WO2021187546A1 - 抗精神疾患剤 - Google Patents

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WO2021187546A1
WO2021187546A1 PCT/JP2021/010982 JP2021010982W WO2021187546A1 WO 2021187546 A1 WO2021187546 A1 WO 2021187546A1 JP 2021010982 W JP2021010982 W JP 2021010982W WO 2021187546 A1 WO2021187546 A1 WO 2021187546A1
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WO
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algae
extract
cell death
cells
light
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PCT/JP2021/010982
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French (fr)
Inventor
礒田　博子
一憲 佐々木
河野　重行
毅 竹下
Original Assignee
国立大学法人筑波大学
国立大学法人東京大学
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/02—Algae
    • A61K36/05—Chlorophycota or chlorophyta (green algae), e.g. Chlorella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants

Definitions

  • the present invention relates to a neuronal cell death inhibitor consisting of algae of a species belonging to the order Chlorella or an extract thereof, and an anti-psychiatric agent containing the same.
  • the present age is also called a stress society.
  • the number of patients with mental illness such as depression
  • the number of mental illness patients in Japan in 2017 exceeded 4 million, which is about 1.6 times that of 2.58 million in 2002 in 15 years. It has increased.
  • the number of patients with mental illness is expected to reach a huge number in Japan. Since these mental illnesses are often found in the working-age population, the impact on society such as economic loss and social loss due to suicide is immeasurable, as well as an increase in medical expenses.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • the present invention is to develop a medicinal ingredient that can be ingested on a daily basis, has no side effects, is highly safe, is relatively inexpensive, and has an anti-psychiatric effect, and provides an anti-psychiatric agent or food or drink containing the same. Is.
  • microalgae is a general term for microalgae whose individual cells are difficult to identify with the naked eye.
  • microalgae have abundant nutrients such as carbohydrates, essential amino acids, lipids, minerals and vitamins in their algae, and also have antioxidant and anti-catalytic effects (Shibata S., et al., 2003, J Nutr). Sci Vitaminol, 49: 334-339), blood glucose lowering effect (Rodriguez-Lopez M.
  • Chlorella algae are used as health foods in Far East Asian countries such as Japan, Taiwan, and South Korea, and many research results have been reported on their safety and abundant nutrients contained.
  • the extract thereof is found in the chlorella algae cultured under the normal culture conditions. It was found that it has an inhibitory effect on the apoptosis of nerve cells. In addition, it was proved that the pseudo-depressive state was significantly suppressed in the mice to which the algae of the microalgae were administered.
  • the present invention is based on the novel findings and provides the following.
  • a nerve cell death inhibitor consisting of an extracted algae extract.
  • the anti-psychiatric agent according to (3), wherein the mental illness is depression, manic-depressive disorder, or schizophrenia.
  • a method for producing a neuronal cell death inhibitor which is a culturing step in which algae of a species belonging to the order Chlorella are cultured by irradiating them with light at a light intensity of 500 to 2500 ⁇ mol photons / m 2 / s for 150 to 500 hours.
  • the production method including.
  • the production method according to (6) which comprises an extraction step of extracting the algae extract from the algae after culturing by a physical and / or chemical method.
  • the nerve cell death inhibitor of the present invention it is possible to provide a drug that is safe for a living body such as the human body and suppresses apoptosis in nerve cells.
  • the anti-psychiatric agent of the present invention it is possible to prevent or treat the onset of mental illness such as depression.
  • the graph shows the relative value (%) when the viability of SH-SY5Y cells in Control is 100.
  • Control is the viability of SH-SY5Y cells to which the algae extract has not been added.
  • the graph shows the relative value (%) when the viability of SH-SY5Y cells in Control is 100.
  • Control is the viability of SH-SY5Y cells to which dexamethasone and algal extract have not been added
  • DEX is the viability of SH-SY5Y cells to which only dexamethasone has been added.
  • ** indicates a significant difference (p ⁇ 0.01) with respect to the survival rate of Control
  • "##” indicates a significant difference (p ⁇ 0.01) with respect to the survival rate of DEX.
  • MAP2K4 Mitogen activated protein kinase kinase 4
  • MAP2K4 is a signaling factor in the MAP kinase signaling pathway that induces apoptosis.
  • the graph shows the relative value (%) when the MAP2K4 gene expression level in Control is 100.
  • Control is the MAP2K4 gene expression level in SH-SY5Y cells to which dexamethasone and algal extract were not added
  • DEX is the MAP2K4 gene expression level in SH-SY5Y cells to which only dexamethasone was added.
  • Control is the MAPK14 gene expression level in SH-SY5Y cells to which dexamethasone and algal extract were not added
  • DEX is the MAPK14 gene expression level in SH-SY5Y cells to which only dexamethasone was added.
  • ** indicates a significant difference (p ⁇ 0.01) with respect to the MAPK14 gene expression level in Control
  • "##” indicates a significant difference (p ⁇ 0.01) with respect to the MAPK14 gene expression level in DEX.
  • MAPK8 Mitogen-Activated Protein Kinase 8
  • MAPK8 is a signaling factor in the MAP kinase signaling pathway that induces apoptosis.
  • the graph shows the relative value (%) when the MAPK8 gene expression level in Control is 100.
  • Control is the MAPK8 gene expression level in SH-SY5Y cells to which dexamethasone and algal extract were not added
  • DEX is the MAPK8 gene expression level in SH-SY5Y cells to which only dexamethasone was added. be.
  • "**” indicates a significant difference (p ⁇ 0.01) with respect to the MAPK8 gene expression level in Control
  • "##" indicates a significant difference (p ⁇ 0.01) with respect to the MAPK8 gene expression level in DEX.
  • PI3KCA Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalyst Subunit Alpha
  • PI3K is a signaling factor that suppressively regulates the activity of ASK1 that induces apoptosis in the PI3K / AKT signaling pathway.
  • the graph shows the relative value (%) when the PI3KCA gene expression level in Control is 100.
  • Control is the expression level of PI3KCA gene in SH-SY5Y cells to which dexamethasone and algal extract were not added
  • DEX is the expression level of PI3KCA gene in SH-SY5Y cells to which only dexamethasone was added.
  • ** indicates a significant difference (p ⁇ 0.01) with respect to the PI3KCA gene expression level in Control
  • "##" indicates a significant difference (p ⁇ 0.01) with respect to the PI3KCA gene expression level in DEX.
  • AKT1 AKT Serine / Threonine Kinase 1
  • AKT1 is a signaling factor that directly and suppressively regulates the activity of the ASK1 protein that induces apoptosis in the PI3K / AKT signaling pathway.
  • the graph shows the relative value (%) when the AKT1 gene expression level in Control is 100.
  • Control is the AKT1 gene expression level in SH-SY5Y cells to which dexamethasone and algae extract have not been added
  • DEX is the AKT1 gene expression level in SH-SY5Y cells to which only dexamethasone has been added.
  • ** indicates a significant difference (p ⁇ 0.01) with respect to the AKT1 gene expression level in Control
  • "##" indicates a significant difference (p ⁇ 0.01) with respect to the AKT1 gene expression level in DEX.
  • CASP3 Caspase-3
  • CASP3 is one of the effector caspases that plays a central role in proteolysis downstream of the apoptotic pathway.
  • the graph shows the relative value (%) when the CASP3 gene expression level in Control is 100.
  • Control is the expression level of the CASP3 gene in SH-SY5Y cells to which dexamethasone and algae extract have not been added
  • DEX is the expression level of the CASP3 gene in SH-SY5Y cells to which only dexamethasone has been added. be.
  • Control is the PARP1 gene expression level in SH-SY5Y cells to which dexamethasone and algae extract have not been added
  • Control is the PARP1 gene expression level in SH-SY5Y cells supplemented with only dexamethasone.
  • ** in the figure indicates a significant difference (p ⁇ 0.01) with respect to the PARP1 gene expression level in Control, and "##”. Shows a significant difference (p ⁇ 0.01) with respect to the PARP1 gene expression level in DEX. It is a figure which shows the antidepressant action of algae body in a tail suspension test of a mouse.
  • the graph shows the immobility time when the tail suspension test was performed for 7 days on the mouse group of the water-administered group (Control), the antidepressant bupropion-administered group (Bupropion), and the chlorella algae-administered group (Chlorella). Is shown.
  • the immobility time is defined as the depression-like state of the mouse. It is a figure which shows the amount of TNF- ⁇ in the brain tissue of each mouse group of the 7th day used in FIG. It is a figure which shows the amount of BDNF in the brain tissue of each mouse group of the 7th day used in FIG. It is a figure which shows the amount of dopamine in the brain tissue of each mouse group of the 7th day used in FIG.
  • the first aspect of the present invention is a nerve cell death inhibitor.
  • the nerve cell death inhibitor of the present invention comprises algae bodies of Chlorella algae or an extract thereof, which have been cultured for a predetermined time under strong light stress having a specific light intensity.
  • the nerve cell death inhibitor of the present invention the apoptosis action in nerve cells can be suppressed, and by administering it to a subject, anti-psychiatric action such as antidepressant action and learning memory ability It is possible to provide the effect of preventing or ameliorating a decrease in nerve function such as.
  • nerve cell death refers to apoptosis in nerve cells.
  • Apoptosis is a caspase-dependent programmed cell death in a multicellular organism.
  • the nerve cells undergoing apoptosis are not particularly limited. Either central nerve cells or peripheral nerve cells can be targeted. Central nerve cells, especially brain cells, are preferred.
  • suppression of nerve cell death means suppression of induction of apoptosis in nerve cells and / or suppression of function of related factors directly involved in apoptosis.
  • suppression of expression or function of MAPK signal transduction factor involved in the induction of nerve cell death can be mentioned.
  • “Mental illness” is a general term for functional or organic disorders of the brain that are extrinsic, psychogenic, or intrinsic in a broad sense. Although not limited, the present specification specifically refers to the conventional diagnostic category of psychopathology (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders 5 as defined by the American Psychiatric Association). Based on the Diagnostic Criteria for Mental Illness [DSM Diagnosis]), psychiatric disorders in a narrow sense belonging to three syndromes classified into schizophrenia, depression, or bipolar disorder are applicable.
  • “Schizophrenia” is a mental illness that is accompanied by symptoms such as hallucinations, auditory hallucinations, and delusions, as well as dull emotional expression, decreased motivation, and develops cognitive dysfunction.
  • “Depression” is a type of mood disorder, and refers to a mental disorder characterized by depressed mood, decreased mental activity such as motivation and interest, impatience, decreased appetite, insomnia, and persistent anxiety.
  • Bipolar disorder (manic depression) is a mental disorder that is classified as a mood disorder together with depression, and has the characteristic of circulating the pathology of depression and its opposite manic state.
  • prevention means to prevent the onset of a disease (mental disease in the present specification).
  • treatment refers to alleviating, suppressing, or ameliorating the progression of symptoms of an affected disease, and ameliorating the symptoms.
  • Chlorellales is a group belonging to the phylum Green algae (Chlorophyta) and Trebouxiophyceae, which has chlorophyll in the cell and is mainly composed of ⁇ -1,4 glucan by photosynthesis. It is an alga that can biosynthesize the starch.
  • Species belonging to the order Chlorella refers to species that are taxonomically classified into the order Chlorella. Specifically, the species belonging to the order Chlorella includes species belonging to the family Chlorellaceae.
  • the chlorella family here is a concept that includes the chlorella strain group (Chlorella-clade), the parachlorella strain group (Parachlorella-clade), and the prototheca strain group (Prototheca-clade) (Takashi Nakata, 2012, supervised by Nobu Watanabe, Algae Handbook, pp33-37, NTS Inc).
  • Species belonging to the chlorella family include, for example, species belonging to the genus Chlorella (eg, C. mirabilis, C. minutissima, C.
  • Species belonging to the genus (Auxenochlorella) (eg, A. protothecoides, etc.), species belonging to the genus Parachlorella (eg, P. kessleri, P. beijerinckii, etc.), species belonging to the genus Dicloster (eg, Dicloster). D. acuatus, etc.), species belonging to the genus Micractinium (eg, M. pusillum, M. benophorum, etc.), species belonging to the genus Lobosphaeropsis (eg, L.
  • di Examples include species belonging to the genus Dictyosphaerium (eg, D. pulchellum, etc.) and species belonging to the genus Actinastrum (eg, A. hantzschii, etc.).
  • the term "light intensity” means a photon flux density.
  • the light intensity is the number of photons per unit area in that unit time, that is, the total number of photons contained in the irradiated surface divided by the irradiation area (m 2 ) and the irradiation time (seconds) (mol photons). It is represented by / m 2 / s).
  • the number of photons of this light intensity can be calculated by measuring the light on the actual irradiation surface with a spectroscopic unit or the like.
  • the nerve cell death inhibitor of this embodiment is composed of algae of a species belonging to the order Chlorella or an extract thereof.
  • the Chlorella algae used in the present invention are algae that have been subjected to a specific environmental stress in an artificial environment.
  • the specific environmental stress referred to here means culturing for a predetermined time under strong light stress.
  • strong light stress means irradiating the chlorella algae with strong light as an external stimulus. Specifically, it refers to load stress when light having a specific light intensity is irradiated for a specific time.
  • the "specific light intensity” refers to a light intensity in the range of 500 to 2500 ⁇ mol photons / m 2 / s, preferably 550 to 2300 ⁇ mol photons / m 2 / s, and more preferably 600 to 2000 ⁇ mol photons / m 2 / s. Is.
  • the light to be irradiated may be artificial light having a peak (maximum wavelength) of the wavelength spectrum at 450 nm ⁇ 15 nm and / or 580 nm ⁇ 15 nm.
  • white light including the entire visible light range of 380 nm to 800 nm, purple light to blue light of 400 to 500 nm, and / or yellow light of 560 nm to 600 nm are applicable.
  • the light source used in this step is not particularly limited as long as it is an artificial light source capable of emitting light in the wavelength range.
  • a fluorescent lamp capable of emitting white light including the entire visible light range a white light emitting diode (Light Emitting Diode: hereinafter often referred to as “LED” in the present specification), and a high intensity discharge (HID: High Intensity Discharge).
  • LED Light Emitting Diode
  • HID High Intensity Discharge
  • the “specific time” refers to the time for directly or indirectly irradiating the Chlorella algae with the light intensity. This time refers to the time during which strong light stress can be sufficiently applied to the Chlorella algae. Specifically, it is 150 to 500 hours, preferably 160 to 400 hours, more preferably 168 to 360 hours, and even more preferably 190 to 340 hours. When converted to days, it is equivalent to 7 to 20 days or 6 to 14 days. Generally, if the light intensity is strong, the irradiation time may be short. For example, if the light intensity is 1800 to 2500 ⁇ mol photons / m 2 / s, irradiation for 150 to 250 hours or 150 to 220 hours is sufficient.
  • the irradiation time is long.
  • the light intensity is 500 to 1000 ⁇ mol photons / m 2 / s, it is preferable to irradiate for 280 to 500 hours or 310 to 500 hours.
  • the load of strong light stress is preferably continuous irradiation, but may be irradiation having a light-dark period.
  • Continuous irradiation here means not only continuous irradiation of light, but also pulsed light that looks like continuous irradiation as a whole by repeating the light and dark period in an extremely short time that cannot be recognized by the naked eye like a fluorescent lamp. Including irradiation.
  • a dark period recognizable by the naked eye for example, a dark period of 1 second or more, preferably several seconds or more
  • the load of strong light stress may be exposed at the above-mentioned specific light intensity in the total time.
  • Chlorella algae cultured under the above-mentioned conditions of applying strong light stress accumulate a large amount of carotenoids in the algae, and the ratio of the amount of carotenoids to the plant pigment per cell is significant as compared with the case of culturing under normal culture conditions.
  • the "plant pigment” here is a main pigment component existing in plant cells, and is roughly classified into four groups of chlorophyll, carotenoid, flavonoid, and betalain.
  • the order Chlorella includes two of the above four groups, chlorophyll and carotenoid.
  • “Carotenoid” is a general term for water-insoluble tetraterpenes having a structure close to left-right symmetry with the chemical formula C 40 H 56 as the basic skeleton. Carotenoids are roughly classified into carotenes containing oxygen in the molecule and xanthophylls containing no oxygen in the molecule, but chlorella algae cultured under high light stress loading conditions can include any carotenoid. ..
  • carotenoids include the red pigment lycopene belonging to carotene, the yellow pigment ⁇ -carotene, ⁇ -carotene, ⁇ -carotene and ⁇ -cloptoxanthin, and the pale yellow pigment astaxanthin and brown pigment belonging to xanthophyll ( Examples thereof include fucoxanthin (including olive color), capsantin of red pigment, astaxanthin and astaxanthin derivative (cantaxanthin, etc.), violaxanthin of orange-red pigment, zeaxanthin of orange-yellow pigment, and lutein and neoxanthin of yellow pigment.
  • Carotenoids are known to have a function of protecting cells from active oxygen generated inside cells by irradiation with ultraviolet rays. It is thought that the reason why chlorella algae accumulate a large amount of carotenoids in cells by culturing under strong light stress load conditions is to protect cells from active oxygen as an antioxidant. However, the specific mechanism and genetic composition of the carotenoid synthesis pathway, which is rarely produced under normal culture, is activated by the application of strong light stress, and so on. Furthermore, it is clear from the results of Examples described later that, in the nerve cell death inhibitor of the present invention, the extract of Chlorella algae obtained by culturing under strong light stress loading conditions has a nerve cell death inhibitory activity. It has become. However, it is unclear whether its activity is due to carotenoids accumulated in large quantities due to high light stress loading, or due to other unidentified small molecule compounds or proteins, etc., and its function and mechanism at the molecular level.
  • algae extract is the algae obtained by treating the Chlorella algae by physical and / or chemical methods.
  • a substance containing all or part of the components in a cell examples thereof include cell contents obtained by crushing the algae cells and an eluate containing components eluted from cells immersed in a liquid.
  • the cell contents may include cell wall pieces and cell membrane pieces.
  • the nerve cell death inhibitor of the present invention may be either liquid or solid. Both may be converted if necessary. For example, it is usually stored as a solid and can be dissolved in a solvent to make a liquid at the time of bioadministration.
  • the solid may be in any shape, such as powder, granules, or small pieces.
  • the nerve cell death inhibitor of the present invention may be a concentrated or purified algae extract of Chlorella algae, if necessary.
  • the production method of the nerve cell death inhibitor of the present invention includes a culture step as an essential step, and an extraction step, a drying step, and a concentration step as selection steps. Hereinafter, each step will be described.
  • the "culturing step” is a step of culturing algae of a species belonging to the order Chlorella by irradiating them with light at a specific light intensity for a specific time.
  • the light irradiation method is not particularly limited as long as it can sufficiently expose the chlorella algae in culture.
  • the light emitted to apply strong light stress to Chlorella algae is artificial light.
  • chlorella algae in culture may be exposed to natural light during artificial light irradiation.
  • the chlorella algae in the culture tank may be exposed to sunlight by sunlight shining through a window.
  • the light that directly contributes to the load of strong light stress on the Chlorella algae is artificial light.
  • the light irradiation is preferably direct irradiation from a light source, but may be indirect irradiation via a reflector or the like for the purpose of distributing the light to the entire culture solution.
  • indirect irradiation since the irradiated light may be attenuated, it is preferable to increase the light intensity of the light source as necessary so that the light intensity to the chlorella algae is within the above range.
  • Chlorella algae can grow and proliferate even under strong light stress, it is desirable to continue culturing during stress application.
  • the culture conditions in this step are not particularly limited as long as the conditions are such that Chlorella algae can be cultured.
  • Optimal culture conditions may be appropriately set according to the species of Chlorella algae to be cultured.
  • the medium used in this step is usually a basic growth medium.
  • TAP medium can be mentioned.
  • the composition of TAP media NH 4 Cl 40mg, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O 5.1mg, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 10mg, K 2 HPO 4 11.9mg, KH 2 PO 4 6.03mg, Hutner's trace elements 0.1mL, Acetic acid 0.1 mL, Tris (hydroxymethyl) aminomethane 242 mg, Distilled water 99.8 mL (pH 6.5 to 6.8) may be used.
  • Hutner's trace elements are, Na 2 EDTA ⁇ 2H 2 O 5g, ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O 2.2g, H 3 BO 3 1.14g, MnCl 2 ⁇ 4H 2 O 506mg, FeSO 4 ⁇ 7H 2 O 499mg, CoCl 2 ⁇ 6H 2 O 161mg, CuSO 4 ⁇ 5H 2 O 157mg, (NH 4) 6 Mo 7 O 24 ⁇ 4H 2 O 110mg, consisting Distilled water 100 mL.
  • the chlorella algae to be cultured are preferably wild strains, but may be mutant strains. However, in that case, the composition of the medium is prepared to be suitable for the growth of the mutant strain.
  • a medium satisfying the auxotrophy is prepared by adding 500 ng / mL to 100 ⁇ g / mL of cysteine to the TAP medium. ..
  • the culture temperature may be any temperature at which Chlorella algae can grow. It is usually in the range of 15 to 35 ° C, preferably 18 to 30 ° C, more preferably 20 to 28 ° C, and even more preferably 25 ⁇ 2 ° C.
  • the culture may be indoors or outdoors, but indoor culture is preferable in order to appropriately apply strong light stress from an artificial light source under the above conditions.
  • Indoor culture can be performed in an artificial environment such as a plant factory where the weather conditions such as light, humidity, and temperature, the supply of medium, and aseptic conditions are controlled, or the culture is installed indoors. It may be any of the in-house cultures.
  • the medium may be agitated throughout the entire period, or periodically or irregularly, as needed.
  • the stirring means does not matter.
  • a stirring device such as a stirring rod may be used, or the medium may be stirred by inverting, rotating, and vibrating the culture tank.
  • CO 2 may be added so that the CO 2 concentration in the medium is 2 to 5%.
  • the medium may be changed once or multiple times as needed.
  • the exchange medium is preferably the same as the medium in use, but can be exchanged with another medium as long as the effect of stress application is not impaired.
  • the time for exchanging the medium is not particularly limited, but it is preferable that the chlorella algae in the culture medium enter the death phase, specifically the stationary phase.
  • the culture solution may be diluted if necessary when the medium is exchanged.
  • the "drying step” is a step of drying the algae of Chlorella order algae or an extract thereof, which is a selection step in the present production method. This step includes a post-culture drying step of drying the algae of Chlorella order algae after the culturing step and a post-extraction drying step of drying the algae extract after the extraction step, and each of them should be performed independently. Can be done. This step is a selection step that may be performed as needed. "Drying" means that the water content of the object is lowered by evaporation or sublimation.
  • the drying method in this step is not particularly limited as long as it can reduce the water content of the target chlorella algae or the algae extract thereof.
  • a natural drying method including sun drying
  • a dehumidifying drying method that dries in a closed container together with a dehumidifying agent
  • an air drying method that blows warm or cold air using a blower or the like.
  • Heat drying method using a heat source vacuum drying method of degassing using a vacuum pump or the like in a closed container, freeze drying method, or a combination thereof.
  • the freeze-drying method is preferable because it can be dried in a relatively short time with almost no denaturation of the medicinal ingredient.
  • the algae may be dried at -50 ° C for 6 hours to 1 week, preferably at -50 ° C for 24 hours to 72 hours. Since the degree of drying in this step differs depending on the drying step after culturing or the drying step after extraction, it may be appropriately determined according to the purpose, but usually the water content of the algae or the algae extract is 50% before drying. It is preferably as follows. More preferably, it is 30% or less, or 20% or less.
  • the solvent easily permeates into the tissue of the algae by reducing the water content in the algae. Therefore, the medicinal ingredient contained in the algae can be efficiently extracted into the solvent in a short time. Further, by drying the algae body, when an organic solvent such as ethanol is used as a solvent, the permeation of the solvent is not hindered or diluted by the water present in the algae body.
  • Extraction step is a step of extracting the algae extract from the algae by a physical and / or chemical method. This step is a selection step that may be performed as needed.
  • the specific extraction method of the algae extract is not limited. A method known in the art may be used. For example, a cell disruption method and an elution method can be mentioned. Each of them will be described below.
  • cell crushing method the cell wall and cell membrane of the target cell (here, the algae of Chlorella algae) are crushed by a physical method, a chemical method, or a combination thereof, and the cells are crushed. This is a method of exposing the contents to the outside.
  • a crushing method, an ultrasonic method, a decomposition method and the like can be mentioned.
  • the "crushing method” is a method of applying physical pressure to cells to crush and crush the cell wall and extract the cell contents, which is a physical cell crushing method.
  • the crushing method for example, first, the collected cells are physically ground using a bead mill, a grind mill, or the like to obtain a crushed solution.
  • a bead mill a grind mill, or the like to obtain a crushed solution.
  • the "ultrasonic method” is a physical cell crushing method in which the cell wall is crushed by ultrasonic waves and the cell contents are extracted.
  • the collected cells are first suspended in a suitable solution such as water or a buffer, and then the cells are crushed at an appropriate oscillation frequency and output using an ultrasonic crusher (sonicator).
  • a suitable solution such as water or a buffer
  • the cells are crushed at an appropriate oscillation frequency and output using an ultrasonic crusher (sonicator).
  • sonic crusher for specific conditions and methods, refer to the instruction manual of the ultrasonic crusher.
  • the “degradation method” is a method in which components (proteins, lipids, sugars, etc.) constituting the biological membrane are treated with a decomposition agent, the cells are crushed by lysing or denaturing the biological membrane, and the cell contents are extracted. , A chemical cell disruption method.
  • the degrading agent include, but are not limited to, an enzyme capable of dissolving the cell wall of Chlorella algae, an alkaline aqueous solution capable of denaturing a protein component such as a cell membrane, and a surfactant capable of solubilizing lipids.
  • the alkaline aqueous solution may be an aqueous solution prepared by dissolving an alkaline salt in water.
  • the alkali salt used for example, sodium hydroxide (NaOH), potassium hydroxide (KOH), sodium carbonate (Na 2 CO 3 ), potassium carbonate (K 2 CO 3 ), or a combination thereof can be used.
  • carbonates such as potassium carbonate and sodium carbonate are preferable as alkali salts used in the decomposition method because they are the main components of "Kansui” approved as a food additive and have an extremely small effect on the human body.
  • the pH of the alkaline aqueous solution is not limited, but may be in the range of pH 11 or more and pH 14 or less.
  • Surfactants are nonionic, such as Triton X-100, Triton X-114, NP-40, Brij-35, Brij-58, Tween-20, Tween-80, octyl- ⁇ -glucoside or OTG.
  • nonionic surfactants such as copolymers of PEG and PPG, anionic surfactants such as SDS, amphoteric surfactants such as CHAPS or CHAPSO, or combinations thereof. It may be either. Preferably, it is a non-ionic surfactant.
  • concentration of the surfactant is not limited, but may be in the range of 0.1 to 20%, 1% to 20%, 3% to 18%, or 5% to 15% in volume%.
  • the "elution method” is a method in which cells are brought into contact with a medium such as a solvent to elute components such as small molecule compounds contained in the cells into the medium. This is a method of eluting only specific intracellular components into a solvent while basically maintaining the structure of biological tissues such as cells.
  • cells which are algae of Chlorella algae
  • a solvent for a predetermined time for example, soaking, coating, spraying
  • the cells are removed by centrifugation or filtration to obtain a desired extraction solution. You can get things.
  • the solvent used can be used as a solid substance remaining by the above-mentioned drying step (drying step after extraction) or a paste in an intermediate state thereof to obtain an extract.
  • the solvent used in the elution method is not particularly limited and may be appropriately selected according to the purpose.
  • an organic solvent or the like may be used to elute the intracellular fat-soluble component.
  • polar organic solvents such as ethanol, aliphatic or alicyclic hydrocarbons with 6 to 10 carbon atoms such as n-hexane or n-heptane, aromatic hydrocarbons with 6 to 10 carbon atoms such as benzene, and the like.
  • polar organic solvents such as ethanol, aliphatic or alicyclic hydrocarbons with 6 to 10 carbon atoms such as n-hexane or n-heptane, aromatic hydrocarbons with 6 to 10 carbon atoms such as benzene, and the like.
  • polar organic solvents such as ethanol, aliphatic or alicyclic hydrocarbons with 6 to 10 carbon atoms such as n-hexane or n-heptane, aromatic hydrocarbons with 6 to 10 carbon atom
  • the organic solvent is preferably a solvent such as ethanol which is non-persistent and / or non-toxic or extremely low.
  • a solvent such as ethanol which is non-persistent and / or non-toxic or extremely low.
  • water, an aqueous solution or the like may be used as the solvent.
  • the amount of the solvent is not limited, but usually, the volume (volume / weight: V / W) of the solvent with respect to the weight of the algae to be used may be in the range of 2 to 10 times.
  • water may be used in the range of 20 mL to 100 mL.
  • the solvent may be heated during this step.
  • the heating temperature varies depending on the type of solvent, but for example, in the case of water, it is in the range of 50 to 100 ° C, preferably 60 to 99 ° C, more preferably 70 to 98 ° C under 1 atm, and a heat-resistant and pressure-resistant sealer such as an autoclave.
  • the temperature may be in the range of 100 to 121 ° C.
  • the temperature may be in the range of 40 to 78.3 ° C., preferably 55 to 77 ° C., and more preferably 60 to 77 ° C. ..
  • the above conditions for water or ethanol may be appropriately applied depending on the concentration of ethanol.
  • the extraction time in the solvent depends on the state of the algae to be extracted, the type and temperature of the solvent, or the solubility of the solvent in the medicinal component. For example, when immersing algae in a raw state in water at 20 ° C under 1 atm, the extraction time takes one year or more, but when immersing the algae powder in a dry state in water heated to 98 ° C. The extraction time is about 2 to 20 minutes. Further, when the solvent is water, the time may be about 1 to 15 minutes if the temperature is 120 to 121 ° C. under 2 atm. In general, the lower the solvent temperature, the longer the extraction time, and the higher the solvent temperature, the shorter the extraction time. Further, the more easily soluble the medicinal ingredient is in the solvent, the shorter the extraction time may be, and the less soluble the medicinal ingredient, the longer it takes.
  • the method of heating the solvent is not particularly limited as long as the solvent can be heated to near a desired temperature.
  • a method of putting it in a container and heating it with an open flame, or a method of heating it with a heat source such as a microwave or a heater can be mentioned.
  • the order of soaking the algae and heating the solvent does not matter.
  • the algae may be immersed after heating the solvent to a predetermined temperature, or the algae may be immersed in a solvent at room temperature and heated to a predetermined temperature.
  • the solvent may be agitated together with heating.
  • the stirring method may be, for example, stirring with a stirring rod or using a stirring device.
  • the “concentration step” is a selection step on the premise that the present production method includes an extraction step, and may be performed after the extraction step if necessary. In this step, the concentration of the medicinal ingredient contained in the extract is increased by reducing the solvent from the extract.
  • Concentration is performed when the extract is an extract, that is, a liquid. Moisture or solvent in the extract may be partially removed to increase the concentration of algae components of Chlorella algae present in the final liquid.
  • the concentration after concentration is not particularly limited, and is not particularly limited as long as it is higher than the concentration of the algae component contained in the original extract obtained by first extracting from the algae.
  • the concentration is preferably 2 to 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, or 10 times or more the concentration of the original extract.
  • This step is not particularly limited as long as it is a method capable of removing a solvent that can reduce only the solvent without denaturing the medicinal component contained in the extract.
  • a method for reducing the liquid from the extract a method known in the art can be used. For example, an evaporation concentration method using an evaporator or the like, a natural evaporation concentration method in which a solvent is evaporated by air drying or the like, and a concentration method in which an extract is cooled can be mentioned.
  • a second aspect of the present invention is an anti-psychiatric agent.
  • the anti-psychiatric agent of the present invention includes the nerve cell death inhibitor according to the first aspect as an active ingredient. According to the anti-psychiatric agent of the present invention, it has an effect of prevention or treatment for mental illness such as depression.
  • the anti-psychiatric agent of the present invention may be an agent composed of only an active ingredient, or a composition composed of a liquid medium, a carrier, and a combination with other active ingredients (anti-psychiatric drug). Composition).
  • an agent composed of only an active ingredient or a composition composed of a liquid medium, a carrier, and a combination with other active ingredients (anti-psychiatric drug). Composition).
  • the anti-psychiatric agent of the present invention includes the nerve cell death inhibitor according to the first aspect as an active ingredient.
  • the amount (content) of the nerve cell death inhibitor contained in the anti-psychiatric agent is the type of mental illness, the dosage form of the anti-psychiatric agent, and the administration of the anti-psychiatric agent. It depends on the amount and the type of carrier described later. Therefore, it may be determined as appropriate in consideration of each condition.
  • the dose is adjusted so that an effective amount of the neuronal cell death inhibitor is included in the single dose.
  • the "effective amount” is an amount necessary for the nerve cell death inhibitor included after administration of the anti-psychiatric agent to exert an anti-psychiatric effect, and is harmful to the living body to which the anti-psychiatric agent is administered. An amount that causes little or no side effects. This effective amount may vary depending on various conditions such as subject information, route of administration, and frequency of administration. Ultimately, it is decided by the judgment of a doctor, veterinarian, pharmacist, etc.
  • the "subject” refers to a living body to which an anti-psychiatric agent is applied.
  • humans pet animals (dogs, cats, etc.), livestock (cattle, horses, sheep, goats, pigs, chickens, ostriches, etc.), racehorses, experimental animals (mouses, rats, rabbits, guinea pigs, monkeys, etc.), etc. Applicable. It is preferably human.
  • Subject information is various individual information of a living body to which an anti-psychiatric agent is administered. For example, if the subject is a human, it includes age, weight, gender, diet, health condition, disease progression and severity, drug sensitivity, presence or absence of concomitant drugs, and the like.
  • the anti-psychiatric agent of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable liquid medium as a constituent component in a liquid composition such as a liquid preparation.
  • Liquid media include, for example, solvents such as water, ethanol, propylene glycol, ethoxylated isostearel alcohols, polyoxylated isostearel alcohols and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters. It is desirable that such a liquid medium is sterilized at the time of use, and it is preferable that the liquid medium is adjusted to be isotonic with the body fluid if necessary.
  • the anti-psychiatric agent of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier, if necessary, in the composition.
  • a pharmaceutically acceptable carrier refers to an additive commonly used in the field of pharmaceutical technology. Examples include solvents, excipients, binders, disintegrants, fillers, emulsifiers, fluidity modifiers, lubricants, human serum albumin and the like.
  • the solvent may be, for example, water or any other pharmaceutically acceptable aqueous solution, or a pharmaceutically acceptable organic solvent.
  • aqueous solution include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents, phosphate buffer solution, and sodium acetate buffer solution.
  • auxiliary agent include D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, low-concentration nonionic surfactants, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, and the like.
  • Excipients include, for example, sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides, metal salts, citric acid, tartrate acid, glycine, polyethylene glycol, Pluronic®, kaolin, silicic acid, or theirs. The combination of.
  • Binders include, for example, starch paste using vegetable starch, pectin, xanthan gum, simple syrup, glucose solution, gelatin, tragacanth, methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, cellac, paraffin, polyvinylpyrrolidone or a combination thereof. Can be mentioned.
  • disintegrant examples include the starch, lactose, carboxymethyl starch, crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar, laminarin powder, sodium hydrogencarbonate, calcium carbonate, alginic acid or sodium alginate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sodium lauryl sulfate, and stear. Acid monoglycerides or salts thereof can be mentioned.
  • Examples of the filler include petrolatum, the sugar and / or calcium phosphate.
  • emulsifier examples include sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, and propylene glycol fatty acid ester.
  • Examples of the flow addition modifier and lubricant include silicate, talc, stearate or polyethylene glycol.
  • solubilizers in addition to the above, if necessary, solubilizers, suspensions, diluents, dispersants, surfactants, painkillers, stabilizers, absorption promoters, bulking agents, moisturizers commonly used in pharmaceuticals. , Moisturizers, wetting agents, adsorbents, flavoring agents, disintegration inhibitors, coating agents, coloring agents, preservatives, preservatives, antioxidants, fragrances, flavoring agents, sweeteners, buffers, isotonic agents, etc. Can also be included as appropriate.
  • the above carrier is used for avoiding or suppressing the decomposition of the active ingredient, a neuronal cell death inhibitor, in vivo, facilitating formulation and administration, and maintaining the dosage form and drug efficacy, and is necessary. It may be used as appropriate as known in the art.
  • the dosage form of the anti-psychiatric agent of the present invention delivers the active ingredient, the nerve cell death inhibitor according to the first aspect, to the target site without inactivating it by decomposition or the like, and is effective in vivo. It is not particularly limited as long as it is in a form capable of exerting the pharmacological effect of the component.
  • the target diseases for which anti-psychiatric agents are applied are mental illnesses described later.
  • the site that causes mental illness is the site where nerve cells are located, that is, mainly the central nervous system, especially the brain. Therefore, the anti-psychiatric agent may be in any dosage form as long as the active ingredient nerve cell death inhibitor can be delivered to the target site, more specifically, the nerve cell, targeting the central nerve, particularly the brain. ..
  • the specific dosage form differs depending on the administration method and / or prescription conditions. Since the administration method can be roughly divided into parenteral administration and oral administration, a dosage form suitable for each administration method may be used.
  • the preferred dosage form is a liquid preparation that can be directly administered to the target site or systemically administered via the circulatory system.
  • liquid preparations include injections.
  • the injection is prepared by appropriately combining with the above-mentioned excipients, emulsifiers, suspensions, surfactants, stabilizers, pH adjusters and the like, and mixing them in a unit dose form required for generally accepted pharmaceutical practice. Can be transformed into.
  • preferred dosage forms include solids (including tablets, capsules, drops, troches), granules, powders, powders, liquids (drinks for internal use, emulsions, syrups). ), But is not limited to these. If it is a solid agent, it may be made into a dosage form with a coating known in the art, for example, sugar-coated tablets, gelatin-encapsulated tablets, enteric-coated tablets, film-coated tablets, double tablets, and multi-layer tablets. be able to.
  • each of the above dosage forms may be within the range of dosage forms known in the art for each dosage form, and are not particularly limited.
  • the method for producing the anti-psychiatric agent of the present invention may be formulated according to a conventional method in the art. For example, the method described in Remington's Pharmaceutical Sciences (Merck Publishing Co., Easton, Pa.) Can be referred to.
  • the administration method of the antipsychotic agent of the present invention can be roughly divided into parenteral administration and oral administration as described above.
  • the oral administration method is generally systemic administration, but the parenteral administration method can be further subdivided into local administration and systemic administration.
  • local administration by intracerebral injection or systemic administration by intracirculatory administration such as intravascular injection can be mentioned.
  • the administration method of the anti-psychiatric agent of the present invention can be appropriately selected depending on the onset site or the degree of progression of the disease, and may be either local administration or systemic administration.
  • the active ingredient, a nerve cell death inhibitor acts on nerve cells. Further, as shown in Examples described later, the nerve cell death inhibitor does not have side effects such as toxicity. Therefore, since there is no or extremely small effect due to side effects, it can be locally administered to the brain, which is the onset site of the disease.
  • Topical administration is preferably by injection.
  • Intravascular injection is convenient in that the nerve cell death inhibitor can be distributed throughout the body through the bloodstream. However, it is necessary that the nerve cell death inhibitor is not decomposed in the blood and crosses the blood-brain barrier to be delivered to the target cell, the brain nerve cell. Further, as shown in Examples described later, the anti-psychiatric agent of the present invention can exert its effect even when orally administered. Oral administration is also preferable as a method for administering the antipsychotic agent of the present invention because it is extremely low in invasiveness and easy to administer.
  • the diseases to which the antipsychotic agent of the present invention is applied are the above-mentioned mental diseases.
  • the term "mental illness” as used herein is a general term for exogenous, psychogenic, or intrinsic brain functional or organic disorders, and in particular, schizophrenia. Depression or bipolar disorder is applicable.
  • the severity of any psychiatric illness does not matter, but the milder the psychiatric illness, that is, the earlier the stage, the more the therapeutic effect after administration of the anti-psychiatric illness can be expected.
  • the anti-psychiatric agent of the present invention has an effect of preventing the onset of mental illness.
  • the nerve cell death inhibitor which is the active ingredient of the anti-psychiatric agent, has almost no side effects on the living body. Therefore, the anti-psychiatric agent of the present invention can be applied even to a healthy person who does not suffer from the above-mentioned disease.
  • a third aspect of the present invention is the invention of a food or drink or feed containing the nerve cell death inhibitor of the first aspect. According to the food or drink or feed of the present invention, it can be provided as a food composition or a beverage composition having an anti-psychiatric effect, or a feed composition.
  • the food and drink and feed having an anti-psychiatric effect of the present invention are foods and drinks or foods or feeds containing the nerve cell death inhibitor of the first aspect as an active ingredient. , Feed.
  • the form When preparing as food and drink, the form is not particularly limited. For example, it can be used as a general food, a food with a functional claim, a food for specified health use, a food additive, and the like. It can also be used as feed for livestock, racehorses, ornamental animals, etc.
  • the form of food and drink or feed is not particularly limited.
  • tablets, chewable tablets, powders, capsules, granules, drinks and the like can be mentioned.
  • general foods in addition to tea beverages, soft beverages, jelly beverages, sports beverages, dairy beverages, carbonated beverages, fruit juice beverages, lactic acid bacteria beverages, fermented milk beverages, powdered beverages, cocoa beverages, purified water and other beverages, Butters, jams, sprinkles, spreads such as margarine, mayonnaise, shortening, custard cream, dressings, breads, rice, noodles, pasta, miso soup, tofu, milk, yogurt, soups or sauces, confectionery, etc. ..
  • Foods also include other food materials used in the manufacture of foods, various nutrients, various vitamins, minerals, amino acids, various fats and oils, various additives (eg, acidulants such as taste components, sweeteners, organic acids, interfaces). It can be produced according to a conventional method by blending with an activator, a pH adjuster, a stabilizer, an antioxidant, a dye, a flavor) and the like.
  • the food or drink according to the present invention can be produced by adding the nerve cell death inhibitor of the present invention to a food that is normally eaten.
  • the food and drink and feed of the present invention can be used in the same composition as the anti-psychiatric agent of the second aspect.
  • the content of the neuronal cell death inhibitor of the present invention in the food or drink or feed varies depending on the form of the food or food or feed, but is usually 0.001 to 80% by mass, preferably 0.01 to 50% by mass based on the dry mass. %, More preferably in the range of 1 to 50% by mass.
  • Example 1 Preparation of nerve cell death inhibitor> (Purpose)
  • the neuronal cell death inhibitor of the present invention chlorella algae cultured under strong light stress for a predetermined time are prepared.
  • the strong light culture conditions are 600 ⁇ molphotons / m 2 / s from a light source that combines a fluorescent lamp for plant culture Lv1 (Mitsubishi Electric Osram), a CCFL lighting unit (Japanese medical equipment), and a powerful LED bulb (Hangzhou distant photoelectric information: China).
  • the light was irradiated for 14 days with continuous irradiation for 24 hours and cultured.
  • 80 mL of TAP medium was placed in a 93 mL tube (IWAKI), and the tube was ventilated at 20 mL / min / tube to adjust the CO 2 concentration in the medium to 2 to 5%.
  • the culture temperature was 25 ⁇ 2 ° C.
  • the algae were precipitated by centrifuging the culture solution after culturing at 10000 g for 5 minutes. The supernatant was removed to obtain algal pellets. The pellet was suspended in water and then centrifuged again under the same conditions to obtain a supernatant. This operation was repeated several times to wash the algae. The washed algae were freeze-dried and then pulverized as needed.
  • the nerve cell death inhibitor is a suspension of algae suspended in MilliQ water at a ratio of 30 mg / mL without extracting the lyophilized algae, and in the case of algae extract.
  • Algae lyophilized powder was mixed with 70% ethanol at a ratio of 1 g / 10 mL, and then left as it was in a dark place for 2 weeks to prepare an extract. After extraction, the extract is further centrifuged, the supernatant is collected, concentrated and dried in a centrifugal concentrator (manufactured by Scrum), and redissolved in 70% ethanol at a concentration of 50 mg / mL. Filter filtration was performed.
  • the obtained Chlorella algae and its extract (extract) were used as nerve cell death inhibitors in subsequent examples.
  • Example 2 Cytotoxicity of algae extract>
  • the toxicity of the chlorella order algal body extract (hereinafter referred to as "algal body extract” in the examples) as the nerve cell death inhibitor prepared in Example 1 to nerve cells will be verified.
  • SH-SY5Y cells were used as nerve cells.
  • SH-SY5Y cells are cell lines derived from human neuroblastoma and are widely used as model cells for evaluating nerve function.
  • Algal extract was added to 2.0 ⁇ 10 5 SH-SY5Y cells cultured on a 96-well plate (manufactured by Falcon) at 25 ⁇ g / mL and 50 ⁇ g / mL, and cultured at 37 ° C.
  • Example 3 Nerve cell protective action of algae extract>
  • the protective effect of the algal body extract prepared in Example 1 on nerve cells will be verified.
  • the neurotoxin dexamethasone was added to the medium of SH-SY5Y cells at a concentration of 500 ⁇ M. Dexamethasone is known to induce cell death (apoptosis) (Budni et al., 2011, Neuroscience, 190: 346-53). Then, the algae extract was added to the culture solution at 25 ⁇ g / mL and 50 ⁇ g / mL, and the cells were cultured under 5% CO 2 at 37 ° C. for 48 hours.
  • SH-SY5Y cells untreated with algal extract and SH-SY5Y cells with dexamethasone added and no algal extract added were used. (result)
  • the results are shown in FIG.
  • Example 4 Action and effect of algal body extract on genes involved in apoptosis> (Purpose) The action and effect of the algal body extract prepared in Example 1 on the apoptosis-inducing factor will be verified. Apoptosis is induced by activation of the MAP kinase signaling pathway or suppression of the PI3K / AKT signaling pathway. Therefore, we will verify the gene expression of MAP kinase signaling factor and PI3K / AKT signaling factor in dexamethasone-treated neurons, and the change in gene expression when algae extract is added thereto.
  • the neurotoxin dexamethasone was added to the medium of SH-SY5Y cells at a concentration of 500 ⁇ M.
  • Dexamethasone is known to induce cell death (apoptosis) (Budni et al., 2011).
  • the algae extract was added to the culture solution at 25 ⁇ g / mL and 50 ⁇ g / mL, and the cells were cultured under 5% CO2 at 37 ° C. for 24 hours.
  • SH-SY5Y cells untreated with algal extract and SH-SY5Y cells with dexamethasone added and no algal extract added were used.
  • Isogen reagent manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.
  • cDNA for real-time PCR was synthesized using SuperScript IV VILO MasterMix (Thermo Fisher Scientific).
  • gene expression analysis was performed by real-time PCR using TaqMan gene expression assays (Thermo Fisher Scientific).
  • MAP kinase signaling factors include MAP2K4 (Mitogen activated protein kinase kinase 4) (Hs00387426_m1) and MAPK14 (Mitogen-activated protein kinase 14) (Assay ID: Hs01051152_m1), which positively activate the MAP kinase signaling pathway and induce apoptosis. ) And MAPK8 (Mitogen-Activated Protein Kinase 8) (Assay ID: Hs01548508_m1) were selected.
  • PI3K / AKT signaling factors include PI3KCA (Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalyst Subunit Alpha) (Assay ID: Hs00907957_m1), which positively activates the PI3K / AKT signaling pathway and suppresses apoptosis.
  • AKT1 AKT Serine / Threonine Kinase 1 (Assay ID: Hs00178289_m1) were selected.
  • CASP3 (Caspase-3) (Assay ID: Hs00234387_m1), which is directly involved in apoptosis
  • PARP1 Poly (ADP-Ribose) Polymerase 1) (Assay ID: Hs00242302_m1), which is involved in DNA repair and induces apoptosis by DNA cleavage. ) was quantified by real-time PCR.
  • FIGS. 3 to 9 show the relative value of each gene expression level of PARP1 with respect to Control.
  • MAP2K4, MAPK14, and MAPK8 genes which activate the MAPK signal transduction pathway and induce apoptosis, were increased by dexamethasone treatment.
  • the algal extract was added together with dexamethasone, the increase in the expression level of each gene was significantly reduced.
  • PI3KCA and AKT1 genes which activate the PI3K / AKT signal transduction pathway and suppress apoptosis, were significantly reduced by dexamethasone treatment, but the expression level was reduced by the addition of algae extract. Significantly increased.
  • the algal body extract can protect nerve cells by suppressing the induction of apoptosis of nerve cells.
  • Example 5 Antidepressant action of algae suspension (1)> (Purpose) The algae suspension prepared in Example 1 is verified by a mouse tail suspension test to have an antidepressant effect in vivo.
  • mice (3 weeks old, male), which are widely used as normal model mice, were used as experimental animals, and a tail suspension test was conducted to apply mental stress to the mice.
  • mice After acclimatization to the breeding environment for one week, the mice were divided into three groups: a water-administered group (Control group), an antidepressant bupropion-administered group, and an algae-administered group of Chlorella algae.
  • Bupropion was orally administered at a body weight of 20 mg / kg and algae suspension was orally administered at a body weight of 100 mg / kg per animal.
  • a tail suspension test was performed on the mice in each administration group.
  • the tail end of the mouse was fixed to the ceiling and suspended upside down for 6 minutes. Immediately after the tail suspension test, the mouse attempts to move its limbs violently to raise its posture, but eventually stops resistance and becomes immobilized. This immobility in mice is used as an indicator of "depression-like state". After the start of the tail suspension test, the immobility time of the mice was measured in the latter 4 minutes, and the antidepressant effect in each administration group was evaluated. The oral administration and tail suspension test were performed daily for 7 days in the same individual.
  • the same results as in Control were shown for the first 3 days, but after the 4th day, the immobility time was closer to that of the bupropion-administered group. This result indicates that the neuronal cell death inhibitor composed of the algae of the present invention has an antidepressant effect in vivo.
  • Example 6 Antidepressant action of algae suspension (2)> (Purpose) The antidepressant effect of mice in Example 5 will be verified at the molecular level. (Method) The three groups of mice used in Example 5 were dissected after the tail suspension test on the 7th day, and the brain tissue was removed. In addition, blood was collected and serum was prepared by a conventional method. Subsequently, the limbic system part of the brain tissue was dissected, homogenized in RIPA Buffer (Thermo Fisher Scientific), and protein was extracted. After that, the amounts of TNF- ⁇ , BDNF (brain-derived neurotrophic factor), dopamine, noradrenaline, glycogen, and ATP in the protein were measured using the ELISA method. In addition, the amount of corticosterone in serum was measured using an ELISA kit. Corticosterone is known as a biomarker for depression in serum.
  • FIGS. 11 to 16 show TNF- ⁇
  • FIG. 12 shows BDNF
  • FIG. 13 shows dopamine
  • FIG. 14 shows noradrenaline
  • FIG. 15 shows ATP
  • FIG. 16 shows the amount of glycogen.
  • TNF- ⁇ is a type of inflammatory cytokine, and it is known that the amount in brain tissue increases in a depressed state. From FIG. 11, a significant decrease in TNF- ⁇ was observed in the bupropion-administered group and the algae-administered group as compared with Control.
  • BDNF is known as a biomarker for depression, and it is known that in depressed state, BDNF production in the brain and BDNF secretion from platelets decrease, which is reflected as a decrease in BDNF in serum or plasma. Has been done. From FIG. 12, a significant increase in BDNF was observed in the bupropion-administered group and the algae-administered group as compared with Control.
  • Dopamine and noradrenaline are monoamines that function as neurotransmitters, and it is known that their amounts decrease in the depressed brain. From FIGS. 13 and 14, a significant increase in dopamine and noradrenaline was observed in the bupropion-administered group and the algal body-administered group as compared with Control.
  • glycogen in the brain is important for maintaining neural function under conditions of high energy load such as hypoxia and hypoglycemia (Brown A. M., et al., 2015, Met. Brain Dis). ., 30: 233), Glycogen metabolism is greatly affected by stress. For example, sleep deprivation (Gip P., et al., 2004, Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol, 286: R1075) and surgical stress (Y. Hashiguchi, et al., 1998, Abumrad, Surg). .Today., 28: 471) is known to reduce glycogen levels in brain tissue. From FIG. 15, a significant decrease in glycogen was observed in the bupropion-administered group and the algae-administered group as compared with Control.
  • ATP is essential for neural activities such as proliferation and differentiation of nerve cells, and it is known that the amount of ATP decreases in the depressed brain (Sasaki et al., 2019. Mol Nutr Food Res. 63 (Sasaki et al., 2019. Mol Nutr Food Res. 63). 19): 1900327). From FIG. 16, a significant increase in ATP was observed in the bupropion-administered group and the algae-administered group as compared with Control.

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Abstract

日常的に摂取可能で、副作用がなく、安全性の高い、比較的安価で抗精神疾患作用を有する薬用成分を開発し、それを含む抗うつ剤又は飲食品を提供する。　特定の光強度を有する強光ストレス下で所定の時間培養したクロレラ目藻類の藻体又はその抽出物からなる神経細胞死抑制剤を有効成分として含む抗精神疾患剤及び飲食品を提供する。

Description

抗精神疾患剤
　本発明は、クロレラ目に属する種の藻体又はその抽出物からなる神経細胞死抑制剤、及びそれを含む抗精神疾患剤に関する。
　現代は、ストレス社会とも言われている。日常的にストレスフルな生活を強いられる結果、うつ病等の精神疾患（Mental Disorder)の患者数が増加し、それが大きな社会問題となっている。例えば、厚生労働省の調査によると、平成29年（2017年）の日本国内の精神疾患患者数は400万人を超え、平成14年（2002年）の258万人から15年間で約1.6倍も増加している。医療機関に通院していない潜在的患者数を加えると、精神疾患患者数は、国内でも膨大な数に達すると予想される。これらの精神疾患は、働き盛りの生産年齢層に多く見られることから、医療費の増大はもとより、経済的損失や自殺による社会的損失等、社会に与える影響は計り知れない。
　現在、パロキセチン、セルトラリン、エスシタロプラム、フルボキサミン、デュロキセチン、ベンラファキシン、ミルナシプラン、ミルタザピン、クロミプラミン、スルピリド、アリピプラゾール、及びミアンセリン等の様々な抗うつ剤が開発されており、うつ病等の精神疾患者に対して処方されている。しかし、その多くが人工的に合成された低分子化合物であり、吐き気、食欲不振、眠気、低血圧等の副作用を生じ得る（非特許文献１）。また、過剰摂取した場合には重度の毒性を引き起こす場合が少なくないという問題を有している。
I.M. Whyte, et al., 2003, An International Journal of Medicine, 96, 369-374.
　本発明は、日常的に摂取可能で、副作用がなく、安全性の高い、比較的安価で抗精神疾患作用を有する薬用成分を開発し、それを含む抗精神疾患剤又は飲食品を提供することである。
　本発明者らは、前記課題を解決するために微細藻類に着目した。微細藻類とは、肉眼での個々の細胞の確認が困難な微小な藻類の総称である。近年、微細藻類は、その藻体内に炭水化物、必須アミノ酸、脂質、ミネラル、ビタミン等の栄養素を豊富に含むことや、抗酸化作用及び抗白内障作用（Shibata S., et al., 2003, J Nutr Sci Vitaminol, 49: 334-339）、血糖値低下作用（Rodriguez-Lopez M. & Lopez-Quijada C., 1971, Life Sci, 10: 57-68）、抗炎症作用及び免疫調節作用（Queiroz M.L., et al., 2002, Immunopharmacol Immunotoxicol, 24: 483-496）等の様々な生理活性作用を有することが報告されている。近年、本発明者らは、微細藻類であるクロレラ目（Chlorellales）藻類を非日常的な強光ストレス条件下で所定の時間培養したときに、通常の培養条件ではほとんど生産されない特定のカロテノイドを藻体内に大量に蓄積することを見出した（再表2016-104487）。クロレラ目藻類は、日本、台湾、韓国等の極東アジア圏において健康食品として利用されており、その安全性や含有する豊富な栄養素については、多数の研究結果が報告されている。そこで、前記強光ストレス条件下で培養したクロレラ目藻類に関して、本発明者らが様々な生理活性作用について検証した結果、その抽出物が通常の培養条件下で培養したクロレラ目藻類には見られない神経細胞のアポトーシス抑制作用を有することを見出した。また、この微細藻類の藻体を投与したマウスでは、疑似うつ状態が有意に抑制されることを立証した。本発明は当該新規知見に基づくものであって、以下を提供する。
（１）500～2500μmol photons/m2/sの光強度で光を150～500時間照射して培養したクロレラ目に属する種の藻体、又はその藻体から物理的及び／又は化学的方法で抽出された藻体抽出物からなる神経細胞死抑制剤。
（２）前記物理的及び／又は化学的方法が細胞破砕法、溶出法、又はその組み合わせである、（１）に記載の神経細胞死抑制剤。
（３）（１）又は（２）に記載の神経細胞死抑制剤を有効成分として含む抗精神疾患剤。（４）前記精神疾患がうつ病、躁うつ病、又は統合失調症である、（３）に記載の抗精神疾患剤。
（５）（１）又は（２）に記載の神経細胞死抑制剤を含む飲食品又は飼料。
（６）神経細胞死抑制剤の生産方法であって、クロレラ目に属する種の藻体に500～2500μmol photons/m2/sの光強度で光を150～500時間照射して培養する培養工程を含む前記生産方法。
（７）培養後の前記藻体から物理的及び／又は化学的方法で藻体抽出物を抽出する抽出工程を含む、（６）に記載の生産方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2020-048362号の開示内容を包含する。
　本発明の神経細胞死抑制剤によれば、人体等の生体に安全な、神経細胞におけるアポトーシスを抑制する薬剤を提供することができる。
　本発明の抗精神疾患剤によれば、うつ病等の精神疾患の発症の予防又は治療をすることができる。
本発明の神経細胞死抑制剤を構成するクロレラ目藻体抽出物の神経細胞（SH-SY5Y細胞）に対する毒性を示した図である。グラフはControlにおけるSH-SY5Y細胞の生存率を100としたときの相対値（％）を示している。図中、「Control」は、藻体抽出液を添加していないSH-SY5Y細胞の生存率である。 神経毒素デキサメタゾンに対する藻体抽出液の神経細胞保護作用効果を示す図である。グラフはControlにおけるSH-SY5Y細胞の生存率を100としたときの相対値（％）を示している。図中、「Control」は、デキサメタゾン及び藻体抽出液を添加していないSH-SY5Y細胞の生存率、そして「DEX」は、デキサメタゾンのみを添加したSH-SY5Y細胞の生存率である。図中の「**」はControlの生存率に対する有意差（p<0.01)を、また「##」はDEXの生存率に対する有意差（p<0.01)を示す。 デキサメタゾン処理したSH-SY5Y細胞に藻体抽出物を添加したときの細胞内におけるMAP2K4（Mitogen activated protein kinase kinase 4）遺伝子の発現量を示す図である。MAP2K4は、アポトーシスを誘導するMAPキナーゼシグナル伝達経路のシグナル因子である。グラフはControlにおけるMAP2K4遺伝子発現量を100としたときの相対値（％）を示している。図中、「Control」は、デキサメタゾン及び藻体抽出液を添加していないSH-SY5Y細胞におけるMAP2K4遺伝子発現量、そして「DEX」は、デキサメタゾンのみを添加したSH-SY5Y細胞におけるMAP2K4遺伝子発現量である。図中の「**」はControlにおけるMAP2K4遺伝子発現量に対する有意差（p<0.01)を、また「##」はDEXにおけるMAP2K4遺伝子発現量に対する有意差（p<0.01)を示す。 デキサメタゾン処理したSH-SY5Y細胞に藻体抽出物を添加したときの細胞内におけるMAPK14（Mitogen-activated protein kinase 14）遺伝子の発現量を示す図である。MAPK14は、アポトーシスを誘導するMAPキナーゼシグナル伝達経路のシグナル因子である。グラフはControlにおけるMAPK14遺伝子発現量を100としたときの相対値（％）を示している。図中、「Control」は、デキサメタゾン及び藻体抽出液を添加していないSH-SY5Y細胞におけるMAPK14遺伝子発現量、そして「DEX」は、デキサメタゾンのみを添加したSH-SY5Y細胞におけるMAPK14遺伝子発現量である。図中の「**」はControlにおけるMAPK14遺伝子発現量に対する有意差（p<0.01)を、また「##」はDEXにおけるMAPK14遺伝子発現量に対する有意差（p<0.01)を示す。 デキサメタゾン処理したSH-SY5Y細胞に藻体抽出物を添加したときの細胞内におけるMAPK8（Mitogen-Activated Protein Kinase 8）遺伝子の発現量を示す図である。MAPK8は、アポトーシスを誘導するMAPキナーゼシグナル伝達経路のシグナル因子である。グラフはControlにおけるMAPK8遺伝子発現量を100としたときの相対値（％）を示している。図中、「Control」は、デキサメタゾン及び藻体抽出液を添加していないSH-SY5Y細胞におけるMAPK8遺伝子発現量、そして「DEX」は、デキサメタゾンのみを添加したSH-SY5Y細胞におけるMAPK8遺伝子発現量である。図中の「**」はControlにおけるMAPK8遺伝子発現量に対する有意差（p<0.01)を、また「##」はDEXにおけるMAPK8遺伝子発現量に対する有意差（p<0.01)を示す。 デキサメタゾン処理したSH-SY5Y細胞に藻体抽出物を添加したときの細胞内におけるPI3KCA（Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalytic Subunit Alpha）遺伝子の発現量を示す図である。PI3Kは、PI3K/AKTシグナル伝達経路において、アポトーシスを誘導するASK1の活性を抑制的に制御するシグナル因子である。グラフはControlにおけるPI3KCA遺伝子発現量を100としたときの相対値（％）を示している。図中、「Control」は、デキサメタゾン及び藻体抽出液を添加していないSH-SY5Y細胞におけるPI3KCA遺伝子発現量、そして「DEX」は、デキサメタゾンのみを添加したSH-SY5Y細胞におけるPI3KCA遺伝子発現量である。図中の「**」はControlにおけるPI3KCA遺伝子発現量に対する有意差（p<0.01)を、また「##」はDEXにおけるPI3KCA遺伝子発現量に対する有意差（p<0.01)を示す。 デキサメタゾン処理したSH-SY5Y細胞に藻体抽出物を添加したときの細胞内におけるAKT1（AKT Serine / Threonine Kinase 1）遺伝子の発現量を示す図である。AKT1は、PI3K/AKTシグナル伝達経路において、アポトーシスを誘導するASK1タンパク質の活性を直接的に抑制的に制御するシグナル因子である。グラフはControlにおけるAKT1遺伝子発現量を100としたときの相対値（％）を示している。図中、「Control」は、デキサメタゾン及び藻体抽出液を添加していないSH-SY5Y細胞におけるAKT1遺伝子発現量、そして「DEX」は、デキサメタゾンのみを添加したSH-SY5Y細胞におけるAKT1遺伝子発現量である。図中の「**」はControlにおけるAKT1遺伝子発現量に対する有意差（p<0.01)を、また「##」はDEXにおけるAKT1遺伝子発現量に対する有意差（p<0.01)を示す。 デキサメタゾン処理したSH-SY5Y細胞に藻体抽出物を添加したときの細胞内におけるCASP3（Caspase-3）遺伝子の発現量を示す図である。CASP3は、アポトーシス経路の下流でタンパク質分解の中心的な機能を担うエフェクターカスパーゼの一つである。グラフはControlにおけるCASP3遺伝子発現量を100としたときの相対値（％）を示している。図中、「Control」は、デキサメタゾン及び藻体抽出液を添加していないSH-SY5Y細胞におけるCASP3遺伝子発現量、そして「DEX」は、デキサメタゾンのみを添加したSH-SY5Y細胞におけるCASP3遺伝子発現量である。図中の「**」はControlにおけるCASP3遺伝子発現量に対する有意差（p<0.01)を、また「##」はDEXにおけるCASP3遺伝子発現量に対する有意差（p<0.01)を示す。 デキサメタゾン処理したSH-SY5Y細胞に藻体抽出物を添加したときの細胞内におけるPARP1（Poly(ADP-Ribose)遺伝子の発現量を示す図である。PARP1は、核DNAにおける一本鎖切断を認識してDNAに結合し、DNA修復を活性化する機能を有するが、過度の活性化は、逆に各DNAの断片化を引き起こし、アポトーシスを誘導することが知られている。グラフはControlにおけるPARP1遺伝子発現量を100としたときの相対値（％）を示している。図中、「Control」は、デキサメタゾン及び藻体抽出液を添加していないSH-SY5Y細胞におけるPARP1遺伝子発現量、そして「DEX」は、デキサメタゾンのみを添加したSH-SY5Y細胞におけるPARP1遺伝子発現量である。図中の「**」はControlにおけるPARP1遺伝子発現量に対する有意差（p<0.01)を、また「##」はDEXにおけるPARP1遺伝子発現量に対する有意差（p<0.01)を示す。 マウスの尾部懸垂試験における藻体の抗うつ作用を示す図である。グラフは、水投与群（Control）、抗うつ薬ブプロピオン投与群（Bupropion）、及びクロレラ目藻類の藻体投与群（Chlorella）のマウス群に対して尾部懸垂試験を7日間行った時の不動時間を示す。不動時間は、マウスのうつ様状態とされる。 図１０で使用した7日目の各マウス群の脳内組織におけるTNF-αの量を示す図である。 図１０で使用した7日目の各マウス群の脳内組織におけるBDNFの量を示す図である。 図１０で使用した7日目の各マウス群の脳内組織におけるドーパミンの量を示す図である。 図１０で使用した7日目の各マウス群の脳内組織におけるノルアドレナリンの量を示す図である。 図１０で使用した7日目の各マウス群の脳内組織におけるATPの量を示す図である。 図１０で使用した7日目の各マウス群の脳内組織におけるグリコーゲンの量を示す図である。
１．神経細胞死抑制剤
１－１．概要
　本発明の第１の態様は、神経細胞死抑制剤である。本発明の神経細胞死抑制剤は、特定の光強度を有する強光ストレス下で所定の時間培養したクロレラ目藻類の藻体又はその抽出物からなる。本発明の神経細胞死抑制剤によれば、神経細胞におけるアポトーシス作用を抑制することができ、また、それを被験体に投与することで、抗うつ作用等の抗精神疾患作用、及び学習記憶能力等の神経機能低下の予防又は改善の効果を提供できる。
１－２．定義
　本明細書で頻用する以下の用語について定義する。
　本明細書において「神経細胞死」とは、神経細胞におけるアポトーシスをいう。「アポトーシス」とは、多細胞生物におけるカスパーゼ依存型のプログラムされた細胞死である。本明細書においてアポトーシスを受ける神経細胞は、特に制限はしない。中枢神経細胞、又は末梢神経細胞のいずれも対象となり得る。好ましくは中枢神経細胞、特に脳細胞である。
　本明細書において「神経細胞死（の）抑制」とは、神経細胞に対するアポトーシス誘導の抑制、及び／又はアポトーシスに直接関与する関連因子の機能抑制をいう。例えば、神経細胞死の誘導に関与するMAPKシグナル伝達因子の発現抑制又は機能抑制等が挙げられる。
　「精神疾患」とは、広義には外因性、心因性、又は内因性の脳の機能的又は器質的障害の総称をいう。限定はしないが、本明細書においては特に従来の精神病理学の診断カテゴリー（米国精神医学会により規定された「精神障害の診断と統計マニュアル第5版（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders 5）」に基づく精神疾患診断基準［DSM診断］）において、統合失調症、うつ病、又は双極性障害に分類される3つの症候群に属する狭義の精神疾患が該当する。
　「統合失調症」とは、幻覚、幻聴、妄想等の症状を伴う他、感情表現が鈍麻し、意欲が低下したり、認知機能障害を発症する精神疾患である。
　「うつ病」とは、気分障害の1種で、抑うつ気分、意欲や興味等の精神活動の低下、焦燥、食欲の低下、不眠、持続的不安等を特徴とした精神障害をいう。
　「双極性障害（躁うつ病）」とは、うつ病と共に気分障害に分類される精神障害であり、うつ状態とその対極の躁状態の病相を循環する特徴を有する。
　本明細書において「予防」とは、疾患（本明細書では精神疾患）の発症を未然に防ぐことをいう。本明細書において「治療」とは、罹患している疾患の症状進行を緩和し、抑制し、又は阻止すること、及び症状を改善することをいう。
　「クロレラ目（Chlorellales）」とは、緑藻植物門（Chlorophyta）、トレボウクシア藻綱（Trebouxiophyceae）に属する一群であり、細胞内に葉緑体を有し、光合成によりα-1, 4グルカンを主成分とするデンプンを生合成することのできる藻類である。
　「クロレラ目に属する種」とは、分類学上、クロレラ目に分類される種をいう。具体的には、クロレラ目に属する種には、クロレラ科（Chlorellaceae）に属する種が挙げられる。ここでいうクロレラ科は、クロレラ系統群（Chlorella-clade）、パラクロレラ系統群（Parachlorella-clade）及びプロトテカ系統群（Prototheca-clade）を包含する概念である（仲田崇志, 2012, 渡邉信監修, 藻類ハンドブック, pp33-37, NTS Inc）。クロレラ科に属する種には、例えば、クロレラ属（Chlorella）に属する種（例えば、C. mirabilis、C. minutissima、C. vulgaris、C. sorokiniana、C. viscose、C. variabilis等）、オーセノクロレラ属（Auxenochlorella）に属する種（例えば、A. protothecoides等）、パラクロレラ属（Parachlorella）に属する種（例えば、P. kessleri、P. beijerinckii等）、ディクロスター属（Dicloster）に属する種（例えば、D. acuatus等）、ミクラクチニウム属（Micractinium）に属する種（例えば、M. pusillum、M. belenophorum等）、ロボスファエロプシス属（Lobosphaeropsis）に属する種（例えば、L. lobophora等）、ディクチオスファエリウム属（Dictyosphaerium）に属する種（例えば、D. pulchellum等）、及びアクチナストルム属（Actinastrum）に属する種（例えば、A. hantzschii等）が挙げられる。
　本明細書において「光強度」とは、光量子束密度を意味する。光強度は、その単位時間の単位面積当たりの光子数、すなわち照射された面に含まれる全光子数を照射面積（m2）と照射時間（秒）を乗じた数値で除した値（mol photons/m2/s）で表す。この光強度の光子数は、実際の照射面における光を分光ユニットなどによって測定することで算出できる。
１－３．構成
　本態様の神経細胞死抑制剤は、クロレラ目に属する種の藻体又はその抽出物で構成される。本発明で使用するクロレラ目藻体は、人工的環境下において特定の環境ストレスを負荷した藻体である。ここでいう、特定の環境ストレスとは、強光ストレス下で所定の時間培養することをいう。
　本明細書において「強光ストレス」とは、外部刺激として強力な光をクロレラ目藻体に照射することをいう。具体的には、特定の光強度を有する光を特定時間照射したときの負荷ストレスをいう。
　前記「特定の光強度」とは、500～2500μmol photons/m2/s、好ましくは550～2300μmol photons/m2/s、より好ましくは600～2000μmol photons/m2/sの範囲内の光強度である。
　照射する光は、450nm±15nm及び／又は580nm±15nmに波長スペクトルのピーク（極大波長）を有する人工光であればよい。例えば、380 nm～800 nmの全可視光域を含む白色光、又は400～500 nmの紫色光～青色光及び／又は560 nm～600 nmの黄色光が該当する。
　本工程で使用する光源は、前記波長域の光を放射可能な人工光源であれば特に限定はしない。例えば、全可視光域を含む白色光を放射可能な蛍光灯、白色発光ダイオード（Light Emitting Diode：以下、本明細書では、しばしば「LED」と表記する）、高輝度放電（HID：High Intensity Discharge）ランプ等が挙げられる。400 nm～500 nmの波長域内及び560 nm～600 nmの波長域内に波長スペクトルのピークを有するLEDを利用するのが効果的である。
　前記「特定時間」とは、前記光強度でクロレラ目藻体を直接的、又は間接的に照射する時間をいう。この時間は、クロレラ目藻体に強光ストレスを十分に負荷可能な時間をいう。具体的には、150～500時間、好ましくは160～400時間、より好ましくは168～360時間、さらに好ましくは190～340時間である。日にち換算すれば、7～20日間や6～14日間に相当する。一般に光強度が強ければ照射する時間は短くてもよい。例えば、1800～2500μmol photons/m2/sの光強度であれば、150～250時間又は150～220時間の照射で足りる。一方、光強度が弱い場合には照射する時間は長い方が好ましい。例えば、500～1000μmol photons/m2/sの光強度であれば、280～500時間又は310～500時間照射することが好ましい。
　強光ストレスの負荷は、連続照射が好ましいが、明暗期を有する照射であってもよい。ここでいう「連続照射」とは、光の連続的照射だけでなく、蛍光灯のように肉眼で認識できない程の極めて短い時間で明暗期を繰り返すことによって全体として連続的照射に見えるパルス光の照射も含む。明暗期を有する照射の場合には、明期に周期的に又は非周期的に、肉眼で認識できる暗期（例えば、1秒以上、好ましくは数秒以上の暗期）が挿入される光照射が該当する。強光ストレスの負荷は、総合時間で上記特定の光強度にて曝光できればよい。
　上記強光ストレスを負荷する条件下で培養したクロレラ目藻類は、藻体内にカロテノイドを大量に蓄積し、通常培養条件下で培養したときよりも細胞あたりの植物色素に占めるカロテノイド量の比率が有意に高い特徴を有する（再表2016-104487）。ここでいう「植物色素」とは、植物細胞内に存在する主要な色素成分であり、クロロフィル、カロテノイド、フラボノイド、及びベタレインの4群に大別される。クロレラ目は、前記4群のうちクロロフィル及びカロテノイドの2種を包含する。「カロテノイド」とは、化学式C40H56を基本骨格とし、左右対称に近い構造を有する水不溶性のテトラテルペンの総称である。カロテノイドは、分子中に酸素を含むカロテン類と、分子中に酸素を含まないキサントフィル類に大別されるが、強光ストレス負荷条件下で培養したクロレラ目藻類は、いずれのカロテノイドも包含し得る。カロテノイドの具体例として、カロテンに属する、赤色色素のリコペン、黄色色素のα-カロテン、β-カロテン、γ-カロテン及びβ-クロプトキサンチン、またキサントフィルに属する、淡黄色色素のアンテラキサンチン、茶色色素（オリーブ色を含む）のフコキサンチン、赤色色素のカプサンチン、アスタキサンチン及びアスタキサンチン誘導体（カンタキサンチン等）、橙赤色色素のビオラキサンチン、橙黄色色素のゼアキサンチン、及び黄色色素のルテイン及びネオキサンチン等が挙げられる。カロテノイドは、紫外線照射によって細胞内で発生する活性酸素から細胞を防御する機能を有することが知られている。強光ストレス負荷条件下での培養によりクロレラ目藻類がカロテノイドを細胞内に大量に蓄積する理由は、抗酸化物質として活性酸素から細胞を保護するためと考えられている。しかし、通常の培養下ではほとんど生産されないカロテノイドの合成経路が、強光ストレスの付与によって活性化される具体的な機序や遺伝学的構成等については明らかになっていない。さらに、本発明の神経細胞死抑制剤において、強光ストレス負荷条件下での培養により得られるクロレラ目藻類の抽出物が神経細胞死抑制活性を有することは、後述する実施例の結果から明らかになっている。しかし、その活性が強光ストレス負荷により大量蓄積したカロテノイドによるものか、又は他の未同定の低分子化合物若しくはタンパク質等によるものか、分子レベルでの機能やメカニズムについても不明である。
　本明細書において「藻体抽出物」（本明細書では、しばしば「抽出物」と称する）とは、前記クロレラ目藻類を物理的及び／又は化学的方法で処理して得られる、前記藻体細胞中の全部又は一部の成分を包含した物質をいう。例えば、前記藻体細胞を破砕して得られる細胞内容物や、液体中に浸漬した細胞から溶出した成分を含む溶出液が挙げられる。細胞内容物は、細胞壁片や細胞膜片を含んでいてもよい。
　本発明の神経細胞死抑制剤は、液体、固体のいずれであってもよい。必要に応じて両者を変換してもよい。例えば、通常は固体で保存し、生体投与時に溶媒中に溶解して液体にすることもできる。固体は、粉末、顆粒、又は小片等、いずれの形状であってもよい。
　本発明の神経細胞死抑制剤は、クロレラ目藻類の藻体抽出物を必要に応じて濃縮、又は精製したものであってもよい。
１－４．生産方法
　本発明の神経細胞死抑制剤の生産方法は、培養工程を必須の工程として、また、抽出工程、乾燥工程、及び濃縮工程を選択工程として含む。以下、各工程について説明をする。
（１）培養工程
　「培養工程」は、クロレラ目に属する種の藻体に特定の光強度で光を特定時間照射して培養する工程である。
　本発明の生産方法において用いる「クロレラ目に属する種」、「特定の光強度」及び「特定時間」については、「１-３．構成」に記載の通りである。
　本工程において、光の照射方法は、培養中のクロレラ目藻類を十分に曝光できる方法であれば、特に限定はしない。例えば、透明な培養槽の周囲に光源を設置して培養槽全体に光を照射する方法、一方向又は複数の方向から透明な培養槽に光を照射しながら培養槽を回転させることで培養槽全体に光を行き渡す方法等が挙げられる。本発明でクロレラ目藻類に強光ストレスを負荷するために照射される光は人工光である。ただし、人工光照射時に培養中のクロレラ目藻類が自然光に曝露されても構わない。例えば、クロレラ目藻類の培養室において窓から差し込む日光により培養槽内のクロレラ目藻類が曝光される場合が挙げられる。この場合も、クロレラ目藻類に強光ストレスの負荷に直接寄与する光は人工光となる。光の照射は、光源からの直接照射が好ましいが、培養液全体に光を行き届かせる目的等のために反射板等を介した間接照射であってもよい。間接照射の場合、照射した光が減衰する可能性があることから、クロレラ目藻類への光強度が前述の範囲となるように、必要に応じて光源の光強度を高めることが好ましい。
　強光ストレスの付与下であってもクロレラ目藻類は、生育及び増殖が可能であることから、ストレス付与中、培養は継続することが望ましい。
　本工程における培養条件は、クロレラ目藻類を培養可能な条件であれば、特に限定はしない。培養するクロレラ目藻類の種に応じて、適宜最適の培養条件を設定すればよい。
　例えば、本工程で用いる培地は、通常は基本生育培地で足りる。例えば、TAP培地が挙げられる。TAP培地の組成は、NH4Cl 40mg, CaCl2・2H2O 5.1mg, MgSO4・7H2O 10mg, K2HPO411.9mg, KH2PO46.03mg, Hutner's trace elements 0.1mL, Acetic acid 0.1mL, Tris(hydroxymethyl) aminomethane 242mg, Distilled water 99.8mL（pH6.5～6.8）とすればよい。ここで、Hutner's trace elementsは、Na2EDTA・2H2O 5g, ZnSO4・7H2O 2.2g, H3BO3 1.14g, MnCl2・4H2O 506mg, FeSO4・7H2O 499mg, CoCl2・6H2O 161mg, CuSO4・5H2O 157mg, (NH4)6Mo7O24・4H2O 110mg, Distilled water 100mLからなる。培養するクロレラ目藻類は、野生株が好ましいが、変異株であっても構わない。ただし、その場合、培地の組成をその変異株の生育に適合したものに調製する。例えば、変異株がシステイン要求性変異株等の栄養要求性変異株であった場合、TAP培地に500ng/mL～100μg/mLのシステインを添加する等して、栄養要求性を満たす培地を調製する。
　培養温度は、クロレラ目藻類が生育可能な温度であればよい。通常は15～35℃、好ましくは18～30℃、より好ましくは20～28℃、さらに好ましくは25±2℃の範囲内である。
　培養は、屋内、又は屋外のいずれであってもよいが、人工光源による強光ストレスを上記条件で適切に負荷するためには屋内培養が好ましい。屋内培養は、光、湿度、温度等の気象条件や培地の供給、及び無菌状態等が管理された植物工場のような完全閉鎖空間内の人工環境下における培養か、屋内に設置された培養庫内での培養のいずれであってもよい。
　培養時は、全期間を通して、又は定期的若しくは不定期に、必要に応じて培地を撹拌してもよい。撹拌手段は問わない。例えば、撹拌棒等の撹拌装置を用いてもよいし、培養槽を反転、回転、振動することで培地を撹拌してもよい。また、必要に応じて、培地のCO2濃度が2～5％となるようにCO2を添加してもよい。
　培養期間中、必要に応じて培地を1回又は複数回交換してもよい。交換培地は、使用中の培地と同じものが好ましいが、ストレス付与の効果を妨げない範囲で他の培地に交換することもできる。培地の交換時期は、特に限定しないが、培養液中のクロレラ目藻類が死滅期（death phase）に入る前、具体的には静止期（stationary phase）が好ましい。また、培地交換の際に、必要に応じて培養液を希釈してもよい。
（２）乾燥工程
　「乾燥工程」は、クロレラ目藻類の藻体、又はその抽出物を乾燥させる工程で、本生産方法における選択工程である。本工程は、培養工程後のクロレラ目藻類の藻体を乾燥させる培養後乾燥工程と、抽出工程後の藻体抽出物を乾燥させる抽出後乾燥工程が挙げられ、それぞれは独立して実行することができる。本工程は、必要に応じて行えばよい選択工程である。
　「乾燥」とは、蒸発、若しくは昇華によって対象物の含水率が低くなることをいう。
　本工程における乾燥方法は、対象物であるクロレラ目藻類の藻体、又はその藻体抽出物に含まれる水分を減じることができれば特には問わない。例えば、外気に晒して放置するだけの自然乾燥法（天日干しを含む）、除湿剤とともに密閉容器内に入れて乾燥する除湿乾燥法、送風装置等を用いて温風若しくは冷風を当てる風乾燥法、熱源を用いた加熱乾燥法、密閉容器内で真空ポンプ等を用いて脱気する真空乾燥法、凍結乾燥（フリーズドライ）法、又はその組み合わせが挙げられる。薬効成分をほとんど変性させることなく、比較的短時間で乾燥できる点で、凍結乾燥法が好ましい。凍結乾燥法であれば、例えば、藻体を-50℃で6時間～1週間、好ましくは-50℃下で24時間～72時間乾燥すればよい。本工程の乾燥度は、培養後乾燥工程、又は抽出後乾燥工程により異なるため、目的に応じて適宜定めればよいが、通常は藻体又は藻体抽出物の含水率が乾燥前の50％以下になることが好ましい。より好ましくは30％以下、又は20％以下である。
　本工程により、例えば、後述する抽出工程で溶出方法を用いる場合、藻体中の水分を減じることによって、溶媒が藻体の組織内に浸透し易くなる。それ故に、藻体中に含まれる薬効成分を溶媒中に短時間で効率的に抽出することができる。また、藻体を乾燥させておくことで、エタノール等の有機溶媒を溶媒として使用した場合に、藻体内に存在する水分によって溶媒の浸透が阻害されたり、又は希釈されたりすることもない。
（３）抽出工程
　「抽出工程」は、前記藻体から物理的及び／又は化学的方法で藻体抽出物を抽出する工程である。本工程は、必要に応じて行えばよい選択工程である。
　藻体抽出物の具体的な抽出方法は、限定はしない。当該分野で公知の方法を用いればよい。例えば、細胞破砕法や溶出方法が挙げられる。以下、それぞれについて説明をする。
　なお、本工程を開始する前に藻体を水等で洗浄し、藻体表面に付着した培地等を十分に除去しておくことが望ましい。
（３－１）細胞破砕法
　「細胞破砕法」は、対象とする細胞（ここではクロレラ目藻類の藻体）の細胞壁や細胞膜を物理的方法、化学的方法、又はその組み合わせによって破砕し、細胞内容物を外部に露出させる方法である。例えば、圧潰法、超音波法、分解法等が挙げられる。
　「圧潰法」は、細胞に物理的圧力を付与して細胞壁を圧潰破砕し、細胞内容物を抽出する方法で、物理的細胞破砕法である。圧潰法は、例えば、まず、回収した細胞をビーズミル又はグラインドミル等を用いて物理的にすり潰して破砕液を得る。具体的な条件や方法は、ミルの使用説明書等を参考にすればよい。
　「超音波法」は、超音波によって細胞壁を破砕し、細胞内容物を抽出する方法で、物理的細胞破砕法である。超音波法は、例えば、まず、回収した細胞を水又はバッファ等の適当な溶液に懸濁した後、超音波破砕装置（ソニケーター）を用いて適当な発振周波数と出力で細胞を破砕する。具体的な条件や方法は、超音波破砕装置の使用説明書等を参考にすればよい。
　「分解法」は、生体膜を構成する成分（タンパク質、脂質、糖等）を分解剤で処理し、生体膜を溶解、又は変性することによって細胞を破砕し、細胞内容物を抽出する方法で、化学的細胞破砕法である。分解剤には、例えば、クロレラ目藻類の細胞壁を溶解できる酵素、細胞膜等のタンパク質成分を変性できるアルカリ水溶液、脂質を可溶化できる界面活性剤等が挙げられるが、それに限定はされない。酵素の例としては、Cellulase R-10、Hemicellulase、Lysozyme、α-Mannosidas、及びβ-Mannosidase、又はそのカクテルが挙げられる。アルカリ水溶液は、アルカリ塩を水に溶解することによって調製される水溶液であればよい。使用するアルカリ塩は、例えば、水酸化ナトリウム（NaOH）、水酸化カリウム（KOH）、炭酸ナトリウム（Na2CO3）、炭酸カリウム（K2CO3）、又はそれらの組み合わせが利用できる。中でも炭酸カリウム、又は炭酸ナトリウム等の炭酸塩は、食品添加物として認可されている「かんすい」の主成分であり、人体に対する影響も極めて小さいことから分解法に使用するアルカリ塩として好ましい。アルカリ水溶液のpHは、限定はしないがpH11以上pH14以下の範囲にあればよい。界面活性剤は、例えば、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween-20、Tween-80、オクチル-β-グルコシド又はOTGのような非イオン性界面活性剤、PEGとPPGのコポリマーのような高分子非イオン性界面活性剤、SDSのような陰イオン性界面活性剤、CHAPS又はCHAPSOのような両性イオン性界面活性剤、又はそれらの組み合わせのいずれであってもよい。好ましくは、非イオン性界面活性剤である。界面活性剤の濃度は、限定はしないが、容量％で0.1～20％、1％～20％、3％～18％、又は5％～15％の範囲内にあればよい。
（３－２）溶出法
　「溶出法」は、細胞を溶媒等の媒体と接触させて、細胞中に含まれる低分子化合物等の成分を媒体中に溶出させる方法である。細胞等の生体組織の構造を基本的に維持しながら特定の細胞内成分のみを溶媒中に溶出させる方法である。溶出法では、クロレラ目藻類の藻体である細胞を溶媒中に所定の時間接触（例えば、浸漬、塗布、噴霧）した後、細胞を遠心や濾過によって除去することで抽出液として、目的の抽出物を得ることができる。その後、必要に応じて使用した溶媒を前述の乾燥工程（抽出後乾燥工程）により残存する固形物又はその中間状態のペーストとして抽出物を得ることができる。
　溶出法で使用する溶媒は、特に限定はなく、目的に応じて適宜選択すればよい。例えば、細胞内の脂溶性成分を溶出する場合は有機溶媒等を用いればよい。例えば、エタノールのような極性有機溶媒、n-ヘキサン若しくはn-ヘプタンのような炭素数6～10の脂肪族若しくは脂環式炭化水素又はベンゼンのような炭素数6～10の芳香族炭化水素等、又はそれらを組み合わせた混合液が挙げられる。本発明の生産物である神経細胞死抑制剤を生体に投与することを考慮すると、有機溶媒は残留性がなく、及び／又は毒性がないか、若しくは極めて低いエタノールのような溶媒が好ましい。一方、細胞内の水溶性成分を溶出する場合は水又は水溶液等を溶媒に用いればよい。
　溶媒の分量は、限定はしないが、通常は、使用する藻体の重量に対する溶媒の容量（容量／重量：V／W）が2～10倍の範囲になるようにすればよい。例えば、抽出工程で藻体を10g使用する場合には、水を20mL～100mLの範囲で使用すればよい。
　藻体抽出物を短時間で効率的に抽出するためには、本工程時に溶媒を加熱してもよい。加熱温度は、溶媒の種類によって異なるが、例えば、水であれば1気圧下50～100℃、好ましくは60～99℃、より好ましくは70～98℃の範囲、またオートクレーブ等の耐熱耐圧密閉器を用いた1～2気圧下であれば100～121℃の範囲、エタノールであれば1気圧下40～78.3℃、好ましくは55～77℃、より好ましくは60～77℃の範囲であればよい。また、水とエタノールの混合液の場合には、エタノールの濃度に応じて、上記水の場合又はエタノールの場合の条件を適宜応用すればよい。
　溶媒中での抽出時間は、抽出する藻体の状態、溶媒の種類や温度、又は薬効成分に対する溶媒の溶解度に依存する。例えば、1気圧下20℃の水に生状態の藻体を浸漬する場合は、抽出時間は、1年以上を要するが、98℃に加熱した水に乾燥状態の藻体粉末を浸漬する場合には、抽出時間は、2～20分程度で足りる。さらに、溶媒が水の場合、2気圧下120～121℃の温度であれば1～15分程度の時間でよい。一般的には、溶媒温度が低いほど抽出時間は長くなり、高いほど短くてよい。また、薬効成分が溶媒に対して易溶性であるほど抽出時間は短くてよく、難溶性であるほど長い時間を要する。
　溶媒を加熱する方法は、所望の温度付近まで溶媒を加熱できる方法であれば特に問わない。例えば、容器に入れて直火で加熱する方法や、マイクロウェーブやヒーター等の熱源によって加熱する方法が挙げられる。
　藻体の浸漬と溶媒の加熱の順序は問わない。例えば、所定の温度まで溶媒を加熱した後に藻体を浸漬してもよいし、室温状態の溶媒に藻体を浸漬して所定の温度まで加熱することもできる。
　なお、溶媒の温度及び抽出された薬効成分の濃度を均一化するために、加熱と共に溶媒の撹拌を行ってもよい。撹拌方法は、例えば、撹拌棒で撹拌してもよいし、撹拌装置を用いて撹拌してもよい。
（４）濃縮工程
　本明細書において「濃縮工程」とは、本生産方法が抽出工程を含むことを前提とする選択工程であり、必要に応じて前記抽出工程後に行えばよい。本工程では、抽出液から溶媒を減じることで、抽出液中に含まれる薬効成分の濃度が高められる。
　濃縮は、抽出物が抽出液、すなわち液体の場合に行われる。抽出液中の水分、又は溶媒を部分的に除去して、最終液体中に存在するクロレラ目藻類の藻体成分の濃度を高めればよい。濃縮後の濃度は、特に限定はされず、藻体から最初に抽出して得られた原抽出液に含まれる藻体成分の濃度よりも高ければ特には問わない。好ましくは原抽出液に対して、2～3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、又は10倍以上の濃度である。
　本工程は、抽出液中に含まれる薬効成分を変性することなく、溶媒のみを減じることのできる溶媒を除去できる方法であれば特に限定はしない。抽出液から液体を減じる方法としては、当該分野で公知の方法を用いることができる。例えば、エバポレーター等を用いた蒸発濃縮法、溶媒を風乾等で蒸発させる自然蒸発濃縮法、抽出液の冷却による濃縮法が挙げられる。
２．抗精神疾患剤
２－１．概要
　本発明の第２の態様は、抗精神疾患剤である。本発明の抗精神疾患剤は、第１態様に記載の神経細胞死抑制剤を有効成分として包含する。本発明の抗精神疾患剤によれば、うつ病をはじめとする精神疾患に対して予防、又は治療等の効果を有する。
２－２．構成
２－２－１．構成成分
　本発明の抗精神疾患剤は、有効成分のみで構成される薬剤であってもよいし、液性媒体、担体、他の活性成分との組み合わせで構成される組成物（抗精神疾患医薬組成物）であってもよい。以下、本発明の抗精神疾患剤の構成成分について、具体的に説明をする。
（１）有効成分
　本発明の抗精神疾患剤は、第１態様に記載の神経細胞死抑制剤を有効成分として包含する。抗精神疾患剤が組成物の場合、抗精神疾患剤に含まれる前記神経細胞死抑制剤の量（含有量）は、精神疾患の種類、抗精神疾患剤の剤形、抗精神疾患剤の投与量、並びに後述する担体の種類によって異なる。したがって、それぞれの条件を勘案して適宜定めればよい。通常は、単回投与における投与量中に有効量の神経細胞死抑制剤が包含されるように調整する。「有効量」とは、抗精神疾患剤の投与後に包含される神経細胞死抑制剤が抗精神疾患作用を発揮する上で必要な量であって、かつそれを投与する生体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。この有効量は、被験体の情報、投与経路、及び投与回数等の様々な条件によって変化し得る。最終的には医師、獣医師又は薬剤師等の判断によって決定される。
　ここで「被験体」とは、抗精神疾患剤の適用対象となる生体をいう。例えば、ヒト、愛玩動物（イヌ、ネコ等）、家畜（ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、ダチョウ等）、競走馬、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル等）等が該当する。好ましくはヒトである。「被験体の情報」とは、抗精神疾患剤を投与する生体の様々な個体情報である。例えば、被験体がヒトであれば、年齢、体重、性別、食生活、健康状態、疾患の進行度や重症度、薬剤感受性、併用薬物の有無等を含む。
（２）液性媒体
　本発明の抗精神疾患剤は、液剤等の液体組成物のときに、薬学的に許容可能な液性媒体を構成成分として含むことができる。液性媒体には、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアレルアルコール、ポリオキシ化イソステアレルアルコール及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類のような溶媒が挙げられる。このような液性媒体は、使用時に殺菌されていることが望ましく、必要に応じて体液と等張に調整されていることが好ましい。
（３）担体
　本発明の抗精神疾患剤は、組成物のときに、必要に応じて薬学的に許容可能な担体を含むことができる。「薬学的に許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、溶媒、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤、ヒト血清アルブミン等が挙げられる。
　溶媒には、例えば、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液、又は薬学的に許容される有機溶剤のいずれであってもよい。水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。補助剤としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。
　賦形剤には、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖、金属塩、クエン酸、酒石酸、グリシン、ポリエチレングリコール、プルロニック（登録商標）、カオリン、ケイ酸、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
　結合剤には、例えば、植物デンプンを用いたデンプン糊、ペクチン、キサンタンガム、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック、パラフィン、ポリビニルピロリドン又はそれらの組み合わせが挙げられる。
　崩壊剤としては、例えば、前記デンプンや、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド又はそれらの塩が挙げられる。
　充填剤としては、ワセリン、前記糖及び／又はリン酸カルシウムが例として挙げられる。
　乳化剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが例として挙げられる。
　流動添加調節剤及び滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。
　上記の他にも、必要であれば医薬において通常用いられる可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、分散剤、界面活性剤、無痛化剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤、湿潤剤、吸着剤、矯味矯臭剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、防腐剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤、等張化剤等を適宜含むこともできる。
　上記担体は、有効成分である神経細胞死抑制剤の生体内での分解を回避又は抑制する他、製剤化や投与を容易にし、剤形及び薬効を維持するために用いられるものであり、必要に応じて当該分野で公知の適宜使用すればよい。
２－２－２．剤形
　本発明の抗精神疾患剤の剤形は、有効成分である第１態様に記載の神経細胞死抑制剤を分解等により不活化させることなく標的部位にまで送達し、生体内でその有効成分の薬理効果を発揮し得る形態であれば特に限定しない。
　抗精神疾患剤の適用対象疾患は、後述する精神疾患である。精神疾患の原因となる部位は、神経細胞が存在する部位、すなわち主として中枢神経、特に脳である。したがって、抗精神疾患剤は、中枢神経、特に脳を標的部位として、その標的部位、より具体的には神経細胞にまで有効成分の神経細胞死抑制剤を送達できればいかなる剤形であってもよい。
　具体的な剤形は、投与方法及び／又は処方条件によって異なる。投与方法は、非経口投与と経口投与に大別することができるので、それぞれの投与法に適した剤形にすればよい。
　投与方法が非経口投与であれば、好ましい剤形は、対象部位への直接投与又は循環系を介した全身投与が可能な液剤である。液剤の例としては、注射剤が挙げられる。注射剤は、前記賦形剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、pH調節剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
　投与方法が経口投与であれば、好ましい剤形は、固形剤（錠剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤（内用水剤、乳剤、シロップ剤を含む）が挙げられるが、これらに限定はされない。固形剤であれば、必要に応じて、当該技術分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠にすることができる。
　なお、上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。本発明の抗精神疾患剤の製造方法については、当該技術分野の常法に従って製剤化すればよい。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Merck Publishing Co., Easton, Pa.)に記載された方法を参照することができる。
２－３．投与方法
　本発明の抗精神疾患剤の投与方法は、前述のように非経口投与と経口投与に大別することができる。経口投与法は、一般に全身投与であるが、非経口投与法は、さらに局所投与と全身投与に細分できる。具体的には、例えば、脳内注射による局所投与、又は血管内注射のような循環器内投与による全身投与が挙げられる。
　本発明の抗精神疾患剤の投与方法は、疾患の発症箇所又は進行度等に応じて適宜選択することができ、局所的投与又は全身投与のいずれであってもよい。有効成分である神経細胞死抑制剤は、神経細胞に対して作用する。また、後述する実施例で示すように、神経細胞死抑制剤は、毒性等の副作用もない。したがって、副作用による影響がないか又は極めて小さいことから疾患の発症箇所である脳に局所投与することもできる。局所投与は、注射による投与が好ましい。
　全身投与には、例えば、血管内注射又は経口投与が採用できる。血管内注射は、血流を介して神経細胞死抑制剤を全身に行き渡らせることが可能な点で便利である。ただし、神経細胞死抑制剤が血液中で分解されず、かつ脳関門を通過して、標的細胞である脳神経細胞にまで送達される必要がある。また、後述の実施例で示すように、本発明の抗精神疾患剤は、経口投与でもその効果を発揮し得る。経口投与は、侵襲性が極めて低く、投与も容易であることから、本発明の抗精神疾患剤の投与方法としても好ましい。
２－４．適用対象疾患
　本発明の抗精神疾患剤の適用対象となる疾患は、前述の精神疾患である。
　本明細書において「精神疾患」とは、前述のように、広義には外因性、心因性、又は内因性の脳の機能的又は器質的障害の総称をいうが、特に、統合失調症、うつ病、又は双極性障害が該当する。いずれの精神疾患も重症度は問わないが、軽度、すなわち初期段階であるほど抗精神疾患剤投与後の治療効果は期待できる。
　また、遺伝性等で精神疾患の発症リスクが高い個体に対しては、精神疾患発症の有無を問わず、適用対象となり得る。これは、本発明の抗精神疾患剤に精神疾患に対する発症予防効果があるためである。
　抗精神疾患剤の有効成分である神経細胞死抑制剤は、生体に対して副作用をほとんど及ぼさない。したがって、本発明の抗精神疾患剤は、前記疾患に罹患していない健常者でも適用対象とすることができる。
３．飲食品又は飼料
３－１．概要
　本発明の第３の態様は、第１態様の神経細胞死抑制剤を含む飲食品又は飼料の発明である。本発明の飲食品又は飼料によれば、抗精神疾患作用を有する食品組成物若しくは飲料組成物、又は飼料組成物として提供することができる。
３－２．構成
　本発明の抗精神疾患作用を有する飲食品及び飼料（以下、しばしば「抗精神疾患飲食品等」と表記する）は、第１態様の神経細胞死抑制剤を有効成分として含有する飲食品又は、飼料である。
　飲食品等として調製する場合、その形態は特に制限しない。例えば、一般食品、機能性表示食品、特定保健用食品、食品添加物等として利用できる。また、家畜、競走馬若しくは鑑賞動物等の飼料として利用することもできる。
　飲食品、又は飼料の形態は、特に限定はしない。例えば、機能性表示食品、特定保健用食品であれば、錠剤、チュアブル錠、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤等が挙げられる。また、一般食品であれば、茶飲料、清涼飲料、ゼリー飲料、スポーツ飲料、乳飲料、炭酸飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料、発酵乳飲料、粉末飲料、ココア飲料、精製水等の飲料の他、バター、ジャム、ふりかけ、マーガリン等のスプレッド類、マヨネーズ、ショートニング、カスタードクリーム、ドレッシング類、パン類、米飯類、麺類、パスタ、味噌汁、豆腐、牛乳、ヨーグルト、スープ又はソース類、菓子等が挙げられる。
　食品は、さらに、食品の製造に用いられる他の食品素材、各種栄養素、各種ビタミン、ミネラル、アミノ酸、各種油脂、種々の添加剤（例えば呈味成分、甘味料、有機酸等の酸味料、界面活性剤、ｐＨ調整剤、安定剤、酸化防止剤、色素、フレーバー）等と配合して、常法に従って製造することができる。また、通常食されている食品に本発明の神経細胞死抑制剤を配合することにより、本発明に係る飲食品を製造することもできる。
　また、本発明の飲食品及び飼料は、第２態様の抗精神疾患剤と同様の組成で利用できる。
　飲食品又は飼料中における本発明の神経細胞死抑制剤の含有量は、飲食品又は飼料等の形態により異なるが、乾燥質量を基準として、通常は0.001～80質量％、好ましくは0.01～50質量％、より好ましくは1～50質量％の範囲にあればよい。
＜実施例１：神経細胞死抑制剤の調製＞
（目的）
　本発明の神経細胞死抑制剤として、強光ストレス下で所定の時間培養したクロレラ目藻類を調製する。
（方法）
　培養する藻類には、トレボウクシア藻綱パラクロレラ属のP. kessleriを用いた。培養には、後述する培地に1.0×106cells/mLで播種した。
　強光培養条件は、植物培養用蛍光灯Lv1（三菱電機オスラム）、CCFL照明ユニット（日本医科機器）及び強力LED電球（杭州遠方光電情報：中国）を組み合わせた光源から600μ molphotons/m2/sの光を、24時間連続照射で14日間照射し、培養した。93ｍLのチューブ（IWAKI）に80mLのTAP培地を入れ、チューブ内には20 mL/min/本で通気し、培地中のCO2濃度を2～5％とした。また、培養温度は25±2℃とした。
　前記条件で培養後の培養液を10000gで5分間の遠心により藻体を沈殿させた。上清を除去して藻体ペレットを得た。ペレットを水で懸濁後、再度同条件で遠心し、上清を得た。この操作を数回繰り返し、藻体を洗浄した。洗浄後の藻体は、凍結乾燥後、必要に応じて粉末化した。
　神経細胞死抑制剤は、藻体の場合、凍結乾燥した藻体を抽出せずに30 mg/mLの割合でMilliQ水に懸濁した藻体懸濁液として、また、藻体抽出物の場合、藻体の凍結乾燥粉末を70%エタノールに1g/10 mLの割合で混合した後、2週間暗所でそのまま放置して得た抽出液として調製した。抽出液は、抽出後、さらに遠心を行い、上清を回収して、遠心濃縮装置（スクラム社製）にて濃縮・乾固し、70%エタノールに50 mg/mLの濃度で再溶解し、フィルター濾過をした。得られたクロレラ目藻体、及びその抽出物（抽出液）を神経細胞死抑制剤として以降の実施例に用いた。
＜実施例２：藻体抽出液の細胞毒性＞
（目的）
　実施例１で調製した神経細胞死抑制剤としてのクロレラ目藻体抽出物（以下、実施例では「藻体抽出物」と表記する）の神経細胞に対する毒性について検証する。
（方法）
　神経細胞には、SH-SY5Y細胞を用いた。SH-SY5Y細胞は、ヒト神経芽腫に由来する細胞株であり、神経機能を評価する為のモデル細胞として幅広く用いられている。
　96 well plate（Falcon社製）に培養した2.0 × 105のSH-SY5Y細胞に25μg/mL及び50μg/mLで藻体抽出物を添加し、5％ CO2下37℃で48時間培養した。培養後、藻体抽出物入りの培養液を除去し、細胞にMTTを5μg/mLの濃度で溶解した培養液を新たに添加し、24時間培養した。その後、10%のSDS溶液を添加し24時間培養し、570 nmにおける吸光度を測定することにより藻体抽出物処理に対するSH-SY5Y細胞の生存率を測定した。対照には、藻体抽出物未処理のSH-SY5Y細胞を用いた。
（結果）
　図１に結果を示す。藻体抽出物で処理したSH-SY5Y細胞は、いずれの濃度においても細胞生存率の減少は認められなかった。この結果から、本発明の神経細胞死抑制剤としての藻体抽出物には細胞毒性はないことが示された。
＜実施例３：藻体抽出液の神経細胞保護作用＞
（目的）
　実施例１で調製した藻体抽出物の神経細胞に対する保護作用について検証する。
（方法）
　SH-SY5Y細胞の培地に神経毒素であるデキサメタゾンを500 μMの濃度で添加した。デキサメタゾンは、細胞死（アポトーシス）を誘導することが知られている（Budni et al., 2011, Neuroscience, 190:346-53）。その後、培養液に25μg/mL及び50μg/mLで藻体抽出物を添加し、5％ CO2下37℃で48時間培養した。対照には、藻体抽出物未処理のSH-SY5Y細胞、及びデキサメタゾンを添加し、藻体抽出物を添加しないSH-SY5Y細胞を用いた。
（結果）
　図２に結果を示す。藻体抽出物で処理したSH-SY5Y細胞は、いずれの濃度においてもデキサメタゾン処理による神経細胞死を有意に抑制した。この結果から、本発明の藻体抽出物による神経細胞死の抑制効果が示された。
＜実施例４：アポトーシスに関与する遺伝子群に対する藻体抽出液の作用効果＞
（目的）
　実施例１で調製した藻体抽出物について、アポトーシス誘導因子に対する作用効果を検証する。アポトーシスは、MAPキナーゼシグナル伝達経路の活性化、又はPI3K/AKTシグナル伝達経路の抑制化によって誘導される。
　そこで、デキサメタゾン処理した神経細胞内での、MAPキナーゼシグナル伝達因子や、PI3K/AKTシグナル伝達因子の遺伝子発現、及びそこに藻体抽出物を添加したときの遺伝子発現の変化等を検証する。
（方法）
　SH-SY5Y細胞の培地に神経毒素であるデキサメタゾンを500 μMの濃度で添加した。デキサメタゾンは、細胞死（アポトーシス）を誘導することが知られている（Budni et al., 2011）。その後、培養液に25μg/mL及び50μg/mLで藻体抽出物を添加し、5％CO2下37℃で24時間培養した。対照には、藻体抽出物未処理のSH-SY5Y細胞、及びデキサメタゾンを添加し、藻体抽出物を添加しないSH-SY5Y細胞を用いた。24時間後の培養後、Isogen試薬（ニッポンジーン社製）を用いて細胞からRNAの抽出を行なった。抽出したRNAは、SuperScript IV VILO MasterMix（Thermo Fisher Scientific）を用いて、リアルタイムPCR用のcDNAの合成を行なった。合成されたcDNAを用いて、TaqMan gene expression assays（Thermo Fisher Scientific）を用いたリアルタイムPCRにより遺伝子発現解析を実施した。
　MAPキナーゼシグナル伝達因子には、MAPキナーゼシグナル伝達経路を正に活性化し、アポトーシスを誘導するMAP2K4（Mitogen activated protein kinase kinase 4）（Hs00387426_m1）、MAPK14（Mitogen-activated protein kinase 14）（Assay ID:Hs01051152_m1）、及びMAPK8（Mitogen-Activated Protein Kinase 8）（Assay ID:Hs01548508_m1）を選択した。
　また、PI3K/AKTシグナル伝達因子には、PI3K/AKTシグナル伝達経路を正に活性化し、アポトーシスを抑制するPI3KCA （Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalytic Subunit Alpha）（Assay ID:Hs00907957_m1）、及びAKT1（AKT Serine/Threonine Kinase 1）（Assay ID:Hs00178289_m1）を選択した。
　さらに、アポトーシスに直接関与するCASP3（Caspase-3）（Assay ID:Hs00234387_m1）、及びDNA修復に関与し、DNA切断によってアポトーシスを誘導するPARP1（Poly(ADP-Ribose) Polymerase 1）（Assay ID:Hs00242302_m1）の各遺伝子の発現をリアルタイムPCRで定量化した。
（結果）
　図３～９に結果を示す。図３はMAP2K4、図４はMAPK14、図５はMAPK8、図６はPI3KCA、図７はAKT1、図８はCASP3、そして図９はPARP1の各遺伝子発現量のControlに対する相対値を示している。
　MAPKシグナル伝達経路を活性化し、アポトーシスを誘導するMAP2K4、MAPK14、及びMAPK8の各遺伝子は、デキサメタゾン処理で遺伝子発現量が増加した。ところが、デキサメタゾンと共に藻体抽出物を添加すると、各遺伝子の発現量の増加が有意に減少した。
　一方、PI3K/AKTシグナル伝達経路を活性化し、アポトーシスを抑制するPI3KCA、及びAKT1の遺伝子は、デキサメタゾン処理で遺伝子発現量が有意に減少したが、藻体抽出物を添加すると、発現量の減少が有意に増加した。
　また、アポトーシスに直接関与するCASP3や、アポトーシスを誘導するPARP1についても、デキサメタゾン処理によって著しく遺伝子発現が増加したが、その増加も藻体抽出物の添加により、Controlと同等にまで減少した。
　以上の結果から、藻体抽出物は、神経細胞のアポトーシス誘導を抑制することにより神経細胞を保護できることが示された。
＜実施例５：藻体懸濁液の抗うつ作用（１）＞
（目的）
　実施例１で調製した藻体懸濁液がin vivoで抗うつ作用を有することをマウスの尾部懸垂試験により検証する。
（方法）
　実験動物には正常モデルマウスとして汎用されているICRマウス（3週齢、オス）を用い、マウスに精神的ストレスを付与する尾部懸垂試験を行った。
　1週間の飼育環境への馴化の後、マウスを水投与群（Control群）、抗うつ薬であるブプロピオン（Bupropion）投与群、及びクロレラ目藻類の藻体投与群の3群に振り分け、マウス1匹あたりブプロピオンを20 mg/kg体重、藻体懸濁液を100 mg/kg体重で経口投与した。投与1時間後に各投与群のマウスに尾部懸垂試験を実施した。
　尾部懸垂試験では、マウスの尾端を天井に固定し、6分間逆さ吊りの状態にした。尾部懸垂試験直後は、マウスは激しく四肢を動かして体勢を起こすことを試みるが、やがて抵抗を止めて不動状態となる。マウスにおけるこの不動状態は「うつ様状態」の指標とされている。尾部懸垂試験開始後、後半4分間におけるマウスの不動時間（Immobility time）を測定し、各投与群における抗うつ効果を評価した。なお、経口投与及び尾部懸垂試験は、同一個体で7日間毎日実施した。
（結果）
　図１０に結果を示す。7日間の尾部懸垂試験で、Controlの水投与群（Control)は、不動時間の増加が認められた。これは、毎日の尾部懸垂試験により、マウスにおける精神的ストレスが徐々に増加し、うつ状態に移行していることを示している。
　また、陰性対照のブプロピオン投与群（Bupropion）では、ブプロピオンの抗うつ作用により、7日目でも不動時間は短く、うつ状態に移行していないことを示している。
　一方、藻体投与群（微細藻類）では、前半3日間はControlと同様の結果を示したが、4日目以降は不動時間がブプロピオン投与群に迫る結果となった。この結果は、本発明の藻体からなる神経細胞死抑制剤がin vivoで抗うつ効果を有することを示している。
＜実施例６：藻体懸濁液の抗うつ作用（２）＞
（目的）
　実施例５におけるマウスの抗うつ効果を分子レベルで検証する。
（方法）
　実施例５で使用した3群のマウスについて、7日目の尾部懸垂試験終了後に解剖して脳組織を摘出した。また、血液を採取し、常法により血清を調製した。続いて、脳組織の大脳辺縁系部位を解剖により摘出し、RIPA Buffer（Thermo Fisher Scientific）中でホモジナイズし、タンパク抽出を行なった。その後タンパクにおけるTNF-α、BDNF（脳内由来神経栄養因子）、ドーパミン、ノルアドレナリン、グリコーゲン、及びATPの量をELISA法を用いてそれぞれ測定した。さらに、血清中のコルチコステロンの量をELISA キットを用いて測定した。コルチコステロンは、血清中のうつ病のバイオマーカーとして知られている。
（結果）
　図１１～１６に結果を示す。図１１はTNF-α、図１２はBDNF、図１３はドーパミン、図１４はノルアドレナリン、図１５はATP、図１６はグリコーゲンの量を示している。
　TNF-αは、炎症性サイトカインの一種であり、うつ病状態では脳組織内の量が増加することが知られている。図１１から、ブプロピオン投与群、及び藻体投与群では、Controlと比較してTNF-αの有意な減少が認められた。
　BDNFは、うつ病のバイオマーカーとして知られており、うつ状態では脳でのBDNF産生量及び血小板からのBDNF分泌量が低下し、血清又は血漿中のBDNF量の低下として反映されることが知られている。図１２から、ブプロピオン投与群、及び藻体投与群では、Controlと比較してBDNFの有意な増加が認められた。
　ドーパミン及びノルアドレナリンは、神経伝達物質として機能するモノアミンであり、うつ状態の脳内では、これらの量が減少することが知られている。図１３及び１４から、ブプロピオン投与群、及び藻体投与群では、Controlと比較してドーパミン及びノルアドレナリンの有意な増加が認められた。
　一方、脳のグリコーゲンは、低酸素症や低血糖症等の高エネルギー負荷の条件下で神経機能を維持するために重要である（Brown A. M.,et al., 2015, Met. Brain Dis., 30: 233）、グリコーゲン代謝は、ストレスによって大きく影響を受ける。例えば、睡眠不足（Gip P., et al., 2004, Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol, 286: R1075）や外科的ストレス（Y. Hashiguchi, et al., 1998, Abumrad, Surg. Today., 28: 471）は、脳組織のグリコーゲンレベルを低下させることが知られている。図１５から、ブプロピオン投与群、及び藻体投与群では、Controlと比較してグリコーゲンの有意な減少が認められた。
　通常ATPは神経細胞の増殖や分化といった神経活動について必須であり、うつ状態の脳内では、ATP量が減少することが知られている（Sasaki et al., 2019. Mol Nutr Food Res. 63(19): 1900327)。図１６から、ブプロピオン投与群、及び藻体投与群では、Controlと比較してATPの有意な増加が認められた。
　以上の結果から、藻体は、バイオマーカー等レベルで検証した場合でも抗うつ作用を有することが立証された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (7)

  1. 　500～2500μmol photons/m2/sの光強度で光を150～500時間照射して培養したクロレラ目（Chlorellales）に属する種の藻体、又はその藻体から物理的及び／又は化学的方法で抽出された藻体抽出物からなる神経細胞死抑制剤。
  2. 　前記物理的及び／又は化学的方法が細胞破砕法、溶出法、又はその組み合わせである、請求項１に記載の神経細胞死抑制剤。
  3. 　請求項１又は２に記載の神経細胞死抑制剤を有効成分として含む抗精神疾患剤。
  4. 　前記精神疾患がうつ病、双極性障害、又は統合失調症である、請求項３に記載の抗精神疾患剤。
  5. 　請求項１又は２に記載の神経細胞死抑制剤を含む飲食品又は飼料。
  6. 　神経細胞死抑制剤の生産方法であって、
    　クロレラ目（Chlorellales）に属する種の藻体に500～2500μmol photons/m2/sの光強度で光を150～500時間照射して培養する培養工程を含む前記生産方法。
  7. 　培養後の前記藻体から物理的及び／又は化学的方法で藻体抽出物を抽出する抽出工程を含む、請求項６に記載の生産方法。
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ZENI, A. L. B. ET AL.: "Lutein prevents corticosterone-induced depressive-like behavior in mice with the involvement of antioxidant and neuroprotective activities", PHARMACOLOGY, BIOCHEMISTRY AND BEHAVIOR, vol. 179, 2019, pages 63 - 72, XP085639968, DOI: https://doi.org/10.1016/j.bb. 2019.02.00 4 *

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