WO2021125177A1 - オルガノイドの製造方法 - Google Patents
オルガノイドの製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2021125177A1 WO2021125177A1 PCT/JP2020/046783 JP2020046783W WO2021125177A1 WO 2021125177 A1 WO2021125177 A1 WO 2021125177A1 JP 2020046783 W JP2020046783 W JP 2020046783W WO 2021125177 A1 WO2021125177 A1 WO 2021125177A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- medium
- production method
- seq
- organoid
- amino acid
- Prior art date
Links
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 title claims abstract description 105
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 claims abstract description 57
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 32
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 52
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 46
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 42
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 39
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 39
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 35
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 33
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 21
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 16
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 15
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 15
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 claims description 13
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 claims description 13
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 9
- 239000011435 rock Substances 0.000 claims description 9
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 claims description 8
- 102000000568 rho-Associated Kinases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010041788 rho-Associated Kinases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims 3
- 102000014429 Insulin-like growth factor Human genes 0.000 claims 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract description 17
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 abstract description 6
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 abstract description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 104
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 36
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 101001063456 Homo sapiens Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5 Proteins 0.000 description 16
- 102100031036 Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5 Human genes 0.000 description 16
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 12
- 239000000306 component Substances 0.000 description 11
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 11
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 9
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 7
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 7
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 7
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 7
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 5
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 4
- 102100023600 Fibroblast growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 4
- 101710182389 Fibroblast growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 4
- 102000019058 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Human genes 0.000 description 4
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 4
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 description 4
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 description 4
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 4
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 3
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 3
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 102100037369 Nidogen-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 102000044162 human IGF1 Human genes 0.000 description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000012913 medium supplement Substances 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 3
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 4-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]-3-pyrazolo[1,5-a]pyrimidinyl]quinoline Chemical compound C1CNCCN1C1=CC=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C3=CC=CC=C3N=CC=2)C=C1 CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 108091016585 CD44 antigen Proteins 0.000 description 2
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 2
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 2
- 101000825954 Homo sapiens R-spondin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000825949 Homo sapiens R-spondin-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000825960 Homo sapiens R-spondin-3 Proteins 0.000 description 2
- 101000825962 Homo sapiens R-spondin-4 Proteins 0.000 description 2
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 2
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101100531973 Mus musculus Rspo1 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 2
- 101150010310 WNT-4 gene Proteins 0.000 description 2
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 2
- 102000052548 Wnt-4 Human genes 0.000 description 2
- 108700020984 Wnt-4 Proteins 0.000 description 2
- -1 Wnt2b Proteins 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 239000012574 advanced DMEM Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N dorsomorphin Chemical compound C=1C=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C=CN=CC=2)C=CC=1OCCN1CCCCC1 XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- QQUXFYAWXPMDOE-UHFFFAOYSA-N kenpaullone Chemical compound C1C(=O)NC2=CC=CC=C2C2=C1C1=CC(Br)=CC=C1N2 QQUXFYAWXPMDOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002849 thermal shift Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102100036774 Afamin Human genes 0.000 description 1
- 101710149366 Afamin Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- JMIFGARJSWXZSH-UHFFFAOYSA-N DMH1 Chemical compound C1=CC(OC(C)C)=CC=C1C1=CN2N=CC(C=3C4=CC=CC=C4N=CC=3)=C2N=C1 JMIFGARJSWXZSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016970 Follistatin Human genes 0.000 description 1
- 108010014612 Follistatin Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100120051 Homo sapiens FGF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100281008 Homo sapiens FGF2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001076292 Homo sapiens Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 1
- 101000851176 Homo sapiens Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 101150017554 LGR5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100120053 Mus musculus Fgf1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100281010 Mus musculus Fgf2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100286577 Mus musculus Igf2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000825950 Mus musculus R-spondin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000858599 Mus musculus R-spondin-4 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102100022762 R-spondin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100022763 R-spondin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100022766 R-spondin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100022759 R-spondin-4 Human genes 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 101150109862 WNT-5A gene Proteins 0.000 description 1
- 101150019524 WNT2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000052547 Wnt-1 Human genes 0.000 description 1
- 108700020987 Wnt-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000052556 Wnt-2 Human genes 0.000 description 1
- 108700020986 Wnt-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000052549 Wnt-3 Human genes 0.000 description 1
- 108700020985 Wnt-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000043366 Wnt-5a Human genes 0.000 description 1
- 108700020483 Wnt-5a Proteins 0.000 description 1
- 101100485097 Xenopus laevis wnt11b gene Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002648 alanylglutamine Drugs 0.000 description 1
- 239000002647 aminoglycoside antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000003445 biliary tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 150000001782 cephems Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 102000006533 chordin Human genes 0.000 description 1
- 108010008846 chordin Proteins 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- YMDXZJFXQJVXBF-STHAYSLISA-N fosfomycin Chemical compound C[C@@H]1O[C@@H]1P(O)(O)=O YMDXZJFXQJVXBF-STHAYSLISA-N 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 102000057877 human IGF2 Human genes 0.000 description 1
- 102000050526 human RSPO1 Human genes 0.000 description 1
- 102000054144 human RSPO3 Human genes 0.000 description 1
- 102000048108 human RSPO4 Human genes 0.000 description 1
- 102000047209 human Rspo2 Human genes 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 108700018499 mouse R-spondin3 Proteins 0.000 description 1
- 108010088102 mouse insulin-like growth factor-1 Proteins 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N quinolin-2-ol Chemical compound C1=CC=C2NC(=O)C=CC2=C1 LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940072172 tetracycline antibiotic Drugs 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4743—Insulin-like growth factor binding protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
- C12N5/068—Stem cells; Progenitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/113—Acidic fibroblast growth factor (aFGF, FGF-1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
Definitions
- the present invention relates to a method for producing an organoid. More specifically, the present invention relates to a method for producing organoids, a medium, an organoid, a method for evaluating a test substance, and a chimeric FGF.
- the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2019-226710 filed in Japan on December 16, 2019, the contents of which are incorporated herein by reference.
- Organoids are cultured cells formed by accumulating cells, and have a structure and function similar to those of organs in the living body.
- stem cells such as somatic stem cells, embryonic stem cells (ES cells), and artificial pluripotent stem cells (iPS cells).
- ES cells embryonic stem cells
- iPS cells artificial pluripotent stem cells
- brain organoids and intestinal organoids have been actively conducted.
- Liver organoids, kidney organoids, gastric organoids, lung organoids, ovarian carcinoma organoids, biliary tract organoids and the like have been produced.
- Organoids are produced from stem cells by controlling signal transduction pathways and inducing stem cell proliferation, differentiation, and the like.
- the MAPK signal transduction pathway is known to be a signal transduction pathway that controls proliferation, growth, differentiation and transformation of stem cells, apoptosis and the like. Further, it is known that the MAPK signal transduction pathway is downwardly regulated by growth factors such as basic fibroblast growth factor (FIbroblast growth factor2, FGF2) and epidermal growth factor (Epidermal Growth Factor, EGF). These growth factors are components that are usually added to a medium for producing organoids from stem cells (see Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
- FIbroblast growth factor2, FGF2 basic fibroblast growth factor
- EGF epidermal growth factor
- an object of the present invention is to provide a technique for producing organoids, which can reduce the content of growth factors contained in the medium.
- the present invention includes the following embodiments.
- Organoids comprising a step of culturing an adult stem cell or a cell tissue piece containing an adult stem cell in a medium containing a chimeric FGF containing a part of Fibroblast growth factor (FGF) 1 and a part of FGF2. Manufacturing method.
- FGF Fibroblast growth factor
- Manufacturing method [2] The production method according to [1], wherein the content of the chimeric FGF contained in the medium is 50 ng / mL or less.
- EGF Epidermal Growth Factor
- the chimeric FGF is a protein consisting of the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 4, or is described in any one of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 4.
- Organoids are produced from living stem cells or cell tissue pieces containing living stem cells by containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence and containing 50 ng / mL or less in the medium.
- the production method according to any one of [1] to [4] which is a protein having an activity capable of capable.
- IGF insulin-like growth factor
- TGF- ⁇ Transforming Growth Factor- ⁇
- Wnt Wnt signaling pathway enhancer
- ROCK Rho-kinase
- a method for evaluating a test substance which comprises a step of bringing the organoid according to [13] into contact with the test substance, and a step of evaluating the effect of the test substance on the organoid.
- a protein consisting of the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 4, or 1 or number in the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 4. It consists of an amino acid sequence in which individual amino acids are deleted, substituted or added, and has an activity capable of producing an organoid from a living stem cell or a cell tissue piece containing the living stem cell by containing 50 ng / mL or less in the medium.
- a protein chimeric FGF.
- FIG. 7 is a graph showing the melting temperature (Tm) of the FGFC mutant measured in Experimental Example 4.
- each component exemplified in the present specification for example, a component contained in a medium or a component used in each step, may be used alone or in combination of two or more.
- medium containing substance X and "in the presence of substance X” mean a medium to which an exogenous substance X is added, a medium containing an exogenous substance X, or an exogenous substance X. It means the presence of substance X. That is, when a cell or tissue present in the medium expresses, secretes or produces the substance X endogenously, the endogenous substance X is distinguished from the exogenous substance X and is an exogenous substance. A medium containing no X does not fall under the category of "medium containing a substance X" even if it contains an intrinsic substance X.
- One embodiment contains an adult stem cell or a cell tissue fragment containing an adult stem cell, containing a chimeric FGF (hereinafter, also referred to as "FGFC") containing a part region of Fibroblast growth factor (FGF) 1 and a part region of FGF2. It is a method for producing an organoid, which comprises a step of culturing in a medium.
- FGFC chimeric FGF
- the content of growth factors added to the medium can be reduced in the production of organoids.
- the production method of the present embodiment is particularly suitable for producing organoids such as intestinal organoids, liver organoids, ovarian cancer organoids, lung organoids, and gastric organoids.
- FGFR fibroblast growth factor receptor
- epithelial stem cells which are important in culturing adult stem cells, are said to express FGFR2b well, but FGF2 does not have good reactivity with FGFR2b.
- FGF1 can react with all seven types of FGFR including FGFR2b, and FGFC having both FGF2 and FGF1 properties can react with FGFR2b, and as a result. It is presumed that it could be cultured even at a low concentration.
- Adult stem cells are stem cells, which are also called somatic stem cells, tissue stem cells, and cancer stem cells, and are non-finally differentiated cells existing in the living body.
- Adult stem cells usually have the ability to differentiate into specific multiple types of cells.
- the adult stem cell may be a cell maintained in culture or a primary cell present in a tissue excised from the adult.
- epithelial stem cells are preferable as adult stem cells.
- a cell mass in which cells are aggregated is referred to as a cell mass.
- organoids those containing adult stem cells and cells differentiated from adult stem cells and having a structure and function similar to those of organs in a living body are referred to as organoids.
- the medium a medium obtained by adding chimeric FGF to the basal medium can be used.
- the basal medium for example, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgo MEM (GMM) medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, F-12 Examples include medium, DMEM / F12 medium, IMDM / F12 medium, ham medium, RPMI 1640 medium, and Fisher's medium.
- the basal medium a medium in which these media are mixed may be used.
- the chimeric FGF in the production method of the present embodiment is a fusion protein containing a partial region of FGF1 and a partial region of FGF2.
- Examples of the NCBI accession number of the human FGF1 protein include NP_0012444138.1, NP_0012444137.1, and NP_0013414881.1.
- Examples of the NCBI accession number of the mouse FGF1 protein include NP_034327.1 and the like.
- Examples of the NCBI accession number of the human FGF2 protein include NP_001348594.1 and NP_001997.5.
- Examples of the NCBI accession number of the mouse FGF2 protein include NP_032032.1 and the like.
- chimeric FGF a protein consisting of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 is preferable.
- the chimeric FGF is any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 as long as it has an activity capable of producing an organoid from a living stem cell or a cell tissue piece containing the living stem cell by containing 50 ng / mL or less in the medium. It may have a mutation with respect to the protein consisting of the amino acid sequence described in 1.
- the chimeric FGF may be a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4. ..
- 1 or several is 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and even more preferably 1 to 2.
- the amino acid corresponding to the 43rd amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is preferably glutamine, valine, isoleucine or leucine.
- the amino acid corresponding to the 43rd amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is glutamine, valine, isoleucine or leucine.
- the chimeric FGF has higher heat resistance than FGF1 and FGF2 and is stable. is there.
- the chimeric FGF in which the amino acid corresponding to the 43rd amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is isoleucine has a particularly high melting temperature (Tm) and high heat resistance.
- the amino acid corresponding to the 43rd amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 can be specified by, for example, aligning the target amino acid sequence with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 using an alignment program such as CrystalW. ..
- the content of the chimeric FGF contained in the medium can be reduced.
- the content of the chimeric FGF contained in the medium is usually 50 ng / mL or less, preferably 20 ng / mL or less, more preferably 15 ng / mL or less, still more preferably 10 ng / mL or less, and particularly preferably 5 ng / mL. It is as follows.
- the medium may further contain Epidermal Growth Factor (EGF).
- EGF Epidermal Growth Factor
- the total content of chimeric FGF and EGF contained in the medium can be reduced.
- the total content of the chimeric FGF and EGF contained in the medium is usually 100 ng / mL or less, preferably 70 ng / mL or less.
- NCBI accession number of the human EGF protein is NP_0011171601.1 or the like.
- the medium further contains a Wnt signaling pathway enhancer.
- Wnt signaling pathway enhancer examples include Wnt family members, R-spondin, Nolin, GSK-3 ⁇ inhibitors and the like. Among these, Wnt family members and R-spondin are preferable.
- Wnt family members include Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 and Wnt16.
- Wnt3a or Wnt4 is preferable, and Wnt3a is more preferable.
- Wnt3a is preferably a complex with Afamine in order to improve stability.
- the concentration of Wnt3a contained in the medium is usually 10 ng / mL to 10 ⁇ g / mL, preferably 10 ng / mL to 1 ⁇ g / mL, for example 100 ng / mL to 700 ng / mL. Is.
- R-spondin examples include R-spondin 1, R-spondin 2, R-spondin 3, R-spondin 4, and the like.
- NCBI accession number of the human R-spondin 1 protein examples include NP_0012229838.1 and XP_006710646.1. Examples of the NCBI accession number of the mouse R-spondin 1 protein include NP_619624.2 and the like.
- NCBI accession numbers for the human R-spondin 2 protein include XP_011515320.1, XP_011515321.1, NP_848660.3 and the like.
- Examples of the NCBI accession number of the mouse R-spondin 2 protein examples include NP_766403.1 and the like.
- Examples of the NCBI accession number of the human R-spondin 3 protein examples include XP_01668667.1., XP_01686668.1, and NP_116173.2.
- Examples of the NCBI accession number of the mouse R-spondin 3 protein include NP_082627.3 and the like.
- Examples of the NCBI accession number of the human R-spondin 4 protein include NP_001035096.1 and NP_001025042.2.
- Examples of the NCBI accession number of the mouse R-spondin 4 protein include NP_0010357791 and the like.
- the concentration of R-spondin contained in the medium is usually 10 ng / mL to 10 ⁇ g / mL, preferably 10 ng / mL to 1 ⁇ g / mL, more preferably 100 ng. It is / mL to 500 ng / mL.
- GSK-3 ⁇ inhibitors include CHIR99021 (CAS number: 252917-06-9), Kenpaullone (CAS number: 142273-20-9), and 6-Bromodyrubin-3'-oxime (BIO, CAS number: 667463-62). -9) and the like.
- the concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor contained in the medium is usually 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M.
- the medium further contains an insulin-like growth factor (IGF) signal transduction pathway enhancer.
- IGF insulin-like growth factor
- Examples of the IGF signal transduction pathway enhancer include IGF-1, IGF-2 and the like, and IGF-1 is preferable.
- Examples of the NCBI accession number of the human IGF-1 protein include NP_001104753.1 and NP_001104755.1.
- Examples of the NCBI accession number of the mouse IGF-1 protein include NP_00110404.1.
- Examples of the NCBI accession number of the human IGF-2 protein include NP_001007140.2 and NP_0012787790.1.
- Examples of the NCBI accession number of the mouse IGF-2 protein include NP_034644.2 and NP_001302418.1.
- the medium further contains a Transforming Growth Factor- ⁇ (TGF- ⁇ ) signal transduction pathway inhibitor.
- TGF- ⁇ Transforming Growth Factor- ⁇
- the TGF- ⁇ signal transduction pathway inhibitor is a substance that inhibits the signal transduction pathway transmitted by the Smad family.
- Examples of the TGF- ⁇ signal transduction pathway inhibitor include A83-01 (CAS number: 909910-43-6), SB-431542 (CAS number: 301836-41-9), and SB-505124 (CAS number: 694433-59-). 5), SB-525334 (CAS number: 356559-20-1), LY364947 (CAS number: 396129-53-6), SC-203294 (CAS number: 627536-09-08), SD-208 (CAS number:: 627536-09-8), SJN2511 (CAS number: 446859-33-2) and the like.
- A83-01 and SB-431542 are preferable.
- the concentration of the TGF- ⁇ signal transduction pathway inhibitor contained in the medium is usually 10 nM to 100 ⁇ M, preferably 100 nM to 10 ⁇ M.
- the medium preferably further contains a Rho-kinase (ROCK) signal transduction pathway inhibitor.
- ROCK Rho-kinase
- ROCK signal transduction pathway inhibitor examples include Y-27632 (CAS number: 129830-38-2), Derivative / HA1077 (CAS number: 105628-07-7), and H-1152 (CAS number: 871543-07-). 6), Wf-536 (CAS number: 539857-64-2), derivatives thereof and the like can be mentioned.
- the concentration of the ROCK signal transduction pathway inhibitor contained in the medium is usually 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M to 50 ⁇ M, and more preferably 0.1 ⁇ M to 30 ⁇ M.
- the medium further contains a bone morphogenetic protein (BMP) signal transduction pathway inhibitor.
- BMP bone morphogenetic protein
- BMP signaling pathway inhibitors examples include Noggin, Chordin, Follistatin, Dorsomorphin (CAS number: 866405-64-3), DMH1 (CAS number: 120671-16-1), LDN193189 (CAS number). : 1062368-24-4) and the like.
- the concentration of the BMP signal transduction pathway inhibitor contained in the medium is usually 0.5 ⁇ M to 10 ⁇ M.
- the concentration of Noggin contained in the medium is usually 10 ng / mL to 1000 ng / mL, preferably 10 ng / mL to 500 ng / mL, more preferably 10 ng / mL to 300 ng. / ML.
- the medium may further contain a medium supplement, an antibacterial agent, serum, a serum substitute, insulin, albumin and the like as other additives.
- a supplement for nerve cell culture such as the product name "B-27 serum-free supplement” (Thermofisher Scientific Co., Ltd.), a product name containing L-glutamine, L-alanyl L-glutamine, etc.
- glutamine-containing supplements such as "GlutaMax” (Thermo Fisher Scientific)
- amino acid aqueous solutions such as "MEM Non-Essential Amino Acids Solution” (Thermo Fisher Scientific)
- 2-mercaptoethanol 2-mercaptoethanol
- antibacterial agents examples include penicillin antibiotics, cephem antibiotics, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics, phosphomycin antibiotics, aminoglycoside antibiotics, and new quinolone antibiotics.
- ECM extracellular matrix
- the cells may be embedded in extracellular matrix (ECM) or ECM may be added to the medium.
- ECM include components contained in the basement membrane and glycoproteins present in the intercellular spaces.
- the components contained in the basement membrane include type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, and entactin.
- glycoproteins present in the intercellular spaces include collagen, laminin, entactin, fibronectin, heparin sulfate and the like.
- ECM a commercially available product containing the ECM may be used. Examples of commercially available products containing ECM include Matrigel (registered trademark, Corning Inc.) and human laminin (Sigma).
- Matrigel contains a basement membrane component derived from Englbreth Holm Swarm mouse sarcoma.
- the main components of Matrigel are type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan and entactin, but in addition to these, epithelial growth factor (EGF), nerve growth factor (NGF), platelet-derived growth factor (PDGF), insulin-like Various growth factors such as growth factor 1 (IGF-1) and TGF- ⁇ are included.
- Matrigel is also available in grades with low concentrations of various growth factors, with EGF less than 0.5 ng / mL, NGF less than 0.2 ng / mL, PDGF less than 5 pg / mL, and IGF-1 less than 5 ng / mL. , TGF- ⁇ is less than 1.7 ng / mL. As the matrigel, it is preferable to use a grade having a low content ratio of various growth factors.
- Dispersion means that cells are separated into a cell population of 10,000 or less by a dispersion treatment such as an enzyme treatment or a physical treatment. Dispersion can be performed by treating the organoid with a cell dispersion liquid or the like.
- the cell dispersion examples include enzymes such as trypsin, collagenase, hyaluronidase, elastase, pronase, DNase, and papain, or a solution containing a chelating agent such as ethylenediaminetetraacetic acid.
- enzymes such as trypsin, collagenase, hyaluronidase, elastase, pronase, DNase, and papain
- a solution containing a chelating agent such as ethylenediaminetetraacetic acid.
- a commercially available cell dispersion can also be used as the cell dispersion.
- Examples of commercially available cell dispersions include TrypLE Select and TrypLE Express manufactured by Thermo Fisher Scientific.
- One embodiment is a medium comprising chimeric FGF and having a content of the chimeric FGF of 50 ng / mL or less.
- Organoids can be produced by culturing adult stem cells or cell tissue pieces containing adult stem cells in the medium of the present embodiment. Therefore, it can be said that the medium of the present embodiment is a medium for producing organoids.
- the medium of this embodiment is a basal medium to which chimeric FGF is added.
- the basal medium and chimeric FGF are the same as those described above.
- the medium of the present embodiment preferably further contains EGF, and the total content of the chimeric FGF and the EGF is 100 ng / mL or less.
- the EGF is the same as that described above.
- the medium of the present embodiment further comprises a Wnt signaling pathway enhancer, an IGF signaling pathway enhancer, a TGF- ⁇ signaling pathway inhibitor, a ROCK signaling pathway inhibitor, a BMP signaling pathway inhibitor, and other additives. Can be contained. Each of these components is the same as described above.
- Organoid produced by the production method described above. Since the organoid of the present embodiment can be produced while reducing the cost required for growth factors and the like, it is easy to produce it in large quantities at low cost. Therefore, for example, it can be suitably used for large-scale evaluation of a test substance, which will be described later.
- the organoid of the present embodiment is produced by using a chimeric FGF instead of the conventionally used FGF2. Therefore, there may be a difference in the gene expression profile and the like between the organoid of the present embodiment and the organoid produced by the conventional production method. However, since it takes a lot of trial and error and labor to identify such a difference, it is not realistic to specify the organoid of the present embodiment by a gene expression profile or the like, and it is specified by a production method. Is considered to be realistic.
- One embodiment is a method for evaluating a test substance, which comprises a step of contacting an organoid produced by the above-mentioned production method with a test substance and a step of evaluating the influence of the test substance on the organoid.
- the test substance can be evaluated using an organoid having a structure and function similar to that of cells in a living body.
- the method of the present embodiment can be applied to screening of therapeutic agents for various diseases and the like.
- test substance examples include a natural compound library, a synthetic compound library, an existing drug library, a metabolite library, and the like.
- the effect of the test substance on organoids can be evaluated, for example, at the gene level, protein level, and metabolite level. It is also possible to evaluate the effect of the test substance on the organoid by evaluating the morphology of the organoid.
- Evaluation at the gene level can be performed by, for example, RNA-seq analysis, DNA microarray analysis, real-time PCR, or the like.
- evaluation at the protein level can be performed by, for example, Western blotting, ELISA, immunostaining, or the like.
- evaluation at the metabolite level can be evaluated by, for example, liquid chromatography (LC), mass spectrometry (MS), LC / MS and the like.
- the morphology of organoids can be evaluated by, for example, microscopic observation, immunostaining, or the like.
- [Chimeraized FGF] One embodiment is a protein consisting of the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 4, or 1 in the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 4.
- the content of growth factors added to the medium in the production of organoids can be reduced by using the chimeric FGF of the present embodiment.
- the amino acid corresponding to the 43rd amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is preferably glutamine, valine, isoleucine or leucine.
- the amino acid corresponding to the 43rd amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is preferably valine, isoleucine or leucine, and more preferably isoleucine. preferable.
- a B-27 serum-free supplement (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) was used.
- FGF2 the product name "FGF-Basic, Human, Recombinant, Animal Free” (Peprotech) was used.
- FGFC Fluji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- Wnt signal enhancer Wnt signal transduction pathway enhancer
- mouse R-spondin 1 conditioned medium self-prepared
- product name "Afamin / Wnt3a CM” MBL Life Sciences
- insulin-like growth factor As the insulin-like growth factor (IGF signal transduction pathway enhancer), the product name "Recombinant Human IGF-I / IGF-1 Protein, CF” (R & D Systems, Inc.) was used.
- TGF- ⁇ signal transduction pathway inhibitor As a TGF- ⁇ inhibitor (TGF- ⁇ signal transduction pathway inhibitor), A83-01 (TOCRIS Bioscience) was used.
- ROCK inhibitor As the ROCK inhibitor (ROCK signal transduction pathway inhibitor), the product name "Y-27632, MF” (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
- BMP inhibitor BMP signal transduction pathway inhibitor
- mouse Noggin conditioned medium self-prepared
- a large intestine tissue piece was used as a cell tissue piece containing adult stem cells. More specifically, cells into which a reporter construct was introduced into the 18th exon of the LGR5 locus of cells derived from colon tissue fragments by genome editing were used in the experiment.
- the LGR5 gene is a stem cell marker.
- IRES-tdTomato was used as a reporter construct. When this cell expresses LGR5, it expresses the fluorescent protein tdTomato.
- the above cells were embedded in 20 ⁇ L of Matrigel (registered trademark, Corning Inc.) per 1000 cells and seeded in a 48-well plate. Subsequently, Matrigel was allowed to stand at 37 ° C. to harden. Subsequently, the medium of each composition described above was added around the matrigel. Then, the medium was changed every 2 to 3 days.
- Matrigel registered trademark, Corning Inc.
- tdTomato was detected by fluorescence microscope observation, and the expression of the LGR5 protein, which is a stem cell marker, was evaluated.
- FIGS. 1 (a) to 1 (d) are micrographs of organoids formed in the absence of EGF on the 9th day of culture.
- FIG. 1A is a bright-field image of organoids formed in the presence of FGF2 at each concentration shown in the figure.
- FIG. 1 (b) is a fluorescence micrograph in which the expression of LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 1 (a).
- FIG. 1 (c) is a bright-field image of organoids formed in the presence of each concentration of FGFC shown in the figure.
- FIG. 1 (d) is a fluorescence micrograph in which the expression of LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 1 (c).
- FIGS. 2 (a) to 2 (d) are micrographs of organoids formed in the presence of EGF on the 8th day of culture.
- FIG. 2A is a bright-field image of organoids formed in the presence of FGF2 at each concentration shown in the figure.
- FIG. 2B is a fluorescence micrograph in which the expression of LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 2A.
- FIG. 2C is a bright-field image of organoids formed in the presence of each concentration of FGFC shown in the figure.
- FIG. 2 (d) is a fluorescence micrograph in which the expression of LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 2 (c).
- organoids As a result, it was clarified that the formation of organoids was insufficient even if the adult stem cells were cultured in a medium containing 10 ng / mL FGF2 in the absence of EGF. On the other hand, it was revealed that organoids can be formed in a medium containing FGFC even in the absence of EGF. Further, as shown in FIGS. 1 (c) and 1 (d), it was clarified that organoids can be formed even if the concentration of FGFC in the medium is reduced to about 2.5 ng / mL.
- organoids can be formed by culturing adult stem cells in a medium containing 12.5 ng / mL FGF2 in the presence of EGF. Further, it was clarified that in the presence of EGF, organoids can be formed even if the concentration of FGFC in the medium is reduced to about 3.1 ng / mL.
- FGFC-I glutamine residue is replaced with isoleucine
- FGFC-I the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 3
- FGFC-I the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4
- FGFC-L the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4
- the gene fragments encoding FGFC, FGFC-V, FGFC-I, and FGFC-L were inserted into the expression vector pET-3a, expressed with BL21 (DE3) pLysS, and purified as a protein. Used for.
- ⁇ Manufacturing of organoids As a cell tissue piece containing adult stem cells, cells similar to those in Experimental Example 1 were used. First, cells were embedded in 20 ⁇ L of Matrigel (registered trademark, Corning) per 1000 cells and seeded on a 48-well plate. Subsequently, Matrigel was allowed to stand at 37 ° C. to harden. Subsequently, the medium of each composition described above was added around the matrigel. Then, the medium was changed every 2 to 3 days.
- Matrigel registered trademark, Corning
- tdTomato was detected by fluorescence microscope observation, and the expression of the LGR5 protein, which is a stem cell marker, was evaluated.
- FIG. 3 (a) to 3 (d) are micrographs of each organoid formed on the 9th day of culture in the absence of EGF.
- FIG. 3A is a bright-field image of organoids formed in the presence of each concentration of FGFC shown in the figure.
- FIG. 3B is a bright-field image of the organoid formed in the presence of each concentration of FGFC-V shown in the figure.
- FIG. 3 (c) is a bright-field image of the organoid formed in the presence of each concentration of FGFC-I shown in the figure.
- FIG. 3D is a bright-field image of the organoid formed in the presence of each concentration of FGFC-L shown in the figure.
- FIG. 4 (a) is a fluorescence micrograph in which the expression of the LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 3 (a).
- FIG. 4 (b) is a fluorescence micrograph in which the expression of the LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 3 (b).
- FIG. 4 (c) is a fluorescence micrograph in which the expression of LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 3 (c).
- FIG. 4 (d) is a fluorescence micrograph in which the expression of the LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 3 (d).
- FIG. 5 (a) to 5 (d) are micrographs of each organoid formed on the 8th day of culture in the presence of EGF.
- FIG. 5A is a bright-field image of organoids formed in the presence of each concentration of FGFC shown in the figure.
- FIG. 5B is a bright-field image of the organoid formed in the presence of each concentration of FGFC-V shown in the figure.
- FIG. 5 (c) is a bright-field image of the organoid formed in the presence of each concentration of FGFC-I shown in the figure.
- FIG. 5D is a bright field image of the organoid formed in the presence of each concentration of FGFC-L shown in the figure.
- FIG. 6 (a) is a fluorescence micrograph in which the expression of the LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 5 (a).
- FIG. 6 (b) is a fluorescence micrograph in which the expression of the LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 5 (b).
- FIG. 6 (c) is a fluorescence micrograph in which the expression of the LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 5 (c).
- FIG. 6 (d) is a fluorescence micrograph in which the expression of the LGR5 protein was detected in the same field of view as in FIG. 5 (d).
- any FGFC mutant can be used to produce organoids to the same extent as when FGFC is used. Further, as shown in FIGS. 3 (a) to (d), 4 (a) to (d), 5 (a) to (d), and 6 (a) to 6 (d), FGFC in the medium. Alternatively, it was revealed that organoids can be produced even if the concentration of the FGFC mutant is reduced to 2.5 ng / mL or 3.1 ng / mL.
- FIG. 7 is a graph showing the measured melting temperature (Tm) of each protein.
- Tm melting temperature
- the horizontal axis of the graph shows the temperature (° C).
- the Tm value of each protein is shown in Table 3 below.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片を、Fibroblast growth factor(FGF)1の一部領域及びFGF2の一部領域を含むキメラ化FGFを含有する培地中で培養する工程を含む、オルガノイドの製造方法;上記製造方法により製造されたオルガノイド;キメラ化FGFを含み、キメラ化FGFの含有量が、50ng/mL以下である、培地;被験物質の評価方法;キメラ化FGFによれば、培地中に含まれる成長因子の含有量を減らすことができる。
Description
本発明は、オルガノイドの製造方法に関する。より詳細には、本発明は、オルガノイドの製造方法、培地、オルガノイド、被験物質の評価方法及びキメラ化FGFに関する。本願は、2019年12月16日に、日本に出願された特願2019-226710号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
オルガノイドとは、細胞が集積して形成された培養細胞であり、生体内の臓器と類似した構造及び機能を有している。近年、体性幹細胞や、胚性幹細胞(ES細胞)や人工多能性幹細胞(iPS細胞)等の幹細胞から様々なオルガノイドを作製する研究が盛んに行われており、例えば、脳オルガノイド、腸オルガノイド、肝臓オルガノイド、腎臓オルガノイド、胃オルガノイド、肺オルガノイド、卵巣癌オルガノイド、胆道癌オルガノイド等が作製されている。
幹細胞からのオルガノイドの製造は、シグナル伝達経路をコントロールして、幹細胞の増殖、分化等を誘導することにより行われている。MAPKシグナル伝達経路は、幹細胞の増殖、成長、分化及び形質転換、並びにアポトーシス等を制御するシグナル伝達経路であることが知られている。また、MAPKシグナル伝達経路は、塩基性繊維芽細胞増殖因子(Fibroblast growth factor2、FGF2)や、上皮成長因子(Epidermal Growth Factor、EGF)等の成長因子により下方制御されることが知られている。これらの成長因子は、幹細胞からオルガノイドを製造する培地に、通常添加される成分である(特許文献1、非特許文献1参照)。
Huch M., et al., Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver, Cell, 160 (1-2), 299-312, 2015.
ところで、幹細胞からのオルガノイドの製造では、培地成分の失活のため、細胞の培養中に定期的に培地を交換する必要がある。特に、オルガノイドを再生医療や薬剤スクリーニング等に用いる場合、十分な大きさのオルガノイドが必要であり、それに伴い培地の交換回数も多くなる。一方で、FGF2やEGF等の成長因子は、コストが非常に高く、また、エンドトキシン等を含有するリスクがある。このため、培地に添加する成長因子の量を減らすことが望まれている。そこで、本発明は、培地中に含まれる成長因子の含有量を減らすことができる、オルガノイドの製造技術を提供することを目的とする。
本発明は以下の実施形態を含む。
[1]成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片を、Fibroblast growth factor(FGF)1の一部領域及びFGF2の一部領域を含むキメラ化FGFを含有する培地中で培養する工程を含む、オルガノイドの製造方法。
[2]前記培地中に含まれる前記キメラ化FGFの含有量が、50ng/mL以下である、[1]に記載の製造方法。
[3]前記培地が、Epidermal Growth Factor(EGF)を更に含有する、[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4]前記培地中に含まれる前記キメラ化FGF及び前記EGFの合計の含有量が、100ng/mL以下である、[3]に記載の製造方法。
[5]前記キメラ化FGFが、配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるか、又は、配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ培地中に50ng/mL以下含有させることにより生体幹細胞又は生体幹細胞を含む細胞組織片からオルガノイドを製造することができる活性を有するタンパク質である、[1]~[4]のいずれかに記載の製造方法。
[6]前記培地が、Insulin-like growth factor(IGF)シグナル伝達経路増強剤を更に含有する、[1]~[5]のいずれかに記載の製造方法。
[7]前記培地が、Transforming Growth Factor-β(TGF-β)シグナル伝達経路阻害剤を更に含有する、[1]~[6]のいずれかに記載の製造方法。
[8]前記培地が、Wntシグナル伝達経路増強剤を更に含有する、[1]~[7]のいずれかに記載の製造方法。
[9]前記培地が、Rhoキナーゼ(ROCK)シグナル伝達経路阻害剤を更に含有する、[1]~[8]のいずれかに記載の製造方法。
[10]前記培地が、Bone morphogenetic protein(BMP)シグナル伝達経路阻害剤を更に含有する、[1]~[9]のいずれかに記載の製造方法。
[11]キメラ化FGFを含み、前記キメラ化FGFの含有量が、50ng/mL以下である、培地。
[12]EGFを更に含み、前記キメラ化FGF及び前記EGFの合計の含有量が、100ng/mL以下である、請求項11に記載の培地。
[13][1]~[10]のいずれかに記載の方法により製造されたオルガノイド。
[14][13]に記載のオルガノイドを被験物質に接触させる工程、及び、前記被験物質が前記オルガノイドに及ぼす影響を評価する工程、を含む、被験物質の評価方法。
[15]配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるか、又は、配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ培地中に50ng/mL以下含有させることにより生体幹細胞又は生体幹細胞を含む細胞組織片からオルガノイドを製造することができる活性を有するタンパク質である、キメラ化FGF。
[1]成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片を、Fibroblast growth factor(FGF)1の一部領域及びFGF2の一部領域を含むキメラ化FGFを含有する培地中で培養する工程を含む、オルガノイドの製造方法。
[2]前記培地中に含まれる前記キメラ化FGFの含有量が、50ng/mL以下である、[1]に記載の製造方法。
[3]前記培地が、Epidermal Growth Factor(EGF)を更に含有する、[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4]前記培地中に含まれる前記キメラ化FGF及び前記EGFの合計の含有量が、100ng/mL以下である、[3]に記載の製造方法。
[5]前記キメラ化FGFが、配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるか、又は、配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ培地中に50ng/mL以下含有させることにより生体幹細胞又は生体幹細胞を含む細胞組織片からオルガノイドを製造することができる活性を有するタンパク質である、[1]~[4]のいずれかに記載の製造方法。
[6]前記培地が、Insulin-like growth factor(IGF)シグナル伝達経路増強剤を更に含有する、[1]~[5]のいずれかに記載の製造方法。
[7]前記培地が、Transforming Growth Factor-β(TGF-β)シグナル伝達経路阻害剤を更に含有する、[1]~[6]のいずれかに記載の製造方法。
[8]前記培地が、Wntシグナル伝達経路増強剤を更に含有する、[1]~[7]のいずれかに記載の製造方法。
[9]前記培地が、Rhoキナーゼ(ROCK)シグナル伝達経路阻害剤を更に含有する、[1]~[8]のいずれかに記載の製造方法。
[10]前記培地が、Bone morphogenetic protein(BMP)シグナル伝達経路阻害剤を更に含有する、[1]~[9]のいずれかに記載の製造方法。
[11]キメラ化FGFを含み、前記キメラ化FGFの含有量が、50ng/mL以下である、培地。
[12]EGFを更に含み、前記キメラ化FGF及び前記EGFの合計の含有量が、100ng/mL以下である、請求項11に記載の培地。
[13][1]~[10]のいずれかに記載の方法により製造されたオルガノイド。
[14][13]に記載のオルガノイドを被験物質に接触させる工程、及び、前記被験物質が前記オルガノイドに及ぼす影響を評価する工程、を含む、被験物質の評価方法。
[15]配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるか、又は、配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ培地中に50ng/mL以下含有させることにより生体幹細胞又は生体幹細胞を含む細胞組織片からオルガノイドを製造することができる活性を有するタンパク質である、キメラ化FGF。
本実施形態によれば、培地中に含まれる成長因子の含有量を減らすことができる、オルガノイドの製造技術を提供することができる。
以下、実施形態を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。
本明細書で例示する各成分、例えば、培地中に含まれる成分や各工程で用いられる成分は、特に言及しない限り、それぞれ1種を単独で又は2種以上を併用して用いることができる。
本明細書で、「A~B」等の数値範囲を表す表記は、「A以上、B以下」と同義であり、A及びBをその数値範囲に含むものとする。
本明細書において、「物質Xを含む培地」、「物質Xの存在下」とは、外来性(exogenous)の物質Xが添加された培地、外来性の物質Xを含む培地、又は外来性の物質Xの存在下を意味する。すなわち、当該培地中に存在する細胞又は組織が当該物質Xを内在的(endogenous)に発現、分泌又は産生する場合、内在的な物質Xは外来性の物質Xとは区別され、外来性の物質Xを含んでいない培地は内在的な物質Xを含んでいても「物質Xを含む培地」の範疇には該当しないものとする。
[オルガノイドの製造方法]
1実施形態は、成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片を、Fibroblast growth factor(FGF)1の一部領域及びFGF2の一部領域を含むキメラ化FGF(以下、「FGFC」ともいう)を含有する培地中で培養する工程を含む、オルガノイドの製造方法である。
1実施形態は、成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片を、Fibroblast growth factor(FGF)1の一部領域及びFGF2の一部領域を含むキメラ化FGF(以下、「FGFC」ともいう)を含有する培地中で培養する工程を含む、オルガノイドの製造方法である。
本実施形態の製造方法により、オルガノイドの製造において、培地に添加する成長因子の含有量を減らすことができる。本実施形態の製造方法は、特に、腸オルガノイド、肝オルガノイド、卵巣癌オルガノイド、肺オルガノイド、胃オルガノイド等のオルガノイドの製造に適している。
オルガノイドの製造において、キメラ化FGFを培地中に含有することで培地中に含まれる成長因子の含有量を減らすことができた理由としては、以下のことが推定される。すなわち、FGFには反応する繊維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)が決まっており、アイソフォームを含めると7種類あることが知られている。FGFをキメラ化することで、多くの種類のFGFRと反応することが可能となり、その結果、低濃度であっても培養できたものと推定される。特に、成体幹細胞の培養において重要な上皮系幹細胞は、FGFR2bがよく発現しているといわれているが、FGF2はFGFR2bとの反応性はよくない。一方で、FGF1はFGFR2bを含めて7種類すべてのFGFRと反応することが可能であることが知られており、FGF2とFGF1の性質を両方併せ持つFGFCは、FGFR2bと反応することができ、その結果、低濃度であっても培養できたものと推定される。
成体幹細胞とは、体性幹細胞、組織幹細胞、癌幹細胞とも呼ばれる幹細胞であり、生体の体内に存在する最終分化していない細胞である。通常、成体幹細胞は特定の複数種の細胞に分化する能力を有する。本実施形態の製造方法において、成体幹細胞は、培養維持された細胞であってもよいし、成体から摘出した組織に存在する初代細胞であってもよい。また、成体幹細胞としては上皮幹細胞が好ましい。
本明細書において、細胞が凝集したもの細胞塊という。また、細胞塊の中でも、特に、成体幹細胞及び成体幹細胞から分化した細胞を含み、生体内の臓器と類似した構造及び機能を有しているものをオルガノイドという。
本実施形態の製造方法において、培地としては、基礎培地にキメラ化FGFを添加した培地を用いることができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM(GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地が挙げられる。基礎培地として、これらの培地を混合した培地を用いてもよい。
本実施形態の製造方法におけるキメラ化FGFは、FGF1の一部領域及びFGF2の一部領域を含む融合タンパク質である。ヒトFGF1タンパク質のNCBIアクセッション番号としては、NP_001244138.1、NP_001244137.1、NP_001341881.1等が挙げられる。マウスFGF1タンパク質のNCBIアクセッション番号としては、NP_034327.1等が挙げられる。ヒトFGF2タンパク質のNCBIアクセッション番号としては、NP_001348594.1、NP_001997.5等が挙げられる。マウスFGF2タンパク質のNCBIアクセッション番号としては、NP_032032.1等が挙げられる。
キメラ化FGFとしては、配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましい。キメラ化FGFは、培地中に50ng/mL以下含有させることにより生体幹細胞又は生体幹細胞を含む細胞組織片からオルガノイドを製造することができる活性を有する限り、配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に対して変異を有していてもよい。
すなわち、キメラ化FGFは、配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。ここで、1若しくは数個とは、1~10個、好ましくは1~5個、より好ましくは1~3個、更に好ましくは1~2個である。
キメラ化FGFのアミノ酸配列において、配列番号1のアミノ酸配列における第43番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は、グルタミン、バリン、イソロイシン又はロイシンであることが好ましい。
配列番号1のアミノ酸配列における第43番目のアミノ酸に対応するアミノ酸が、グルタミン、バリン、イソロイシン又はロイシンであるキメラ化FGFは、FGF1やFGF2と比較して高い耐熱性を有しており、安定である。
なかでも、配列番号1のアミノ酸配列における第43番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がイソロイシンであるキメラ化FGFは、特に高い融解温度(Tm)を有し、高い耐熱性を有する。
配列番号1のアミノ酸配列における第43番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は、例えば、ClustalW等のアラインメントプログラムを用いて対象アミノ酸配列と、配列番号1のアミノ酸配列をアラインメントすること等により特定することができる。
従来、オルガノイドの製造では、培地中に100ng/mL程度のFGF2を添加することが通常であった。これに対し、FGF2の代わりにキメラ化FGFを用いることにより、培地中に含まれる前記キメラ化FGFの含有量を減らすことができる。培地中に含まれる前記キメラ化FGFの含有量は、通常、50ng/mL以下、好ましくは20ng/mL以下、より好ましくは15ng/mL以下、更に好ましくは10ng/mL以下、特に好ましくは5ng/mL以下である。
本実施形態の製造方法において、培地は、Epidermal Growth Factor(EGF)を更に含有していてもよい。培地がEGFを含む場合、培地中に含まれるキメラ化FGF及びEGFの合計の含有量を減らすことができる。培地がEGFを含む場合、培地中に含まれるキメラ化FGF及びEGFの合計の含有量としては、通常、100ng/mL以下、好ましくは70ng/mL以下である。
ヒトEGFタンパク質のNCBIアクセッション番号は、NP_001171601.1等である。
本実施形態の製造方法において、培地は、Wntシグナル伝達経路増強剤を更に含有していることが好ましい。
Wntシグナル伝達経路増強剤としては、Wntファミリーメンバー、R-スポンジン、ノリン、GSK-3β阻害剤等が挙げられる。これらの中でも、Wntファミリーメンバー、R-スポンジンが好ましい。
Wntファミリーメンバーとしては、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11及びWnt16等が挙げられる。
Wntファミリーメンバーとしては、Wnt3a又はWnt4が好ましく、Wnt3aがより好ましい。Wnt3aは、安定性を向上させるために、Afamin(アファミン)との複合体であることが好ましい。
Wntシグナル伝達経路増強剤としてWnt3aを用いる場合、培地中に含まれるWnt3aの濃度は、通常、10ng/mL~10μg/mL、好ましくは10ng/mL~1μg/mL、例えば100ng/mL~700ng/mLである。
R-スポンジンとしては、R-スポンジン1、R-スポンジン2、R-スポンジン3、R-スポンジン4等が挙げられる。
ヒトR-スポンジン1タンパク質のNCBIアクセッション番号としては、NP_001229838.1、XP_006710646.1等が挙げられる。マウスR-スポンジン1タンパク質のNCBIアクセッション番号としては、NP_619624.2等が挙げられる。ヒトR-スポンジン2タンパク質のNCBIアクセッション番号としては、XP_011515320.1、XP_011515321.1、NP_848660.3等が挙げられる。マウスR-スポンジン2タンパク質のNCBIアクセッション番号としては、NP_766403.1等が挙げられる。ヒトR-スポンジン3タンパク質のNCBIアクセッション番号としては、XP_016866867.1、XP_016866868.1、NP_116173.2等が挙げられる。マウスR-スポンジン3タンパク質のNCBIアクセッション番号としては、NP_082627.3等が挙げられる。ヒトR-スポンジン4タンパク質のNCBIアクセッション番号としては、NP_001035096.1、NP_001025042.2等が挙げられる。マウスR-スポンジン4タンパク質のNCBIアクセッション番号としては、NP_001035779.1等が挙げられる。
Wntシグナル伝達経路増強剤としてR-スポンジンを用いる場合、培地中に含まれるR-スポンジンの濃度は、通常、10ng/mL~10μg/mL、好ましくは10ng/mL~1μg/mL、より好ましくは100ng/mL~500ng/mLである。
GSK-3β阻害剤としては、CHIR99021(CAS番号:252917-06-9)、Kenpaullone(CAS番号:142273-20-9)、及び6-Bromoindirubin-3’-oxime(BIO、CAS番号:667463-62-9)等が挙げられる。
Wntシグナル伝達経路増強剤としてGSK-3β阻害剤を用いる場合、培地中に含まれるGSK-3β阻害剤の濃度は、通常、0.1μM~10μMである。
本実施形態の製造方法において、培地は、Insulin-like growth factor(IGF)シグナル伝達経路増強剤を更に含有していることが好ましい。
IGFシグナル伝達経路増強剤としては、IGF-1、IGF-2等が挙げられ、IGF-1が好ましい。ヒトIGF-1タンパク質のNCBIアクセッション番号としては、NP_001104753.1、NP_001104755.1等が挙げられる。マウスIGF-1タンパク質のNCBIアクセッション番号としては、NP_001104745.1等が挙げられる。ヒトIGF-2タンパク質のNCBIアクセッション番号としては、NP_001007140.2、NP_001278790.1等が挙げられる。マウスIGF-2タンパク質のNCBIアクセッション番号としては、NP_034644.2、NP_001302418.1等が挙げられる。
本実施形態の製造方法において、培地は、Transforming Growth Factor-β(TGF-β)シグナル伝達経路阻害剤を更に含有していることが好ましい。
TGF-βシグナル伝達経路阻害剤は、Smadファミリーにより伝達されるシグナル伝達経路を阻害する物質である。TGF-βシグナル伝達経路阻害剤としては、A83-01(CAS番号:909910-43-6)、SB-431542(CAS番号:301836-41-9)、SB-505124(CAS番号:694433-59-5)、SB-525334(CAS番号:356559-20-1)、LY364947(CAS番号:396129-53-6)、SC-203294(CAS番号:627536-09-08)、SD-208(CAS番号:627536-09-8)、SJN2511(CAS番号:446859-33-2)等が挙げられる。これらの中でも、A83-01、SB-431542が好ましい。
培地中に含まれるTGF-βシグナル伝達経路阻害剤の濃度は、通常10nM~100μM、好ましくは100nM~10μMである。
本実施形態の製造方法において、培地は、Rhoキナーゼ(ROCK)シグナル伝達経路阻害剤を更に含有していることが好ましい。
ROCKシグナル伝達経路阻害剤としては、例えば、Y-27632(CAS番号:129830-38-2)、Fasudil/HA1077(CAS番号:105628-07-7)、H-1152(CAS番号:871543-07-6)、Wf-536(CAS番号:539857-64-2)、これらの誘導体等が挙げられる。
培地中に含まれるROCKシグナル伝達経路阻害剤の濃度は、通常0.1μM~100μM、好ましくは0.1μM~50μM、より好ましくは0.1μM~30μMである。
本実施形態の製造方法において、培地は、Bone morphogenetic protein(BMP)シグナル伝達経路阻害剤を更に含有していることが好ましい。
BMPシグナル伝達経路阻害剤としては、例えば、Noggin(ノギン)、コーディン、フォリスタチン、ドルソモルフィン(CAS番号:866405-64-3)、DMH1(CAS番号:1206711-16-1)、LDN193189(CAS番号:1062368-24-4)等が挙げられる。
培地中に含まれるBMPシグナル伝達経路阻害剤の濃度は、通常、0.5μM~10μMである。BMPシグナル伝達経路阻害剤としてNogginを用いる場合、培地中に含まれるNogginの濃度は、通常、10ng/mL~1000ng/mL、好ましくは10ng/mL~500ng/mL、より好ましくは10ng/mL~300ng/mLである。
本実施形態の製造方法において、培地は、その他の添加剤として、培地サプリメント、抗菌剤、血清、血清代替物、インスリン、アルブミン等を更に含有していてもよい。
培地サプリメントとしては、例えば、製品名「B-27無血清サプリメント」(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)等の神経細胞培養用サプリメント、L-グルタミン、L-アラニルL-グルタミン等を含有する、製品名「GlutaMax」(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)等のグルタミン含有サプリメント、「MEM Non-Essential Amino Acids Solution」(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)等のアミノ酸水溶液、2-メルカプトエタノールが挙げられる。
抗菌剤としては、例えば、ペニシリン系抗生物質、セフェム系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、ホスホマイシン系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、及びニューキノロン系抗生物質が挙げられる。
成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片の培養において、細胞を細胞外マトリックス(ECM)に包埋するか、培地にECMを添加してもよい。ECMとしては、例えば、基底膜に含まれる成分、細胞間隙に存在する糖タンパク質が挙げられる。基底膜に含まれる成分としては、例えば、IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン等が挙げられる。細胞間隙に存在する糖タンパク質としては、コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、フィブロネクチン、ヘパリン硫酸塩等が挙げられる。ECMとして、ECMを含む市販品を用いてもよい。ECMを含む市販品としては、例えば、マトリゲル(登録商標、コーニング社)、ヒト型ラミニン(シグマ社)等が挙げられる。
マトリゲルは、Englbreth Holm Swarmマウス肉腫由来の基底膜成分を含有する。マトリゲルの主成分は、IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチンであるが、これらに加えて、上皮成長因子(EGF)、神経成長因子(NGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、インスリン様成長因子1(IGF-1)、TGF-β等の各種増殖因子が含まれる。マトリゲルには各種増殖因子の濃度が低いグレードもあり、その濃度はEGFが0.5ng/mL未満、NGFが0.2ng/mL未満、PDGFが5pg/mL未満、IGF-1が5ng/mL未満、TGF-βが1.7ng/mL未満である。マトリゲルとしては、各種増殖因子の含有割合が低いグレードを用いることが好ましい。
成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片の培養において、培地は1~5日に1回程度交換することが好ましい。また、形成されたオルガノイドが大きい場合には、オルガノイドを分散することが好ましい。分散とは、細胞を酵素処理や物理処理等の分散処理により、10,000個以下の細胞集団に分離させることをいう。分散は、オルガノイドを細胞分散液処理すること等により行うことができる。
細胞分散液としては、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase、パパイン等の酵素類、又は、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤を含む溶液を挙げることができる。細胞分散液として、市販の細胞分散液を用いることもできる。市販の細胞分散液としては、例えば、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のTrypLE Select、TrypLE Express等が挙げられる。
[培地]
1実施形態は、キメラ化FGFを含み、前記キメラ化FGFの含有量が、50ng/mL以下である、培地である。本実施形態の培地で成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片を培養することにより、オルガノイドを製造することができる。したがって、本実施形態の培地は、オルガノイド製造用培地であるということができる。
1実施形態は、キメラ化FGFを含み、前記キメラ化FGFの含有量が、50ng/mL以下である、培地である。本実施形態の培地で成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片を培養することにより、オルガノイドを製造することができる。したがって、本実施形態の培地は、オルガノイド製造用培地であるということができる。
本実施形態の培地は、基礎培地にキメラ化FGFを添加したものである。基礎培地、キメラ化FGFについては上述したものと同様である。
本実施形態の培地は、好ましくは、EGFを更に含み、前記キメラ化FGF及び前記EGFの合計の含有量が、100ng/mL以下である。EGFについては上述したものと同様である。
本実施形態の培地は、Wntシグナル伝達経路増強剤、IGFシグナル伝達経路増強剤、TGF-βシグナル伝達経路阻害剤、ROCKシグナル伝達経路阻害剤、BMPシグナル伝達経路阻害剤、その他の添加剤を更に含有することができる。これらの各成分については上述したものと同様である。
[オルガノイド]
1実施形態は、上述した製造方法により製造されたオルガノイドである。本実施形態のオルガノイドは、成長因子等に要するコストを低減させて製造することができるため、低コストで大量に製造することが容易である。このため、例えば、後述する被験物質の評価等を大規模に実施する用途に好適に用いることができる。
1実施形態は、上述した製造方法により製造されたオルガノイドである。本実施形態のオルガノイドは、成長因子等に要するコストを低減させて製造することができるため、低コストで大量に製造することが容易である。このため、例えば、後述する被験物質の評価等を大規模に実施する用途に好適に用いることができる。
本実施形態のオルガノイドは、従来用いられてきたFGF2の代わりにキメラ化FGFを用いて製造されている。したがって、本実施形態のオルガノイドと従来の製造方法で製造されたオルガノイドとは遺伝子発現プロファイル等に相違が存在する可能性がある。しかしながら、そのような相違点を特定するためには多大な試行錯誤及び労力を必要とするため、本実施形態のオルガノイドを遺伝子発現プロファイル等で特定することは現実的ではなく、製造方法により特定することが現実的であると考えられる。
[被験物質の評価方法]
1実施形態は、上述した製造方法により製造されたオルガノイドを被験物質に接触させる工程、及び、前記被験物質が前記オルガノイドに及ぼす影響を評価する工程を含む、被験物質の評価方法である。
1実施形態は、上述した製造方法により製造されたオルガノイドを被験物質に接触させる工程、及び、前記被験物質が前記オルガノイドに及ぼす影響を評価する工程を含む、被験物質の評価方法である。
本実施形態の方法により、生体内の細胞と類似した構造及び機能を有するオルガノイドを用いて被験物質の評価を行うことができる。本実施形態の方法は、様々な疾患の治療薬のスクリーニング等に適用することができる。
被験物質としては、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。
被験物質がオルガノイドに及ぼす影響は、例えば、遺伝子レベル、タンパク質レベル、代謝物レベルで評価することができる。また、オルガノイドの形態の評価により、被験物質がオルガノイドに及ぼす影響を評価することもできる。
遺伝子レベルでの評価は、例えば、RNA-seq解析、DNAマイクロアレイ解析、リアルタイムPCR等により行うことができる。また、タンパク質レベルでの評価は、例えば、ウエスタンブロッティング、ELISA、免疫染色等により行うことができる。また、代謝物レベルでの評価は、例えば、液体クロマトグラフィー(LC)、質量分析(MS)、LC/MS等により評価することができる。また、オルガノイドの形態の評価は、例えば顕微鏡観察、免疫染色等により行うことができる。
[キメラ化FGF]
1実施形態は、配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるか、又は、配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ培地中に50ng/mL以下含有させることにより生体幹細胞又は生体幹細胞を含む細胞組織片からオルガノイドを製造することができる活性を有するタンパク質である、キメラ化FGFである。
1実施形態は、配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるか、又は、配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ培地中に50ng/mL以下含有させることにより生体幹細胞又は生体幹細胞を含む細胞組織片からオルガノイドを製造することができる活性を有するタンパク質である、キメラ化FGFである。
実施例において後述するように、本実施形態のキメラ化FGFを用いることにより、オルガノイドの製造において培地中に添加する成長因子の含有量を減らすことができる。
また、上述したように、キメラ化FGFのアミノ酸配列において、配列番号1のアミノ酸配列における第43番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は、グルタミン、バリン、イソロイシン又はロイシンであることが好ましい。
なかでも、高い耐熱性を有し安定である観点から、配列番号1のアミノ酸配列における第43番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は、バリン、イソロイシン又はロイシンであることが好ましく、イソロイシンであることがより好ましい。
以下、本実施形態を実施例に基づいて更に具体的に説明するが、本実施形態はこれら実施例に限定されるものではない。
[実験例1]
(オルガノイドの製造)
EGFの存在下又は非存在下で、FGF2又はキメラ化FGFを様々な濃度で含む培地を用いて、成体幹細胞を培養し、オルガノイドの形成を検討した。
(オルガノイドの製造)
EGFの存在下又は非存在下で、FGF2又はキメラ化FGFを様々な濃度で含む培地を用いて、成体幹細胞を培養し、オルガノイドの形成を検討した。
《培地の調製》
基本培地として、製品名「Advanced DMEM/F12」(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を使用し、下記表1に記載の成分を添加した培地を調製した。表1中、「w/o EGF処方」はEGFを含まない培地処方を意味し、「w/ EGF処方」はEGFを含む培地処方を意味する。
基本培地として、製品名「Advanced DMEM/F12」(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を使用し、下記表1に記載の成分を添加した培地を調製した。表1中、「w/o EGF処方」はEGFを含まない培地処方を意味し、「w/ EGF処方」はEGFを含む培地処方を意味する。
培地サプリメントとしては、B-27無血清サプリメント(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いた。
FGF2としては、製品名「FGF-Basic、Human、Recombinant、Animal Free」(ペプロテック社)を用いた。また、キメラ化FGFとしては、製品名「FGFC」(富士フィルム和光純薬株式会社)を用いた。
EGFとしては、製品名「Animal-Free Recombinant Murine EGF」(ペプロテック社)を用いた。
Wntシグナル増強剤(Wntシグナル伝達経路増強剤)としては、マウス R-スポンジン1 コンディションドメディウム(自家調製)及び製品名「Afamin/Wnt3a CM」(MBLライフサイエンス社)を用いた。
インスリン様成長因子(IGFシグナル伝達経路増強剤)としては、製品名「Recombinant Human IGF-I/IGF-1 Protein,CF」(R&Dシステムズ社)を用いた。
TGF-β阻害剤(TGF-βシグナル伝達経路阻害剤)としては、A83-01(TOCRIS Bioscience社)を用いた。
ROCK阻害剤(ROCKシグナル伝達経路阻害剤)としては、製品名「Y-27632,MF」(富士フィルム和光純薬株式会社)を用いた。
BMP阻害剤(BMPシグナル伝達経路阻害剤)としては、マウス Noggin コンディションドメディウム(自家調製)を用いた。
《オルガノイドの形成》
成体幹細胞を含む細胞組織片として大腸組織片を使用した。より詳細には、ゲノム編集により、大腸組織片由来の細胞のLGR5遺伝子座の第18エクソンに、レポーターコンストラクトを導入した細胞を実験に使用した。LGR5遺伝子は幹細胞マーカーである。また、レポーターコンストラクトとしては、IRES-tdTomatoを使用した。この細胞は、LGR5を発現すると蛍光タンパク質であるtdTomatoを発現する。
成体幹細胞を含む細胞組織片として大腸組織片を使用した。より詳細には、ゲノム編集により、大腸組織片由来の細胞のLGR5遺伝子座の第18エクソンに、レポーターコンストラクトを導入した細胞を実験に使用した。LGR5遺伝子は幹細胞マーカーである。また、レポーターコンストラクトとしては、IRES-tdTomatoを使用した。この細胞は、LGR5を発現すると蛍光タンパク質であるtdTomatoを発現する。
上記の細胞を、細胞1000個あたり20μLのマトリゲル(登録商標、コーニング社)で包埋し、48ウェルプレートに播種した。続いて、マトリゲルを37℃で静置して固めた。続いて、上述した各組成の培地をマトリゲルの周囲に添加した。その後、2~3日おきに培地交換を行った。
続いて、蛍光顕微鏡観察によりtdTomatoの発現を検出し、幹細胞マーカーであるLGR5タンパク質の発現を評価した。
図1(a)~(d)は、培養9日目のEGFの非存在下で形成したオルガノイドの顕微鏡写真である。図1(a)は図に示す各濃度のFGF2の存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図1(b)は、図1(a)と同一視野においてLGR5タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。図1(c)は図に示す各濃度のFGFCの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図1(d)は、図1(c)と同一視野においてLGR5タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。
図2(a)~(d)は、培養8日目のEGFの存在下で形成したオルガノイドの顕微鏡写真である。図2(a)は図に示す各濃度のFGF2の存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図2(b)は、図2(a)と同一視野においてLGR5タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。図2(c)は図に示す各濃度のFGFCの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図2(d)は、図2(c)と同一視野においてLGR5タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。
その結果、EGFの非存在下では、10ng/mLのFGF2を含む培地で成体幹細胞を培養しても、オルガノイドの形成が不十分であることが明らかとなった。一方、EGFの非存在下であっても、FGFCを含む培地ではオルガノイドを形成することができることが明らかとなった。また、図1(c)及び(d)に示すように、培地中のFGFCの濃度が2.5ng/mL程度に減らしてもオルガノイドを形成することができることが明らかとなった。
また、EGFの存在下では、12.5ng/mLのFGF2を含む培地で成体幹細胞を培養することにより、オルガノイドを形成することができることが明らかとなった。また、EGFの存在下では、培地中のFGFCの濃度を3.1ng/mL程度に減らしてもオルガノイドを形成することができることが明らかとなった。
また、FGFCを含む培地を用いると、FGF2を含む培地を用いた場合に比べて、コロニー形成数が多いことが明らかとなった。
[実験例2]
(FGFC変異体の作製)
人工合成によりFGFC変異体をコードする遺伝子断片を作製した。FGFCのアミノ酸配列を配列番号1に示す。FGFC変異体としては、FGFCの第43番目のグルタミン残基をバリンに置換した変異体(以下、「FGFC-V」といい、アミノ酸配列を配列番号2に示す。)、FGFCの第43番目のグルタミン残基をイソロイシンに置換した変異体(以下、「FGFC-I」といい、アミノ酸配列を配列番号3に示す。)、FGFCの第43番目のグルタミン残基をロイシンに置換した変異体(以下、「FGFC-L」といい、アミノ酸配列を配列番号4に示す。)を作製した。
(FGFC変異体の作製)
人工合成によりFGFC変異体をコードする遺伝子断片を作製した。FGFCのアミノ酸配列を配列番号1に示す。FGFC変異体としては、FGFCの第43番目のグルタミン残基をバリンに置換した変異体(以下、「FGFC-V」といい、アミノ酸配列を配列番号2に示す。)、FGFCの第43番目のグルタミン残基をイソロイシンに置換した変異体(以下、「FGFC-I」といい、アミノ酸配列を配列番号3に示す。)、FGFCの第43番目のグルタミン残基をロイシンに置換した変異体(以下、「FGFC-L」といい、アミノ酸配列を配列番号4に示す。)を作製した。
続いて、FGFC、FGFC-V、FGFC-I、FGFC-Lをコードする遺伝子断片を、発現ベクターpET-3aにそれぞれ挿入し、BL21(DE3)pLysSで発現させてタンパク質として精製し、以下の実験に用いた。
[実験例3]
(FGFC変異体を用いたオルガノイドの製造)
FGFC又はFGFC変異体を様々な濃度で含む培地を用いて、成体幹細胞を培養し、オルガノイドの形成を検討した。
(FGFC変異体を用いたオルガノイドの製造)
FGFC又はFGFC変異体を様々な濃度で含む培地を用いて、成体幹細胞を培養し、オルガノイドの形成を検討した。
《培地の調製》
基本培地として、製品名「Advanced DMEM/F12」(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を使用し、下記表2に記載の成分を添加した培地を調製した。表2中、「w/o EGF処方」はEGFを含まない培地処方を意味し、「w/ EGF処方」はEGFを含む培地処方を意味する。FGFC及びFGFC変異体としては、実験例2で調製したものを使用した。また、EGF、Wntシグナル増強剤、インスリン様成長因子、TGF-β阻害剤、ROCK阻害剤、BMP阻害剤としては、実験例1と同様のものを使用した。
基本培地として、製品名「Advanced DMEM/F12」(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を使用し、下記表2に記載の成分を添加した培地を調製した。表2中、「w/o EGF処方」はEGFを含まない培地処方を意味し、「w/ EGF処方」はEGFを含む培地処方を意味する。FGFC及びFGFC変異体としては、実験例2で調製したものを使用した。また、EGF、Wntシグナル増強剤、インスリン様成長因子、TGF-β阻害剤、ROCK阻害剤、BMP阻害剤としては、実験例1と同様のものを使用した。
《オルガノイドの製造》
成体幹細胞を含む細胞組織片として、実験例1と同様の細胞を使用した。まず、細胞を細胞1000個あたり20μLのマトリゲル(登録商標、コーニング社)で包埋し、48ウェルプレートに播種した。続いて、マトリゲルを37℃で静置して固めた。続いて、上述した各組成の培地をマトリゲルの周囲に添加した。その後、2~3日おきに培地交換を行った。
成体幹細胞を含む細胞組織片として、実験例1と同様の細胞を使用した。まず、細胞を細胞1000個あたり20μLのマトリゲル(登録商標、コーニング社)で包埋し、48ウェルプレートに播種した。続いて、マトリゲルを37℃で静置して固めた。続いて、上述した各組成の培地をマトリゲルの周囲に添加した。その後、2~3日おきに培地交換を行った。
続いて、蛍光顕微鏡観察によりtdTomatoの発現を検出し、幹細胞マーカーであるLGR5タンパク質の発現を評価した。
図3(a)~(d)は、EGFの非存在下で形成した培養9日目の各オルガノイドの顕微鏡写真である。図3(a)は図に示す各濃度のFGFCの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図3(b)は図に示す各濃度のFGFC-Vの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図3(c)は図に示す各濃度のFGFC-Iの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図3(d)は図に示す各濃度のFGFC-Lの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。
また、図4(a)は、図3(a)と同一視野においてLGR5タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。図4(b)は、図3(b)と同一視野においてLGR5タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。図4(c)は、図3(c)と同一視野においてLGR5タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。図4(d)は、図3(d)と同一視野においてLGR5タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。
図5(a)~(d)は、EGFの存在下で形成した培養8日目の各オルガノイドの顕微鏡写真である。図5(a)は図に示す各濃度のFGFCの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図5(b)は図に示す各濃度のFGFC-Vの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図5(c)は図に示す各濃度のFGFC-Iの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。図5(d)は図に示す各濃度のFGFC-Lの存在下で形成したオルガノイドの明視野画像である。
また、図6(a)は、図5(a)と同一視野においてLGR5タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。図6(b)は、図5(b)と同一視野においてLGR5タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。図6(c)は、図5(c)と同一視野においてLGR5タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。図6(d)は、図5(d)と同一視野においてLGR5タンパク質の発現を検出した蛍光顕微鏡写真である。
その結果、いずれのFGFC変異体を用いても、FGFCを用いた場合と同程度にオルガノイドを製造することができることが明らかとなった。また、図3(a)~(d)、図4(a)~(d)、図5(a)~(d)、図6(a)~(d)に示すように、培地中のFGFC又はFGFC変異体の濃度を2.5ng/mL又は3.1ng/mLに減らしてもオルガノイドを製造することができることが明らかとなった。
[実験例4]
(FGFC変異体の耐熱性の検討)
実験例2で調製したFGFC、FGFC-V、FGFC-I、FGFC-Lの耐熱性を検討した。また、比較のために、FGF1(製品名「FGF-Acidic、Human、Recombinant」、ペプロテック社)、FGF2(製品名「FGF-Basic、Human、Recombinant、Animal Free」、ペプロテック社)の耐熱性も同様に検討した。
(FGFC変異体の耐熱性の検討)
実験例2で調製したFGFC、FGFC-V、FGFC-I、FGFC-Lの耐熱性を検討した。また、比較のために、FGF1(製品名「FGF-Acidic、Human、Recombinant」、ペプロテック社)、FGF2(製品名「FGF-Basic、Human、Recombinant、Animal Free」、ペプロテック社)の耐熱性も同様に検討した。
耐熱性の検討には、市販のキット(製品名「Protein Thermal ShiftTM Dye Kit」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を使用し、キットのマニュアルにしたがってサンプルを調製した後、リアルタイムPCR装置(製品名「7500fast」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)で各タンパク質の耐熱性を検討した。測定結果は、ソフトウエア(製品名「Protein Thermal ShiftTM Software v1.3」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて解析した。
図7は、測定された各タンパク質の融解温度(Tm)を示すグラフである。グラフの横軸は温度(℃)を示す。また、各タンパク質のTm値を下記表3に示す。
その結果、FGFCは、FGF2よりも耐熱性が高いことが明らかとなった。また、FGFC-V、FGFC-I、FGFC-Lは、FGFCよりも更に高い耐熱性を有することが明らかとなった。
本実施形態によれば、培地中に含まれる成長因子の含有量を減らすことができる、オルガノイドの製造技術を提供することができる。
Claims (15)
- 成体幹細胞又は成体幹細胞を含む細胞組織片を、Fibroblast growth factor(FGF)1の一部領域及びFGF2の一部領域を含むキメラ化FGFを含有する培地中で培養する工程を含む、オルガノイドの製造方法。
- 前記培地中に含まれる前記キメラ化FGFの含有量が、50ng/mL以下である、請求項1に記載の製造方法。
- 前記培地が、Epidermal Growth Factor(EGF)を更に含有する、請求項1又は請求項2に記載の製造方法。
- 前記培地中に含まれる前記キメラ化FGF及び前記EGFの合計の含有量が、100ng/mL以下である、請求項3に記載の製造方法。
- 前記キメラ化FGFが、配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるか、又は、配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ培地中に50ng/mL以下含有させることにより生体幹細胞又は生体幹細胞を含む細胞組織片からオルガノイドを製造することができる活性を有するタンパク質である、請求項1~請求項4のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記培地が、Insulin-like growth factor(IGF)シグナル伝達経路増強剤を更に含有する、請求項1~請求項5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記培地が、Transforming Growth Factor-β(TGF-β)シグナル伝達経路阻害剤を更に含有する、請求項1~請求項6のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記培地が、Wntシグナル伝達経路増強剤を更に含有する、請求項1~請求項7のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記培地が、Rhoキナーゼ(ROCK)シグナル伝達経路阻害剤を更に含有する、請求項1~請求項8のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記培地が、Bone morphogenetic protein(BMP)シグナル伝達経路阻害剤を更に含有する、請求項1~請求項9のいずれか一項に記載の製造方法。
- キメラ化FGFを含み、前記キメラ化FGFの含有量が、50ng/mL以下である、培地。
- EGFを更に含み、前記キメラ化FGF及び前記EGFの合計の含有量が、100ng/mL以下である、請求項11に記載の培地。
- 請求項1~請求項10のいずれか一項に記載の製造方法により製造されたオルガノイド。
- 請求項13に記載のオルガノイドを被験物質に接触させる工程、及び
前記被験物質が前記オルガノイドに及ぼす影響を評価する工程、
を含む、被験物質の評価方法。 - 配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるか、又は、配列番号1~配列番号4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ培地中に50ng/mL以下含有させることにより生体幹細胞又は生体幹細胞を含む細胞組織片からオルガノイドを製造することができる活性を有するタンパク質である、キメラ化FGF。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2021565593A JPWO2021125177A1 (ja) | 2019-12-16 | 2020-12-15 | |
US17/783,598 US20230002724A1 (en) | 2019-12-16 | 2020-12-15 | Production method for organoid |
CN202080085820.9A CN114829582A (zh) | 2019-12-16 | 2020-12-15 | 类器官的制造方法 |
EP20901631.0A EP4079755A4 (en) | 2019-12-16 | 2020-12-15 | METHOD FOR PRODUCING AN ORGANOID |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2019-226710 | 2019-12-16 | ||
JP2019226710 | 2019-12-16 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2021125177A1 true WO2021125177A1 (ja) | 2021-06-24 |
Family
ID=76478753
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/JP2020/046783 WO2021125177A1 (ja) | 2019-12-16 | 2020-12-15 | オルガノイドの製造方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230002724A1 (ja) |
EP (1) | EP4079755A4 (ja) |
JP (1) | JPWO2021125177A1 (ja) |
CN (1) | CN114829582A (ja) |
WO (1) | WO2021125177A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023162950A1 (ja) * | 2022-02-22 | 2023-08-31 | 国立大学法人大阪大学 | 肝オルガノイド由来培養肝細胞 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP4365192A1 (en) * | 2022-11-04 | 2024-05-08 | DSM IP Assets B.V. | Microbial production of growth factors |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009048119A1 (ja) * | 2007-10-12 | 2009-04-16 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | 高機能化キメラ蛋白質を含有する医薬組成物 |
WO2017199811A1 (ja) * | 2016-05-18 | 2017-11-23 | 学校法人慶應義塾 | オルガノイド培養用細胞培養培地、培養方法、及びオルガノイド |
WO2018207714A1 (ja) * | 2017-05-09 | 2018-11-15 | 公立大学法人名古屋市立大学 | 多能性幹細胞由来腸管オルガノイドの作製法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6351952B2 (ja) * | 2012-10-23 | 2018-07-04 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 多能性幹細胞培養方法 |
JP5818977B2 (ja) * | 2012-11-28 | 2015-11-18 | 国立研究開発法人放射線医学総合研究所 | 細胞膜透過性の線維芽細胞増殖因子の医療用途 |
-
2020
- 2020-12-15 CN CN202080085820.9A patent/CN114829582A/zh active Pending
- 2020-12-15 US US17/783,598 patent/US20230002724A1/en active Pending
- 2020-12-15 WO PCT/JP2020/046783 patent/WO2021125177A1/ja unknown
- 2020-12-15 EP EP20901631.0A patent/EP4079755A4/en active Pending
- 2020-12-15 JP JP2021565593A patent/JPWO2021125177A1/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009048119A1 (ja) * | 2007-10-12 | 2009-04-16 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | 高機能化キメラ蛋白質を含有する医薬組成物 |
WO2017199811A1 (ja) * | 2016-05-18 | 2017-11-23 | 学校法人慶應義塾 | オルガノイド培養用細胞培養培地、培養方法、及びオルガノイド |
EP3460042A1 (en) | 2016-05-18 | 2019-03-27 | Keio University | Cell culture medium for culturing organoid, culture method, and organoid |
WO2018207714A1 (ja) * | 2017-05-09 | 2018-11-15 | 公立大学法人名古屋市立大学 | 多能性幹細胞由来腸管オルガノイドの作製法 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
"NCBI", Database accession no. NP _001104745.1 |
CAS , no. 627536-09-08 |
CAS, no. 446859-33-2 |
HUCH M. ET AL.: "Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver", CELL, vol. 160, no. 1-2, 2015, pages 299 - 312 |
HUCH. M. ET AL.: "Modeling mouse and human development using organoid cultures", DEVELOPMENT, vol. 142, 2015, pages 3113 - 3125, XP009188081, DOI: 10.1242/dev.118570 * |
See also references of EP4079755A4 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023162950A1 (ja) * | 2022-02-22 | 2023-08-31 | 国立大学法人大阪大学 | 肝オルガノイド由来培養肝細胞 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP4079755A1 (en) | 2022-10-26 |
US20230002724A1 (en) | 2023-01-05 |
JPWO2021125177A1 (ja) | 2021-06-24 |
EP4079755A4 (en) | 2024-02-14 |
CN114829582A (zh) | 2022-07-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3418376B1 (en) | Cell culture medium, culture method, and organoid | |
KR102417262B1 (ko) | 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2d 오가노이드 및 그 사용 | |
CN105802904B (zh) | 用于培养可分化细胞的组合物和方法 | |
JP2020110164A (ja) | 上皮オルガノイド培養方法及び上皮オルガノイド | |
WO2021125176A1 (ja) | 増殖性肝オルガノイド、代謝活性化肝オルガノイド、及びそれらの使用 | |
EP3310901B1 (en) | In vitro production of cholangiocytes | |
WO2021125177A1 (ja) | オルガノイドの製造方法 | |
CN112585262B (zh) | 肠神经前体细胞的制造方法 | |
JP2021531018A (ja) | 肝胆膵組織およびその作製方法 | |
US20150361392A1 (en) | Liquid culturing of epithelial stem cells | |
Hirayama et al. | Identification of transcription factors that promote the differentiation of human pluripotent stem cells into lacrimal gland epithelium-like cells | |
CN116790476A (zh) | 用于体外制造胃底组织的方法和与其相关的组合物 | |
JP2020092700A (ja) | 肝臓オルガノイドの製造方法、肝臓オルガノイド製造用培地、肝臓オルガノイド、細胞製剤、及び被験物質の評価方法 | |
EP3801577A1 (en) | Methods and compositions comprising tankyrase inhibitors for generating insulin producing cells | |
JP2024028791A (ja) | 上皮細胞培養用培養容器及びその使用 | |
JP7285520B2 (ja) | 皮膚由来多能性前駆細胞の作製方法 | |
US20230257701A1 (en) | Method of culturing human induced pluripotent stem cells, culture of human induced pluripotent stem cells, and method of producing cerebral organoids | |
WO2022154090A1 (ja) | ヒト肝実質細胞の培養方法、培養ヒト肝実質細胞、培地及びその製造方法、ヒト肝非実質細胞の培養上清の製造方法 | |
WO2013165252A1 (en) | Culturing of mesenchymal stem cells | |
Xia et al. | ISRIB facilitates the co‐culture of human trophoblast stem cells and embryonic stem cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 20901631 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2021565593 Country of ref document: JP Kind code of ref document: A |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2020901631 Country of ref document: EP Effective date: 20220718 |