)Rh(COD)Cl, [Rh(COD)2]BARF, [Rh(COE)2Cl]2, [RhCl(C6H10)]2, (1,5-Cyclooctadiene)(8-quinolinolato)rhodium(I), RhCp*(CO)2, [Rh(OMe)(COD)]2, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [ferroceneRh(COD)]BF4 및 1,1’-Bis((2R,5R)-2,5-diethylphospholano)ferrocene(cyclooctadiene)rhodium(I) tetrafluoroborate로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 촉매일 수 있고, 구체적으로 [Rh(COD)Cl]2, [Rh(OH)(COD)]2 및 Rh(COD)(acac)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 촉매일 수 있고, 보다 구체적으로 [Rh(COD)Cl]2일 수 있다.
상기 [Rh(COD)Cl]2는 구체적으로 하기 화학식 8의 화합물일 수 있다:
[화학식 8]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000025
.
상기 제2 생성물을 얻는 단계는 이중 가닥의 뉴클레오티드 중 구아노신 벌지된 가닥 내 벌지된 구아노신의 구아닌의 O6 위치가 선택적으로 변형되는 것일 수 있고, 구체적으로는 짝을 이루지 않은(unpaired) 구아닌의 O6 위치가 변형되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 짝을 이루지 않는(unpaired) 구아닌의 O6 위치에 카르보닐기를 결합시키는 것일 수 있다. 따라서, 제2 생성물은 상기 벌지된 구아노신의 구아닌의 O6 위치가 변형된 것일 수 있다.
일 양상에 따른 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체 제조 방법은 상기 제2 생성물과 상기 화학식 4의 화합물을 반응시켜 제3 생성물을 얻는 단계를 포함한다.
상기 제2 생성물은 상기 화학식 4의 화합물의 아민기와 반응하여 결합될 수 있으며, 예를 들어, 결합된 형태는 옥심(oxime) 형태일 수 있다.
상기 화학식 4의 화합물의 X는 형광물질일 수 있고, 상기 형광물질은 플루오레신(fluorescein), 보디피(BODIPY), 테트라메틸로드아민(Tetramethylrhodamine), 알렉사(Alexa), 시아닌(Cyanine), 알로피코시아닌(allopicocyanine), 로다민 B(Rhodamine B) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 형광물질일 수 있고, 구체적으로 하기 화학식 5의 화합물로 표시되는 로다민 B의 유도체일 수 있다:
[화학식 5]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000026
.
또한, 일 양상에 따른 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체 제조 방법은 상기 제3 생성물을 분리하여 형광물질이 표지된 단일 가닥의 제4 생성물을 얻는 단계를 포함한다.
상기 제3 생성물은 전술한 바와 마찬가지로, 형광물질 및 옥심형태의 변형된 이중 가닥의 뉴클레오티드일 수 있고, 제3 생성물의 분리는 이중 가닥을 단일 가닥으로 분리하는 것으로서 denaturation에 해당한다. 이 후, 형광물질이 표지된 단일 가닥만 분리하여 얻을 수 있다.
상기 denaturation은 공지된 방법이라면 제한없이 사용될 수 있고, 예를 들어, 열을 가하는 것일 수 있다.
상기 형광물질이 표지된 단일 가닥인 제4 생성물의 분리는 공지된 분리방법이라면 제한없이 사용가능하며, 예를 들어, 크로마토그래피를 이용하여 분리하는 것일 수 있고, 구체적으로 HPLC를 이용하여 분리하는 것일 수 있다.
또한, 일 양상에 따른 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체 제조 방법은 상기 제4 생성물에 제4 생성물과 상보적인 단일 가닥의 뉴클레오티드를 결합시켜 한 쪽 가닥이 구아노신 벌지된(G-bulged) 이중 가닥의 제5 생성물을 얻는 단계를 포함한다.
상기 제4 생성물과 상보적인 단일 가닥의 뉴클레오티드는 제4 생성물의 염기서열로부터 디자인하여 제조될 수 있다.
상기 구아노신 벌지된 이중 가닥의 제5 생성물은 구아노신 벌지된 가닥이 형광물질이 표지된 가닥 또는 그의 상보적인 가닥일 수 있어, 제한되지 않는다.
또한, 일 양상에 따른 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체 제조 방법은 로듐 촉매 하에서 이중 가닥의 상기 제5 생성물과 하기 화학식 1의 화합물을 반응시켜 제6 생성물을 얻는 단계를 포함하며, 구체적인 방법은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 구아노신 벌지된 이중 가닥의 제5 생성물이 화학식 1과 반응하여 벌지된 구아노신의 구아닌의 O6 위치가 선택적으로 변형되어 제6 생성물을 얻는 것일 수 있고, 구체적으로는 짝을 이루지 않은(unpaired) 구아닌의 O6 위치가 변형되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 짝을 이루지 않는(unpaired) 구아닌의 O6 위치에 카르보닐기가 결합되는 것일 수 있다.
또한, 일 양상에 따른 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체 제조 방법은 환원제 하에서 상기 제6 생성물을 라이신(Lysine) 잔기를 가진 단백질과 환원적 아민화 반응(Reductive amination reaction)을 일으키는 단계를 포함한다.
상기 환원제는 환원적 아민화 반응(Reductive Amination)을 일으킬 수 있는 환원제라면 제한없이 사용될 수 있으나, 예를 들어, NaBH3CN, NaBH4, LiBH3CN 및 NaBH(OCOCH3)3로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 환원제일 수 있다.
상기 제6 생성물은 벌지된 구아노신의 구아닌의 O6 위치가 선택적으로 변형된 형광물질이 표지된 이중 가닥의 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 벌지된 구아닌 위치가 환원적 아민화 반응을 통해 단백질과 결합되어 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체가 제조되는 것일 수 있다.
상기 단백질은 아미노산 잔기로서 라이신을 가져야하며, 이를 통해 상기 환원적 아민화 반응이 잘 일어나 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체가 쉽고 신속하게 제조되는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 로듐 촉매 하에서 뉴클레오티드의 유도체와 하기 화학식 1의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 변형된 뉴클레오티드의 유도체 제조 방법에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000027
(상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택됨).
일 양상에 따른 변형된 뉴클레오티드의 유도체 제조 방법을 이용하여, 뉴클레오티드의 유도체를 단축된 반응 시간을 통해 우수한 수율로 변형된 뉴클레오티드의 유도체를 제조할 수 있다.
일 양상에 따른 변형된 뉴클레오티드의 유도체 제조 방법에서 "뉴클레오티드", "용매", "완충 수용액", "pH 조건", "첨가제" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 유도체는 구아닌(Guanine, G) 염기를 가진 뉴클레오티드의 유도체를 포함할 수 있고, 구체적으로, 상기 뉴클레오티드의 유도체는 하기 화학식 9의 화합물, 하기 화학식 10의 화합물 및 하기 화학식 12의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물일 수 있다:
[화학식 9]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000028
[화학식 10]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000029
[화학식 12]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000030
.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드의 유도체는 구아닌 염기를 가진 뉴클레오티드의 유도체 구조 중 구아닌 염기 부분이 변형된 것일 수 있고, 구체적으로, 상기 변형된 뉴클레오티드의 유도체는 하기 화학식 10의 화합물, 하기 화학식 11의 화합물 및 하기 화학식 13의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물일 수 있다:
[화학식 10]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000031
[화학식 11]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000032
[화학식 13]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000033
.
일 양상에 있어서, 상기 로듐 촉매는 [Rh(COD)Cl]2, [Rh(OH)(COD)]2, Rh(COD)(acac), [Rh(COD)(MeCN)2]BF4, [Rh(COD)2]OTf, Rh(C8H14)2(acac), Rh(C2H4)2(acac), Rh(nbd)(acac), Rh(nbd)2BF4, Rh(nbd)2(OTf), [Rh(nbd)Cl]2, Rh(COD)2SbF6, (CAAC-Cy)Rh(COD)Cl, [Rh(COD)2]BARF, [Rh(COE)2Cl]2, [RhCl(C6H10)]2, (1,5-Cyclooctadiene)(8-quinolinolato)rhodium(I), RhCp*(CO)2, [Rh(OMe)(COD)]2, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [ferroceneRh(COD)]BF4 및 1,1’-Bis((2R,5R)-2,5-diethylphospholano)ferrocene(cyclooctadiene)rhodium(I) tetrafluoroborate로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 촉매일 수 있고, 구체적으로 [Rh(COD)Cl]2, [Rh(OH)(COD)]2 및 Rh(COD)(acac)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 촉매일 수 있고, 보다 구체적으로 [Rh(COD)Cl]2일 수 있다.
상기 [Rh(COD)Cl]2는 구체적으로 하기 화학식 8의 화합물일 수 있다:
[화학식 8]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000034
.
일 양상에 따른 뉴클레오티드의 변형 방법은 화학적 연결(chemical ligation), 포토케이지된(photocaged) 뉴클레오티드의 제조, 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체 제조(단백질과 핵산의 상호작용), 시퀀싱(sequencing), DNA 나노테크놀로지(nanotechnology), DNA 손상 및 복구(damage and repair), 분자성 비콘 프로브(molecular beacon probe) 개발 등 다양한 분야에 활용될 수 있으며, 그 활용 분야가 상기 기재된 화학적 연결(chemical ligation), 포토케이지된(photocaged) 뉴클레오티드의 제조, 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체 제조에 한정되는 것은 아니다.
일 양상에 따른 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법은 뉴클레오티드의 4개의 염기 중 선택적으로 구아닌의 O6 위치를 변형시킬 수 있고, 구체적으로, 짝을 이루지 않는(unpaired) 구아닌의 O6 위치를 변형시킬 수 있으며, 적은 양의 촉매, 낮은 반응 농도에서 반응이 가능하며, 동역학적으로 빠르고, 공기 중에서도 반응이 가능하며, 뉴클레오티드라면 단일 뉴클레오티드, 올리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 모두 선택적 변형이 가능하다.
나아가, 상기 방법을 이용하여 화학적으로 연결된(chemical ligated) 뉴클레오티드를 쉽고 빠르게 제조할 수 있고, 복잡한 합성 과정을 거쳐야 하는 포토케이지된(photocaged) 뉴클레오티드를 단일 단계로 가능하며, 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체를 제조할 수 있고, 뉴클레오티드의 유도체들까지도 변형이 가능하므로, 변형된 구아닌을 지닌 뉴클레오티드를 활용한 다양한 기술에 적용할 수 있다.
도 1은 올리고뉴클레오티드의 일 양상에 따른 선택적 변형 방법을 나타낸 도이다.
도 2는 구아노신 벌지된(G-bulged) 뉴클레오티드의 일 양상에 따른 선택적 변형 방법을 나타낸 도이다.
도 3은 일 양상에 따른 선택적 변형 방법을 응용하여 ODN을 화학적으로 연결(chemical ligation)하는 방법을 나타낸 도이다.
도 4는 SYBR gold를 이용해서 가시화한 ligation의 Denaturing PAGE 분석을 나타낸 도이다(Lanes; 1: acetonylation 전, 2: acetonylation 후, 3: ligation 후, 4: 도 3의 5a, 5: 도 3의 5b, 6: 도 3의 5c)
도 5의 A는 포토케이지된(photocaged) 올리고뉴클레오티드를 나타낸 도이며, 도 5의 B는 포토케이지된(photocaged) 올리고뉴클레오티드의 기존 방법에 따른 합성 단계를 나타낸 도이다.
도 6은 일 양상에 따른 선택적 변형 방법을 이용하여 포토케이지된(photocaged) 올리고뉴클레오티드의 제조를 나타낸 도이다.
도 7은 다양한 올리고뉴클레오티드를 일 양상에 따른 선택적 변형 방법으로 변형시키는 것을 나타낸 도이다.
도 8은 일 양상에 따른 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법을 이용하여 변형된 DNA와 단백질 간의 Cross-linking을 나타낸 개략도이다.
도 9는 E.coli의 전체 cell lysate에서 일 양상에 따른 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법을 이용하여 형광물질 표지 및 단백질과의 crosslink 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 10은 일 양상에 따른 선택적 변형 방법을 이용하여 형광물질 표지된 올리고뉴클레오티드와 T7 RNAP(단백질)의 crosslink시킨 후 그를 확인하기 위해 형광물질 SDS-PAGE 겔 전기영동을 통해 UV, SYBR gold, silver stain으로 가시화시킨 도이다.
도 11은 일 양상에 따른 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법을 나타낸 개략도이다.
도 12는 용매에 따른 뉴클레오티드의 선택적 변형 과정 및 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참조예
본 발명의 실시예에서는 별도로 언급하지 않는 한, 시판되는 시약을 추가 정제 없이 사용하였다. 반응 용기는 오븐에서 밤새 건조시킨 다음 사용 전에 실온에서 냉각시켜 사용하였고, 박층 크로마토 그래피는 Kieselgel 60F254 (Merck)로 코팅된 플레이트를 사용하여 수행하였으며, 플래시 칼럼 크로마토 그래피의 경우, P60 silica gel (230 - 400 mesh)을 사용하였다.
핵자기 공명 스펙트럼 (1H 및 13C NMR)은 Agilent 400-MR DD2 Fourier-transform NMR 분광기에서 기록되었으며, 화학적 이동은 백만분율 (ppm) 단위로 기재되었다. 공명 패턴은 s (singlet), d (doublet), t (triplet), q(quartet), q(quintet), sext (sextet) 및 m (multiplet)로 함께 표시되는 것이며, br는 넓은 신호를 나타내는 것에 사용된다. 커플링 상수 (J)는 헤르쯔 (Hz)로 표시하였다.
IR 스펙트럼은 Perkin Elmer Spectrum Two 적외선 분광 광도계에서 기록되었고 cm-1로 기재하였다. 고해상도 질량 스펙트럼 (HRMS)은 JOEL AccuTOF 4G+ DART-HRMS 분광기를 통해 분석되었다. 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석(HPLC-MS)은 Agilent 1260 Infinity HPLC와 결합된 Agilent 6130 quadrupole 질량 분석기를 이용하여 진행되었다.
실시예
실시예 1. 뉴클레오티드의 변형 방법의 촉매를 포함한 반응 조건의 최적화
본 실시예 1에서는 diazoacetone(DAX)과 금속 촉매로 만들어지는 metal-carbene을 통해 구아노신의 선택적 acetonyl화 반응을 개발하고자 하였다. 상기 합성에 있어 반응 최적 조건을 설정하고자, 하기 반응식 1에 도시된 바와 같이, DAX와 금속 촉매 하에서 뉴클레오사이드들(1~4)의 반응성 및 선택성을 조사하여 최적화 조건을 도출하고자 하였다:
[반응식 1]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000035
.
구체적으로, nucleobase들의 변형에 쓸 최적의 촉매를 확인하기 위해, Cu(I, II), Fe(III), Ir(I), Rh(I, II)를 포함하는 metal carbene complex를 형성한다 알려진 다양한 metal catalyst(5 mol%)들을 50% THF-H2O 안에 DAX와 4가지 nucleobase들을 model substrate으로 base-selectivity를 가지는 지 스크리닝하였다(표 1, entry 1 내지 7).
또한, [Rh(COD)Cl]2의 뛰어난 촉매적 활성에 힘입어, 다양한 Rh(I) 촉매들로 추가적인 스크리닝을 진행하였다(표 1, entry 10 내지 14).
Entry Catalyst Time Conv.
1a Cu(OTf) 24 h N/R
2a Cu(OTf)2 24 h N/R
3a Fe(TSPP)Cl 24 h N/R
4a [Ir(COD)Cl]2 24 h N/R
5a Ir(COD)(MeCN)2BF4 24 h N/R
6a Rh2(OAc)4 24 h N/R
7a Rh2(TFA)4 24 h N/R
8a [Rh(COD)Cl]2 30 min 45%
9b [Rh(COD)Cl]2 10 min 98%
10b [Rh(OH)(COD)]2 30 min 84%
11b Rh(COD)(acac) 60 min 83%
12b [Rh(COD)(MeCN)2]BF₄ o/n 76%
13b [Rh(COD)2]OTf o/n 48%
14b Rh(CO)2(acac) o/n N/R
15c [Rh(COD)Cl]2 3 h N/R
a반응 조건 : 각 뉴클레오사이드 (5 mM), 촉매 (5 mol%), DAX (1.2 equiv.), 50% THF-H2O, 실온
b반응 조건 : 각 뉴클레오사이드 (5 mM), 촉매 (10 mol%), DAX (8 equiv.), 10% THF-H2O, 20 mM MES, pH 6.0, 실온
cDAX 대신에 ethyl diazoacetate를 사용했음 (반응 조건 b에서 변형함)
그 결과(표 1), Cu(I, II), Fe(III), Ir(I), Rh(II) 촉매들은 전부 효과가 없는 것을 확인하였고, [Rh(COD)Cl]2 외에 다른 Rh(I) 촉매들은 반응성이 떨어지는 것으로 판명되었다(표 1, Entry 10 내지 14).
Rh(I) 촉매를 이용한 경우 구아닌의 O6 위치가 선택적으로 DAX와 반응이 이루어져 acetonyl화가 이루어졌음을 확인할 수 있었고, 촉매로 [Rh(COD)Cl]2(entry 8 및 9), [Rh(OH)(COD)]2(entry 10), Rh(COD)(acac)(entry 11), [Rh(COD)(MeCN)2]BF4(entry 12) 및 [Rh(COD)2]OTf(entry 13)의 경우에만, 반응이 이루어졌으며, 그 중 [Rh(COD)Cl]2(entry 9)을 촉매로 사용하고, 뉴클레오사이드 (5 mM), 촉매 (10 mol%), DAX (8 equiv.), 10% THF-H2O, 20 mM MES, pH 6.0, 실온 조건에서 수행한 경우에 가장 반응 수율이 좋았으며 반응속도도 빨랐다.
실시예 2. 뉴클레오티드의 변형 방법의 buffer와 diazocompound를 포함한 반응 조건의 최적화
본 실시예 2에서는 DAX와 다양한 Rh(I) 촉매로도 구아노신의 선택적 acetonyl화 반응이 추가적으로 최적화가 가능한지 점검하고자 하였다. 또한, DAX 외에 다른 diazo compound들로도 선택성과 반응성을 가지는지 확인해보고자 하였다. 상기 합성에 있어 반응 최적 조건을 추가적으로 설정하고자, 하기 반응식 2에 도시된 바와 같이, 몇 가지 diazo compound들과 다양한 Rh(I) 촉매 하에서 뉴클레오사이드들(1~4)의 반응성 및 선택성을 조사하여 최적화하였다:
[반응식 2]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000036
.
이 때, 상기 몇 가지 diazo compound들은 하기 화학식 14 내지 17의 화합물과 같았다:
[화학식 14]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000037
[화학식 15]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000038
[화학식 16]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000039
[화학식 17]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000040
.
Figure PCTKR2021001073-appb-T000001
a반응 조건 : 뉴클레오사이드 (5 mM), 촉매 (10 mol%), diazo compound (8 equiv.), 10% THF-H2O, MES (20 mM), pH 6.0, 실온
b50% THF-H2O를 사용하였다(반응 조건 a에서 변형했음).
그 결과, 4가지 기질(구아닌, 티민, 시토신, 아데닌)이 포함된 경우, 다른 diazo compound로는 반응이 수행되지 않음을 확인하였고, 반응 조건은 촉매로서 [Rh(COD)Cl]2 사용하며, diazo compound로는 diazoacetone(DAX, 화학식 14의 화합물)을 사용하되, 버퍼로서 20 mM MES, pH 6.0을 사용하는 경우(3번 조건)에 가장 수율이 좋음(98%)을 확인하였다.
본 발명의 반응에 적절한 촉매가 a) 목표물에 대한 반응성 및 선택성과 buffer 수용액 안에서의 안정성 사이에서 균형을 가지는 metal carbene complex를 형성하는 능력, b) 적은 촉매 사용량을 위한 높은 turnover 숫자를 가져야 할 것으로 판단했다. carbene 전구물질으로 우리는 diazoacetone(DAX)을 선택했고, 이는 하기와 같은 이점들이 있었다: a) keto group이 oxime ether형성이나 reductive amination으로 추가적인 conjugation을 제공할 수 있는 orthogonal functional handle로써 작용한다는 점, b) 작은 크기가 단백질과 핵산의 결합 작용을 포함하는 연구들에 사용될 때 최소한의 steric interference만을 가진다는 점, c) 높은 물에서의 용해도, d) 증발을 이용한 hydroxyacetone이라는 주요 부산물의 제거가 쉽다는 점. 이하에서는 diazocompound로서 DAX와 촉매로서 [Rh(COD)Cl]2를 사용하여 응용 반응들을 수행하였다.
실시예 3. 다양한 올리고뉴클레오티드의 변형
본 실시예 3에서는 도 1에 나타난 반응과 같이, 다양한 형태의 올리고뉴클레오티드들(ssODNs(single-stranded oligodeoxynucleotides), ssORNs(single-stranded　oligoribonucleotides), hairpins 및 duplexes)도 DAX와 Rh(I) 촉매로 구아노신의 선택적 acetonyl화 반응이 가능한지 점검하고자 하였다.
Figure PCTKR2021001073-appb-T000002
Figure PCTKR2021001073-appb-I000041
a모든 ON들은 r(sequences)로 표시되지 않았으면 ODN이다.
b반응 조건: ON(5 mM), DAX (8당량), [Rh(COD)Cl]2 (10 mol%), 10% THF-H2O, MES (20 mM), pH 6.0, Mg(OAc) 2 (10 mM), r.t.
그 결과, unpaired 구아노신은 전부 변형이 이루어졌음을 확인할 수 있었다(표 3). 따라서, 다양한 올리고뉴클레오티드에서도 본 발명의 방법을 통해 구아노신을 선택적으로 변형시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. G-bulged 올리고뉴클레오티드의 변형
본 실시예 4에서는 도 2에 나타난 반응과 같이, bulge G duplexes and hairpins에서도 DAX와 Rh(I) 촉매로 구아노신의 선택적 acetonyl화 반응이 가능한지 점검하고자 하였다.
Figure PCTKR2021001073-appb-T000003
Figure PCTKR2021001073-appb-I000042
a모든 ON들은 r(sequences)로 표시되지 않았으면 ODN이다.
b반응 조건: ON (5 mM), DAX (20당량), [Rh(COD)Cl]2 (10 mol%), 10% THF-H2O, MES (50 mM), pH 6.0, Mg(OAc)2 (50 mM), r.t.
그 결과(표 4), bulge G duplexes and hairpins에서도 구아노신의 선택적인 변형이 이루어졌음을 확인하였다.
실시예 5. ODN의 화학적 연결(Chemical ligation)
도 3과 같이, 본 발명의 방법으로 ODN을 화학적으로 연결하고자 하였다. 구체적으로, 도 3에서 나타난 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 template(도 3의 5a(서열번호 45))와 듀플렉스(duplex)를 형성하며, 오버행(overhang) 구아노신을 가지는 두 개의 단일가닥 올리고뉴클레오티드(도 3의 5b(서열번호 46) 및 5c(서열번호 47)) 시스템에서, [Rh(COD)Cl]2의 촉매와 diazoacetone(DAX)을 이용하여 도 3의 5a, 6b(서열번호 48) 및 6c(서열번호 49)를 형성하고, 하기 화학식 6의 화합물(dialkoxyamine)을 링커로서 반응시킴으로써, ligation된 oligodeoxyribonucleotide(ODN)을 얻었다.
[화학식 6]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000043
LC-MS와 denaturing PAGE 분석방법을 통해서 확인한 결과(도 4), 도 4의 최종 생성물인 5a 및 8(서열번호 50)이 형성된 것을 확인하였다.
실시예 6. photocaged 올리고뉴클레오티드의 단일 단계 합성
Photocaged 올리고뉴클레오티드들의 기본적인 합성은 photocleavable group을 가진 phosphoramidite 단분자의 합성으로부터 시작하는 데(도 5A), 주로 긴 합성과정을 수반한다. 예를 들면, Woodson group에서는 photocaged oligoribonucleotide(ORN)들을 이용하여 시간적으로 조절된 Hfq 촉진 annealing study를 보고했다. 긴 10단계의 합성 과정을 거쳐 만든 photocaged phosphoramidite 단분자 9를 보며(도 5B), 본 발명의 방법으로 합성 효율을 향상시킬 수 있을지 확인해 보기로 했다(도 6).
도 6에서 나타난 바와 같이, 단일 가닥 올리고DNA template(ODN)과 듀플렉스(duplex)를 형성하며 벌지된(bulged) 구아노신을 가지는 단일 가닥 올리고RNA(ORN) 시스템에서 [Rh(COD)Cl]2의 촉매와 하기 화학식 7의 화합물(diazocompound)을 이용하여 듀플렉스(duplex) 형태의 혼성 올리고뉴클레오티드를 형성하였다.
[화학식 7]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000044
또한, 도 7에 나타난 바와 같이, 다양한 올리고뉴클레오티드들(7a(서열번호 51), 7c(서열번호 53) 및 7e(서열번호 55))을 [Rh(COD)Cl]2의 촉매와 상기 화학식 2의 화합물을 이용하여 외각(external), 내각(internal) 및 헤어핀 오버행(hairpin overhang) 부분이 변형된 올리고뉴클레오티드들(7b(서열번호 52), 7d(서열번호 54) 및 7f(서열번호 56)을 형성하였다.
결과적으로, ORN-ODN 혼성 이중가닥의 형성으로 만들어진 G-bulge ORN 10m을 α-diazo-p-hydroxyacetophenone(11, 20 당량)과 10 mol% [Rh(COD)Cl]2 (20 % DMSO-H2O, MES, pH = 6.0) 조건 하에서 12m을 50% conversion으로 얻을 수 있었다(도 6). 게다가, ssODN과 hairpin을 11과 반응시켜 보았고, G-선택적인 변형 산물을 적당하거나 높은 conversion으로 얻었다(도 7).
실시예 7. 변형된 DNA와 단백질 간의 Cross-linking
본 발명의 방법을 이용하여 sequence-specific DNA에 결합하는 단백질을 상응하는 dsODN와 공유 결합을 형성함으로써 단백질을 catch하는 방법을 개발하고자 하였다. ODN probe에 선택된 위치에 도입된 acetonyl group이 결합한 단백질의 lysine 잔기와의 reductive amination을 통해 이루어진다(도 8).
구체적으로, E.coli whole cell lysate의 복잡한 환경 내에서 선택적인 crosslinking을 시도하였다(도 9). crosslinking product를 cell lysate 안에서 검출하기 위해서, 이중가닥 G-bulge dsDNA probe를 디자인하였고, 두 개의 acetonyl group을 구분하기 위해, 단계적으로 두 group을 도입하였다. 이와 같이, 첫 번째 의도했던 자리에 G-bulge가 있는 dsDNA를 상응하는 반대편 가닥을 사용해서 만들었고, 다음으로 DAX와 반응하여 도 9의 13a를 얻었다. 그 다음 ketone에 oxime ether를 통해 형광 물질(하기 화학식 5의 화합물로 표시되는 Rhodamine B의 유도체)을 연결했고, 형광 물질을 지닌 단일가닥을 도 9의 13c를 HPLC를 통해서 분리하였다. 상응하는 반대편 가닥과의 이중 가닥 형성을 통해 두 번째 G-bulge의 도입 후, DAX와의 반응을 통해서 crosslinking 실험을 위한 이중 act-G-bulge dsDNA probe(도 9의 14a)를 얻었다:
[화학식 5]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000045
.
Reductive amination을 통해 crosslinking을 진행하였고, 도 9의 14a를 T7 RNAP와 섞여있는 E.coli lysate 안에서 NaCNBH3와 배양하였다(표 5의 lane 1). 하기와 같이, 대조 실험 또한 실행되었다: a) T7 RNAP 없는 경우(표 5의 lane 2), b) lysate만 있는 경우(표 5의 lane 3), c) NaCNBH3 없는 경우(표 5의 lane 4), d) lysate 없는 경우(표 5의 lane 5), e) T7 RNAP만 있는 경우(표 5의 lane 6), f) 도 9의 14a만 있는 경우(표 5의 lane 7).
T7 RNAP + - - + + + -
lysate + + + + - - -
NaCNBH3 + + - - + - -
18a + + - + + - +
SDS-PAGE 겔 전기영동을 통해 UV, SYBR gold, silver stain으로 가시화시킬 수 있었다. UV를 통한 가시화에서 cell lysate가 있음에도 선택적인 crosslinking이 성공적으로 이루어졌음을 확인하였다. 양성 대조 실험(표 5의 lane 5)과 비교했을 때 똑같은 band가 표 1의 lane 1에서 관찰되었고, 표 5의 lane 1에서는 cell lysate과 T7 RNAP가 있는 상태에서 crosslinking이 진행되었다. 몇 가지의 음성 대조 실험들을 통해 실제 crosslinking product가 probe와 T7 RNAP의 sequence-specific binding을 바탕으로 만들어진 것임을 확인할 수 있었다(도 10).
실시예 8. 용매에 따른 뉴클레오티드의 변형 방법의 비교
상기 실시예 1 내지 7은 뉴클레오티드의 변형 시 THF-H2O의 공용매를 사용하였으나, 본 실시예 8에서는 THF를 포함하지 않고 H2O만을 용매로 하여 뉴클레오티드 변형이 일어날 수 있는지 실험하고자 하였다.
구체적으로, 실험 조건은 도 12A와 같았고, 헤어핀 구조의 올리고뉴클레오티드(서열번호 57, 화합물 7b)를 10 mol% [Rh(COD)Cl]2 촉매 하에서 diazoacetone(DAX)와 반응시켜 구아닌이 선택적으로 변형된 올리고뉴클레오티드(서열번호 58, 화합물 8b)를 얻는 과정에서 용매를 H2O 또는 10% THF-H2O로 비교하여 반응시켰다. 또한, 이후 Oxime 형성 반응을 통해 oxime이 구아닌에 결합된 올리고뉴클레오티드(서열번호 59, 화합물 8b-OX)를 형성시키고, 상기 화합물 8b 및 8b-OX가 잘 형성되었는 지 확인하였다.
그 결과, 도 12B와 같이, H2O만 용매로 한 경우와 10% THF-H2O를 용매로 한 경우 모두 상기 화합물 8b 및 8b-OX를 거의 유사한 정도로 형성하여, 본 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법에 있어서, 두 용매 간 차이가 거의 없는 것을 확인하였다.
실시예 9. 뉴클레오티드 유도체의 선택적 변형
또한, 본 실시예 9에서는 다양한 형태의 뉴클레오티드들 외에 뉴클레오티드의 유도체들도 DAX와 Rh(I) 촉매로 구아노신의 선택적 acetonyl화 반응이 가능한지 점검하고자 하였다.
(1) 사이클릭 다이구아닐레이트의 선택적 변형
뉴클레오티드 유도체인 사이클릭 다이구아닐레이트(c-di-GMP, cyclic diguanylate, CAS: 61093-23-0)도 선택적 변형이 가능한지 하기 반응식 3과 같이 실험을 수행하였다:
[반응식 3]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000046
.
구체적으로, 하기 화학식 9의 화합물(cyclic diguanylate)을 10 mol% [Rh(COD)Cl]2 촉매 및 10% THF-H2O 용매 하에서 diazoacetone(DAX)와 반응시켰다:
[화학식 9]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000047
.
그 결과, 상기 반응식 3에서 확인할 수 있듯이, mono-acetonylated된 하기 화학식 10의 화합물(mono-acetonylated cyclic diguanylate) 및 bis-acetonylated된 하기 화학식 11의 화합물(bis-acetonylated cyclic diguanylate)을 얻을 수 있었다:
[화학식 10]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000048
[화학식 11]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000049
.
(2) 7-메틸디옥시구아노신의 선택적 변형
뉴클레오티드 유도체인 7-메틸디옥시구아노신(7-Me-dG, 7-methyldeoxyguanosine iodide)도 선택적 변형이 가능한지 하기 반응식 4와 같이 실험을 수행하였다:
[반응식 4]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000050
.
구체적으로, 하기 화학식 12의 화합물(7-methyldeoxyguanosine iodide)을 10 mol% [Rh(COD)Cl]2 촉매 및 10% THF-H2O 용매 하에서 diazoacetone(DAX)와 반응시켰다:
[화학식 12]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000051
.
그 결과, 상기 반응식 4에서 확인할 수 있듯이, 변형된 하기 화학식 13의 화합물(derivative of 7-methyldeoxyguanosine iodide)을 얻을 수 있었다:
[화학식 13]
Figure PCTKR2021001073-appb-I000052
.

Claims (33)

  1. 로듐 촉매 하에서 뉴클레오티드와 하기 화학식 1의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000053
    (상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택됨).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 로듐 촉매는 [Rh(COD)Cl]2, [Rh(OH)(COD)]2, Rh(COD)(acac), [Rh(COD)(MeCN)2]BF4, [Rh(COD)2]OTf, Rh(C8H14)2(acac), Rh(C2H4)2(acac), Rh(nbd)(acac), Rh(nbd)2BF4, Rh(nbd)2(OTf), [Rh(nbd)Cl]2, Rh(COD)2SbF6, (CAAC-Cy)Rh(COD)Cl, [Rh(COD)2]BARF, [Rh(COE)2Cl]2, [RhCl(C6H10)]2, (1,5-Cyclooctadiene)(8-quinolinolato)rhodium(I), RhCp*(CO)2, [Rh(OMe)(COD)]2, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [ferroceneRh(COD)]BF4 및 1,1’-Bis((2R,5R)-2,5-diethylphospholano)ferrocene(cyclooctadiene)rhodium(I) tetrafluoroborate로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 촉매인, 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 로듐 촉매의 반응 비율은 상기 뉴클레오티드, 상기 화학식 1의 화합물 및 로듐 촉매 총 몰수 대비 0.01 내지 1000 mol%인, 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 뉴클레오티드는 구아닌(Guanine, G) 염기를 가진 뉴클레오티드 또는 구아닌(Guanine, G) 염기를 가진 뉴클레오티드의 유도체를 포함하는 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 뉴클레오티드는 단일 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드인, 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 뉴클레오티드는 헤어핀(hairpin) 구조, 듀플렉스(duplex) 구조, 단일 가닥 구조, 이중 가닥 구조 및 구아노신 벌지된(G-bulged) 구조로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 구조를 포함하는 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 유도체는 하기 화학식 9의 화합물, 하기 화학식 10의 화합물 및 하기 화학식 12의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인, 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법:
    [화학식 9]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000054
    [화학식 10]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000055
    [화학식 12]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000056
    .
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 다이아조아세톤(diazoacetone, DAX) 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인, 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000057
    .
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물의 반응비는 상기 뉴클레오티드 대비 0.1 내지 100 당량(equiv.)인, 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 반응의 용매는 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF) 및 다이메틸술폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물과 물이 혼합된 공용매 또는 물인, 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 반응의 용매가 공용매인 경우, 테트로하이드로퓨란 및 다이메틸술폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물의 상기 공용매 내 농도는 0.1 내지 70 부피%인, 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 반응은 pH 3 내지 10의 조건에서 이루어지는 것인, 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 반응은 2-[N-모르폴리노]에탄술폰산(2-[N-morpholino]ethansulfonic acid, MES) 완충 수용액 및 3-[N-모르폴리노]프로판술폰산(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid, MOPS) 완충 수용액으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 완충 수용액에서 이루어지는 것인, 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 반응은 염화나트륨(NaCl), 염화마그네슘(MgCl2), 염화칼륨(KCl), 아세트산나트륨(sodium acetate, NaOAc), 아세트산마그네슘(magnesium aceate, Mg(OAc)2) 및 아세트산칼륨(Potassium acetate, KOAc)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 첨가제가 첨가되어 이루어지는 것인, 뉴클레오티드의 선택적 변형 방법.
  15. 로듐 촉매 하에서 뉴클레오티드와 하기 화학식 1의 화합물을 반응시켜 제1 생성물을 얻는 단계; 및
    상기 제1 생성물과 하기 화학식 3의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 화학적으로 연결된(chemical ligated) 뉴클레오티드의 제조 방법으로서,
    상기 뉴클레오티드는 단일 가닥의 뉴클레오티드 템플레이트(template) 및 상기 단일 가닥의 뉴클레오티드 템플레이트와 듀플렉스(duplex)를 형성하며, 오버행(overhang)된 구아노신을 가지는 2개 이상의 단일 가닥 뉴클레오티드로 이루어진, 제조 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000058
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000059
    (상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    상기 n은 1 내지 10임).
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 다이아조아세톤(diazoacetone, DAX) 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인, 화학적으로 연결된(chemical ligated) 뉴클레오티드의 제조 방법:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000060
    .
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 오버행된 구아노신을 가지는 단일 가닥 뉴클레오티드는 2개인, 화학적으로 연결된(chemical ligated) 뉴클레오티드의 제조 방법.
  18. 청구항 15에 있어서, 상기 로듐 촉매는 [Rh(COD)Cl]2, [Rh(OH)(COD)]2, Rh(COD)(acac), [Rh(COD)(MeCN)2]BF4, [Rh(COD)2]OTf, Rh(C8H14)2(acac), Rh(C2H4)2(acac), Rh(nbd)(acac), Rh(nbd)2BF4, Rh(nbd)2(OTf), [Rh(nbd)Cl]2, Rh(COD)2SbF6, (CAAC-Cy)Rh(COD)Cl, [Rh(COD)2]BARF, [Rh(COE)2Cl]2, [RhCl(C6H10)]2, (1,5-Cyclooctadiene)(8-quinolinolato)rhodium(I), RhCp*(CO)2, [Rh(OMe)(COD)]2, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [ferroceneRh(COD)]BF4 및 1,1’-Bis((2R,5R)-2,5-diethylphospholano)ferrocene(cyclooctadiene)rhodium(I) tetrafluoroborate로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 촉매인, 화학적으로 연결된(chemical ligated) 뉴클레오티드의 제조 방법.
  19. 청구항 15에 있어서, 상기 n은 1 내지 5인, 화학적으로 연결된(chemical ligated) 뉴클레오티드의 제조 방법.
  20. 로듐 촉매 하에서 뉴클레오티드와 하기 화학식 1의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 포토케이지된(photocaged) 뉴클레오티드의 제조 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000061
    (상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택됨).
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 다이아조아세톤(diazoacetone, DAX) 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인, 포토케이지된(photocaged) 뉴클레오티드의 제조 방법:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000062
    .
  22. 청구항 20에 있어서, 상기 로듐 촉매는 [Rh(COD)Cl]2, [Rh(OH)(COD)]2, Rh(COD)(acac), [Rh(COD)(MeCN)2]BF4, [Rh(COD)2]OTf, Rh(C8H14)2(acac), Rh(C2H4)2(acac), Rh(nbd)(acac), Rh(nbd)2BF4, Rh(nbd)2(OTf), [Rh(nbd)Cl]2, Rh(COD)2SbF6, (CAAC-Cy)Rh(COD)Cl, [Rh(COD)2]BARF, [Rh(COE)2Cl]2, [RhCl(C6H10)]2, (1,5-Cyclooctadiene)(8-quinolinolato)rhodium(I), RhCp*(CO)2, [Rh(OMe)(COD)]2, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [ferroceneRh(COD)]BF4 및 1,1’-Bis((2R,5R)-2,5-diethylphospholano)ferrocene(cyclooctadiene)rhodium(I) tetrafluoroborate로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 촉매인, 포토케이지된(photocaged) 뉴클레오티드의 제조 방법.
  23. 청구항 20에 있어서, 상기 뉴클레오티드는 구아닌(Guanine, G) 염기를 가진 뉴클레오티드를 포함하는 포토케이지된(photocaged) 뉴클레오티드의 제조 방법.
  24. 로듐 촉매 하에서 한 쪽 가닥이 구아노신 벌지된(G-bulged) 이중 가닥의 뉴클레오티드와 하기 화학식 1의 화합물을 반응시켜 제2 생성물을 얻는 단계;
    상기 제2 생성물과 하기 화학식 4의 화합물을 반응시켜 제3 생성물을 얻는 단계;
    상기 제3 생성물을 분리하여 형광물질이 표지된 단일 가닥의 제4 생성물을 얻는 단계;
    상기 제4 생성물에 제4 생성물과 상보적인 단일 가닥의 뉴클레오티드를 결합시켜 한 쪽 가닥이 구아노신 벌지된(G-bulged) 이중 가닥의 제5 생성물을 얻는 단계;
    로듐 촉매 하에서 이중 가닥의 상기 제5 생성물과 하기 화학식 1의 화합물을 반응시켜 제6 생성물을 얻는 단계;
    환원제 하에서 상기 제6 생성물을 라이신(Lysine) 잔기를 가진 단백질과 환원적 아민화 반응(Reductive amination reaction)을 일으키는 단계를 포함하는 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체 제조 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000063
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000064
    (상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    상기 X는 형광물질임).
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 다이아조아세톤(diazoacetone, DAX) 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인, 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체 제조 방법:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000065
    .
  26. 청구항 24에 있어서, 상기 로듐 촉매는 [Rh(COD)Cl]2, [Rh(OH)(COD)]2, Rh(COD)(acac), [Rh(COD)(MeCN)2]BF4, [Rh(COD)2]OTf, Rh(C8H14)2(acac), Rh(C2H4)2(acac), Rh(nbd)(acac), Rh(nbd)2BF4, Rh(nbd)2(OTf), [Rh(nbd)Cl]2, Rh(COD)2SbF6, (CAAC-Cy)Rh(COD)Cl, [Rh(COD)2]BARF, [Rh(COE)2Cl]2, [RhCl(C6H10)]2, (1,5-Cyclooctadiene)(8-quinolinolato)rhodium(I), RhCp*(CO)2, [Rh(OMe)(COD)]2, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [ferroceneRh(COD)]BF4 및 1,1’-Bis((2R,5R)-2,5-diethylphospholano)ferrocene(cyclooctadiene)rhodium(I) tetrafluoroborate로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 촉매인, 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체 제조 방법.
  27. 청구항 24에 있어서, 상기 환원제는 NaBH3CN, NaBH4, LiBH3CN 및 NaBH(OCOCH3)3로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 환원제인, 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체 제조 방법.
  28. 청구항 24에 있어서, 상기 형광물질은 플루오레신(fluorescein), 보디피(BODIPY), 테트라메틸로드아민(Tetramethylrhodamine), 알렉사(Alexa), 시아닌(Cyanine), 알로피코시아닌(allopicocyanine), 로다민 B(Rhodamine B) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 형광물질인, 형광물질 표지된 뉴클레오티드와 단백질의 결합체 제조 방법.
  29. 로듐 촉매 하에서 뉴클레오티드의 유도체와 하기 화학식 1의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 변형된 뉴클레오티드의 유도체 제조 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000066
    (상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택됨).
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 유도체는 구아닌(Guanine, G) 염기를 가진 뉴클레오티드의 유도체를 포함하는 변형된 뉴클레오티드의 유도체 제조 방법.
  31. 청구항 29에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 유도체는 하기 화학식 9의 화합물, 하기 화학식 10의 화합물 및 하기 화학식 12의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인, 변형된 뉴클레오티드의 유도체 제조 방법:
    [화학식 9]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000067
    [화학식 10]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000068
    [화학식 12]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000069
    .
  32. 청구항 29에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드의 유도체는 하기 화학식 10의 화합물, 하기 화학식 11의 화합물 및 하기 화학식 13의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인, 변형된 뉴클레오티드의 유도체 제조 방법:
    [화학식 10]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000070
    [화학식 11]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000071
    [화학식 13]
    Figure PCTKR2021001073-appb-I000072
    .
  33. 청구항 29에 있어서, 상기 로듐 촉매는 [Rh(COD)Cl]2, [Rh(OH)(COD)]2, Rh(COD)(acac), [Rh(COD)(MeCN)2]BF4, [Rh(COD)2]OTf, Rh(C8H14)2(acac), Rh(C2H4)2(acac), Rh(nbd)(acac), Rh(nbd)2BF4, Rh(nbd)2(OTf), [Rh(nbd)Cl]2, Rh(COD)2SbF6, (CAAC-Cy)Rh(COD)Cl, [Rh(COD)2]BARF, [Rh(COE)2Cl]2, [RhCl(C6H10)]2, (1,5-Cyclooctadiene)(8-quinolinolato)rhodium(I), RhCp*(CO)2, [Rh(OMe)(COD)]2, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Ethyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Ethyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]BF4, [(R,R)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [(S,S)Methyl-DuPhosRh(COD)]OTf, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]BF4, [((R,R)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [((S,S)Methyl-(BPE))Rh(COD)]OTf, [ferroceneRh(COD)]BF4 및 1,1’-Bis((2R,5R)-2,5-diethylphospholano)ferrocene(cyclooctadiene)rhodium(I) tetrafluoroborate로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 촉매인, 변형된 뉴클레오티드의 유도체 제조 방법.
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