WO2021107082A1 - 癌性腹膜炎の治療薬 - Google Patents
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- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Definitions
- the present invention relates to a therapeutic agent for cancerous peritonitis containing an anti-transferrin receptor antibody.
- TfR transferrin receptor
- TfR transferrin receptor
- Cancerous peritonitis is a condition in which cancer has spread to the peritoneum. Cancerous peritonitis can be complicated in all cancer types, but the complication rate is high in intra-abdominal gastrointestinal cancer (stomach cancer, pancreatic cancer, colon cancer, etc.) and ovarian cancer.
- Cancer cells with peritoneal metastasis are known to be special cells that have acquired viability in hypoxic conditions. Cancer cells with peritoneal metastasis are expected to acquire resistance to anticancer drugs targeting the normal cell proliferation mechanism. From many clinical experiences and the results of clinical trials, it has become clear that the usual intraperitoneal administration of anticancer drugs is ineffective in the treatment of cancerous peritonitis.
- Examples of the therapeutic method for cancerous peritonitis include immunotherapy, hyperthermia, and the like in addition to chemotherapy, but the therapeutic effect is not sufficient and the prognosis is poor, and a new therapeutic method is desired.
- the present invention has made it a problem to be solved to provide a therapeutic agent for cancerous peritonitis.
- cancerous peritonitis can be treated by administering an antibody that recognizes an amino acid sequence at a predetermined position in TfR to a model mouse of cancerous peritonitis.
- the invention was completed.
- a therapeutic agent for cancerous peritonitis which comprises an antibody that recognizes a transferrin receptor.
- the antibody has the heavy chain first complementarity determining region (VH CDR1), the heavy chain second complementarity determining region (VH CDR2), and the heavy chain third complementarity determining region (VH CDR3) having SEQ ID NOs: 1, respectively. , 2, 3 and the light chain first complementarity determining regions (VL CDR1), light chain second complementarity determining regions (VL CDR2), and light chain third complementarity determining regions (VL CDR3) are SEQ ID NOs: respectively.
- the therapeutic agent for cancerous peritonitis according to any one of (1) to (3), which is an antibody that is 4, 5, and 6.
- the antibody is selected from the group consisting of peptides containing Fab, Fab', F (ab') 2 , single chain antibody (scFv), bispecific antibody, disulfide-stabilized V region (dsFv) and CDR.
- Cancerous peritonitis is associated with gastric cancer, pancreatic cancer, colon cancer, ovarian cancer, biliary tract cancer, liver cancer, gastrointestinal stromal tumor (GIST) or small intestinal cancer.
- the therapeutic agent for cancerous peritonitis according to any one of 1) to (8).
- a method for treating cancerous peritonitis comprises administering to a subject an antibody that recognizes a transferrin receptor.
- B An antibody that recognizes a transferrin receptor for use in the treatment of cancerous peritonitis.
- C Use of an antibody that recognizes the transferrin receptor for the manufacture of a therapeutic agent for cancerous peritonitis.
- the therapeutic agent for cancerous peritonitis of the present invention is useful in the treatment of cancerous peritonitis.
- the therapeutic agent for cancerous peritonitis of the present invention is a molecular-targeted agent targeting a new mechanism that attacks the supply route of nutrients required for cell metabolism.
- the therapeutic agent for cancerous peritonitis of the present invention is an optimal approach to existing anticancer drug-resistant peritoneal disseminated cells that survive in a hypoxic and malnourished environment, and is an unprecedented and original new medical treatment. Leads to.
- FIG. 1 shows a site where each TfR mutant fragment is point-mutated.
- FIG. 2 shows the reactivity of TfR436 with soluble wild type TfR (sTfR) and TfR mutant fragment.
- FIG. 3 shows the Tf-TfR binding inhibitory activity of TfR436.
- FIG. 4 shows the expression of TfR in patient tumor tissue.
- FIG. 5 shows the results of the survival time analysis.
- FIG. 6 shows HE specimens of mouse peritoneal masses in the TfR436 antibody-administered group.
- FIG. 7 shows the measurement result of the ascites weight.
- FIG. 8 shows the results of analysis of the survival rate of the pancreatic cancer cell line SUIT2 peritoneal dissemination model.
- FIG. 9 shows the expression of TfR in patient specimens.
- the transferrin receptor (TfR) is a transmembrane protein composed of 760 amino acids encoded on human chromosome 3 (SEQ ID NO: 9). This protein, also known as the CD71 antigen, is thought to be involved in cell iron uptake and cell proliferation.
- the TfR of the present invention is not particularly limited in structure, and the monomer, multimer, intact form expressed on the cell membrane, solubilized form composed in the extracellular region, truncated form, gene mutation, and the like. , Mutation form due to defects, etc., and post-translational modified form due to phosphorylation, etc., all mean TfR.
- React and Reactivity mean the same thing unless otherwise specified. That is, the antibody recognizes the antigen.
- This antigen may be an antigen TfR expressed on the cell membrane, a truncated form, or a solubilized form. Further, TfR having a three-dimensional structure may be used, or TfR may be modified.
- Means for examining reactivity include flow cytometer (FACS), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), western-blot, fluorescence trace measurement technology (FMAT), surface plasmon resonance (BIAcore), immunostaining, immunoprecipitation, etc. Can be mentioned.
- the antibody used for the flow cytometer may be an antibody labeled with a fluorescent substance such as FITC, biotin, or the like, or an unlabeled antibody.
- fluorescent-labeled avidin, fluorescent-labeled anti-human immunoglobulin antibody, or the like is used depending on the presence or absence of labeling of the antibody used and its type. Reactivity should be evaluated by adding a sufficient amount of anti-TfR antibody (usually the final concentration is 0.01 to 10 ⁇ g / mL) to the sample and comparing it with the reactivity of the negative control antibody and the positive control antibody. Can be done.
- Antibodies The following abbreviations (in parentheses) are used herein as is customary. Heavy chains (H chains), light chains (L chains), heavy chain variable regions (VH), light chain variable regions (VL), complementarity determining regions (CDRs), first complementarity determining regions (CDR1), second Complementarity determining regions (CDR2), third complementarity determining regions (CDR3) heavy chain first complementarity determining regions (VH CDR1), heavy chain second complementarity determining regions (VH CDR2), heavy chain third Complementarity determining regions (VH CDR3s)
- antibody is synonymous with immunoglobulin and should be understood as is commonly known in the art. Specifically, the term antibody is not limited to any particular method of making an antibody. For example, the term antibody includes, but is not limited to, recombinant antibodies, monoclonal antibodies, and polyclonal antibodies.
- human antibody means any antibody in which the sequences of the variable and constant regions are human sequences.
- the term has a sequence derived from a human gene, but has been altered to, for example, reduce possible immunogenicity, increase affinity, remove cysteines that can cause unwanted folding, and so on. Includes antibodies.
- the term also includes such antibodies made recombinantly in non-human cells that can undergo glycosylation that is not unique to human cells. These antibodies can be prepared in a variety of forms.
- humanized antibody refers to an antibody of non-human origin, where an amino acid residue characteristic of the antibody sequence of a non-human species is replaced with a residue found at the corresponding position of the human antibody. Has been done. It is believed that this "humanization" step reduces the human immunogenicity of the resulting antibody.
- non-human derived antibodies can be humanized using techniques well known in the art. For example, Winter et al., Immunol. See Today 14: 43-46 (1993).
- Antibodies of interest can be engineered by recombinant DNA techniques that replace CH1, CH2, CH3, hinge domains, and / or framework domains with the corresponding human sequences. For example, WO 92/02190, and US Pat.
- humanized antibody includes, within its meaning, chimeric human antibody and CDR-transplanted antibody.
- the sequence of the framework region (FR) in the variable region of the antibody is not particularly limited as long as it does not substantially affect the specific binding property to the corresponding antigen. It is preferable to use the FR region of a human antibody, but the FR region of a non-human animal species (for example, mouse or rat) can also be used.
- a constant region is included in addition to the variable region (for example, IgG type antibody).
- the arrangement of the constant region is not particularly limited.
- a known constant region of a human antibody can be used.
- the heavy chain constant region (CH) of the human antibody may be any as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter referred to as hIgG), but hIgG class ones are preferable, and hIgG1 belonging to the hIgG class, Any of the subclasses such as hIgG2, hIgG3 and hIgG4 can be used.
- the light chain constant region (CL) any one belonging to hIg may be used, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used. It is also possible to use constant regions of animal species other than humans (eg, mice and rats).
- the term "modified” or “modified antibody” means that one or more amino acids are substituted, deleted, added and / or in the amino acid sequence of the variable region (CDR sequence and / or FR sequence) of the parent antibody. It is inserted.
- the "parent antibody” is a TfR436 antibody having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 for VH and SEQ ID NO: 8 for VL.
- amino acid sequence one or several (eg, 1 to 8, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, particularly preferably 1 or 2) amino acids are deleted, added, substituted and /. Or it has been inserted.
- a method of introducing a mutation into a protein is known.
- those skilled in the art can use the site-directed mutagenesis method (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, anDNAkagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene. 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.
- a modified antibody functionally equivalent to the antibody having a binding activity to TfR can be prepared.
- an antibody in which one or several amino acids are mutated in the variable region or constant region of the antibody and has a binding activity to TfR can also be used.
- the activity is equivalent to that of the parent antibody
- the binding activity to TfR is equivalent.
- “Equivalent” does not necessarily mean that the activity is of the same degree, the activity may be enhanced, or the activity may be decreased as long as the activity is maintained.
- Examples of the antibody having reduced activity include 30% or more activity, preferably 50% or more activity, more preferably 80% or more activity, and further preferably 90% or more activity as compared with the original antibody. Particularly preferably, an antibody having an activity of 95% or more can be mentioned.
- Binding activity means recognizing an antigen.
- This antigen may be an antigen TfR expressed on the cell membrane, a truncated form, or a solubilized form. Further, TfR having a three-dimensional structure may be used, or TfR may be modified.
- a flow cytometer FACS
- an enzyme-linked immunosorbent assay ELISA
- Western-blot FMAT
- fluorescence trace measurement technology FMAT
- BIOcore surface plasmon resonance
- the Tf-TfR binding inhibitory activity of an antibody can be measured according to the method described in "Example 2 (2) Comparison of TfR436 antibody and antibody of another company in Tf-TfR binding inhibition" described later.
- the TfR solution is dispensed onto a substrate (96-well plate, etc.), allowed to stand, solidified, and blocked. Then, the HRP-labeled Tf solution is dispensed, an antibody is further added, and the reaction is carried out at room temperature. Then, the substrate is washed, a coloring reagent (TMB or the like) is added and reacted, and the absorbance is measured with a plate reader.
- TMB coloring reagent
- the antibody is not limited by its origin, and may be any animal-derived antibody such as a human antibody, a mouse antibody, and a rat antibody. Further, a chimeric antibody, a humanized antibody, or the like may be used.
- a human antibody is one of the preferred embodiments of the antibody in the present invention.
- the antibody may differ in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence / absence and morphology of sugar chain, etc., depending on the cell producing the antibody described later, the host, or the purification method.
- amino acid sequence described in the present invention is modified after translation is also included in the present invention.
- post-translational modifications for sites other than known post-translational modifications are also included in the present invention.
- the antibody is expressed in prokaryotic cells, for example, Escherichia coli, a methionine residue is added to the N-terminal of the amino acid sequence of the original antibody. In the present invention, such an antibody may be used.
- Post-translational modifications for sites other than known post-translational modifications are also included in the invention.
- scFv that reacts with antigen by phage display library Obtaining the antibody can be prepared according to several methods known in the art. For example, phage display technology can be used to provide a library containing a repertoire of antibodies with varying affinities for TfR. These libraries can then be screened to identify and isolate antibodies against TfR.
- the phage library is an scFv phage display library produced using human VL and VH cDNA prepared from mRNA isolated from human B cells. Methods of preparing and screening such libraries are known in the art. Genetic material is recovered from reactive phage clones screened using TfR as an antigen.
- the DNA sequences of VH and VL encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined.
- a human antibody can be obtained by converting scFv to IgG using this scFv sequence.
- a full long heavy chain gene can be obtained by linking a DNA encoding VH with another DNA molecule encoding a heavy chain constant region (CH1, CH2 and CH3).
- a heavy chain constant region CH1, CH2 and CH3
- the sequences of human heavy chain constant region genes are known in the art (eg, Kabat, EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), DNA fragments containing these regions can be obtained by standard PCR amplification.
- the heavy chain constant region may be a constant region of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM or IgD, but most preferably a constant region of IgG1 or IgG2.
- the IgG1 constant region sequence can be any of a variety of alleles or allotypes known to occur between different individuals, such as Gm (1), Gm (2), Gm (3) and Gm (17). These allotypes correspond to naturally occurring amino acid substitutions in the IgG1 constant region.
- a full-length L-chain gene (and Fab light chain gene) can be obtained by linking the VL-encoding DNA with another DNA molecule encoding the light chain constant region CL.
- the sequence of the human light chain constant region gene is known in the art (eg, Kabat, EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, US Department of Health and. Human Services, NIH Publication No. 91-3242), DNA fragments containing these regions can be obtained by standard PCR amplification.
- the light chain constant region may be a constant region of ⁇ or ⁇ .
- the ⁇ constant region can be any of a variety of alleles known to occur between different individuals, such as Inv (1), Inv (2) and Inv (3).
- the ⁇ constant region may be derived from any of the three ⁇ genes.
- An expression vector is prepared by inserting the DNA encoding the H chain or L chain obtained as described above into an expression vector, expressed in a host cell, and a human antibody is obtained by collecting and purifying the secreted supernatant.
- Expression vectors include plasmids, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses (AAV), plant viruses such as cauliflower mosaic virus and tobacco mosaic virus, and episomes derived from cosmid, YAC, and EBV.
- the expression vector and expression regulatory sequence are selected to be compatible with the expression host cell used.
- the antibody light chain gene and the antibody heavy chain gene can be inserted into separate vectors, or both genes can be inserted into the same expression vector.
- the antibody gene is inserted into the expression vector by standard methods (eg, ligation of the vector with complementary restriction sites on the antibody gene fragment, or blunt-ended ligation in the absence of restriction sites).
- the favorable vector is a functionally complete human CH or CL with suitable restriction sites engineered to allow easy insertion and expression of any VH or VL sequence as described above. It encodes an immunoglobulin sequence.
- splicing usually occurs between the splice-donating site in the inserted J region and the splice receiving site preceding the human C domain, and also in the splice region present within the human CH exon. Polyadenylation and transcription termination occur at naturally occurring chromosomal sites downstream of the coding region.
- the recombinant expression vector can also encode a signal peptide that stimulates the secretion of host cell-derived antibody chains.
- the antibody chain gene can be cloned into the vector such that the signal peptide is linked in-frame to the amino terminus of the immunoglobulin chain.
- the signal peptide may be an immunoglobulin signal peptide or a heterologous signal peptide (ie, a signal peptide derived from a non-immunoglobulin protein).
- the antibody expression vector may have, in addition to the antibody gene and control sequence, an additional sequence such as a sequence that controls the replication of the vector in the host cell (for example, an origin of replication) or a selectable marker gene.
- the selectable marker gene facilitates the selection of the host cell into which the vector has been introduced.
- the selectable marker gene usually confer resistance to drugs such as G418, hygromycin and methotrexate on the host cell into which the vector has been introduced.
- Preferred selectable marker genes include the dehydrofolate reductase (DHFR) gene (used with methotrexate selection / amplification in dhfr-host cells), the neomycin phosphotransferase gene (for G418 selection), and the glutamic acid synthase gene.
- DHFR dehydrofolate reductase
- the host cell may be any cell such as a bacterium, a yeast, an animal cell, an insect cell, or a plant cell as long as it can produce an antibody, but an animal cell is preferable.
- animal cells Chinese hamster ovary cells CHO / dhfr (-) cells CHO / DG44 cells, monkey-derived cells COS cells (A.Wright & SLMorrison, J.Immunol.160, 3393-3402 (1998)), SP2 / O cells (Mouth Mieroma) (K. Motmans et al., Eur.J. Cancer Prev.
- the lipofectin method (RWMalone et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6007 (1989), PLFelgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 ( 1987), the electroporation method, the calcium phosphate method (FLGraham & AJvan der Eb, Virology 52,456-467 (1973)), the DEAE-Dextran method and the like are preferably used.
- the human antibody After culturing the transformant, the human antibody is separated from the cells of the transformant or the culture medium.
- methods such as centrifugation, salting out, salting out, ultrafiltration, affinity chromatography, ion exchange chromatography, and gel filtration chromatography can be appropriately combined and used.
- Antibody fragment can be prepared based on an antibody or based on the sequence information of a gene encoding an antibody.
- Examples of the antibody fragment include Fab, Fab', F (ab') 2 , scFv, and dsFv antibodies.
- Fab is a fragment having a molecular weight of about 50,000, which is obtained by papain digestion of IgG in the presence of cysteine and is composed of an L chain and an H chain variable region, and an H chain fragment consisting of a CH1 domain and a part of a hinge portion. is there. In the present invention, it can be obtained by digesting the above antibody with papain. Further, a Fab can be prepared from a transformant transformed by incorporating a part of the H chain and the DNA encoding the L chain of the antibody into an appropriate vector.
- Fab' is a fragment having a molecular weight of about 50,000 obtained by cleaving the disulfide bond between the H chains of F (ab') 2 described later. In the present invention, it is obtained by digesting the above antibody with pepsin and cleaving a disulfide bond with a reducing agent. Further, as with Fab, it can also be genetically engineered using DNA encoding Fab'.
- F (ab') 2 is a fragment (Fab') obtained by pepsin digestion of IgG, which is composed of an L chain and an H chain variable region, and an H chain fragment consisting of a CH1 domain and a part of a hinge portion. Is a fragment having a molecular weight of about 100,000 bonded by a disulfide bond. In the present invention, it is obtained by pepsin digestion of the above antibody. Further, similarly to Fab, it can also be genetically engineered using DNA encoding F (ab') 2.
- the scFv is an antibody fragment obtained by linking an Fv composed of an H chain variable region and an L chain variable region with the C-terminal of one chain and the N-terminal of the other with an appropriate peptide linker to form a single chain.
- the peptide linker for example, highly flexible (GGGGS) 3 or the like can be used.
- GGGGS highly flexible
- a DNA encoding an scFv antibody is constructed using a DNA encoding the H chain variable region and the L chain variable region of the antibody and a DNA encoding a peptide linker, and this is incorporated into an appropriate vector, and the vector is used.
- ScFv can be prepared from the transformed transformant.
- dsFv is an Fv fragment in which Cys residues are introduced at appropriate positions in the H chain variable region and the L chain variable region, and the H chain variable region and the L chain variable region are stabilized by a disulfide bond.
- the introduction position of the Cys residue in each chain can be determined based on the three-dimensional structure predicted by molecular modeling.
- the three-dimensional structure is predicted from the amino acid sequences of the H chain variable region and the L chain variable region of the above antibody, and based on this prediction, DNA encoding the H chain variable region and the L chain variable region into which the mutation is introduced is constructed. Then, this can be incorporated into a suitable vector, and dsFv can be prepared from the transformant transformed with the vector.
- the antibody fragment can be multimerized by ligating an scFv antibody, a dcFv antibody, or the like using an appropriate linker, or by fusing streptavidin.
- Bispecific antibody The antibody may be a bispecific antibody.
- Bispecific antibodies are bispecific (mabs) obtained by chemically cross-linking two monoclonal antibodies, and bispecific obtained by chemically cross-linking two or two Fab fragments. Gender F (ab') 2, quadroma, bsDb (bispecific diabody), scBsDb (single-chain bispecific diabody), scBsTaFv (single-chain bispecific tandem variable domain), Bite (Bispecific T cell Engager antibody), DNL-F (ab) ) 3 (docl-and-lock trivalent Fab) and the like (Shim, H. Bispecific Antibodies and Antibody-Drug COmjugates for Cancer Therapy: Technological Considerations. Biomolecules 2020, 10, 360).
- compositions and preparations containing a therapeutic agent for cancerous peritonitis of the present invention are also included within the scope of the present invention.
- the therapeutic agent for cancerous peritonitis of the present invention can be used for the treatment of cancerous peritonitis.
- Cancerous peritonitis is a condition in which cancer has spread to the peritoneum.
- the cancerous peritonitis is not particularly limited, and examples thereof include those associated with cancer that causes cancerous peritonitis, and more specifically, gastric cancer, pancreatic cancer, colon cancer, ovarian cancer, and the like. Examples include those associated with biliary tract cancer, liver cancer, gastrointestinal stromal tumor (GIST) or small intestinal cancer.
- GIST gastrointestinal stromal tumor
- cancerous peritonitis cancer cells are scattered in the abdominal cavity, a large number of sand-granular masses are formed on the peritoneum, and ascites accumulates.
- the pharmaceutical composition and preparation containing the therapeutic agent for cancerous peritonitis of the present invention preferably contains a physiologically acceptable diluent or carrier in addition to the antibody, and may be a mixture with other agents.
- Suitable carriers include, but are not limited to, physiological saline, phosphate buffered saline, phosphate buffered saline glucose solution, and buffered saline.
- the antibody may be freeze-dried and reconstituted and used by adding a buffered aqueous solution as described above when required.
- Examples of the administration form include parenteral administration by intraperitoneal administration (intraperitoneal injection, etc.).
- the dose of the therapeutic agent for cancerous peritonitis of the present invention varies depending on symptoms, age, body weight, etc., but in general, the amount of antibody in oral administration is about 0.01 mg to 1000 mg per day for adults. , These can be administered once or in several divided doses. In parenteral administration, about 0.01 mg to 3000 mg can be administered intraperitoneally at a time.
- VH CDR1 SYGMH (SEQ ID NO: 1)
- VH CDR2 VISYDGSNKYADSVKG (SEQ ID NO: 2)
- VH CDR3 DSNFWSGYYSPVDV (SEQ ID NO: 3)
- VL CDR1 TRSSGSIASNSVQ (SEQ ID NO: 4)
- VL CDR2 YEDTQRPS (SEQ ID NO: 5)
- VL CDR3 QSYDSAYHWV (SEQ ID NO: 6)
- TfR436 VH (SEQ ID NO: 7) DVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFPFKSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRGEDTAVYYCARDSNFFWSGYSPVTVGS
- TfR436 VL (SEQ ID NO: 8) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNSVQWYQQRPGSAPITVIYEDTQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLSGLLQTEDEADYYCQSYDSAYHWVFGGGTKLALL
- Example 1 Identification of the binding site of the TfR436 antibody
- the TfR436 antibody did not cross-react with mouse TfR, but showed cross-reactivity with hamster TfR.
- the amino acid sequence of the Transferrin (TF) binding site (amino acids 569 to 760) in TfR was aligned.
- the same amino acids as hamsters and different from mice were picked up.
- the picked up amino acids were point-mutated as shown in FIG. 1 to prepare a soluble TfR mutant fragment.
- the plasmid was transfected into Expi293 cells (Invitrogen) using Expectamine (Invitrogen) and cultured at 37 ° C., 8% CO2, 135 rpm for 5 days. Then, the culture supernatant is collected by centrifugation, a HisTrapHP (GE Healthcare) column is connected to the AKTA prime (GE Healthcare), 20 mM Imidazole / DPBS is used as the binding buffer, and 500 mM Imidazole / DPBS is used as the elution buffer. Was purified. The eluted protein was buffer exchanged with 30 mM HEPES, 5% trehalose, pH 7.2 using Zeba spin colon (Thermo Scientific).
- TfR436 antibody (1 ug / mL) was dispensed into 100 ⁇ L / well, placed on a shaker, and reacted at room temperature for 1 hour. Then, it was washed 5 times with PBS-T Buffer, diluted 50,000 times, and dispensed into 100 ⁇ L / well of secondary antibody F (ab') 2 Fragment Anti-Human IgG Fc ⁇ (Jackson Immuno Research) and reacted at room temperature for 1 hour. I let you.
- TMB Solve Reagent High Sensitivity (Scy Tek) was dispensed into 100 ⁇ L / well, reacted at room temperature and in the dark for 3 minutes, and then TMB Stop Buffer (Scy Tek) was 100 ⁇ L. The mixture was added, shaken with a shaker for 1 minute, and the absorbance at 450 n (ref. 620 nm) was measured with a plate reader.
- the TfR436 antibody showed a decrease in reactivity with TfR mutant fragment MF5, but no decrease in reactivity with other mutant fragments was observed. That is, if the 629th, 630th, and 633th amino acids of TfR are replaced with other amino acids, the TfR436 antibody cannot be recognized as TfR. It was suggested that amino acids 629-633 are recognition epitopes of the TfR436 antibody.
- Example 2 Comparison of TfR436 antibody and comparative antibody in Tf-TfR binding inhibition (1) Preparation of comparative antibody A24 Patent Document US2008 / 0193453 describes an A24 antibody against human TfR. To compare this antibody with the TfR436 antibody, a deposited Hybridoma was obtained and the antibody was produced. Specifically, Hybridoma was sprinkled in a medium of RPMI1640 (GIBCO) and FBS 10% so that the cell concentration was 1 to 2x10 5 / mL, and cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C.
- the cells were collected by centrifugation, washed twice with PBS, and then expanded and cultured in serum-free medium cosmedium005 (Cosmobio) and 0.5% Nutridoma-CS (Roche) until the volume became 550 mL.
- the culture supernatant was collected by centrifugation 5 days after the cells became confluent.
- the recovered supernatant is applied to a protein A carrier (Ab-Capcher Extra: Protenova), and the antibody bound to protein A is eluted with 0.1 M glycine hydrochloride buffer (pH 2.7), and promptly. Neutralized with 1M Tris hydrochloric acid buffer (pH 8.5). After that, the buffer was exchanged with PBS using an ultracell ultrafiltration disk (Merck Millipore).
- the results show that the TfR436 antibody completely inhibited Tf-TfR binding at a much lower dose (100 ng / mL), as shown in FIG.
- the A24 antibody could not completely inhibit the binding of Tf-TfR even at a dose of 10 ⁇ g / mL, and could inhibit the binding of Tf-TfR by only 50%. It was suggested that the TfR436 antibody was superior in inhibiting the binding of Tf-TfR.
- Example 3 Expression of TfR in a patient sample of cancerous peritonitis (immunostaining of a patient pathological sample)
- the expression of TfR1 in the tumor tissues of the primary and peritoneal disseminated lesions collected from patients with cancerous peritonitis of the primary gastric cancer was examined by immunostaining. Tumor tissue slides were deparaffinized and autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes in pH 6.0 activation buffer for antigen activation. After endogenous peroxidase treatment with 0.3% H 2 O 2 water, primary antibody (0.4 ⁇ g / mL Anti TFRC Rabbit, ATLAS ANTIBODIES, HPA028598) was reacted at 4 ° C. overnight.
- the polymer reagent Histfine Simple Stain MAX-PO MULTI, Nichirei, 424152
- DAB reagent Histfine Simple Stain DAB, Nichirei, 415172
- the expression of TfR was confirmed in both the tumor tissue derived from the primary tumor of the gastric cancer patient (FIG. 4A) and the tumor tissue of the peritoneal disseminated lesion (FIG. 4B).
- Example 4 Antitumor effect of gastric cancer cell line MKN45-Luc peritoneal dissemination model
- the antitumor effect of TfR436 antibody was examined using the gastric cancer cell line MKN45-Luc peritoneal dissemination model.
- the MKN45-Luc cell line (JCRB1379) was cultured in culture medium (RPMI-1640, 10% FBS, 1% P / S). The culture medium was removed, washed once with PBS, and the cells were detached using TrypLE Express. The cells were collected by adding the culture medium, washed once with PBS, suspended again in PBS, and the number of cells was counted using 0.4% trypan blue. After counting, the cells were prepared with PBS to a cell concentration of 1 ⁇ 10 7 / mL.
- This cell suspension was sucked up into a 1 mL tuberculin syringe, attached with a two-step needle, and C.I. 200 ⁇ L / animal was transplanted into the abdominal cavity of 20 B-17 / IcrHsd-Prkdc scid mice (female, 6 weeks old at the time of arrival).
- the number of transplanted cells is 2 ⁇ 10 6 cells / animal.
- luciferin was intraperitoneally administered and the luminescence of the transplanted cells was measured.
- 17 mice in which the engraftment of the transplanted cells was confirmed by the detection of luminescence were used for grouping according to the luminescence intensity (8 in the control group and 9 in the antibody administration group).
- the drug was intraperitoneally administered four times at intervals of once a week.
- PBS was administered to the control group, and 15 mg / kg of TfR436 antibody was administered to the antibody-administered group.
- mice were observed during the test period to determine whether they were alive or dead.
- the test was completed 77 days after transplantation, and statistical analysis was performed based on the survival time of the mice.
- the formation of a mass was confirmed in the abdominal cavity of 7 mice in the TfR436 antibody-administered group that were alive at the end of the test.
- necrosis was observed extensively in the tumor, and tumor cells retaining the proliferative capacity were confirmed to remain only on the surface of the tumor and in a small area around the blood vessel (Fig. 6). ).
- Example 5 Examination of antitumor effect by pancreatic cancer cell line SUIT-2 peritoneal dissemination model SUIT-2 cell line (JCRB1094) was cultured in a culture medium (EMEM, 10% FBS, 1% P / S). The culture broth was removed, washed once with PBS, and the cells were detached using TrypLE Express. The cells were collected by adding the culture medium, washed once with PBS, suspended again in PBS, and the number of cells was counted using 0.4% trypan blue. After counting, the cells were prepared with PBS to a cell concentration of 1 ⁇ 10 7 / mL. This cell suspension was sucked up into a 1 mL tuberculin syringe, attached with a two-step needle, and C.I.
- a culture medium EMEM, 10% FBS, 1% P / S
- the culture broth was removed, washed once with PBS, and the cells were detached using TrypLE Express.
- the cells were collected by adding the culture medium, washed once
- Example 6 Life-prolonging effect of pancreatic cancer cell line SUIT2 peritoneal dissemination model SUIT-2 cell line (JCRB1094) was cultured in a culture medium (EMEM, 10% FBS, 1% P / S). The culture medium was removed, washed once with PBS, and the cells were detached using TrypLE Express. The cells were collected by adding the culture medium, washed once with PBS, suspended again in PBS, and the number of cells was counted using 0.4% trypan blue. After counting, the cells were prepared with PBS to a cell concentration of 1 ⁇ 10 7 / mL. This cell suspension was sucked up into a 1 mL tuberculin syringe, attached with a two-step needle, and C.I.
- EMEM 10% FBS, 1% P / S
- Example 7 TfR expression analysis of patient specimens Using the cancer patient specimens shown in the table below, the TfR expression state was analyzed by immunostaining only for peritoneal disseminated tumors by the same method as in Example 3. The judgment criteria are shown in Table 1.
Abstract
本発明の課題は、癌性腹膜炎の治療薬を提供することである。本発明によれば、トランスフェリンレセプターを認識する抗体を含む、癌性腹膜炎の治療薬が提供される。
Description
本発明は、抗トランスフェリン受容体抗体を含む癌性腹膜炎の治療薬に関する。
トランスフェリン受容体(Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴｆＲ)は、トランスフェリン(Ｔｆ)と結合した鉄を細胞内に取り込むための細胞膜構造として、最初網状赤血球上にあると同定された。その後、ＴｆＲは、胎盤の栄養膜細胞や、活性化されたリンパ球、更にさまざまな腫瘍細胞などに発現していることが分かっている。例えば、乳がん、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、大腸がん、胃がん、膀胱癌、肝癌、子宮頸がん、脳腫瘍、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、成人Ｔ細胞白血病におけるＴｆＲの高発現が報告されていた。また、ＴｆＲは様々な癌細胞表面に高発現し、正常細胞における発現が低いため、がん治療の分子標的と認識されている。例えば、特許文献１には、トランスフェリン受容体を特異的に認識できる抗体、及び上記抗体を用いた抗がん剤が記載されている。
癌性腹膜炎とは、腹膜にがんが転移した病態である。癌性腹膜炎は、すべての癌種で合併する可能性があるが、腹腔内の消化器がん（胃がん、膵臓がん、大腸がんなど）や卵巣がんにおいて合併率が高い。
腹膜転移のがん細胞は、低酸素状態での生存能力を獲得した特殊な細胞であることが知られている。腹膜転移のがん細胞は、通常の細胞増殖機序をターゲットとした抗がん剤には耐性を獲得していることが予想される。多くの臨床経験や臨床試験の結果からも、通常の抗がん剤の腹腔内投与は、癌性腹膜炎の治療には無効であることが明らかになっている。癌性腹膜炎の治療法としては、化学療法に加えて、免疫療法、温熱療法等も挙げられるが、治療効果は十分なものではなく予後が悪く、新たな治療法が望まれている。本発明は、癌性腹膜炎の治療薬を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために検討した結果、癌性腹膜炎のモデルマウスにＴｆＲにおける所定の位置のアミノ酸配列を認識する抗体を投与したところ、癌性腹膜炎を治療できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）トランスフェリンレセプターを認識する抗体を含む、癌性腹膜炎の治療薬。
（２）トランスフェリンレセプターを認識する抗体が、ヒトトランスフェリンレセプターを認識する抗体である、（１）に記載の癌性腹膜炎治療薬。
（３）ヒトトランスフェリンレセプターを認識する抗体が、ヒトトランスフェリンレセプターの６２９番目～６３３番目のアミノ酸を認識する抗体である、（２）に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
（４）前記抗体が、重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体である、（１）から（３）の何れか一に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
（５）前記抗体が、重鎖が配列番号７を有し、軽鎖が配列番号８を有する抗体である、（１）から（４）の何れか一に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
（６）抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である、（１）から（５）の何れか一に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
（７）抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、ジスルフィド安定化V領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、（１）から（６）の何れか一に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
（８）癌性腹膜炎が、癌性腹膜炎の起因となるがんに合併したものである、（１）から（７）の何れか一項に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
（９）癌性腹膜炎が、胃がん、膵臓がん、大腸がん、卵巣がん、胆道がん、肝臓がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）または小腸がんに合併したものである、（１）から（８）の何れか一に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
（１０）腹腔内投与される、（１）から（９）の何れか一に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
（１）トランスフェリンレセプターを認識する抗体を含む、癌性腹膜炎の治療薬。
（２）トランスフェリンレセプターを認識する抗体が、ヒトトランスフェリンレセプターを認識する抗体である、（１）に記載の癌性腹膜炎治療薬。
（３）ヒトトランスフェリンレセプターを認識する抗体が、ヒトトランスフェリンレセプターの６２９番目～６３３番目のアミノ酸を認識する抗体である、（２）に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
（４）前記抗体が、重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体である、（１）から（３）の何れか一に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
（５）前記抗体が、重鎖が配列番号７を有し、軽鎖が配列番号８を有する抗体である、（１）から（４）の何れか一に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
（６）抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である、（１）から（５）の何れか一に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
（７）抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、ジスルフィド安定化V領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、（１）から（６）の何れか一に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
（８）癌性腹膜炎が、癌性腹膜炎の起因となるがんに合併したものである、（１）から（７）の何れか一項に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
（９）癌性腹膜炎が、胃がん、膵臓がん、大腸がん、卵巣がん、胆道がん、肝臓がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）または小腸がんに合併したものである、（１）から（８）の何れか一に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
（１０）腹腔内投与される、（１）から（９）の何れか一に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
（Ａ） トランスフェリンレセプターを認識する抗体を対象者に投与することを含む、癌性腹膜炎を治療する方法が提供される。
（Ｂ） 癌性腹膜炎の治療において使用するための、トランスフェリンレセプターを認識する抗体。
（Ｃ） 癌性腹膜炎の治療薬の製造のための、トランスフェリンレセプターを認識する抗体の使用。
（Ｂ） 癌性腹膜炎の治療において使用するための、トランスフェリンレセプターを認識する抗体。
（Ｃ） 癌性腹膜炎の治療薬の製造のための、トランスフェリンレセプターを認識する抗体の使用。
本発明の癌性腹膜炎の治療薬は、癌性腹膜炎の治療において有用である。本発明の癌性腹膜炎の治療薬は、細胞の代謝に必要な栄養素の補給ルートを攻撃する新しい機序をターゲットとした分子標的薬である。本発明の癌性腹膜炎の治療薬は、低酸素・低栄養環境で生存する既存の抗がん剤耐性の腹膜播種細胞には、最適のアプローチ法であり、これまでにない独創的な新規医療につながる。
次に、本発明について更に詳細に説明する。
定義および一般的技術
本明細書において別段定義しない限り、本発明に関して使用した科学技術用語は、当業者に通常理解されている意味を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して使用した命名法およびその技術は、当技術分野で周知のものであり、通常使用されている。
定義および一般的技術
本明細書において別段定義しない限り、本発明に関して使用した科学技術用語は、当業者に通常理解されている意味を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して使用した命名法およびその技術は、当技術分野で周知のものであり、通常使用されている。
本発明の方法および技術は一般に、別段示さない限り、当技術分野で周知である従来の方法に従って、本明細書全体にわたって引用し論じた種々の一般的参照文献およびより具体的な参照文献に記載されているように実施する。
ＴｆＲ
ヒトの場合、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）はヒト三番染色体にコードされる７６０アミノ酸から構成される一回膜貫通型タンパクである(配列番号９)。このタンパクはＣＤ７１抗原としても知られ、細胞の鉄の取り込みに関与し、細胞の増殖に関与すると考えられている。本発明のＴｆＲは、構造上特別に限定せず、単量体、多量体、細胞膜に発現しているｉｎｔａｃｔ ｆｏｒｍ、細胞外領域に構成された可溶化ｆｏｒｍ、ｔｒｕｎｃｔｅｄ ｆｏｒｍ、また、遺伝子の変異や、欠損などによりｍｕｔａｔｉｏｎ ｆｏｒｍ、リン酸化などにより翻訳後修飾を受けたｆｏｒｍなども含め、すべてＴｆＲを意味する。
ヒトの場合、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）はヒト三番染色体にコードされる７６０アミノ酸から構成される一回膜貫通型タンパクである(配列番号９)。このタンパクはＣＤ７１抗原としても知られ、細胞の鉄の取り込みに関与し、細胞の増殖に関与すると考えられている。本発明のＴｆＲは、構造上特別に限定せず、単量体、多量体、細胞膜に発現しているｉｎｔａｃｔ ｆｏｒｍ、細胞外領域に構成された可溶化ｆｏｒｍ、ｔｒｕｎｃｔｅｄ ｆｏｒｍ、また、遺伝子の変異や、欠損などによりｍｕｔａｔｉｏｎ ｆｏｒｍ、リン酸化などにより翻訳後修飾を受けたｆｏｒｍなども含め、すべてＴｆＲを意味する。
反応する及び反応性
本明細書において、「反応する」と「反応性」は特別に示さない限り、同じのことを意味する。すなわち、抗体が抗原を認識すること。この抗原は、細胞膜に発現するｉｎｔａｃｔ ＴｆＲでもよいし、ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍや、可溶化ｆｏｒｍでも良い。また、立体構造を保ったＴｆＲでもよいし、変性したＴｆＲでもよい。反応性を検討する手段として、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ、蛍光微量測定技術（ＦＭＡＴ）表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）、免疫染色、免疫沈降などが挙げられる。
本明細書において、「反応する」と「反応性」は特別に示さない限り、同じのことを意味する。すなわち、抗体が抗原を認識すること。この抗原は、細胞膜に発現するｉｎｔａｃｔ ＴｆＲでもよいし、ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍや、可溶化ｆｏｒｍでも良い。また、立体構造を保ったＴｆＲでもよいし、変性したＴｆＲでもよい。反応性を検討する手段として、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ、蛍光微量測定技術（ＦＭＡＴ）表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）、免疫染色、免疫沈降などが挙げられる。
フローサイトメーターに用いる抗体としては、ＦＩＴＣなどの蛍光物質、ビオチンなどにより標識された抗体であっても、標識をされていない抗体であってもよい。用いた抗体の標識の有無、その種類により、蛍光標識アビジン、蛍光標識抗ヒト免疫グロブリン抗体などを使用する。反応性は、十分量の抗ＴｆＲ抗体（通常最終濃度が０．０１～１０μｇ／ｍＬ）を検体に加えて行い、陰性対照抗体、陽性対照抗体の反応性との比較を行うことにより評価することができる。
抗体
本明細書では必要に応じて、慣習に従い以下の略号（括弧内）を使用する。
重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）、第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）重鎖の第１相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、重鎖の第２相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、重鎖の第３相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）軽鎖の第１相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１）、軽鎖の第２相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ２）、軽鎖の第３相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ３）。
本明細書では必要に応じて、慣習に従い以下の略号（括弧内）を使用する。
重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）、第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）重鎖の第１相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、重鎖の第２相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、重鎖の第３相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）軽鎖の第１相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１）、軽鎖の第２相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ２）、軽鎖の第３相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ３）。
本明細書において、「抗体」という用語は、イムノグロブリンと同義であり、当技術分野で通常知られている通りに理解されるべきである。具体的には、抗体という用語は、抗体を作製する任意の特定の方法により限定されるものではない。例えば、抗体という用語には、それだけに限らないが、組換え抗体、モノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体がある。
本明細書において、「ヒト抗体」という用語は、可変領域および定常領域の配列がヒト配列である任意の抗体を意味する。その用語は、ヒト遺伝子に由来する配列を有するが、例えば、考えられる免疫原性の低下、親和性の増大、望ましくない折りたたみを引き起こす可能性があるシステインの除去などを行うように変化させている抗体を包含する。その用語はまた、ヒト細胞に特有でないグリコシル化を施すことができる、非ヒト細胞中で組換えにより作製されたそのような抗体をも包含する。これらの抗体は、様々な形で調製することができる。
本明細書において、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト由来の抗体を指し、非ヒト種の抗体配列に特徴的なアミノ酸残基が、ヒト抗体の対応する位置で認められる残基と置換されている。この「ヒト化」の工程が、その結果得られる抗体のヒトでの免疫原性を低下させると考えられる。当技術分野で周知の技術を使用して、非ヒト由来の抗体をヒト化できることが理解されるであろう。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１４：４３～４６（１９９３）を参照されたい。対象とする抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメイン、および／またはフレームワークドメインを対応するヒト配列と置換する組換えＤＮＡ技術によって工学的に作製することができる。例えば、ＷＯ９２／０２１９０、ならびに米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７９２号、第５，７１４，３５０号、および第５，７７７，０８５号を参照できる。本明細書において、「ヒト化抗体」という用語は、その意味の範囲内で、キメラヒト抗体およびＣＤＲ移植抗体を含む。
抗体の可変領域においてフレームワーク領域（ＦＲ）の配列は、対応する抗原に対する特異的結合性に実質的な影響のない限り、特に限定されない。ヒト抗体のＦＲ領域を用いることが好ましいが、ヒト以外の動物種（例えばマウスやラット）のＦＲ領域を用いることもできる。
抗体の一態様において、可変領域に加えて定常領域を含む（例えばIgG型抗体）。定常領域の配列は特に限定されない。例えば、公知のヒト抗体の定常領域を用いることができる。ヒト抗体の重鎖定常領域（ＣＨ）としては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇＧと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、軽鎖定常領域（ＣＬ）としては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。また、ヒト以外の動物種（例えばマウスやラット）の定常領域を用いることもできる。
本明細書において、「改変体」や「改変抗体」とは、親抗体の可変領域（ＣＤＲ配列および／またはＦＲ配列）のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されていることである。
本発明において、「親抗体」とは、ＶＨは配列番号７、ＶＬは配列番号８で示されたアミノ酸配列を有するＴｆＲ４３６抗体である。アミノ酸配列において、１または数個（例えば、１から８個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から３個、特に好ましくは１または２個）のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／または挿入されている。ＴｆＲに対する結合活性を有する抗体のアミノ酸配列を調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, anＤＮＡkagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of ＤＮＡ fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V,Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex ＤＮＡ approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex ＤＮＡ Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492）などを用いて、ＴｆＲに対する結合活性を有する抗体のアミノ酸配列に適宜変異を導入することにより、ＴｆＲに対する結合活性を有する抗体と機能的に同等な改変抗体を調製することができる。このように、抗体の可変領域又は定常領域において、１または数個のアミノ酸が変異しており、ＴｆＲに対する結合活性を有する抗体を使用することもできる。
本発明において、「親抗体」とは、ＶＨは配列番号７、ＶＬは配列番号８で示されたアミノ酸配列を有するＴｆＲ４３６抗体である。アミノ酸配列において、１または数個（例えば、１から８個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から３個、特に好ましくは１または２個）のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／または挿入されている。ＴｆＲに対する結合活性を有する抗体のアミノ酸配列を調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, anＤＮＡkagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of ＤＮＡ fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V,Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex ＤＮＡ approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex ＤＮＡ Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492）などを用いて、ＴｆＲに対する結合活性を有する抗体のアミノ酸配列に適宜変異を導入することにより、ＴｆＲに対する結合活性を有する抗体と機能的に同等な改変抗体を調製することができる。このように、抗体の可変領域又は定常領域において、１または数個のアミノ酸が変異しており、ＴｆＲに対する結合活性を有する抗体を使用することもできる。
本明細書において、「活性が親抗体と同等である」とは、ＴｆＲへの結合活性が同等であることを意味する。「同等」とは、必ずしも同程度の活性である必要はなく、活性が増強されていてもよいし、又、活性を有する限り活性が減少していてもよい。活性が減少している抗体としては、例えば、元の抗体と比較して３０％以上の活性、好ましくは５０％以上の活性、より好ましくは８０％以上の活性、さらに好ましくは９０％以上の活性、特に好ましくは９５％以上の活性を有する抗体を挙げることができる。
結合活性としては、抗原を認識することを意味する。この抗原は、細胞膜に発現するｉｎｔａｃｔ ＴｆＲでもよいし、ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍや、可溶化ｆｏｒｍでも良い。また、立体構造を保ったＴｆＲでもよいし、変性したＴｆＲでもよい。たとえば、結合活性を検討する手段として、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ、蛍光微量測定技術（ＦＭＡＴ）表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）などが挙げられる。
抗体のＴｆ－ＴｆＲ結合阻害活性は、後記する「実施例２（２）Ｔｆ－ＴｆＲ結合阻害におけるＴｆＲ４３６抗体及び他社抗体の比較」に記載した方法に準じて測定することができる。ＴｆＲ溶液を基板（９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ等）に分注して静置し、固相化し、ブロッキングする。次いで、ＨＲＰ標識したＴｆ溶液を分注し、さらに抗体を添加して、室温で反応させる。その後、基板を洗浄し、発色試薬（ＴＭＢ等）を添加して反応させ、プレートリーダーで吸光度を測定する。上記操作により、当該抗体が、Ｔｆ－ＴｆＲ結合阻害活性を評価することができる。
抗体は、その由来で限定されず、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体など、如何なる動物由来の抗体でもよい。又、キメラ化抗体、ヒト化抗体などでもよい。本発明における抗体の好ましい様態の一つとして、ヒト抗体である。
抗体は、後述する抗体を産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。例えば、本発明で記載されているアミノ酸配列に翻訳後に修飾を受ける場合も本発明に含まれる。更に、既知の翻訳後修飾以外の部位に対する翻訳後修飾も、本発明に含まれる。また、抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明においては、このような抗体を使用してもよい。既知の翻訳後修飾以外の部位に対する翻訳後修飾も、本発明に含まれる。
抗体の作製
（１）ファージディスプレイライブラリーにより抗原と反応するｓｃＦｖ
抗体の取得は、当技術分野で知られているいくつかの方法に従って調製することができる。例えば、ファージディスプレイ技術を使用して、ＴｆＲに対する親和性が様々である抗体のレパートリーを含むライブラリーを提供することができる。次いで、これらのライブラリーをスクリーニングして、ＴｆＲに対する抗体を同定し単離することができる。好ましくは、ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬおよびＶＨｃＤＮＡを使用して生成されるｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。そのようなライブラリーを調製しスクリーニングする方法は当技術分野で知られている。ＴｆＲを抗原としてスクリーニングした反応性を示すファージクローンから遺伝物質を回収する。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＶＨ及びＶＬのＤＮＡ配列を決定することができる。このｓｃＦｖの配列を用いて、ｓｃＦｖをＩｇＧ化すれば、ヒト抗体を取得することができる。
（１）ファージディスプレイライブラリーにより抗原と反応するｓｃＦｖ
抗体の取得は、当技術分野で知られているいくつかの方法に従って調製することができる。例えば、ファージディスプレイ技術を使用して、ＴｆＲに対する親和性が様々である抗体のレパートリーを含むライブラリーを提供することができる。次いで、これらのライブラリーをスクリーニングして、ＴｆＲに対する抗体を同定し単離することができる。好ましくは、ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬおよびＶＨｃＤＮＡを使用して生成されるｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。そのようなライブラリーを調製しスクリーニングする方法は当技術分野で知られている。ＴｆＲを抗原としてスクリーニングした反応性を示すファージクローンから遺伝物質を回収する。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＶＨ及びＶＬのＤＮＡ配列を決定することができる。このｓｃＦｖの配列を用いて、ｓｃＦｖをＩｇＧ化すれば、ヒト抗体を取得することができる。
（２）ｓｃＦｖのＩｇＧ化（ヒト抗体の作製）
Ｈ鎖またＬ鎖の発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製によりヒト抗体を取得する。また、ＶＨ及びＶＬを同一ベクターに発現すること（タンデム型）によりヒト抗体の取得もできる。これらの方法は周知であり、ＷＯ９２/０１０４７、ＷＯ９２/２０７９１、ＷＯ９３/０６２１３、ＷＯ９３/１１２３６、Ｗ０９３/１９１７２、ＷＯ９５/０１４３８、ＷＯ９５/１５３８８、ＷＯ９７/１０３５４などを参考にすることができる。
Ｈ鎖またＬ鎖の発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製によりヒト抗体を取得する。また、ＶＨ及びＶＬを同一ベクターに発現すること（タンデム型）によりヒト抗体の取得もできる。これらの方法は周知であり、ＷＯ９２/０１０４７、ＷＯ９２/２０７９１、ＷＯ９３/０６２１３、ＷＯ９３/１１２３６、Ｗ０９３/１９１７２、ＷＯ９５/０１４３８、ＷＯ９５/１５３８８、ＷＯ９７/１０３５４などを参考にすることができる。
具体的には、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする他のＤＮＡ分子と連結することによって、完全長重鎖遺伝子を取得することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤの定常領域でよいが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２の定常領域である。ＩｇＧ１定常領域配列は、Ｇｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）やＧｍ（１７）など、異なる個人間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子またはアロタイプでよい。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域中の天然に存在するアミノ酸置換に相当する。
ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子と連結することによって、完全長Ｌ鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）を取得することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλの定常領域でよい。κ定常領域は、Ｉｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）やＩｎｖ（３）など、異なる個人間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子でよい。λ定常領域は、３つのλ遺伝子のいずれかに由来するものでよい。
上記のように得られたＨ鎖またＬ鎖コードするＤＮＡを発現ベクター中に挿入することにより、発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製によりヒト抗体を取得する。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルスやタバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用する発現用宿主細胞と適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクター中に挿入することができるし、また両方の遺伝子を同じ発現ベクター中に挿入することもできる。抗体遺伝子を、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補的な制限部位とベクターの連結、または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）によって発現ベクター中に挿入する。
好都合なベクターは、上記に記載のように任意のＶＨまたはＶＬ配列を容易に挿入し発現させることができるように工学的に作製された適当な制限部位を有する機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬイムノグロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターでは、通常、挿入されたＪ領域中のスプライス供与部位とヒトＣドメインに先行するスプライス受容部位の間で、またヒトＣＨエキソン内に存在するスプライス領域でもスプライシングが起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流にある天然の染色体部位で起こる。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞由来の抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることもできる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがインフレームでイムノグロブリン鎖のアミノ末端と連結するようにベクター中にクローン化することができる。シグナルペプチドは、イムノグロブリンシグナルペプチドでもよく、あるいは異種性シグナルペプチド（すなわち非イムノグロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）でもよい。
抗体の発現ベクターは、抗体遺伝子および制御配列に加えて、宿主細胞中でのベクターの複製を制御する配列（例えば複製起点）や選択マーカー遺伝子などのさらなる配列を有してよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンやメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、デヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ－宿主細胞でメトトレキセート選択／増幅とともに使用する）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇ４１８選択用）、およびグルタミン酸合成酵素遺伝子がある。
以上の方法で作製された抗体遺伝子発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、抗体を産生させる可能であればいかなる細胞でもよいが、動物細胞が好ましい。動物細胞として、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ/ｄｈｆｒ (－)細胞ＣＨＯ/ＤＧ４４細胞、サル由来細胞ＣＯＳ細胞(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immunol.１６０, ３３９３-３４０２ (１９９８))、ＳＰ２／Ｏ細胞(マウスミエローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.５,５１２-５１９9(１９９６),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.５０,１４９５-１５０２ (１９９０)) など挙げられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８６,６００７ (１９８９), P.L.Felgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８４,７４１３ (１９８７)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology ５２,４５６-４６７(１９７３))、ＤＥＡＥ-Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト抗体を分離する。抗体の分離・精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて利用することができる。
抗体断片
抗体を基にして又は抗体をコードする遺伝子の配列情報を基にして抗体断片を作製することができる。抗体断片としてはＦａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ抗体が挙げられる。
抗体を基にして又は抗体をコードする遺伝子の配列情報を基にして抗体断片を作製することができる。抗体断片としてはＦａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ抗体が挙げられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧをシステイン存在下パパイン消化することにより得られる、Ｌ鎖とＨ鎖可変領域、並びにＣＨ１ドメイン及びヒンジ部の一部からなるＨ鎖フラグメントとから構成される分子量約５万の断片である。本発明では、上記抗体をパパイン消化することにより得ることができる。また、上記抗体のＨ鎖の一部及びＬ鎖をコードするＤＮＡを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりＦａｂを調製することもできる。
Ｆａｂ'は、後述のF(ａｂ')２のＨ鎖間のジスルフィド結合を切断することにより得られる分子量が約５万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化し、還元剤を用いてジスルフィド結合を切断することにより得られる。また、Ｆａｂ同様に、Ｆａｂ'をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
Ｆ(ａｂ')２は、ＩｇＧをペプシン消化することにより得られる、Ｌ鎖とＨ鎖可変領域、並びにＣＨ１ドメイン及びヒンジ部の一部からなるＨ鎖フラグメントとから構成される断片（Ｆａｂ'）がジスルフィド結合で結合した分子量約１０万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化することにより得られる。また、Ｆａｂ同様に、Ｆ(ａｂ')２をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
ｓｃＦｖは、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とからなるＦｖを、片方の鎖のＣ末端と他方のＮ末端とを適当なペプチドリンカーで連結し一本鎖化した抗体断片である。ペプチドリンカーとしては例えば柔軟性の高い（ＧＧＧＧＳ）３などを用いることができる。例えば、上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡとペプチドリンカーをコードするＤＮＡを用いてｓｃＦｖ抗体をコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりｓｃＦｖを調製することができる。
ｄｓＦｖは、Ｈ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域の適切な位置にＣｙｓ残基を導入し、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とをジスルフィド結合により安定化させたＦｖ断片である。各鎖におけるＣｙｓ残基の導入位置は分子モデリングにより予測される立体構造に基づき決定することができる。本発明では例えば上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域のアミノ酸配列から立体構造を予測し、かかる予測に基づき変異を導入したＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をそれぞれコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、そして当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりｄｓＦｖを調製することができる。
尚、適当なリンカーを用いてｓｃＦｖ抗体、ｄｃＦｖ抗体などを連結させたり、ストレプトアビジンを融合させたりして抗体断片を多量体化することもできる。
尚、適当なリンカーを用いてｓｃＦｖ抗体、ｄｃＦｖ抗体などを連結させたり、ストレプトアビジンを融合させたりして抗体断片を多量体化することもできる。
二重特異性抗体
抗体は、二重特異性抗体でもよい。
二重特異性抗体としては、２分子のモノクローナル抗体を化学的に架橋することにより得られる二重特異性 （ｍａｂ）２、２分子のＦａｂフラグメントを化学的に架橋することにより得られる二重特異性Ｆ（ａｂ’）２、ｑｕａｄｒｏｍａ、ｂｓＤｂ（bispecific diabody）、ｓｃＢｓＤｂ（single-chain bispecific diabody）、ｓｃＢｓＴａＦｖ（single-chain bispecific tandem variable domain）、Ｂｉｔｅ(Bispecific T cell Engager antibody)、ＤＮＬ－Ｆ（ａｂ）３（docl-and-lock trivalent Fab）などが挙げられる（Shim, H. Bispecific Antibodies and Antibody-Drug COmjugates for Cancer Therapy: Technological Considerations. Biomolecules 2020, 10, 360）。
抗体は、二重特異性抗体でもよい。
二重特異性抗体としては、２分子のモノクローナル抗体を化学的に架橋することにより得られる二重特異性 （ｍａｂ）２、２分子のＦａｂフラグメントを化学的に架橋することにより得られる二重特異性Ｆ（ａｂ’）２、ｑｕａｄｒｏｍａ、ｂｓＤｂ（bispecific diabody）、ｓｃＢｓＤｂ（single-chain bispecific diabody）、ｓｃＢｓＴａＦｖ（single-chain bispecific tandem variable domain）、Ｂｉｔｅ(Bispecific T cell Engager antibody)、ＤＮＬ－Ｆ（ａｂ）３（docl-and-lock trivalent Fab）などが挙げられる（Shim, H. Bispecific Antibodies and Antibody-Drug COmjugates for Cancer Therapy: Technological Considerations. Biomolecules 2020, 10, 360）。
医薬組成物及び製剤
本発明の癌性腹膜炎の治療薬を含む医薬組成物及び製剤も本発明の範囲内に含まれる。
本発明の癌性腹膜炎の治療薬は、癌性腹膜炎の処置のために使用することができる。
本発明の癌性腹膜炎の治療薬を含む医薬組成物及び製剤も本発明の範囲内に含まれる。
本発明の癌性腹膜炎の治療薬は、癌性腹膜炎の処置のために使用することができる。
癌性腹膜炎とは、腹膜にがんが転移した病態である。癌性腹膜炎としては、特に限定されないが、癌性腹膜炎の起因となるがんに合併したものを挙げることができ、さらに具体的には、胃がん、膵臓がん、大腸がん、卵巣がん、胆道がん、肝臓がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）または小腸がんに合併したものを挙げることができる。癌性腹膜炎においては、腹腔内にがん細胞が散らばり、腹膜に砂粒状の腫瘤が多数生じ、腹水が溜まるようになる。
本発明の癌性腹膜炎の治療薬を含む医薬組成物及び製剤は、好ましくは、抗体に加え、生理学的に許容され得る希釈剤又はキャリアを含んでおり、他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。或いは、抗体は凍結乾燥（フリーズドライ）し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用してもよい。投与形態としては、腹腔内投与（腹腔内注など）による非経口投与を挙げることができる。
本発明の癌性腹膜炎の治療薬の投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、抗体の量として、成人に対して、１日約０．０１ｍｇ～１０００ｍｇであり、これらを１回、又は数回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、１回約０．０１ｍｇ～３０００ｍｇを腹腔内に投与することができる。
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
以下の実施例においては、国際公開ＷＯ２０１４／０７３６４１号公報の段落００９０及び００９１に記載されているＴｆＲ４３６抗体を使用した。
ＴｆＲ４３６抗体のＣＤＲ配列を以下に示す。
ＶＨ ＣＤＲ１：ＳＹＧＭＨ（配列番号１）
ＶＨ ＣＤＲ２：ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）
ＶＨ ＣＤＲ３：ＤＳＮＦＷＳＧＹＹＳＰＶＤＶ（配列番号３）
ＶＬ ＣＤＲ１：ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＳＶＱ（配列番号４）
ＶＬ ＣＤＲ２：ＹＥＤＴＱＲＰＳ（配列番号５）
ＶＬ ＣＤＲ３：ＱＳＹＤＳＡＹＨＷＶ（配列番号６）
ＶＨ ＣＤＲ１：ＳＹＧＭＨ（配列番号１）
ＶＨ ＣＤＲ２：ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）
ＶＨ ＣＤＲ３：ＤＳＮＦＷＳＧＹＹＳＰＶＤＶ（配列番号３）
ＶＬ ＣＤＲ１：ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＳＶＱ（配列番号４）
ＶＬ ＣＤＲ２：ＹＥＤＴＱＲＰＳ（配列番号５）
ＶＬ ＣＤＲ３：ＱＳＹＤＳＡＹＨＷＶ（配列番号６）
ＴｆＲ４３６抗体のＶＨ配列及びＶＬ配列を以下に示す。
ＴｆＲ４３６ ＶＨ(配列番号７)
ＤＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＰＦＫＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＧＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＳＮＦＷＳＧＹＹＳＰＶＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＴｆＲ４３６ ＶＨ(配列番号７)
ＤＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＰＦＫＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＧＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＳＮＦＷＳＧＹＹＳＰＶＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＴｆＲ４３６ ＶＬ(配列番号８)
ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＳＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＡＰＩＴＶＩＹＥＤＴＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＱＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＡＹＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＡＶＬ
ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＳＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＡＰＩＴＶＩＹＥＤＴＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＱＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＡＹＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＡＶＬ
実施例１：ＴｆＲ４３６抗体の結合部位の同定
ＴｆＲ４３６抗体はマウスＴｆＲと交差反応しないが、ハムスターＴｆＲと交差反応性を示した。ＴｆＲにおけるＴｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（ＴＦ）結合部位（５６９～７６０番目のアミノ酸）のアミノ酸配列のアライメントを行った。ヒトＴｆＲ配列において、ハムスターと同じ、マウスと異なるアミノ酸をピックアップした。ピックアップされたアミノ酸を図１に示されたようにｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎを行い、可溶性ＴｆＲ ｍｕｔａｎｔ ｆｒａｇｍｅｎｔを作製した。
ＴｆＲ４３６抗体はマウスＴｆＲと交差反応しないが、ハムスターＴｆＲと交差反応性を示した。ＴｆＲにおけるＴｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（ＴＦ）結合部位（５６９～７６０番目のアミノ酸）のアミノ酸配列のアライメントを行った。ヒトＴｆＲ配列において、ハムスターと同じ、マウスと異なるアミノ酸をピックアップした。ピックアップされたアミノ酸を図１に示されたようにｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎを行い、可溶性ＴｆＲ ｍｕｔａｎｔ ｆｒａｇｍｅｎｔを作製した。
（１）可溶性ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ＴｆＲ（ｓＴｆＲ）及びＴｆＲ ｍｕｔａｎｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＭＦ１～ＭＦ７）の作製
ヒトＴｆＲ細胞外ｄｏｍａｉｎ（８９～７６０番目のアミノ酸）、あるいは図１に示されたそれぞれＴｆＲ ｍｕｔａｎｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＭＦ１～ＭＦ７）とＡＡＡＲＧＧＰＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＳＡＶＤＨＨＨＨＨＨ（配列番号１０）をコードする塩基配列を全合成した。発現ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡＧＧＳ（非特許文献２．：Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ． １９９１）にネオマイシン耐性遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子を組み込んだベクターのマルチクローニングサイトにそれぞれ合成した遺伝子を挿入し、ｐＣＡＧＧＳ－Ｎｅｏ－ＤＨＦＲ－ｓＴＦＲ－ｍｙｃ－ｈｉｓ発現ｐｌａｓｍｉｄを作製した。Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥｘｐｉ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に上記ｐｌａｓｍｉｄをトランスフェクションし、３７℃、８％ＣＯ２、１３５ｒｐｍで５日間培養した。その後遠心により培養上清を回収し、ＡＫＴＡ ｐｒｉｍｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にＨｉｓＴｒａｐＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを接続し、結合バッファーに２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ／ＤＰＢＳ、溶出バッファーに５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ／ＤＰＢＳを用いてｓＴｆＲあるいはＭＦ１～ＭＦ７を精製した。溶出したタンパク質はＺｅｂａ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ （Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５％ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、ｐＨ７．２にバッファー交換した。
ヒトＴｆＲ細胞外ｄｏｍａｉｎ（８９～７６０番目のアミノ酸）、あるいは図１に示されたそれぞれＴｆＲ ｍｕｔａｎｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＭＦ１～ＭＦ７）とＡＡＡＲＧＧＰＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＳＡＶＤＨＨＨＨＨＨ（配列番号１０）をコードする塩基配列を全合成した。発現ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡＧＧＳ（非特許文献２．：Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ． １９９１）にネオマイシン耐性遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子を組み込んだベクターのマルチクローニングサイトにそれぞれ合成した遺伝子を挿入し、ｐＣＡＧＧＳ－Ｎｅｏ－ＤＨＦＲ－ｓＴＦＲ－ｍｙｃ－ｈｉｓ発現ｐｌａｓｍｉｄを作製した。Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥｘｐｉ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に上記ｐｌａｓｍｉｄをトランスフェクションし、３７℃、８％ＣＯ２、１３５ｒｐｍで５日間培養した。その後遠心により培養上清を回収し、ＡＫＴＡ ｐｒｉｍｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にＨｉｓＴｒａｐＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを接続し、結合バッファーに２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ／ＤＰＢＳ、溶出バッファーに５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ／ＤＰＢＳを用いてｓＴｆＲあるいはＭＦ１～ＭＦ７を精製した。溶出したタンパク質はＺｅｂａ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ （Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５％ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、ｐＨ７．２にバッファー交換した。
（２）ＴｆＲ４３６抗体の結合部位の同定
上記精製したｓＴｆＲあるいはＭＦ１～ＭＦ７をＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ２０，ＴａＫａＲａ） にて希釈し、６００ｎｇ／ｍＬから３倍希釈で７段階に調製した。その後Ｎｉ－ＮＴＡ ＨｉｓＳｏｒｂ Ｓｔｒｉｐｓ ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ）に希釈液を１００μＬ／ｗｅｌｌに分注し、シェーカーに乗せ、室温で反応させた。１時間後ＰＢＳＴ Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄し、ＴｆＲ４３６抗体（１ｕｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ｗｅｌｌに分注し、シェーカーに乗せ、室温で１時間反応させた。その後、ＰＢＳ－Ｔ Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄し、５０，０００倍希釈した二次抗体Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１００μＬ／ｗｅｌｌに分注し室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴ Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄後ＴＭＢ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）（Ｓｃｙ Ｔｅｋ）を１００μＬ／ｗｅｌｌに分注し、室温、暗所で３分間反応させた後、ＴＭＢ Ｓｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｃｙ Ｔｅｋ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、１分間シェーカーで振とうさせ、プレートリーダーで４５０ｎ（ｒｅｆ．６２０ｎｍ）の吸光度を測定した。
上記精製したｓＴｆＲあるいはＭＦ１～ＭＦ７をＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ２０，ＴａＫａＲａ） にて希釈し、６００ｎｇ／ｍＬから３倍希釈で７段階に調製した。その後Ｎｉ－ＮＴＡ ＨｉｓＳｏｒｂ Ｓｔｒｉｐｓ ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ）に希釈液を１００μＬ／ｗｅｌｌに分注し、シェーカーに乗せ、室温で反応させた。１時間後ＰＢＳＴ Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄し、ＴｆＲ４３６抗体（１ｕｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ｗｅｌｌに分注し、シェーカーに乗せ、室温で１時間反応させた。その後、ＰＢＳ－Ｔ Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄し、５０，０００倍希釈した二次抗体Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１００μＬ／ｗｅｌｌに分注し室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴ Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄後ＴＭＢ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）（Ｓｃｙ Ｔｅｋ）を１００μＬ／ｗｅｌｌに分注し、室温、暗所で３分間反応させた後、ＴＭＢ Ｓｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｃｙ Ｔｅｋ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、１分間シェーカーで振とうさせ、プレートリーダーで４５０ｎ（ｒｅｆ．６２０ｎｍ）の吸光度を測定した。
結果は図２に示すように、ＴｆＲ４３６抗体はＴｆＲ ｍｕｔａｎｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＭＦ５との反応性低下がみられたが、その他のｍｕｔａｎｔ ｆｒａｇｍｅｎｔとの反応性の低下は見られなかった。つまり、ＴｆＲの６２９番目、６３０番目、６３３番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換すると、ＴｆＲ４３６抗体がＴｆＲと認識できなくなる。アミノ酸６２９番目～６３３番目はＴｆＲ４３６抗体の認識エピトープであることが示唆された。
実施例２：Ｔｆ－ＴｆＲ結合阻害におけるＴｆＲ４３６抗体及び比較用抗体の比較
（１）比較用抗体Ａ２４の作製
特許文献ＵＳ２００８／０１９３４５３にヒトＴｆＲに対するＡ２４抗体が記載されている。ＴｆＲ４３６抗体とこの抗体を比較するため、寄託されたＨｙｂｒｉｄｏｍａを入手し、抗体を生産した。具体的には、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ をＲＰＭＩ１６４０ （ＧＩＢＣＯ）、ＦＢＳ１０％の培地に細胞濃度が１～２ｘ１０５／ｍＬになるようにまきこみ、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。拡大培養後、遠心により細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄後無血清培地ｃｏｓｍｅｄｉｕｍ００５ （コスモバイオ）、０．５％ Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ－ＣＳ （Ｒｏｃｈｅ）にてさらに５５０ｍＬになるまで拡大培養した。細胞がコンフルエントになってから５日後に遠心により培養上清を回収した。
（１）比較用抗体Ａ２４の作製
特許文献ＵＳ２００８／０１９３４５３にヒトＴｆＲに対するＡ２４抗体が記載されている。ＴｆＲ４３６抗体とこの抗体を比較するため、寄託されたＨｙｂｒｉｄｏｍａを入手し、抗体を生産した。具体的には、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ をＲＰＭＩ１６４０ （ＧＩＢＣＯ）、ＦＢＳ１０％の培地に細胞濃度が１～２ｘ１０５／ｍＬになるようにまきこみ、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。拡大培養後、遠心により細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄後無血清培地ｃｏｓｍｅｄｉｕｍ００５ （コスモバイオ）、０．５％ Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ－ＣＳ （Ｒｏｃｈｅ）にてさらに５５０ｍＬになるまで拡大培養した。細胞がコンフルエントになってから５日後に遠心により培養上清を回収した。
回収された上清をプロテインＡ担体（Ａｂ－Ｃａｐｃｈｅｒ ＥｘＴｒａ：プロテノバ社）にアプライし、プロテインＡ と結合している抗体を０．１ Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ ２．７）で溶出し、速やかに１Ｍ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ ８．５）で中和した。その後ウルトラセル限外ろ過ディスク（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳにバッファー交換を行った。
（２）Ｔｆ－ＴｆＲ結合阻害におけるＴｆＲ４３６抗体及び他社抗体の比較
実施例１に記載されたｓＴｆＲをＰＢＳＴにて５．０μｇ／ｍＬになるように調整し、ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に希釈液を１００μＬ／ｗｅｌｌに分注して４℃で一晩静置し固相化した。翌日に固相液を捨て、１００％ブロックエース（ＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）２００μＬ／ｗｅｌｌで室温静置しブロッキングした。１時間後ＰＢＳＴ Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄後、ＨＲＰ標識したＴｆ（２ｕｇ／ｍＬ）５０μＬ／ｗｅｌｌを分注し、更にＴｆＲ４３６抗体、Ａ２４抗体（１０μｇ／ｍＬから２倍希釈系列）またはｈｏｌｏ－Ｔｆ（Ｓｉｇｍａ）３００μｇ／ｍＬから２倍希釈系列）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。室温で１時間反応させた後、ＰＢＳＴ Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄し、ＴＭＢ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を１００μＬ／ｗｅｌｌに分注し、室温暗所で反応させた。２５分間後、ＴＭＢ Ｓｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、１分間シェーカーで震とうさせた、プレートリーダーで４５０ｎｍ （ｒｅｆ．６２０ｎｍ）の吸光度を測定した。
実施例１に記載されたｓＴｆＲをＰＢＳＴにて５．０μｇ／ｍＬになるように調整し、ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に希釈液を１００μＬ／ｗｅｌｌに分注して４℃で一晩静置し固相化した。翌日に固相液を捨て、１００％ブロックエース（ＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）２００μＬ／ｗｅｌｌで室温静置しブロッキングした。１時間後ＰＢＳＴ Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄後、ＨＲＰ標識したＴｆ（２ｕｇ／ｍＬ）５０μＬ／ｗｅｌｌを分注し、更にＴｆＲ４３６抗体、Ａ２４抗体（１０μｇ／ｍＬから２倍希釈系列）またはｈｏｌｏ－Ｔｆ（Ｓｉｇｍａ）３００μｇ／ｍＬから２倍希釈系列）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。室温で１時間反応させた後、ＰＢＳＴ Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄し、ＴＭＢ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を１００μＬ／ｗｅｌｌに分注し、室温暗所で反応させた。２５分間後、ＴＭＢ Ｓｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、１分間シェーカーで震とうさせた、プレートリーダーで４５０ｎｍ （ｒｅｆ．６２０ｎｍ）の吸光度を測定した。
結果は図３に示すように、ＴｆＲ４３６抗体は遥かに低い用量で（１００ｎｇ／ｍＬ）完全にＴｆ－ＴｆＲの結合を阻害した。一方、Ａ２４抗体は１０ μｇ／ｍＬの用量でも完全にＴｆ－ＴｆＲの結合を阻害できず、Ｔｆ－ＴｆＲの結合を５０％しか阻害できなかった。Ｔｆ－ＴｆＲの結合阻害において、ＴｆＲ４３６抗体が優れていることが示唆された。
実施例３：癌性腹膜炎患者検体におけるＴｆＲの発現（患者病理標本の免疫染色）
胃癌原発の癌性腹膜炎患者より採取された原発巣および腹膜播種巣の腫瘍組織におけるＴｆＲ１の発現を免疫染色による検討した。腫瘍組織スライドを脱パラフィン処理し、ｐＨ ６．０賦活バッファー中で１２１℃ １５分オートクレーブによる抗原賦活を実施した。０．３％ Ｈ２Ｏ２水で内在性ペルオキシダーゼ処理後、一次抗体（０．４μｇ／ｍＬ Ａｎｔｉ ＴＦＲＣ Ｒａｂｂｉｔ， ＡＴＬＡＳ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ， ＨＰＡ０２８５９８）を４℃ 一晩で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ポリマー試薬（ヒストファインシンプルステインＭＡＸ－ＰＯ ＭＵＬＴＩ， ニチレイ，４２４１５２）を室温で３０分反応させ、ＰＢＳで洗浄後、ＤＡＢ試薬（ヒストファインシンプルステイン ＤＡＢ， ニチレイ， ４１５１７２）で発色させた。ヘマトキシリンで核染色後、脱水、透徹、封入を行い、免疫染色標本とした。
胃癌原発の癌性腹膜炎患者より採取された原発巣および腹膜播種巣の腫瘍組織におけるＴｆＲ１の発現を免疫染色による検討した。腫瘍組織スライドを脱パラフィン処理し、ｐＨ ６．０賦活バッファー中で１２１℃ １５分オートクレーブによる抗原賦活を実施した。０．３％ Ｈ２Ｏ２水で内在性ペルオキシダーゼ処理後、一次抗体（０．４μｇ／ｍＬ Ａｎｔｉ ＴＦＲＣ Ｒａｂｂｉｔ， ＡＴＬＡＳ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ， ＨＰＡ０２８５９８）を４℃ 一晩で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ポリマー試薬（ヒストファインシンプルステインＭＡＸ－ＰＯ ＭＵＬＴＩ， ニチレイ，４２４１５２）を室温で３０分反応させ、ＰＢＳで洗浄後、ＤＡＢ試薬（ヒストファインシンプルステイン ＤＡＢ， ニチレイ， ４１５１７２）で発色させた。ヘマトキシリンで核染色後、脱水、透徹、封入を行い、免疫染色標本とした。
その結果、図４に示すように、胃癌患者原発巣由来の腫瘍組織（図４Ａ）および腹膜播種巣腫瘍組織（図４Ｂ）ともにＴｆＲの発現が確認された。
実施例４：胃癌細胞株ＭＫＮ４５－Ｌｕｃ腹膜播種モデルによる抗腫瘍効果
胃癌細胞株ＭＫＮ４５－Ｌｕｃ腹膜播種モデルを用いてＴｆＲ４３６抗体の抗腫瘍効果を検討した。
ＭＫＮ４５－Ｌｕｃ細胞株（ＪＣＲＢ１３７９）を培養液（ＲＰＭＩ－１６４０，１０％ＦＢＳ，１％ Ｐ／Ｓ）で培養した。培養液を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて細胞を剥離した。培養液を添加して細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄後、再度ＰＢＳに懸濁し、０．４％トリパンブルーを使用して細胞数をカウントした。カウント後、細胞濃度が１×１０７／ｍＬになるようＰＢＳで調製した。この細胞懸濁液を１ｍＬツベルクリンシリンジに吸い上げて二段針を装着し、Ｃ．Ｂ－１７／ＩｃｒＨｓｄ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ マウス（雌、入荷時６週令）２０匹の腹腔に ２００μＬ／匹を移植した。移植細胞数は２×１０６個／匹である。
胃癌細胞株ＭＫＮ４５－Ｌｕｃ腹膜播種モデルを用いてＴｆＲ４３６抗体の抗腫瘍効果を検討した。
ＭＫＮ４５－Ｌｕｃ細胞株（ＪＣＲＢ１３７９）を培養液（ＲＰＭＩ－１６４０，１０％ＦＢＳ，１％ Ｐ／Ｓ）で培養した。培養液を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて細胞を剥離した。培養液を添加して細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄後、再度ＰＢＳに懸濁し、０．４％トリパンブルーを使用して細胞数をカウントした。カウント後、細胞濃度が１×１０７／ｍＬになるようＰＢＳで調製した。この細胞懸濁液を１ｍＬツベルクリンシリンジに吸い上げて二段針を装着し、Ｃ．Ｂ－１７／ＩｃｒＨｓｄ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ マウス（雌、入荷時６週令）２０匹の腹腔に ２００μＬ／匹を移植した。移植細胞数は２×１０６個／匹である。
移植３日後にルシフェリン５００μｇを腹腔投与して移植細胞の発光を測定した。移植マウス２０匹のうち、発光の検出により移植細胞の生着が確認された１７匹を使用して、発光強度による群分け（コントロール群８匹、抗体投与群９匹）を実施した。その後、１週間に１回の間隔で合計４回、薬剤の腹腔投与を実施した。コントロール群にはＰＢＳ、抗体投与群はＴｆＲ４３６抗体１５ｍｇ／ｋｇを投与した。
試験期間中マウスの観察を行い、生死判定を実施した。移植後７７日に試験終了とし、マウスの生存時間による統計解析を実施した。その結果、ＴｆＲ４３６抗体投与群にはコントロール群との比較によりＬｏｇ－Ｒａｎｋ（ｐ＝０．０００２）およびＷｉｌｃｏｘｏｎ（ｐ＝０．０００４）の有意な延命効果が確認された（図５）。また、試験終了時に生存していたＴｆＲ４３６抗体投与群マウス７匹の腹腔には、腫瘤の形成が確認された。これを採取して病理標本を作製したところ、腫瘤には広範囲に壊死が認められ、増殖能を保持する腫瘍細胞は、腫瘤表面および血管周囲のわずかな領域のみに残存が確認された（図６）。
実施例５：膵癌細胞株ＳＵＩＴ－２腹膜播種モデルによる抗腫瘍効果の検討
ＳＵＩＴ－２細胞株（ＪＣＲＢ１０９４）を培養液（ＥＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，１％ Ｐ／Ｓ）で培養した。培養液を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて細胞を剥離した。培養液を添加して細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄後、再度ＰＢＳに懸濁し、０．４％トリパンブルーを使用して細胞数をカウントした。カウント後、細胞濃度が１×１０７／ｍＬになるようＰＢＳで調製した。この細胞懸濁液を１ｍＬツベルクリンシリンジに吸い上げて二段針を装着し、Ｃ．Ｂ－１７／ＩｃｒＨｓｄ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ マウス（雌、入荷時６週令）３０匹の腹腔に ２００μＬ／匹を移植した。移植細胞数は２×１０６個／匹である。
ＳＵＩＴ－２細胞株（ＪＣＲＢ１０９４）を培養液（ＥＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，１％ Ｐ／Ｓ）で培養した。培養液を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて細胞を剥離した。培養液を添加して細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄後、再度ＰＢＳに懸濁し、０．４％トリパンブルーを使用して細胞数をカウントした。カウント後、細胞濃度が１×１０７／ｍＬになるようＰＢＳで調製した。この細胞懸濁液を１ｍＬツベルクリンシリンジに吸い上げて二段針を装着し、Ｃ．Ｂ－１７／ＩｃｒＨｓｄ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ マウス（雌、入荷時６週令）３０匹の腹腔に ２００μＬ／匹を移植した。移植細胞数は２×１０６個／匹である。
本モデルは移植後の細胞生着率は１００％であるため（予備試験の結果より）、細胞移植４日後に体重による無作為割り付け（コントロール群、抗体投与群、ｎ＝１０）を実施した。その後１週間に１回の間隔で合計２回、薬剤の腹腔投与を実施した。コントロール群にはＰＢＳ、抗体投与群はＴｆＲ４３６抗体１５ｍｇ／ｋｇを投与した。試験期間中はマウス体重測定と観察を行い、コントロール群マウスに、腹膜播種腫瘍増加に伴う全身状態の悪化が確認された移植１７日後を試験終了とした。両群のマウスを安楽死後、腹水採取および腹腔中腫瘤の観察を実施した。腹水の重量についてコントロール群とＴｆＲ４３６抗体投与群の比較をｔ検定により実施した。腹水重量の測定結果を図７に示す。その結果、ＴｆＲ４３６抗体投与群にはＰ＝０.０００５の有意な腹水重量の減量が確認された。また腹腔中腫瘤の観察においては、コントロール群の腸間膜上に複数の腫瘤形成が認められたが、ＴｆＲ４３６抗体投与群では、４匹に1～２個の腫瘤が認められたものの、６匹には明瞭な腫瘤形成は観察されなかった。
実施例６：膵癌細胞株ＳＵＩＴ２腹膜播種モデルの延命効果
ＳＵＩＴ－２細胞株（ＪＣＲＢ１０９４）を培養液（ＥＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，１％ Ｐ／Ｓ）で培養した。培養液を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて細胞を剥離した。培養液を添加して細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄後、再度ＰＢＳに懸濁し、０．４％トリパンブルーを使用して細胞数をカウントした。カウント後、細胞濃度が１×１０７／ｍＬになるようＰＢＳで調製した。この細胞懸濁液を１ｍＬツベルクリンシリンジに吸い上げて二段針を装着し、Ｃ．Ｂ－１７／ＩｃｒＨｓｄ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ マウス（雌、入荷時７週令）２５匹の腹腔に ２００μＬ／匹を移植した。移植細胞数は２×１０６個／匹である。
ＳＵＩＴ－２細胞株（ＪＣＲＢ１０９４）を培養液（ＥＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，１％ Ｐ／Ｓ）で培養した。培養液を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて細胞を剥離した。培養液を添加して細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄後、再度ＰＢＳに懸濁し、０．４％トリパンブルーを使用して細胞数をカウントした。カウント後、細胞濃度が１×１０７／ｍＬになるようＰＢＳで調製した。この細胞懸濁液を１ｍＬツベルクリンシリンジに吸い上げて二段針を装着し、Ｃ．Ｂ－１７／ＩｃｒＨｓｄ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ マウス（雌、入荷時７週令）２５匹の腹腔に ２００μＬ／匹を移植した。移植細胞数は２×１０６個／匹である。
本モデルは移植後の細胞生着率は１００％であるため（予備試験の結果より）、細胞移植４日後に体重による無作為割り付け（コントロール群、抗体腹腔内投与群、抗体静脈内投与群、ｎ＝８）を実施した。その後１週間に１回の間隔で合計２回、コントロール群にはＰＢＳ、抗体投与群はＴｆＲ４３６ １５ｍｇ／ｋｇを投与した。細胞移植から５５日後までマウス体重測定と全身状態の観察を行った。腫瘍増加に伴う全身状態の悪化（過度の腹水貯留、貧血、衰弱）が確認された時点で安楽死させ、細胞移植から安楽死までの日数を生存期間とした。移植５５日後の生存期間についてＬｏｇ－Ｒａｎｋ解析を行った結果、ＰＢＳ群に対し、ＴｆＲ４３６投与群では、腹腔投与群 （ｐ＝０．０００３）、静脈投与群（ｐ＝０．００７）の有意な延命効果が確認され、腹腔投与の薬効が優位であった（図８）。
実施例７：患者検体のＴｆＲ発現解析
下記表に示すがん患者の検体を用いて、実施例３と同様に方法により、腹膜播種腫瘍のみの免疫染色により、ＴｆＲ発現状態を解析した。判定基準は表１に示す。
下記表に示すがん患者の検体を用いて、実施例３と同様に方法により、腹膜播種腫瘍のみの免疫染色により、ＴｆＲ発現状態を解析した。判定基準は表１に示す。
結果を表２及び図９に示す。
Claims (10)
- トランスフェリンレセプターを認識する抗体を含む、癌性腹膜炎の治療薬。
- トランスフェリンレセプターを認識する抗体が、ヒトトランスフェリンレセプターを認識する抗体である、請求項１に記載の癌性腹膜炎治療薬。
- ヒトトランスフェリンレセプターを認識する抗体が、ヒトトランスフェリンレセプターの６２９番目～６３３番目のアミノ酸を認識する抗体である、請求項２に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
- 前記抗体が、重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体である、請求項１から３の何れか一項に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
- 前記抗体が、重鎖が配列番号７を有し、軽鎖が配列番号８を有する抗体である、請求項１から４の何れか一項に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
- 抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項１から５の何れか一項に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
- 抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、ジスルフィド安定化V領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、請求項１から６の何れか一項に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
- 癌性腹膜炎が、癌性腹膜炎の起因となるがんに合併したものである、請求項１から７の何れか一項に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
- 癌性腹膜炎が、胃がん、膵臓がん、大腸がん、卵巣がん、胆道がん、肝臓がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）または小腸がんに合併したものである、請求項１から８の何れか一項に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
- 腹腔内投与される、請求項１から９の何れか一項に記載の癌性腹膜炎の治療薬。
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