KR20190113389A - 세리아 나노입자 구조체 및 그 형성 방법 - Google Patents

세리아 나노입자 구조체 및 그 형성 방법 Download PDF

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현택환
권혁진
김도균
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서울대학교산학협력단
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Abstract

세리아 나노입자 구조체 및 그 형성 방법이 제공된다.
상기 세리아 나노입자 구조체는 복수개의 세리아 나노입자가 모여서 형성된 세리아 나노입자 클러스터를 포함한다. 상기 세리아 나노입자 구조체는 상기 세리아 나노입자 클러스터에 결합된 수분산성 화합물을 더 포함할 수 있다.
상기 나노입자 구조체의 형성 방법은 복수개의 세리아 나노입자로 세리아 나노입자 클러스터를 형성하는 단계를 포함한다. 상기 세리아 나노입자 구조체의 형성 방법은 상기 세리아 나노입자 클러스터에 수분산성 화합물을 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

Description

세리아 나노입자 구조체 및 그 형성 방법{CERIA NANOPARTICLES STRUCTURE AND METHOD OF FORMING THE SAME}
본 발명은 세리아 나노입자 구조체 및 그 형성 방법에 관한 것이다.
산소 대사 시 천연 생성물로 생성되는 활성 산소 종(reactive oxygen species, ROS)은 세포 신호 전달 및 면역 반응과 같은 기능으로 인해 생명에 필수적이다. 그러나 과도하게 생성된 활성 산소 종은 생체 분자와 세포에 산화적 손상을 유도하기 때문에 해롭다. 이와 같이 활성 산소 종은 패혈증, 심혈관 질환, 암 및 신경 퇴행성 질환을 포함한 많은 질병의 발병 기전 및 진행과 밀접하게 관련되어 있다. 따라서, 질병의 치료를 위해서 활성 산소 종을 제거하는 것이 필요하다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 인체 내 활성 산소 종을 효과적으로 제거할 수 있는 세리아 나노입자 구조체를 제공한다.
본 발명은 상기 세리아 나노입자 구조체의 형성 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적들은 다음의 상세한 설명과 첨부한 도면으로부터 명확해 질 것이다.
본 발명의 실시예들에 따른 세리아 나노입자 구조체는 복수개의 세리아 나노입자가 모여서 형성된 세리아 나노입자 클러스터를 포함한다.
상기 세리아 나노입자 구조체는 상기 세리아 나노입자 클러스터에 결합된 수분산성 화합물을 더 포함할 수 있다. 상기 수분산성 화합물은 각각 Lipid-PEG 또는 PEG를 포함할 수 있다. 상기 세리아 나노입자 구조체는 상기 수분산성 화합물에 결합된 FITC(fluorescein isothiocyanate)를 더 포함할 수 있다.
상기 세리아 나노입자 클러스터는 상기 세리아 나노입자를 50,000 ~ 150,000개 포함할 수 있다. 상기 세리아 나노입자 구조체는 200 ~ 400nm의 크기를 가질 수 있다.
상기 세리아 나노입자 구조체는 세포 외 활성 산소 종을 제거할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 세리아 나노입자 구조체의 형성 방법은 복수개의 세리아 나노입자로 세리아 나노입자 클러스터를 형성하는 단계를 포함한다.
상기 세리아 나노입자 구조체의 형성 방법은 상기 세리아 나노입자 클러스터에 수분산성 화합물을 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 세리아 나노입자 구조체의 형성 방법은 상기 세리아 나노입자 클러스터에 상기 수분산성 화합물을 결합시키기 전에 상기 세리아 나노입자 클러스터를 폴리아크릴산과 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 수분산성 화합물은 PEG를 포함할 수 있다.
상기 세리아 나노입자 클러스터를 형성하는 단계는 상기 복수개의 세리아 나노입자를 도데실트리메틸암모늄 브로마이드와 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 세리아 나노입자 구조체는 인체 내 활성 산소 종을 효과적으로 제거할 수 있다. 상기 세리아 나노입자 구조체는 인체 내 질병을 야기하는 세포 외 활성 산소 종을 선택적으로 제거할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 세리아 나노입자 구조체를 개략적으로 나타낸다.
도 2는 상기 제1 세리아 나노입자 구조체 중 일 예의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 제2 세리아 나노입자 구조체를 개략적으로 나타낸다.
도 4는 상기 제2 세리아 나노입자 구조체 중 일 예의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 제3 세리아 나노입자 구조체를 개략적으로 나타낸다.
도 6은 상기 제3 세리아 나노입자 구조체 중 일 예의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 7 및 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 세리아 나노입자 시스템에 의한 활성 산소 종의 선택적 제거를 설명하기 위한 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 세리아 나노입자 구조체, 제2 세리아 나노입자 구조체, 및 제3 세리아 나노입자 구조체의 세포 위치를 보여주는 SH-SY5Y 세포의 공초점 이미지를 나타낸다.
도 10 내지 도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 세리아 나노입자 구조체, 제2 세리아 나노입자 구조체, 또는 제3 세리아 나노입자 구조체를 포함하는 세포에 대한 형광 변화 실험 결과를 나타낸다.
도 25 내지 도 30은 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 세리아 나노입자 구조체, 제2 세리아 나노입자 구조체, 또는 제3 세리아 나노입자 구조체가 MPTP로 유도된 파킨슨 병 마우스의 스트리아타에 대하여 미치는 치료 효과를 설명하기 위한 도면이다.
이하, 실시예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예들을 통해 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서, 이하의 실시예들에 의하여 본 발명이 제한되어서는 안 된다.
본 명세서에서 제1, 제2 등의 용어가 다양한 요소들(elements)을 기술하기 위해서 사용되었지만, 상기 요소들이 이 같은 용어들에 의해서 한정되어서는 안 된다. 이러한 용어들은 단지 상기 요소들을 서로 구별시키기 위해서 사용되었을 뿐이다. 또, 어떤 요소가 다른 요소와 결합 또는 연결되어 있다고 언급되는 경우에 그것은 다른 요소와 직접 결합 또는 연결되거나, 또는 그들 사이에 제3의 요소가 개재될 수도 있다는 것을 의미한다.
도면들에서 요소의 크기, 또는 요소들 사이의 상대적인 크기는 본 발명에 대한 더욱 명확한 이해를 위해서 다소 과장되게 도시될 수 있다. 또, 도면들에 도시된 요소의 형상이 제조 공정상의 변이 등에 의해서 다소 변경될 수 있을 것이다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 실시예들은 특별한 언급이 없는 한 도면에 도시된 형상으로 한정되어서는 안 되며, 어느 정도의 변형을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 세리아 나노입자 구조체를 개략적으로 나타내고, 도 2는 상기 제1 세리아 나노입자 구조체 중 일 예의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 1을 참조하면, 제1 세리아 나노입자 구조체(10)는 제1 세리아 나노입자(11)와 제1 수분산성 화합물(13)을 포함할 수 있다.
제1 수분산성 화합물(13)은 제1 세리아 나노입자(11)의 표면에 결합되고, 제1 세리아 나노입자 구조체(10)는 수분산성을 가질 수 있다. 제1 수분산성 화합물(13)은 유분산성을 배제하지 않으며, 수분산성과 유분산성을 모두 갖는 화합물을 포함할 수 있다. 제1 세리아 나노입자(11)는 제1 수분산성 화합물(13)에 의해 캐핑(capping)될 수 있다. 제1 수분산성 화합물(13)은 제1 세리아 나노입자(11)에 수분산성을 제공할 수 있는 물질, 예를 들어, Lipid-PEG(polyethylene glycol) 또는 PEG를 포함할 수 있다. 바람직하게 제1 수분산성 화합물(13)은 Lipid-PEG를 포함할 수 있다.
도 2를 참조하면, 제1 세리아 나노입자 구조체는 세리아 나노입자 및 상기 세리아 나노입자에 결합된 Lipid-PEG를 포함한다. 상기 세리아 나노입자는 약 3nm의 평균 크기를 갖는다. 상기 세리아 나노입자는 Lipid-PEG로 캡슐화되어 수분산성을 가질 수 있고 생체 분자와의 비특이적 결합을 방지할 수 있다. 물에 분산된 제1 세리아 나노입자 구조체의 유체역학 직경은 약 11nm이고, ζ-포텐셜 값은 약 -23mV이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 제2 세리아 나노입자 구조체를 개략적으로 나타내고, 도 4는 상기 제2 세리아 나노입자 구조체 중 일 예의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 3을 참조하면, 제2 세리아 나노입자 구조체(20)는 제2 세리아 나노입자(21), 제2 수분산성 화합물(23), 및 양이온성 화합물(25)을 포함할 수 있다.
제2 수분산성 화합물(23)은 제2 세리아 나노입자(21)의 표면에 결합되고, 제2 세리아 나노입자 구조체(20)는 수분산성을 가질 수 있다. 제2 수분산성 화합물(23)은 유분산성을 배제하지 않으며, 수분산성과 유분산성을 모두 갖는 화합물을 포함할 수 있다. 제2 세리아 나노입자(21)는 제2 수분산성 화합물(23)에 의해 캐핑(capping)될 수 있다. 제2 수분산성 화합물(23)은 제2 세리아 나노입자(21)에 수분산성을 제공할 수 있는 물질, 예를 들어, Lipid-PEG(polyethylene glycol) 또는 PEG를 포함할 수 있다. 바람직하게 제2 수분산성 화합물(23)은 Lipid-PEG를 포함할 수 있다.
양이온성 화합물(25)은 제2 수분산성 화합물(23)과 결합하는 것에 의해 제2 세리아 나노입자(21)에 연결될 수 있다. 제2 세리아 나노입자 구조체(20)는 양이온성 화합물(25)에 의해 미토콘트리아에 침투할 수 있다. 또, 양이온성 화합물(25)은 친유성을 가질 수 있고, 제2 세리아 나노입자 구조체(20)는 미토콘드리아에 축적될 수 있다. 양이온성 화합물(25)은, 예를 들어, TPP(Triphenylphosphonium)를 포함할 수 있다. 상기 TPP는 상기 Lipid-PEG의 PEG와 반응하여 결합할 수 있다.
도 4를 참조하면, 제2 세리아 나노입자 구조체는 세리아 나노입자, 상기 세리아 나노입자에 결합한 Lipid-PEG, 및 상기 Lipid-PEG에 결합된 TPP를 포함한다. 상기 세리아 나노입자는 약 3nm의 평균 크기를 갖는다. 상기 세리아 나노입자는 Lipid-PEG로 캡슐화되어 수분산성을 가질 수 있고 생체 분자와의 비특이적 결합을 방지할 수 있다. 또, 상기 세리아 나노입자는 상기 TPP로 캡슐화되어 미토콘트리아에 침투하여 축적될 수 있다. 물에 분산된 제2 세리아 나노입자 구조체의 직경은 약 22nm이고, ζ-포텐셜 값은 약 +45mV이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 제3 세리아 나노입자 구조체를 개략적으로 나타내고, 도 6은 상기 제3 세리아 나노입자 구조체 중 일 예의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 5를 참조하면, 제3 세리아 나노입자 구조체(30)는 세리아 나노입자 클러스터(32)와 제3 수분산성 화합물(33)을 포함할 수 있다.
세리아 나노입자 클러스터(32)는 복수개의 제3 세리아 나노입자(31)가 모여 형성될 수 있다. 상기 세리아 나노입자 클러스터는 상기 제3 세리아 나노입자를 50,000~150,000개 포함할 수 있다.
제3 수분산성 화합물(33)은 세리아 나노입자 클러스터(32)의 표면에 결합되고, 제3 세리아 나노입자 구조체(30)는 수분산성을 가질 수 있다. 제3 수분산성 화합물(33)은 유분산성을 배제하지 않으며, 수분산성과 유분산성을 모두 갖는 화합물을 포함할 수 있다. 세리아 나노입자 클러스터(32)는 제3 수분산성 화합물(33)에 의해 캐핑(capping)될 수 있다. 제3 수분산성 화합물(33)은 세리아 나노입자 클러스터(32)에 수분산성을 제공할 수 있는 물질, 예를 들어, Lipid-PEG(polyethylene glycol) 또는 PEG를 포함할 수 있다. 바람직하게 제3 수분산성 화합물(33)은 PEG를 포함할 수 있다.
도 6을 참조하면, 제3 세리아 나노입자 구조체는 복수개의 세리아 나노입자가 모여 형성된 세리아 나노입자 클러스터와 상기 세리아 나노입자 클러스터에 결합된 PEG를 포함한다. 예를 들어, 상기 제3 세리아 나노입자 구조체(30)는 오일-인-워터 마이크로에멀젼(oil-in-water microemulsion) 기술을 사용하여 약 100,000개의 세리아 나노입자를 조립하여 형성될 수 있다. 상기 세리아 나노입자는 약 3nm의 평균 크기를 갖고, 상기 세리아 나노입자 클러스터는 약 300nm의 평균 크기를 갖는다. 상기 세리아 나노입자 클러스터는 PEG로 캡슐화되어 수분산성을 가질 수 있고, 생체 분자와의 비특이적 결합을 방지할 수 있다. 물에 분산된 제3 세리아 나노입자 구조체의 직경은 약 400nm이고, ζ-포텐셜 값은 약 -20mV이다.
[ 실시예 ]
세리아 나노입자의 제조예
세륨(III) 아세테이트(1mmol), 올레일 아민(12mmol) 및 자일렌(15mL)의 혼합 용액을 12시간 동안 실온에서 격렬하게 교반한 다음, 승온 속도 2℃/분으로 90℃까지 가열한다. 탈이온수(1mL)를 용액에 급속 주입하여 졸-겔 반응을 개시한다. 용액을 90℃에서 3시간 동안 유지한 다음 실온으로 냉각시킨다. 아세톤을 첨가한 후 원심 분리에 의해 세리아 나노입자를 분리한다. 상기 세리아 나노입자를 클로로포름에 분산시킨다.
제1 세리아 나노입자 구조체의 제조예
세리아 나노입자(8mg)를 클로로포름(25mL) 내 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DSPE-PEG, Avanti Polar Lipids, Inc.)(25mg)과 혼합시킨다. 진공 오븐(80℃)을 사용하여 클로로포름을 제거한 후, 탈이온수(10mL)를 첨가하고, 용액을 초음파 처리한다. 포어 크기가 0.2㎛인 시린지 필터로 여과한 후, 초원심 분리에 의해 제1 세리아 나노입자 구조체를 분리한다. 상기 제1 세리아 나노입자 구조체를 24시간 동안 물에 투석하여 정제한다.
제2 세리아 나노입자 구조체의 제조예
TPP-결합 DSPE-PEG가 사용된 것을 제외하고는 제1 세리아 나노입자 구조체의 제조와 유사한 방식으로 제2 세리아 나노입자 구조체를 제조한다.
TPP-결합 DSPE-PEG의 제조예
(3-카르복시프로필)트리페닐포스포늄(3-CTPP) 브로마이드((3-carboxypropyl)triphenylphosphonium bromide)(8.6mg, 20㎛ol), N-(3-(디메틸아미노)프로필)-N'-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-(dimethylamino)propyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride)(EDCI, 11.5㎎, 60μmol), N-하이드록시숙신이미드(Nhydroxysuccinimide)(NHS, 6.9mg, 60㎛ol), 및 트리에틸아민(triethylamine)(20μL)을 1mL의 클로로포름에 용해시킨다. 상기 용액을 실온에서 2시간 동안 격렬하게 교반한다. 상기 용액을 50mg의 DSPE-PEG-NH2이 용해된 2mL의 클로로포름에 첨가한다. 이 용액 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반한다.
제3 세리아 나노입자 구조체의 제조예
클로로포름(4.5g) 내 세리아 나노입자(150mg)를 탈이온수(10g) 내 도데실트리메틸암모늄 브로마이드(150mg)와 혼합한다. 증발에 의해 클로로포름을 제거한 후 용액을 에틸렌 글리콜(11g) 내 폴리아크릴산(0.9g)과 혼합한다. 탈이온수로 세척한 후 제3 세리아 나노입자 구조체를 원심 분리에 의해 분리한다. 상기 제3 세리아 나노입자 구조체를 탈이온수에 분산시키고, 그 표면에 카르보디이미드-매개 커플링 반응에 의해 PEG-아민을 그라프트시킨다.
FITC -결합 세리아 나노입자 구조체의 제조예
FITC-결합 DSPE-PEG는 FITC(7.8mg)를 DSPE-PEG-아민(50mg)과 반응시켜 제조 한다. FITC-결합 제1 및 제2 세리아 나노입자 구조체를 제조하기 위해, 제1 및 제2 세리아 나노입자 구조체를 형성하기 위한 수 전달(water transfer) 동안 1:50의 비율로 FITC-결합 DSPE-PEG를 DSPE-PEG 또는 TPP-결합 DSPE-PEG와 함께 사용한다. FITC-결합 제3 세리아 나노입자 구조체를 제조하기 위해 폴리아크릴산이 코팅된 제3 세리아 나노입자 구조체의 표면 그라프팅을 위해 FITC-결합 폴리(알릴아민)을 PEG-아민과 함께 사용한다.
FITC-결합 DSPE-PEG의 제조예
FITC 7.8mg(20㎛ol), 트리에틸아민 20μL 및 DSPE-PEG-NH2 50㎎을 클로로포름 10mL에 용해시키고, 이 용액을 실온에서 24시간 동안 격렬하게 교반한다.
도 7 및 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 세리아 나노입자 시스템에 의한 활성 산소 종의 선택적 제거를 설명하기 위한 도면이다.
도 7을 참조하면, 세리아 나노입자는 Ce3 +와 Ce4 + 이온 사이의 재생 레독스 스위칭(regenerative redox switching)에서 유래한 카탈라아제 및 수퍼옥사이드 디스무타제(SOD, superoxide dismutase) 유사 작용을 이용하여 활성 산소 종을 효과적으로 제거한다.
도 8을 참조하면, 제1 세리아 나노입자 구조체(Ceria nanoparticles)는 세포에 침투하여 세포 내 활성 산소 종을 제거할 수 있다. 제2 세리아 나노입자 구조체(TPP Ceria nanoparticles)는 미토콘드리아에 침투하여 미토콘드리아 활성 산소 종을 제거할 수 있다. 제3 세리아 나노입자 구조체(Cluster ceria nanoparticles)는 세포에 침투하지 못하고 세포 외 활성 산소 종을 제거할 수 있다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 세리아 나노입자 구조체, 제2 세리아 나노입자 구조체, 및 제3 세리아 나노입자 구조체의 세포 위치를 보여주는 SH-SY5Y 세포의 공초점 이미지를 나타낸다.
도 9를 참조하면, SH-SY5Y와 HeLa 세포를 사용하여 수행된 실험에서 제1 세리아 나노입자 구조체(Ceria nanoparticles)는 작은 유체역학 직경에 의해 세포에 쉽게 흡수될 수 있다. 내재화된 제1 세리아 나노입자 구조체는 세포질에 위치하는 것으로 확인된다. 그러나, 상기 제1 세리아 나노입자 구조체는 음으로 하전된 나노입자 표면과 내부 미토콘드리아 막 사이의 정전기적 반발로 인해 미토콘드리아에 침투하지 못한다. 그러나, 제2 세리아 나노입자 구조체(TPP Ceria nanoparticles)는 미토콘드리아에 축적되는 성질을 갖는 친유성 양이온인 TPP로 캡슐화됨으로써 미토콘드리아에 침투하여 내재할 수 있다. 제3 세리아 나노입자 구조체(Cluster ceria nanoparticles)는 크기가 크기 때문에 엔도시토시스(endocytosis)는 차단되고 세포 외 공간에 남게 된다. 상기 제1 내지 제3 세리아 나노입자 구조체는 사람의 혈장에서 눈에 띄는 응집을 보이지 않았고 적어도 1주일 동안 안정성을 유지할 수 있다.
도 10 내지 도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 세리아 나노입자 구조체, 제2 세리아 나노입자 구조체, 또는 제3 세리아 나노입자 구조체를 포함하는 세포에 대한 형광 변화 실험 결과를 나타낸다.
세포 내 활성 산소 종, 미토콘드리아 활성 산소 종, 및 세포 외 활성 산소 종에 대한 제1 내지 제3 세리아 나노입자 구조체의 활성 산소 종 제거 효과는 SH-SY5Y 및 HeLa 세포에 대하여 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. 세리아 나노입자 구조체의 각 유형의 부재 또는 존재 하에 배양된 세포를 tBHP(tert-butyl hydroperoxide) 또는 H2O2로 처리한 후 CellROX 시약(세포질 내에 존재하는 세포 투과성 형광 프로브) 또는 MitoSOX(미토콘드리아 활성 산소 종에 민감한 적색 방출을 갖는 미토콘드리아-표적화 형광 프로브)를 사용하여 활성 산소 종 제거를 시험하였다. tBHP는 H2O2와 같은 다른 산화제보다 더 안정하기 때문에 세포 내 활성 산소 종을 유도하는데 사용될 수 있다.
도 10 내지 도 13은 대조군(도 10)의 세포와 제1 세리아 나노입자 구조체(도 11), 제2 세리아 나노입자 구조체(도 12), 제3 세리아 나노입자 구조체(도 13)를 포함하는 세포에 대하여 측정된 CellROX의 형광 광도를 나타내고, 각 도면에서 우측 그래프는 tBHP로 처리된 것을 나타내고, 좌측 그래프는 tBHP로 처리되지 않은 것을 나타낸다.
도 14 내지 도 17은 대조군(도 14)의 세포와 제1 세리아 나노입자 구조체(도 15), 제2 세리아 나노입자 구조체(도 16), 제3 세리아 나노입자 구조체(도 17)를 포함하는 세포에 대하여 측정된 MitoSOX의 형광 광도를 나타내고, 각 도면에서 우측 그래프는 tBHP로 처리된 것을 나타내고, 좌측 그래프는 tBHP로 처리되지 않은 것을 나타낸다.
도 18 내지 도 21은 대조군(도 18)의 세포와 제1 세리아 나노입자 구조체(도 19), 제2 세리아 나노입자 구조체(도 20), 제3 세리아 나노입자 구조체(도 21)를 포함하는 세포에 대하여 측정된 CellROX의 형광 광도를 나타내고, 각 도면에서 우측 그래프는 H2O2로 처리된 것을 나타내고, 좌측 그래프는 H2O2로 처리되지 않은 것을 나타낸다.
도 22는 도 10 내지 도 13의 형광 강도의 평균을 나타내고, 도 23은 도 14 내지 도 17의 형광 강도의 평균을 나타내며, 도 24는 도 18 내지 도 21의 형광 강도의 평균을 나타낸다.
도 10 내지 도 24를 참조하면, 세포 내의 CellROX의 후속 산화는 형광 변화를 일으킨다(도 10). 세리아 나노입자 구조체가 로딩된 세포와 관련하여 CellROX는 세포 내재화된 tBHP에 의해 생성된 산화 스트레스가 제1 세리아 나노입자 구조체에 의해 중화되기 때문에 어떠한 형광 변화도 보이지 않는다(도 11). 미토콘드리아에 위치한 제2 세리아 나노입자 구조체는 세포 내 활성 산소 종을 제거할 수 없기 때문에 CellROX의 형광 변화를 막을 수 없다(도 12). 세포 외 공간에 있는 제3 세리아 나노입자 구조체도 또한 다른 위치에 있기 때문에 세포가 취한 CellROX의 형광 변화를 막을 수 없다(도 13).
미토콘드리아 활성 산소 종은 제2 세리아 나노입자 구조체만이 MitoSOX의 형광 변화를 최소화할 수 있고(도 16), 제1 및 제3 세리아 나노입자 구조체는 제2 세리아 나노입자 구조체에 비하여 효과적이지 못하다(도 15, 도 17).
높은 반응성으로 인해 H2O2는 세포 내로 섭취되기 훨씬 전에 산화 스트레스를 매우 빠르게 유도한다. 생성된 세포 외 활성 산소 종은 세포 내로 유입되어 CellROX의 형광 변화를 유발할 수 있다(도 18). 제3 세리아 나노입자 구조체는 세포 외 활성 산소 종을 제거하여 CellROX의 산화 유도 형광 변화를 일으키지 않는다 (도 21). 세포 내 로딩된 제1 세리아 나노입자 구조체는 세포 내재화된 활성 산소 종에 의한 CellROX의 산화를 막아 형광 변화를 억제할 수 있다(도 19). 미토콘드리아에 있는 제2 세리아 나노입자 구조체는 세포 내재화된 활성 산소 종과 상호 작용할 수 없어 CellROX의 형광 변화를 일으킨다(도 20).
이와 같이, 제1 세리아 나노입자 구조체, 제2 세리아 나노입자 구조체, 및 제3 세리아 나노입자 구조체는 각각 세포 내 활성 산소 종, 미토콘드리아 활성 산소 종, 세포 외 활성 산소 종을 제거할 수 있다.
도 25 내지 도 30은 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 세리아 나노입자 구조체, 제2 세리아 나노입자 구조체, 또는 제3 세리아 나노입자 구조체가 MPTP로 유도된 파킨슨 병 마우스의 스트리아타에 대하여 미치는 치료 효과를 설명하기 위한 도면이다.
제1 내지 제3 세리아 나노입자 구조체를 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)로 파킨슨 병을 유도한 1일 후에 C57BL/6 마우스의 오른쪽 스트리아타(striata)에 주사하여 투여하였다. 파킨슨 병 유도 7일 후에 마우스를 희생시키고 코로나 뇌 절편을 분석하였다.
도 25 내지 도 30을 참조하면, 각 섹션의 제1 세리아 나노입자 구조체, 제2 세리아 나노입자 구조체, 또는 제3 세리아 나노입자 구조체의 존재는 나노입자에 결합된 형광 이소티오시아네이트(FITC, fluorescein isothiocyanate)의 형광을 사용하여 공초점 현미경으로 확인된다(도 25, 도 26). 면역 조직 형광(IHF, immunohistofluorescence) 데이터(도 25, 도 27)는 야생형 마우스에 비해 파킨슨 병 그룹(무처리 그룹) 및 대조군 그룹(식염수 처리 그룹)의 스트리아타에서 이온화 칼슘-결합 어댑터 분자 1(IBA-1)-양성 세포의 증가를 나타냈다. IBA-1의 상향 조절된 발현은 증가된 신경 염증의 결과로서 마이크로글리아(microglia)의 활성화를 나타낸다. 그러나, 제1 내지 제3 세리아 나노입자 구조체로 처리한 그룹에서 유의하게 감소된 IBA-1 수준이 관찰되었는데, 이는 제1 내지 제3 세리아 나노입자 구조체에 의한 활성 산소 종 제거가 신경 염증을 감소시키는데 기여한다는 것을 나타낸다.
티로신 하이드록실라제는 L-티로신을 신경 전달 물질인 도파민을 생산하는 전구체인 레보도파(levodopa)로 전환시키는 효소이다. 따라서 파킨슨 병의 특징인 티로신 하이드록실라제(TH)의 감소는 운동 기능을 조절하는 니그로스트리아타 경로(nigrostriatal pathway)에서 도파민성 신경 세포의 퇴화를 나타낸다. 파킨슨 병 그룹과 대조군 그룹은 분명히 티로신 하이드록실라제 수준이 감소한 것으로 나타났다. 그러나, 또, 제1 및 제2 세리아 나노입자 구조체로 처리된 그룹은 파킨슨 병 그룹과 대조군 그룹보다 유의하게 높은 티로신 하이드록실라제를 나타냈다(도 26, 도 28).
산화 손상의 지표인 지질 과산화(lipid peroxidation)는 각 그룹에 대해 4-HNE(4-hydroxynonenal) 수준을 측정하여 평가하였다(도 29). 제1 및 제2 세리아 나노입자 구조체로 처리된 그룹은 파킨슨 병 그룹에 비해 4-HNE의 수준이 유의하게 낮았다. 제1 및 제2 세리아 나노입자 구조체는 각각 세포 내 및 미토콘드리아 산화 스트레스를 경감시킴으로써 도파민성 신경 세포의 퇴행을 억제할 수 있다.
티로신 하이드록실라제의 전반적인 분포는 뇌 절편의 IHC(immunohistochemistry)에 의해 시각화된다. IHC 데이터(도 30 Top)에서 파킨슨 병 그룹 및 대조군 그룹의 스트리아타 영역에서 낮은 수준의 티로신 하이드록실라제가 나타났다. 대조적으로, 제1 및 제2 세리아 나노입자 구조체로 처리된 그룹은 높은 수준의 티로신 하이드록실라제가 관찰된다. 이는 IHF 데이터와 유사하며, 이 티로신 하이드록실라제 분포는 공초점 영상에서도 보인다(도 30 Middle). 세리아 나노입자 구조체에 결합된 FITC의 녹색 형광에 의해 제공된 바와 같이, 형광 이미징(도 30 bottom)은 스트리아타 영역에서 제1 내지 제3 세리아 나노입자 구조체의 성공적인 치료를 나타낸다.
[ 분석예 ]
SOD 및 카탈라아제 유사 활성 분석
SOD 유사 활성은 SOD 분석 키트(Sigma-Aldrich)를 사용하여 평가하였다. 제1 세리아 나노입자 구조체, 제2 세리아 나노입자 구조체, 또는 제3 세리아 나노입자 구조체를 0, 0.63, 0.125, 0.25, 0.5 및 1mM의 세륨 농도를 갖는 WST-1(water-soluble tetrazolium salt; (2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfo-phenyl)-2H-tetrazolium, onosodium salt) 용액에 희석시키고, 마이크로 플레이트 웰에 3회 첨가하였다. 각 웰에 크산틴 산화 효소(20μL)를 첨가하고 37℃에서 20분 동안 인큐베이션한 후 450nm에서의 흡광도를 측정하여 SOD 유사 활성을 평가하였으며, 50U/mL SOD는 50%까지 WST-1의 환원 반응을 억제하는 SOD량으로 정의하였다.
Amplex Red hydrogen peroxide/peroxidase assay kit (Molecular Probes Inc.)를 사용하여 카탈라제 유사 활성을 측정하였다. 제1 세리아 나노입자 구조체, 제2 세리아 나노입자 구조체, 또는 제3 세리아 나노입자 구조체는 100μM Amplex Red 시약과 2mM 과산화수소를 포함하는 반응 버퍼에서 서로 다른 세륨 농도(0, 0.375, 0.75, 1.5mM)로 희석되었다. 각 용액 50μL를 마이크로 플레이트 웰에 3회 첨가하였다. 마이크로 플레이트를 실온에서 30 분간 인큐베이션하고, 490nm에서의 흡광도를 측정하였다. 1mU/mL HRP는 카탈라제 유사 활성을 측정할 때 100% 대조군으로 사용되었다.
세포 배양
SH-SY5Y 세포를 MEM(minimum essential medium)과 HFM(Ham's F12 medium)의 1:1 혼합물에서 배양하였다. HeLa 세포를 DMEM(Dulbecco 's modified Eagle's medium)에서 배양하였다. 두 세포 배양 배지에는 10% 열-불활성화된 태아 소혈청(FBS, fetal bovine serum)을 보충하였다. 세포는 5% CO2의 가습 분위기 37℃에서 1x105세포/mL로 유지되었다.
세포 생존율 분석
SH-SY5Y 또는 HeLa 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고(10,000세포/웰) 24시간 동안 배양하였다. 제1 세리아 나노입자 구조체, 제2 세리아 나노입자 구조체, 또는 제3 세리아 나노입자 구조체를 세포 배양 배지(0, 0.125, 0.25, 0.5, 및 1mM[Ce])로 희석하고 마이크로 플레이트 웰에 3회 첨가하였다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양하고, MTT(3-[4,5-dimethylthialzol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium diphenyltetrazolium bromide)(5mg/mL) 20μL를 각 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 4시간 동안 배양한 후, 디메틸 술폭사이드(200μL)를 각 웰에 첨가 하였다. 세포 생존력은 595nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.
세리아 나노입자 구조체의 세포 내 위치 파악
SH-SY5Y 또는 HeLa 세포(1Х105)를 세포 배양 배지(2mL)가 들어있는 공초점 접시에 뿌리고 세포를 24시간 동안 배양하였다. 배지를 0.5μM MitoTracker Orange CMTMRos(Invitrogen-Life Technologies)와 0.5μM LysoTracker Blue DND-22(Invitrogen-Life Technologies)의 새로운 배지(2mL)로 교체하고 세포를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 DPBS로 3번 세척 한 후 FITC-결합 제1 세리아 나노입자 구조체, FITC-결합 제2 세리아 나노입자 구조체, 또는 FITC-결합 제3 세리아 나노입자 구조체가 함유된 세포 배지에서 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 세리아 나노입자 구조체의 위치는 공초점 현미경으로 조사하였다. 공존(Colocalization) 계수는 현미경 이미지로부터 계산하였다.
세포 내 활성 산소 종 제거 활성
SH-SY5Y 또는 HeLa 세포를 24-웰 플레이트에 접종하고(1x105세포/웰) 24시간 동안 배양하였다. 제1 세리아 나노입자 구조체, 제2 세리아 나노입자 구조체, 또는 제3 세리아 나노입자 구조체(각각 0.1, 0.1 및 0.3mM)를 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 37℃에서 12시간 동안 배양한 후, 세포 배양 배지를 100μM tBHP를 함유하는 새로운 배지(1mL)로 대체하였다. 상기 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. CellROX 시약을 5μM의 최종 농도로 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고, 트립신 처리에 의해 수확하고, 3% 포름알데히드에서 10분 동안 고정시켰다. 고정된 세포를 원심 분리에 의해 수집하고, 473nm 레이저 및 575nm 필터를 사용하여 유동 세포 계측법 분석을 위해 0.5mL PBS에 재현탁시켰다.
미토콘드리아 활성 산소 종 제거 활성
이 과정은 CellROX 대신 MitoSOX 시약을 사용하는 것을 제외하고는 세포 내 활성 산소 종 제거 활성 분석과 유사하다.
세포 외 활성 산소 종 제거 활성
이 과정은 tBHP 대신 2mM의 과산화수소를 사용하는 것을 제외하고는 세포 내 활성 산소 종 제거 활성 분석과 유사하다.
동물 모델
8주된 수컷 C57BL/6 마우스(n=6)는 공개된 지침에 따라 2시간 간격으로 식염수에 용해된 MPTP 하이드로클로라이드(20mg/kg체중)의 피하 주사를 4회 맞았다. 대조군 마우스는 생리 식염수만을 맞았다. 마지막 주사 후 7일째에 마우스를 희생시켰다. 동물 치료 및 유지 관리는 서울 대학교의 동물용 동물 보호 및 사용위원회의 승인을 받았다.
스테레오택식 ( Stereotaxic ) 주입
마우스를 이소플루오란으로 마취시키고 스테레오택식 틀에 두었다. 상기 장치를 사용하여 염수, FITC-결합 제1 세리아 나노입자 구조체, FITC-결합 제2 세리아 나노입자 구조체, 또는 FITC-결합 제3 세리아 나노입자 구조체의 스트리아텀 주입(0.62mm AP, -2.0mm ML 및 -3.5mm DV)을 수행하였다
면역 조직 화학과 면역 조직 형광
마우스를 이소플루오란으로 마취시키고 PBS 내 4% 파라포름알데히드로 관류시켰다. 이어서 뇌를 4% 파라포름알데하이드의 0.1M 인산염 버퍼에 4℃에서 20시간 동안 고정시킨 후, 항온 장치를 사용하여 72시간 동안 30% 수크로오스의 0.05M PBS에서 배양시키고, 30㎛ 절편으로 잘랐다. 조직 절편을 항TH 항체(1:1000, abcam ab112) 또는 항IBA1 항체(1:1000, ThermoFisher PA5-27436)와 함께 밤새 4℃에서 배양하였다. IHF 및 IHC에 대한 2차 항체로서 HRP-접합 항-토끼 IgG 항체(1:500, abcam ab205718) 및 Alexa 647-접합 항-토끼 IgG 항체(1:500, ThermoFisher A-21245)를 각각 사용하였다.
4- 하이드록시노네날의 정량 분석
4-HNE는 HNE 부가물 경쟁 ELISA 키트(Cell Biolabs)에 의해 정량되었다. 균질기를 사용하여 각 처리 그룹의 6개의 조직으로부터 단백질을 추출하였다. 단백질 농도를 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)로 표준화하였다.
이제까지 본 발명에 대한 구체적인 실시예들을 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
10 : 제1 세리아 나노입자 구조체 11 : 제1 세리아 나노입자
13 : 제1 수분산성 화합물 20 : 제2 세리아 나노입자 구조체
21 : 제2 세리아 나노입자 23 : 제2 수분산성 화합물
25 : 양이온성 화합물 30 : 제3 세리아 나노입자 구조체
31 : 제3 세리아 나노입자 32 : 세리아 나노입자 클러스터
33 : 제3 수분산성 화합물

Claims (12)

  1. 복수개의 세리아 나노입자가 모여서 형성된 세리아 나노입자 클러스터를 포함하는 세리아 나노입자 구조체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 세리아 나노입자 클러스터에 결합된 수분산성 화합물을 더 포함하는 세리아 나노입자 구조체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 수분산성 화합물은 각각 Lipid-PEG 또는 PEG를 포함하는 것을 특징으로 하는 세리아 나노입자 구조체.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 수분산성 화합물에 결합된 FITC(fluorescein isothiocyanate)를 더 포함하는 세리아 나노입자 구조체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 세리아 나노입자 클러스터는 상기 세리아 나노입자를 50,000 ~ 150,000개 포함하는 것을 특징으로 하는 세리아 나노입자 구조체.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 세리아 나노입자 구조체는 200 ~ 400nm의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 세리아 나노입자 구조체.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 세리아 나노입자 구조체는 세포 외 활성 산소 종을 제거하는 것을 특징으로 하는 세리아 나노입자 구조체.
  8. 복수개의 세리아 나노입자로 세리아 나노입자 클러스터를 형성하는 단계를 포함하는 세리아 나노입자 구조체의 형성 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 세리아 나노입자 클러스터에 수분산성 화합물을 결합시키는 단계를 더 포함하는 세리아 나노입자 구조체의 형성 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 세리아 나노입자 클러스터에 상기 수분산성 화합물을 결합시키기 전에 상기 세리아 나노입자 클러스터를 폴리아크릴산과 혼합하는 단계를 더 포함하는 세리아 나노입자 구조체의 형성 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 수분산성 화합물은 PEG를 포함하는 것을 특징으로 하는 세리아 나노입자 구조체의 형성 방법.
  12. 제 8 항에 있어서,
    상기 세리아 나노입자 클러스터를 형성하는 단계는,
    상기 복수개의 세리아 나노입자를 도데실트리메틸암모늄 브로마이드와 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세리아 나노입자 구조체의 형성 방법.
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