WO2021177693A2 - 나노입자 구조체 및 그 형성 방법 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a nanoparticulate structure and a method for forming the same.
  • Rheumatoid arthritis is an inflammatory autoimmune disease that causes long-term synovitis and joint disorders.
  • disease modifying anti-rheumatic drugs DMARDs
  • side effects do not provide long-term disease relief.
  • the present invention provides a nanoparticle structure for the treatment of diseases.
  • the present invention provides a method for forming the nanoparticle structure.
  • Nanoparticle structures according to embodiments of the present invention include a porous support and nanoparticles coupled to the porous support, wherein the nanoparticles include manganese ferrite nanoparticles and ceria nanoparticles.
  • the porous support may include mesoporous silica nanoparticles.
  • the nanoparticulate structure may further include a drug loaded on the porous support.
  • the drug may include an arthritis drug.
  • the nanoparticulate structure can be injected into the human body to remove pro-inflammatory M1 macrophages and induce anti-inflammatory M2 macrophages.
  • the nanoparticle structure may be injected into the human body to remove reactive oxygen species and generate oxygen.
  • a method of forming a nanoparticle structure according to embodiments of the present invention includes forming a porous support and nanoparticles, and combining the porous support and the nanoparticles, wherein the nanoparticles are manganese ferrite nanoparticles and ceria including nanoparticles.
  • the porous support may include mesoporous silica nanoparticles.
  • the method of forming the nanoparticulate structure may further include loading a drug onto the porous support.
  • the porous support is amine-functionalized, the nanoparticles are BMPA (2-Bromo-2-methylpropionic acid)-capped, and the bonding of the porous support and the nanoparticles includes, the amine-functionalized porous support and mixing the BMPA-capped nanoparticles.
  • Nanoparticle structures according to embodiments of the present invention may be injected into a living body and effectively used to treat diseases.
  • FIG. 3 shows STEM images and EDX mapping images of MFC-MSN showing the conjugation of manganese ferrite nanoparticles and ceria nanoparticles in MSN.
  • 10 shows the SOD activity of MF-MSN, C-MSN and MFC-MSN.
  • FIG. 15 shows CLSM images in BMDM incubated with MF-MSN, C-MSN or MFC-MSN in the presence of H 2 O 2 in the medium and the corresponding fluorescence intensity of intracellular H 2 O 2 (green).
  • Figure 16 shows HIF-1 ⁇ (green) of BMDM pretreated with MF-MSN, C-MSN or MFC-MSN for 4 hours and then incubated for 4 hours under hypoxic (1% O 2 ) and inflammatory (+LPS) conditions. indicates dyeing.
  • FIG. 17 shows protein expression of HIF1- ⁇ , M1 (iNOS, IL-1 ⁇ and Cox-2) and M2 (Arg-1) macrophage markers in BMDM under various conditions.
  • Figure 21 shows the inhibition of HIF-1 ⁇ (red) expression in the knee joint synovial membrane and femur 30 days after injection of MFC-MSN.
  • M1 Cox-2; red
  • M2 CD206; green
  • FIG. 24 shows thermal image images of the left hind paw at various time points after treatment in a rheumatoid arthritis induced rat model.
  • Figure 25 shows the paw temperature of the left hind paw at various time points after treatment in a rheumatoid arthritis induced rat model.
  • 26 shows paw width at various time points after treatment in a rheumatoid arthritis induced rat model.
  • FIG. 27 shows the time required to traverse a 70 cm beam at various time points after treatment in a rheumatoid arthritis induced rat model.
  • Nanoparticle structures according to embodiments of the present invention include manganese ferrite and ceria nanoparticle-anchored mesoporous silica nanoparticles (MFC-MSN).
  • MFC-MSN can synergistically scavenge reactive oxygen species and generate O 2 to reduce M1 macrophage levels and induce M2 macrophages for the treatment of rheumatoid arthritis.
  • MFC-MSN exhibits a synergistic effect on O 2 production and removal of reactive oxygen species. This leads to efficient polarization of M1 vs. M2 macrophages both in vitro and in vivo, while removing the intermediate hydroxyl radicals generated by manganese ferrite nanoparticles in the process of O 2 generation during Fenton reaction of ceria nanoparticles. due to a complementary reaction.
  • MFC-MSN Mesoporous silica nanoparticles
  • Inflammatory cells including macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, neutrophils and natural killer cells, infiltrate the rheumatoid arthritis joint synovial membrane and contribute to severe destruction of joint bone and cartilage.
  • macrophages play a key role in the pathophysiological response in rheumatoid arthritis.
  • the macrophages of rheumatoid arthritis joints are mainly of the M1 phenotype and promote the progression of rheumatoid arthritis by releasing various inflammatory cytokines.
  • Hypoxia-inducing factor (HIF-1 ⁇ ) expression and reactive oxygen species (ROS) in rheumatoid arthritis joints induce synovial inflammation and affect the balance of macrophage subtypes.
  • Hypoxia is mainly induced in the rheumatoid arthritis synovial membrane through fibroblast-like synovial hyperplasia and increased oxygen demand of infiltrated inflammatory cells.
  • Hypoxia upregulates HIF-1 ⁇ in rheumatoid arthritis, which induces polarization of macrophages to the M1 subtype through reactive oxygen species production or other pathways. Therefore, inhibition of HIF-1 ⁇ can attenuate the M1 phenotype, enhance the M2 polarization of macrophages, and effectively ameliorate rheumatoid arthritis.
  • Ceria nanoparticles can induce M2 polarization of macrophages by eradicating reactive oxygen species. Simultaneous inhibition of HIF-1 ⁇ and reactive oxygen species shifts the phenotypic transition of pro-inflammatory M1 macrophages to the anti-inflammatory M2 subtype for the treatment of rheumatoid arthritis.
  • Manganese ferrite nanoparticles down-regulate hypoxic markers such as HIF-1 ⁇ by alleviating hypoxic conditions through the Fenton reaction.
  • Ceria nanoparticles can scavenge reactive oxygen species for various inflammatory diseases.
  • ceria nanoparticles Catalytic properties of ceria nanoparticles is due to that the two reversible oxidation state (Ce 3+ or Ce + 4) to the nanoparticle surface exists.
  • high concentrations of nanoparticles can cause cytotoxicity.
  • Excessive concentration of manganese ferrite nanoparticles can lead to a decrease in cytotoxicity and oxygen production efficiency because hydroxyl radicals are generated as intermediates of the Fenton reaction.
  • ceria nanoparticles can interfere with clinical translation with respect to their potential cytotoxicity, there is a need for increased efficiency in biomedical applications to reduce nanoparticle dose.
  • Manganese ferrite nanoparticles and ceria nanoparticles exhibit a synergistic effect on O 2 production through efficient removal of intermediate reactive oxygen species, thereby inducing M2 polarization of macrophages even at relatively low nanoparticle concentrations.
  • MFC-MSN efficiently scavenges reactive oxygen species and generates O2 for M2 polarization of macrophages in a rheumatoid arthritis model (Fig. 1).
  • BMDM bone marrow-derived macrophages
  • MTX methotrexate
  • MFC-MSN a DMARD
  • MFC-MSN is formed by loading mesoporous silica nanoparticles (MSN) with 3 nm-sized ceria nanoparticles and 6 nm-sized manganese ferrite nanoparticles by a nucleophilic substitution reaction. The sizes of ceria and manganese ferrite nanoparticles were confirmed by transmission electron microscopy (TEM).
  • MSN mesoporous silica nanoparticles
  • TEM transmission electron microscopy
  • ICP-AES Inductively coupled plasma atomic emission spectrometer
  • MFC-MSN has a Bruneter -Emmett-Teller (BET) surface area of 320.19 m 2 /g and a mesopore size of 3.80 nm (FIG. 4).
  • BET Bruneter -Emmett-Teller
  • Mesoporous silica nanoparticles having a large pore size were synthesized for effective drug absorption by adding a swelling agent, mesitylene, to the reaction mixture.
  • Rhodamine B isothiocyanate was incorporated into MSN for fluorescent labeling, which was verified by UV-Vis (ultraviolet-visible) and PL (photoluminescence) spectroscopy (FIG. 5).
  • the surface of nanoparticles was coated with polyethylene glycol (PEG) to avoid non-specific protein adsorption under in vivo conditions.
  • PEG polyethylene glycol
  • the hydrodynamic size increased from 67.3 ⁇ 1.3 nm of MSN to 80.8 ⁇ 2.2 nm of PEGylated MFC-MSN after conjugation with manganese ferrite nanoparticles and ceria nanoparticles ( FIG. 6 ).
  • MF-MSN Hydroxyl radical generation in the presence of nanoparticles after addition of H 2 O 2 at pH 7.4 was evaluated.
  • MF-MSN generates a hydroxyl radical as an intermediate in the Fenton reaction (FIG. 11).
  • MFC-MSN did not generate hydroxyl radicals, indicating that ceria nanoparticles scavenge these radicals generated by manganese ferrite nanoparticles.
  • MFC-MSN did not show cytotoxicity for 24 hours at a concentration of up to 55 ⁇ g/mL, as measured by MTS assay ( FIG. 14 ). Therefore, subsequent in vitro experiments were performed at MFC-MSN concentrations below 55 ⁇ g/mL.
  • BMDMs pretreated with MF-MSN, C-MSN, and MFC-MSN were incubated with 100 ⁇ M H 2 O 2 for 1 hour, and then intracellular H 2 O 2 levels were measured through fluorescence intensity.
  • MFC-MSN degraded intracellular H 2 O 2 more efficiently than the control, which was consistent with previous results , showing the synergistic H 2 O 2 resolution of MFC-MSN ( FIG. 7 ).
  • HPF 3'-(p-hydroxyphenyl) fluorescein
  • BMDM pretreated with MF-MSN, C-MSN and MFC-MSN was treated with 100 ⁇ M H 2 O 2 , and then the fluorescence intensity of HPF was evaluated.
  • BMDM pretreated with C-MSN or MFC-MSN had significantly reduced fluorescence intensity compared to H 2 O 2 -treated control, confirming that ceria nanoparticles could effectively remove intracellular hydroxyl radicals.
  • HIF-1 ⁇ expression level was evaluated.
  • BMDMs were incubated for 4 hours under hypoxic and inflammatory conditions, which were hypoxic (1% O 2 , 5% CO 2 and 94% N 2 ) and 0.2 This was achieved by the addition of ⁇ g/mL lipopolysaccharide (LPS).
  • hypoxic 1% O 2 , 5% CO 2 and 94% N 2
  • LPS lipopolysaccharide
  • Hypoxia and LPS upregulated HIF-1 ⁇ expression which was attenuated by treatment with MF-MSN, C-MSN and MFC-MSN ( FIG. 16 ).
  • the decrease in HIF-1 ⁇ expression level was most pronounced in MFC-MSN, indicating synergistic generation of O 2 by MFC-MSN.
  • treatment with MFC-MSN significantly reduced the expression levels of HIF-1 ⁇ and pro-inflammatory M1 markers.
  • qRT-PCR analysis of BMDM showed that hypoxia and LPS treatment increased mRNA expression levels of M1 markers including iNOS, IL-6 and TNF- ⁇ ( FIG. 18 ).
  • MFC-MSN treatment significantly reduced mRNA expression levels of M1 markers.
  • anti-inflammatory M2 markers including Arg-1, CD206 and IL-10 were significantly increased after MFC-MSN treatment.
  • Manganese ferrite nanoparticles and ceria nanoparticles also showed a macrophage polarizing effect, but less than that of MFC-MSN.
  • Successful M1 to M2 phenotypic transition of macrophages is confirmed by MFC-MSN synergistically scavenging reactive oxygen species and generating O 2 .
  • AIA adjuvant-induced arthritis
  • sO 2 hemoglobin oxygen saturation
  • FIG. 19 Intra-articular injection of MFC-MSN immediately increased sO2 levels from 17.0 ⁇ 0.7% to 22.9 ⁇ 1.2%. This result shows that MFC-MSN can generate O 2 immediately and efficiently in a hypoxic environment.
  • M1 macrophage-specific biomarkers such as Cox-2, TNF- ⁇ and iNOS were increased after induction of rheumatoid arthritis, whereas MFC-MSN injection significantly reduced their levels.
  • Rheumatoid arthritis also stimulated expression of M2 markers due to macrophage infiltration, but injection of MFC-MSN further up-regulated anti-inflammatory M2 markers. Consequently, MFC-MSN immediately increased hemoglobin sO 2 levels to alleviate hypoxia around rheumatoid arthritis synovial joints, and changed the macrophage phenotype from pro-inflammatory M1 to anti-inflammatory M2 subtype.
  • MFC-MSN could deliver the anti-rheumatic drug MTX to enhance the therapeutic effect.
  • sustained release of low-dose MTX is very beneficial for the treatment of rheumatoid arthritis.
  • the loading capacity and loading efficiency of MTX were 10.4 ⁇ g/mg and 20.8%, respectively.
  • MFC-MSN and MTX-loaded MFC-MSN were further evaluated by histological and immunohistochemical analysis ( FIG. 28 ). These rheumatoid arthritis-induced pathological features were evaluated as severe rheumatoid arthritis cartilage destruction, synovial inflammation and stimulated angiogenesis in response to hypoxia. Safranin-O staining of the knee joint showed complete destruction of cartilage in the PBS-injected group. In contrast, injection of MFC-MSN or MTX-loaded MFC-MSN showed efficient preservation of cartilage structures. Mankin's score was applied to the quantification of cartilage structures.
  • synovitis was significantly reduced in the MFC-MSN and/or MTX-loaded MFC-MSN infusion groups as assessed by H&E staining.
  • the number of inflammatory cells was significantly reduced after treatment with MFC-MSN or MTX-loaded MFC-MSN.
  • angiogenesis a typical response induced by hypoxia to increase oxygen supply, was analyzed by immunohistochemical staining of blood vessels with von Willebrand factor (vWF).
  • CLSM and quantification of vWF-positive vessels indicate that injection of either MFC-MSN or MTX-loaded MFC-MSN significantly reduced angiogenesis in the knee joint.
  • MTX-loaded MFC-MSN was monitored by monitoring key liver function markers and body weight in the blood, including alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), blood urea nitrogen (BUN) and creatinine. It was evaluated whether it had a negative effect on the rat's health. No significant changes in body weight and blood levels were observed compared to healthy rats, and the toxicity of MTX-loaded MFC-MSN was negligible.
  • ALT alanine aminotransferase
  • AST aspartate aminotransferase
  • BUN blood urea nitrogen
  • manganese ferrite, ceria and MTX in MTX-loaded MFC-MSN are synergistic and show optimal therapeutic effects for rheumatoid arthritis.
  • MFC-MSN can relieve inflammation by removing reactive oxygen species and generating O 2 to induce polarization of macrophages from M1 to M2 in the rheumatoid arthritis knee joint.
  • the synergistic effect of manganese ferrite and ceria nanoparticles is due to the hydroxyl radical scavenging effect of ceria nanoparticles, whereby intermediate radicals generated by manganese ferrite nanoparticles can generate O 2 .
  • MFC-MSN can induce polarization of M1 to M2 macrophages under hypoxic and inflammatory conditions both in vitro and in vivo.
  • MFC-MSN Intra-articular injection of MFC-MSN into rheumatoid arthritis mice oxygenates inflamed synovial joints, downregulating HIF-1 ⁇ and attenuating inflammation through polarization of M1 to M2 macrophages. Anti-rheumatic drug delivery using MFC-MSN further alleviates rheumatoid arthritis.
  • MFC-MSN can be applied as an anti-inflammatory agent and M2 macrophage stimulator for the treatment of other hypoxia-related inflammatory diseases such as myocardial infarction.
  • Manganese ferrite nanoparticles with a size of 6 nm were synthesized through thermal decomposition of manganese oleate and iron oleate complexes.
  • the iron oleate complex was prepared by dissolving 40 mmol of iron chloride and 120 mmol of sodium oleate in 60 mL of deionized water, 80 mL of ethanol and 140 mL of n-hexane.
  • Manganese oleate complex was prepared by substituting manganese chloride for iron chloride during the synthesis of iron oleate complex.
  • the prepared solution was heated to 70° C. and stirred for 4 hours.
  • the upper organic layer was separated, and the solvent was evaporated using a rotary evaporator to obtain a metal oleate complex.
  • For the synthesis of manganese ferrite nanoparticles 0.67 mmol of manganese oleate, 1.33 mmol of iron oleate, and 4 mmol of oleic acid were dissolved in 10 g of 1-octadecene. After degassing under vacuum, the mixture was heated to 320° C. at a constant heating rate of 3.3° C./min and aged for 1 hour. The resulting nanoparticles were washed several times with ethanol and dispersed in chloroform.
  • BMPA-capped manganese ferrite nanoparticles For the synthesis of BMPA-capped manganese ferrite nanoparticles, 0.5 g of 2-Bromo-2-methylpropionic acid (BMPA), 0.05 g of citric acid and 15 mg of oleic acid capped manganese ferrite nanoparticles were dissolved in a mixture of chloroform and DMF. (50/50 v/v, 15 mL). Similarly, BMPA-capped ceria nanoparticles were synthesized by mixing 0.25 g of BMPA, 0.025 g of citric acid, and 15 mg of ceria nanoparticles in a mixture of chloroform and DMF. The mixture was stirred overnight and then centrifuged to remove excess ligand. BMPA-capped nanoparticles were dispersed in ethanol for conjugation to mesoporous silica nanoparticles.
  • CTAC cetyltrimethylammonium chloride
  • APTES ((3-Aminopropyl) triethoxysilane)-RITC
  • amine-functionalized MSN 20 mg was added to 15 mg of BMPA-capped manganese ferrite nanoparticles and 15 mg of BMPA-capped ceria nanoparticles and stirred overnight at room temperature.
  • MF-MSN and C-MSN were synthesized using 15 mg of manganese ferrite nanoparticles and 60 mg of ceria nanoparticles, respectively.
  • the product was washed several times with ethanol and water and then coated with PEG using methoxy poly(ethylene glycol) succinimidylglutarate (mPEG-SG) and methoxy poly(ethylene glycol) amine (mPEG-AM).
  • mPEG-SG methoxy poly(ethylene glycol) succinimidylglutarate
  • mPEG-AM methoxy poly(ethylene glycol) amine
  • TEM analysis was performed using a JEOL EM-2010 microscope operated at 200 kV.
  • Metal ion concentrations including manganese, iron and ceria were analyzed by inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy (ICP-AES) using an ICPS-7500 spectrometer (Shimadzu).
  • the hydrodynamic size of the nanoparticles was measured using a dynamic light scattering instrument (Malvern).
  • the Brunauer-Emmett-Teller (BET) surface area and pore size of MFC-MSN were measured by nitrogen adsorption at 77 K using a 3Flex surface characterization analyzer (Micrometritics).
  • RITC labeling of MSN was confirmed using a UV-Vis spectrophotometer (Agilent Technologies). MTX loading was also demonstrated by UV-Vis spectrophotometry by measuring the intrinsic absorbance of MTX at 305 nm. Successful labeling of RITC in MSN was investigated using PL spectrophotometry (Agilent Technologies).
  • MF-MSN, C-MSN and MFC-MSN containing 2.5 mM H 2 O 2 and 60 ⁇ g/mL manganese ferrite and ceria were mixed in PBS at room temperature.
  • 50 ⁇ L of the above solution was added to 100 ⁇ L of a Ti(SO 4 ) 2 solution containing 1.33 mL of 24% Ti(SO 4 ) 2 8.33 mL of H 2 SO 4 in 50 mL of deionized water, and added every 30 minutes until 3 hours. .
  • the absorbance of the solution was measured at 405 nm to evaluate the H 2 O 2 concentration.
  • MF-MSN, C-MSN and MFC-MSN containing 1M H 2 O 2 and 150 ⁇ g/mL of manganese ferrite nanoparticles and ceria nanoparticles were mixed in 20 mL of PBS at room temperature, and dissolved oximetry (HI9136, HANNA) instrument, Korea) to measure the O 2 concentration every 5 minutes.
  • MF-MSN, C-MSN, MFC-MSN containing 1M H 2 O 2 and 75 ⁇ g/mL manganese ferrite nanoparticles and ceria nanoparticles were used. Mix and monitor for up to 1 hour.
  • the O 2 generating ability of MFC-MSN was also evaluated under hypoxic and inflammatory conditions achieved by uptake of Ar in PBS and addition of 100 ⁇ M H 2 O 2 .
  • the SOD mimicking catalytic activity of MF-MSN, C-MSN and MFC-MSN was investigated using the SOD assay kit (Sigma Aldrich) according to the provided protocol.
  • WST aqueous tetrazolium salt
  • the SOD activity was calculated using the unique property of WST to generate a water-soluble formazan dye upon reduction with a peroxide anion.
  • WST working solution and enzyme working solution were added to MF-MSN, C-MSN and MFC-MSN at a final concentration of 300 ⁇ g/mL, followed by thorough mixing and incubation at room temperature for 20 minutes.
  • the absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader, and the slope of the inhibition rate compared to the blank was measured to calculate the SOD activity (%).
  • hydroxyl radicals by MF-MSN, C-MSN and MFC-MSN was assessed using the hydroxyl radical antioxidant capacity (HORAC) assay (Cell Biolabs, Inc.) with a slightly modified protocol.
  • HORAC hydroxyl radical antioxidant capacity
  • a 1X fluorescein solution and a 1X hydroxyl radical initiator were prepared by diluting a fluorescein probe (100X) and a hydroxyl radical initiator (5X) with an analytical diluent and deionized water, respectively.
  • 40 ⁇ L of MF-MSN, C-MSN and MFC-MSN containing 20 ⁇ g/mL of manganese ferrite and ceria were mixed with 140 ⁇ L of 1X fluorescein solution and incubated for 30 minutes.
  • BMDM murine bone marrow-derived macrophages
  • differentiation medium consisting of high-glucose DMEM supplemented with mycin.
  • Conditioned medium was prepared from L929 cells by growing the cells in high-glucose DMEM containing 10% (v/v) FBS, and 1% (v/v) penicillin/streptomycin. After 4 days of incubation, the macrophage differentiation medium was discarded and adherent BMDMs were obtained using a cell scraper.
  • BMDM was incubated with MFC-MSN for 24 h, followed by flow cytometry using FACS AriaII in National Center for Inter-University Research Facilities (NCIRF) and CLSM analysis. Analysis was performed.
  • CLSM analysis cell nuclei were co-stained using Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific). Cell viability was assessed using the MTS cell proliferation assay (Promega).
  • MTS solution was added to the medium and absorbance was measured at 490 nm using a microplate reader.
  • BMDMs were incubated with 40 ⁇ g/mL of MF-MSN, C-MSN and MFC-MSN for 24 hours and then incubated with 100 ⁇ M of H 2 O 2 for an additional 1 hour. The H 2 O 2 containing medium was removed and replaced with 5 ⁇ M HPF working solution. After 30 min, the green fluorescence intensity of the wells was investigated using CLSM assay.
  • HPF 3'-(p-hydroxyphenyl) fluorescein
  • HIF-1 ⁇ immunostaining was performed on BMDMs cultured in lipopolysaccharide (LPS)-containing medium under hypoxic conditions after treatment with MF-MSN, C-MSN and MFC-MSN. Hypoxia was achieved by incubation in a hypoxic chamber containing 1% O 2 , 5% CO 2 and 94% N 2 gas for 4 hours.
  • LPS lipopolysaccharide
  • BMDM cells pre-incubated with 40 ⁇ g/mL of MF-MSN, C-MSN, and MFC-MSN for 4 hours were cultured in a medium containing 0.2 ⁇ g/mL of LPS under hypoxic conditions for another 4 hours, followed by HIF-1 ⁇ was stained with a primary antibody against (Abcam) and an Alexa Fluor 488-labeled secondary antibody (Abcam).
  • F-actin was co-stained using rhodamine paloid (Thermo Fisher Scientific).
  • Rat BMDM was pretreated with MSN, C-MSN, MF-MSN and MFC-MSN for 4 hours, followed by extensive PBS washing.
  • Fresh DMEM supplemented with LPS (0.2 ⁇ g/mL) was added and cells were incubated in hypoxic conditions (1% O 2 , 5% CO 2 and 94% N 2 ).
  • hypoxic conditions 1% O 2 , 5% CO 2 and 94% N 2 .
  • total RNA and protein from BMDM were extracted with TRIzol ® (Life Technologies, CA) and Cell Lysis Buffer ® (Cell Signaling Technology, MA), respectively.
  • the concentration of total RNA was measured using a NanoDrop spectrometer (ND-2000, NanoDrop Technologies, Wilmington, DE).
  • the cDNA was then synthesized with 600 ng of total RNA.
  • TOPOne TM SYBR Green premix Enzynomics, Daejeon, Korea
  • StepOnePlus real-time PCR system Applied Biosystems, CA
  • Amplification was carried out in 50 cycles for 30 seconds.
  • Bradford assays were performed for determination of protein concentration.
  • Proteins were then mixed with NuPAGE ® LDS sample buffer (Life Technologies, CA), boiled at 95° C. for 3 minutes for denaturation, and loaded onto a 12% (w/v) SDS-polyacrylamide gel. After 100 min of electrophoresis at 80 V, proteins were transferred to a nitrocellulose membrane (Bio-Rad, CA) using a Trans-Blot ® SD semi-dry electrophoretic transfer cell (Bio-Rad) at 20 V for 50 min. For specific binding, the membrane was blocked with 5% skim milk for 2 hours. Membranes were probed with primary antibodies, HIF-1 ⁇ (Novus Biologicals, CO), iNOS, IL-1 ⁇ , Cox-2, Arg-1 (Abcam, UK) overnight at 4°C.
  • HIF-1 ⁇ Novus Biologicals, CO
  • iNOS IL-1 ⁇
  • Cox-2 Cox-2
  • Arg-1 Abcam, UK
  • the membrane was washed 3 times with TBS-T and reacted with HRP-conjugated secondary antibody for 50 min. After washing, the membrane was developed using a chemiluminescence detection system (GE Healthcare, UK). Blotted membranes were visualized using a Gel Logic 2200 PRO imaging system (Carestream Health, NY).
  • AIA adjuvant-induced arthritis
  • Vascular O 2 saturation (sO2) around synovial joints was measured using a Vevo LAZR optoacoustic imaging system (VisualSonics Inc., Canada) with LZ550 transducer differential optics of peroxidized and deoxygenated hemoglobin at different wavelengths of 850 nm and 750 nm, respectively. was measured by absorption.
  • sO2 around the synovial joint was measured before and after administration of 50 ⁇ L of MFC-MSN to the synovial joint through intra-articular injection.
  • Histopathology was evaluated to determine the characteristics of rheumatoid arthritis, including hypoxia, M1/M2 equilibrium, angiogenesis, synovitis (synovitis) and cartilage destruction.
  • the animals were sacrificed and the knee joint was recovered. Knee joints were fixed in 4% paraformaldehyde for 3 days at 4°C, then transferred to descaling solution (Sigma, MO) and placed on an orbital shaker. Tissues were transcribed at room temperature for 14 days. The transcribed knee joint was placed in paraffin and cut with a microtome at 10 ⁇ m.
  • tissue sections were dewaxed and stained with primary antibodies against HIF-1 ⁇ (Novus Biologicals), Cox-2, CD206 (Abcam), F4/80 and vWF (Santa Cruz Biotechnology, TX). .
  • the secondary antibodies used were goat anti-mouse Alexa Fluor ® 568 (Abcam) against HIF-1 ⁇ , goat anti-rabbit Alexa Fluor ® 488 (Abcam) against F4/80 and CD206 and goat against Cox-2 and vWF. anti-rabbit Alexa Fluor ® 568 (Abcam).
  • Tissue sections were then stained with DAPI mounting solution and observed using a confocal fluorescence microscope (LSM780, Carl Zeiss, Germany). For quantification of vWF-positive vessel density, vWF-positive areas relative to DAPI-positive areas were measured using ImageJ software.
  • RNAse/DNAse-free conical tubes On day 30 after adjuvant administration, the knee joints of all animals were retrieved and placed in RNAse/DNAse-free conical tubes. Synovial tissue of the knee joint was collected using a sterile surgical blade. The obtained tissue was minced with a surgical blade and then homogenized in the presence of TRIzol ® (D1000, Benchmark Scientific, NJ), and total RNA was isolated. Synthesis of cDNA and qRT-PCR was performed as described above for in vitro assays.
  • safranin-O and H&E staining were performed, respectively.
  • Safranin-O staining for proteoglycans in cartilage was performed according to the method described above. Briefly, dewaxed tissue sections were stained with Weigert's hematoxylin working solution consisting of 1% hematoxylin and 30% iron chloride (anhydrous) for 10 min.
  • Nanoparticle structures according to embodiments of the present invention may be injected into a living body and effectively used to treat diseases.

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Abstract

나노입자 구조체 및 그 형성 방법이 제공된다. 상기 나노입자 구조체는, 다공성 지지체 및 상기 다공성 지지체에 결합되는 나노입자를 포함하고, 상기 나노입자는 망간 페라이트 나노입자 및 세리아 나노입자를 포함한다. 상기 나노입자 구조체의 형성 방법은 다공성 지지체 및 나노입자를 형성하는 단계 및 상기 다공성 지지체와 상기 나노입자를 결합시키는 단계를 포함하고, 상기 나노입자는 망간 페라이트 나노입자 및 세리아 나노입자를 포함한다.

Description

나노입자 구조체 및 그 형성 방법
본 발명은 나노입자 구조체 및 그 형성 방법에 관한 것이다.
류마티스 관절염은 염증성자가 면역 질환으로 장기적인 활막염과 관절 장애를 유발한다. DMARD(Disease modifying anti-rheumatic drugs)가 주요 류마티스 관절염 치료법이지만 부작용으로 인해 장기적인 질병 완화가 이루어지지 않는다.
본 발명은 질병 치료용 나노입자 구조체를 제공한다.
본 발명은 상기 나노입자 구조체의 형성 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적들은 다음의 상세한 설명과 첨부한 도면으로부터 명확해 질 것이다.
본 발명의 실시예들에 따른 나노입자 구조체는, 다공성 지지체 및 상기 다공성 지지체에 결합되는 나노입자를 포함하고, 상기 나노입자는 망간 페라이트 나노입자 및 세리아 나노입자를 포함한다.
상기 다공성 지지체는 메조포러스 실리카 나노입자를 포함할 수 있다.
상기 나노입자 구조체는 상기 다공성 지지체에 로딩된 약물을 더 포함할 수 있다. 상기 약물은 관절염 약물을 포함할 수 있다.
상기 나노입자 구조체는 인체에 주입되어 전-염증성 M1 대식세포를 제거하고 항-염증성 M2 대식세포를 유도할 수 있다.
상기 나노입자 구조체는 인체에 주입되어 활성 산소종을 제거하고 산소를 생성할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 나노입자 구조체의 형성 방법은 다공성 지지체 및 나노입자를 형성하는 단계 및 상기 다공성 지지체와 상기 나노입자를 결합시키는 단계를 포함하고, 상기 나노입자는 망간 페라이트 나노입자 및 세리아 나노입자를 포함한다.
상기 다공성 지지체는 메조포러스 실리카 나노입자를 포함할 수 있다.
상기 나노입자 구조체의 형성 방법은 상기 다공성 지지체에 약물을 로딩하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 다공성 지지체는 아민-작용화되고, 상기 나노입자는 BMPA(2-Bromo-2-methylpropionic acid)-캡핑되며, 상기 다공성 지지체와 상기 나노입자를 결합시키는 단계는, 상기 아민-작용화된 다공성 지지체와 상기 BMPA-캡핑된 나노입자를 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 나노입자 구조체는 생체에 주입되어 질병 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 류마티스 관절염에 대한 MFC-MSN의 치료 메커니즘을 나타낸다.
도 2는 MFC-MSN의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 3은 MSN에서 망간 페라이트 나노입자 및 세리아 나노입자의 컨쥬게이션을 나타내는 MFC-MSN의 STEM 이미지 및 EDX 맵핑 이미지를 나타낸다.
도 4는 MFC-MSN의 N2 흡착/탈착 등온선을 나타내고, 삽입도는 MFC-MSN의 기공 크기 분포를 나타낸다.
도 5는 RITC-라벨링된 MSN 및 MFC-MSN의 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 MSN 및 MFC-MSN 수에 따른 유체 역학적 크기 분포를 나타낸다.
도 7은 pH 7.4에서 MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN의 존재 하에서의 H2O2 분해 곡선을 나타낸다.
도 8은 생리학적 조건 하에서 MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN의 존재 하에 1M H2O2 용액에서 O2 생성 곡선을 나타낸다.
도 9는 MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN의 존재 하에 O2가 생성되는 이미지를 나타낸다.
도 10은 MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN의 SOD 활성을 나타낸다.
도 11은 H2O2의 존재 하에 MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN의 시간-의존적 하이드록실 라디칼 생성을 나타낸다.
도 12는 MFC-MSN의 시너지적 O2 생성 및 활성 산소종 제거의 메커니즘을 나타낸다.
도 13은 쥐 BMDM에서 RITC-표지된 MFC-MSN의 세포 내재화를 보여주는 CLSM 이미지를 나타낸다.
도 14는 24시간 동안 다양한 농도로 C-MSN, MF-MSN 또는 MFC-MSN과 함께 인큐베이션한 후 MTS 분석에 의해 결정된 BMDM 생존력을 나타낸다.
도 15는 배지에서 H2O2의 존재 하에 MF-MSN, C-MSN 또는 MFC-MSN과 함께 인큐베이션된 BMDM에서의 CLSM 이미지 및 세포 내 H2O2(녹색)의 상응하는 형광 강도를 나타낸다.
도 16은 MF-MSN, C-MSN 또는 MFC-MSN으로 4시간 동안 전처리한 후 저산소성(1% O2) 및 염증성(+LPS) 조건 하에서 4시간 동안 인큐베이션한 BMDM의 HIF-1α(녹색) 염색을 나타낸다.
도 17은 다양한 조건 하에서 BMDM에서 HIF1-α, M1(iNOS, IL-1β 및 Cox-2) 및 M2(Arg-1) 대식세포 마커의 단백질 발현을 나타낸다.
도 18은 다양한 조건 하에서 BMDM에서의 M1 및 M2 대식세포 마커의 mRNA 발현을 나타낸다.
도 19는 MFC-MSN의 관절 내 주입 전후 무릎 관절에서 sO2(빨간색)를 보여주는 광음향 이미지를 나타낸다.
도 20은 주입 3일 후 무릎 관절에서 대식세포-특이적 F4/80 항체로 표지된 활막 대식세포에 의한 MFC-MSN의 흡수를 보여주는 CLSM 이미지를 나타낸다.
도 21은 MFC-MSN의 주입 30일 후 무릎 관절 활막 및 대퇴골에서의 HIF-1α(적색) 발현의 억제를 나타낸다.
도 22는 주입 30일 후 활막에서 M1(Cox-2; 적색) 및 M2(CD206; 녹색) 대식세포 마커의 면역 조직 화학적 분석을 나타낸다.
도 23은 주입 30일 후 활막 조직에서 HIF-1α, M1 및 M2 대식세포 마커의 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸다.
도 24는 류마티스 관절염 유도된 쥐 모델에서 치료 후 다양한 시점에서의 좌측 뒷발의 열 화상 이미지를 나타낸다.
도 25는 류마티스 관절염 유도된 쥐 모델에서 치료 후 다양한 시점에서의 좌측 뒷발의 발 온도를 나타낸다.
도 26은 류마티스 관절염 유도된 쥐 모델에서 치료 후 다양한 시점에서의 발 폭을 나타낸다
도 27은 류마티스 관절염 유도된 쥐 모델에서 치료 후 다양한 시점에서 70cm 빔을 가로지르는 데 필요한 시간을 나타낸다.
도 28은 류마티스 관절염 유도된 쥐 모델에서 치료 30일 후 류마티스 관절염 무릎 관절의 조직학적 및 면역 조직 화학적 평가를 나타낸다.
이하, 실시예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예들을 통해 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서, 이하의 실시예들에 의하여 본 발명이 제한되어서는 안 된다.
류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA)의 공동 활막에서 침윤된 면역 세포로의 O2 공급 부족은 저산소증-유도 인자(HIF-1α) 발현을 상향 조절하고 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성을 유도하여, 둘 다 활막 염증을 악화시킨다. 전-염증성 M1 대식세포를 제거하고 항-염증성 M2 대식세포를 유도함으로써 류마티스 관절염에서의 활액 염증을 해결할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 나노입자 구조체는 망간 페라이트 및 세리아 나노입자 고정 메조포러스 실리카 나노입자(manganese ferrite and ceria nanoparticle-anchored mesoporous silica nanoparticles, MFC-MSN)를 포함한다.
MFC-MSN는 류마티스 관절염 치료를 위해 M1 대식세포 수준을 감소시키고 M2 대식세포를 유도하기 위해 시너지적으로 활성 산소종을 제거하고 O2를 생성할 수 있다.
MFC-MSN은 O2 생성 및 활성 산소종 제거에 시너지 효과를 나타낸다. 이는 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서 M1 대 M2 대식세포의 효율적인 분극화를 유도하면서, Fenton 반응 중 O2 생성 과정에서 망간 페라이트 나노입자에 의해 생성된 중간 하이드록실 라디칼을 제거할 수 있는 세리아 나노 입자의 상보적 반응에 기인한다.
쥐의 류마티스 관절염 모델에 대한 MFC-MSN의 관절 내 투여는 관절의 저산소증, 염증 및 병리학적 특징을 완화시켰다. 메조포러스 실리카 나노입자(MSN)는 약물 전달 수송체로서 사용되어, 류마티스 약물 메토트렉세이트를 지속적으로 방출하여 MFC-MSN의 치료 효과를 증대시켰다.
류마티스 관절염의 발병 기전은 명확하게 밝혀지지 않았지만, 메커니즘은 관절을 공격하는 원치않는 면역 반응을 포함한다. 대식세포, 수지상 세포, T 및 B 림프구, 호중구 및 자연 킬러 세포를 포함한 염증성 세포는 류마티스 관절염 관절 활막에 침투하여 관절 뼈와 연골의 심각한 파괴에 기여한다. 특히, 대식세포는 류마티스 관절염에서 병리생리학적 반응에서 핵심적인 역할을 한다.
대식세포는 전-염증성(M1) 표현형 및 항-염증성(M2) 표현형의 2가지 상이한 표현형이 존재한다. M1 대식세포는 염증의 초기 단계에서 우세하며, IL-1β 및 TNF-α와 같은 전-염증성 사이토 카인을 분비함으로써 염증을 유발한다. 대조적으로, M2 대식세포는 항-염증성 사이토카인을 분비하고 염증을 줄인다. 류마티스 관절염 관절의 대식세포는 주로 M1 표현형이며, 다양한 염증성 사이토카인을 방출함으로써 류마티스 관절염 진행을 촉진시킨다.
류마티스 관절염 관절에서 저산소증-유도 인자(HIF-1α) 발현 및 활성 산소종(ROS)은 활막 염증을 유도하고 대식세포 서브 타입의 균형에 영향을 미친다. 저산소증은 주로 섬유 아세포 유사 활막 세포 증식증 및 침윤된 염증 세포의 증가된 산소 요구를 통해 류마티스 관절염 활막에서 유도된다. 저산소증은 류마티스 관절염에서 HIF-1α를 상향 조절하며, 이는 활성 산소종 생성 또는 다른 경로를 통해 대식세포의 M1 서브 타입으로의 분극을 유도한다. 따라서, HIF-1α의 억제는 M1 표현형을 약화시키고, 대식세포의 M2 분극을 강화시키며, 류마티스 관절염을 효과적으로 개선할 수 있다.
세리아 나노입자는 활성 산소종을 근절함으로써 대식세포의 M2 분극화를 유도할 수 있다. HIF-1α 및 활성 산소종의 동시 억제는 전-염증성 M1 대식세포의 표현형 전이를 류마티스 관절염 치료를 위한 항-염증성 M2 서브 타입으로 이동시킨다. 망간 페라이트 나노입자는 펜톤 반응을 통해 저산소 상태를 완화시켜 HIF-1α와 같은 저산소 마커를 하향 조절한다. 세리아 나노입자는 다양한 염증성 질환에 대하여 활성 산소종을 제거할 수 있다.
세리아 나노입자의 촉매 특성은 나노입자 표면에 2개의 가역적 산화 상태(Ce3+ 또는 Ce4 +)가 존재하는 것에 기인한다. 그러나, 높은 농도의 나노입자는 세포 독성을 유발할 수 있다. 망간 페라이트 나노입자의 과도한 농도는 하이드록실 라디칼이 펜톤 반응의 중간체로서 생성되기 때문에 세포 독성 및 산소 생성 효능의 감소를 초래할 수 있다. 세리아 나노입자는 세포 독성 가능성과 관련하여 임상적 번역을 방해할 수 있으므로 생체 의학 분야에서는 효율을 높여 나노입자 선량을 줄이는 것이 필요하다. 망간 페라이트 나노입자 및 세리아 나노입자는 중간 활성 산소종의 효율적인 제거를 통해 O2 생성에 시너지 효과를 나타내어 비교적 낮은 나노입자 농도에도 대식세포의 M2 분극화를 유도할 수 있다.
MFC-MSN은 류마티스 관절염 모델에서 대식세포의 M2 분극화를 위해 효율적으로 활성 산소종을 제거하고 O2를 생성한다(도 1). 골수 유래 대식세포(bone marrow-derived macrophages, BMDM)를 이용한 시험 관내 실험에서, MFC-MSN으로 처리한 후 HIF-1α 발현의 억제 및 M2 분극화를 관찰하였다. 또, DMARD인 메토트렉세이트(MTX)가 지속적인 방출 및 효율적인 류마티스 관절염 치료를 위해 MSN에 로딩되었다. MTX-로딩된 MFC-MSN가 생체 내 류마티스 관절염 쥐 모델에서 큰 치료 잠재력을 보여주었다.
[MFC-MSN의 제조 및 특성]
MFC-MSN은 메조포러스 실리카 나노입자(MSN)에 친핵성 치환 반응에 의해 3nm 크기의 세리아 나노입자 및 6nm 크기의 망간 페라이트 나노입자를 로딩하는 것에 의해 형성된다. 세리아 및 망간 페라이트 나노입자의 크기는 투과 전자 현미경(TEM)에 의해 확인된다.
ICP-AES(Inductively coupled plasma atomic emission spectrometer) 분석은 망간 및 철 이온 대 세륨 이온의 중량비가 약 1.0임을 나타낸다. 80μg의 이온을 1mg의 메조포러스 실리카 나노입자의 표면에 접합시킨다. 메조포러스 실리카 나노입자에 대한 망간 페라이트 나노입자 및 세리아 나노입자의 컨쥬게이션(conjugation)은 MFC-MSN의 TEM에 의해 확인된다(도 2).
EDX(energy-dispersive X-ray spectroscopy) 분석을 통해 메조포러스 실리카 나노입자 표면에서 망간, 철 및 세륨 이온이 관찰된다(도 3). 질소 흡착-탈착 실험에 따르면 MFC-MSN은 320.19m2/g의 BET(Bruneter-Emmett-Teller) 표면적과 3.80nm의 중간 기공 크기를 갖는다(도 4). 팽윤제, 메시틸렌(mesitylene)을 반응 혼합물에 첨가하여 효과적인 약물 흡수를 위해 큰 기공 크기의 메조포러스 실리카 나노입자를 합성하였다.
로다민 B 이소티오시아네이트(Rhodamine B isothiocyanate, RITC)를 형광 표지를 위해 MSN에 병합시켰으며, 이는 UV-Vis(ultraviolet-visible) 및 PL(photoluminescence) 분광법(도 5)에 의해 검증되었다. 생의학 적용을 위해, 생체 내 조건에서 비특이적 단백질 흡착을 피하기 위해 나노입자의 표면을 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 코팅하였다. 유체 역학적 크기는 망간 페라이트 나노입자 및 세리아 나노입자와의 컨쥬게이션 후 MSN의 67.3±1.3nm에서 PEG화된 MFC-MSN의 80.8±2.2nm로 증가하였다(도 6).
[MFC-MSN의 시너지적 O2 생성 및 활성 산소종 제거]
MFC-MSN의 촉매 특성을 망간 페라이트 나노입자 고정 MSN(MF-MSN) 및 세리아 나노입자 고정 MSN(C-MSN)의 촉매 특성과 비교하여 망간 페라이트 나노입자와 세리아 나노입자의 시너지 효과를 조사하였다. 생리적 조건(pH 7.4) 하에서 시간-의존적 H2O2 분석에서, 31.6% 및 20.5%의 H2O2가 3시간 후에 MF-MSN 및 C-MSN에 의해 각각 분해되었다(도 7). 그러나, 대부분의 H2O2는 단지 1.5시간 후에 동일한 농도의 MFC-MSN에 의해 분해되었다. 용존 산소값이 증가하고 O2 기포 수가 증가함에 따라 MF-MSN 및 C-MSN에 비해 pH 7.4에서 MFC-MSN의 O2 생성 기능이 크게 향상되었다(도 8 및 도 9).
이러한 결과는 망간 페라이트 나노입자 및 세리아 나노입자가 H2O2 분해 및 O2 생성에 시너지 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 또, MF-MSN과 C-MSN의 혼합물은 MFC-MSN과 비교하여 H2O2 분해 및 O2 생성에 대해 시너지 효과를 거의 나타내지 않았으며, 이는 망간 페라이트 나노입자와 세리아 나노입자 사이의 짧은 거리가 시너지 효과에서 핵심적인 역할을 한다는 것을 의미한다.
이 시너지 효과를 이해하기 위해, 세포 내 H2O2 대사 경로에서 중간체인 수산화 라디칼과 과산화물 음이온의 농도 변화를 조사하였다. 먼저, pH 7.4에서 SOD(superoxide dismutase) 분석을 사용하여 나노입자의 수퍼 옥사이드 음이온 분해 능력을 평가하였다. MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN의 SOD 활성은 각각 64.9±1.0%, 19.4±13.4% 및 79.2±2.2%였다. 모든 나노입자는 SOD 활성을 갖지만, 망간 페라이트 나노입자 및 세리아 나노입자에 대해 SOD 활성에 대한 시너지 효과는 관찰되지 않았다(도 10).
pH 7.4에서 H2O2를 첨가한 후 나노입자의 존재 하에서의 하이드록실 라디칼 생성을 평가하였다. MF-MSN이 펜톤 반응의 중간체로서 하이드록실 라디칼을 생성한다(도 11). 특히, MFC-MSN은 하이드록실 라디칼을 생성하지 않았는데, 이는 세리아 나노입자가 망간 페라이트 나노입자에 의해 생성된 이러한 라디칼을 제거하는 것을 나타낸다.
따라서, 효율적인 H2O2 분해 및 O2 생성에 대한 시너지 효과가 망간 페라이트 나노입자의 펜톤 반응 동안 세리아 나노입자에 의해 하이드록실 라디칼을 O2 분자로 전환시키는 것에 기인한다(도 12). 또, MFC-MSN에 의한 O2 생성이 염증 조건에서 H2O2의 세포 내 농도인 100μM과 같은 낮은 H2O2 농도에서도 발생한다.
또, 24시간 후 염증 생리학적 조건 하에서 MFC-MSN의 안정성을 나타내는 ICP-MS 분석에 의해 결정된 바와 같이 무시할만한 양의 Mn, Fe 및 Ce 이온만이 침출되었다.
[MFC-MSN의 시험 관내 활성 산소종 제거 및 저산소증 약화 능력]
쥐에서 분리된 BMDM을 사용하여 체외 실험을 수행하였다. RITC-표지된 MFC-MSN과 24시간 배양한 후 CLSM(confocal laser scanning microscopy)은 BMDM에 의한 MFC-MSN의 효율적인 세포 흡수를 보여주었다(도 13). 유동 세포 계측법 분석은 또한 농도 의존적 방식으로 MFC-MSN과 함께 배양한 후 세포의 형광 강도가 증가함을 보여주었다.
또, MFC-MSN은 MTS 분석에 의해 측정된 바와 같이, 최대 55㎍/mL의 농도에서 24시간 동안 세포 독성을 나타내지 않았다(도 14). 따라서, 55㎍/mL 미만의 MFC-MSN 농도에서 후속 시험 관내 실험이 수행되었다.
체외 조건에서 MFC-MSN의 활성 산소종 제거 효과를 평가하기 위해, 먼저 세포 내 H2O2 분석 키트를 사용하여 세포 내 H2O2 수준을 평가하였다(도 15). MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN로 전처리된 BMDM을 1시간 동안 100μM H2O2와 배양한 후, 형광 강도를 통해 세포 내 H2O2 수준을 측정하였다. MFC-MSN은 대조군보다 세포 내 H2O2를 보다 효율적으로 분해하였으며, 이는 이전 결과와 일치하여 MFC-MSN의 시너지 H2O2 분해능을 보여주었다(도 7).
하이드록실 라디칼에 민감한 활성 산소종 지표인 HPF(3'-(p-hydroxyphenyl) fluorescein)을 사용하여 하이드록실 라디칼의 세포 내 농도를 평가하였다. MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN로 전처리된 BMDM을 100μM H2O2로 처리한 후, HPF의 형광 강도를 평가하였다. C-MSN 또는 MFC-MSN으로 전처리된 BMDM은 H2O2-처리된 대조군과 비교하여 형광 강도가 유의하게 감소되어 세리아 나노입자가 세포 내 하이드록실 라디칼을 효과적으로 제거할 수 있음을 확인하였다.
MFC-MSN의 저산소증 약화 능력을 확인하기 위해, HIF-1α 발현 수준을 평가하였다. MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN으로 전처리한 후, BMDM을 저산소 및 염증 조건 하에서 4시간 동안 배양하였으며, 이는 저산소 분위기(1% O2, 5% CO2 및 94% N2) 및 0.2㎍/mL 리포폴리사카라이드(LPS)의 첨가에 의해 달성되었다. 저산소증 및 LPS는 HIF-1α 발현을 상향 조절하였으며, 이는 MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN으로 처리함으로써 약화되었다(도 16). HIF-1α 발현 수준의 감소는 MFC-MSN에서 가장 두드러졌으며, 이는 MFC-MSN에 의한 O2의 시너지 생성을 의미한다.
[MFC-MSN에 의해 유도된 BMDM의 시험 관내 M1의 M2 표현형 전이]
MFC-MSN과의 배양 후 BMDM의 체외 M1의 M2 표현형 전이를 평가하였다. 웨스턴 블롯 분석은 HIF-1α 및 iNOS, IL-1β 및 Cox-2를 포함하는 전-염증성 M1 마커의 단백질 발현이 저산소증 및 LPS 처리 후 현저하게 증가하였음을 보여주었다(도 17). HIF-1α 및 M1 마커의 발현 수준은 유사한 경향을 나타내었고, 이는 HIF-1α가 활성화된 대식세포의 염증 거동에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
특히, MFC-MSN으로 처리하는 것은 HIF-1α 및 전-염증성 M1 마커의 발현 수준을 현저하게 감소시켰다. 대표적인 M2 마커인 아르기나제-1(Arg-1)의 발현 수준은 다른 그룹의 것에 비해 MFC-MSN으로 처리된 BMDM에서 유의하게 증가하였다. BMDM의 qRT-PCR 분석은 저산소증 및 LPS 처리가 iNOS, IL-6 및 TNF-α를 포함하는 M1 마커의 mRNA 발현 수준을 증가시켰음을 보여주었다(도 18).
유사하게, MFC-MSN 처리는 M1 마커의 mRNA 발현 수준을 상당히 감소시켰다. 대조적으로, Arg-1, CD206 및 IL-10을 포함하는 항-염증성 M2 마커는 MFC-MSN 처리 후에 현저하게 증가하였다. 망간 페라이트 나노입자 및 세리아 나노입자는 또한 대식세포 분극화 효과를 보였지만 MFC-MSN의 경우보다 적었다. 시너지적으로 활성 산소종을 제거하고 O2를 생성하는 MFC-MSN에 의해 대식 세포의 성공적인 M1의 M2 표현형 전이가 확인된다.
[쥐 류마티스 관절염 모델에서 활막 대식세포의 산소 생성 및 M2 분극화]
류마티스 관절염 치료를 위한 MFC-MSN의 생체 내 효과를 조사하기 위해, 완전한 프로윈트 아주반트(Freund's adjuvant)의 피내 주입을 통해 쥐 아주반트 유도 관절염(adjuvant-induced arthritis, AIA) 모델을 확립하였다. 만성 염증 및 연골 및 뼈 파괴를 포함하는 인간 류마티스 관절염의 중요한 병리학적 특징이 AIA 모델에서 공유되고 있다.
쥐 AIA 모델을 사용하여, 먼저 광음향 이미징(photoacoustic imaging)을 사용하여 저산소 무릎 관절의 혈액에서 헤모글로빈 산소 포화(sO2)를 시각화하였다(도 19). MFC-MSN의 관절 내 주사는 sO2 수준을 17.0±0.7%에서 22.9±1.2%로 즉시 증가시켰다. 이 결과는 저산소 환경에서 MFC-MSN이 즉각적이고 효율적으로 O2를 생성할 수 있음을 보여준다.
주입 하루 후, 활막 조직을 절제하여 MFC-MSN의 세포 내 경로를 추적하였다 (도 20). 대식세포-특이적 F4/80 항체로 염색된 활막 조직의 CLSM 이미지는 대식세포에서 MFC-MSN의 세포 내 축적을 나타내는데, 이는 다른 면역 세포와 비교하여 이물질에 대한 그들의 강력한 식작용 능력에 기인한 것으로 보인다.
MFC-MSN에 의해 생성된 O2가 류마티스 관절염 무릎 관절의 저산소증을 완화시키는지 여부를 확인하였다. 활막 조직 및 대퇴골에서 HIF-1α에 대한 면역 조직 화학적 염색은 MFC-MSN의 주입이 활막 조직 및 뼈 조직 둘 다에서 HIF-1α 발현을 성공적으로 약화시켰다는 것을 나타낸다(도 21). 또, 활성 산소종 제거기 및 O2 발생기로서 작용하는 MFC-MSN은 류마티스 관절염 무릎 관절에서 M1에서 M2 표현형으로 활막 대식세포의 표현형 변경을 유도하였다(도 22 및 도 23).
Cox-2, TNF-α 및 iNOS와 같은 M1 대식세포 특이적 바이오마커는 류마티스 관절염을 유도한 후에 증가한 반면, MFC-MSN 주입은 그 수준을 현저하게 감소시켰다. 류마티스 관절염은 또한 대식세포 침윤으로 인해 M2 마커의 발현을 자극하였으나, MFC-MSN의 주입은 추가로 항-염증성 M2 마커를 상향 조절하였다. 결과적으로, MFC-MSN은 즉시 헤모글로빈 sO2 수준을 증가시켜 류마티스 관절염 활액 관절 주위의 저산소증을 완화시키고, 대식세포 표현형을 전-염증성 M1에서 항-염증성 M2 서브타입으로 변경시켰다.
[류마티스 관절염에 대한 MTX-로딩된 MFC-MSN의 생체 내 치료 효과]
지속적인 통합 약물 방출을 가능하게 하는 MSN의 고유한 특성에 기초하여, MFC-MSN이 치료 효과를 증대시키기 위해 항-류마티스 약물 MTX를 전달할 수 있는지 여부를 조사하였다. 고농도 MTX의 반복 주입으로 인한 신속한 제거 및 심각한 세포 독성을 방지하기 위해 저용량 MTX의 지속적인 방출은 류마티스 관절염 치료에 매우 유리하다. MTX의 로딩 용량 및 로딩 효율은 각각 10.4㎍/mg 및 20.8%였다. MTX의 방출 프로파일에서 볼 수 있듯이 MTX의 약 60%가 7일 동안 천천히 방출되어 지속적인 방출을 보여준다.
류마티스 관절염에서의 염증 및 저산소증이 발의 고열 및 부종을 야기함에 따라, 열 화상 측정은 MFC-MSN 또는 MTX-로딩된 MFC-MSN의 투여 후 발 온도 및 부종을 평가하는데 사용되었다. 30일 후 PBS 처리군에서 발 온도와 폭이 각각 약 37% 및 약 120% 증가하였다(도 24). 대조적으로, 고열 및 발 부종은 MFC-MSN으로 처리된 쥐에서 급격히 감소하였고 MTX-로딩된 MFC-MSN 처리 후에 추가로 감소하였다(도 25 및 도 26). 그러나, MFC-MSN에 로딩된 것과 동일한 용량으로 유리 MTX의 주입은 MTX의 빠른 제거로 인해 류마티스 관절염에 대한 치료 효과를 나타내지 않았다. 또, 70cm 빔을 가로지르는 데 필요한 시간을 결정하여 다른 치료를 받은 류마티스 관절염 쥐에 대한 행동 테스트를 수행하였다. MFC-MSN 또는 MTX-로딩된 MFC-MSN을 주입한 쥐는 PBS 또는 MTX-주입된 그룹에 비해 현저히 감소된 시간을 보였다(도 27).
MFC-MSN 및 MTX-로딩된 MFC-MSN의 치료 효과는 조직학적 및 면역 조직 화학 분석에 의해 추가로 평가되었다(도 28). 심각한 류마티스 관절염 연골 파괴, 활액 염증(synovitis) 및 저산소증에 대한 응답으로서의 자극된 혈관신생으로 이러한 류마티스 관절염 유발 병리학 특징을 평가하였다. 무릎 관절의 사프라닌-O 염색은 PBS 주입 그룹에서 연골의 완전한 파괴를 보여주었다. 대조적으로, MFC-MSN 또는 MTX-로딩된 MFC-MSN의 주입은 연골 구조의 효율적인 보존을 보여주었다. Mankin의 점수가 연골 구조의 정량화에 적용되었다. 또, H&E 염색에 의해 평가된 바와 같이 MFC-MSN 및/또는 MTX-로딩된 MFC-MSN 주입 그룹에서 활막염이 현저하게 감소하였다. 또, MFC-MSN 또는 MTX-로딩된 MFC-MSN으로 처리한 후 염증 세포의 수가 현저히 감소하였다.
마지막으로, 산소 공급을 증가시키기 위해 저산소증에 의해 유발되는 전형적인 반응인 혈관신생을 폰 빌레브란트 인자(vWF)로 혈관의 면역 조직 화학 염색에 의해 분석하였다. vWF-양성 혈관의 CLSM 및 정량화는 MFC-MSN 또는 MTX-로딩된 MFC-MSN의 주입이 무릎 관절의 혈관 형성을 현저하게 감소시켰음을 나타낸다.
치료 동안, 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 혈액 우레아 질소(BUN) 및 크레아티닌을 포함하는 혈액 내 주요 간 기능 마커 및 체중을 모니터링하여 MTX-로딩된 MFC-MSN이 쥐 건강에 부정적인 영향을 미치는지 평가하였다. 건강한 쥐와 비교하여 체중 및 혈액 수준의 유의한 변화가 관찰되지 않았으며, MTX-로딩된 MFC-MSN의 독성은 무시할 수 있다.
전반적으로, MTX-로딩된 MFC-MSN에서 망간 페라이트, 세리아 및 MTX가 시너지적이며 류마티스 관절염에 대해 최적의 치료 효과를 나타낸다.
상술한 바와 같이, MFC-MSN은 활성 산소종을 제거하고 O2를 생성하여 류마티스 관절염 무릎 관절에서 대식세포의 M1에서 M2로의 분극화를 유도하여 염증을 완화시킬 수 있다. 망간 페라이트 및 세리아 나노입자의 시너지 효과는 세리아 나노입자의 하이드록실 라디칼 소거 효과에 기인하며, 이에 의해 망간 페라이트 나노입자에 의해 생성된 중간 라디칼은 O2를 생성할 수 있다. MFC-MSN은 시험 관내 및 생체 내 모두에서 저산소 성 및 염증성 조건 하에서 M1에서 M2 대식세포의 분극화를 유도할 수 있다.
류마티스 관절염 쥐에 대한 MFC-MSN의 관절 내 주입은 염증이 있는 활액 관절을 산소화하여, HIF-1α를 하향 조절하고 M1에서 M2 대식세포의 분극화를 통해 염증을 약화시킨다. MFC-MSN을 이용한 항-류마티스 약물 전달은 류마티스 관절염을 더욱 완화시킨다. MFC-MSN은 심근 경색과 같은 다른 저산소증 관련 염증성 질환의 치료를 위한 염증 완화제 및 M2 대식세포 자극제로 적용될 수 있다.
[실시예 및 분석예]
[6nm 크기의 망간 페라이트 나노입자의 합성]
6nm 크기의 망간 페라이트 나노입자는 망간 올레에이트 및 철 올레에이트 착물의 열분해를 통해 합성되었다. 철 올레에이트 착물은 염화철 40mmol 및 올레산 나트륨 120mmol을 탈이온수 60mL, 에탄올 80mL 및 n-헥산 140mL에 용해시켜 제조하였다. 올레인산 철 착물의 합성 과정에서 염화철 대신 염화 망간을 대체하여 망간 올레에이트 착물을 제조하였다.
제조된 용액을 70℃로 가열하고 4시간 동안 교반하였다. 상부 유기층을 분리하고, 회전 증발기를 사용하여 용매를 증발시켜 금속 올레에이트 착물을 얻었다. 망간 페라이트 나노입자의 합성을 위해, 1-옥타데센 10g에 올레산 망간 0.67mmol, 올레산 철 1.33mmol 및 올레산 4mmol을 용해시켰다. 진공 하에서 탈기한 후, 혼합물을 3.3℃/min의 일정한 가열 속도로 320℃로 가열하고 1시간 동안 숙성시켰다. 생성된 나노입자를 에탄올로 수회 세척하고 클로로포름에 분산시켰다.
[3nm 크기의 세리아 나노입자의 합성]
1mmol의 세륨(III) 아세테이트 및 12mmol의 올레일 아민을 15mL의 크실렌에 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고 90℃로 가열하였다. 1mL의 탈이온수를 용액에 첨가한 후 생성된 용액을 90℃에서 3시간 동안 숙성시키고 실온으로 냉각시켰다. 세리아 나노입자를 에탄올로 수회 세척하고 클로로포름에 재분산시켰다.
[BMPA-캡핑된 망간 페라이트 나노입자 및 세리아 나노입자의 합성]
BMPA-캡핑된 망간 페라이트 나노입자의 합성을 위해, 0.5g의 BMPA(2-Bromo-2-methylpropionic acid), 0.05g의 시트르산 및 15mg의 올레산 캡핑된 망간 페라이트 나노입자를 클로로포름 및 DMF의 혼합물에 용해시켰다(50/50 v/v, 15mL). 유사하게, BMPA-캡핑된 세리아 나노입자는 0.25g의 BMPA, 0.025g의 시트르산, 15mg의 세리아 나노입자를 클로로포름 및 DMF의 혼합물에서 혼합함으로써 합성되었다. 혼합물을 밤새 교반한 다음 원심 분리하여 과량의 리간드를 제거하였다. BMPA-캡핑된 나노입자를 메조포러스 실리카 나노입자에 컨쥬게이션시키기 위해 에탄올에 분산시켰다.
[RITC 및 아민 작용기를 포함하는 큰 기공 크기의 메조 포러스 실리카 나노입자(MSN)의 합성]
2g의 CTAC(cetyltrimethylammonium chloride), 0.08g의 트리에탄올 아민을 20mL의 탈이온수에 용해시킨 후 격렬히 교반하면서 95℃에서 가열하였다. 1시간 후 1.5mL의 메시틸렌, 1.5mL의 TEOS 및 제조된 0.15mL의 APTES((3-Aminopropyl)triethoxysilane)-RITC를 혼합물에 첨가하고 추가로 1시간 동안 숙성시켰다. 생성물을 원심 분리로 수집하고 에탄올로 여러번 세척하였다. CTAC를 질산 암모늄(메탄올 중 60mg/mL) 처리로 3회 제거하였다. 아민-작용화된 MSN을 합성하기 위해 0.15mL의 APTES를 MSN에 첨가하고, 70℃로 가열하고 3시간 동안 숙성시켰다. 에탄올로 수회 세척하여 최종 생성물을 수득하였다.
[MFC-MSN, MF-MSN 및 C-MSN의 합성]
20mg의 아민-작용화된 MSN을 15mg의 BMPA-캡핑된 망간 페라이트 나노입자 및 15mg의 BMPA-캡핑된 세리아 나노입자에 첨가하고 밤새 실온에서 교반하였다. MF-MSN 및 C-MSN은 각각 15mg의 망간 페라이트 나노입자 및 60mg의 세리아 나노입자를 사용하여 합성되었다. 생성물을 에탄올 및 물로 수회 세척한 후, 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 숙신 이미딜글루타레이트(mPEG-SG) 및 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 아민(mPEG-AM)을 사용하여 PEG로 코팅하였다. 생성된 MFC-MSN, MF-MSN 및 C-MSN을 5mL의 탈이온수에 재분산시켰다.
[MTX 로딩 및 방출 테스트]
탈이온수에 1mL의 MFC-MSN 및 1mL의 0.2mg/mL MTX를 혼합하고 실온에서 밤새 교반하여 MTX를 로딩하였다. 과량의 MTX는 탈이온수로 여러 번 세척함으로써 제거되었다. 원심 분리 후 상층액의 305nm에서의 흡광도를 측정하여 7일까지 MTX의 방출 프로파일을 얻었다.
[MFC-MSN의 특성]
200kV에서 작동되는 JEOL EM-2010 현미경을 사용하여 TEM 분석을 수행하였다. ICPS-7500 분광계(Shimadzu)를 사용하여 유도 결합 플라즈마 원자 방출 분광법(ICP-AES)에 의해 망간, 철 및 세리아를 포함한 금속 이온 농도를 분석하였다. 나노입자의 유체 역학적 크기는 동적 광 산란 기구(Malvern)를 사용하여 측정되었다. MFC-MSN의 BET(Brunauer-Emmett-Teller) 표면적 및 기공 크기는 3Flex 표면 특성 분석기 (Micrometritics)를 사용하여 77K에서 질소 흡착에 의해 측정되었다. MSN의 RITC 라벨링은 UV-Vis 분광 광도계(Agilent Technologies)를 사용하여 확인되었다. MTX 로딩은 또한 305nm에서 MTX의 고유 흡광도를 측정함으로써 UV-Vis 분광 광도법에 의해 입증되었다. PL 분광 광도법(Agilent Technologies)을 사용하여 MSN에서 RITC의 성공적인 라벨링을 조사하였다.
[H2O2 분해 분석]
2.5mM의 H2O2와 60μg/mL의 망간 페라이트 및 세리아를 포함하는 MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN을 PBS에서 실온에서 혼합하였다. 상기 용액 50μL를 50mL의 탈이온수 중 1.33mL의 24% Ti(SO4)2 8.33mL의 H2SO4를 포함하는 Ti(SO4)2 용액 100μL에 첨가하고, 3시간까지 30분마다 첨가하였다. 반응이 완료된 후 405nm에서 용액의 흡광도를 측정하여 H2O2 농도를 평가하였다.
[O2 생성 분석]
1M의 H2O2 와 150㎍/mL의 망간 페라이트 나노입자 및 세리아 나노입자를 포함하는 MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN을 실온에서 20mL의 PBS에 혼합하고 용존 산소 측정기(HI9136, HANNA instrument, Korea)를 사용하여 5분마다 O2 농도를 측정하였다. 에펜도르프 튜브(Eppendorf Tube)에서 O2 기포를 관찰하기 위해, 1M의 H2O2와 75μg/mL의 망간 페라이트 나노입자 및 세리아 나노입자를 포함하는 MF-MSN, C-MSN, MFC-MSN을 1시간까지 혼합하고 모니터링하였다. MFC-MSN의 O2 생성 능력은 또한 PBS에서 Ar 취입 및 100μM의 H2O2 첨가에 의해 달성된 저산소성 및 염증성 조건 하에서 평가되었다.
[SOD 모방 촉매 활성]
제공된 프로토콜에 따라 SOD 분석 키트(Sigma Aldrich)를 사용하여 MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN의 SOD 모방 촉매 활성을 조사하였다. 19mL의 완충액으로 1mL의 WST 용액을 희석하여 WST(수용성 테트라 졸륨 염) 작업 용액을 제조하고, 2.5mL의 희석 완충액으로 15μL의 효소 용액을 희석하여 효소 작업 용액을 제조하였다. SOD 활성은 과산화물 음이온으로 환원시 수용성 포르마잔 염료를 생성하는 WST의 독특한 특성을 이용하여 계산되었다. WST 작업 용액 및 효소 작업 용액을 최종 농도 300μg/mL로 MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN에 첨가한 후 실온에서 20분 동안 완전히 혼합 및 배양하였다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서의 흡광도를 측정하고, 블랭크와 비교하여 억제율의 기울기를 측정하여 SOD 활성(%)을 계산하였다.
[하이드록실 라디칼 생성]
MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN에 의한 하이드록실 라디칼의 생성은 약간 변형된 프로토콜로 하이드록실 라디칼 항산화제 용량(HORAC) 분석법(Cell Biolabs, Inc.)을 사용하여 평가되었다. 플루오레세인 프로브(Fluorescein Probe)(100X)와 하이드록실 라디칼 개시제(Hydroxyl Radical Initiator)(5X)를 분석 희석제와 탈이온수로 각각 희석하여 1X 플루오레세인 용액과 1X 하이드록실 라디칼 개시제를 준비하였다. 20㎍/mL의 망간 페라이트 및 세리아를 포함하는 40μL의 MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN을 140μL의 1X 플루오레세인 용액과 혼합한 후 30분 동안 인큐베이션하였다.
20μL의 1X 하이드록실 라디칼 개시제를 나노입자와 펜톤 반응용 용액에 첨가하였다. 용액의 형광 강도는 마이크로 플레이트 리더(ex/em = 480/530)를 사용하여 2시간까지 30분마다 측정되었다. 하이드록실 라디칼 생성 속도는 HAT (hydrogen atom transfer) 공정을 통해 하이드록실 라디칼에 의한 형광 프로브의 산화 속도를 평가함으로써 계산되었다.
[BMDM의 준비]
쥐 골수 유래 대식세포(BMDM)를 분리하기 위해, 전술한 바와 같이 5주령 수컷 스프라그 다울리(SD) 쥐(한국 경기도 코아테크)의 대퇴골로부터 골수를 수집하였다. 먼저, 동물의 뒷다리를 수집하고 대퇴골을 노출시키기 위해 근육 조직을 제거하였다. 이어서 골을 골수 세포를 분리하기 위해 주사기를 사용하여 PBS로 플러싱하였다. 원심 분리 후, 수집된 골수 세포를 30%(v/v) L929 세포 조건 배지, 15%(v/v) FBS, 5%(v/v) 말 혈청 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 고-글루코스 DMEM으로 구성된 분화 배지에서 4일 동안 대식세포로 분화시켰다. 10%(v/v) FBS, 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 고-글루코스 DMEM에서 세포를 성장시킴으로써 L929 세포로부터 조건화된 배지를 제조하였다. 인큐베이션 4일 후, 대식세포 분화 배지를 버리고 세포 스크레이퍼를 사용하여 부착성 BMDM을 획득하였다.
[세포 흡수 및 세포 생존력 테스트]
RITC-표지된 MFC-MSN의 세포 흡수를 확인하기 위해, BMDM을 24시간 동안 MFC-MSN과 함께 인큐베이션한 후, NCIRF(National Center for Inter-University Research Facilities) 및 CLSM 분석에서 FACS AriaII를 사용하여 유세포 분석을 수행하였다. CLSM 분석을 위해, Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 세포 핵을 공동-염색시켰다. 세포 생존율은 MTS 세포 증식 분석(Promega)을 사용하여 평가되었다. BMDM을 MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN과 함께 24시간 동안 배양한 후 MTS 용액을 배지에 첨가하고 490nm에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 흡광도를 측정하였다.
[세포 내 H2O2 분석]
세포 내 H2O2 농도를 평가하기 위해, 세포 내 H2O2 분석(Sigma Aldrich)을 사용하였다. 100μM의 H2O2를 BMDM으로 처리하고, 40μg/mL의 MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN과 24시간 동안 사전 배양하였다. 1시간 후, 세포 배지를 분석 완충액으로 교체하고 세포 내 H2O2 농도를 CLSM(ex/em = 490/520)을 사용하여 측정하였다.
[세포 내 OH 라디칼 생성]
세포 내 하이드록실 라디칼 생성 능력은 하이드록실 라디칼에 민감한 활성 산소종 지시자인 3'-(p-하이드록시페닐) 플루오레세인(HPF, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 조사되었다. BMDM을 40㎍/mL의 MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN과 함께 24시간 동안 인큐베이션한 다음, 100μM의 H2O2와 함께 추가 1시간 동안 인큐베이션하였다. H2O2 함유 배지를 제거하고 5μM HPF 작업 용액으로 교체하였다. 30분 후 CLSM 분석을 사용하여 웰의 녹색 형광 강도를 조사하였다.
[HIF-1α 면역 염색]
HIF-1α 면역 염색은 MF-MSN, C-MSN 및 MFC-MSN 처리 후 저산소 조건 하에서 지질 다당류(LPS) 함유 배지에서 배양된 BMDM에서 수행되었다. 저산소 상태는 4시간 동안 1% O2, 5% CO2 및 94% N2 가스를 함유하는 저산소 챔버에서 배양함으로써 달성되었다. 40μg/mL의 MF-MSN, C-MSN, MFC-MSN과 함께 4시간 동안 사전 배양된 BMDM 세포를 저산소 조건 하에서 또 다른 4시간 동안 0.2μg/mL의 LPS 함유 배지에서 배양한 후, HIF-1α에 대항 1차 항체(Abcam) 및 Alexa Fluor 488-표지된 2차 항체(Abcam)로 염색하였다. 로다민 팔로이드(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 F-액틴을 공동-염색시켰다.
[qRT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석(qRT-PCR and western blot analysis)]
쥐 BMDM을 MSN, C-MSN, MF-MSN 및 MFC-MSN으로 4시간 동안 전처리 한 후, 광범위한 PBS 세척을 수행하였다. LPS(0.2㎍/mL)가 보충된 신선한 DMEM을 첨가하고 세포를 저산소 조건(1% O2, 5% CO2 및 94% N2)에서 배양하였다. 4시간 후 BMDM으로부터의 총 RNA 및 단백질을 각각 TRIzol®(Life Technologies, CA) 및 Cell Lysis Buffer®(Cell Signaling Technology, MA)로 추출하였다. 총 RNA의 농도는 NanoDrop 분광계(ND-2000, NanoDrop Technologies, Wilmington, DE)를 사용하여 측정하였다. 이어서 cDNA를 600ng의 총 RNA로 합성하였다.
qRT-PCR의 경우 TOPOneTM SYBR Green 프리믹스(Enzynomics, Daejeon, Korea)를 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, CA)에서 cDNA에 첨가하여 94℃에서 10초 동안, 60℃에서 15초 동안, 72℃에서 30초 동안 50 사이클로 증폭하였다. 웨스턴 블롯을 수행하기 위해, 단백질 농도의 측정을 위해 브래드포드 분석을 수행하였다.
이어서 단백질을 NuPAGE® LDS 샘플 완충액(Life Technologies, CA)과 혼합하고, 변성을 위해 95℃에서 3분 동안 비등시키고 12%(w/v) SDS-폴리아크릴아미드 겔에 로딩하였다. 80V에서 100분의 전기 영동 후, 단백질을 20V에서 50분 동안 Trans-Blot® SD 반건식 전기 영동 전달 셀(Bio-Rad)을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막(Bio-Rad, CA)으로 옮겼다. 특이적 결합에서, 막을 2시간 동안 5% 탈지유로 차단하였다. 막은 1차 항체, 4℃에서 밤새 HIF-1α (Novus Biologicals, CO), iNOS, IL-1β, Cox-2, Arg-1(Abcam, UK)로 프로브되었다. 다음날, 막을 TBS-T로 3회 세척하고, HRP- 접합된 이차 항체와 50분 동안 반응시켰다. 세척 후, 화학 발광 검출 시스템(GE Healthcare, UK)을 사용하여 막을 개발하였다. 블롯된 막을 Gel Logic 2200 PRO 이미징 시스템(Carestream Health, NY)을 사용하여 시각화하였다.
[아주반트-유도 관절염(AIA) 모델 및 나노입자의 관절 내 주입]
모든 동물 연구는 서울대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회(IACUC)의 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다. AIA 모델의 확립을 위해 10주령 SD 쥐를 코아테크에서 구입하여 1주일 동안 순응시켰다. 관절염은 전술한 바와 같이 10mg/mL 완전 프로윈트 아주반트(Chondrex, WA)의 꼬리 기반 피내 주입에 의해 유도되었다. 8일째에 염증의 첫 징후가 관찰된 후 동물을 무작위로 할당하였다. AIA-유도 동물을 8 개의 그룹으로 무작위로 할당하였다(n = 6).
아주번트 투여 후 10일째에, 무릎 관절에 관절 내 주입을 통해 50μL의 PBS, MTX, MSN, MSN+MTX, C-MSN, MF-MSN, MFC-MSN, MFC-MSN+MTX를 투여하였다. ICP-AES 분석에 의해 결정된 바와 같이, C-MSN, MF-MSN 및 MFC-MSN을 10㎍ 용량의 망간 페라이트 및 세리아로 주입하였다. MSN은 MFC-MSN내 실리카와 같은 농도로 주입되었다. 유리 MTX는 2μg 용량으로, MSN 및 MFC-MSN에 같은 양으로 주입되었다.
[열 화상 이미징 및 관절염의 물리적 기능 평가]
관절 내 주입 후, 뒷발의 온도 변화 및 광열 이미지를 적외선 열 화상 시스템(FLIR i2, FLIR Systems Inc., OR)을 사용하여 아주반트 투여 후 30일까지 기록하였다. 발 너비의 변화는 캘리퍼에 의해 측정되었다. 발의 온도 및 폭의 누적 측정에서 동물의 뒷발 둘 다를 세었다. 70cm 빔을 통과하는 평균 시간을 기록하여 AIA 동물의 물리적 기능을 평가하였다. 염증의 첫 징후 전 3일 및 6일에 동물을 빔에 순응시켰다.
[무릎 관절의 산소 수준에 대한 광음향 이미징]
활액 관절 주위의 혈관 O2 포화도(sO2)는 LZ550 변환기를 갖는 Vevo LAZR 광음향 이미징 시스템(VisualSonics Inc., 캐나다)을 사용하여 각각 850nm 및 750nm의 상이한 파장에서 과산화되고 산소가 제거된 헤모글로빈의 차등 광학 흡수에 의해 측정되었다. 쥐 AIA 모델에서 활액 관절 주위의 sO2를 관절 내 주입을 통해 50μL의 MFC-MSN을 활액 관절에 투여하기 전후에 측정하였다.
[면역 조직 화학 분석]
저산소증, M1/M2 평형, 혈관 신생, 활막염(활막염) 및 연골 파괴를 포함한 류마티스 관절염의 특징을 결정하기 위해 조직 병리학을 평가하였다. 30일째에, 동물을 희생시키고 무릎 관절을 회수하였다. 무릎 관절을 4℃에서 3일 동안 4% 파라포름알데히드에 고정시킨 다음, 석회 제거 용액(Sigma, MO)으로 옮기고 오비탈 쉐이커(orbital shaker) 위에 놓았다. 조직을 실온에서 14일 동안 전사하였다. 전사된 무릎 관절을 파라핀에 넣고 10μm에서 마이크로톰으로 절단 하였다. 면역 조직 화학을 위해, 조직 섹션을 탈왁싱하고, HIF-1α(Novus Biologicals), Cox-2, CD206(Abcam), F4/80 및 vWF(Santa Cruz Biotechnology, TX)에 대한 1차 항체로 염색하였다. 사용된 2차 항체는 HIF-1α에 대한 염소 항-마우스 Alexa Fluor® 568(Abcam), F4/80 및 CD206에 대한 염소 항-토끼 Alexa Fluor® 488(Abcam) 및 Cox-2 및 vWF에 대한 염소 항-토끼 Alexa Fluor® 568 (Abcam)이었다. 이어서, 조직 섹션을 DAPI 장착 용액으로 염색하고 공초점 형광 현미경(LSM780, Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 관찰하였다. vWF-양성 혈관 밀도의 정량화를 위해, DAPI- 양성 영역에 대한 vWF-양성 영역을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.
[수집된 활액 관절에서 M1/M2 발현의 qRT-PCR 분석]
아주번트 투여 후 30 일째에, 모든 동물의 무릎 관절을 검색하여 RNAse/DNAse가 없는 원추형 튜브에 넣었다. 무균 수술 블레이드를 사용하여 무릎 관절의 활액 조직을 수집하였다. 획득된 조직을 수술 블레이드로 다진 후 TRIzol®의 존재 하에 균질화(D1000, Benchmark Scientific, NJ)하였고, 총 RNA를 분리하였다. cDNA 및 qRT-PCR의 합성은 시험 관내 분석에 대해 전술한 바와 같이 수행하였다.
[Safranin-O 및 H&E 염색]
연골 파괴 및 활막 염증의 평가를 위해, 사프라닌 -O 및 H&E 염색을 각각 수행 하였다. 연골에서 프로테오글리칸을 염색하는 사프라닌-O 염색은 전술한 방법에 따라 수행되었다. 간단히 말해서, 탈왁스 조직 섹션을 1% 헤마톡실린 및 30% 염화철(무수)로 구성된 Weigert의 헤마톡실린 작업 용액으로 10분 동안 염색하였다.
광범위하게 세척한 후, 섹션을 고속 녹색(FCF) 용액으로 5분간 카운터-염색시켰다. 1% 아세트산으로 세정한 후, 섹션을 추가 5분 동안 0.1% 사프라닌 O 용액으로 염색하였다. H&E 염색의 경우, 탈왁스 조직 섹션을 처음에 헤마톡실린 작업 용액으로 10분 동안 염색하였다. 흐르는 수돗물 및 95% 알코올로 광범위하게 세척한 후, 슬라이드를 1% 에오신 Y 용액으로 3분 동안 염색하였다.
탈수 후, 사프라닌-O 및 H&E 염색된 조직 섹션을 캐나다 발삼(Sigma)으로 고정하였다. 무릎 관절 및 활액 조직을 각각 연골 파괴 및 활막 염증의 평가를 위해 광학 현미경으로 가시화하였다. 연골 파괴는 실험 동물 그룹에 대해 알지못하는 7명의 조사자와 함께, 전술한 바와 같이 Mankin의 방법을 사용하여 스코어링되었다.
이제까지 본 발명에 대한 구체적인 실시예들을 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
본 발명의 실시예들에 따른 나노입자 구조체는 생체에 주입되어 질병 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 다공성 지지체; 및
    상기 다공성 지지체에 결합되는 나노입자를 포함하고,
    상기 나노입자는 망간 페라이트 나노입자 및 세리아 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 다공성 지지체는 메조포러스 실리카 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 다공성 지지체에 로딩된 약물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 약물은 관절염 약물을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자 구조체는 인체에 주입되어 전-염증성 M1 대식세포를 제거하고 항-염증성 M2 대식세포를 유도하는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자 구조체는 인체에 주입되어 활성 산소종을 제거하고 산소를 생성하는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  7. 다공성 지지체 및 나노입자를 형성하는 단계; 및
    상기 다공성 지지체와 상기 나노입자를 결합시키는 단계를 포함하고,
    상기 나노입자는 망간 페라이트 나노입자 및 세리아 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체의 형성 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 다공성 지지체는 메조포러스 실리카 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체의 형성 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 다공성 지지체에 약물을 로딩하는 단계를 더 포함하는 나노입자 구조체의 형성 방법.
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 다공성 지지체는 아민-작용화되고,
    상기 나노입자는 BMPA-캡핑되며,
    상기 다공성 지지체와 상기 나노입자를 결합시키는 단계는,
    상기 아민-작용화된 다공성 지지체와 상기 BMPA(2-Bromo-2-methylpropionic acid)-캡핑된 나노입자를 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체의 형성 방법.
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