WO2021125177A1 - オルガノイドの製造方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for producing an organoid. More specifically, the present invention relates to a method for producing organoids, a medium, an organoid, a method for evaluating a test substance, and a chimeric FGF.
- the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2019-226710 filed in Japan on December 16, 2019, the contents of which are incorporated herein by reference.
- Organoids are cultured cells formed by accumulating cells, and have a structure and function similar to those of organs in the living body.
- stem cells such as somatic stem cells, embryonic stem cells (ES cells), and artificial pluripotent stem cells (iPS cells).
- ES cells embryonic stem cells
- iPS cells artificial pluripotent stem cells
- brain organoids and intestinal organoids have been actively conducted.
- Liver organoids, kidney organoids, gastric organoids, lung organoids, ovarian carcinoma organoids, biliary tract organoids and the like have been produced.
- Organoids are produced from stem cells by controlling signal transduction pathways and inducing stem cell proliferation, differentiation, and the like.
- the MAPK signal transduction pathway is known to be a signal transduction pathway that controls proliferation, growth, differentiation and transformation of stem cells, apoptosis and the like. Further, it is known that the MAPK signal transduction pathway is downwardly regulated by growth factors such as basic fibroblast growth factor (FIbroblast growth factor2, FGF2) and epidermal growth factor (Epidermal Growth Factor, EGF). These growth factors are components that are usually added to a medium for producing organoids from stem cells (see Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
- FIbroblast growth factor2, FGF2 basic fibroblast growth factor
- EGF epidermal growth factor
- an object of the present invention is to provide a technique for producing organoids, which can reduce the content of growth factors contained in the medium.
- the present invention includes the following embodiments.
- Organoids comprising a step of culturing an adult stem cell or a cell tissue piece containing an adult stem cell in a medium containing a chimeric FGF containing a part of Fibroblast growth factor (FGF) 1 and a part of FGF2. Manufacturing method.
- FGF Fibroblast growth factor
- Manufacturing method [2] The production method according to [1], wherein the content of the chimeric FGF contained in the medium is 50 ng / mL or less.
- EGF Epidermal Growth Factor
- the chimeric FGF is a protein consisting of the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 4, or is described in any one of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 4.
- Organoids are produced from living stem cells or cell tissue pieces containing living stem cells by containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence and containing 50 ng / mL or less in the medium.
- the production method according to any one of [1] to [4] which is a protein having an activity capable of capable.
- IGF insulin-like growth factor
- TGF- ⁇ Transforming Growth Factor- ⁇
- Wnt Wnt signaling pathway enhancer
- ROCK Rho-kinase
- a method for evaluating a test substance which comprises a step of bringing the organoid according to [13] into contact with the test substance, and a step of evaluating the effect of the test substance on the organoid.
- a protein consisting of the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 4, or 1 or number in the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 4. It consists of an amino acid sequence in which individual amino acids are deleted, substituted or added, and has an activity capable of producing an organoid from a living stem cell or a cell tissue piece containing the living stem cell by containing 50 ng / mL or less in the medium.
- a protein chimeric FGF.
- FIG. 7 is a graph showing the melting temperature (Tm) of the FGFC mutant measured in Experimental Example 4.
- each component exemplified in the present specification for example, a component contained in a medium or a component used in each step, may be used alone or in combination of two or more.
- medium containing substance X and "in the presence of substance X” mean a medium to which an exogenous substance X is added, a medium containing an exogenous substance X, or an exogenous substance X. It means the presence of substance X. That is, when a cell or tissue present in the medium expresses, secretes or produces the substance X endogenously, the endogenous substance X is distinguished from the exogenous substance X and is an exogenous substance. A medium containing no X does not fall under the category of "medium containing a substance X" even if it contains an intrinsic substance X.
- One embodiment contains an adult stem cell or a cell tissue fragment containing an adult stem cell, containing a chimeric FGF (hereinafter, also referred to as "FGFC") containing a part region of Fibroblast growth factor (FGF) 1 and a part region of FGF2. It is a method for producing an organoid, which comprises a step of culturing in a medium.
- FGFC chimeric FGF
- the content of growth factors added to the medium can be reduced in the production of organoids.
- the production method of the present embodiment is particularly suitable for producing organoids such as intestinal organoids, liver organoids, ovarian cancer organoids, lung organoids, and gastric organoids.
- FGFR fibroblast growth factor receptor
- epithelial stem cells which are important in culturing adult stem cells, are said to express FGFR2b well, but FGF2 does not have good reactivity with FGFR2b.
- FGF1 can react with all seven types of FGFR including FGFR2b, and FGFC having both FGF2 and FGF1 properties can react with FGFR2b, and as a result. It is presumed that it could be cultured even at a low concentration.
- Adult stem cells are stem cells, which are also called somatic stem cells, tissue stem cells, and cancer stem cells, and are non-finally differentiated cells existing in the living body.
- Adult stem cells usually have the ability to differentiate into specific multiple types of cells.
- the adult stem cell may be a cell maintained in culture or a primary cell present in a tissue excised from the adult.
- epithelial stem cells are preferable as adult stem cells.
- a cell mass in which cells are aggregated is referred to as a cell mass.
- organoids those containing adult stem cells and cells differentiated from adult stem cells and having a structure and function similar to those of organs in a living body are referred to as organoids.
- the medium a medium obtained by adding chimeric FGF to the basal medium can be used.
- the basal medium for example, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgo MEM (GMM) medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, F-12 Examples include medium, DMEM / F12 medium, IMDM / F12 medium, ham medium, RPMI 1640 medium, and Fisher's medium.
- the basal medium a medium in which these media are mixed may be used.
- the chimeric FGF in the production method of the present embodiment is a fusion protein containing a partial region of FGF1 and a partial region of FGF2.
- Examples of the NCBI accession number of the human FGF1 protein include NP_0012444138.1, NP_0012444137.1, and NP_0013414881.1.
- Examples of the NCBI accession number of the mouse FGF1 protein include NP_034327.1 and the like.
- Examples of the NCBI accession number of the human FGF2 protein include NP_001348594.1 and NP_001997.5.
- Examples of the NCBI accession number of the mouse FGF2 protein include NP_032032.1 and the like.
- chimeric FGF a protein consisting of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 is preferable.
- the chimeric FGF is any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 as long as it has an activity capable of producing an organoid from a living stem cell or a cell tissue piece containing the living stem cell by containing 50 ng / mL or less in the medium. It may have a mutation with respect to the protein consisting of the amino acid sequence described in 1.
- the chimeric FGF may be a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4. ..
- 1 or several is 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and even more preferably 1 to 2.
- the amino acid corresponding to the 43rd amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is preferably glutamine, valine, isoleucine or leucine.
- the amino acid corresponding to the 43rd amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is glutamine, valine, isoleucine or leucine.
- the chimeric FGF has higher heat resistance than FGF1 and FGF2 and is stable. is there.
- the chimeric FGF in which the amino acid corresponding to the 43rd amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is isoleucine has a particularly high melting temperature (Tm) and high heat resistance.
- the amino acid corresponding to the 43rd amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 can be specified by, for example, aligning the target amino acid sequence with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 using an alignment program such as CrystalW. ..
- the content of the chimeric FGF contained in the medium can be reduced.
- the content of the chimeric FGF contained in the medium is usually 50 ng / mL or less, preferably 20 ng / mL or less, more preferably 15 ng / mL or less, still more preferably 10 ng / mL or less, and particularly preferably 5 ng / mL. It is as follows.
- the medium may further contain Epidermal Growth Factor (EGF).
- EGF Epidermal Growth Factor
- the total content of chimeric FGF and EGF contained in the medium can be reduced.
- the total content of the chimeric FGF and EGF contained in the medium is usually 100 ng / mL or less, preferably 70 ng / mL or less.
- NCBI accession number of the human EGF protein is NP_0011171601.1 or the like.
- the medium further contains a Wnt signaling pathway enhancer.
- Wnt signaling pathway enhancer examples include Wnt family members, R-spondin, Nolin, GSK-3 ⁇ inhibitors and the like. Among these, Wnt family members and R-spondin are preferable.
- Wnt family members include Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 and Wnt16.
- Wnt3a or Wnt4 is preferable, and Wnt3a is more preferable.
- Wnt3a is preferably a complex with Afamine in order to improve stability.
- the concentration of Wnt3a contained in the medium is usually 10 ng / mL to 10 ⁇ g / mL, preferably 10 ng / mL to 1 ⁇ g / mL, for example 100 ng / mL to 700 ng / mL. Is.
- R-spondin examples include R-spondin 1, R-spondin 2, R-spondin 3, R-spondin 4, and the like.
- NCBI accession number of the human R-spondin 1 protein examples include NP_0012229838.1 and XP_006710646.1. Examples of the NCBI accession number of the mouse R-spondin 1 protein include NP_619624.2 and the like.
- NCBI accession numbers for the human R-spondin 2 protein include XP_011515320.1, XP_011515321.1, NP_848660.3 and the like.
- Examples of the NCBI accession number of the mouse R-spondin 2 protein examples include NP_766403.1 and the like.
- Examples of the NCBI accession number of the human R-spondin 3 protein examples include XP_01668667.1., XP_01686668.1, and NP_116173.2.
- Examples of the NCBI accession number of the mouse R-spondin 3 protein include NP_082627.3 and the like.
- Examples of the NCBI accession number of the human R-spondin 4 protein include NP_001035096.1 and NP_001025042.2.
- Examples of the NCBI accession number of the mouse R-spondin 4 protein include NP_0010357791 and the like.
- the concentration of R-spondin contained in the medium is usually 10 ng / mL to 10 ⁇ g / mL, preferably 10 ng / mL to 1 ⁇ g / mL, more preferably 100 ng. It is / mL to 500 ng / mL.
- GSK-3 ⁇ inhibitors include CHIR99021 (CAS number: 252917-06-9), Kenpaullone (CAS number: 142273-20-9), and 6-Bromodyrubin-3'-oxime (BIO, CAS number: 667463-62). -9) and the like.
- the concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor contained in the medium is usually 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M.
- the medium further contains an insulin-like growth factor (IGF) signal transduction pathway enhancer.
- IGF insulin-like growth factor
- Examples of the IGF signal transduction pathway enhancer include IGF-1, IGF-2 and the like, and IGF-1 is preferable.
- Examples of the NCBI accession number of the human IGF-1 protein include NP_001104753.1 and NP_001104755.1.
- Examples of the NCBI accession number of the mouse IGF-1 protein include NP_00110404.1.
- Examples of the NCBI accession number of the human IGF-2 protein include NP_001007140.2 and NP_0012787790.1.
- Examples of the NCBI accession number of the mouse IGF-2 protein include NP_034644.2 and NP_001302418.1.
- the medium further contains a Transforming Growth Factor- ⁇ (TGF- ⁇ ) signal transduction pathway inhibitor.
- TGF- ⁇ Transforming Growth Factor- ⁇
- the TGF- ⁇ signal transduction pathway inhibitor is a substance that inhibits the signal transduction pathway transmitted by the Smad family.
- Examples of the TGF- ⁇ signal transduction pathway inhibitor include A83-01 (CAS number: 909910-43-6), SB-431542 (CAS number: 301836-41-9), and SB-505124 (CAS number: 694433-59-). 5), SB-525334 (CAS number: 356559-20-1), LY364947 (CAS number: 396129-53-6), SC-203294 (CAS number: 627536-09-08), SD-208 (CAS number:: 627536-09-8), SJN2511 (CAS number: 446859-33-2) and the like.
- A83-01 and SB-431542 are preferable.
- the concentration of the TGF- ⁇ signal transduction pathway inhibitor contained in the medium is usually 10 nM to 100 ⁇ M, preferably 100 nM to 10 ⁇ M.
- the medium preferably further contains a Rho-kinase (ROCK) signal transduction pathway inhibitor.
- ROCK Rho-kinase
- ROCK signal transduction pathway inhibitor examples include Y-27632 (CAS number: 129830-38-2), Derivative / HA1077 (CAS number: 105628-07-7), and H-1152 (CAS number: 871543-07-). 6), Wf-536 (CAS number: 539857-64-2), derivatives thereof and the like can be mentioned.
- the concentration of the ROCK signal transduction pathway inhibitor contained in the medium is usually 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M to 50 ⁇ M, and more preferably 0.1 ⁇ M to 30 ⁇ M.
- the medium further contains a bone morphogenetic protein (BMP) signal transduction pathway inhibitor.
- BMP bone morphogenetic protein
- BMP signaling pathway inhibitors examples include Noggin, Chordin, Follistatin, Dorsomorphin (CAS number: 866405-64-3), DMH1 (CAS number: 120671-16-1), LDN193189 (CAS number). : 1062368-24-4) and the like.
- the concentration of the BMP signal transduction pathway inhibitor contained in the medium is usually 0.5 ⁇ M to 10 ⁇ M.
- the concentration of Noggin contained in the medium is usually 10 ng / mL to 1000 ng / mL, preferably 10 ng / mL to 500 ng / mL, more preferably 10 ng / mL to 300 ng. / ML.
- the medium may further contain a medium supplement, an antibacterial agent, serum, a serum substitute, insulin, albumin and the like as other additives.
- a supplement for nerve cell culture such as the product name "B-27 serum-free supplement” (Thermofisher Scientific Co., Ltd.), a product name containing L-glutamine, L-alanyl L-glutamine, etc.
- glutamine-containing supplements such as "GlutaMax” (Thermo Fisher Scientific)
- amino acid aqueous solutions such as "MEM Non-Essential Amino Acids Solution” (Thermo Fisher Scientific)
- 2-mercaptoethanol 2-mercaptoethanol
- antibacterial agents examples include penicillin antibiotics, cephem antibiotics, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics, phosphomycin antibiotics, aminoglycoside antibiotics, and new quinolone antibiotics.
- ECM extracellular matrix
- the cells may be embedded in extracellular matrix (ECM) or ECM may be added to the medium.
- ECM include components contained in the basement membrane and glycoproteins present in the intercellular spaces.
- the components contained in the basement membrane include type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, and entactin.
- glycoproteins present in the intercellular spaces include collagen, laminin, entactin, fibronectin, heparin sulfate and the like.
- ECM a commercially available product containing the ECM may be used. Examples of commercially available products containing ECM include Matrigel (registered trademark, Corning Inc.) and human laminin (Sigma).
- Matrigel contains a basement membrane component derived from Englbreth Holm Swarm mouse sarcoma.
- the main components of Matrigel are type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan and entactin, but in addition to these, epithelial growth factor (EGF), nerve growth factor (NGF), platelet-derived growth factor (PDGF), insulin-like Various growth factors such as growth factor 1 (IGF-1) and TGF- ⁇ are included.
- Matrigel is also available in grades with low concentrations of various growth factors, with EGF less than 0.5 ng / mL, NGF less than 0.2 ng / mL, PDGF less than 5 pg / mL, and IGF-1 less than 5 ng / mL. , TGF- ⁇ is less than 1.7 ng / mL. As the matrigel, it is preferable to use a grade having a low content ratio of various growth factors.
- Dispersion means that cells are separated into a cell population of 10,000 or less by a dispersion treatment such as an enzyme treatment or a physical treatment. Dispersion can be performed by treating the organoid with a cell dispersion liquid or the like.
- the cell dispersion examples include enzymes such as trypsin, collagenase, hyaluronidase, elastase, pronase, DNase, and papain, or a solution containing a chelating agent such as ethylenediaminetetraacetic acid.
- enzymes such as trypsin, collagenase, hyaluronidase, elastase, pronase, DNase, and papain
- a solution containing a chelating agent such as ethylenediaminetetraacetic acid.
- a commercially available cell dispersion can also be used as the cell dispersion.
- Examples of commercially available cell dispersions include TrypLE Select and TrypLE Express manufactured by Thermo Fisher Scientific.
- One embodiment is a medium comprising chimeric FGF and having a content of the chimeric FGF of 50 ng / mL or less.
- Organoids can be produced by culturing adult stem cells or cell tissue pieces containing adult stem cells in the medium of the present embodiment. Therefore, it can be said that the medium of the present embodiment is a medium for producing organoids.
- the medium of this embodiment is a basal medium to which chimeric FGF is added.
- the basal medium and chimeric FGF are the same as those described above.
- the medium of the present embodiment preferably further contains EGF, and the total content of the chimeric FGF and the EGF is 100 ng / mL or less.
- the EGF is the same as that described above.
- the medium of the present embodiment further comprises a Wnt signaling pathway enhancer, an IGF signaling pathway enhancer, a TGF- ⁇ signaling pathway inhibitor, a ROCK signaling pathway inhibitor, a BMP signaling pathway inhibitor, and other additives. Can be contained. Each of these components is the same as described above.
- Organoid produced by the production method described above. Since the organoid of the present embodiment can be produced while reducing the cost required for growth factors and the like, it is easy to produce it in large quantities at low cost. Therefore, for example, it can be suitably used for large-scale evaluation of a test substance, which will be described later.
- the organoid of the present embodiment is produced by using a chimeric FGF instead of the conventionally used FGF2. Therefore, there may be a difference in the gene expression profile and the like between the organoid of the present embodiment and the organoid produced by the conventional production method. However, since it takes a lot of trial and error and labor to identify such a difference, it is not realistic to specify the organoid of the present embodiment by a gene expression profile or the like, and it is specified by a production method. Is considered to be realistic.
- One embodiment is a method for evaluating a test substance, which comprises a step of contacting an organoid produced by the above-mentioned production method with a test substance and a step of evaluating the influence of the test substance on the organoid.
- the test substance can be evaluated using an organoid having a structure and function similar to that of cells in a living body.
- the method of the present embodiment can be applied to screening of therapeutic agents for various diseases and the like.
- test substance examples include a natural compound library, a synthetic compound library, an existing drug library, a metabolite library, and the like.
- the effect of the test substance on organoids can be evaluated, for example, at the gene level, protein level, and metabolite level. It is also possible to evaluate the effect of the test substance on the organoid by evaluating the morphology of the organoid.
- Evaluation at the gene level can be performed by, for example, RNA-seq analysis, DNA microarray analysis, real-time PCR, or the like.
- evaluation at the protein level can be performed by, for example, Western blotting, ELISA, immunostaining, or the like.
- evaluation at the metabolite level can be evaluated by, for example, liquid chromatography (LC), mass spectrometry (MS), LC / MS and the like.
- the morphology of organoids can be evaluated by, for example, microscopic observation, immunostaining, or the like.
- [Chimeraized FGF] One embodiment is a protein consisting of the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 4, or 1 in the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 4.
- the content of growth factors added to the medium in the production of organoids can be reduced by using the chimeric FGF of the present embodiment.
- the amino acid corresponding to the 43rd amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is preferably glutamine, valine, isoleucine or leucine.
- the amino acid corresponding to the 43rd amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is preferably valine, isoleucine or leucine, and more preferably isoleucine. preferable.
- a B-27 serum-free supplement (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) was used.
- FGF2 the product name "FGF-Basic, Human, Recombinant, Animal Free” (Peprotech) was used.
- FGFC Fluji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- Wnt signal enhancer Wnt signal transduction pathway enhancer
- mouse R-spondin 1 conditioned medium self-prepared
- product name "Afamin / Wnt3a CM” MBL Life Sciences
- insulin-like growth factor As the insulin-like growth factor (IGF signal transduction pathway enhancer), the product name "Recombinant Human IGF-I / IGF-1 Protein, CF” (R & D Systems, Inc.) was used.
- TGF- ⁇ signal transduction pathway inhibitor As a TGF- ⁇ inhibitor (TGF- ⁇ signal transduction pathway inhibitor), A83-01 (TOCRIS Bioscience) was used.
- ROCK inhibitor As the ROCK inhibitor (ROCK signal transduction pathway inhibitor), the product name "Y-27632, MF” (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
- BMP inhibitor BMP signal transduction pathway inhibitor
- mouse Noggin conditioned medium self-prepared
- a large intestine tissue piece was used as a cell tissue piece containing adult stem cells. More specifically, cells into which a reporter construct was introduced into the 18th exon of the LGR5 locus of cells derived from colon tissue fragments by genome editing were used in the experiment.
- the LGR5 gene is a stem cell marker.
- IRES-tdTomato was used as a reporter construct. When this cell expresses LGR5, it expresses the fluorescent protein tdTomato.
- the above cells were embedded in 20 ⁇ L of Matrigel (registered trademark, Corning Inc.) per 1000 cells and seeded in a 48-well plate. Subsequently, Matrigel was allowed to stand at 37 ° C. to harden. Subsequently, the medium of each composition described above was added around the matrigel. Then, the medium was changed every 2 to 3 days.
- Matrigel registered trademark, Corning Inc.
- tdTomato was detected by fluorescence microscope observation, and the expression of the LGR5 protein, which is a stem cell marker, was evaluated.
- FIGS. 1 (a) to 1 (d) are micrographs of organoids formed in the absence of EGF on the 9th day of culture.
- FIG. 1A is a bright-field image of organoids formed in the presence of FGF2 at each concentration shown in the figure.
- FIG. 1 (b) is a fluorescence micrograph in which the expression of LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 1 (a).
- FIG. 1 (c) is a bright-field image of organoids formed in the presence of each concentration of FGFC shown in the figure.
- FIG. 1 (d) is a fluorescence micrograph in which the expression of LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 1 (c).
- FIGS. 2 (a) to 2 (d) are micrographs of organoids formed in the presence of EGF on the 8th day of culture.
- FIG. 2A is a bright-field image of organoids formed in the presence of FGF2 at each concentration shown in the figure.
- FIG. 2B is a fluorescence micrograph in which the expression of LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 2A.
- FIG. 2C is a bright-field image of organoids formed in the presence of each concentration of FGFC shown in the figure.
- FIG. 2 (d) is a fluorescence micrograph in which the expression of LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 2 (c).
- organoids As a result, it was clarified that the formation of organoids was insufficient even if the adult stem cells were cultured in a medium containing 10 ng / mL FGF2 in the absence of EGF. On the other hand, it was revealed that organoids can be formed in a medium containing FGFC even in the absence of EGF. Further, as shown in FIGS. 1 (c) and 1 (d), it was clarified that organoids can be formed even if the concentration of FGFC in the medium is reduced to about 2.5 ng / mL.
- organoids can be formed by culturing adult stem cells in a medium containing 12.5 ng / mL FGF2 in the presence of EGF. Further, it was clarified that in the presence of EGF, organoids can be formed even if the concentration of FGFC in the medium is reduced to about 3.1 ng / mL.
- FGFC-I glutamine residue is replaced with isoleucine
- FGFC-I the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 3
- FGFC-I the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4
- FGFC-L the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4
- the gene fragments encoding FGFC, FGFC-V, FGFC-I, and FGFC-L were inserted into the expression vector pET-3a, expressed with BL21 (DE3) pLysS, and purified as a protein. Used for.
- ⁇ Manufacturing of organoids As a cell tissue piece containing adult stem cells, cells similar to those in Experimental Example 1 were used. First, cells were embedded in 20 ⁇ L of Matrigel (registered trademark, Corning) per 1000 cells and seeded on a 48-well plate. Subsequently, Matrigel was allowed to stand at 37 ° C. to harden. Subsequently, the medium of each composition described above was added around the matrigel. Then, the medium was changed every 2 to 3 days.
- Matrigel registered trademark, Corning
- tdTomato was detected by fluorescence microscope observation, and the expression of the LGR5 protein, which is a stem cell marker, was evaluated.
- FIG. 3 (a) to 3 (d) are micrographs of each organoid formed on the 9th day of culture in the absence of EGF.
- FIG. 3A is a bright-field image of organoids formed in the presence of each concentration of FGFC shown in the figure.
- FIG. 3B is a bright-field image of the organoid formed in the presence of each concentration of FGFC-V shown in the figure.
- FIG. 3 (c) is a bright-field image of the organoid formed in the presence of each concentration of FGFC-I shown in the figure.
- FIG. 3D is a bright-field image of the organoid formed in the presence of each concentration of FGFC-L shown in the figure.
- FIG. 4 (a) is a fluorescence micrograph in which the expression of the LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 3 (a).
- FIG. 4 (b) is a fluorescence micrograph in which the expression of the LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 3 (b).
- FIG. 4 (c) is a fluorescence micrograph in which the expression of LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 3 (c).
- FIG. 4 (d) is a fluorescence micrograph in which the expression of the LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 3 (d).
- FIG. 5 (a) to 5 (d) are micrographs of each organoid formed on the 8th day of culture in the presence of EGF.
- FIG. 5A is a bright-field image of organoids formed in the presence of each concentration of FGFC shown in the figure.
- FIG. 5B is a bright-field image of the organoid formed in the presence of each concentration of FGFC-V shown in the figure.
- FIG. 5 (c) is a bright-field image of the organoid formed in the presence of each concentration of FGFC-I shown in the figure.
- FIG. 5D is a bright field image of the organoid formed in the presence of each concentration of FGFC-L shown in the figure.
- FIG. 6 (a) is a fluorescence micrograph in which the expression of the LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 5 (a).
- FIG. 6 (b) is a fluorescence micrograph in which the expression of the LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 5 (b).
- FIG. 6 (c) is a fluorescence micrograph in which the expression of the LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 5 (c).
- FIG. 6 (d) is a fluorescence micrograph in which the expression of the LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 5 (d).
- any FGFC mutant can be used to produce organoids to the same extent as when FGFC is used. Further, as shown in FIGS. 3 (a) to (d), 4 (a) to (d), 5 (a) to (d), and 6 (a) to 6 (d), FGFC in the medium. Alternatively, it was revealed that organoids can be produced even if the concentration of the FGFC mutant is reduced to 2.5 ng / mL or 3.1 ng / mL.
- FIG. 7 is a graph showing the measured melting temperature (Tm) of each protein.
- Tm melting temperature
- the horizontal axis of the graph shows the temperature (° C).
- the Tm value of each protein is shown in Table 3 below.
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Abstract
成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片を、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）１の一部領域及びＦＧＦ２の一部領域を含むキメラ化ＦＧＦを含有する培地中で培養する工程を含む、オルガノイドの製造方法；上記製造方法により製造されたオルガノイド；キメラ化ＦＧＦを含み、キメラ化ＦＧＦの含有量が、５０ｎｇ／ｍＬ以下である、培地；被験物質の評価方法；キメラ化ＦＧＦによれば、培地中に含まれる成長因子の含有量を減らすことができる。
Description
本発明は、オルガノイドの製造方法に関する。より詳細には、本発明は、オルガノイドの製造方法、培地、オルガノイド、被験物質の評価方法及びキメラ化ＦＧＦに関する。本願は、２０１９年１２月１６日に、日本に出願された特願２０１９－２２６７１０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
オルガノイドとは、細胞が集積して形成された培養細胞であり、生体内の臓器と類似した構造及び機能を有している。近年、体性幹細胞や、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の幹細胞から様々なオルガノイドを作製する研究が盛んに行われており、例えば、脳オルガノイド、腸オルガノイド、肝臓オルガノイド、腎臓オルガノイド、胃オルガノイド、肺オルガノイド、卵巣癌オルガノイド、胆道癌オルガノイド等が作製されている。
幹細胞からのオルガノイドの製造は、シグナル伝達経路をコントロールして、幹細胞の増殖、分化等を誘導することにより行われている。ＭＡＰＫシグナル伝達経路は、幹細胞の増殖、成長、分化及び形質転換、並びにアポトーシス等を制御するシグナル伝達経路であることが知られている。また、ＭＡＰＫシグナル伝達経路は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ２、ＦＧＦ２）や、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）等の成長因子により下方制御されることが知られている。これらの成長因子は、幹細胞からオルガノイドを製造する培地に、通常添加される成分である（特許文献１、非特許文献１参照）。
Huch M., et al., Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver, Cell, 160 (1-2), 299-312, 2015.
ところで、幹細胞からのオルガノイドの製造では、培地成分の失活のため、細胞の培養中に定期的に培地を交換する必要がある。特に、オルガノイドを再生医療や薬剤スクリーニング等に用いる場合、十分な大きさのオルガノイドが必要であり、それに伴い培地の交換回数も多くなる。一方で、ＦＧＦ２やＥＧＦ等の成長因子は、コストが非常に高く、また、エンドトキシン等を含有するリスクがある。このため、培地に添加する成長因子の量を減らすことが望まれている。そこで、本発明は、培地中に含まれる成長因子の含有量を減らすことができる、オルガノイドの製造技術を提供することを目的とする。
本発明は以下の実施形態を含む。
［１］成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片を、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）１の一部領域及びＦＧＦ２の一部領域を含むキメラ化ＦＧＦを含有する培地中で培養する工程を含む、オルガノイドの製造方法。
［２］前記培地中に含まれる前記キメラ化ＦＧＦの含有量が、５０ｎｇ／ｍＬ以下である、［１］に記載の製造方法。
［３］前記培地が、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）を更に含有する、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記培地中に含まれる前記キメラ化ＦＧＦ及び前記ＥＧＦの合計の含有量が、１００ｎｇ／ｍＬ以下である、［３］に記載の製造方法。
［５］前記キメラ化ＦＧＦが、配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるか、又は、配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ培地中に５０ｎｇ／ｍＬ以下含有させることにより生体幹細胞又は生体幹細胞を含む細胞組織片からオルガノイドを製造することができる活性を有するタンパク質である、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記培地が、Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）シグナル伝達経路増強剤を更に含有する、［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］前記培地が、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β（ＴＧＦ－β）シグナル伝達経路阻害剤を更に含有する、［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］前記培地が、Ｗｎｔシグナル伝達経路増強剤を更に含有する、［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］前記培地が、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）シグナル伝達経路阻害剤を更に含有する、［１］～［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］前記培地が、Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤を更に含有する、［１］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］キメラ化ＦＧＦを含み、前記キメラ化ＦＧＦの含有量が、５０ｎｇ／ｍＬ以下である、培地。
［１２］ＥＧＦを更に含み、前記キメラ化ＦＧＦ及び前記ＥＧＦの合計の含有量が、１００ｎｇ／ｍＬ以下である、請求項１１に記載の培地。
［１３］［１］～［１０］のいずれかに記載の方法により製造されたオルガノイド。
［１４］［１３］に記載のオルガノイドを被験物質に接触させる工程、及び、前記被験物質が前記オルガノイドに及ぼす影響を評価する工程、を含む、被験物質の評価方法。
［１５］配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるか、又は、配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ培地中に５０ｎｇ／ｍＬ以下含有させることにより生体幹細胞又は生体幹細胞を含む細胞組織片からオルガノイドを製造することができる活性を有するタンパク質である、キメラ化ＦＧＦ。
［１］成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片を、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）１の一部領域及びＦＧＦ２の一部領域を含むキメラ化ＦＧＦを含有する培地中で培養する工程を含む、オルガノイドの製造方法。
［２］前記培地中に含まれる前記キメラ化ＦＧＦの含有量が、５０ｎｇ／ｍＬ以下である、［１］に記載の製造方法。
［３］前記培地が、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）を更に含有する、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記培地中に含まれる前記キメラ化ＦＧＦ及び前記ＥＧＦの合計の含有量が、１００ｎｇ／ｍＬ以下である、［３］に記載の製造方法。
［５］前記キメラ化ＦＧＦが、配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるか、又は、配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ培地中に５０ｎｇ／ｍＬ以下含有させることにより生体幹細胞又は生体幹細胞を含む細胞組織片からオルガノイドを製造することができる活性を有するタンパク質である、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記培地が、Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）シグナル伝達経路増強剤を更に含有する、［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］前記培地が、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β（ＴＧＦ－β）シグナル伝達経路阻害剤を更に含有する、［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］前記培地が、Ｗｎｔシグナル伝達経路増強剤を更に含有する、［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］前記培地が、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）シグナル伝達経路阻害剤を更に含有する、［１］～［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］前記培地が、Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤を更に含有する、［１］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］キメラ化ＦＧＦを含み、前記キメラ化ＦＧＦの含有量が、５０ｎｇ／ｍＬ以下である、培地。
［１２］ＥＧＦを更に含み、前記キメラ化ＦＧＦ及び前記ＥＧＦの合計の含有量が、１００ｎｇ／ｍＬ以下である、請求項１１に記載の培地。
［１３］［１］～［１０］のいずれかに記載の方法により製造されたオルガノイド。
［１４］［１３］に記載のオルガノイドを被験物質に接触させる工程、及び、前記被験物質が前記オルガノイドに及ぼす影響を評価する工程、を含む、被験物質の評価方法。
［１５］配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるか、又は、配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ培地中に５０ｎｇ／ｍＬ以下含有させることにより生体幹細胞又は生体幹細胞を含む細胞組織片からオルガノイドを製造することができる活性を有するタンパク質である、キメラ化ＦＧＦ。
本実施形態によれば、培地中に含まれる成長因子の含有量を減らすことができる、オルガノイドの製造技術を提供することができる。
以下、実施形態を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。
本明細書で例示する各成分、例えば、培地中に含まれる成分や各工程で用いられる成分は、特に言及しない限り、それぞれ１種を単独で又は２種以上を併用して用いることができる。
本明細書で、「Ａ～Ｂ」等の数値範囲を表す表記は、「Ａ以上、Ｂ以下」と同義であり、Ａ及びＢをその数値範囲に含むものとする。
本明細書において、「物質Ｘを含む培地」、「物質Ｘの存在下」とは、外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）の物質Ｘが添加された培地、外来性の物質Ｘを含む培地、又は外来性の物質Ｘの存在下を意味する。すなわち、当該培地中に存在する細胞又は組織が当該物質Ｘを内在的（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）に発現、分泌又は産生する場合、内在的な物質Ｘは外来性の物質Ｘとは区別され、外来性の物質Ｘを含んでいない培地は内在的な物質Ｘを含んでいても「物質Ｘを含む培地」の範疇には該当しないものとする。
［オルガノイドの製造方法］
１実施形態は、成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片を、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）１の一部領域及びＦＧＦ２の一部領域を含むキメラ化ＦＧＦ（以下、「ＦＧＦＣ」ともいう）を含有する培地中で培養する工程を含む、オルガノイドの製造方法である。
１実施形態は、成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片を、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）１の一部領域及びＦＧＦ２の一部領域を含むキメラ化ＦＧＦ（以下、「ＦＧＦＣ」ともいう）を含有する培地中で培養する工程を含む、オルガノイドの製造方法である。
本実施形態の製造方法により、オルガノイドの製造において、培地に添加する成長因子の含有量を減らすことができる。本実施形態の製造方法は、特に、腸オルガノイド、肝オルガノイド、卵巣癌オルガノイド、肺オルガノイド、胃オルガノイド等のオルガノイドの製造に適している。
オルガノイドの製造において、キメラ化ＦＧＦを培地中に含有することで培地中に含まれる成長因子の含有量を減らすことができた理由としては、以下のことが推定される。すなわち、ＦＧＦには反応する繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）が決まっており、アイソフォームを含めると７種類あることが知られている。ＦＧＦをキメラ化することで、多くの種類のＦＧＦＲと反応することが可能となり、その結果、低濃度であっても培養できたものと推定される。特に、成体幹細胞の培養において重要な上皮系幹細胞は、ＦＧＦＲ２ｂがよく発現しているといわれているが、ＦＧＦ２はＦＧＦＲ２ｂとの反応性はよくない。一方で、ＦＧＦ１はＦＧＦＲ２ｂを含めて７種類すべてのＦＧＦＲと反応することが可能であることが知られており、ＦＧＦ２とＦＧＦ１の性質を両方併せ持つＦＧＦＣは、ＦＧＦＲ２ｂと反応することができ、その結果、低濃度であっても培養できたものと推定される。
成体幹細胞とは、体性幹細胞、組織幹細胞、癌幹細胞とも呼ばれる幹細胞であり、生体の体内に存在する最終分化していない細胞である。通常、成体幹細胞は特定の複数種の細胞に分化する能力を有する。本実施形態の製造方法において、成体幹細胞は、培養維持された細胞であってもよいし、成体から摘出した組織に存在する初代細胞であってもよい。また、成体幹細胞としては上皮幹細胞が好ましい。
本明細書において、細胞が凝集したもの細胞塊という。また、細胞塊の中でも、特に、成体幹細胞及び成体幹細胞から分化した細胞を含み、生体内の臓器と類似した構造及び機能を有しているものをオルガノイドという。
本実施形態の製造方法において、培地としては、基礎培地にキメラ化ＦＧＦを添加した培地を用いることができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ（ＧＭＥＭ）培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地が挙げられる。基礎培地として、これらの培地を混合した培地を用いてもよい。
本実施形態の製造方法におけるキメラ化ＦＧＦは、ＦＧＦ１の一部領域及びＦＧＦ２の一部領域を含む融合タンパク質である。ヒトＦＧＦ１タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿００１２４４１３８．１、ＮＰ＿００１２４４１３７．１、ＮＰ＿００１３４１８８１．１等が挙げられる。マウスＦＧＦ１タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿０３４３２７．１等が挙げられる。ヒトＦＧＦ２タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿００１３４８５９４．１、ＮＰ＿００１９９７．５等が挙げられる。マウスＦＧＦ２タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿０３２０３２．１等が挙げられる。
キメラ化ＦＧＦとしては、配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましい。キメラ化ＦＧＦは、培地中に５０ｎｇ／ｍＬ以下含有させることにより生体幹細胞又は生体幹細胞を含む細胞組織片からオルガノイドを製造することができる活性を有する限り、配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に対して変異を有していてもよい。
すなわち、キメラ化ＦＧＦは、配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。ここで、１若しくは数個とは、１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、更に好ましくは１～２個である。
キメラ化ＦＧＦのアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列における第４３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は、グルタミン、バリン、イソロイシン又はロイシンであることが好ましい。
配列番号１のアミノ酸配列における第４３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸が、グルタミン、バリン、イソロイシン又はロイシンであるキメラ化ＦＧＦは、ＦＧＦ１やＦＧＦ２と比較して高い耐熱性を有しており、安定である。
なかでも、配列番号１のアミノ酸配列における第４３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がイソロイシンであるキメラ化ＦＧＦは、特に高い融解温度（Ｔｍ）を有し、高い耐熱性を有する。
配列番号１のアミノ酸配列における第４３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ等のアラインメントプログラムを用いて対象アミノ酸配列と、配列番号１のアミノ酸配列をアラインメントすること等により特定することができる。
従来、オルガノイドの製造では、培地中に１００ｎｇ／ｍＬ程度のＦＧＦ２を添加することが通常であった。これに対し、ＦＧＦ２の代わりにキメラ化ＦＧＦを用いることにより、培地中に含まれる前記キメラ化ＦＧＦの含有量を減らすことができる。培地中に含まれる前記キメラ化ＦＧＦの含有量は、通常、５０ｎｇ／ｍＬ以下、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１５ｎｇ／ｍＬ以下、更に好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは５ｎｇ／ｍＬ以下である。
本実施形態の製造方法において、培地は、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）を更に含有していてもよい。培地がＥＧＦを含む場合、培地中に含まれるキメラ化ＦＧＦ及びＥＧＦの合計の含有量を減らすことができる。培地がＥＧＦを含む場合、培地中に含まれるキメラ化ＦＧＦ及びＥＧＦの合計の含有量としては、通常、１００ｎｇ／ｍＬ以下、好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ以下である。
ヒトＥＧＦタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００１１７１６０１．１等である。
本実施形態の製造方法において、培地は、Ｗｎｔシグナル伝達経路増強剤を更に含有していることが好ましい。
Ｗｎｔシグナル伝達経路増強剤としては、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ－スポンジン、ノリン、ＧＳＫ－３β阻害剤等が挙げられる。これらの中でも、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ－スポンジンが好ましい。
Ｗｎｔファミリーメンバーとしては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１及びＷｎｔ１６等が挙げられる。
Ｗｎｔファミリーメンバーとしては、Ｗｎｔ３ａ又はＷｎｔ４が好ましく、Ｗｎｔ３ａがより好ましい。Ｗｎｔ３ａは、安定性を向上させるために、Ａｆａｍｉｎ（アファミン）との複合体であることが好ましい。
Ｗｎｔシグナル伝達経路増強剤としてＷｎｔ３ａを用いる場合、培地中に含まれるＷｎｔ３ａの濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ、例えば１００ｎｇ／ｍＬ～７００ｎｇ／ｍＬである。
Ｒ－スポンジンとしては、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４等が挙げられる。
ヒトＲ－スポンジン１タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿００１２２９８３８．１、ＸＰ＿００６７１０６４６．１等が挙げられる。マウスＲ－スポンジン１タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿６１９６２４．２等が挙げられる。ヒトＲ－スポンジン２タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＸＰ＿０１１５１５３２０．１、ＸＰ＿０１１５１５３２１．１、ＮＰ＿８４８６６０．３等が挙げられる。マウスＲ－スポンジン２タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿７６６４０３．１等が挙げられる。ヒトＲ－スポンジン３タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＸＰ＿０１６８６６８６７．１、ＸＰ＿０１６８６６８６８．１、ＮＰ＿１１６１７３．２等が挙げられる。マウスＲ－スポンジン３タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿０８２６２７．３等が挙げられる。ヒトＲ－スポンジン４タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿００１０３５０９６．１、ＮＰ＿００１０２５０４２．２等が挙げられる。マウスＲ－スポンジン４タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿００１０３５７７９．１等が挙げられる。
Ｗｎｔシグナル伝達経路増強剤としてＲ－スポンジンを用いる場合、培地中に含まれるＲ－スポンジンの濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬである。
ＧＳＫ－３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ番号：２５２９１７－０６－９）、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（ＣＡＳ番号：１４２２７３－２０－９）、及び６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ、ＣＡＳ番号：６６７４６３－６２－９）等が挙げられる。
Ｗｎｔシグナル伝達経路増強剤としてＧＳＫ－３β阻害剤を用いる場合、培地中に含まれるＧＳＫ－３β阻害剤の濃度は、通常、０．１μＭ～１０μＭである。
本実施形態の製造方法において、培地は、Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）シグナル伝達経路増強剤を更に含有していることが好ましい。
ＩＧＦシグナル伝達経路増強剤としては、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２等が挙げられ、ＩＧＦ－１が好ましい。ヒトＩＧＦ－１タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿００１１０４７５３．１、ＮＰ＿００１１０４７５５．１等が挙げられる。マウスＩＧＦ－１タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿００１１０４７４５．１等が挙げられる。ヒトＩＧＦ－２タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿００１００７１４０．２、ＮＰ＿００１２７８７９０．１等が挙げられる。マウスＩＧＦ－２タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿０３４６４４．２、ＮＰ＿００１３０２４１８．１等が挙げられる。
本実施形態の製造方法において、培地は、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β（ＴＧＦ－β）シグナル伝達経路阻害剤を更に含有していることが好ましい。
ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、Ｓｍａｄファミリーにより伝達されるシグナル伝達経路を阻害する物質である。ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤としては、Ａ８３－０１（ＣＡＳ番号：９０９９１０－４３－６）、ＳＢ－４３１５４２（ＣＡＳ番号：３０１８３６－４１－９）、ＳＢ－５０５１２４（ＣＡＳ番号：６９４４３３－５９－５）、ＳＢ－５２５３３４（ＣＡＳ番号：３５６５５９－２０－１）、ＬＹ３６４９４７（ＣＡＳ番号：３９６１２９－５３－６）、ＳＣ－２０３２９４（ＣＡＳ番号：６２７５３６－０９－０８）、ＳＤ－２０８（ＣＡＳ番号：６２７５３６－０９－８）、ＳＪＮ２５１１（ＣＡＳ番号：４４６８５９－３３－２）等が挙げられる。これらの中でも、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２が好ましい。
培地中に含まれるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤の濃度は、通常１０ｎＭ～１００μＭ、好ましくは１００ｎＭ～１０μＭである。
本実施形態の製造方法において、培地は、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）シグナル伝達経路阻害剤を更に含有していることが好ましい。
ＲＯＣＫシグナル伝達経路阻害剤としては、例えば、Ｙ－２７６３２（ＣＡＳ番号：１２９８３０－３８－２）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（ＣＡＳ番号：１０５６２８－０７－７）、Ｈ－１１５２（ＣＡＳ番号：８７１５４３－０７－６）、Ｗｆ－５３６（ＣＡＳ番号：５３９８５７－６４－２）、これらの誘導体等が挙げられる。
培地中に含まれるＲＯＣＫシグナル伝達経路阻害剤の濃度は、通常０．１μＭ～１００μＭ、好ましくは０．１μＭ～５０μＭ、より好ましくは０．１μＭ～３０μＭである。
本実施形態の製造方法において、培地は、Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤を更に含有していることが好ましい。
ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤としては、例えば、Ｎｏｇｇｉｎ（ノギン）、コーディン、フォリスタチン、ドルソモルフィン（ＣＡＳ番号：８６６４０５－６４－３）、ＤＭＨ１（ＣＡＳ番号：１２０６７１１－１６－１）、ＬＤＮ１９３１８９（ＣＡＳ番号：１０６２３６８－２４－４）等が挙げられる。
培地中に含まれるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤の濃度は、通常、０．５μＭ～１０μＭである。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤としてＮｏｇｇｉｎを用いる場合、培地中に含まれるＮｏｇｇｉｎの濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬである。
本実施形態の製造方法において、培地は、その他の添加剤として、培地サプリメント、抗菌剤、血清、血清代替物、インスリン、アルブミン等を更に含有していてもよい。
培地サプリメントとしては、例えば、製品名「Ｂ－２７無血清サプリメント」（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）等の神経細胞培養用サプリメント、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アラニルＬ－グルタミン等を含有する、製品名「ＧｌｕｔａＭａｘ」（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）等のグルタミン含有サプリメント、「ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）等のアミノ酸水溶液、２－メルカプトエタノールが挙げられる。
抗菌剤としては、例えば、ペニシリン系抗生物質、セフェム系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、ホスホマイシン系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、及びニューキノロン系抗生物質が挙げられる。
成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片の培養において、細胞を細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に包埋するか、培地にＥＣＭを添加してもよい。ＥＣＭとしては、例えば、基底膜に含まれる成分、細胞間隙に存在する糖タンパク質が挙げられる。基底膜に含まれる成分としては、例えば、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン等が挙げられる。細胞間隙に存在する糖タンパク質としては、コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、フィブロネクチン、ヘパリン硫酸塩等が挙げられる。ＥＣＭとして、ＥＣＭを含む市販品を用いてもよい。ＥＣＭを含む市販品としては、例えば、マトリゲル（登録商標、コーニング社）、ヒト型ラミニン（シグマ社）等が挙げられる。
マトリゲルは、Ｅｎｇｌｂｒｅｔｈ Ｈｏｌｍ Ｓｗａｒｍマウス肉腫由来の基底膜成分を含有する。マトリゲルの主成分は、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチンであるが、これらに加えて、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、ＴＧＦ－β等の各種増殖因子が含まれる。マトリゲルには各種増殖因子の濃度が低いグレードもあり、その濃度はＥＧＦが０．５ｎｇ／ｍＬ未満、ＮＧＦが０．２ｎｇ／ｍＬ未満、ＰＤＧＦが５ｐｇ／ｍＬ未満、ＩＧＦ－１が５ｎｇ／ｍＬ未満、ＴＧＦ－βが１．７ｎｇ／ｍＬ未満である。マトリゲルとしては、各種増殖因子の含有割合が低いグレードを用いることが好ましい。
成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片の培養において、培地は１～５日に１回程度交換することが好ましい。また、形成されたオルガノイドが大きい場合には、オルガノイドを分散することが好ましい。分散とは、細胞を酵素処理や物理処理等の分散処理により、１０，０００個以下の細胞集団に分離させることをいう。分散は、オルガノイドを細胞分散液処理すること等により行うことができる。
細胞分散液としては、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、ＤＮａｓｅ、パパイン等の酵素類、又は、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤を含む溶液を挙げることができる。細胞分散液として、市販の細胞分散液を用いることもできる。市販の細胞分散液としては、例えば、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ等が挙げられる。
［培地］
１実施形態は、キメラ化ＦＧＦを含み、前記キメラ化ＦＧＦの含有量が、５０ｎｇ／ｍＬ以下である、培地である。本実施形態の培地で成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片を培養することにより、オルガノイドを製造することができる。したがって、本実施形態の培地は、オルガノイド製造用培地であるということができる。
１実施形態は、キメラ化ＦＧＦを含み、前記キメラ化ＦＧＦの含有量が、５０ｎｇ／ｍＬ以下である、培地である。本実施形態の培地で成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片を培養することにより、オルガノイドを製造することができる。したがって、本実施形態の培地は、オルガノイド製造用培地であるということができる。
本実施形態の培地は、基礎培地にキメラ化ＦＧＦを添加したものである。基礎培地、キメラ化ＦＧＦについては上述したものと同様である。
本実施形態の培地は、好ましくは、ＥＧＦを更に含み、前記キメラ化ＦＧＦ及び前記ＥＧＦの合計の含有量が、１００ｎｇ／ｍＬ以下である。ＥＧＦについては上述したものと同様である。
本実施形態の培地は、Ｗｎｔシグナル伝達経路増強剤、ＩＧＦシグナル伝達経路増強剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＲＯＣＫシグナル伝達経路阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、その他の添加剤を更に含有することができる。これらの各成分については上述したものと同様である。
［オルガノイド］
１実施形態は、上述した製造方法により製造されたオルガノイドである。本実施形態のオルガノイドは、成長因子等に要するコストを低減させて製造することができるため、低コストで大量に製造することが容易である。このため、例えば、後述する被験物質の評価等を大規模に実施する用途に好適に用いることができる。
１実施形態は、上述した製造方法により製造されたオルガノイドである。本実施形態のオルガノイドは、成長因子等に要するコストを低減させて製造することができるため、低コストで大量に製造することが容易である。このため、例えば、後述する被験物質の評価等を大規模に実施する用途に好適に用いることができる。
本実施形態のオルガノイドは、従来用いられてきたＦＧＦ２の代わりにキメラ化ＦＧＦを用いて製造されている。したがって、本実施形態のオルガノイドと従来の製造方法で製造されたオルガノイドとは遺伝子発現プロファイル等に相違が存在する可能性がある。しかしながら、そのような相違点を特定するためには多大な試行錯誤及び労力を必要とするため、本実施形態のオルガノイドを遺伝子発現プロファイル等で特定することは現実的ではなく、製造方法により特定することが現実的であると考えられる。
［被験物質の評価方法］
１実施形態は、上述した製造方法により製造されたオルガノイドを被験物質に接触させる工程、及び、前記被験物質が前記オルガノイドに及ぼす影響を評価する工程を含む、被験物質の評価方法である。
１実施形態は、上述した製造方法により製造されたオルガノイドを被験物質に接触させる工程、及び、前記被験物質が前記オルガノイドに及ぼす影響を評価する工程を含む、被験物質の評価方法である。
本実施形態の方法により、生体内の細胞と類似した構造及び機能を有するオルガノイドを用いて被験物質の評価を行うことができる。本実施形態の方法は、様々な疾患の治療薬のスクリーニング等に適用することができる。
被験物質としては、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。
被験物質がオルガノイドに及ぼす影響は、例えば、遺伝子レベル、タンパク質レベル、代謝物レベルで評価することができる。また、オルガノイドの形態の評価により、被験物質がオルガノイドに及ぼす影響を評価することもできる。
遺伝子レベルでの評価は、例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析、ＤＮＡマイクロアレイ解析、リアルタイムＰＣＲ等により行うことができる。また、タンパク質レベルでの評価は、例えば、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫染色等により行うことができる。また、代謝物レベルでの評価は、例えば、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、ＬＣ／ＭＳ等により評価することができる。また、オルガノイドの形態の評価は、例えば顕微鏡観察、免疫染色等により行うことができる。
［キメラ化ＦＧＦ］
１実施形態は、配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるか、又は、配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ培地中に５０ｎｇ／ｍＬ以下含有させることにより生体幹細胞又は生体幹細胞を含む細胞組織片からオルガノイドを製造することができる活性を有するタンパク質である、キメラ化ＦＧＦである。
１実施形態は、配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるか、又は、配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ培地中に５０ｎｇ／ｍＬ以下含有させることにより生体幹細胞又は生体幹細胞を含む細胞組織片からオルガノイドを製造することができる活性を有するタンパク質である、キメラ化ＦＧＦである。
実施例において後述するように、本実施形態のキメラ化ＦＧＦを用いることにより、オルガノイドの製造において培地中に添加する成長因子の含有量を減らすことができる。
また、上述したように、キメラ化ＦＧＦのアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列における第４３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は、グルタミン、バリン、イソロイシン又はロイシンであることが好ましい。
なかでも、高い耐熱性を有し安定である観点から、配列番号１のアミノ酸配列における第４３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は、バリン、イソロイシン又はロイシンであることが好ましく、イソロイシンであることがより好ましい。
以下、本実施形態を実施例に基づいて更に具体的に説明するが、本実施形態はこれら実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（オルガノイドの製造）
ＥＧＦの存在下又は非存在下で、ＦＧＦ２又はキメラ化ＦＧＦを様々な濃度で含む培地を用いて、成体幹細胞を培養し、オルガノイドの形成を検討した。
（オルガノイドの製造）
ＥＧＦの存在下又は非存在下で、ＦＧＦ２又はキメラ化ＦＧＦを様々な濃度で含む培地を用いて、成体幹細胞を培養し、オルガノイドの形成を検討した。
《培地の調製》
基本培地として、製品名「Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２」（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用し、下記表１に記載の成分を添加した培地を調製した。表１中、「ｗ／ｏ ＥＧＦ処方」はＥＧＦを含まない培地処方を意味し、「ｗ／ ＥＧＦ処方」はＥＧＦを含む培地処方を意味する。
基本培地として、製品名「Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２」（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用し、下記表１に記載の成分を添加した培地を調製した。表１中、「ｗ／ｏ ＥＧＦ処方」はＥＧＦを含まない培地処方を意味し、「ｗ／ ＥＧＦ処方」はＥＧＦを含む培地処方を意味する。
培地サプリメントとしては、Ｂ－２７無血清サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いた。
ＦＧＦ２としては、製品名「ＦＧＦ－Ｂａｓｉｃ、Ｈｕｍａｎ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、Ａｎｉｍａｌ Ｆｒｅｅ」（ペプロテック社）を用いた。また、キメラ化ＦＧＦとしては、製品名「ＦＧＦＣ」（富士フィルム和光純薬株式会社）を用いた。
ＥＧＦとしては、製品名「Ａｎｉｍａｌ－Ｆｒｅｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｕｒｉｎｅ ＥＧＦ」（ペプロテック社）を用いた。
Ｗｎｔシグナル増強剤（Ｗｎｔシグナル伝達経路増強剤）としては、マウス Ｒ－スポンジン１ コンディションドメディウム（自家調製）及び製品名「Ａｆａｍｉｎ／Ｗｎｔ３ａ ＣＭ」（ＭＢＬライフサイエンス社）を用いた。
インスリン様成長因子（ＩＧＦシグナル伝達経路増強剤）としては、製品名「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩＧＦ－Ｉ／ＩＧＦ－１ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＦ」（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いた。
ＴＧＦ－β阻害剤（ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤）としては、Ａ８３－０１（ＴＯＣＲＩＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いた。
ＲＯＣＫ阻害剤（ＲＯＣＫシグナル伝達経路阻害剤）としては、製品名「Ｙ－２７６３２，ＭＦ」（富士フィルム和光純薬株式会社）を用いた。
ＢＭＰ阻害剤（ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤）としては、マウス Ｎｏｇｇｉｎ コンディションドメディウム（自家調製）を用いた。
《オルガノイドの形成》
成体幹細胞を含む細胞組織片として大腸組織片を使用した。より詳細には、ゲノム編集により、大腸組織片由来の細胞のＬＧＲ５遺伝子座の第１８エクソンに、レポーターコンストラクトを導入した細胞を実験に使用した。ＬＧＲ５遺伝子は幹細胞マーカーである。また、レポーターコンストラクトとしては、ＩＲＥＳ－ｔｄＴｏｍａｔｏを使用した。この細胞は、ＬＧＲ５を発現すると蛍光タンパク質であるｔｄＴｏｍａｔｏを発現する。
成体幹細胞を含む細胞組織片として大腸組織片を使用した。より詳細には、ゲノム編集により、大腸組織片由来の細胞のＬＧＲ５遺伝子座の第１８エクソンに、レポーターコンストラクトを導入した細胞を実験に使用した。ＬＧＲ５遺伝子は幹細胞マーカーである。また、レポーターコンストラクトとしては、ＩＲＥＳ－ｔｄＴｏｍａｔｏを使用した。この細胞は、ＬＧＲ５を発現すると蛍光タンパク質であるｔｄＴｏｍａｔｏを発現する。
上記の細胞を、細胞１０００個あたり２０μＬのマトリゲル（登録商標、コーニング社）で包埋し、４８ウェルプレートに播種した。続いて、マトリゲルを３７℃で静置して固めた。続いて、上述した各組成の培地をマトリゲルの周囲に添加した。その後、２～３日おきに培地交換を行った。
続いて、蛍光顕微鏡観察によりｔｄＴｏｍａｔｏの発現を検出し、幹細胞マーカーであるＬＧＲ５タンパク質の発現を評価した。
図１（ａ）～（ｄ）は、培養９日目のＥＧＦの非存在下で形成したオルガノイドの顕微鏡写真である。図１（ａ）は図に示す各濃度のＦＧＦ２の存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図１（ｂ）は、図１（ａ）と同一視野においてＬＧＲ５タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。図１（ｃ）は図に示す各濃度のＦＧＦＣの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図１（ｄ）は、図１（ｃ）と同一視野においてＬＧＲ５タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。
図２（ａ）～（ｄ）は、培養８日目のＥＧＦの存在下で形成したオルガノイドの顕微鏡写真である。図２（ａ）は図に示す各濃度のＦＧＦ２の存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図２（ｂ）は、図２（ａ）と同一視野においてＬＧＲ５タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。図２（ｃ）は図に示す各濃度のＦＧＦＣの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図２（ｄ）は、図２（ｃ）と同一視野においてＬＧＲ５タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。
その結果、ＥＧＦの非存在下では、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を含む培地で成体幹細胞を培養しても、オルガノイドの形成が不十分であることが明らかとなった。一方、ＥＧＦの非存在下であっても、ＦＧＦＣを含む培地ではオルガノイドを形成することができることが明らかとなった。また、図１（ｃ）及び（ｄ）に示すように、培地中のＦＧＦＣの濃度が２．５ｎｇ／ｍＬ程度に減らしてもオルガノイドを形成することができることが明らかとなった。
また、ＥＧＦの存在下では、１２．５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を含む培地で成体幹細胞を培養することにより、オルガノイドを形成することができることが明らかとなった。また、ＥＧＦの存在下では、培地中のＦＧＦＣの濃度を３．１ｎｇ／ｍＬ程度に減らしてもオルガノイドを形成することができることが明らかとなった。
また、ＦＧＦＣを含む培地を用いると、ＦＧＦ２を含む培地を用いた場合に比べて、コロニー形成数が多いことが明らかとなった。
［実験例２］
（ＦＧＦＣ変異体の作製）
人工合成によりＦＧＦＣ変異体をコードする遺伝子断片を作製した。ＦＧＦＣのアミノ酸配列を配列番号１に示す。ＦＧＦＣ変異体としては、ＦＧＦＣの第４３番目のグルタミン残基をバリンに置換した変異体（以下、「ＦＧＦＣ－Ｖ」といい、アミノ酸配列を配列番号２に示す。）、ＦＧＦＣの第４３番目のグルタミン残基をイソロイシンに置換した変異体（以下、「ＦＧＦＣ－Ｉ」といい、アミノ酸配列を配列番号３に示す。）、ＦＧＦＣの第４３番目のグルタミン残基をロイシンに置換した変異体（以下、「ＦＧＦＣ－Ｌ」といい、アミノ酸配列を配列番号４に示す。）を作製した。
（ＦＧＦＣ変異体の作製）
人工合成によりＦＧＦＣ変異体をコードする遺伝子断片を作製した。ＦＧＦＣのアミノ酸配列を配列番号１に示す。ＦＧＦＣ変異体としては、ＦＧＦＣの第４３番目のグルタミン残基をバリンに置換した変異体（以下、「ＦＧＦＣ－Ｖ」といい、アミノ酸配列を配列番号２に示す。）、ＦＧＦＣの第４３番目のグルタミン残基をイソロイシンに置換した変異体（以下、「ＦＧＦＣ－Ｉ」といい、アミノ酸配列を配列番号３に示す。）、ＦＧＦＣの第４３番目のグルタミン残基をロイシンに置換した変異体（以下、「ＦＧＦＣ－Ｌ」といい、アミノ酸配列を配列番号４に示す。）を作製した。
続いて、ＦＧＦＣ、ＦＧＦＣ－Ｖ、ＦＧＦＣ－Ｉ、ＦＧＦＣ－Ｌをコードする遺伝子断片を、発現ベクターｐＥＴ－３ａにそれぞれ挿入し、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳで発現させてタンパク質として精製し、以下の実験に用いた。
［実験例３］
（ＦＧＦＣ変異体を用いたオルガノイドの製造）
ＦＧＦＣ又はＦＧＦＣ変異体を様々な濃度で含む培地を用いて、成体幹細胞を培養し、オルガノイドの形成を検討した。
（ＦＧＦＣ変異体を用いたオルガノイドの製造）
ＦＧＦＣ又はＦＧＦＣ変異体を様々な濃度で含む培地を用いて、成体幹細胞を培養し、オルガノイドの形成を検討した。
《培地の調製》
基本培地として、製品名「Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２」（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用し、下記表２に記載の成分を添加した培地を調製した。表２中、「ｗ／ｏ ＥＧＦ処方」はＥＧＦを含まない培地処方を意味し、「ｗ／ ＥＧＦ処方」はＥＧＦを含む培地処方を意味する。ＦＧＦＣ及びＦＧＦＣ変異体としては、実験例２で調製したものを使用した。また、ＥＧＦ、Ｗｎｔシグナル増強剤、インスリン様成長因子、ＴＧＦ－β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤としては、実験例１と同様のものを使用した。
基本培地として、製品名「Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２」（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用し、下記表２に記載の成分を添加した培地を調製した。表２中、「ｗ／ｏ ＥＧＦ処方」はＥＧＦを含まない培地処方を意味し、「ｗ／ ＥＧＦ処方」はＥＧＦを含む培地処方を意味する。ＦＧＦＣ及びＦＧＦＣ変異体としては、実験例２で調製したものを使用した。また、ＥＧＦ、Ｗｎｔシグナル増強剤、インスリン様成長因子、ＴＧＦ－β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤としては、実験例１と同様のものを使用した。
《オルガノイドの製造》
成体幹細胞を含む細胞組織片として、実験例１と同様の細胞を使用した。まず、細胞を細胞１０００個あたり２０μＬのマトリゲル（登録商標、コーニング社）で包埋し、４８ウェルプレートに播種した。続いて、マトリゲルを３７℃で静置して固めた。続いて、上述した各組成の培地をマトリゲルの周囲に添加した。その後、２～３日おきに培地交換を行った。
成体幹細胞を含む細胞組織片として、実験例１と同様の細胞を使用した。まず、細胞を細胞１０００個あたり２０μＬのマトリゲル（登録商標、コーニング社）で包埋し、４８ウェルプレートに播種した。続いて、マトリゲルを３７℃で静置して固めた。続いて、上述した各組成の培地をマトリゲルの周囲に添加した。その後、２～３日おきに培地交換を行った。
続いて、蛍光顕微鏡観察によりｔｄＴｏｍａｔｏの発現を検出し、幹細胞マーカーであるＬＧＲ５タンパク質の発現を評価した。
図３（ａ）～（ｄ）は、ＥＧＦの非存在下で形成した培養９日目の各オルガノイドの顕微鏡写真である。図３（ａ）は図に示す各濃度のＦＧＦＣの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図３（ｂ）は図に示す各濃度のＦＧＦＣ－Ｖの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図３（ｃ）は図に示す各濃度のＦＧＦＣ－Ｉの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図３（ｄ）は図に示す各濃度のＦＧＦＣ－Ｌの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。
また、図４（ａ）は、図３（ａ）と同一視野においてＬＧＲ５タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。図４（ｂ）は、図３（ｂ）と同一視野においてＬＧＲ５タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。図４（ｃ）は、図３（ｃ）と同一視野においてＬＧＲ５タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。図４（ｄ）は、図３（ｄ）と同一視野においてＬＧＲ５タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。
図５（ａ）～（ｄ）は、ＥＧＦの存在下で形成した培養８日目の各オルガノイドの顕微鏡写真である。図５（ａ）は図に示す各濃度のＦＧＦＣの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図５（ｂ）は図に示す各濃度のＦＧＦＣ－Ｖの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図５（ｃ）は図に示す各濃度のＦＧＦＣ－Ｉの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図５（ｄ）は図に示す各濃度のＦＧＦＣ－Ｌの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。
また、図６（ａ）は、図５（ａ）と同一視野においてＬＧＲ５タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。図６（ｂ）は、図５（ｂ）と同一視野においてＬＧＲ５タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。図６（ｃ）は、図５（ｃ）と同一視野においてＬＧＲ５タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。図６（ｄ）は、図５（ｄ）と同一視野においてＬＧＲ５タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。
その結果、いずれのＦＧＦＣ変異体を用いても、ＦＧＦＣを用いた場合と同程度にオルガノイドを製造することができることが明らかとなった。また、図３（ａ）～（ｄ）、図４（ａ）～（ｄ）、図５（ａ）～（ｄ）、図６（ａ）～（ｄ）に示すように、培地中のＦＧＦＣ又はＦＧＦＣ変異体の濃度を２．５ｎｇ／ｍＬ又は３．１ｎｇ／ｍＬに減らしてもオルガノイドを製造することができることが明らかとなった。
［実験例４］
（ＦＧＦＣ変異体の耐熱性の検討）
実験例２で調製したＦＧＦＣ、ＦＧＦＣ－Ｖ、ＦＧＦＣ－Ｉ、ＦＧＦＣ－Ｌの耐熱性を検討した。また、比較のために、ＦＧＦ１（製品名「ＦＧＦ－Ａｃｉｄｉｃ、Ｈｕｍａｎ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ」、ペプロテック社）、ＦＧＦ２（製品名「ＦＧＦ－Ｂａｓｉｃ、Ｈｕｍａｎ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、Ａｎｉｍａｌ Ｆｒｅｅ」、ペプロテック社）の耐熱性も同様に検討した。
（ＦＧＦＣ変異体の耐熱性の検討）
実験例２で調製したＦＧＦＣ、ＦＧＦＣ－Ｖ、ＦＧＦＣ－Ｉ、ＦＧＦＣ－Ｌの耐熱性を検討した。また、比較のために、ＦＧＦ１（製品名「ＦＧＦ－Ａｃｉｄｉｃ、Ｈｕｍａｎ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ」、ペプロテック社）、ＦＧＦ２（製品名「ＦＧＦ－Ｂａｓｉｃ、Ｈｕｍａｎ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、Ａｎｉｍａｌ Ｆｒｅｅ」、ペプロテック社）の耐熱性も同様に検討した。
耐熱性の検討には、市販のキット（製品名「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ ＳｈｉｆｔＴＭ Ｄｙｅ Ｋｉｔ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用し、キットのマニュアルにしたがってサンプルを調製した後、リアルタイムＰＣＲ装置（製品名「７５００ｆａｓｔ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で各タンパク質の耐熱性を検討した。測定結果は、ソフトウエア（製品名「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ ＳｈｉｆｔＴＭ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．３」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて解析した。
図７は、測定された各タンパク質の融解温度（Ｔｍ）を示すグラフである。グラフの横軸は温度（℃）を示す。また、各タンパク質のＴｍ値を下記表３に示す。
その結果、ＦＧＦＣは、ＦＧＦ２よりも耐熱性が高いことが明らかとなった。また、ＦＧＦＣ－Ｖ、ＦＧＦＣ－Ｉ、ＦＧＦＣ－Ｌは、ＦＧＦＣよりも更に高い耐熱性を有することが明らかとなった。
本実施形態によれば、培地中に含まれる成長因子の含有量を減らすことができる、オルガノイドの製造技術を提供することができる。
Claims (15)
- 成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片を、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）１の一部領域及びＦＧＦ２の一部領域を含むキメラ化ＦＧＦを含有する培地中で培養する工程を含む、オルガノイドの製造方法。
- 前記培地中に含まれる前記キメラ化ＦＧＦの含有量が、５０ｎｇ／ｍＬ以下である、請求項１に記載の製造方法。
- 前記培地が、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）を更に含有する、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。
- 前記培地中に含まれる前記キメラ化ＦＧＦ及び前記ＥＧＦの合計の含有量が、１００ｎｇ／ｍＬ以下である、請求項３に記載の製造方法。
- 前記キメラ化ＦＧＦが、配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるか、又は、配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ培地中に５０ｎｇ／ｍＬ以下含有させることにより生体幹細胞又は生体幹細胞を含む細胞組織片からオルガノイドを製造することができる活性を有するタンパク質である、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記培地が、Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）シグナル伝達経路増強剤を更に含有する、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記培地が、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β（ＴＧＦ－β）シグナル伝達経路阻害剤を更に含有する、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記培地が、Ｗｎｔシグナル伝達経路増強剤を更に含有する、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記培地が、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）シグナル伝達経路阻害剤を更に含有する、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記培地が、Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤を更に含有する、請求項１～請求項９のいずれか一項に記載の製造方法。
- キメラ化ＦＧＦを含み、前記キメラ化ＦＧＦの含有量が、５０ｎｇ／ｍＬ以下である、培地。
- ＥＧＦを更に含み、前記キメラ化ＦＧＦ及び前記ＥＧＦの合計の含有量が、１００ｎｇ／ｍＬ以下である、請求項１１に記載の培地。
- 請求項１～請求項１０のいずれか一項に記載の製造方法により製造されたオルガノイド。
- 請求項１３に記載のオルガノイドを被験物質に接触させる工程、及び
前記被験物質が前記オルガノイドに及ぼす影響を評価する工程、
を含む、被験物質の評価方法。 - 配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるか、又は、配列番号１～配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ培地中に５０ｎｇ／ｍＬ以下含有させることにより生体幹細胞又は生体幹細胞を含む細胞組織片からオルガノイドを製造することができる活性を有するタンパク質である、キメラ化ＦＧＦ。
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