WO2021172925A1 - Apoe4 rna 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도 - Google Patents

Apoe4 rna 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도 Download PDF

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WO2021172925A1
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trans
ribozyme
region
splicing
rna
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PCT/KR2021/002443
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이성욱
한승렬
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알지노믹스 주식회사
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
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    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing

Definitions

  • the present invention relates to an APOE4 gene-specific trans-splicing ribozyme and uses thereof.
  • Alzheimer's disease is one of the main causes of dementia, a degenerative brain disease in which abnormal proteins such as amyloid beta protein and tau protein accumulate in the brain and gradually damage brain neurons. Memory and cognitive functions gradually decline, and as it progresses further, speech and gait disorders appear, making it difficult to live alone.
  • APP amyloid precursor protein
  • BACE beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme
  • amyloid hypothesis Due to the amyloid hypothesis, most Alzheimer's disease candidates are focused on 'inhibiting BACE1' and 'inhibiting the formation of amyloid beta fibrils'.
  • Lilly's solanezumab an antibody targeting amyloid beta, failed in phase 3 clinical trials in patients with mild dementia. .
  • the amyloid hypothesis which was thought to be the cause of Alzheimer's disease, is being shaken, and there is an argument that the target molecule or the approach must be changed for the treatment of Alzheimer's disease.
  • ApoE (Apolipoprotein E) is a protein expressed in the liver and brain, and a number of research results supporting the relationship between ApoE protein expressed in the brain and Alzheimer's have been recently presented. It is known that ApoE protein has two forms of ApoE2, ApoE3, and ApoE4, ApoE2 functions to protect neurons, and ApoE4 contributes to the accumulation of beta-amyloid and exhibits neurotoxicity by itself. In addition, as a result of statistical analysis based on metagenome studies, it was found that APOE4 is a genetic factor that causes Alzheimer's disease. Therefore, an attempt to block the function of ApoE4 for the treatment of Alzheimer's disease is in progress, but the situation is still insufficient.
  • ApoE3 christchurch (ApoE3 ch ) mutation is a mutant form of ApoE3 found in elderly people in their 70s, and it has been found that amyloid plaques are found throughout the brain in people with this mutation, but cognitive impairment does not occur ( Nature medicine 2019;11:1680-1683.).
  • a group I intron ribozyme from Tetrahmena thermophila targets and attaches an exon RNA attached to the 3' end of the ribozyme in a trans to the 5' exon, thereby linking with a separate transcript. It has been reported that trans-splicing reactions can occur. This suggests that the trans-splicing reaction of group I ribozymes can also correct the transcriptome of genes related to various genetic diseases. It has been found that the ⁇ -globin gene transcript can be converted into an anti-sickling, ⁇ -globin gene transcript by trans-splicing ribozymes in precursor) cells.
  • trans-splicing ribozyme can correct mutant gene RNA to normal RNA, and in the same way, it can reduce the expression of a specific gene and simultaneously express a target gene in a host cell.
  • the ribozyme operates at the RNA level, there is an advantage in that it does not cause an undesirable immune response problem and safety problem due to the incorporation of a gene at a random location in the host cell genome.
  • the present inventors have intensively studied a method for treating Alzheimer's disease using a trans-splicing ribozyme targeting APOE4 and completed the present invention.
  • An object of the present invention is to solve the above problems, and an object of the present invention is to provide an Alzheimer's disease-specific trans-splicing ribozyme having excellent safety and expression efficiency and a use for treating Alzheimer's disease using the same.
  • the present invention provides a trans-splicing ribozyme that targets APOE4 RNA.
  • the trans-splicing ribozyme may have a structure of 5'-IGS (internal guide sequence)-Ribozyme * -exon-3'.
  • the IGS region may be composed of a nucleotide sequence of 5 to 10 nt in length that can specifically bind to the 5' UTR region of APOE4 RNA and form a G/U wobble base pair,
  • a nucleotide sequence of 5 to 10 nt in length that can specifically bind to the 5' UTR region of APOE4 RNA and form a G/U wobble base pair
  • +21, +30, +49, +56, +71, +77, +80, +82, +95, +98, +104, +128, +140, +181, + of APOE4 RNA 229, +255, +263, +275, +326, +368, +830, or +839 position preferably binds complementary to a region comprising position +21, +30, or +56 and binds G/ It may consist of a nucleotide sequence of 5 to 10 nt in length that can form a U wobble base pair.
  • the IGS region may include or consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, 4, or 6.
  • the trans-splicing ribozyme may further include an antisense sequence (AS) region capable of complementary binding to a portion of the APOE4 gene upstream of the IGS region.
  • AS antisense sequence
  • the length of the AS region may be 10 nt to 200 nt, preferably 50 nt to 150 nt.
  • the trans-splicing ribozyme may include an IGS region consisting of SEQ ID NO: 2 and an AS region having a length of 150 nt.
  • the trans-splicing ribozyme may include an IGS region consisting of SEQ ID NO: 4 and an AS region having a length of 50 nt.
  • 5 to 10 random nucleotides may be included between the IGS region and the AS region, and the random nucleotide sequence may be a restriction enzyme sequence, and the random nucleotide sequence is preferably 6 nt in length. It may be composed of a sequence complementary to a part of P1 and P10 illustrated in FIG. 10 .
  • the Ribozyme * region may include or consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the exon region may be a gene for preventing or treating Alzheimer's disease, and may include a part or all of the nucleotide sequence encoding the ApoE2 or ApoE3 christchurch mutation (R136S).
  • the present invention provides a trans-splicing ribozyme expression vector comprising a base sequence of the trans-splice ribozyme and/or a base sequence complementary thereto.
  • the expression vector may further include a promoter operably linked to the ribozyme gene, and the promoter may be a neuron-specific promoter, and the neuron is a neuron. , astrocytes, and oligodendrocytes.
  • the present invention provides a gene delivery system comprising the trans-splicing ribozyme expression vector.
  • the present invention is the trans-splicing ribozyme, a vector capable of expressing the same, and Alzheimer's disease prevention or treatment comprising any one or more selected from the group consisting of a gene delivery system comprising the vector as an active ingredient
  • a pharmaceutical composition for use is provided.
  • the present invention is Alzheimer's disease comprising administering to an individual any one or more selected from the group consisting of the trans-splicing ribozyme, a vector capable of expressing the same, and a gene delivery system comprising the vector A method of preventing or treating is provided.
  • the subject may be a human in need of prevention or treatment of Alzheimer's disease, more specifically, an Alzheimer's disease patient, an elderly person (over 60 years of age), or an APOE4 allele carrier.
  • the method may further comprise measuring the degree of cognitive ability of the subject.
  • the present invention provides the use of the trans-splicing ribozyme, a vector capable of expressing the same, or a gene delivery system comprising the vector for the manufacture of a medicament for preventing or treating Alzheimer's disease.
  • the Alzheimer's disease is a neurodegenerative disease in which brain neurons are gradually damaged as abnormal proteins such as amyloid beta protein and tau protein accumulate in the brain, and other diseases appearing as Alzheimer's disease progresses, for example, Alzheimer's dementia include disease.
  • the trans-splicing ribozyme according to the present invention replaces RNA of a gene that causes or increases the risk of Alzheimer's disease with RNA of a gene beneficial for disease treatment, thereby lowering the expression of genes causing or increasing the risk of disease , it can be usefully used for the prevention or treatment of Alzheimer's disease because it increases the expression of a gene useful for disease treatment specifically in cells or tissues expressing the target gene.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the mechanism of action of a trans-splicing ribozyme targeting APOE4 RNA (FIG. 1a), and a diagram of the result of comparing the sequences of ApoE RNA variants to construct a trans-splicing ribozyme for ApoE4 RNA targeting is (Fig. 1b).
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the trans-splicing ribozyme for ApoE4 RNA target of the present invention.
  • Figure 4 confirms the effect of the AS region on trans-splicing efficiency
  • A shows a structure in which the AS region is introduced at the 5' end of the trans-splicing ribozyme for ApoE RNA target
  • B is the AS region It is a graph confirming the trans-splicing efficiency of the ribozyme according to the introduction and the length of the introduced AS region.
  • FIG. 5 is a view confirming the +56 targeting ribozyme trans-splicing efficiency according to the introduction of the AS region and the length of the introduced AS region in a neuron-derived cell line
  • FIG. 5a is a view confirmed at the protein level
  • FIG. 5b (A) is a view confirmed at the protein level
  • FIG. 5B (B) is a sequencing result of the trans-splicing product.
  • FIG. 6 is a schematic diagram and results of an APOE4 RNA reaction site mapping experiment in vitro.
  • Figure 7 is a schematic diagram of the reaction site mapping experiment of APOE4 RNA in cells and the results.
  • FIG. 8 is a view confirming the trans-splicing efficiency of ribozymes with different target positions of APOE4 RNA.
  • Figure 9 is a view confirming the +21 targeting ribozyme trans-splicing efficiency according to the introduction of the AS region and the length of the introduced AS region
  • Figure 9a is a view confirmed at the protein level
  • Figure 9b is a view confirmed at the gene level
  • 9C is a sequencing result of a trans splicing product.
  • Figure 10 is a schematic diagram of the structure of the trans-splicing ribozyme of the present invention
  • Figure 10a shows the structure of +21 targeting ribozyme
  • Figure 10b shows the structure of +30 targeting ribozyme
  • Figure 10c is the structure of +56 targeting ribozyme indicates Upstream of the IGS region of each ribozyme may include a three nucleotide region (P1) complementary to APOE4 RNA to increase the binding specificity and binding force of the ribozyme with the target.
  • P1 nucleotide region
  • each ribozyme includes a 5' region including the P1 region at a position downstream of the ribozyme * region and a P10 region with a length of 5 to 10 nt complementary to the ribozyme trans-splicing as shown in FIG. 10 .
  • efficiency can be increased.
  • +21 targeting ribozyme consists of SEQ ID NO: 8
  • +30 targeting ribozyme consists of SEQ ID NO: 9
  • +56 targeting ribozyme consists of or contains the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 may be doing
  • the present inventors studied the cytotoxicity and beta-amyloid accumulation function of the APOE4 protein itself and the gene therapy method for the prevention and treatment of Alzheimer's disease targeting APOE4 from the statistical results of many APOE4 allele carriers among Alzheimer's disease patients. A trans-splicing ribozyme targeting the was completed.
  • the present inventors confirmed the consensus sequence in the 5'-UTR region through sequencing of various APOE RNA variants, and set the region including base +56 of APOE4 RNA as a target.
  • a trans-splicing ribozyme (+56 targeting ribozyme) including an internal guide sequence (IGS) complementary to the target region was designed (Example 1) , It was confirmed that the +56 targeting ribozyme accurately trans-splices at the desired position of APOE4 RNA (Examples 2 and 3).
  • the present inventors introduced an antisense (AS) region having a sequence complementary to APOE RNA at the 5' end of the ribozyme in order to increase the target specificity and trans-splicing efficiency of the +56 targeting ribozyme, and lucifer in the 3' exon region.
  • the degree of trans-splicing activity was confirmed by measuring luciferase activity by introducing the lyase gene. As a result, it was found that the introduction of the AS region and the length of the introduced AS region affect the trans-splicing efficiency of the ribozyme (Example 3-1).
  • the present inventors confirmed the reaction site through sequencing of the transsplicing product generated by mixing APOE4 RNA and random library ribozyme to secure a target region other than the +56 base of APOE4 RNA, and each reaction site As a result of confirming the trans-splicing effect of the ribozyme targeting .
  • the trans-splicing efficiency of ribozymes targeting +21 and +30 of APOE4 RNA was excellent (Example 4).
  • the present inventors found that in the ribozyme targeting APOE4 RNA, the target site preferably includes bases +21, +30, and +56, and an IGS sequence of 5-10 nt in length complementary to the region It can be seen that by including the APOE4 RNA-specific efficient trans-splicing can occur.
  • the AS region of the sequence complementary to APOE4 RNA is included in the upstream of the IGS region, trans-splicing efficiency can be increased, but the optimal AS region for increasing efficiency It can be seen that the length is different depending on the target site (target base) and the target cell.
  • the present inventors provide a trans-splicing ribozyme for reducing the expression of APOE4 protein in neurons in particular for the prevention and treatment of Alzheimer's disease, and the ribozyme is 5'-IGS (internal guide sequence)-Ribozyme * -exon (exon) ) -3' or 5'-AS (antisense) - IGS - Ribozyme * - may have a structure of exon -3'.
  • ribozyme refers to an RNA molecule that acts like an enzyme or a molecule composed of a protein containing the RNA molecule, also called RNA enzyme or catalytic RNA. It is an RNA molecule with a clear tertiary structure that performs a chemical reaction and has catalytic or autocatalytic properties. It is known that some ribozymes inhibit the activity by cleaving self or other RNA molecules, and other ribozymes catalyze the aminotransferase activity of ribosomes. Such ribozymes may include hammerhead ribozymes, VS ribozymes and hairpin ribozymes.
  • trans-splicing refers to linking RNAs from different genes to each other.
  • the ribozyme cuts APOE4 RNA and replaces it with self RNA (particularly, the 3' exon region of the ribozyme) to inhibit the expression of APOE4 protein in the host cell and induce the expression of the gene encoded in the exon region.
  • -me ans a splicing ribozyme.
  • the ribozyme may have a 5'-IGS (internal guide sequence)-Ribozyme * -exon-3' or 5'-AS (antisense) -IGS-Ribozyme * -exon-3' structure.
  • Ribozyme * region in the structure means a region that performs the function of cleavage of APOE4 RNA and/or substitution with an exon region in the trans-splicing ribozyme, and includes or consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 can
  • ribozyme refers to a trans-splicing ribozyme including the entire structure including the ribozyme * region, which is a substantially functional region.
  • the gene encoded in the 3' exon region of the ribozyme may be a gene encoding a known protein (or peptide) known to have neuroprotective activity, preferably the APOE2 or APOE3 christchurch gene.
  • vector refers to an expression vector capable of expressing a trans-splicing ribozyme in a suitable host cell, and a gene construct comprising essential regulatory elements operably linked to express the ribozyme gene insert contained in the vector.
  • operably linked refers to a nucleic acid expression control sequence performing a general function and a nucleic acid sequence encoding a desired gene are functionally linked.
  • operably linking a ribozyme coding sequence to a promoter places expression of the ribozyme coding sequence under the influence or control of the promoter.
  • Two nucleic acid sequences (a ribozyme coding sequence and a promoter region sequence at the 5' end of the sequence) are operably linked when promoter action is induced and the ribozyme coding sequence is transcribed, and the linkage property between the two sequences is frame-altered. If the mutation (frameshift mutation) does not induce and the expression control sequence does not inhibit the expression of the ribozyme, it can be considered to be operably linked.
  • the operable linkage with the recombinant vector may be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation may use enzymes generally known in the art.
  • the vector according to the present invention includes a signal sequence or leader sequence for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as a promoter, operator, initiation codon, stop codon, polyadenylation signal, and enhancer, and may be prepared in various ways depending on the purpose. have.
  • the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • the expression vector contains a selectable marker for selecting host cells containing the vector, and in the case of a replicable expression vector, it may contain an origin of replication. Vectors can be self-replicating or integrated into host DNA.
  • the vector according to the present invention may be preferably a plasmid vector, a cosmid vector or a viral vector, and most preferably a viral vector.
  • the viral vector is preferably a retrovirus, for example, Human immunodeficiency virus (HIV), Murine leukemia virus (MLV), Avian sarcoma/leucosis virus, ASLV), spleen necrosis virus (SNV), Rous sarcoma virus (RSV), mouse mammary tumor virus (MMTV), etc., adenovirus, adeno-associated virus It may be a vector derived from (Adeno-associated virus, AAV), or herpes simplex virus (HSV), but is not limited thereto.
  • the recombinant vector according to the present invention may most preferably be a recombinant adeno-associated viral vector.
  • promoter is involved in the binding of RNA polymerase to initiate transcription as a part of DNA.
  • a transcription factor which is an RNA polymerase or a protein that induces RNA polymerase, to induce the enzyme or protein to be located at the correct transcription start site.
  • a transcription factor which is an RNA polymerase or a protein that induces RNA polymerase, to induce the enzyme or protein to be located at the correct transcription start site.
  • it is located at the 5' region of the gene to be transcribed on the sense strand and induces RNA polymerase to bind to the position directly or through transcription factors to initiate mRNA synthesis for the target gene.
  • the promoter according to the present invention may be a neural cell type-specific promoter from the viewpoint of increasing gene expression in neurons, and the neurons include neurons, astrocytes, and oligodendrocytes.
  • gene delivery system refers to a system capable of increasing the expression efficiency by increasing the delivery efficiency of a ribozyme gene and/or nucleic acid sequence into a cell, and a virus-mediated system and a non-viral system. can be classified as
  • the virus-mediated system uses viral vectors such as retroviral vectors, adenoviral vectors, and adeno-associated viral vectors, and uses the unique intracellular penetration mechanism of viruses that cause infection in human cells. It is known that the efficiency is relatively high.
  • the non-viral vector after entering the cell has a problem in that the endosome is fused with the lysosome and then the genes are degraded in the endolysosome. It has the advantage of high gene transfer efficiency due to its small size.
  • Viral vectors that can be used in the present invention may be vectors derived from retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, etc. as described in the above recombinant vector.
  • a viral vector can be introduced into the cell by a transduction method such as infection (infection) after assembly into the viral particles.
  • the non-viral system is a method of using a cationic lipid carrier or a cationic polymer carrier as a delivery medium for nucleic acids and/or genes, or using an electroporation method.
  • the cationic lipid delivery system uses the positive charge of nanometer-sized liposomes or lipid material nanoparticles mainly composed of cationic lipids to form a complex with a negatively charged gene, an expression vector or a nucleic acid containing the gene, and then converts the complex into phagocytosis.
  • a method of delivery into cells The complex delivered into the cell is first delivered from the endosome to the lysosome, and then exits into the cytoplasm and is expressed.
  • Cationic polymer delivery systems deliver genes in a similar manner to cationic lipid delivery systems except that polymers are used instead of lipids.
  • Representative cationic polymers include polyethyleneimine, poly-L-lysine, and chitosan. (chitosan), etc.
  • the complex formed by combining the recombinant vector of the present invention with a cationic lipid carrier or a cationic polymer carrier can be used as a gene carrier.
  • the gene delivery system includes the above-described recombinant vector, and both a virus-mediated system and a non-viral system may be used, but a virus-mediated system is preferably used.
  • the trans-splicing ribozyme of the present invention can inhibit APOE4 protein expression by targeting APOE4 RNA in neurons, and APOE4 is known as a major risk-inducing gene for Alzheimer's disease.
  • APOE4 is known as a major risk-inducing gene for Alzheimer's disease.
  • a splicing ribozyme, the ribozyme expression vector, and a gene delivery system comprising the vector can be used in a pharmaceutical composition for preventing or treating Alzheimer's disease.
  • prevention refers to any action of inhibiting or delaying the onset of Alzheimer's disease by administering the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment refers to any action that improves Alzheimer's disease or changes its symptoms beneficially by administration of a composition containing the vector according to the present invention.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • pharmaceutically acceptable carriers, excipients and diluents that can be used in the pharmaceutical composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate. , gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, calcium carbonate, cellulose, methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally according to a desired method, but is preferably administered parenterally.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered intravenously, intraarterially, intracerebral tissue, subcutaneous administration or intracisternal injection.
  • the injection according to the present invention may be in a form dispersed in a sterile medium so that it can be used as it is when administered to a patient, or may be administered after dispersing it at an appropriate concentration by adding distilled water for injection during administration.
  • it when prepared as an injection, it may be mixed with a buffer, preservative, analgesic agent, solubilizer, isotonic agent, stabilizer, etc., and may be prepared in a unit dosage ampule or multiple dosage form.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the condition and weight of the patient, the degree of disease, the drug form, the route and time of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art. Meanwhile, the pharmaceutical composition according to the present invention may be used alone or in combination with other Alzheimer's therapeutic agents or treatment methods.
  • RNA variants V1 to V5 published in NCBI were compared, and a ribozyme and GU wobble base pair among the consensus sequence (23 bp) of 5'-UTR was selected.
  • the target site includes the base at position +56 of APOE4 RNA (SEQ ID NO: 11), and IGS (GUUCCG: SEQ ID NO: 2) capable of targeting the target site at the 5' end and the 3' end of the target
  • a trans-splicing ribozyme hereinafter, referred to as '+56 targeting ribozyme'
  • FIG. 2 A trans-splicing ribozyme (hereinafter, referred to as '+56 targeting ribozyme') targeting ApoE4 RNA into which the gene ApoE2 was introduced was constructed (FIG. 2).
  • the +56 targeting ribozyme was cloned into a pcDNA vector to prepare a vector for trans-splicing ribozyme expression.
  • RNA product after the reaction was recovered by phenol extraction/ethanol precipitation method and dissolved in 10 ⁇ l of distilled water (D.W) treated with DEPC (diethyl pyrocarbonate).
  • an antisense (AS) region having a sequence complementary to APOE4 RNA was introduced at the 5' end of the ribozyme.
  • a luciferase gene was introduced into the 3' exon region of the ribozyme in order to confirm trans-splicing efficiency according to the length of the AS region. Luciferase activity was measured when the length of the AS region was 0 nt, 50 nt, 100 nt, or 150 nt.
  • each ribozyme expression vector was transfected into the Huh-7.5 cell line expressing ApoE and the 293A cell line not expressing it, and a luciferase assay was performed.
  • the trans-splicing efficiency of the trans-splice ribozyme introduced with 50 antisense sequences was remarkably excellent, but in the 293A cell line, the trans-splicing of each ribozyme was It was confirmed that there was no significant difference in the efficiency (FIG. 4B).
  • the trans-splicing ribozyme should be able to effectively trans-splice in neurons to reduce APOE4 gene expression. Accordingly, the experiment of Example 3-1 was repeated in a neuron-derived cell line, and the trans-splicing efficiency according to the length of the AS region was confirmed.
  • 1x10 5 CCF-STTG1 (E3/E4, astrocyte) cells were cultured in a 12 well plate for 24 hours, and +56 containing AS regions of different lengths (0nt, 50nt, 100nt, or 150nt) 500ng of a plasmid vector expressing a targeting ribozyme and 50ng of a pTK-renilla luciferase plasmid vector were co-transfected for 48 hours.
  • transsplicing of APOE4 RNA was induced by ribozyme in CCF-STTG1 cells regardless of the presence or absence of the AS region and the length of the AS region. It was confirmed that the trans-splicing efficiency by the zyme was excellent (FIG. 5a).
  • electrophoresis was performed to detect a trans-splicing product. More specifically, 2x10 5 CCF-STTG1 or U118MG (E2/E4) cells were cultured in a 6 well plate for 24 hours, and transformation was induced with 2.5ug of +56 targeting ribozyme expression vector. After 48 hours, all of the culture medium was removed, washed once with 1 mL of 1xPBS, and the cells recovered and 100uL of chloroform were mixed to extract total RNA. After adding RT primer (5'-CCCATATCGTTTCATAGCTTCTGCC-3') to 1ug of the extracted total RNA, reverse transcription was performed under 20uL volume conditions to generate cDNA.
  • RT primer 5'-CCCATATCGTTTCATAGCTTCTGCC-3'
  • 2uL of the cDNA was mixed with a forward primer (5'-CAGCGGAGGTGAAGGACGT-3') and a reverse primer (5'-ATGTTCACCTCGATATGTGCATC-3') and subjected to 30 cycle PCR under the conditions of 95 °C 30 sec, 58 °C 30 sec, 72 °C 30 sec. and confirmed the PCR band on 2% TBE agarose gel.
  • a forward primer 5'-CAGCGGAGGTGAAGGACGT-3'
  • a reverse primer 5'-ATGTTCACCTCGATATGTGCATC-3'
  • APOE4 RNA and random library ribozyme were mixed and reacted in a test tube, followed by RT-PCR. Sequence analysis of PCR DNA band expected as a transsplicing product The APOE4 RNA site where trans-splicing occurred was confirmed.
  • APOE4 RNA was synthesized through the in-vitro transcription process, and a trans-splicing ribozyme RNA library having a random sequence (GNNNNN) at the 5' end was synthesized through the in vitro transcription process.
  • trans-splicing ribozyme targeting the +21 base of APOE4 RNA (hereinafter referred to as '+21 targeting ribozyme') is effective in reducing APOE4 protein expression.
  • +30, +71, +77, +80, and +82 sites identified as overlapping and +21 sites with the highest transsplicing frequency for in vitro mapping were selected.
  • a ribozyme targeting each site was prepared, and trans-splicing was confirmed by performing an in vitro trans-splicing reaction.
  • +56 targeting ribozyme was used as a control.
  • APOE4 RNA was mixed with 1 pmole of each trans-splicing ribozyme library RNA to induce a trans-splicing reaction.
  • RNA was recovered from each reaction solution, RT-PCR was performed, and the prepared cDNA was used with APOE4 RNA specific 5' primer (5'-CTACTCAGCCCCAGCGGAGG-3') and ribozyme specific 3' primer (5'-TGTAAAAACGACGGCCAGTG-3') and PCR amplification (95 °C 30 sec, 55 °C 30 sec, 72 °C 30 sec, 35 cycle), and each amplified product was confirmed by electrophoresis on agarose gel.
  • the target region including the +21 base is 5'-GGAGGU-3' (SEQ ID NO: 3), and the IGS of the +21 targeting ribozyme has 5'-GCCUCC-3' (SEQ ID NO: 4).
  • the target region including base +30 in APOE4 RNA is 5'-GGACGU-3' (SEQ ID NO: 5), and the IGS of +30 targeting ribozyme has 5'-GCGUCC-3' (SEQ ID NO: 6).
  • a ribozyme introduced with an AS region having a different length as in Example 3 was prepared. After transformation into Huh-7.5 cells, CCF-STTG1 cells, and U118MG cells, the degree of trans-splicing was confirmed at the protein level and gene level.
  • the ribozyme targeting the +21 base of APOE4 RNA induced transsplicing of APOE4 RNA in cells expressing APOE4 regardless of whether the AS region was introduced or the length of the AS region. It was confirmed that the trans-splicing efficiency was remarkably excellent in the ribozyme into which the 50 nt-length AS region was introduced (FIG. 9a).
  • the trans-splicing product confirmation result was the same as the protein-level confirmation result (FIG. 9b), and it was confirmed that the reaction occurred precisely at the expected trans-splicing position as a result of sequencing of the trans-splicing product (Fig. 9c).
  • the APOE4 target trans-splicing ribozyme of the present invention can be used as a drug for the prevention or treatment of Alzheimer's disease by inhibiting the expression of APOE4 protein, which itself increases the incidence of Alzheimer's disease, and by trans-splicing Since it can induce the expression of a gene that lowers the incidence of Alzheimer's disease, it can be used as a platform for introducing a therapeutic gene for Alzheimer's disease.

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Abstract

본 발명은 알츠하이머병 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도에 관한 것이다. 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임은 알츠하이머병의 발병 원인이 되거나 발병 위험을 높이는 유전자의 RNA를 질환 치료에 유익한 유전자의 RNA로 치환하여 질환 원인 유전자의 발현은 낮추고, 질환 치료에 유익한 유전자의 발현은 증가시키므로 알츠하이머병의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

APOE4 RNA 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도
본 발명은 APOE4 유전자 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도 등에 관한 것이다.
경제가 발전하면서 식생활 및 위생 상태가 좋아지고, 의료 기술 또한 개선되면서 사람들의 평균 수명이 계속 연장되고 있다. 우리나라는 2000년에 65세 이상 인구 비율이 7.2%에 이르러 고령화 사회에 진입하였고, 2017년에는 그 비중이 14%를 넘어 고령사회가 되었다. 65세 이상 노인 인구의 비중이 급격히 증가하면서 만성 노인성 질환을 앓는 노인 인구가 증가하고 있으며 이는 노인 인구 및 가족들의 삶의 질을 현저히 떨어뜨리고, 사회적 비용 또한 크게 증가시킨다. 주요 노인성 질환에는 치매, 파킨슨, 뇌졸중이 있으며, 국민건강보험 공단의 자료에 따르면 2014년부터 2018년까지 치매, 파킨슨, 뇌졸중으로 진료받은 인원은 605만 9,437명에 이른다.
알츠하이머병(Alzheimer's disease)은 치매의 주요 원인 중 하나로 아밀로이드 베타 단백질, 타우 단백질 등 이상 단백질이 뇌 속에 쌓이면서 서서히 뇌 신경세포를 손상시키는 퇴행성 뇌 질환이다. 기억력을 비롯해 인지기능이 점점 떨어지고, 더 진행하면 언어·보행 장애가 나타나며 혼자서는 일상 생활이 어려워진다.
알츠하이머병 발병 기작에 대한 연구는 대부분 아밀로이드 가설에 근거하고 있으며, 이를 기반으로 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP), 베타-사이트 아밀로이드 전구체 단백질 절단 효소 (β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme, BACE), 프레셀린(Presenilin) 유전자에 대한 연구, 세포 내 다른 요인과의 상호작용 및 조절에 대한 연구, 인자들의 생성, 분해 및 신호전달에 대한 연구가 주를 이루어 왔다.
아밀로이드 가설에 인해 대부분의 알츠하이머병 치료 후보 물질은 'BACE1 억제', '아밀로이드 베타 피브릴 형성 억제'에 초점이 맞춰져 있다. 그러나 아밀로이드 베타를 겨냥한 항체인 릴리의 솔라네주맙은 경도치매 환자에서 임상 3상에 실패하였고, 노바티스와 암젠이 알츠하이머 질환을 적응증으로 공동 개발 중이던 BACE1 억제제 'CNP520' 또한 환자의 인지 기능 개선에 실패하였다. 이에 알츠하이머병의 발병 원인으로 여겨졌던 아밀로이드 가설이 흔들리고 있으며, 알츠하이머병 치료를 위해서는 표적 분자를 변경하거나, 접근 방식을 변경해야 한다는 주장이 나오고 있다.
ApoE(Apolipoprotein E)는 간 및 뇌 등에서 발현하는 단백질로서, 최근 뇌에서 발현되는 ApoE 단백질과 알츠하이머와의 관련성을 뒷받침하는 연구 결과가 다수 제시되고 있다. ApoE 단백질은 ApoE2, ApoE3, 및 ApoE4의 이형태를 가지고 있으며, ApoE2는 신경세포를 보호하는 기능을 수행하고, ApoE4는 베타 아밀로이드의 축적에 기여하고 그 자체로 신경독성을 나타냄이 알려져 있다. 또한, 매타게놈 연구를 기반으로한 통계적 분석 결과 APOE4는 알츠하이머병을 유발하는 유전적 인자인 것이 밝혀졌다. 이에, 알츠하이머병 치료를 위하여 ApoE4의 기능을 차단하고자 하는 시도가 진행되고 있으나 아직 미진한 실정이다. 한편, ApoE3 christchurch (ApoE3ch) 돌연변이는 70대의 고령의 노인에서 발견된 ApoE3의 돌연변이 형태이며, 이러한 돌연변이를 가지는 사람은, 뇌 전체에서 아밀로이드 플라크가 발견이 되지만, 인지 장애가 발생하지 않는 것이 밝혀져 있다(Nature medicine 2019;11:1680-1683.).
한편, Tetrahmena thermophila로부터의 그룹 I 인트론 리보자임이 실험관 내에서 리보자임의 3' 말단에 부착되어 있는 엑손 RNA를 트랜스하게 존재하는 5'엑손을 표적으로 한 후 부착시킴으로써 별도로 존재하는 전사체와 서로 연결시킬 수 있는 트랜스-스플라이싱 반응을 일으킬 수 있음이 보고되었다. 이는 곧 그룹 I 리보자임의 트랜스-스플라이싱 반응을 통하여 여러 유전질환과 관련있는 유전자의 전사체도 보정될 수 있음을 시사하며 실제로 최근에 겸상적혈구(sickle cell) 질병을 갖은 환자의 적혈구 전구 (erythrocyte precursor) 세포에서 β-글로빈 유전자 전사체가 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의해 항-겸상적 혈구화(anti-sickling), γ-글로빈 유전자 전사체로 전환될 수 있음이 밝혀졌다.
유전자 치료 방법으로서 트랜스 스플라이싱 리보자임은 돌연변이 유전자 RNA를정상 RNA로 보정할 수 있으며, 마찬가지 원리로 특정 유전자의 발현을 감소와 동시에 목적 유전자를 숙주세포에서 발현시킬 수 있다. 이때 리보자임은 RNA 수준에서 작동하기 때문에 숙주세포 게놈 내 무작위 위치에서 유전자의 혼입에 의한 바람직하지 않은 면역 반응 문제 및 안전성 문제 등을 야기하지 않는 장점이 있다.
이에, 본 발명자들은 APOE4를 타겟으로 하는 트랜스-스플라이싱 리보자임을 이용한 알츠하이머병 치료 방법에 대해 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위한 것으로서, 안전성 및 발현 효율이 우수한 알츠하이머병 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이를 이용한 알츠하이머병의 치료 용도를 제공하는 데 그 목적이 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 APOE4 RNA를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 리보자임을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임은 5'- IGS (internal guide sequence)-Ribozyme*-엑손(exon)-3'의 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 IGS 영역은 APOE4 RNA의 5' UTR 영역에 특이적으로 결합하고 G/U wobble base pair을 형성할 수 있는 5 ~ 10 nt 길이의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 바람직하게는, APOE4 RNA의 +21, +30,+49, +56, +71, +77, +80, +82, +95, +98, +104, +128, +140, +181, +229, +255, +263, +275, +326, +368, +830, 또는 +839 위치, 바람직하게는 +21, +30, 또는 +56 위치를 포함하는 영역과 상보적으로 결합하고 G/U wobble base pair을 형성할 수 있는 5 ~ 10 nt 길이의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 IGS 영역은 서열번호 2, 4, 또는 6의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임은 IGS 영역의 upstream에 APOE4 유전자의 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 AS(antisense sequence) 영역을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 AS 영역의 길이는 10 nt 내지 200 nt, 바람직하게는 50 nt 내지 150 nt 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임은 서열번호 2로 이루어진 IGS 영역을 포함하고, 150nt 길이의 AS 영역을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임은 서열번호 4로 이루어진 IGS 영역을 포함하고, 50nt 길이의 AS 영역을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 IGS 영역과 AS 영역 사이에는 5~10개의 무작위 뉴클레오티드가 포함될 수 있으며, 상기 무작위 뉴클레오티드 서열은 제한효소 서열일 수 있고, 상기 무작위 뉴클레오티드 서열은 바람직하게 6nt 길이일 수 있으며, 도 10에 도식화된 P1 및 P10의 일부와 상보적인 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 Ribozyme* 영역은 서열번호 7의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 엑손 영역은 알츠하이머병 예방 또는 치료용 유전자일 수 있으며, ApoE2 또는 ApoE3 christchurch 돌연변이 (R136S)을 암호화하는 염기서열의 일부 또는 전부를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임의 염기서열 및/또는 이와 상보적인 염기서열을 포함하는 트랜스-스플라이싱 리보자임 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 발현 벡터는 상기 리보자임 유전자와 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 프로모터는 신경세포 특이적인 프로모터일 수 있고, 상기 신경세포는 뉴런(neuron), 선상세포(astrocyte), 및 희돌기교 세포(oligodendrocyte)를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임 발현 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임, 이를 발현할 수 있는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임, 이를 발현할 수 있는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 개체는 알츠하이머병의 예방 또는 치료가 필요한 인간, 보다 구체적으로 알츠하이머병 환자, 고령자(만 60세 이상), 또는 APOE4 대립 유전자 보유자일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 방법은 개체의 인지 능력 정도를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 알츠하이머병 예방 또는 치료 약제의 제조를 위한 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임, 이를 발현할 수 있는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템의 용도를 제공한다. 본 발명에서 상기 알츠하이머병은 아밀로이드 베타 단백질, 타우 단백질 등 이상 단백질이 뇌 속에 쌓이면서 서서히 뇌 신경세포가 손상되는 신경 퇴행성 질환이며, 알츠하이머병이 진행되어 나타나는 다른 질환들, 예를 들어 알츠하이머성 치매와 같은 질환을 포함한다.
본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임은 알츠하이머병의 발병 원인이 되거나 발병 위험을 높이는 유전자의 RNA를 질환 치료에 유익한 유전자의 RNA로 치환하여 질환 원인이 되거나 발병 위험을 높이는 유전자의 발현은 낮추고, 질환 치료에 유익한 유전자의 발현을 표적 유전자를 발현하는 세포 또는 조직 특이적으로 증가시키므로 알츠하이머병의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 APOE4 RNA를 표적하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임의 작용 기전 모식도와(도 1a), ApoE4 RNA 표적용 트랜스-스플라이싱 리보자임을 제작하기 위해 ApoE RNA 변이체들의 서열을 비교한 결과 도면이다(도 1b).
도 2는 본 발명의 ApoE4 RNA 표적용 트랜스-스플라이싱 리보자임을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 APOE4 RNA의 +56번 염기를 타겟으로 하는 +56 targeting ribozyme의 트랜스 스플라이싱 효과를 확인한 것으로서, A는 +56 targeting ribozyme 에 의한 트랜스-스플라이싱 산물 생성 여부를 확인한 결과이고, B는 생성된 트랜스-스플라이싱 산물의 서열분석 결과이다.
도 4는 트랜스 스플라이싱 효율에 있어 AS 영역의 효과를 확인한 것으로서, A는 ApoE RNA 표적용 트랜스-스플라이싱 리보자임의 5' 말단에 AS 영역을 도입한 구조를 보여주고, B는 AS 영역의 도입 및 도입된 AS 영역의 길이에 따른 리보자임의 트랜스 스플라이싱 효율을 확인한 그래프이다.
도 5는 신경세포 유래 세포주에서 AS 영역의 도입 및 도입된 AS 영역의 길이에 따른 +56 targeting ribozyme 트랜스 스플라이싱 효율을 확인한 것으로서, 도 5a는 단백질 수준에서 확인한 도면이고, 도 5b에 (A)는 단백질 수준에서 확인한 도면이이고, 도 5b에 (B)는 트랜스 스플라이싱 산물의 서열분석 결과이다.
도 6은 in vitro상에서 APOE4 RNA의 reaction site mapping 실험의 모식도 및 그 결과 도면이다.
도 7은 세포 안에서 APOE4 RNA의 reaction site mapping 실험의 모식도 및 그 결과 도면이다.
도 8은 APOE4 RNA의 표적 위치를 달리한 리보자임의 트랜스 스플라이싱 효율을 확인한 도면이다.
도 9는 AS 영역의 도입 및 도입된 AS 영역의 길이에 따른 +21 targeting ribozyme 트랜스 스플라이싱 효율을 확인한 것으로서, 도 9a는 단백질 수준에서 확인한 도면이고, 도 9b는 유전자 수준에서 확인한 도면이이고, 도 9c는 트랜스 스플라이싱 산물의 서열분석 결과이다.
도 10은 본 발명의 트랜스-스플라이싱 리보자임 구조 모식도로, 도 10a 는 +21 targeting ribozyme의 구조를 나타내며, 도 10b는 +30 targeting ribozyme의 구조를 나타내고, 도 10c는 +56 targeting ribozyme의 구조를 나타낸다. 각 리보자임의 IGS 영역의 upstream에는 APOE4 RNA 와 상보적인 3개의 뉴클레오타이드 영역(P1)이 포함되어 리보자임의 타겟과의 결합 특이성 및 결합력을 증가시킬 수 있다. 또한, 각 리보자임은 도 10에 도식화한바와 같이 Ribozyme* 영역의 downstream 위치에 상기 P1영역을 포함하는 5' 영역과 상보적인 5~10nt 길이의 P10 영역을 포함하여 리보자임의 트랜스-스플라이싱 효율을 증가시킬 수 있다. AS 영역 및 exon 영역을 제외한 리보자임의 구체적인 서열과 관련하여, +21 targeting ribozyme은 서열번호 8, +30 targeting ribozyme은 서열번호 9, +56 targeting ribozyme은 서열번호 10의 염기서열로 이루어지거나 이를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명자들은 APOE4 단백질 자체의 세포독성 및 베타 아밀로이드 축적 기능과 알츠하이머병 환자 중에서 APOE4 대립 유전자 보유자가 많은 통계적 결과로부터 APOE4를 타겟으로 하는 알츠하이머병의 예방 및 치료를 위한 유전자 치료 방법에 대해 예의 연구하여 APOE4를 타겟으로 하는 트랜스 스플라이싱 리보자임을 완성하였다.
보다 구체적으로, 본 발명자들은 다양한 APOE RNA 변이체의 서열분석을 통해 5'-UTR 영역에 공통서열을 확인하고, APOE4 RNA의 +56번 염기를 포함하는 영역을 타겟으로 설정하였다. APOE4 RNA와 반응 특이성을 향상시키기 위하여 상기 타겟 영역과 상보적인 서열의 내부가이드 서열(Internal Guide Sequence, IGS)을 포함한 트랜스-스플라이싱 리보자임(+56 targeting ribozyme)을 설계하고(실시예 1), +56 targeting ribozyme이 APOE4 RNA의 원하는 위치에서 정확하게 트랜스-스플라이싱함을 확인하였다 (실시예 2 및 3).
이어서, 본 발명자들은 +56 targeting ribozyme의 표적 특이성 및 트랜스 스플라이싱 효율 증대를 위하여 리보자임의 5' 말단에 APOE RNA와 상보적인 서열을 갖는 안티센스(AS) 영역을 도입하고 3' 엑손 영역에 루시퍼라아제 유전자를 도입하여 루시퍼라아제 활성 측정을 통해 트랜스 스플라이싱 활성 정도를 확인하였다. 그 결과, AS 영역의 도입과 도입된 AS 영역의 길이는 리보자임의 트랜스-스플라이싱 효율에 영향을 미침을 알 수 있었다(실시예 3-1).
신경세포에 특이적이고 보다 효율적인 트랜스 스플라이싱 리보자임 설계를 위하여 신경세포 유래 세포주에서 동일한 실험을 수행한 결과 +56 targeting ribozyme은 150nt 길이의 AS 영역이 도입되는 경우 우수한 트랜스 스플라이싱 효율을 나타냄을 알 수 있었다(실시예 3-2).
이어서, 본 발명자들은 APOE4 RNA의 +56번 염기 이외의 표적 영역을 확보하기 위하여 APOE4 RNA와 random library ribozyme을 혼합하여 생성된 트랜스 스플라이싱 산물의 서열분석을 통하여 reaction site를 확인하고, 각 reaction site를 타겟으로 하는 리보자임의 트랜스 스플라이싱 효과를 확인한 결과, +56번 염기 이외에도 APOE4 RNA의 +21, +30, +71, 및 +77 site가 효과적인 타겟 영역으로 이용될 수 있음을 알 수 있었다. 그 중에서도 특히 APOE4 RNA의 +21 및 +30을 표적으로 하는 리보자임의 트랜스 스플라이싱 효율이 우수함을 확인하였다(실시예 4).
또한, 본 발명자들은 APOE4 RNA의 타겟 위치의 변화에 따른 최적의 AS 영역길이를 탐구한 결과, +21 targeting ribozyme은 50 nt 길이의 AS 영역이 도입되는 경우 트랜스 스플라이싱 효율이 증대됨을 확인할 수 있었다(실시예 5).
상기 결과로부터 본 발명자들은 APOE4 RNA를 표적으로 하는 리보자임에 있어서 표적 부위는 +21, +30, 및 +56 번 염기를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 영역과 상보적인 5~10 nt 길이의 IGS 서열을 포함함으로서 APOE4 RNA 특이적으로 효율적인 트랜스 스플라이싱을 발생시킬 수 있음을 알 수 있다.
또한, APOE4 RNA를 표적으로 하는 리보자임에 있어서 IGS 영역의 upstream에 APOE4 RNA와 상보적인 서열의 AS 영역이 포함되는 경우 트랜스 스플라이싱 효율을 증가시킬 수 있으나, 효율 증대를 위한 최적의 AS 영역의 길이는 표적 부위(표적 염기)와 표적 세포에 따라 상이함을 알 수 있다.
본 발명자들은 알츠하이머병 예방 및 치료를 위하여 특히 신경세포에서 APOE4 단백질 발현 저하를 위한 트랜스 스플라이싱 리보자임을 제공하며, 상기 리보자임은 5'- IGS (internal guide sequence)-Ribozyme*-엑손(exon)-3'의 구조 또는 5'-AS(antisense) - IGS - Ribozyme* - 엑손 -3'의 구조를 가질 수 있다.
본 발명에서 사용된 “리보자임”이라는 용어는 효소처럼 작용하는 RNA 분자 또는 그 RNA 분자를 포함하는 단백질로 구성되는 분자로 RNA 효소 또는 촉매적 RNA라고도 불린다. 명확한 3차 구조를 갖는 RNA 분자로 화학반응을 수행하며 촉매적 또는 자기촉매적 특성을 가진다. 일부 리보자임은 자기 또는 다른 RNA 분자를 절단하여 활성을 저해하고, 다른 리보자임은 리보솜의 아미노전달효소(aminotransferase) 활성을 촉매하는 것으로 알려져다. 이러한 리보자임에는 망치머리(hammerhead) 리보자임, VS 리보자임 및 헤어핀(hairpin) 리보자임 등이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 “트랜스-스플라이싱(trans-splicing)”은 서로 다른 유전자로부터의 RNA를 서로 연결하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 리보자임은 APOE4 RNA를 절단하고 자기 RNA(특히, 리보자임의 3' exon 영역)로 치환하여 숙주세포 내에서 APOE4 단백질의 발현을 저해하고 exon 영역에 암호화된 유전자의 발현을 유도하는 트랜스-스플라이싱 리보자임을 의미한다. 본 발명에서 리보자임은 5'- IGS (internal guide sequence)-Ribozyme*-엑손(exon)-3' 또는 5'-AS(antisense) - IGS - Ribozyme* - 엑손 -3' 구조를 가질 수 있다. 상기 구조 내의 Ribozyme* 영역은 트랜스-스플라이싱 리보자임 내에서 APOE4 RNA의 절단 및/또는 exon 영역으로의 치환의 기능을 수행하는 영역을 의미하고, 서열번호 7의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다. 본 명세서 내에서 특별한 언급이 없는 한 리보자임은 실질적 기능 수행 영역인 Ribozyme* 영역을 포함한 상기 전체 구조를 포함한 트랜스-스플라이싱 리보자임을 지칭한다.
본 발명에서 리보자임의 3' 엑손(exon) 영역에 암호화되는 유전자는 신경세포 보호 활성이 있는 것으로 알려진 공지의 단백질(또는 펩타이드)를 암호화하는 유전자일 수 있으며, 바람직하게는 APOE2 또는 APOE3 christchurch 유전자일 수 있다.
본 명세서에서 “벡터”는 적당한 숙주세포에서 트랜스 스플라이싱 리보자임을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 벡터 내에 포함된 리보자임 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 구조물을 말한다.
본 명세서에서 “작동 가능하게 연결된(operably linked)”은 일반적 기능을 수행하는 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 유전자를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다.
예를 들어, 리보자임 암호화 서열을 프로모터에 작동 가능하게 연결시키면 리보자임 암호화 서열의 발현은 프로모터의 영향 또는 조절 하에 있게 된다. 2개의 핵산 서열(리보자임 암호화 서열 및 이 서열의 5' 말단의 프로모터 부위 서열)은 프로모터 작용이 유도되어 리보자임 암호화 서열이 전사되면 작동 가능하게 연결된 것이며, 상기 두 서열 사이의 연결 특성이 프레임 변경 돌연변이(frameshift mutation)를 유도하지 않고, 발현 조절 서열이 리보자임의 발현을 저해하지 않으면 작동 가능하게 연결된 것으로 볼 수 있다. 재조합 벡터와의 작동 가능한 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서와 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.
본 발명에 따른 벡터는 바람직하게는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 또는 바이러스 벡터 등일 수 있고, 가장 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 바람직하게는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스(Human immunodeficiency virus, HIV), 마우스 백혈병 바이러스(Murine leukemia virus, MLV), 조류 육종/백혈병 바이러스(Avian sarcoma/leucosis virus, ASLV), 비장 괴사 바이러스(Spleen necrosis virus, SNV), 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV), 마우스 유방 종양 바이러스(Mouse mammary tumor virus, MMTV) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus, AAV), 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus, HSV) 등에서 유래한 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 재조합 벡터는 가장 바람직하게는 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명에서 사용된 “프로모터”라는 용어는 DNA의 일부분으로 전사를 개시할 수 있도록 RNA 중합효소의 결합에 관여한다. 일반적으로 표적 유전자에 인접하여 이의 상류에 위치하며, RNA 중합효소 또는 RNA 중합효소를 유도하는 단백질인 전사 인자(transcription factor)가 결합하는 자리로서 상기 효소 또는 단백질이 올바른 전사 시작 부위에 위치하도록 유도할 수 있다. 즉, 센스 가닥(sense strand)에서 전사하고자 하는 유전자의 5' 부위에 위치하여 RNA 중합효소가 직접 또는 전사인자를 통해 해당 위치에 결합하여 표적 유전자에 대한 mRNA 합성을 개시하도록 유도하는 것으로 특정한 유전자 서열을 갖는다.
본 발명에 따른 프로모터는 신경세포에서 유전자의 발현을 높이기 위한 관점에서 신경세포 타입 특이적인 프로모터일 수 있으며, 상기 신경세포는 뉴런, 성상세포, 및 희돌기교 세포를 포함한다.
본 명세서에서 “유전자 전달 시스템(gene delivery system)”은 리보자임 유전자 및/또는 핵산 서열의 세포 내부로의 전달 효율을 높여 발현 효율을 증가시킬 수 있는 시스템을 의미하며, 바이러스 매개 시스템 및 비바이러스 시스템으로 분류될 수 있다.
바이러스 매개 시스템은 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련바이러스 벡터와 같은 바이러스성 벡터를 사용하며, 인간 세포에 감염을 일으키는 바이러스 고유의 세포 내 침투 기전을 이용하므로 비바이러스성 시스템보다 세포내 유전자 전달 효율이 비교적 높은 것으로 알려져 있다. 또한, 세포 내로 들어간 다음 비바이러스성 벡터는 엔도솜이 리소좀과 융합된 다음 엔도리소좀에서 유전자들이 분해되는 문제점이 있으나, 바이러스성 벡터는 리소좀을 통과하지 않고 핵 내로 유전자를 전달하는 기전에 의하여 유전자의 손실이 작아서 유전자 전달 효율이 높은 장점이 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 바이러스성 벡터는 상기 재조합 벡터에서 설명한 바와 같이 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 등에서 유래한 벡터일 수 있다. 이러한 바이러스성 벡터는 바이러스 입자에 조립된 후 감염(infection)과 같은 형질도입(transduction) 방법으로 세포 내부로 도입될 수 있다.
상기 비바이러스성 시스템은 핵산 및/또는 유전자의 전달 매개체로 양이온성 지질 전달체 또는 양이온성 고분자 전달체 등을 이용하거나, 전기 천공법을 사용하는 방법이다.
양이온성 지질 전달체는 주로 양이온성 지질로 이루어진 나노미터 크기의 리포좀이나 지질 소재 나노입자의 양전하를 이용하여 음전하인 유전자, 유전자를 포함하는 발현 벡터 또는 핵산과 복합체를 형성시킨 후 이 복합체를 탐식 작용으로 세포 내로 전달하는 방법이다. 세포 내로 전달된 복합체는 엔도솜에서 리소좀으로 1차 전달된 다음 세포질로 빠져나와 발현된다. 양이온성 고분자 전달체는 지질 대신 고분자를 사용하는 것을 제외하면 양이온성 지질 전달체와 유사한 방식으로 유전자를 전달하며, 대표적인 양이온성 고분자로는 폴리에틸렌이민 (polyethyleneimine), 폴리라이신(poly-L-lysine), 키토산(chitosan) 등이 있다.
따라서, 본 발명의 재조합 벡터가 양이온성 지질 전달체 또는 양이온성 고분자 전달체와 결합하여 형성된 복합체는 유전자 전달체로 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 유전자 전달 시스템은 상기 설명한 재조합 벡터를 포함하며, 바이러스 매개 시스템 및 비바이러스 시스템 모두 사용될 수 있으나, 바이러스 매개 시스템을 사용하는 것이 바림직하다.
한편, 본 발명의 트랜스-스플라이싱 리보자임은 신경세포에서 APOE4 RNA를 타겟으로 하여 APOE4 단백질 발현을 저해할 수 있고, APOE4는 알츠하이머병의 주요 발병 위험 유발 유전자로 알려져 있는바, 본 발명의 트랜스-스플라이싱 리보자임, 상기 리보자임 발현 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템은 알츠하이머병의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물에 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 "예방"이라는 용어는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여로 알츠하이머병을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용된 "치료"라는 용어는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 조성물의 투여로 알츠하이머병이 호전되거나 그 증상을 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 칼슘 카보네이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으나, 비경구로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 뇌조직 내, 피하 투여 또는 intracisternal injection 수 있다. 본 발명에 따른 주사제는 환자에게 투여시 그대로 이용될 수 있도록 멸균 매질에 분산된 형태일 수 있으며, 투여시 주사용 증류수를 가해 적절한 농도로 분산시킨 다음 투여하는 형태일 수도 있다. 또한, 주사제로 제조될 때 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등과 혼합될 수 있고, 단위 투약 앰플 또는 다중 투약 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 단독으로 사용되거나, 또는 타 알츠하이머 치료제 또는 치료 방법과 병행하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. ApoE4 RNA +56 targeting 트랜스-스플라이싱 리보자임 설계 및 제작
타겟 RNA 부위를 선정하기 위해 NCBI에 공개된 APOE RNA 변이체들 (V1 내지 V5)의 서열을 비교하고, 5'-UTR의 공통서열(23 bp) 중에서 리보자임과 G-U 워블 염기쌍(wobble base pair)을 형성할 수 있는 우라실(U) 염기가 포함된 서열(GCCAAU: 서열번호 1)을 타겟 부위로 선정하였다(도 1).
상기 타겟 부위는 APOE4 RNA(서열번호 11)의 +56 위치의 염기를 포함하고, 5' 말단에 상기 타겟 부위를 표적할 수 있는 IGS (GUUCCG: 서열번호 2) 과 3' 말단에는 치환하고자 하는 목적 유전자인 ApoE2를 도입된 ApoE4 RNA를 표적하는 트랜스-스플라이싱 리보자임(이하, '+56 targeting ribozyme'이라 함)을 제작하였다(도 2).
상기 +56 targeting ribozyme을 pcDNA 벡터에 클로닝하여 트랜스-스플라이싱 리보자임 발현용 벡터를 제작하였다.
실시예 2. +56 targeting 리보자임의 트랜스 스플라이싱 효과 확인
상기 실시예 1에서 제작한 +56 targeting ribozyme의 효과를 하기와 같이 확인하였다.
리보자임 1 pmole 및 ApoE4 RNA 1 pmole을 트랜스-스플라이싱 반응버퍼 (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5mM MgCl 2, pH 7.0)와 섞은 후 부피를 9 ㎕로 맞추고, 95℃에서 1분 동안 가열하였다. 37℃에서 3분 동안 방치한 뒤 1mM GTP 1 ㎕ 를 첨가하여 부피를 10 ㎕로 맞추고, 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 RNA 산물은 페놀 추출/에탄올 침전 방법으로 회수하여 DEPC(diethyl pyrocarbonate)가 처리된 증류수(D.W) 10 ㎕에 녹였다. 회수한 RNA에 RY-RT 프라이머 (5'-ATGTGCTGCAAGGCGATT―3') 10 pmole을 넣어 95℃에서 1분 동안 가열하고 상온에서 10분 동안 방치하였다. 이후 RNA에 10mM dNTP 1 ㎕, 5x RTase buffer 4 ㎕, RTase 1 ㎕ 및 DEPC가 처리된 D.W를 첨가하여 부피를 20 ㎕로 맞추고, 42℃에서 50분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
합성한 cDNA 2 ㎕, 5X PCR 버퍼 10 ㎕, 10mM dNTP 1 ㎕, ApoE4 전방향 프라이머 (5'- CTACTCAGCCCCAGCGGAGGTGAAGG - 3') 10 pmole, RY-TS 프라이머 (5'-TGTAAAACGACGGCCAGTG-3') 10 pmole 및 Phusion DNA taq polymerase 0.2 ㎕를 혼합하였다. 여기에 D.W를 첨가하여 부피를 50 ㎕로 맞추고, 98℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 15초 조건으로 30 사이클을 증폭시켜 트랜스-스플라이싱 산물 DNA를 수득하였다. PCR 산물 5 ㎕를 2% TBE 아가로스 젤에서 전기영동하여 트랜스-스플라이싱 산물의 생성 여부를 확인하고, 생성물의 서열분석을 수행하였다.
전기영동 결과, ApoE4 RNA가 리보자임의 3' 엑손 RNA로 치환되었을 때 생성되는 트랜스-스플라이싱 산물(131 bp)을 확인할 수 있었고, 서열분석(sequencing) 결과 생성물은 ApoE4 RNA의 5'-UTR에 리보자임의 3' 엑손 RNA가 연결된 것임을 알 수 있었다(도 3).
실시예 3. +56 targeting 트랜스-스플라이싱 리보자임 최적화
3-1. 안티센스(anti-sense: AS) 영역 도입의 효과 확인
실시예 1에서 제작한 +56 targeting ribozyme의 표적 특이성 및 트랜스-스플라이싱 효율 증가를 위해 리보자임의 5' 말단에 APOE4 RNA와 상보적인 서열을 갖는 안티센스(AS) 영역을 도입하였다. 상기 AS 영역의 길이에 따른 트랜스 스플라이싱 효율을 확인하기 위하여 상기 리보자임의 3' 엑손 영역에 루시퍼라아제 유전자를 도입하였다. AS 영역의 길이가 0nt, 50nt, 100nt, 또는 150nt일 때 루시퍼라아제 활성을 측정하였다.
보다 구체적으로, ApoE를 발현하는 Huh-7.5 세포주와 이를 발현하지 않는 293A 세포주에 각각의 리보자임 발현 벡터를 형질주입 시키고, 루시퍼라제 어세이를 진행하였다. 루시퍼라제 신호를 확인한 결과, Huh-7.5 세포주에서는 안티센스 서열 50개를 도입한 트랜스-스플라이싱 리보자임의 트랜스-스플라이싱 효율이 현저히 우수하나, 293A 세포주에서는 각 리보자임의 트랜스-스플라이싱 효율에 별 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다(도 4의 B).
상기 결과로부터, AS 영역의 도입과 AS 영역의 길이는 리보자임의 트랜스-스플라이싱 효율에 영향을 미침을 확인할 수 있었다.
3-2. 타겟 세포주에 따른 AS 영역 길이 최적화
알츠하이머의 예방 및 치료 타겟으로서 APOE4 유전자 발현 감소를 위해 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임은 신경세포에서 효과적으로 트랜스-스플라이싱을 수행할 수 있어야한다. 이에, 신경세포 유래 세포주에서 상기 실시예 3-1의 실험을 반복 수행하여, AS 영역의 길이에 따른 트랜스-스플라이싱 효율을 확인하였다.
보다 구체적으로, 1x105 개의 CCF-STTG1 (E3/E4, astrocyte) 세포를 12 well plate에 24시간 동안 배양하고, 서로 다른 길이(0nt, 50nt, 100nt, 또는 150nt)의 AS 영역을 포함하는 +56 targeting ribozyme을 발현하는 plasmid 벡터 500ng와 pTK-renilla luciferase plasmid 벡터 50ng을 48시간 동안 co-transfection하였다. 이어서, 배양액을 모두 제거한 뒤에 1xPBS 500ul로 1회 세척하고 passive lysis buffer (Promega, E1980, Dual-Luciferase Reporter Assay System) 100ul를 각 well에 넣어 준 뒤, 상온에서 15분간 shaking하여 세포를 용해시켰다. 용해물을 회수하고 13000 rpm으로 1분 동안 원심분리한 뒤 10ul의 상층액을 취하여 luciferase activity를 측정하였다(Promega, E1980, Dual-Luciferase Reporter Assay System). Positive control (CF)는 CMV promoter-Firefly luciferase를 사용하였다.
그 결과, AS 영역의 도입 유무와 AS 영역의 길이와 무관하게 CCF-STTG1 세포에서 리보자임에 의한 APOE4 RNA의 트랜스 스플라이싱이 유도됨을 확인할 수 있었으며, 특히 150 nt 길이의 AS 영역을 포함하는 리보자임에 의한 트랜스 스플라이싱 효율이 우수함을 확인할 수 있었다(도 5a).
상기 결과를 유전자 수준에서 재검증하기 위하여, 전기영동을 수행하여 트랜스 스플라이싱 산물(trans-splicing product)을 검출하였다. 보다 구체적으로, 2x105개의 CCF-STTG1 또는 U118MG(E2/E4) 세포를 6 well plate에 24시간 동안 배양하고 2.5ug의 +56 targeting ribozyme 발현 벡터로 형질전환을 유도하였다. 48시간 경과 후 배양액을 모두 제거하고, 1xPBS 1mL로 1회 세척하여 회수된 세포와 chloroform 100uL을 혼합하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA 1ug에 RT primer (5’ - CCCATATCGTTTCATAGCTTCTGCC - 3’)를 넣어 준 뒤 20uL volume 조건에서 역전사를 수행하여 cDNA를 생성하였다. 상기 cDNA 2uL를 정방향 프라이머 (5’ - CAGCGGAGGTGAAGGACGT - 3’), 역방향 프라이머 (5’ - ATGTTCACCTCGATATGTGCATC - 3’)과 혼합하여 95 ℃ 30 sec, 58 ℃ 30 sec, 72 ℃ 30 sec 조건으로 30 cycle PCR을 수행하고, 2% TBE agarose gel에서 PCR band를 확인하였다. 그 결과 Trans-splicing product로 예상되는 211bp PCR DNA band를 확인할 수 있었으며, 특히 150 nt 길이의 AS 영역을 포함하는 리보자임이 형질전환된 세포에서 가장 진한 밴드를 확인할 수 있었다(도 5b의 (A)).
이어서, 원하는 위치에서 트랜스 스플라이싱이 수행되었는지 확인하기 위하여 상기 211bp PCR DNA 서열분석을 수행한 결과, 트랜스 스플라이싱 예상 site에서 정확하게 트랜스 스플라이싱이 일어나 APOE RNA+reporter RNA (Firefly luciferase) fusion RNA가 생성되었음을 확인할 수 있었다(도 5b의 (B)).
실시예 4. IGS 영역 최적화
4-1. in vitro mapping
신경세포에서 APOE4 단백질 제거를 위한 다양한 툴 확보를 위하여, test tube에서 APOE4 RNA와 random library ribozyme을 혼합하여 반응시킨 뒤 RT-PCR을 수행한 후 트랜스 스플라이싱 산물로 예상되는 PCR DNA band의 서열분석을 통해 트랜스 스플라이싱이 발생한 APOE4 RNA site를 확인하였다.
보다 구체적으로, APOE4 RNA를 in-vitro transcription 과정을 통해 합성하고, 5’ end에 random한 서열을 (GNNNNN) 가지는 trans-splicing ribozyme RNA library를 in vitro transcription 과정을 통해 합성하였다. APOE4 RNA 0.1 pmole, ribozyme library RNA 1 pmole을 1X in vitro trans-splicing reaction buffer (50mM Hepes (pH 7.0), 150mM NaCl, 5mM MgCl2)와 섞어 total 9uL로 만든 뒤, 95℃ 1 min, 37℃ 3 min에서 반응시키고, 1mM GTP 1uL를 넣어 주어, final 0.1mM GTP로 농도를 맞춘 뒤, 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응액을 phenol extraction/EtOH precipitation 과정을 거쳐 RNA를 회수한 뒤 RT-PCR을 수행하였다. 이어서, Ribozyme specific RT primer (5'- ATGTGCTGCAAGGCGATT-3’) 을 넣어 준 뒤, 20uL volume 조건에서 reverse transcription으로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA 2uL를 사용하여 APOE4 RNA specific 5’ primer (5’- CTACTCAGCCCCAGCGGAGG-3’), ribozyme specific 3’ primer (RY-TS)(5’- TGTAAAACGACGGCCAGTG-3’)을 각각 10pmole씩 사용하여 95 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 30 sec 조건으로 35 cycle PCR을 수행하고, 2% TBE agarose gel에서 PCR band를 확인하고, 확인된 모든 PCR band를 gel extraction 과정을 거쳐 elution 한 뒤, APOE4 RNA의 어느 부위에서 trans-splicing 반응이 일어났는지 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 그 결과, APOE4 RNA(서열번호 11)에서 트랜스 스플라이싱이 발생한 reaction site와 발생 빈도는 하기 표 1과 같다.
Figure PCTKR2021002443-appb-T000001
상기 표 1에서 확인되는 바와 같이 APOE4 RNA의 +21번 부위에서 가장 많은 trans-splicing이 일어남을 확인하였다. 상기 결과로부터, APOE4 RNA의 +21번 염기를 타겟으로 하는 트랜스 스플라이싱 리보자임(이하, '+21 targeting ribozyme'이라 함)이 APOE4 단백질 발현 감소에 효과적임을 알 수 있다.
4-2. Cell mapping
Test tube 상에서 APOE4 RNA의 trans splicing reaction site mapping 결과에 이어서, 이와 동일한 실험을 APOE4 RNA와 random library ribozyme을 co-transfection하여 293A 세포 안에서 수행하였다(도 7). 그 결과, APOE4 RNA(서열번호 11)에서 트랜스 스플라이싱이 발생한 reaction site와 발생 빈도는 하기 표 2와 같다.
Figure PCTKR2021002443-appb-T000002
4-3. 각 reaction site를 타겟으로 하는 리보자임의 트랜스 스플라이싱 효과 확인
In vitro 및 cell mapping을 통해 확인된 target site들 중에서 중복되어 확인된 +30, +71, +77, +80, +82 site와 in vitro mapping에 가장 트랜스 스플라이싱 빈도가 높은 +21 site를 선별하여 상기 각 site를 타겟으로 하는 리보자임을 제작하고 in vitro trans-splicing reaction을 수행하여 trans-splicing여부를 확인하였다. +56 targeting ribozyme은 대조군으로 사용하였다.
보다 구체적으로, APOE4 RNA 0.1 pmole을 각 trans-splicing ribozyme library RNA 1 pmole과 혼합하여 trans-splicing reaction을 유도하였다. 각 반응액에서 RNA를 회수하여 RT-PCR을 수행하고 제작된 cDNA를 APOE4 RNA specific 5’ primer (5’- CTACTCAGCCCCAGCGGAGG-3’), ribozyme specific 3’ primer (5’- TGTAAAACGACGGCCAGTG-3’)을 이용하여 PCR 증폭하였고(95 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 30 sec, 35 cycle), 각 증폭산물을 agarose gel에서 전기영동을 통해 확인하였다.
그 결과, APOE4 RNA의 +21, +30, +71, 및 +77 site를 타겟으로 하는 리보자임에 의한 트랜스 스플라이싱 효율이 우수하였으며, 특히 +21 targeting ribozyme과 +30 targeting ribozyme의 효율이 각별히 우수함을 확인할 수 있었다(도 8).
APOE4 RNA에서 +21번 염기를 포함한 타겟 영역은 5’-GGAGGU-3’(서열번호 3)이고, +21 targeting ribozyme의 IGS는 5’-GCCUCC-3’(서열번호 4)을 갖는다. 또한, APOE4 RNA에서 +30번 염기를 포함한 타겟 영역은 5’-GGACGU-3’(서열번호 5)이고, +30 targeting ribozyme의 IGS는 5’-GCGUCC-3’(서열번호 6)을 갖는다.
실시예 5. +21 targeting 트랜스-스플라이싱 리보자임 최적화
이어서, APOE4 RNA의 표적 부위를 달리한 트랜스-스플라이싱 리보자임의 표적 특이성 및 트랜스-스플라이싱 효율 증가를 위하여 상기 실시예 3과 동일하게 길이를 달리한 AS 영역을 도입한 리보자임을 제작한 후 Huh-7.5 세포, CCF-STTG1 세포, 및 U118MG 세포에 형질전환한 후 트랜스 스플라이싱 발생 정도를 단백질 수준 및 유전자 수준에서 확인하였다.
단백질 수준에서 확인 결과, APOE4 RNA의 +21 염기를 타겟으로 하는 리보자임은 AS 영역 도입 여부 및 AS 영역의 길이와 무관하게 APOE4를 발현하는 세포에서 APOE4 RNA의 트랜스 스플라이싱을 유도하였고, 특히, 50nt 길이의 AS 영역이 도입된 리보자임에서 현저하게 우수한 트랜스 스플라이싱 효율을 확인할 수 있었다(도 9a).
유전자 수준에서 트랜스 스플라이싱 산물 확인 결과도 단백질 수준 확인 결과와 동일하였으며(도 9b), 트랜스 스플라이싱 산물의 서열분석 결과 모두 트랜스 스플라이싱 예상 위치에서 정확하게 반응이 일어났음을 확인하였다(도 9c).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 APOE4 표적의 트랜스 스플라이싱 리보자임은 그 자체로 알츠하이머병의 발병율을 높이는 APOE4 단백질의 발현을 억제하여 알츠하이머병의 예방 또는 치료를 위한 약제로 이용될 수 있으며, 트랜스 스플라이싱에 의해 알츠하이머병의 발병율을 낮추는 유전자의 발현을 유도할 수 있는바 알츠하이머병의 치료 유전자 도입을 위한 플랫폼으로 이용될 수 있다.

Claims (17)

  1. APOE4 RNA 서열을 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 리보자임.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 트랜스-스플라이싱 리보자임은 5'- IGS (internal guide sequence)-Ribozyme*-엑손(exon)-3'의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 트랜스-스플라이싱 리보자임.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 IGS 영역은 APOE4 RNA의 +21, +30,+49, +56, +71, +77, +80, +82, +95, +98, +104, +128, +140, +181, +229, +255, +263, +275, +326, +368, +830, 또는 +839 염기를 포함하는 영역과 상보적으로 결합할 수 있는 5~10 nt 길이의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 트랜스-스플라이싱 리보자임.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 IGS 영역은 서열번호 2, 4, 또는 6의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 트랜스-스플라이싱 리보자임.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 트랜스-스플라이싱 리보자임은 IGS 영역의 upstream에 APOE4 RNA의 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 10 nt 내지 200 nt 길이의 AS(antisense sequence) 영역을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 트랜스-스플라이싱 리보자임.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 IGS 영역은 서열번호 2의 염기서열을 포함하고, 상기 AS 영역은 150 nt 길이인 것을 특징으로 하는, 트랜스-스플라이싱 리보자임.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 IGS 영역은 서열번호 4의 염기서열을 포함하고, 상기 AS 영역은 50 nt 길이인 것을 특징으로 하는, 트랜스-스플라이싱 리보자임.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 IGS 영역과 AS 영역은 5~10 nt 길이의 무작위 염기서열로 연결된 것을 특징으로 하는, 트랜스-스플라이싱 리보자임.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 Ribozyme* 영역은 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 트랜스-스플라이싱 리보자임.
  10. 제2항에 있어서,
    상기 엑손 영역은 ApoE2 또는 ApoE3 christchurch 돌연변이(R136S)를 암호화하는 염기서열의 일부 또는 전부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 트랜스-스플라이싱 리보자임.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 트랜스-스플라이싱 리보자임을 발현할 수 있는 발현 벡터.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 발현 벡터는 상기 리보자임 유전자와 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 프로모터는 신경세포 타입 특이적인 프로모터인 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 신경세포 타입 특이적인 프로모터는 뉴런(neuron)-, 성상세포(astrocyte)- 또는 희돌기교 세포(oligodendrocyte)- 특이적 프로모터인 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
  15. 제1항 내지 제10항의 트랜스-스플라이싱 리보자임; 제11항 내지 제14항의 발현 벡터; 및 상기 발현 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제1항의 트랜스-스플라이싱 리보자임, 이를 발현할 수 있는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료 방법.
  17. 알츠하이머병 예방 또는 치료 약제의 제조를 위한 제1항의 트랜스-스플라이싱 리보자임, 이를 발현할 수 있는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템의 용도.
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