WO2021095829A1 - オリゴヌクレオチドの検出又は定量方法 - Google Patents

オリゴヌクレオチドの検出又は定量方法 Download PDF

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WO2021095829A1
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oligonucleotide
poly
target
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雅子 大澤
綾 大江
風和 小川
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積水メディカル株式会社
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    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting or quantifying an oligonucleotide having high sensitivity and excellent quantification.
  • the present invention relates to a method for highly sensitive detection and quantification of oligonucleotides and DNA in which the nucleobase at the 3'end is chemically modified.
  • the PALSAR method is known as a technique for amplifying and detecting oligonucleotides such as nucleic acids and DNA.
  • the principle of the PALSAR method is to use a set of DNA probes (sometimes referred to as self-aggregating probes in the present specification) consisting of three complementary regions prepared in advance, and label the probes. By repeating the self-agglutination reaction by hybridization, a large network-like DNA mass is formed, which is used as an amplification signal. By binding this large chunk of DNA to the DNA or RNA to be detected, the amplified signal is captured to detect and quantify the DNA or RNA to be detected.
  • the method of detecting a detection target such as microRNA by the PALSAR method includes the following steps.
  • a step of adding poly A to the 3'end of micro RNA with a poly A polymerase then a step of reacting a capture probe with the micro RNA to which poly A is added to capture, and a step of capturing micros captured by the capture probe.
  • This is a method including a step of reacting RNA with a self-aggregating probe to form a detection complex containing microRNA, a capture probe, and a probe polymer, and a detection step (Patent Document 1).
  • the poly A polymerase is generally known to be Mg 2+ or Mn 2+ requirement
  • Non-Patent Document 1 states that the primer RNA (Escherichia coli K12) when Mg 2+ or Mn 2+ is added at each concentration.
  • Fig. 3 The amount of AMP uptake into strain tRNA is shown graphically (Fig. 3). According to this figure, in the absence of Mg 2+ or Mn 2+ , the poly A polymerase shows no activity, Mn 2+ shows the maximum activity at 2.5 mM, and Mg 2+ shows the maximum activity at 10 mM. Furthermore, when both metal ions are added together at the concentrations showing their maximum activity (Mn 2+ 2.5 mM and Mg 2+ 10 mM), the further highest activity of the poly A polymerase is obtained. Is disclosed (Fig. 3B).
  • the detection sensitivity can hardly be obtained under the reaction conditions of the conventional poly A polymerase. Therefore, the biological sample such as plasma or midbrain Increasing the detection sensitivity in plasma is a more difficult task.
  • the present invention enhances the reactivity of a poly A polymerase to an oligonucleotide or DNA in which a 3'-terminal nucleic acid base is chemically modified, as used in nucleic acid medicine, and thus an oligo in which the 3'-terminal nucleic acid base is chemically modified.
  • a method of detecting an oligonucleotide by a step of adding a poly A to the 3'end of the oligonucleotide with a poly A polymerase, then capturing it with a capture probe, and amplifying it by a PALSAR method or the like, using a nucleotide or DNA as a detection target.
  • the present invention has the following configuration.
  • One of the above methods (I) A step of contacting a target oligonucleotide in a sample with a poly A polymerase in the presence of Mn 2+. (2) A method for recovering a target oligonucleotide in a sample, which comprises the following steps, wherein the target oligonucleotide is an oligonucleotide or DNA in which the nucleobase at the 3'end is chemically modified.
  • a step of contacting a target oligonucleotide in a sample with a poly A polymerase in the presence of Mn 2+ to add poly A to the 3'end of the target oligonucleotide (ii) Capturing the target oligonucleotide in the sample. Step of contacting and hybridizing capture probes for Here, the capture probe is (A) Nucleic acid probe and (B) Containing a solid phase or an adapter or linker adjacent to the 3'end or 5'end nucleotide of the nucleic acid probe.
  • the nucleic acid probe contains the entire sequence or a partial sequence of the target oligonucleotide (iii) A step of recovering a hybridization product contained in the sample.
  • a method for detecting a target oligonucleotide in a sample which comprises the following steps, wherein the target oligonucleotide is an oligonucleotide or DNA in which the nucleobase at the 3'end is chemically modified.
  • the target oligonucleotide is an oligonucleotide or DNA in which the nucleobase at the 3'end is chemically modified.
  • the capture probe is (A) Nucleic acid probe and (B) Containing a solid phase or an adapter or linker adjacent to the 3'end or 5'end nucleotide of the nucleic acid probe.
  • the nucleic acid probe contains the entire sequence or a partial sequence of the target oligonucleotide (iii) A step of recovering a hybridization product contained in the sample. (iv) A step of detecting the recovered hybridization product.
  • a method for detecting a target oligonucleotide in a sample which comprises the following steps, wherein the target oligonucleotide is an oligonucleotide or DNA in which the nucleobase at the 3'end is chemically modified.
  • the target oligonucleotide is an oligonucleotide or DNA in which the nucleobase at the 3'end is chemically modified.
  • the capture probe is (A) Nucleic acid probe and (B) Containing a solid phase or an adapter or linker adjacent to the 3'end or 5'end nucleotide of the nucleic acid probe.
  • the hybridization probe contains the entire sequence or a partial sequence of the target oligonucleotide (iii) A pair of self-aggregable signal amplifications consisting of the first and second oligonucleotides on the hybridization product contained in the sample.
  • a step of contacting a probe for forming a complex of the hybridization product with an oligonucleotide polymer obtained by self-aggregating the first and second oligonucleotides iv).
  • a step of detecting the complex (5) The detection method according to (4), wherein at least one of the first and second oligonucleotides contains a poly T sequence.
  • the complex forming step of (iv) above includes a step of contacting with an assist probe.
  • the assist probe Includes a poly T sequence and a sequence complementary to at least one full or partial sequence of the first or second oligonucleotide.
  • the first oligonucleotide contains at least nucleic acid region X, nucleic acid region Y, and nucleic acid region Z or nucleic acid region Z containing a poly T sequence in order from the 5'terminal side.
  • the second oligonucleotide is complementary to at least the nucleic acid region X'complementary to the nucleic acid region X, the nucleic acid region Y'complementary to the nucleic acid region Y, and the nucleic acid region Z in order from the 5'terminal side.
  • the detection method according to any one of (4) to (6), which comprises a nucleic acid region Z'or a nucleic acid region Z'containing a poly A sequence.
  • Oligonucleotides in which the nucleobase at the 3'end is chemically modified are LNA, BNA, phosphorothioate, morpholinooligo, boranophosphate, 2'-O-methylated RNA (2'-OMe), 2'-.
  • the method according to (9), wherein the oligonucleotide in which the nucleobase at the 3'end is chemically modified is LNA, BNA, MOE, or OMe.
  • the first oligonucleotide contains at least nucleic acid region X, nucleic acid region Y and nucleic acid region Z or poly T sequence from the 5'end side.
  • the second oligonucleotide is complementary to at least the nucleic acid region X'complementary to the nucleic acid region X, the nucleic acid region Y'complementary to the nucleic acid region Y, and the nucleic acid region Z in order from the 5'terminal side.
  • the kit according to (12) which comprises a nucleic acid region Z'or a nucleic acid region Z'containing a poly A sequence.
  • the first oligonucleotide contains at least nucleic acid region X, nucleic acid region Y and nucleic acid region Z or nucleic acid region Z containing a poly T sequence in order from the 5'end side. From the 5'end side, the second oligonucleotide has at least a nucleic acid region X'complementary to the nucleic acid region X, a nucleic acid region Y'complementary to the nucleic acid region Y, and a nucleic acid complementary to the nucleic acid region Z.
  • the pair of probes comprising region Z'or nucleic acid region Z'containing a poly A sequence.
  • the present invention it is possible to enhance the reactivity of the reaction of adding poly A with poly A polymerase to an oligonucleotide and DNA in which the nucleobase at the 3'end is chemically modified.
  • FIG. 5 is a conceptual diagram showing the basic steps of polyadenylation of a target oligonucleotide and then detection by the PALSAR method.
  • FIG. 5 is a conceptual diagram showing a basic step when an assist probe is used in the step of polyadenylating a target oligonucleotide and then detecting it by the PALSAR method.
  • the concentration and measurement sensitivity of the target oligonucleotide (Target-1) when the concentration of Mn 2+ in the polyadenylation reaction solution is 17.5 mM. It is a graph which shows the relationship of (Example 3). A graph showing the relationship between the SN ratios of each concentration of the target oligonucleotide when the target oligonucleotide Target-1 in the mouse 100% plasma matrix was subjected to a polyadenylation reaction using the buffer of Example 3 and the buffer of Comparative Example 3. Is.
  • Target oligonucleotides Target-3 (3'end BNA-NC (N-Me)), Target-4 (3'end MOE), Target-5 (3'end OMe), Target-6 (3'end BNA-NC (N-Me)) in 100% mouse plasma matrix
  • Mn 2+ buffer Example 6
  • Mg 2+ buffer Comparative Example 6
  • This is a test result confirming the effect of Mn 2+ when performing a polyadenylation reaction of the target oligonucleotide Target-2 (3'terminal LNA) in a mouse 2% (20 mg / mL) brain matrix, and is the concentration of Target-2.
  • Example 7-1 Is a graph showing the result of the MFI and SN ratio when the concentration is 0.1 fmol (Example 7-1).
  • the effect of Mg 2+ was also confirmed for comparison (Comparative Example 7-1).
  • This is a test result confirming the effect of Mn 2+ when performing a polyadenylation reaction of the target oligonucleotide Target-2 (3'terminal LNA) in a mouse 4% (40 mg / mL) brain matrix, and is the concentration of Target-2.
  • the effect of Mg 2+ was also confirmed for comparison (Comparative Example 7-2).
  • the first aspect of the present invention is a reaction of adding poly A to a target oligonucleotide.
  • an oligonucleotide or DNA in which the 3'end nucleobase is chemically modified in a sample is brought into contact with a poly A polymerase (polynucleotide adenyl transferase) to chemically modify the 3'end nucleobase.
  • a poly A polymerase polynucleotide adenyl transferase
  • the poly A polymerase means a protein having an enzymatic activity that introduces an adenine residue into the 3'end of single-stranded or double-stranded RNA or DNA.
  • E. coli-derived poly A polymerase is preferably used.
  • the target oligonucleotide can be polyadenylated by contacting the poly A polymerase and adenosine triphosphate (ATP) under the active conditions of the poly A polymerase.
  • the length of the poly A introduced in the present invention is not limited, but for example, as the lower limit, 4 mer or more is preferable, 10 mer or more is more preferable, and 15 mer or more is even more preferable.
  • the upper limit is preferably 1000 mer or less.
  • the poly A polymerase is preferably inactivated by heat or the like after the addition reaction. Unless otherwise specified, polyA addition, polyadenylation, and polyA polymerase reaction are used interchangeably in the present specification.
  • a second aspect of the present invention is a method for recovering an oligonucleotide or DNA (hereinafter, may be simply referred to as a target oligonucleotide) in which a nucleobase at the 3'end is chemically modified.
  • the present invention includes the following steps (i) to (iii). (i) is the same as the poly A addition reaction, and is a step of contacting the target oligonucleotide in the sample with the poly A polymerase in the presence of Mn 2+ to add poly A to the 3'end of the target oligonucleotide. ..
  • (ii) is a step of contacting the sample with a capture probe for capturing the target oligonucleotide and hybridizing the sample.
  • the capture probe includes (A) a nucleic acid probe and (B) a solid phase or an adapter or a linker adjacent to a nucleotide at the 3'end or 5'end of the nucleic acid probe.
  • the nucleic acid probe contains the entire sequence or a partial sequence of the target oligonucleotide
  • (iii) is a step of recovering the hybridization product of the target oligonucleotide and the capture probe contained in the sample. The preparation of the Mn 2+ concentration in the poly A addition reaction will be described later.
  • a third aspect of the present invention is a method for detecting a target oligonucleotide, which comprises steps (i) to (iv). (I) to (iii) are the same steps as in the second aspect, and (iv) is a step of detecting the recovered hybridization product. The detection method will be described later.
  • a fourth aspect of the present invention is a method for detecting a target oligonucleotide by the pulsar method, which comprises steps (i) to (iv).
  • steps (i) to (ii) are the same steps as in the second aspect.
  • a pair of self-aggregating probes consisting of first and second oligonucleotides are brought into contact with the hybridization product, and the hybridization product and the first and second oligonucleotides are self-sustaining. This is a step of forming a complex with an agglomerated oligonucleotide polymer.
  • (Iv) is a step of detecting the complex.
  • the steps (iii) and (iv) are the so-called PALSAR method (pulsar method), which is a step of amplifying the self-aggregating probe and detecting the amplified signal.
  • PALSAR method pulsesar method
  • the self-aggregating probes consisting of the first and second oligonucleotides of the present invention preferably contains a poly T sequence.
  • the assist probe is a sequence complementary to the poly T sequence and at least one of the first or second oligonucleotide, whichever is the entire sequence or a partial sequence. Is preferably included. Specific steps of the PALSAR method, an assist probe, and a self-aggregating probe will be described later.
  • the present invention is suitable for detecting nucleic acid drugs, which have been attracting particular attention and being actively developed in recent years as new molecular-targeted drugs. Since almost all products of nucleic acid drugs use nucleic acids with some modification in order to control their degradation in the body, the detection technique of the present invention is preferably applied.
  • a Gapmer-structured antisense nucleic acid drug known for its "artificial nucleic acid-DNA-artificial nucleic acid" structure can be mentioned.
  • the target oligonucleotide to be detected in the present invention is an oligonucleotide or DNA in which the nucleobase at the 3'end is chemically modified, and the chemical modification includes, for example, phosphorothioate modification (S conversion), 2 '-F modification, 2'-O-Methyl (2'-OMe) modification, 2'-O-Methoxythyl (2'-MOE) modification, morpholino modification, LNA modification, BNA COC modification, BNA NC modification, ENA modification, Examples include cEt BNA modification.
  • LNA, BNA, phosphorothionate, morpholinooligo, boranophosphate, and 2'-O-methylated RNA are examples of oligonucleotides in which the 3'-terminal nucleobase is chemically modified.
  • 2'-O-methoxyethylated RNA 2'-MOE
  • 2'-F more preferably LNA, BNA, MOE or OMe.
  • DNA ordinary DNA can be mentioned.
  • the above-mentioned target oligonucleotide and DNA may be either single-stranded or double-stranded, and in the case of double-stranded, it is usually used as a single strand in the present invention, but it is used as it is. May be done.
  • the step of adding the poly A needs to be performed in the presence of Mn 2+.
  • the presence of Mn 2+ specifically means that the poly A addition reaction is carried out in a solution containing Mn 2+.
  • the concentration of Mn 2+ in the solution may be appropriately adjusted according to the type of target oligonucleotide, the type of sample, the type of reaction solution, or the desired sensitivity, preferably 3 mM to 38 mM, more preferably 5 mM to 35 mM, and 10 mM. ⁇ 30 mM is even more preferable.
  • the concentration of Mn 2+ is preferably 3 mM to 17.5 mM, more preferably 5 mM to 15 mM, and even more preferably 7.5 mM to 15 mM.
  • the concentration of Mn 2+ is preferably 3 mM to 25 mM, preferably 10 mM to 25 mM. Is more preferable, and 10 mM to 20 mM is even more preferable.
  • the concentration of Mn 2+ is preferably 7.5 mM to 27.5 mM. 10 mM to 25 mM is more preferable, and 12.5 mM to 25 mM is even more preferable.
  • the concentration of Mn 2+ is preferably 12.5 mM to 37.5 mM.
  • the concentration of Mn 2+ is preferably 17 mM to 38 mM, more preferably 17 mM to 35 mM, further more preferably 17 mM to 30 mM. preferable.
  • the above biological sample is an individual such as a brain, the individual is suspended in a suspension and stirred with an electric conduction stirrer or the like to prepare a suspension of the individual, which is diluted with a diluent as needed for adjustment. To do.
  • the individual is adjusted to less than 0% (0 mg) to less than 50% (500 mg / ml).
  • the suspension include suspensions for suspending ordinary biological samples, and examples thereof include commercially available Direct PCR Lysisi Reagent (VIAGEN biotec) and RLT buffer (QIAGEN).
  • the above-mentioned diluent include ordinary diluents, such as water, phosphate buffer, and Tris-hydrochloric acid buffer.
  • a solution containing Mn 2+ can be obtained by adding Mn 2+ to a buffer solution as described later.
  • the concentration can be set by reacting the target oligonucleotide with the poly A polymerase in the presence of Mn 2+ having different dilution steps and selecting the concentration at which the desired activity can be obtained.
  • the desired activity can also be evaluated by measuring the amount of AMP uptake using ATP in the reaction step as a substrate, or by performing a pulsar reaction after the step and detecting an amplified signal.
  • the poly A addition reaction is a reaction in which poly A is added to a target oligonucleotide to form an adduct thereof (hereinafter, may be simply referred to as "target oligonucleotide-poly A”), and thereafter. Hybridization of the adduct with the capture probe forms a double strand of "target oligonucleotide-poly A" and the capture probe.
  • the “capture probe” is a probe for capturing a target oligonucleotide, and is a solid phase adjacent to (A) a nucleic acid probe and (B) a nucleotide at the 3'end or 5'end of the nucleic acid probe. Alternatively, it includes an adapter or a linker.
  • the nucleic acid probe (A) used in the present invention may be a substance that can specifically bind to the target oligonucleotide, and is not particularly limited, but contains a base sequence complementary to the target oligonucleotide.
  • the "nucleic acid probe" used in the present invention includes a sequence complementary to the entire or partial sequence of the target oligonucleotide.
  • the total length of the target oligonucleotide contains a sequence complementary to the portion containing the 3'end or 5'end of the target oligonucleotide, and the following (a-1) and (a-2) are included. ).
  • A-1 When the solid phase or the adapter or linker is adjacent to the 3'-terminal nucleotide, the nucleic acid probe is a sequence complementary to the target oligonucleotide in the portion containing the 3'-terminal nucleotide. including.
  • the nucleic acid probe is complementary to the target oligonucleotide in the portion containing the 5'end nucleotide.
  • the sequence complementary to the portion containing the 3'end or the 5'end of the target oligonucleotide preferably contains a sequence complementary to the portion of the target oligonucleotide.
  • the sequence complementary to the full length of the target oligonucleotide may have the same degree of identity to hybridize with respect to the full length, and it is more preferable that the sequence is completely complementary to the full length. ..
  • the nucleic acid probe contains a polybase T (or U) adjacent to the 5'end nucleotide of the sequence complementary to the target oligonucleotide. May be good.
  • the length (number of bases) of the sequence of the nucleic acid probe may be any length as long as it can bind to the target oligonucleotide.
  • a base of 4 mer or more is preferable, a base of 10 mer or more is more preferable, and a base of 15 mer or more is more preferable.
  • the base of is even more preferred.
  • a base of 1000 mer or less is preferable.
  • Solid phase examples of the solid phase in the present invention include insoluble fine particles, microbeads, fluorescent fine particles, magnetic particles, microplates, microarrays, slide glasses, substrates such as electrically conductive substrates, and the like, preferably fluorescent fine particles, and more preferably.
  • Fluorescent beads particularly preferably beads having a fluorescent substance on the surface.
  • the "beads having a fluorescent substance on the surface" used in the present invention are not particularly limited as long as they are beads having a fluorescent substance, and for example, MicroPlex TM Microspheres manufactured by Luminex Corporation can be preferably used.
  • One type of beads can be used, or many types of beads can be used. By using a plurality of types of color-coded beads, the method for quantifying oligonucleotides of the present invention can be easily multiplexed.
  • the solid phase and the nucleic acid probe may be directly bound or may be bound via an adapter or a linker, preferably via an adapter or a linker.
  • the "adjacent" of "a solid phase adjacent to a nucleotide at the 3'end or 5'end of a nucleic acid probe" is directly bound to the nucleotide or is bound via an adapter, a linker, or the like. The meaning of the combination will be described later.
  • Adapter or linker examples of the "adapter or linker” used in the present invention include compounds having an amino group or a carboxyl group such as spacers such as biotin, Spacer 9, Spacer 12, Spacer 18, Spacer C3, and the like, preferably 5'-.
  • Amino-Modifier C12 (12- (4-Monomethoxytritylamino) dodecyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)]-phosphoramidite), biotin and the like.
  • a compound having an amino group is an example of a linker.
  • labeling substance Suitable examples of the labeling substance in the present invention include radioactive isotopes, biotin, digoxigenin, fluorescent substances, luminescent substances, dyes and the like. Specifically, for using radioisotopes such as 125 I and 32 P, luminescent / coloring substances such as digoxygenin and acridinium ester, luminescent substances such as dioxetane, and fluorescent substances such as 4-methylumbelliferyl phosphate.
  • radioactive isotopes such as 125 I and 32 P
  • luminescent / coloring substances such as digoxygenin and acridinium ester
  • luminescent substances such as dioxetane
  • fluorescent substances such as 4-methylumbelliferyl phosphate.
  • a target oligonucleotide is added with a donor fluorescent dye and an acceptor fluorescent dye for utilizing fluorescence resonance energy transfer (FRET), such as alkali phosphatase and biotin for utilizing fluorescence, luminescence, and color-developing substances bound to avidin. It is also possible to detect.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • Binding of nucleic acid probe to solid phase examples include a method by chemical bonding, a method by biological interaction, and a method by physical adsorption.
  • a chemical bond method for example, when a carrier coated with a carboxyl group is used, a coupling reaction can be carried out with the amino group labeled on the oligonucleotide.
  • Biological interaction methods can utilize, for example, the binding force between carrier-coated streptavidin and biotin modified to a hybrid probe.
  • the oligonucleotide in the method by physical adsorption, for example, when a solid phase having a negative charge is used, the oligonucleotide can be electrostatically adsorbed on the carrier by labeling the oligonucleotide with a substance having a positive charge such as an amino group. ..
  • contacting can form a chemical bond, such as a covalent bond, an ionic bond, a metal bond, or a non-covalent bond, between one substance and another. As such, it means placing these substances in close proximity to each other.
  • "contacting" one substance with another means mixing a solution containing one substance with a solution containing another substance.
  • the step of bringing the poly A polymerase and ATP into contact with the sample is carried out by keeping the sample warm at 30 to 42 ° C. for 5 to 120 minutes, preferably 37 ° C. for 60 minutes.
  • the contact step between the sample and the capture probe is carried out by keeping the temperature at 30 to 70 ° C.
  • the contact step between the sample and the first and second oligonucleotides is carried out by keeping the temperature at 28 to 70 ° C. for 0.2 to 3 hours, preferably 30 to 54 ° C. for 0.5 to 2 hours. Will be. It also means that the contact between the target oligonucleotide and the capture probe is performed under conditions under which the corresponding bases of the complementary sequences of the target oligonucleotide and the nucleic acid probe can hybridize. Similarly, it means that the contact between the pair of self-aggregating probes and the capture probe and the assist probe and the contact between the pair of self-aggregating probes are also performed under conditions under which the corresponding bases can hybridize.
  • Self-aggregation refers to a state in which a plurality of first oligonucleotides are hybridized with a second oligonucleotide to form a complex, and a state in which a plurality of second oligonucleotides are used. It means a state in which a complex is formed by hybridization with a first oligonucleotide.
  • the pair of "self-aggregating" probes used in the method of the present invention has complementary nucleotide sequence regions in which the first oligonucleotide and the second oligonucleotide can hybridize with each other, and is a probe polymer by a self-aggregating reaction.
  • oligonucleotide capable of forming Preferably, at least one of the first or second oligonucleotides is labeled with a labeling substance.
  • “hybridizable” means that, in one embodiment, it is completely complementary in the complementary base sequence region.
  • the pair of self-aggregating probes can be pre-labeled with a labeling substance for detection.
  • labeling substances include radioactive isotopes, biotin, digoxigenin, fluorescent substances, luminescent substances, dyes and the like.
  • radioisotopes such as 125 I and 32 P
  • luminescent / coloring substances such as digoxygenin and acridinium ester
  • luminescent substances such as dioxetane
  • fluorescent substances such as 4-methylumbelliferyl phosphate.
  • a target oligonucleotide is added with a donor fluorescent dye and an acceptor fluorescent dye for utilizing fluorescence resonance energy transfer (FRET), such as alkali phosphatase and biotin for utilizing fluorescence, luminescence, and color-developing substances bound to avidin. It is also possible to detect.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the labeling substance is biotin
  • labeling of the oligonucleotide is preferably carried out by biotinlating the 5'end or 3'end.
  • the labeling substance is biotin
  • the substance that specifically binds to the labeling substance is streptavidin or avidin.
  • the first oligonucleotide is an oligonucleotide containing at least nucleic acid region X, nucleic acid region Y and nucleic acid region Z in order from the 5'end side.
  • a pair of self-aggregating probes consisting of first and second oligonucleotides are brought into contact with a sample containing the "target oligonucleotide-poly A" in the present invention and the hybridization product of the capture probe, and the first and first ones are contacted.
  • the step of forming a complex with an oligonucleotide polymer composed of two oligonucleotides there are a case where the complex is formed without an assist probe and a case where a complex is formed via an assist probe.
  • the assist probe is a probe having a role of assisting to form a complex of a target oligonucleotide-poly A and the oligonucleotide polymer.
  • the first aspect of the assist probe is a probe containing a sequence complementary to at least one full sequence or partial sequence of the first or second oligonucleotide and a full sequence or partial sequence of the target oligonucleotide.
  • the assist probe may or may not be labeled with a labeling substance.
  • the assist probe of the present invention has a sequence complementary to at least one full sequence or partial sequence of the first or second oligonucleotide and a full sequence or partial sequence of poly A added to the target oligonucleotide (a sequence complementary to the full sequence or partial sequence of poly A added to the target oligonucleotide. That is, it is a probe containing poly T).
  • a sequence complementary to the full sequence or partial sequence of poly A added to the target oligonucleotide a sequence complementary to the full sequence or partial sequence of poly A added to the target oligonucleotide. That is, it is a probe containing poly T).
  • one sequence of a pair of self-aggregating probes is XYZ, (poly T) -X'Y'X', (poly T) -Z'Y'Z' can be mentioned. The case with and without the assist probe will be described separately below.
  • At least one of the first or second oligonucleotides is the entire sequence of poly A added to the target oligonucleotide or the entire sequence.
  • the complementary strand (poly T) of the partial sequence may be included. It is preferable that at least one of the first or second oligonucleotides is labeled with a labeling substance.
  • a method of adding poly A to a target oligonucleotide and detecting it by the PALSAR method will be specifically described below with reference to FIG. 7.
  • a sample that may contain the target oligonucleotide and a capture probe for capturing the target oligonucleotide are prepared.
  • the capture probe of the present invention (A) Nucleic acid probe and (B) Contains beads immobilized on the nucleotide portion at the 3'end of the nucleic acid probe.
  • the nucleic acid probe contains the entire sequence of the target oligonucleotide.
  • polyA polymerase is allowed to act on the 3'end of the target oligonucleotide in the sample to add polyA (1 in FIG. 7)).
  • the present invention is characterized in that, in this step, the Mn 2+ concentration in the reaction solution is adjusted to a specific concentration to enhance the addition reactivity of poly A, and thus to enhance the detection sensitivity by the subsequent PALSAR reaction.
  • the capture probe is brought into contact with the target oligonucleotide to which poly A is added (1st hybridization).
  • the target oligonucleotide to which poly A is added is hybridized with the nucleic acid probe in the capture probe to form a double strand (FIG. 7-2)).
  • the target oligonucleotide contained in the hybridization product can be quantified by the following pulsar method.
  • the hybrid product and the first and second oligonucleotides are self-aggregated by contacting the sample containing the hybridization product with a pair of self-aggregating probes consisting of the first and second oligonucleotides. It forms a complex with the oligonucleotide polymer (so-called pulsar reaction).
  • the first oligonucleotide is an oligonucleotide containing nucleic acid region X, nucleic acid region Y, and nucleic acid region Z in order from the 5'terminal side.
  • the second oligonucleotide is complementary to the nucleic acid region X, the nucleic acid region Y'complementary to the nucleic acid region Y, and the nucleic acid region Z in order from the 5'terminal side.
  • Nucleic acid region Z' is included (hereinafter, the nucleic acid region may be simply referred to as X, Y, Z, X', Y', Z').
  • Z contains a poly T sequence, and Z'contains a poly A sequence.
  • a labeling substance is attached to the 5'end of the first and second oligonucleotides.
  • Z (poly T) of the first oligonucleotide hybridizes to poly A of the hybridization product, and X'and Y'of the second oligonucleotide hybridize to X and Y of the first oligonucleotide, respectively. .. Then, X and X', Y and Y', Z (poly T) and Z'(poly A) hybridize one after another to form an oligonucleotide polymer of a self-aggregating probe (3 in FIG. 7). ).
  • the hybridization product of the capture probe and the target oligonucleotide and the complex of the self-aggregated first and second oligonucleotides are separated by precipitation by centrifugation or the like, and the first and second oligonucleotides are labeled.
  • concentration of the target oligonucleotide or the like can be measured (Fig. 7-4)). It is also possible to detect the target oligonucleotide by detecting the double-stranded hybridization product formed by the capture probe before the pulsar reaction and the target oligonucleotide to which poly A is added.
  • a poly T probe whose 5'end is pre-labeled with a labeling substance is hybridized to the poly A region of a double-stranded hybridization product, and the labeling substance of the poly T probe is detected to obtain a target oligonucleotide. Can be detected.
  • the first or second oligonucleotide may be an oligonucleotide capable of forming a probe polymer by a self-aggregating reaction.
  • the assist probe may include the poly T and at least one full sequence or partial sequence of the first or second oligonucleotide. It is preferable that at least one of the first oligonucleotide, the second oligonucleotide, and the assist probe is labeled with a labeling substance.
  • a method of adding poly A to the target oligonucleotide and then detecting it via an assist probe will be specifically described below with reference to FIG.
  • the step of adding poly A and the step of hybridizing the “poly A-target oligonucleotide” with the capture probe are the same as in the case of performing the PALSAR method without using an assist probe.
  • the assist probe is brought into contact with the sample containing the hybridization product (3 in FIG. 8).
  • the assist probe includes a poly T sequence and a sequence of a second oligonucleotide (X', Y', Z'or X', Y', X', etc.).
  • the poly T sequence of the assist probe hybridizes with the poly A of the "target oligonucleotide-poly A" to form a complex of the "target oligonucleotide-poly A" with the assist probe.
  • the first oligonucleotide is an oligonucleotide containing X, Y and Z in order from the 5'terminal side
  • the second oligonucleotide is 5, X', Y'and Z'are included in order from the terminal side.
  • Labeling substances are attached to the 5'ends of the first and second oligonucleotides.
  • the first oligonucleotides X, Y, and Z hybridize to the assist probes X', Y', and Z', and the first oligonucleotide hybridizes to the second oligonucleotide.
  • the oligonucleotide polymer of the self-aggregating probe is formed (4 in FIG. 8).
  • the method for detecting these complexes is the same as when there is no assist probe.
  • FIGS. 4 to 14 of International Publication No. 2013/172305 Specific examples of the pulsar method are shown in FIGS. 4 to 14 of International Publication No. 2013/172305, which are appropriately modified based on the common sense of those skilled in the art using a probe for forming a dimer or the like to obtain the self-aggregating reaction of the present invention. It can be applied.
  • the capture probe of the present invention and the self-aggregated first and second oligonucleotide polymers (signal probe polymers) are preferably separated, and the method for separating the complex is not particularly limited, and is preferably centrifuged. Separation method and suction filtration method can be mentioned.
  • the step of precipitating the capture probe and its complex by "centrifugation" is usually 20-30 ° C. for 0.2-5 minutes, 500-3000 xg centrifugation, 23-28 ° C. 0.5-2. Centrifuge at 800-1500 xg for 1 minute, preferably at 25 ° C. for 1 minute at 1000 xg. More specifically, the instruction manual of the bead manufacturer may be followed.
  • the step of separating the capture probe and its complex by "suction filtration method” can be carried out by the method described in Biochem Biophys Res Commun. 2015 Nov 27; 467 (4): 1012-8.
  • the solution containing the capture probe and its complex is transferred to a filter plate, and usually, suction in a negative pressure range of 1 to 10 in.Hg at 20 to 30 ° C. and 1 to 10 in.Hg at 23 to 28 ° C. Suction, preferably 1-5 in.Hg at 25 ° C.
  • the suction time may be such that the liquid is visually removed from the filter, and examples thereof include 1 second to 5 minutes, preferably 5 seconds to 1 minute.
  • the pore size of the filter plate is preferably smaller than the diameter of the capture probe, and is preferably 1.2 ⁇ m or 1.0 ⁇ m, for example.
  • filter plates MultiScreen (TM) HTS-BV plate (Merck Millipore , product number: MSBVN1250), manifold: MultiScreen (TM) HTS Vacuum Manifold (Merck Millipore) , suction pump: Chemical duty Pump (Merck Millipore, catalog number: WP6110060).
  • sample used in the method of the present invention includes whole blood, serum, plasma, lymph, urine, saliva, tears, sweat, gastric fluid, pancreatic fluid, bile, human, monkey, dog, pig, rat, guinea pig or mouse.
  • body fluids such as pleural fluid, joint cavity fluid, cerebrospinal fluid, cerebrospinal fluid, and bone marrow fluid, or biological samples such as tissues such as brain, liver, kidney, lung, and heart.
  • the sample is human whole blood, serum, plasma, brain or urine. More preferably, the sample is whole blood, serum, plasma, brain or urine of a human who has been administered a drug containing the target oligonucleotide. These may be diluted with water or buffer before use.
  • the sample of the present invention also includes a target oligonucleotide diluted with water or barfer.
  • the buffer may be any commonly used buffer, for example, tris hydrochloric acid, boric acid, phosphoric acid, acetic acid, citric acid, succinic acid, phthalic acid, glutaric acid, maleic acid, glycine and salts thereof. And the like, Gut buffer such as MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES and the like, and examples of water include RNase, DNase free water and the like.
  • Examples of the method for detecting the first and second oligonucleotide polymers of the present invention include a turbidity method, an agarose gel electrophoresis method, an absorbance method, a fluorescence measurement method, an electrochemical luminescence method, and a flow cytometry method, and are preferable.
  • Flow cytometry method can be mentioned.
  • the flow cytometry method is performed in, for example, "a step of detecting the first fluorescence emitted by the first fluorescent substance and the second fluorescence emitted by the second fluorescent substance by using the flow cytometry method".
  • the “step of detecting the first fluorescence emitted by the first fluorescent substance and the second fluorescence emitted by the second fluorescent substance by using the flow cytometry method” is the first fluorescence emitted by the first fluorescent substance. It is preferable to detect the second fluorescence emitted by the second fluorescent substance and the second fluorescent substance at the same time or at the same opportunity.
  • detecting at the same time or at the same opportunity means that the first fluorescent substance and the second fluorescent substance contained in one complex (three-component complex or four-component complex) are the flow cytometers. It means that the first fluorescence and the second fluorescence emitted by being simultaneously or sequentially excited in the flow path are detected as the fluorescence emitted from the one complex.
  • examples of the first fluorescent substance include a fluorescent substance contained in the solid phase of the capture probe
  • examples of the second fluorescent substance include labels attached to the first and second oligonucleotides. Included are fluorescent substances that are pre-bound to a substance that specifically binds to the substance. The reaction solution containing these first and second fluorescent substances is detected by the flow cytometry method for the first fluorescence emitted by the first fluorescent substance and the second fluorescence emitted by the second fluorescent substance. be able to.
  • the poly A polymerase buffer solution kit includes at least the following configurations.
  • the reaction buffer solution of (2) may have a concentration of Mn 2+ of 3 mM to 38 mM in the final reaction solution to which the reagents of the sample and the kit are added, preferably 5 mM to 35 mM, and more. It is preferably 10 mM to 30 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 6 mM to 76 mM, preferably 10 mM to 70 mM, and more preferably 20 mM to 60 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 9 mM to 114 mM, preferably 15 mM to 105 mM, and more preferably 30 mM to 90 mM.
  • the concentration of Mn2 + may be 12 mM to 152 mM, preferably 20 mM to 140 mM, and more preferably 40 mM to 120 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 15 mM to 190 mM, preferably 25 mM to 175 mM, and more preferably 50 mM to 150 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 18 mM to 228 mM, preferably 30 mM to 210 mM, and more preferably 60 mM to 180 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 21 mM to 266 m, preferably 35 mM to 245 mM, and more preferably 70 mM to 210 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 24 mM to 304 mM, preferably 40 mM to 280 mM, and more preferably 80 mM to 240 mM.
  • the concentration of Mn 2+ is 27 mM to 342 mM, preferably 45 mM to 315 mM, and more preferably 90 mM to 270 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 30 mM to 380 mM, preferably 50 mM to 350 mM, and more preferably 100 mM to 300 mM.
  • the buffer any buffer may be used as long as the activity of the poly A polymerase is maintained, and in general, tris-hydrochloric acid, phosphoric acid and the like are used.
  • the reaction buffer of (2) above contains Mn 2+ so as to be 3 mM to 17.5 mM in the final reaction solution.
  • the reaction buffer solution in (2) above has a concentration of Mn 2+ of 3 mM to 17.5 mM in the final reaction solution to which the reagents of the sample and kit are added.
  • the concentration may be any, preferably 5 mM to 15 mM, and more preferably 7.5 mM to 15 mM.
  • the concentration of Mn 2+ is 6 mM to 35 mM, preferably 10 mM to 30 mM, and more preferably 15 mM to 30 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 9 mM to 52.5 mM, preferably 15 mM to 45 mM, and more preferably 22.5 mM to 45 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 12 mM to 70 mM, preferably 20 mM to 60 mM, and more preferably 30 mM to 60 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 15 mM to 87.5 mM, preferably 25 mM to 75 mM, and more preferably 37.5 mM to 75 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 18 mM to 105 mM, preferably 30 mM to 90 mM, and more preferably 45 mM to 90 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 21 mM to 122.5 mM, preferably 35 mM to 105 mM, and more preferably 52.5 mM to 105 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 24 mM to 140 mM, preferably 40 mM to 120 mM, and more preferably 60 mM to 120 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 27 mM to 157.5 mM, preferably 45 mM to 135 mM, and more preferably 67.5 mM to 135 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 30 mM to 175 mM, preferably 50 mM to 150 mM, and more preferably 75 mM to 150 mM.
  • the reaction buffer of (2) above is contained so that Mn 2+ is 17 mM to 38 mM in the final reaction solution. ing.
  • the reaction buffer solution of (2) above has a concentration of Mn 2+ of 17 mM in the final reaction solution to which the samples, kit reagents, etc. are added. The concentration may be about 38 mM, preferably 17 mM to 35 mM, and more preferably 17 to 30 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 34 mM to 76 mM, preferably 34 mM to 70 mM, and more preferably 34 mM to 60 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 51 mM to 114 mM, preferably 51 mM to 105 mM, and more preferably 51 mM to 90 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 68 mM to 152 mM, preferably 68 mM to 140 mM, and more preferably 68 mM to 120 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 85 mM to 190 mM, preferably 85 mM to 175 mM, and more preferably 85 mM to 150 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 102 mM to 228 mM, preferably 102 mM to 210 mM, and more preferably 102 mM to 180 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 119 mM to 266 mM, preferably 119 mM to 245 mM, and more preferably 119 mM to 210 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 136 mM to 304 mM, preferably 136 mM to 280 mM, and more preferably 136 mM to 240 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 153 mM to 342 mM, preferably 153 mM to 315 mM, and more preferably 153 mM to 270 mM.
  • the concentration of Mn 2+ may be 170 mM to 380 mM, preferably 170 mM to 350 mM, and more preferably 170 mM to 300 mM.
  • the kit for detecting the target oligonucleotide of the present invention includes the following (3) and (4).
  • Capture probe for capturing the target oligonucleotide (4)
  • a pair of self-aggregating probes composed of the first and second oligonucleotides, and if necessary, an assist probe and the like are included.
  • Each configuration is as described above. Since the reaction buffer may precipitate when stored for a long period of time, it is preferably prepared at the time of use, and a redox agent such as DTT or a chelating agent such as EDTA may be added.
  • concentrations of the oxidation-reducing agent and the chelating agent are preferably 0.01 mM to 5 mM, more preferably 0.5 mM to 2 mM. Further, the redox agent and the reducing agent may be added in the step of the poly A addition reaction.
  • Example 1 MnCl 2 concentration during poly A addition reaction with poly A polymerase (mouse 100% plasma matrix) (1) Poly A addition reaction (1-1) Preparation of sample Mouse plasma (Nippon Charles River) so that the final concentration of Target-1 (target oligonucleotide) of the sequence shown below is 0, 1, 10 fmol. Adjusted by company).
  • ⁇ HCP-1 sequence 5'-(biotin) CAACAATCAGGAC GATACCGATGAAG TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
  • Detection step After washing the reaction solution after the complex formation reaction once with 1xPBS-TP, add 50 ⁇ L of the detection reagent [Streptavidin-R-Phycoerythrin (hereinafter referred to as SA-PE) (Prozyme) 5 ⁇ g / mL]. After allowing to stand for 10 minutes under shading at 25 ° C., it was washed twice with 1xPBS-TP. After that, 75 ⁇ L of 1xPBS-TP was added, and the fluorescence of the beads and the SA-PE complex was measured with the Luminex System (manufactured by Luminex) to detect the signal of the substance to be measured.
  • SA-PE Streptavidin-R-Phycoerythrin
  • FIGS. 1 to 3 show the results of examining the MnCl 2 concentration during the polyA polymerase reaction of Target-1 (3'terminal LNA) in the 100% mouse plasma matrix.
  • FIG. 1 shows the result of the background (BG) in which Target-1 is not included.
  • the background was significantly suppressed when the MnCl 2 concentration was greater than 15 mM and 40 mM or less.
  • the BG value within this MnCl 2 concentration range was lower than that when the MgCl 2 buffer attached to the kit of Comparative Example 1 was used.
  • 2 and 3 are graphs showing the results of the MFI and SN ratio when the concentration of Target-1 is 1 fmol and 10 fmol.
  • the SN ratio increased significantly when the MnCl 2 concentration in the buffer was greater than 15 mM and 40 mM or less, and the general polyA polymerase reaction of Comparative Example 1 (buffer attached to a commercially available kit). : The value of the SN ratio was hundreds of times higher than when MgCl 2 was used). From the above, when reacting Poly A polymerase with Target-1, MnCl 2 is added to the buffer and the concentration is adjusted to an appropriate range to suppress the background and significantly increase the SN ratio. It turned out that it was possible to make it.
  • Target oligonucleotide concentration dependence in PAP Mn buffer (mouse 100% plasma matrix)
  • Poly A addition reaction (1-1) Preparation of sample The final concentration of the target oligonucleotide (Target-1; SEQ ID NO: 1) is 0, 10, 31.6, 100, 316, 1000, 3160, 10000 amol. It was prepared with mouse plasma (Nippon Charles River Co., Ltd.) so as to have a concentration of.
  • FIG. 4 shows the linearity of Target-1 concentration in PAP Mn buffer (Example 2) in a 100% mouse plasma matrix.
  • Concentration of Target-1 is R 2 value 0.9943 is obtained in the range of 0-1000 amol, as compared to the straight line indicating the target concentration dependence in the case of using Mg buffer attached to the kit of Comparative Example 2 (FIG. 5) Good linearity was obtained, which was not inferior to that of the product.
  • FIG. 6 shows a comparison of the SN ratios of Mn buffer (Example 2) and Mg buffer (Comparative Example 2) for each Target concentration. It was shown that the SN ratio of Mn buffer (Example 2) was significantly higher than that of Mg buffer (Comparative Example 2) at any Target-1 concentration. The SN ratio at a target concentration of 10 amol is 2 for Mg buffer (Comparative Example 2), indicating that the Mg buffer cannot obtain a sensitivity of 10 amol or less at a target concentration. On the other hand, in Mn buffer (Example 2), the SN ratio of Target-1 concentration of 10 amol is 9, indicating that sensitivity can be obtained even at 10 amol or less. From the above, it was found that the Target concentration dependence was good in Mn buffer and was quantitative. It was also found that the detection sensitivity can be increased by using the Mn buffer in the present invention.
  • Poly A addition reaction (1-1) Preparation of sample The target oligonucleotide (Target-1; SEQ ID NO: 1) has a final concentration of 0, 10, 31.6, 100, 316, 1000, 3160 amol. It was adjusted with mouse plasma (Charles River Japan Co., Ltd.) so as to be.
  • FIGS. 9 and 10 show the results of Target-1 concentration dependence in PAP 17.5 mM Mn buffer in a 100% mouse plasma matrix.
  • FIG. 9 shows the linearity of Target-1 concentration in PAP 17.5 mM Mn buffer (Example 3) in a 100% mouse plasma matrix.
  • Concentration of Target-1 is R 2 value 0.9976 is obtained in the range of 0-1000 amol, good linearity was obtained.
  • FIG. 10 shows a comparison of the SN ratios of 17.5 mM Mn buffer (Example 3) and Mg buffer (Comparative Example 3) for each Target-1 concentration. It was shown that the SN ratio of Mn buffer (Example 3) was significantly higher than that of Mg buffer (Comparative Example 3) at any Target-1 concentration. Further, the SN ratio at the Target-1 concentration of 10 amol is 2 for the Mg buffer (Comparative Example 3), indicating that the Mg buffer cannot obtain the sensitivity of the Target-1 concentration of 10 amol or less.
  • the SN ratio of Target-1 concentration of 10 amol is 8, indicating that sensitivity can be obtained even at 10 amol or less. From the above, it was found that the Target-1 concentration dependence was good in the 17.5 mM Mn buffer and was quantitative. It was also found that the detection sensitivity can be increased by using the 17.5 mM Mn buffer in the present invention.
  • Example 4-1 MnCl 2 concentration during poly A addition reaction with poly A polymerase (mouse 50% plasma matrix) (1) Poly A addition reaction (1-1) Preparation of sample Target-2 (target oligonucleotide) of the sequence shown below was adjusted with a mouse 50% plasma matrix so that the final concentration was 0, 0.1 fmol. did. As the mouse 50% plasma matrix, mouse plasma (Charles River Japan) diluted 2-fold with RNase-Free Water was used.
  • Detection step After washing the reaction solution after the complex formation reaction once with 1xPBS-TP, add 50 ⁇ L of the detection reagent [SA-PE (Prozyme) 5 ⁇ g / mL] and leave it to stand for 10 minutes under shading at 25 ° C. After that, it was washed twice with 1xPBS-TP. After that, 75 ⁇ L of 1xPBS-TP was added, and the fluorescence from the beads and the SA-PE complex was measured with the Luminex System (manufactured by Luminex) to detect the signal of the substance to be measured.
  • SA-PE Prozyme
  • Example 4-2 Concentration of MnCl 2 during poly A addition reaction with poly A polymerase (mouse 10% plasma matrix) (1) Poly A addition reaction (1-1) Preparation of sample The target oligonucleotide (Target-2; SEQ ID NO: 5) was prepared in a mouse 10% plasma matrix so that the final concentration was 0, 0.1 fmol. It was adjusted. As the mouse 10% plasma matrix, mouse plasma (Charles River Japan) diluted 10-fold with RNase-Free Water was used.
  • Detection step After washing the reaction solution after the complex formation reaction once with 1xPBS-TP, add 50 ⁇ L of the detection reagent [SA-PE (Prozyme) 5 ⁇ g / mL] and leave it to stand for 10 minutes under shading at 25 ° C. After that, it was washed twice with 1xPBS-TP. After that, 75 ⁇ L of 1xPBS-TP was added, and the fluorescence from the beads and the SA-PE complex was measured with the Luminex System (manufactured by Luminex) to detect the signal of the substance to be measured.
  • SA-PE Prozyme
  • Example 5 Concentration of MnCl 2 during poly A addition reaction with poly A polymerase (water) (1) Poly A addition reaction (1-1) Preparation of sample The target oligonucleotide (Target-2; SEQ ID NO: 5) was subjected to Nuclease-Free Water so that the final concentration was 0.1 fmol. It was adjusted.
  • Detection step After washing the reaction solution after the complex formation reaction once with 1xPBS-TP, add 50 ⁇ L of the detection reagent [SA-PE (Prozyme) 5 ⁇ g / mL] and leave it to stand for 10 minutes under shading at 25 ° C. After that, it was washed twice with 1xPBS-TP. After that, 75 ⁇ L of 1xPBS-TP was added, and the fluorescence from the beads and the SA-PE complex was measured with the Luminex System (manufactured by Luminex) to detect the signal of the substance to be measured.
  • SA-PE Prozyme
  • Results Fig. 13 shows the results of examining the MnCl 2 concentration of Target-2 (3'terminal LNA) during the polyA polymerase reaction in water. It is a graph which showed the result of the MFI and SN ratio when the concentration of Target-2 was 0.1 fmol. Looking at the graph of the SN ratio of Example 5, the SN ratio increased when the MnCl 2 concentration in the buffer was 5 mM or more and 15 mM or less, and the general polyA polymerase reaction of Comparative Example 5 (buffer attached to a commercial kit: MgCl 2). The value of the SN ratio was several times higher than that (when using). From the above, when reacting Poly A polymerase with Target-2 in water (buffer), MnCl 2 is added to the buffer and the concentration is adjusted to an appropriate range to suppress the background and SN. It has been found that it is possible to increase the ratio.
  • Example 6 Types of modified nucleic acid at 3'end of target oligonucleotide in PAP Mn buffer (mouse 100% plasma matrix) (1) Poly A addition reaction (1-1) Preparation of samples Target-3, 4, 5, 6 (target oligonucleotides) of the sequences shown below were prepared in mice so that the final concentration was 0,1 fmol. Prepared with plasma (Charles River Japan).
  • Example 7-1 MnCl 2 concentration during poly A addition reaction with poly A polymerase (mouse 2% brain (20 mg / ml) matrix)
  • Poly A addition reaction (1-1) Preparation of mouse brain matrix Direct PCR Lysis Reagent (VIAGEN biotec, product number: 102-T) and Proteinase K solution (Kanto Chemical Co., Ltd., product number: 9034) 100: The solution mixed at a ratio of 1 was added to a mouse brain sample (Charles River Japan, product number: P00041) so as to be 200 mg / mL (20% brain matrix). After crushing the mouse brain in a solution using Power Smasher II (Nippi, product number: 891300), the mouse was kept warm at 55 ° C.
  • Power Smasher II Nippi, product number: 891300
  • Detection step After washing the reaction solution after the complex formation reaction once with 1xPBS-TP, add 50 ⁇ L of the detection reagent [SA-PE (Prozyme) 5 ⁇ g / mL] and leave it to stand for 10 minutes under shading at 25 ° C. After that, it was washed twice with 1xPBS-TP. After that, 75 ⁇ L of 1xPBS-TP was added, and the fluorescence from the beads and the SA-PE complex was measured with the Luminex System (manufactured by Luminex) to detect the signal of the substance to be measured.
  • SA-PE Prozyme
  • FIG. 15 is a graph showing the results of the MFI to SN ratio when the concentration of Target-2 (3'terminal LNA) in the mouse 2% brain matrix (20 mg / mL) was 0.1 fmol.
  • the SN ratio increased significantly when the MnCl 2 concentration in the buffer was 10 to 17.5 M, and the general poly A polymerase reaction of Comparative Example 7-1 (commercially available kit). The value of the SN ratio was higher than that of the attached buffer (when MgCl 2 was used). From the above, in the mouse 2% brain matrix, when the poly A polymerase is reacted with Target-2, MnCl 2 is added to the buffer and the concentration is adjusted to an appropriate range to suppress the background. Moreover, it was found that the SN ratio can be significantly increased.
  • Example 7-2 Concentration of MnCl 2 during poly A addition reaction with poly A polymerase (mouse 4% brain (40 mg / ml) matrix)
  • Poly A addition reaction (1-1) Preparation of mouse brain matrix Direct PCR Lysis Reagent (VIAGEN biotec, product number: 102-T) and Proteinase K solution (Kanto Chemical Co., Ltd., product number: 9034) 100: The solution mixed at a ratio of 1 was added to a mouse brain sample (Charles River Japan, product number: P00041) so as to be 200 mg / mL (20% brain matrix).
  • the mouse After crushing the mouse brain in a solution using Power Smasher II (Nippi, product number: 891300), the mouse was kept warm at 55 ° C. and 800 rpm for 60 minutes. After further heat-treating at 85 ° C. and 800 rpm for 45 minutes, the supernatant was recovered by centrifugation at 25 ° C. and 1600 ⁇ g for 15 minutes. The collected supernatant was diluted 5-fold with RNase-Free Water.
  • Detection step After washing the reaction solution after the complex formation reaction once with 1xPBS-TP, add 50 ⁇ L of the detection reagent [SA-PE (Prozyme) 5 ⁇ g / mL] and leave it to stand for 10 minutes under shading at 25 ° C. After that, it was washed twice with 1xPBS-TP. After that, 75 ⁇ L of 1xPBS-TP was added, and the fluorescence from the beads and the SA-PE complex was measured with the Luminex System (manufactured by Luminex) to detect the signal of the substance to be measured.
  • SA-PE Prozyme
  • FIG. 16 is a graph showing the results of the MFI to SN ratio when the concentration of Target-2 (3'terminal LNA) in the mouse 4% brain (40 mg / ml) matrix was 0.1 fmol.
  • the SN ratio increased significantly when the MnCl 2 concentration in the buffer was 10 to 20 mM, and the general poly A polymerase reaction of Comparative Example 7-2 (attached to a commercially available kit). The value of the SN ratio was higher than that of the buffer (when MgCl 2 was used).
  • PK / PD pharmacokinetic / pharmacodynamic

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Abstract

本発明は、３'末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡに対するポリＡポリメラーゼの反応性を高め、ひいてはＰＡＬＳＡＲ法などによる検出感度を向上させることを課題とする。　本発明は、核酸医薬に用いられるような、３'末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡに対するポリＡポリメラーゼの反応性を高め、ひいては３'末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡを検出対象として、当該オリゴヌクレオチドの３'末端にポリＡポリメラーゼでポリＡを付加し、その後捕捉プローブで捕捉して、ＰＡＬＳＡＲ法などで増幅する工程により当該オリゴヌクレオチドを検出する方法において、ポリＡポリメラーゼ反応時のＭｎ２＋濃度を調製することにより本発明の課題を解決した。

Description

オリゴヌクレオチドの検出又は定量方法
　本発明は、高感度及び定量性に優れたオリゴヌクレオチドの検出又は定量方法に関するものである。特に３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド及びＤＮＡを高感度に検出、定量する方法に関する。
　核酸やＤＮＡなどのオリゴヌクレオチドを増幅して検出する技術としてＰＡＬＳＡＲ法が知られている。ＰＡＬＳＡＲ法の原理は、あらかじめ用意した互いに相補的な３つの領域からなる１組のＤＮＡプローブ（本明細書中、自己凝集プローブということがある）を使用し、当該プローブに標識を付け、これらがハイブリダイゼーションによる自己凝集反応を繰り返すことにより網目状の大きなＤＮＡの塊となることからこれを増幅シグナルとして利用するものである。検出対象のＤＮＡやＲＮＡにこの大きなＤＮＡの塊が結合することによって、その増幅したシグナルを捕捉して検出対象のＤＮＡやＲＮＡを検出、定量するという方法である。
　マイクロＲＮＡなどの検出対象をＰＡＬＳＡＲ法で検出する方法は次の工程を含む。まず、マイクロＲＮＡの３’末端にポリＡポリメラーゼでポリＡを付加する工程と、次にポリＡの付加されたマイクロＲＮＡに捕捉プローブを反応させて捕捉する工程と、捕捉プローブに捕捉されたマイクロＲＮＡと自己凝集プローブを反応させて、マイクロＲＮＡと捕捉プローブと、プローブポリマーとを含む検出用複合体を形成する工程と、検出工程とを含む方法である（特許文献１）。
　ここで、ポリＡポリメラーゼは、一般にＭｇ２＋あるいはＭｎ２＋要求性であることが知られており、非特許文献１には、Ｍｇ２＋あるいはＭｎ２＋を各濃度で添加した場合のプライマーＲＮＡ（大腸菌Ｋ１２株ｔＲＮＡ）へのＡＭＰ取り込み量がグラフで示されている（Ｆｉｇ．３）。本図によれば、Ｍｇ２＋あるいはＭｎ２＋無しの場合は、ポリＡポリメラーゼはなんら活性を示さず、Ｍｎ２＋は２．５ｍＭの場合に、Ｍｇ２＋は１０ｍＭの場合に最大の活性を示すことが示され、さらには、両方の金属イオンをそれぞれの最大活性を示す濃度で一緒に添加した場合（Ｍｎ２＋２．５ｍＭとＭｇ２＋１０ｍＭ）には、ポリＡポリメラーゼのさらなる最高の活性が得られることが開示されている（Ｆｉｇ．３Ｂ）。
ＷＯ２０１３－１７２３０５号パンフレット
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７，３１－４０（１９７３）
　ここで、我々は、核酸医薬に用いられるような、３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド及びＤＮＡを検出対象として、３’末端にポリＡポリメラーゼでポリＡを付加し、その後捕捉プローブで捕捉して、ＰＡＬＳＡＲ法で増幅するといった工程により当該オリゴヌクレオチドの検出を試みたところ、ポリＡポリメラーゼの反応工程においてＭｇ２＋濃度を上記濃度で添加した場合は、検出時のシグナルが低く、バッググラウンド値も高く、検出対象物を測定できないという新たな問題点を見出した。
　したがって、本発明は、３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡに対するポリＡポリメラーゼの反応性を高め、ひいてはＰＡＬＳＡＲ法による検出感度を向上させることを課題とする。特に、血漿中、脳中等の生体試料中で前記オリゴヌクレオチドを検出しようとした場合には従来のポリＡポリメラーゼの反応条件ではほとんど検出感度が得られないことから、血漿中、脳中等の生体試料中での検出感度を高めることはより難しい課題である。
　本発明は、核酸医薬に用いられるような、３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡに対するポリＡポリメラーゼの反応性を高め、ひいては３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡを検出対象として、当該オリゴヌクレオチドの３’末端にポリＡポリメラーゼでポリＡを付加し、その後捕捉プローブで捕捉して、ＰＡＬＳＡＲ法などで増幅する工程により当該オリゴヌクレオチドを検出する方法において、ポリＡポリメラーゼ反応時のＭｎ２＋濃度を調製することによりシグナルを高め、且つ、バックグラウンドを抑制し、signal-to-noise ratio (SN比)を大幅に上昇させ、検出感度をより高めることができることを見出し本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の構成を有する。
（１）以下の工程を含む試料中の標的オリゴヌクレオチドの３’末端にポリＡを付加する方法であって、前記標的オリゴヌクレオチドが３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡである前記方法：
（i）Ｍｎ２＋存在下、試料中の標的オリゴヌクレオチドとポリＡポリメラーゼを接触させる工程。
（２）以下の工程を含む試料中の標的オリゴヌクレオチドの回収方法であって、前記標的オリゴヌクレオチドが３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡである前記方法:
　(i) Ｍｎ２＋存在下、試料中の標的オリゴヌクレオチドとポリＡポリメラーゼを接触させて前記標的オリゴヌクレオチドの３’末端にポリＡを付加する工程
　(ii)前記試料に前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させてハイブリダイゼーションさせる工程、
　ここで、前記捕捉プローブは、
　（Ａ）核酸プローブと、
　（Ｂ）前記核酸プローブの３’末端又は５’末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含み、
　前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列を含む
　(iii)前記試料に含まれるハイブリダイゼーション生成物を回収する工程。
（３）以下の工程を含む、試料中の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法であって、前記標的オリゴヌクレオチドが３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡである前記方法:
　(i) Ｍｎ２＋存在下、試料中の標的オリゴヌクレオチドとポリＡポリメラーゼを接触させて前記標的オリゴヌクレオチドの３’末端にポリＡを付加する工程
　(ii)前記試料に前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させてハイブリダイゼーションさせる工程、
　ここで、前記捕捉プローブは、
　（Ａ）核酸プローブと、
　（Ｂ）前記核酸プローブの３’末端又は５’末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含み、
　前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列を含む
　(iii)前記試料に含まれるハイブリダイゼーション生成物を回収する工程。
　(iv)回収されたハイブリダイゼーション生成物を検出する工程。
（４）以下の工程を含む、試料中の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法であって、前記標的オリゴヌクレオチドが３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡである前記方法:
　(i) Ｍｎ２＋存在下、試料中の標的オリゴヌクレオチドとポリＡポリメラーゼを接触させて前記標的オリゴヌクレオチドの３’末端にポリＡを付加する工程
　(ii)前記試料に前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させてハイブリダイゼーションさせる工程、
　ここで、前記捕捉プローブは、
　（Ａ）核酸プローブと、
　（Ｂ）前記核酸プローブの３’末端又は５’末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含み、
　前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列を含む
（iii）前記試料中に含まれるハイブリダイゼーション生成物に、第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のシグナル増幅用プローブを接触させて、前記ハイブリダイゼーション生成物と、第１及び第２のオリゴヌクレオチドが自己凝集してなるオリゴヌクレオチドポリマーとの複合体を形成する工程
（iv）前記複合体を検出する工程。
（５）第１及び第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方が、ポリＴ配列を含む、（４）に記載の検出方法。
（６）前記（iv）の複合体形成工程が、アシストプローブと接触させる工程を含み、
前記アシストプローブが、
ポリＴ配列、並びに、前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方の全配列若しくは部分配列に対して相補的な配列、を含む、
（４）又は（５）に記載の検出方法。
（７）前記第１のオリゴヌクレオチドが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚ若しくはポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含み、
　前記第２のオリゴヌクレオチドが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’若しくはポリＡ配列を含む核酸領域Ｚ’ を含む（４）～（６）のいずれかに記載の検出方法。
（８）試料が標的オリゴヌクレオチドを含む、血液由来成分、脳由来成分、バッファー又は水である（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチドが、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ホスホロチオエート、モルフォリノオリゴ、ボラノホスフェート、２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル化ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）又は２’－Ｆである（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチドが、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＭＯＥ、又はＯＭｅである（９）に記載の方法。
（１１）ポリＡを付加する工程が、３ｍＭ～３８ｍＭのＭｎ２＋を含む溶液中で行われる工程である（１）～（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）以下を含むポリＡポリメラーゼ反応液組成物キット。
（i）ポリＡポリメラーゼ
（ii）Ｍｎ２＋をポリＡポリメラーゼ反応液の最終濃度で３ｍＭ～３８ｍＭとなるように含む反応バッファー溶液
（iii）ＡＴＰ
（１３）以下を含む、試料中の標的オリゴヌクレオチドを検出するキットであって、前記標的オリゴヌクレオチドが３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡである前記キット。
（i）ポリＡポリメラーゼ
（ii）Ｍｎ２＋をポリＡポリメラーゼ反応液の最終濃度で３ｍＭ～３８ｍＭとなるように含む反応バッファー溶液
（iii）標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブ
（iv）第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブ
（１４）前記第１のオリゴヌクレオチドが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚ若しくはポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含み、
　前記第２のオリゴヌクレオチドが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’又はポリＡ配列を含む核酸領域Ｚ’を含む（１２）に記載のキット。
（１５）（４）～（７）の検出方法に用いられる第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブであって、
前記第１のオリゴヌクレオチドが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚ若しくはポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含み、
　前記第２のオリゴヌクレオチドが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’若しくはポリＡ配列を含む核酸領域Ｚ’を含む
　前記一対のプローブ。
　本発明によれば、３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド及びＤＮＡにポリＡポリメラーゼでポリＡを付加する反応の反応性を高めることが可能である。また、３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド及びＤＮＡを検出する場合の検出感度を高めることができる。また、本来検出困難である、血漿等の生体由来試料からの上記核酸の検出も可能である。
マウス１００％血漿マトリクスにおける標的オリゴヌクレオチドTarget-1にポリアデニル化反応を行う場合に、Ｍｎ２＋の影響を確認した試験結果であって、バックグラウンド（ＢＧ、標的オリゴヌクレオチドの濃度がゼロ）の各Ｍｎ２＋濃度ごとの検出感度（ＭＦＩ）を示すグラフである（実施例１）。比較のためにＭｇ２＋の影響も確認した（比較例１）。 マウス１００％血漿マトリクスにおける標的オリゴヌクレオチドTarget-1にポリアデニル化反応を行う場合に、Ｍｎ２＋の濃度の影響を確認した試験結果であって、標的オリゴヌクレオチドの濃度が１ｆｍｏｌの場合の各Ｍｎ２＋濃度ごとの検出感度（ＭＦＩ）を示すグラフである（実施例１）。比較のためにＭｇ２＋の影響も確認した（比較例１）。 マウス１００％血漿マトリクスにおける標的オリゴヌクレオチドTarget-1にポリアデニル化反応を行う場合に、Ｍｎ２＋の濃度の影響を確認するための試験結果であって、標的オリゴヌクレオチドの濃度が１０ｆｍｏｌの場合の各Ｍｎ２＋濃度ごとの検出感度（ＭＦＩ）を示すグラフである（実施例１）。比較のためにＭｇ２＋の影響も確認した（比較例１）。 マウス１００％血漿マトリクスにおける標的オリゴヌクレオチドTarget-1にポリアデニル化反応を行う場合に、ポリアデニル化反応液中のＭｎ２＋の濃度を２２．５ｍＭとした場合の標的オリゴヌクレオチドの濃度と測定感度との関係を示すグラフである（実施例２）。 マウス１００％血漿マトリクスにおける標的オリゴヌクレオチドTarget-1にポリアデニル化反応を行う場合に、ポリアデニル化反応液中のＭｇ２＋の濃度を１０．０ｍＭとした場合の標的オリゴヌクレオチドの濃度と測定感度との関係を示すグラフである（比較例２）。 実施例２のバッファーと比較例２のバッファーを用いて、マウス１００％血漿マトリクスにおける標的オリゴヌクレオチドTarget-1にポリアデニル化反応を行った場合のＳＮ比の関係を示すグラフである（実施例２）。 標的オリゴヌクレオチドをポリアデニル化した後、ＰＡＬＳＡＲ法により検出する基本的なステップを示す概念図である。 標的オリゴヌクレオチドをポリアデニル化した後、ＰＡＬＳＡＲ法により検出する工程において、アシストプローブを利用する場合の基本的なステップを示す概念図である。 マウス１００％血漿マトリクスにおける標的オリゴヌクレオチドにポリアデニル化反応を行う場合に、ポリアデニル化反応液中のＭｎ２＋の濃度を１７．５ｍＭとした場合の標的オリゴヌクレオチド（Target-1）の濃度と測定感度との関係を示すグラフである（実施例３）。 実施例３のバッファーと比較例３のバッファーを用いて、マウス１００％血漿マトリクスにおける標的オリゴヌクレオチドTarget-1にポリアデニル化反応を行った場合の標的オリゴヌクレオチドの各濃度のＳＮ比の関係を示すグラフである。 マウス５０％血漿マトリクスにおける標的オリゴヌクレオチドTarget-2(3’末端LNA)にポリアデニル化反応を行う場合に、Ｍｎ２＋の濃度の影響を確認した試験結果であって、標的オリゴヌクレオチドの濃度が０．１ｆｍｏｌの場合の各Ｍｎ２＋濃度ごとの検出感度（ＭＦＩ）を示すグラフである（実施例４－１）。比較のためにＭｇ２＋の影響も確認した（比較例４－１）。 マウス１０％血漿マトリクスにおける標的オリゴヌクレオチドTarget-2(3’末端LNA)にポリアデニル化反応を行う場合に、Ｍｎ２＋の濃度の影響を確認した試験結果であって、標的オリゴヌクレオチドの濃度が０．１ｆｍｏｌの場合の各Ｍｎ２＋濃度ごとの検出感度（ＭＦＩ）を示すグラフである（実施例４－２）。比較のためにＭｇ２＋の影響も確認した（比較例４－２）。 水における標的オリゴヌクレオチドTarget-2(3’末端LNA)のポリアデニル化反応を行う場合に、Ｍｎ２＋の濃度の影響を確認した試験結果であって、標的オリゴヌクレオチドの濃度が０．１ｆｍｏｌの場合の各Ｍｎ２＋濃度ごとのＭＦＩを示すグラフである（実施例５）。比較のためにＭｇ２＋の影響も確認した（比較例５）。 マウス１００％血漿マトリクスにおける標的オリゴヌクレオチドTarget-3 (3’末端BNA-NC (N-Me))、Target-4(3’末端MOE)、Target-5(3’末端OMe)、Target-6(3’末端DNA)のポリアデニル化反応を行う場合に、Ｍｎ２＋バッファー（実施例６）とＭｇ２＋　バッファー（比較例６）におけるＳＮ比の比較を示すグラフである。 マウス２％（20mg/mL）脳マトリクスにおける標的オリゴヌクレオチドTarget-2（3’末端LNA）のポリアデニル化反応を行う場合に、Ｍｎ２＋の影響を確認した試験結果であって、Target-2の濃度が濃度が０．１ｆｍｏｌの時のＭＦＩとＳＮ比の結果を示すグラフである（実施例７－１）。比較のためにＭｇ２＋の影響も確認した（比較例７－１）。 マウス４％（40mg/mL）脳マトリクスにおける標的オリゴヌクレオチドTarget-2（3’末端LNA）のポリアデニル化反応を行う場合に、Ｍｎ２＋の影響を確認した試験結果であって、Target-2の濃度が０．１ｆｍｏｌの時のＭＦＩとＳＮ比の結果を示すグラフである（実施例７－２）。比較のためにＭｇ２＋の影響も確認した（比較例７－２）。
（ポリＡ付加反応）
　本発明の第１の態様は、標的オリゴヌクレオチドにポリＡを付加する反応である。ポリＡ付加反応は、試料中の３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡとポリＡポリメラーゼ（ポリヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ）を接触させて３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡの３’末端にポリＡを付加する方法であって、Ｍｎ２＋存在下で行われる方法である。
　上記ポリＡポリメラーゼとしては、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡの３'末端にアデニン残基を導入する酵素活性を有するタンパク質を意味する。例えば、大腸菌由来のポリＡポリメラーゼが好適に使用される。
　ポリＡポリメラーゼ及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をポリＡポリメラーゼの活性条件下で接触させることによって、標的オリゴヌクレオチドをポリアデニル化することができる。
　本発明において導入するポリＡの長さに制限はないが、例えば、下限としては、４mer以上が好ましく、１０mer以上が更に好ましく、１５mer以上がよりいっそう好ましい。上限としては、１０００mer以下が好ましい。
　ポリＡポリメラーゼは、付加反応の後に、熱等で失活させることが好ましい。
　なお、本明細書中、特に断らない限りは、ポリＡ付加、ポリアデニル化する、ポリＡポリメラーゼ反応はそれぞれ同じ意味で用いるものとする。
（回収方法）
　本発明の第２の態様は、３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ（以下、単に標的オリゴヌクレオチドということがある）の回収方法である。本発明は、以下の（i）～（iii）の工程を含む。
　(i) は前記ポリＡ付加反応と同じであり、Ｍｎ２＋存在下、試料中の標的オリゴヌクレオチドとポリＡポリメラーゼを接触させて前記標的オリゴヌクレオチドの３’末端にポリＡを付加する工程である。
　(ii)は前記試料に前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させてハイブリダイゼーションさせる工程である。
　ここで、前記捕捉プローブは、（Ａ）核酸プローブと、（Ｂ）前記核酸プローブの３'末端又は５'末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含み、
　前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列を含む
　(iii)は前記試料に含まれる標的オリゴヌクレオチドと捕捉プローブとのハイブリダイゼーション生成物を回収する工程である。
　ポリＡ付加反応におけるＭｎ２＋濃度の調製については後述する。
（検出方法）
　本発明の第３の態様は、標的オリゴヌクレオチドを検出する方法であり、（i）～（iv）の工程を含む。（i）～（iii）は前記第２の態様と同じ工程であり、(iv)は回収されたハイブリダイゼーション生成物を検出する工程である。検出方法は、後述する。
（パルサー法による検出）
　本発明の第４の態様は、標的オリゴヌクレオチドをパルサー法により検出する方法であり、（i）～（iv）の工程を含む。（i）～（ii）は前記第２の態様と同じ工程である。
　（iii）は、ハイブリダイゼーション生成物に、第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブを接触させて、前記ハイブリダイゼーション生成物と、第１及び第２のオリゴヌクレオチドが自己凝集してなるオリゴヌクレオチドポリマーとの複合体を形成する工程である。（iv）は前記複合体を検出する工程である。
　（iii）、（iv）の工程は、いわゆるＰＡＬＳＡＲ法（パルサー法）と言われる自己凝集プローブの増幅、増幅したシグナルを検出する工程であるが、ハイブリダイゼーション生成物を直接増幅する場合とアシストプローブを介して増幅する場合がある。アシストプローブを介さない場合は、本発明の第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集プローブの少なくとも一方は、ポリＴ配列を含むことが好ましい。また、アシストプローブを介して増幅する場合は、前記アシストプローブは、ポリＴ配列、並びに、前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方の全配列若しくは部分配列に対して相補的な配列、を含むことが好ましい。ＰＡＬＳＡＲ法の具体的なステップ、アシストプローブ、自己凝集プローブについてはさらに後述する。
（標的オリゴヌクレオチド）
　本発明は、新たな分子標的薬として近年、特に注目され開発が活発に行われている核酸医薬品の検出に適している。核酸医薬品は、体内での分解を制御するために、ほぼすべての製品において、何らかの修飾が施された核酸が使用されていることから、本発明の検出技術が好適に応用される。例えば、「人工核酸-DNA-人工核酸」構造で知られるGapmer構造型のアンチセンス核酸医薬などが挙げられる。
　具体的には、本発明の検出対象である標的オリゴヌクレオチドは、３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡであり、上記化学修飾としては、例えばホスホロチオエート修飾（Ｓ化）、２’－Ｆ修飾、２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌ（２’－ＯＭｅ）修飾、２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ（２’－ＭＯＥ）修飾、モルフォリノ修飾、ＬＮＡ修飾、ＢＮＡＣＯＣ修飾、ＢＮＡＮＣ修飾、ＥＮＡ修飾、ｃＥｔ ＢＮＡ修飾などが挙げられる。
　このうちでも、３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチドとしては、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ホスホロチオネート、モルフォリノオリゴ、ボラノホスフェート、２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル化ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）又は２’－Ｆが好ましく、さらに好ましくはＬＮＡ、ＢＮＡ、ＭＯＥ又はＯＭｅである。
　また、ＤＮＡとしては、通常のＤＮＡが挙げられる。
　上記、標的オリゴヌクレオチド及びＤＮＡは一本鎖又は二本鎖の何れでも良く、二本鎖の場合は、通常は、一本鎖にして本発明に使用されるが、二本鎖のままで使用されてもよい。
（Ｍｎ２＋存在下）
　本発明において前記のポリＡを付加する工程は、Ｍｎ２＋存在下で行われることを要する。Ｍｎ２＋存在下とは、具体的にはＭｎ２＋を含む溶液中でポリＡ付加反応が行われることを意味する。当該溶液中のＭｎ２＋の濃度は、標的オリゴヌクレオチドの種類や試料の種類、反応溶液の種類あるいは、所望の感度によって適宜調製すればよく、３ｍＭ～３８ｍＭが好ましく、５ｍＭ～３５ｍＭがより好ましく、１０ｍＭ～３０ｍＭが更により好ましい。上記試料が水、もしくはバッファーの場合(生体試料０％)では、Ｍｎ２＋の濃度は、３ｍＭ～１７．５ｍＭが好ましく、５ｍＭ～１５ｍＭがより好ましく、７．５ｍＭ～１５ｍＭが更により好ましい。
　上記試料に生体試料（血漿、脳等）が０％（０ｍｇ／ｍｌ）より大きく１０％（１００ｍｇ／ｍｌ）未満含まれる場合には、Ｍｎ２＋の濃度は、３ｍＭ～２５ｍＭが好ましく、１０ｍＭ～２５ｍＭがより好ましく、１０ｍＭ～２０ｍＭが更により好ましい。
　上記試料に生体試料（血漿、脳等）が１０％（１００ｍｇ／ｍｌ）以上５０％（５００ｍｇ／ｍｌ）未満含まれる場合には、Ｍｎ２＋の濃度は、７．５ｍＭ～２７．５ｍＭが好ましく、１０ｍＭ～２５ｍＭがより好ましく、１２．５ｍＭ～２５ｍＭが更により好ましい。
　上記試料に生体試料（血漿、脳等）が５０％（５００ｍｇ／ｍｌ）以上１００％（１０００ｍｇ／ｍｌ）未満含まれる場合には、Ｍｎ２＋の濃度は、１２．５ｍＭ～３７．５ｍＭが好ましく、１５ｍＭ～３０ｍＭがより好ましく、１５ｍＭ～２５ｍＭが更により好ましい。
　上記試料に生体試料（血漿、脳等）が１００％（１０００ｍｇ／ｍｌ）含まれる場合には、Ｍｎ２＋の濃度は、１７ｍＭ～３８ｍＭが好ましく、１７ｍＭ～３５ｍＭがより好ましく、１７ｍＭ～３０ｍＭが更により好ましい。
　上記生体試料が脳等の個体の場合は、個体を懸濁液に懸濁して、電気伝導撹拌機等で撹拌して、個体の懸濁液を作製して、随時希釈液で希釈して調整する。好ましくは、個体が０％（０ｍｇ）～５０％（５００ｍｇ／ｍｌ）未満で調整する。
　上記懸濁液としては、通常の生体試料を懸濁する懸濁液があげられ、例えば、市販のDirect PCR Lysisi Reagent(VIAGEN biotec社)やRLT buffer(QIAGEN社)があげられる。
　上記希釈液は、通常の希釈液があげられ、例えば、水、リン酸バッファー、トリス塩酸バッファー等があげられる。
　Ｍｎ２＋を含む溶液は、後述するように緩衝液（バッファー）にＭｎ２＋を添加することによって得られる。
　濃度の設定は、希釈段階の異なるＭｎ２＋の存在下で標的オリゴヌクレオチドとポリＡポリメラーゼの反応を行い、所望活性の得られる濃度を選択することによって行うことができる。所望の活性は、当該反応工程におけるＡＴＰを基質としてＡＭＰの取り込み量の測定や、当該工程の後にパルサー反応を行い、増幅シグナルを検出することによっても評価することができる。
　本発明において、ポリＡ付加反応は、標的オリゴヌクレオチドにポリＡを付加してその付加物（以下、単に「標的オリゴヌクレオチド－ポリＡ」と記載することがある）を形成する反応であり、その後当該付加物と捕捉プローブのハイブリダイゼーションにより「標的オリゴヌクレオチド－ポリＡ」と捕捉プローブの二本鎖を形成する。
（捕捉プローブ）
　本発明において「捕捉プローブ」とは、標的オリゴヌクレオチドを捕捉するためのプローブであり、（Ａ）核酸プローブと、（Ｂ）前記核酸プローブの３’末端又は５’末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含む。
（核酸プローブ）
　本発明に使用する（Ａ）核酸プローブは、標的オリゴヌクレオチドと特異的に結合可能な物質であればよく、特に制限はないが、標的オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を含む。
　（Ｂ）の固相としては、例えば、不溶性の微粒子、マイクロビーズ、蛍光微粒子、磁気粒子、マイクロプレート、マイクロアレイ、スライドガラス、電気伝導性基板等の基板を用いることが好ましい。
　本発明に使用する「核酸プローブ」は、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列又は部分配列に対して相補的な配列を含む。好ましくは、前記標的オリゴヌクレオチドの全長に対して、前記標的オリゴヌクレオチドの３’末端若しくは５’末端を含む部分に対して相補的な配列を含み、以下の（ａ－１）と（ａ－２）の場合が挙げられる。
（ａ－１）固相又はアダプター若しくはリンカーが３’末端のヌクレオチドに隣接する場合には、核酸プローブは、当該３’末端のヌクレオチドを含む部分において、前記標的オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含む。
（ａ－２）前記固相又はアダプター若しくはリンカーが５’末端のヌクレオチドに隣接する場合には、核酸プローブは、当該５’末端のヌクレオチドを含む部分において、前記標的オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含む。
　上記核酸プローブにおいて、標的オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端を含む部分に対して相補的な配列は、標的オリゴヌクレオチドの部分に対して相補的な配列を含むことが好ましい。
　また、前記標的オリゴヌクレオチドの全長に対して相補的な配列は、全長に対してハイブリダイズできる程度の同一性があれば良く、同全長に対して完全に相補的な配列であることがより好ましい。
　また、標的オリゴヌクレオチドの３’末端にポリＡが付加されるため、核酸プローブは、標的オリゴヌクレオチドに相補的な配列の５'末端のヌクレオチドに隣接するポリ塩基Ｔ（又はＵ）を含んでいてもよい。
　上記核酸プローブの配列の長さ（塩基数）は、標的オリゴヌクレオチドと結合できる長さであればよく、例えば、下限としては、４mer以上の塩基が好ましく、１０mer以上の塩基が更に好ましく、１５mer以上の塩基が更により好ましい。上限としては、１０００mer以下の塩基が好ましい。
（固相）
　本発明における固相は、不溶性の微粒子、マイクロビーズ、蛍光微粒子、磁気粒子、マイクロプレート、マイクロアレイ、スライドガラス、電気伝導性基板等の基板等が挙げられ、好ましくは蛍光微粒子であり、更に好ましくは蛍光ビーズであり、特に好ましくは、表面に蛍光物質を有するビーズである。本発明に使用する、「表面に蛍光物質を有するビーズ」としては、蛍光物質を有するビーズであれば、特に限定されず、例えば、Luminex社のMicroPlexTM Microspheresが好適に使用することができる。1種類のビーズを用いることも、多種類のビーズを用いることもできる。カラーコード化された複数種類のビーズを使用すれば、本発明のオリゴヌクレオチドの定量方法も容易にマルチプレックス化できる。
　上記固相と上記核酸プローブは、直接結合していてもよく、アダプター又はリンカーを介して結合してもよく、好ましくは、アダプター又はリンカーを介して結合していることが好ましい。
　本発明において「核酸プローブの３’末端又は５’末端のヌクレオチドに隣接する固相」の「隣接」とは、前記ヌクレオチドに直接結合しているか、あるいはアダプターやリンカー等を介して結合していることを意味し、結合の意味については後述する。
（アダプター又はリンカー）
　本発明に使用する「アダプター又はリンカー」としては、例えば、ビオチン、Spacer 9、Spacer 12、Spacer18、Spacer C3等のスペーサー等のアミノ基若しくはカルボキシル基を有する化合物等が挙げられ、好ましくは5'-Amino-Modifier C12 (12-(4-Monomethoxytritylamino)dodecyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)、ビオチン等である。
　例えば、ビーズ表面にカルボキシル基を有し、アミノ基の化合物を付加した核酸プローブが、アミノ基を介してビーズ表面のカルボキシル基と結合する態様は、アミノ基を有する化合物がリンカーの例となる。
（標識物質）
　本発明における標識物質は、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素等が好適な例として挙げられる。
　具体的には、１２５Ｉや３２Ｐ等のラジオアイソトープ、ジゴキシゲニンやアクリジニウム・エステル等の発光・発色物質、ジオキセタン等の発光物質や４－メチルウンベリフェリルリン酸等の蛍光物質を利用するためのアルカリフォスファターゼ、アビジンに結合した蛍光・発光・発色物質等を利用するためのビオチン等、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用するためのドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素を付加させておき、標的オリゴヌクレオチドを検出することも可能である。
（核酸プローブの固相への結合）
　核酸プローブの固相への結合は、化学結合による方法、生物学的相互作用による方法、物理吸着による方法などが挙げられる。化学結合による方法では、例えば、カルボキシル基でコートされた担体を用いる場合、オリゴヌクレオチドに標識したアミノ基との間でカップリング反応をさせることができる。生物学的相互作用による方法では、例えば、担体にコートしたストレプトアビジンと、核酸プローブに修飾したビオチンとの間の結合力を利用することができる。また、物理吸着による方法では、例えば、負の電荷を有する固相を用いた場合、オリゴヌクレオチドにアミノ基など正の電荷を有する物質を標識することで、静電気的に担体に吸着させることができる。
（接触）
　本明細書において、「接触させる」、あるいは、「接触工程」という用語は、ある物質と他の物質との間で、共有結合、イオン結合、金属結合、非共有結合などの化学結合を形成できるように、これらの物質を互いに近傍に置くことを意味する。本発明の一態様においては、ある物質と他の物質を「接触させる」とは、ある物質を含む溶液と他の物質を含む溶液を混合することを意味する。試料にポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰを接触させる工程は、３０～４２℃で５～１２０分間保温すること、好ましくは、３７℃で６０分間保温することで行われる。試料と捕捉プローブの接触工程は、３０～７０℃で０．２～３０時間保温すること、好ましくは、３５～６５℃で８～２４時間保温することで行われる。試料と第１及び第２のオリゴヌクレオチドとの接触工程は、２８～７０℃で０．２～３時間保温すること、好ましくは、３０～５４℃で０．５～２時間保温することで行われる。
　また、標的オリゴヌクレオチドと捕捉プローブとの接触は、標的オリゴヌクレオチドと核酸プローブの相補的な配列の対応する塩基がハイブリダイゼーションできる条件下で行われることを意味する。同様に、自己凝集可能な一対のプローブと当該捕捉プローブとアシストプローブとの接触、自己凝集可能な一対のプローブ同士の接触も対応する塩基がハイブリダイゼーションできる条件下で行われることを意味する。
（自己凝集）
　本明細書において、「自己凝集」という用語は、複数の第１のオリゴヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより複合体を形成した状態、及び、複数の第２のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより複合体を形成した状態を意味する。
（自己凝集可能な一対のプローブ）
　本発明の方法に使用する「自己凝集可能」な一対のプローブは、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し、自己凝集反応によるプローブポリマーの形成が可能なオリゴヌクレオチドをいう。好ましくは、前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方は、標識物質により標識されている。ここで、「ハイブリダイズ可能」とは、一態様においては、当該相補的塩基配列領域において完全に相補的であることを意味する。
　自己凝集可能な一対のプローブにはあらかじめ検出のための標識物質で標識しておくことも可能である。そのような標識物質として、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素等が好適な例として挙げられる。具体的には、125Ｉや32Ｐ等のラジオアイソトープ、ジゴキシゲニンやアクリジニウム・エステル等の発光・発色物質、ジオキセタン等の発光物質や４-メチルウンベリフェリルリン酸等の蛍光物質を利用するためのアルカリフォスファターゼ、アビジンに結合した蛍光・発光・発色物質等を利用するためのビオチン等、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用するためのドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素を付加させておき、標的オリゴヌクレオチドを検出することも可能である。
　好ましくは、当該標識物質はビオチンであり、当該オリゴヌクレオチドの標識は、好ましくは５’末端又は３’末端をビオチン化することにより行われる。当該標識物質はビオチンの場合、標識物質に特異的に結合する物質はストレプトアビジン又はアビジンである。
　「自己凝集可能」な一対のプローブをより具体的に説明すると、第１のオリゴヌクレオチドが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚを含むオリゴヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチドが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含むオリゴヌクレオチドということになる。
　後述するアシストプローブを介さずにＰＡＬＳＡＲ法を行う場合は、前記核酸領域ＺがポリＴ配列を含み、かつ、前記核酸領域Ｚ’がポリＡ配列を含む態様が例示される。
　本発明における「標的オリゴヌクレオチド－ポリＡ」と捕捉プローブのハイブリダイゼーション生成物を含む試料に、第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブを接触させて、第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドポリマーとの複合体を形成させる工程は、アシストプローブを介さずに複合体を形成する場合と、アシストプローブを介して複合体を形成する場合がある。
　上記アシストプローブとは、標的オリゴヌクレオチド－ポリＡと前記オリゴヌクレオチドポリマーとの複合体を形成するためにアシストする役割を有するプローブである。アシストプローブの第一の態様は前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方の全配列又は部分配列に対して相補的な配列及び標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列を含むプローブである。
　上記アシストプローブは、標識物質で標識されていても、標識されていなくてもよい。
　また、本発明のアシストプローブは、第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方の全配列又は部分配列、並びに、標的オリゴヌクレオチドに付加したポリＡの全配列又は部分配列に相補的な配列（つまり、ポリＴ）を含むプローブである。
　例えば、自己凝集可能な一対のプローブの片方の配列がＸＹＺの場合、（ポリＴ）－Ｘ’Ｙ’Ｘ’、（ポリＴ）－Ｚ’Ｙ’Ｚ’が挙げられる。
　アシストプローブがある場合と無い場合について以下場合分けして説明する。
（アシストプローブを介さずにＰＡＬＳＡＲ法を行う場合）
　上記アシストプローブを介さずに自己凝集可能な一対のプローブと複合体を形成する場合は、前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方は、標的オリゴヌクレオチドに付加したポリＡの全配列若しくは部分配列の相補鎖（ポリＴ）を含めばよい。第１又は第２のオリゴヌクレオチドは少なくとも一方は標識物質により標識されていることが好ましい。
　本発明の標的オリゴヌクレオチドの検出方法の第１の態様として、標的オリゴヌクレオチドにポリＡを付加してＰＡＬＳＡＲ法により検出する方法について図７にもとづいて以下具体的に説明する。
　まず、標的オリゴヌクレオチドが含まれうる試料と標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを準備する。
本発明の捕捉プローブは、
　（Ａ）核酸プローブと、
　（Ｂ）前記核酸プローブの３’末端のヌクレオチド部分に固定化されたビーズを含む。
　前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列を含む。
　次に、前記試料中の標的オリゴヌクレオチドの３’末端にポリＡポリメラーゼを作用させてポリＡを付加する（図７の１））。本発明は、この工程において、反応溶液中のＭｎ２＋濃度を特定濃度に調整することにより、ポリＡの付加反応性を高め、ひいては後のＰＡＬＳＡＲ反応による検出感度を高めることを特徴とする。
　続いて、ポリＡを付加した標的オリゴヌクレオチドに、前記捕捉プローブを接触させる（１ｓｔハイブリダイゼーション）。これにより、ポリＡが付加された標的オリゴヌクレオチドと、捕捉プローブ中の核酸プローブのハイブリダイゼーションが行われ２本鎖が形成される（図７の２））。ハイブリダイゼーション生成物に含まれる標的オリゴヌクレオチドは、以下のパルサー法により定量することができる。
　前記ハイブリダイゼーション生成物を含む試料に、第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブを接触させて、ハイブリダイゼーション生成物と、第１及び第２のオリゴヌクレオチドが自己凝集してなるオリゴヌクレオチドポリマーとの複合体を形成する（いわゆるパルサー反応）。
　ここで、第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブは、第１のオリゴヌクレオチドが、５’末端側から順に核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚを含むオリゴヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチドが、５’末端側から順に、前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含んでいる（以下、当該核酸領域を単に、Ｘ，Ｙ，Ｚ，Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’ということがある）。　
　また、ＺはポリＴ配列を含み、Ｚ’がポリＡ配列を含んでいる。また、第１と第２のオリゴヌクレオチドの５’末端には標識物質が付与されている。
　ハイブリダイゼーション生成物のポリＡに第１のオリゴヌクレオチドのＺ（ポリＴ）がハイブリダイズし、第１のオリゴヌクレオチドのＸ、Ｙに第２のオリゴヌクレオチドのＸ’、Ｙ’がそれぞれハイブリダイズする。そして次々とＸとＸ’、ＹとＹ’、Ｚ（ポリＴ）とＺ’（ポリＡ）がハイブリダイズを繰り返すことで、自己凝集プローブのオリゴヌクレオチドポリマーが形成される（図７の３））。
　前記捕捉プローブと標的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション生成物及び自己凝集した第１及び第２のオリゴヌクレオチドの複合体を遠心分離法により沈殿させるなどして分離し、第１及び第２のオリゴヌクレオチドの標識物質等を検出することにより標的オリゴヌクレオチドの濃度等を測定することができる（図７の４））。
　なお、パルサー反応を行う前の捕捉プローブとポリＡの付加された標的オリゴヌクレオチドにより形成された２本鎖のハイブリダイゼーション生成物を検出することにより標的オリゴヌクレオチドを検出することも可能である。例えば、５’末端が予め標識物質で標識されたポリＴプローブを２本鎖のハイブリダイゼーション生成物のポリＡ領域にハイブリダイズさせ、ポリＴプローブの標識物質を検出することで、標的オリゴヌクレオチドを検出することができる。
（アシストプローブを介してＰＡＬＳＡＲ法を行う場合）
　上記アシストプローブを介して複合体を形成する場合は、前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドは、自己凝集反応によるプローブポリマーの形成が可能なオリゴヌクレオチドであればよい。この場合、アシストプローブは、ポリＴ、並びに、第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方の全配列若しくは部分配列を含めばよい。第１オリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、アシストプローブのうち、少なくとも一つは標識物質により標識されていることが好ましい。
　本発明の標的オリゴヌクレオチドの検出方法の第２の態様として、標的オリゴヌクレオチドにポリＡを付加して、その後アシストプローブを介して検出する方法について図８に基づいて以下、具体的に説明する。
　ポリＡを付加する工程と「ポリＡ－標的オリゴヌクレオチド」と捕捉プローブをハイブリダイゼーションさせる工程は、アシストプローブを介さずにＰＡＬＳＡＲ法を行う場合と同じである。
　前記ハイブリダイゼーション生成物を含む試料に、アシストプローブを接触させる（図８の３）アシストプローブハイブリダイゼーション）。ここで、アシストプローブは、ポリＴ配列及び第２のオリゴヌクレオチドの配列（Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’あるいは、Ｘ’，Ｙ’，Ｘ’など）を含んでいる。アシストプローブのポリＴ配列は「標的オリゴヌクレオチド－ポリＡ」のポリＡとハイブリダイズし、「標的オリゴヌクレオチド－ポリＡ」とアシストプローブの複合体を生成する。
　ここに第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブを接触させて、前記複合体と、第１及び第２のオリゴヌクレオチドが自己凝集してなるオリゴヌクレオチドポリマーとの複合体を形成する（いわゆるパルサー反応）。
　第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブは、第１のオリゴヌクレオチドが、５’末端側から順にＸ、Ｙ及びＺを含むオリゴヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチドが、５’末端側から順にＸ’、Ｙ’及びＺ’を含んでいる。第１と第２のオリゴヌクレオチドの５’末端には標識物質が付与されている。アシストプローブのＸ’、Ｙ’、Ｚ’に第１のオリゴヌクレオチドのＸ、Ｙ、Ｚがハイブリダイズし、第１のオリゴヌクレオチドに第２のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする。そして次々とＸとＸ’、ＹとＹ’、ＺとＺ’がハイブリダイズを繰り返すことで、自己凝集プローブのオリゴヌクレオチドポリマーが形成される（図８の４））。これらの複合体の検出方法は、アシストプローブが無い場合と同様である。
　パルサー法の具体例は、国際公開2013/172305号の図４～図１４などに示されており、ダイマー形成用プローブ等を用いて当業者常識にもとづき適宜変形して本発明の自己凝集反応に応用することが可能である。
　本発明の捕捉プローブ並びに、自己凝集した第１及び第２のオリゴヌクレオチドポリマー（シグナルプローブポリマー）は、好ましくは分離した方がよく、複合体の分離方法は、特に限定されず、好ましくは、遠心分離法、吸引ろ過法が挙げられる。
　捕捉プローブ及びその複合体を「遠心分離法」により沈殿させる工程は、通常、２０～３０℃で０．２～５分間、５００～３０００×ｇの遠心、２３～２８℃で０．５～２分間、８００～１５００×gの遠心、好ましくは、２５℃で１分間、１０００×gの遠心にて行う。より具体的には、ビーズの製造会社の取扱説明書に従えばよい。
　捕捉プローブ及びその複合体を「吸引ろ過法」により分離させる工程は、Biochem Biophys Res Commun. 2015 Nov 27;467(4):1012-8.に記載の方法にて実施できる。具体的には、捕捉プローブ及びその複合体を含む溶液をフィルタープレートへ移し変え、通常、２０～３０℃で陰圧範囲１～１０in.Hgの吸引、２３～２８℃で１～１０in.Hgの吸引、好ましくは、２５℃で１～５in.Hgの吸引にて行う。吸引時間は、フィルター上から目視で液体が除去されていればよく、例えば１秒～５分間、好ましくは５秒間～１分間が挙げられる。フィルタープレートのポアサイズは、捕捉プローブの直径より小さいものが好適に用いられ、例えば1.2μm又は1.0μmが好ましい。具体的な部材の例として、フィルタープレート:MultiScreen(登録商標) HTS-BV plate (Merck Millipore、製品番号:MSBVN1250)、マニフォールド:MultiScreen(登録商標) HTS Vacuum Manifold (Merck Millipore)、吸引ポンプ:Chemical duty pump (Merck Millipore、カタログ番号:WP6110060) が挙げられる。
（試料）
　本発明の方法に使用する「試料」は、ヒト、サル、イヌ、ブタ、ラット、モルモット又はマウスの全血、血清、血漿、リンパ液、尿、唾液、涙液、汗、胃液、膵液、胆汁、胸水、関節腔液、脳脊髄液、髄液、骨髄液などの体液又は脳、肝臓、腎臓、肺、心臓などの組織等の生体試料が挙げられる。好ましくは、試料は、ヒトの全血、血清、血漿、脳又は尿である。更に好ましくは、試料は、標的オリゴヌクレオチドを含む医薬を投与されたヒトの全血、血清、血漿、脳又は尿である。これらは水又はバッファーで希釈されて用いられることもある。
　また、本発明の試料は、標的オリゴヌクレオチドを水又はバーファーで希釈したものも含む。
　上記バッファーとしては、一般的に使用されるものであればよく、例えば、トリス塩酸、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、フタル酸、グルタル酸、マレイン酸、グリシン及びそれらの塩などや、ＭＥＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグット緩衝液などが挙げられ、水としては、RNase, DNase free waterなどが挙げられる。
　本発明の第１及び第２オリゴヌクレオチドポリマーを検出する方法は、例えば、濁度法、アガロース電気泳動法、吸光度法、蛍光測定法、電気化学発光法、フローサイトメトリー法が挙げられ、好ましくは、フローサイトメトリー法が挙げられる。
　フローサイトメトリー法としては、例えば、「フローサイトメトリー法を用いて、第１の蛍光物質が発する第１の蛍光と第２の蛍光物質が発する第２の蛍光を検出する工程」で行われ、「フローサイトメトリー法を用いて、第１の蛍光物質が発する第１の蛍光と第２の蛍光物質が発する第２の蛍光を検出する工程」は、第１の蛍光物質が発する第１の蛍光と第２の蛍光物質が発する第２の蛍光を、同時に又は同一機会に検出することが好ましい。ここで、「同時又は同一機会に検出する」とは、１つの複合体（３成分複合体又は４成分複合体）に含まれる第１の蛍光物質と第２の蛍光物質が、フローサイトメーターの流路内で同時に又は順次に励起され、発せられた第１の蛍光と第２の蛍光が、当該１つの複合体から発せられた蛍光として検出されることを意味する。
　より具体的には、第1の蛍光物質としては、捕捉プローブの固相に含まれる蛍光物質等が挙げられ、第２の蛍光物質としては、第1及び第２のオリゴヌクレオチドに付与された標識物質に特異的に結合する物質に予め結合された蛍光物質が挙げられる。これらの第1及び第２の蛍光物質が含まれる反応液をフローサイトメトリー法を用いて、第1の蛍光物質が発する第1の蛍光と第２の蛍光物質が発する第２の蛍光を検出することができる。
　本発明においてポリＡポリメラーゼ緩衝液キットには、少なくとも以下の構成が含まれる。
（１）ポリＡポリメラーゼ
（２）Ｍｎ２＋を最終反応溶液で３ｍＭ～３８ｍＭとなるように含む反応バッファー溶液
（３）ＡＴＰ
　上記（２）の反応バッファー溶液は、試料、キットの各試薬等を加えた最終反応溶液でのＭｎ２＋の濃度が３ｍＭ～３８ｍＭになる濃度であればよく、好ましくは５ｍＭ～３５ｍＭであり、より好ましくは１０ｍＭ～３０ｍＭである。例えば、２倍溶液（ｘ２）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が６ｍＭ～７６ｍＭであればよく、好ましくは１０ｍＭ～７０ｍＭであり、より好ましくは２０ｍＭ～６０ｍＭである。３倍溶液（ｘ３）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が９ｍＭ～１１４ｍＭであればよく、好ましくは１５ｍＭ～１０５ｍＭであり、より好ましくは３０ｍＭ～９０ｍＭである。４倍溶液（ｘ４）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が１２ｍＭ～１５２ｍＭであればよく、好ましくは２０ｍＭ～１４０ｍＭであり、より好ましくは４０ｍＭ～１２０ｍＭである。５倍溶液（ｘ５）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が１５ｍＭ～１９０ｍＭであればよく、好ましくは２５ｍＭ～１７５ｍＭであり、より好ましくは５０ｍＭ～１５０ｍＭである。６倍溶液（ｘ６）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が１８ｍＭ～２２８ｍＭであればよく、好ましくは３０ｍＭ～２１０ｍＭであり、より好ましくは６０ｍＭ～１８０ｍＭである。７倍溶液（ｘ７）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が２１ｍＭ～２６６ｍであればよく、好ましくは３５ｍＭ～２４５ｍＭであり、より好ましくは７０ｍＭ～２１０ｍＭである。８倍溶液（ｘ８）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が２４ｍＭ～３０４ｍＭであればよく、好ましくは４０ｍＭ～２８０ｍＭであり、より好ましくは８０ｍＭ～２４０ｍＭである。９倍溶液（ｘ９）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が２７ｍＭ～３４２ｍＭであり、好ましくは４５ｍＭ～３１５ｍＭであり、より好ましくは９０ｍＭ～２７０ｍＭである。１０倍溶液（ｘ１０）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が３０ｍＭ～３８０ｍＭであればよく、好ましくは５０ｍＭ～３５０ｍＭであり、より好ましくは１００ｍＭ～３００ｍＭである。
　バッファーとしては、ポリＡポリメラーゼの活性が保持されるものであればいずれでもよく、一般的には、トリス塩酸、リン酸等が用いられる。
（水もしくはバッファー中の成分測定の場合のキットの説明）
　上記ポリＡポリメラーゼ緩衝液キットが水もしくはバッファー中の成分を測定する場合には、上記（２）の反応バッファーがＭｎ２＋を最終反応溶液で３ｍＭ～１７．５ｍＭとなるように含まれている。
　水もしくはバッファー中の成分を測定する場合には、上記（２）の反応バッファー溶液は、試料、キットの各試薬等を加えた最終反応溶液でのＭｎ２＋の濃度が３ｍＭ～１７．５ｍＭになる濃度であればよく、好ましくは５ｍＭ～１５ｍＭであり、より好ましくは７．５ｍＭ～１５ｍＭになる濃度である。例えば、２倍溶液（ｘ２）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が６ｍＭ～３５ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ～３０ｍＭ、より好ましくは１５ｍＭ～３０ｍＭである。３倍溶液（ｘ３）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が９ｍＭ～５２．５ｍＭであればよく、好ましくは１５ｍＭ～４５ｍＭであり、より好ましくは２２．５ｍＭ～４５ｍＭである。４倍溶液（ｘ４）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が１２ｍＭ～７０ｍＭであればよく、好ましくは２０ｍＭ～６０ｍＭであり、より好ましくは３０ｍＭ～６０ｍＭである。５倍溶液（ｘ５）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が１５ｍＭ～８７．５ｍＭであればよく、好ましくは２５ｍＭ～７５ｍＭであり、より好ましくは３７．５ｍＭ～７５ｍＭである。６倍溶液（ｘ６）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が１８ｍＭ～１０５ｍＭであればよく、好ましくは３０ｍＭ～９０ｍＭであり、より好ましくは４５ｍＭ～９０ｍＭである。７倍溶液（ｘ７）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が２１ｍＭ～１２２．５ｍＭであればよく、好ましくは３５ｍＭ～１０５ｍＭであり、より好ましくは５２．５ｍＭ～１０５ｍＭである。８倍溶液（ｘ８）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が２４ｍＭ～１４０ｍＭであればよく、好ましくは４０ｍＭ～１２０ｍＭであり、より好ましくは６０ｍＭ～１２０ｍＭである。９倍溶液（ｘ９）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が２７ｍＭ～１５７．５ｍＭであればよく、好ましくは４５ｍＭ～１３５ｍＭであり、より好ましくは６７．５ｍＭ～１３５ｍＭである。１０倍溶液（ｘ１０）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が３０ｍＭ～１７５ｍＭであればよく、好ましくは５０ｍＭ～１５０ｍＭであり、より好ましくは７５ｍＭ～１５０ｍＭである。
（生体試料１００％（血液試料１００％等）成分測定の場合のキットの説明）
　上記ポリＡポリメラーゼ緩衝液キットが生体試料１００％（血液試料１００％等）を測定する場合には、上記（２）の反応バッファーがＭｎ２＋を最終反応溶液で１７ｍＭ～３８ｍＭとなるように含まれている。
　生体試料１００％（血液試料１００％等）成分を測定する場合には、上記（２）の反応バッファー溶液は、試料、キットの各試薬等を加えた最終反応溶液でのＭｎ２＋の濃度が１７ｍＭ～３８ｍＭになる濃度であればよく、好ましくは１７ｍＭ～３５ｍＭであり、より好ましくは１７～３０ｍＭになる濃度である。例えば、２倍溶液（ｘ２）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が３４ｍＭ～７６ｍＭであればよく、好ましくは３４ｍＭ～７０ｍＭであり、より好ましくは３４ｍＭ～６０ｍＭである。３倍溶液（ｘ３）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が５１ｍＭ～１１４ｍＭであればよく、好ましくは５１ｍＭ～１０５ｍＭであり、より好ましくは５１ｍＭ～９０ｍＭである。４倍溶液（ｘ４）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が６８ｍＭ～１５２ｍＭであればよく、好ましくは６８ｍＭ～１４０ｍＭであり、より好ましくは６８ｍＭ～１２０ｍＭである。５倍溶液（ｘ５）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が８５ｍＭ～１９０ｍＭであればよく、好ましくは８５ｍＭ～１７５ｍＭであり、より好ましくは８５ｍＭ～１５０ｍＭである。６倍溶液（ｘ６）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が１０２ｍＭ～２２８ｍＭであればよく、好ましくは１０２ｍＭ～２１０ｍＭであり、より好ましくは１０２ｍＭ～１８０ｍＭである。７倍溶液（ｘ７）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が１１９ｍＭ～２６６ｍＭであればよく、好ましくは１１９ｍＭ～２４５ｍＭであり、より好ましくは１１９ｍＭ～２１０ｍＭである。８倍溶液（ｘ８）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が１３６ｍＭ～３０４ｍＭであればよく、好ましくは１３６ｍＭ～２８０ｍＭであり、より好ましくは１３６ｍＭ～２４０ｍＭである。９倍溶液（ｘ９）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が１５３ｍＭ～３４２ｍＭであればよく、好ましくは１５３ｍＭ～３１５ｍＭであり、より好ましくは１５３ｍＭ～２７０ｍＭである。１０倍溶液（ｘ１０）の場合は、Ｍｎ２＋の濃度が１７０ｍＭ～３８０ｍＭであればよく、好ましくは１７０ｍＭ～３５０ｍＭであり、より好ましくは１７０ｍＭ～３００ｍＭである。
　また、本発明の標的オリゴヌクレオチドを検出するキットには、上記（１）、（２）のほかに、以下の（３）、（４）が含まれる。
（３）標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブ
（４）第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブ
　また、必要に応じてアシストプローブ等が含まれている。各構成については、上述のとおりである。
　上記反応バッファーは、長期間保存すると沈殿が生じる場合があるので、用時調製が好ましく、ＤＴＴ等の酸化還元剤あるいは、ＥＤＴＡ等のキレート剤が添加されていてもよい。
　上記酸化還元剤及びキレート剤の濃度は、好ましくは０．０１ｍＭ～５ｍＭ、更に好ましくは、０．５ｍＭ～２ｍＭである。
　また、上記酸化還元剤、還元剤は、ポリＡ付加反応の工程において、添加してもよい。
〔実施例１〕ポリＡポリメラーゼによるポリＡ付加反応時のMnCl2濃度について（マウス１００％血漿マトリクス）
（１）ポリＡ付加反応
（１－１）サンプルの調製
　以下に示す配列のTarget-1（標的オリゴヌクレオチド）を、最終濃度が0、１、10fmolの濃度となるようにマウス血漿（日本チャールスリバー社）で調整した。
＜target-1の配列＞　
T(L)^G(L)^A(L)^g^c^t^g^a^c^t^t^g^a^T(L)^G(L)^5(L) （塩基配列部分について配列表配列番号１）
「（L）」は「LNA」を示す。
「５」は「５-methyl cytosine」を示す。
「^」は「S（ホスホロチオエート）化されている」ことを示す。
（１－２）ポリＡポリメラーゼ反応液の調製
(i)市販キットによるPAP Mixの調製（比較例１）
　A-PlusTM Poly(A) Polymerase Tailing Kit（CELLSCRIPT社、製品番号: C-PAP5104H）の添付試薬を用いて、10x 反応バッファー（キット添付；0.5 M Tris-HCl (pH 8.0), 2.5 M NaCl, and 100mM MgCl2）を4μL、10mM ATP（キット添付）を4μL、poly(A) polymerase（キット添付）を1μL、Nuclease-Free Waterを26μL混合して、合計35μLのPAP Mixを調製した。キット添付のPAP Mixを用いた場合のポリＡポリメラーゼ反溶液中のMgCl2の最終濃度度は10mMである。
(ii)本発明のPAP Mixの調製（実施例１）
　Target-1の3’末端にポリＡを付加するため、自家調製した5xPAP Mn buffer（0.25 M Tris-HCl (pH 8.0), 1.25 M NaCl, and MnCl2）を用いて、PAP反応を行った。反応溶液は、PCRプレートを用いて、全量40μL中、終濃度が、1xPAP Mn buffer、1mM ATP、となるように調整した。また、ポリＡポリメラーゼは、4U添加した。MnCl2濃度は、1xPAP Mn buffer中の濃度が、2.5、10、15、20、22.5、25、30、35、40mM となるよう5xPAP Mn buffer を調製し実験に用いた。
（１－３）ポリＡ付加反応
　PCRプレートにPAP Mixを35μL、及び、target-1溶液を5μL添加し、混合した(合計40μL)。サーマルサイクラー（Eppendorf社製　Mastercycler nexus GSX1）を用いて、反応液を37℃で60分間保温した後、65℃で10分間熱処理し、4℃で保持した。
（２）ポリＡ付加オリゴヌクレオチドの捕捉プローブへの捕捉（ハイブリダイゼーション）
（２－１）捕捉プローブの調製
　Luminex社のMicroPlexTM Microspheres(Region No.: 43、製品番号: LC10043-01)に、target-1に相補的な以下に示す配列の核酸プローブCP-1（配列表配列番号２）を、3’末端のNH2修飾を介して結合させることにより調製した（測定対象物質捕捉ビーズという）。
＜核酸プローブCP-1の配列＞
gcatcaagtcagctca（配列表配列番号２）
（２－２）1ｓｔハイブリダイゼーション反応液の組成
　PAP反応溶液と混合した65μL中、終濃度が、1.6xsupplement（10x supplement；[500 mM Tris-HCl (pH8.0)、40mM EDTA (pH8.0)、8% N-ラウロイルサルコシンナトリウム]）、1.1M テトラメチルアンモニウムクロリド（以下、TMACという）（SIGMA、T3411）、上記（２－１）で調製した測定対象物質捕捉ビーズが500個となるように調製した。
（２－３）1stハイブリダイゼーション反応
　poly(A)付加反応後のオリゴヌクレオチド溶液に、25μLの1stハイブリダイゼーション反応液を添加し、混合した(合計65μL)。当該混合液を42℃で1時間保温後、4℃で保持した。
（３）検出用複合体形成反応（自己凝集反応／パルサー反応）
（３－１）PALSAR反応液の調製
　1stハイブリダイゼーション反応液と混合した100μL中、終濃度が1.6xsupplement、2.1M TMACとなるよう添加した。自己凝集可能な一対のプローブとして、5’末端がビオチン標識された、以下に示す配列のHCP-1（配列表配列番号３）、及び、HCP-2（配列表配列番号４）を用いた。HCP-1、HCP-2のそれぞれの濃度は、最終濃度がそれぞれ、0.7pmol/μL、0.56pmol/μLとなるように添加した。
＜HCP-1の配列＞
5’-(biotin)CAACAATCAGGAC　GATACCGATGAAG　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’（塩基配列部分について配列表配列番号３）
＜HCP-2の配列＞
5’-(biotin)GTCCTGATTGTTG　CTTCATCGGTATC　AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’（ 塩基配列部分について配列表配列番号４）
（３－２）検出用複合体形成反応（自己凝集反応／パルサー反応）
　1stハイブリダイゼーション工程後の反応液65μLに、PALSAR反応液を35μL加え、計100μLとし、42℃で1時間反応させ、4℃で保持した。
（４）分離工程（洗浄工程）
　検出用複合体形成反応後に、室温で1000×g、1分間遠心し、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。その後、1xPBS-TP [1x PBS (Nippon Gene)、0.02% Tween 20(CALBIOCHEM)、1.5ppm ProClin 300（SIGMA)]を添加し、室温で1000×g、1分間遠心し、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。
（５）検出工程(蛍光検出）
　複合体形成反応後の反応液を1xPBS-TPで1回洗浄した後、検出試薬[Streptavidin-R-Phycoerythrin （以下、SA-PEという）(Prozyme社製) 5 μg/mL]を50 μL加え、25℃の遮光下で10分間静置した後、1xPBS-TPで２回洗浄した。その後1xPBS-TPを75 μL加え、Luminex System (Luminex社製)でビーズ及びSA-PE複合体らの蛍光を測定し、測定対象物質のシグナルを検出した。
（６）結果
　マウス１００％血漿マトリクスにおけるTarget-1(3’末端LNA)のポリＡポリメラーゼ反応時のMnCl2濃度の検討結果を図1～図3に示した。
　図１は、Target-1が含まれていないバックグラウンド（BG）の結果である。実施例１では、MnCl2濃度が15mMより大きく40mM以下でバックグラウンドが大幅に抑制された。このMnCl2濃度範囲内のBG値は、比較例１のキット添付のMgCl2 bufferを用いたときよりも低い値となった。
　図２及び図３は、Target-1の濃度が、1fmol、10fmolの時のMFIとSN比の結果を示すグラフである。実施例１のSN比のグラフをみると、バッファー中のMnCl2濃度が15mMより大きく40mM以下でSN比が大幅に上昇し、比較例１の一般的なポリＡポリメラーゼ反応 (市販キット添付のバッファー：MgCl2を用いた場合)よりもSN比の値は数百倍も高くなった。
　以上のことより、Target-1にポリＡポリメラーゼを反応させる場合に、バッファー中にMnCl2を添加し、濃度を適切な範囲に調製することにより、バックグランドを抑え、かつＳＮ比を大幅に上昇させることが可能であることがわかった。
[実施例２]PAP Mn bufferにおける標的オリゴヌクレオチド濃度依存性について（マウス１００％血漿マトリクス）
（１）ポリＡ付加反応
（１－１）サンプルの調製
　標的オリゴヌクレオチド（Target-1；配列表配列番号１）は、最終濃度が0、10、31.6、100、316、1000、3160、10000 amolの濃度となるようにマウス血漿（日本チャールスリバー社）で調製した。
（１－２）ポリＡポリメラーゼ反応液の調製
(i)市販キットによるPAP Mixの調製（比較例２）
　A-PlusTM Poly(A) Polymerase Tailing Kit（CELLSCRIPT社、製品番号: C-PAP5104H）の添付試薬を用いて、10x 反応バッファー（キット添付；0.5 M Tris-HCl (pH 8.0), 2.5 M NaCl, and 100mM MgCl2）を4μL、10mM ATP（キット添付）を4μL、poly(A) polymerase（キット添付）を1μL、Nuclease-Free Waterを26μL混合して、合計35μLのPAP Mixを調製した。キット添付のPAP Mixを用いた場合のポリＡポリメラーゼ反溶液中のMgCl2の最終濃度度は10mMである。
 (ii)本発明のPAP Mixの調製（実施例２）
　Target-1の3’末端にpolyAを付加するため、自家調製した5xPAP Mn bufferを用いて、PAP反応を行った。反応溶液は、PCRプレートを用いて、全量40μL中、終濃度が、1xPAP Mn buffer、1mM ATP、となるように調整した。また、ポリＡポリメラーゼは、4U添加した。MnCl2濃度は、1xPAP Mn buffer中の濃度が、22.5mM となるよう5xPAP Mn buffer を調製し実験に用いた。
（１－３）ポリＡ付加反応
　PCRプレートにPAP Mixを35μL、及び、Target-1溶液を5μL添加し、混合した(合計40μL)。サーマルサイクラーを用いて、反応液を37℃で60分間保温した後、65℃で10分間熱処理し、4℃で保持した。
（２）ポリＡ付加オリゴヌクレオチドの捕捉プローブへの捕捉（ハイブリダイゼーション）
（２－１）捕捉プローブの調製
　Luminex社のMicroPlexTM Microspheres(Region No.: 43、製品番号: LC10043-01)に、Target-1に相補的な核酸プローブCP-1（配列表配列番号２）を、3’末端のNH2修飾を介して結合させることにより調製した（測定対象物質捕捉ビーズという）。
（２－２）1stハイブリダイゼーション反応液 の組成
　PAP反応溶液と混合した65μL中、終濃度が、1.6xsupplement（10x supplement；[500 mM Tris-HCl (pH8.0)、40mM EDTA (pH8.0)、8% N-ラウロイルサルコシンナトリウム]）、1.1M TMAC、上記（２－１）で調製した測定対象物質捕捉ビーズが500個となるように調整した。
（２－３）1stハイブリダイゼーション反応
　ポリＡ付加反応後のオリゴヌクレオチド溶液に、25μLの1st ハイブリダイゼーション反応液を添加し、混合した(合計65μL)。当該混合液を42℃で１時間保温後、4℃で保持した。
（３）検出用複合体形成反応（自己凝集反応／パルサー反応）
（３－１）PALSAR反応液の調製
　1stハイブリダイゼーション反応液と混合した100μL中、終濃度が1.6xsupplement、2.1M TMACとなるよう添加した。自己凝集可能な一対のプローブとして、5’末端がビオチン標識された、HCP-1（配列表配列番号３）、及び、HCP-2（配列表配列番号４）を用いた。HCP-1、HCP-2のそれぞれの濃度は、最終濃度がそれぞれ、0.7pmol/μL、0.56pmol/μLとなるように添加した。
（３－２）検出用複合体形成反応（自己凝集反応／パルサー反応）
　1stハイブリダイゼーション工程後の反応液65 μLに、PALSAR反応液を35μL加え、計100μLとし、42℃で1時間反応させ、4℃で保持した。
（４）分離工程（洗浄工程）
　検出用複合体形成反応後に、室温で1000×g、1分間遠心し、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。その後、1xPBS-TP [1x PBS (Nippon Gene)、0.02% Tween 20(CALBIOCHEM)、1.5ppm ProClin 300（SIGMA)]を添加し、室温で1000×g、1分間遠心し、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。
（５）検出工程(蛍光検出）
　複合体形成反応後の反応液を1xPBS-TPで1回洗浄した後、検出試薬[SA-PE (Prozyme社製) 5μg/mL]を50 μL加え、25℃の遮光下で10分間静置した後、1xPBS-TPで2 回洗浄した。その後1xPBS-TPを75μL加え、Luminex System (Luminex社製)でビーズ及びSA-PE複合体からの蛍光を測定し、測定対象物質のシグナルを検出した。
（６）試験結果
（６－１）濃度依存性
　マウス１００％血漿マトリクスでの、PAP Mn bufferにおけるTarget-1濃度依存性についての結果を図４－６に示した。
　図４は、マウス１００％血漿マトリクスにおけるPAP Mn buffer（実施例２）におけるTarget-1濃度の直線性を示している。Target-1の濃度が0-1000 amolの範囲でR2値0.9943が得られ、比較例２のキット添付のMg bufferを用いた場合のtarget濃度依存性を示す直線（図５）と比較しても遜色ない、良好な直線性が得られた。
（６－２）ＳＮ比
　図６は、Target濃度ごとのMn buffer（実施例２）とMg buffer（比較例２）におけるSN比の比較を示した。いずれのTarget-1濃度においても、Mg buffer（比較例２）よりも、Mn buffer（実施例２）の方が、SN比が大幅に上昇していることが示された。また、Target濃度10 amolにおけるSN比は、Mg buffer（比較例２）は、2であり、Mg bufferでは、target濃度10 amol以下の感度が得られないことを示している。一方、Mn buffer（実施例２）では、Target-1濃度10 amolのSN比は、９であり、10 amol以下でも感度が得られることを示している。
　以上より、Target濃度依存性は、Mn bufferにおいて良好であり、定量性があることがわかった。　
　また、本発明におけるMn bufferを用いることにより、検出感度を上昇させることが可能であることがわかった。
[実施例３]PAP 17.5mM Mn bufferにおける標的オリゴヌクレオチド濃度依存性について（マウス１００％血漿マトリクス）
（１）ポリＡ付加反応
（１－１）サンプルの調製
　標的オリゴヌクレオチド（Target-1；配列表配列番号１）は、最終濃度が0、10、31.6、100、316、1000、3160 amolの濃度となるようにマウス血漿（日本チャールスリバー社）で調整した。
（１－２）ポリＡポリメラーゼ反応液の調製
(i)市販キットによるPAP Mixの調製（比較例３）
　A-PlusTM Poly(A) Polymerase Tailing Kit（CELLSCRIPT社、製品番号: C-PAP5104H）の添付試薬を用いて、10x 反応バッファー（キット添付；0.5 M Tris-HCl (pH 8.0), 2.5 M NaCl, and 100mM MgCl2）を4μL、10mM ATP（キット添付）を4μL、poly(A) polymerase（キット添付）を1μL、Nuclease-Free Waterを26μL混合して、合計35μLのPAP Mixを調製した。キット添付のPAP Mixを用いた場合のポリＡポリメラーゼ反溶液中のMgCl2の最終濃度度は10mMである。
 (ii)本発明のPAP Mixの調製（実施例３）
　Target-1の3’末端にpolyAを付加するため、自家調製した5xPAP Mn bufferを用いて、PAP反応を行った。反応溶液は、PCRプレートを用いて、全量40μL中、終濃度が、1xPAP Mn buffer、1mM ATP、となるように調整した。また、ポリＡポリメラーゼは、4U添加した。MnCl2濃度は、1xPAP Mn buffer中の濃度が、17.5mM となるよう5xPAP Mn buffer を調製し実験に用いた。
（１－３）ポリＡ付加反応
　PCRプレートにPAP Mixを35μL、及び、Target-1溶液を5μL添加し、混合した(合計40μL)。サーマルサイクラーを用いて、反応液を37℃で60分間保温した後、65℃で10分間熱処理し、4℃で保持した。
（２）ポリＡ付加オリゴヌクレオチドの捕捉プローブへの捕捉（ハイブリダイゼーション）
（２－１）捕捉プローブの調製
　Luminex社のMicroPlexTM Microspheres(Region No.: 43、製品番号: LC10043-01)に、Target-1に相補的な核酸プローブCP-1（配列表配列番号２）を、3’末端のNH2修飾を介して結合させることにより調製した（測定対象物質捕捉ビーズという）。
（２－２）1stハイブリダイゼーション反応液 の組成
　PAP反応溶液と混合した65μL中、終濃度が、0.8x supplement（10x supplement；[500 mM Tris-HCl (pH8.0)、40mM EDTA (pH8.0)、8% N-ラウロイルサルコシンナトリウム]）、1.1M TMAC、上記（２－１）で調製した測定対象物質捕捉ビーズが500個となるように調整した。
（２－３）1stハイブリダイゼーション反応
　ポリＡ付加反応後のオリゴヌクレオチド溶液に、25μLの1st ハイブリダイゼーション反応液を添加し、混合した(合計65μL)。当該混合液を42℃で１時間保温後、4℃で保持した。
（３）検出用複合体形成反応（自己凝集反応／パルサー反応）
（３－１）PALSAR反応液の調製
　1stハイブリダイゼーション反応液と混合した100μL中、終濃度が0.8x supplement、1.6M TMACとなるよう添加した。自己凝集可能な一対のプローブとして、5’末端がビオチン標識された、HCP-1（配列表配列番号３）、及び、HCP-2（配列表配列番号４）を用いた。HCP-1、HCP-2のそれぞれの濃度は、最終濃度がそれぞれ、0.35pmol/μL、0.245pmol/μLとなるように添加した。
（３－２）検出用複合体形成反応（自己凝集反応／パルサー反応）
　１stハイブリダイゼーション工程後の反応液65μLに、PALSAR反応液を35μL加え、計100μLとし、42℃で1時間反応させ、4℃で保持した。
（４）分離工程（洗浄工程）
　検出用複合体形成反応後に、室温で1000×g、1分間遠心し、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。その後、1xPBS-TP [1x PBS (Nippon Gene)、0.02% Tween 20(CALBIOCHEM)、1.5ppm ProClin 300（SIGMA)]を添加し、室温で1000×g、1分間遠心し、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。
（５）検出工程(蛍光検出）
　複合体形成反応後の反応液を1xPBS-TPで1回洗浄した後、検出試薬[SA-PE (Prozyme社製) 5μg/mL]を50 μL加え、25℃の遮光下で10分間静置した後、1xPBS-TPで2 回洗浄した。その後1xPBS-TPを75μL加え、Luminex System (Luminex社製)でビーズ及びSA-PE複合体からの蛍光を測定し、測定対象物質のシグナルを検出した。
（６）試験結果
（６－１）濃度依存性
　マウス１００％血漿マトリクスでの、PAP 17.5mM Mn bufferにおけるTarget-1濃度依存性についての結果を図９、図１０に示した。
　図９は、マウス１００％血漿マトリクスでの、PAP 17.5mM Mn buffer（実施例３）におけるTarget-1濃度の直線性を示している。Target-1の濃度が0-1000 amolの範囲でR2値0.9976が得られ、良好な直線性が得られた。
（６－２）ＳＮ比
　図１０は、Target-1濃度ごとの17.5mM Mn buffer（実施例３）とMg buffer（比較例３）におけるSN比の比較を示した。いずれのTarget-1濃度においても、Mg buffer（比較例３）よりも、Mn buffer（実施例３）の方が、SN比が大幅に上昇していることが示された。また、Target-1濃度10 amolにおけるSN比は、Mg buffer（比較例３）は、2であり、Mg bufferでは、Target-1濃度10 amol以下の感度が得られないことを示している。一方、Mn buffer（実施例３）では、Target-1濃度10 amolのSN比は、８であり、10 amol以下でも感度が得られることを示している。
　以上より、Target-1濃度依存性は、17.5mM Mn bufferにおいて良好であり、定量性があることがわかった。また、本発明における17.5mM Mn bufferを用いることにより、検出感度を上昇させることが可能であることがわかった。
〔実施例４-１〕ポリＡポリメラーゼによるポリＡ付加反応時のMnCl2濃度について（マウス５０％血漿マトリクス）
（１）ポリＡ付加反応
（１－１）サンプルの調製
　以下に示す配列のTarget-2（標的オリゴヌクレオチド）を、最終濃度が0、0.1fmolの濃度となるようにマウス５０％血漿マトリクスで調整した。マウス５０％血漿マトリクスは、マウス血漿（日本チャールスリバー社）をRNase-Free Waterで2倍希釈したものを使用した。
＜target-2の配列＞　
T(L)^G(L)^A(L)^g^c^t^g^a^c^t^t^g^a^T(L)^G(L)^T(L) （塩基配列部分について配列表配列番号５）
「（L）」は「LNA」を示す。
「^」は「S（ホスホロチオエート）化されている」ことを示す。
（１－２）ポリＡポリメラーゼ反応液の調製
(i)市販キットによるPAP Mixの調製（比較例４-１）
　Poly(A) Tailing Kit（Invitrogen社、製品番号: AM1350）の添付試薬を用いて、合計10μLのPAP Mixを調製した。5x E-PAPバッファー（キット添付）を4μL、10mM ATP溶液（キット添付）を2μL、E-PAP（キット添付）を0.4μL、Nuclease-Free Waterを3.6μL混合して、合計10μLのPAP Mixを調製した。
(ii)本発明のPAP Mixの調製（実施例４-１）
　Target-2の3’末端にポリＡを付加するため、自家調製した5xPAP Mn bufferを用いて、PAP反応を行った。反応溶液は、PCRプレートを用いて、全量20μL中、終濃度が、1xPAP Mn buffer、1mM ATPとなるように調整した。また、ポリＡポリメラーゼは0.8U添加した。MnCl2濃度は、1xPAP Mn buffer中の濃度が、5、10、15、17.5、20、22.5、25、30、35、40mM となるよう5xPAP Mn buffer を調製し実験に用いた。
（１－３）ポリＡ付加反応
　PCRプレートにPAP Mixを10μL、及び、target-2溶液を10μL添加し、混合した(合計20μL)。サーマルサイクラー（Eppendorf社製　Mastercycler nexus GSX1）を用いて、反応液を37℃で60分間保温した後、65℃で10分間熱処理し、4℃で保持した。
（２）ポリＡ付加オリゴヌクレオチドの捕捉プローブへの捕捉（ハイブリダイゼーション）
（２－１）捕捉プローブの調製
　Luminex社のMicroPlexTM Microspheres(Region No.: 43、製品番号: LC10043-01)に、Target-2に部分相補的な核酸プローブCP-1（配列表配列番号２）を、3’末端のNH2修飾を介して結合させることにより調製した（測定対象物質捕捉ビーズという）。
（２－２）1ｓｔハイブリダイゼーション反応液の組成
　PAP反応溶液と混合した35μL中、終濃度が、0.8x supplement（10x supplement；[500 mM Tris-HCl (pH8.0)、40mM EDTA (pH8.0)、8% N-ラウロイルサルコシンナトリウム]）、1.1M TMAC、上記（２－１）で調製した測定対象物質捕捉ビーズが500個となるように調整した。
（２－３）1stハイブリダイゼーション反応
　poly(A)付加反応後のオリゴヌクレオチド溶液に、15μLの1stハイブリダイゼーション反応液を添加し、混合した(合計35μL)。当該混合液を42℃で1時間保温後、4℃で保持した。
（３）検出用複合体形成反応（自己凝集反応／パルサー反応）
（３－１）PALSAR反応液の調製
　1stハイブリダイゼーション反応液と混合した50μL中、終濃度が0.8x supplement、1.6M TMACとなるよう添加した。自己凝集可能な一対のプローブとして、5’末端がビオチン標識された、HCP-1（配列表配列番号３）、及び、HCP-2（配列表配列番号４）を用いた。HCP-1、HCP-2のそれぞれの濃度は、最終濃度がそれぞれ、0.7pmol/μL、0.49pmol/μLとなるように添加した。
（３－２）検出用複合体形成反応（自己凝集反応／パルサー反応）
　1stハイブリダイゼーション工程後の反応液35μLに、PALSAR反応液を15μL加え、計50μLとし、42℃で1時間反応させ、4℃で保持した。
（４）分離工程（洗浄工程）
　検出用複合体形成反応後に、室温で1000×g、1分間遠心し、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。その後、1xPBS-TP [1x PBS (Nippon Gene)、0.02% Tween 20(CALBIOCHEM)、1.5ppm ProClin 300（SIGMA)]を添加し、室温で1000×g、1分間遠心し、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。
（５）検出工程(蛍光検出）
　複合体形成反応後の反応液を1xPBS-TPで1回洗浄した後、検出試薬[SA-PE (Prozyme社製) 5 μg/mL]を50 μL加え、25℃の遮光下で10分間静置した後、1xPBS-TPで２回洗浄した。その後1xPBS-TPを75 μL加え、Luminex System (Luminex社製)でビーズ及びSA-PE複合体からの蛍光を測定し、測定対象物質のシグナルを検出した。
（６）結果
　マウス５０％血漿マトリクスにおける、Target-2(3’末端LNA)のポリＡポリメラーゼ反応時のMnCl2濃度の検討結果を図１１に示した。Target-2の濃度が0.1fmolの時のMFIとSN比の結果を示したグラフである。実施例４-１のSN比のグラフをみると、バッファー中のMnCl2濃度が15mM以上35mM以下でSN比が上昇し、比較例４-１の一般的なポリＡポリメラーゼ反応 (市販キット添付のバッファー：MgCl2を用いた場合)よりもSN比の値が高くなった。
　以上のことより、２倍希釈の血漿マトリクスにおいても、Target-2にポリＡポリメラーゼを反応させる場合に、バッファー中にMnCl2を添加し、濃度を適切な範囲に調製することにより、バックグランドを抑え、かつＳＮ比を大幅に上昇させることが可能であることがわかった。
〔実施例４-２〕ポリＡポリメラーゼによるポリＡ付加反応時のMnCl2濃度について（マウス１０％血漿マトリクス）
（１）ポリＡ付加反応
（１－１）サンプルの調製
　標的オリゴヌクレオチド（Target-2；配列表配列番号５）は、最終濃度が0、0.1fmolの濃度となるようにマウス１０％血漿マトリクスで調整した。マウス１０％血漿マトリクスは、マウス血漿（日本チャールスリバー社）をRNase-Free Waterで10倍希釈したものを使用した。
（１－２）ポリＡポリメラーゼ反応液の調製
(i)市販キットによるPAP Mixの調製（比較例４-２）
　Poly(A) Tailing Kit（Invitrogen社、製品番号: AM1350）の添付試薬を用いて、合計10μLのPAP Mixを調製した。5x E-PAPバッファー（キット添付）を4μL、10mM ATP溶液（キット添付）を2μL、E-PAP（キット添付）を0.2μL、Nuclease-Free Waterを3.8μL混合して、合計10μLのPAP Mixを調製した。
(ii)本発明のPAP Mixの調製（実施例４-２）
　Target-2の3’末端にポリＡを付加するため、自家調製した5xPAP Mn bufferを用いて、PAP反応を行った。反応溶液は、PCRプレートを用いて、全量20μL中、終濃度が、1xPAP Mn buffer、1mM ATP、となるように調整した。また、ポリＡポリメラーゼは0.4U添加した。MnCl2濃度は、1xPAP Mn buffer中の濃度が、5、10、15、17.5、20、22.5、25、30、35mM となるよう5xPAP Mn buffer を調製し実験に用いた。
（１－３）ポリＡ付加反応
　PCRプレートにPAP Mixを10μL、及び、target-2溶液を10μL添加し、混合した(合計20μL)。サーマルサイクラー（Eppendorf社製　Mastercycler nexus GSX1）を用いて、反応液を37℃で30分間保温した後、65℃で10分間熱処理し、4℃で保持した。
（２）ポリＡ付加オリゴヌクレオチドの捕捉プローブへの捕捉（ハイブリダイゼーション）
（２－１）捕捉プローブの調製
　Luminex社のMicroPlexTM Microspheres(Region No.: 43、製品番号: LC10043-01)に、Target-2に部分相補的な核酸プローブCP-1（配列表配列番号２）を、3’末端のNH2修飾を介して結合させることにより調製した（測定対象物質捕捉ビーズという）。
（２－２）1ｓｔハイブリダイゼーション反応液の組成
　PAP反応溶液と混合した35μL中、終濃度が、0.8x supplement（10x supplement；[500 mM Tris-HCl (pH8.0)、40mM EDTA (pH8.0)、8% N-ラウロイルサルコシンナトリウム]）、1.1M TMAC、上記（２－１）で調製した測定対象物質捕捉ビーズが500個となるように調整した。
（２－３）1stハイブリダイゼーション反応
　poly(A)付加反応後のオリゴヌクレオチド溶液に、15μLの1stハイブリダイゼーション反応液を添加し、混合した(合計35μL)。当該混合液を42℃で1時間保温後、4℃で保持した。
（３）検出用複合体形成反応（自己凝集反応／パルサー反応）
（３－１）PALSAR反応液の調製
　1stハイブリダイゼーション反応液と混合した50μL中、終濃度が0.8x supplement、1.6M TMACとなるよう添加した。自己凝集可能な一対のプローブとして、5’末端がビオチン標識された、HCP-1（配列表配列番号３）及びHCP-2（配列表配列番号４）を用いた。HCP-1、HCP-2のそれぞれの濃度は、最終濃度がそれぞれ、0.7pmol/μL、0.49pmol/μLとなるように添加した。
（３－２）検出用複合体形成反応（自己凝集反応／パルサー反応）
　1stハイブリダイゼーション工程後の反応液35μLに、PALSAR反応液を15μL加え、計50μLとし、42℃で1時間反応させ、4℃で保持した。
（４）分離工程（洗浄工程）
　検出用複合体形成反応後に、室温で1000×g、1分間遠心し、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。その後、1xPBS-TP [1x PBS (Nippon Gene)、0.02% Tween 20(CALBIOCHEM)、1.5ppm ProClin 300（SIGMA)]を添加し、室温で1000×g、1分間遠心し、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。
（５）検出工程(蛍光検出）
　複合体形成反応後の反応液を1xPBS-TPで1回洗浄した後、検出試薬[SA-PE (Prozyme社製) 5 μg/mL]を50 μL加え、25℃の遮光下で10分間静置した後、1xPBS-TPで２回洗浄した。その後1xPBS-TPを75 μL加え、Luminex System (Luminex社製)でビーズ及びSA-PE複合体からの蛍光を測定し、測定対象物質のシグナルを検出した。
（６）結果
　マウス１０％血漿マトリクスにおける、Target-2(3’末端LNA)のポリＡポリメラーゼ反応時のMnCl2濃度の検討結果を図１２に示した。Target-2の濃度が0.1fmolの時のMFIとSN比の結果を示したグラフである。実施例４-２のSN比のグラフをみると、バッファー中のMnCl2濃度が10mM以上25mM以下で、それぞれSN比が上昇し、比較例４-２の一般的なポリＡポリメラーゼ反応 (市販キット添付のバッファー：MgCl2を用いた場合)よりもSN比の値が高くなった。
　以上のことより、１０倍希釈の血漿マトリクスにおいても、Target-2にポリＡポリメラーゼを反応させる場合に、バッファー中にMnCl2を添加し、濃度を適切な範囲に調製することにより、バックグランドを抑え、かつＳＮ比を大幅に上昇させることが可能であることがわかった。
〔実施例５〕ポリＡポリメラーゼによるポリＡ付加反応時のMnCl2濃度について（水）
（１）ポリＡ付加反応
（１－１）サンプルの調製
　標的オリゴヌクレオチド（Target-2；配列表配列番号５）は、最終濃度が0、0.１fmolの濃度となるようにNuclease-Free Waterで調整した。
（１－２）ポリＡポリメラーゼ反応液の調製
(i)市販キットによるPAP Mixの調製（比較例５）
　A-PlusTM Poly(A) Polymerase Tailing Kit（CELLSCRIPT社、製品番号: C-PAP5104H）の添付試薬を用いて、10x 反応バッファー（キット添付；0.5 M Tris-HCl (pH 8.0), 2.5 M NaCl, and 100mM MgCl2）を2μL、10mM ATP（キット添付）を2μL、poly(A) polymerase（キット添付）を0.25μL、Nuclease-Free Waterを5.75μL混合して、合計10μLのPAP Mixを調製した。キット添付のPAP Mixを用いた場合のポリＡポリメラーゼ反溶液中のMgCl2の最終濃度度は10mMである。
(ii)本発明のPAP Mixの調製（実施例５）
　Target-2の3’末端にポリＡを付加するため、自家調製した5xPAP Mn bufferを用いて、PAP反応を行った。反応溶液は、PCRプレートを用いて、全量10μL中、終濃度が、1x PAP Mn buffer、1mM ATP、となるように調整した。また、ポリＡポリメラーゼは、1U添加した。MnCl2濃度は、1x PAP Mn buffer中の濃度が、2.5、5、7.5、15、17.5、20mM となるよう5x PAP Mn buffer を調製し実験に用いた。
（１－３）ポリＡ付加反応
　PCRプレートにPAP Mixを10μL、及び、target-2溶液を10μL添加し、混合した(合計20μL)。サーマルサイクラー（Eppendorf社製　Mastercycler nexus GSX1）を用いて、反応液を37℃で5分間保温した後、65℃で10分間熱処理し、4℃で保持した。
（２）ポリＡ付加オリゴヌクレオチドの捕捉プローブへの捕捉（ハイブリダイゼーション）
（２－１）捕捉プローブの調製
　Luminex社のMicroPlexTM Microspheres(Region No.: 43、製品番号: LC10043-01)に、Target-2に部分相補的な核酸プローブCP-1（配列表配列番号２）を、3’末端のNH2修飾を介して結合させることにより調製した（測定対象物質捕捉ビーズという）。
（２－２）1ｓｔハイブリダイゼーション反応液の組成
　PAP反応溶液と混合した35μL中、終濃度が、1.6x supplement（10x supplement；[500 mM Tris-HCl (pH8.0)、40mM EDTA (pH8.0)、8% N-ラウロイルサルコシンナトリウム]）、1.1M TMAC、上記（２－１）で調製した測定対象物質捕捉ビーズが500個となるように調整した。
（２－３）1stハイブリダイゼーション反応
　poly(A)付加反応後のオリゴヌクレオチド溶液に、15μLの1stハイブリダイゼーション反応液を添加し、混合した(合計35μL)。当該混合液を42℃で1時間保温後、4℃で保持した。
（３）検出用複合体形成反応（自己凝集反応／パルサー反応）
（３－１）PALSAR反応液の調製
　1stハイブリダイゼーション反応液と混合した50μL中、終濃度が1.6x supplement、1.6M TMACとなるよう添加した。自己凝集可能な一対のプローブとして、5’末端がビオチン標識された、HCP-1（配列表配列番号３）、及び、HCP-2（配列表配列番号４）を用いた。HCP-1、HCP-2のそれぞれの濃度は、最終濃度がそれぞれ、0.7pmol/μL、0.49pmol/μLとなるように添加した。
（３－２）検出用複合体形成反応（自己凝集反応／パルサー反応）
　1stハイブリダイゼーション工程後の反応液35μLに、PALSAR反応液を15μL加え、計50μLとし、42℃で1時間反応させ、4℃で保持した。
（４）分離工程（洗浄工程）
　検出用複合体形成反応後に、室温で1000×g、1分間遠心し、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。その後、1xPBS-TP [1x PBS (Nippon Gene)、0.02% Tween 20(CALBIOCHEM)、1.5ppm ProClin 300（SIGMA)]を添加し、室温で1000×g、1分間遠心し、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。
（５）検出工程(蛍光検出）
　複合体形成反応後の反応液を1xPBS-TPで1回洗浄した後、検出試薬[SA-PE (Prozyme社製) 5 μg/mL]を50 μL加え、25℃の遮光下で10分間静置した後、1xPBS-TPで２回洗浄した。その後1xPBS-TPを75 μL加え、Luminex System (Luminex社製)でビーズ及びSA-PE複合体からの蛍光を測定し、測定対象物質のシグナルを検出した。
（６）結果
　水におけるTarget-2(3’末端LNA)のポリＡポリメラーゼ反応時のMnCl2濃度の検討結果を図１３に示した。Target-2の濃度が0.1fmolの時のMFIとSN比の結果を示したグラフである。実施例５のSN比のグラフをみると、バッファー中のMnCl2濃度が5mM以上15mM以下でSN比が上昇し、比較例５の一般的なポリＡポリメラーゼ反応 (市販キット添付のバッファー：MgCl2を用いた場合)よりもSN比の値は数倍高くなった。
　以上のことより、水（バッファー）においてTarget-2にポリＡポリメラーゼを反応させる場合に、バッファー中にMnCl2を添加し、濃度を適切な範囲に調製することにより、バックグランドを抑え、かつＳＮ比を上昇させることが可能であることがわかった。
 [実施例６]PAP Mn bufferにおける標的オリゴヌクレオチドの3’末端の修飾核酸の種類について（マウス１００％血漿マトリクス）
（１）ポリＡ付加反応
（１－１）サンプルの調製
　以下に示す配列のTarget-3、4、5、6（標的オリゴヌクレオチド）を、最終濃度が0、1 fmolの濃度となるようにマウス血漿（日本チャールスリバー社）で調整した。
＜target-3の配列＞　
T(L)^G(L)^A(L)^g^c^t^g^a^c^t^t^g^a^T(L)^G(L)^5(E) （塩基配列部分について配列表配列番号１）
＜target-4の配列＞　
T(L)^G(L)^A(L)^g^c^t^g^a^c^t^t^g^a^T(L)^G(L)^5(m) （塩基配列部分について配列表配列番号１）
＜target-5の配列＞　
T(L)^G(L)^A(L)^g^c^t^g^a^c^t^t^g^a^T(L)^G(L)^5(M) （塩基配列部分について配列表配列番号１）
＜target-6の配列＞　
T(L)^G(L)^A(L)^g^c^t^g^a^c^t^t^g^a^T(L)^G(L)^c （塩基配列部分について配列表配列番号１）
「（E）」は「BNA-NC (N-Me)」を示す。
「（m）」は「MOE」を示す。
「（M）」は「OMe」を示す。
「^」は「S（ホスホロチオエート）化されている」ことを示す。
（１－２）ポリＡポリメラーゼ反応液の調製
(i)市販キットによるPAP Mixの調製（比較例６）
　Poly(A) Tailing Kit（Invitrogen社、製品番号: AM1350）の添付試薬を用いて、5x E-PAPバッファー（キット添付）を8μL、10mM ATP溶液（キット添付）を4μL、E-PAP（キット添付）を1.6μL、Nuclease-Free Waterを21.4μL混合して、合計35μLのPAP Mixを調製した。
 (ii)本発明のPAP Mixの調製（実施例６）
　Target-3、4、5、6の3’末端にpolyAを付加するため、自家調製した5x PAP Mn bufferを用いて、PAP反応を行った。反応溶液は、PCRプレートを用いて、全量40μL中、終濃度が、1x PAP Mn buffer、1mM ATP、となるように調整した。また、ポリＡポリメラーゼは、3.2U添加した。MnCl2濃度は、1x PAP Mn buffer中の濃度は、22.5mM となるよう5xPAP Mn buffer を調製し実験に用いた。
（１－３）ポリＡ付加反応
　PCRプレートにPAP Mixを35μL、及び、各Target溶液をそれぞれ5μL添加し、混合した(合計40μL)。サーマルサイクラーを用いて、反応液を37℃で60分間保温した後、65℃で10分間熱処理し、4℃で保持した。
（２）ポリＡ付加オリゴヌクレオチドの捕捉プローブへの捕捉（ハイブリダイゼーション）
（２－１）捕捉プローブの調製
　Luminex社のMicroPlexTM Microspheres(Region No.: 43、製品番号: LC10043-01)に、Target-3、4、5、6に相補的な核酸プローブCP-1（配列表配列番号２）を、3’末端のNH2修飾を介して結合させることにより調製した（測定対象物質捕捉ビーズという）。
（２－２）1stハイブリダイゼーション反応液 の組成
　PAP反応溶液と混合した65μL中、終濃度が、1.0xsupplement（10x supplement；[500 mM Tris-HCl (pH8.0)、40mM EDTA (pH8.0)、8% N-ラウロイルサルコシンナトリウム]）、1.1M TMAC、上記（２－１）で調製した測定対象物質捕捉ビーズが500個となるように調整した。
（２－３）1stハイブリダイゼーション反応
　ポリＡ付加反応後のオリゴヌクレオチド溶液に、25μLの1st ハイブリダイゼーション反応液を添加し、混合した(合計65μL)。当該混合液を42℃で１時間保温後、4℃で保持した。
（３）検出用複合体形成反応（自己凝集反応／パルサー反応）
（３－１）PALSAR反応液の調製
　1stハイブリダイゼーション反応液と混合した100μL中、終濃度が1.0x supplement、1.6M TMACとなるよう添加した。自己凝集可能な一対のプローブとして、5’末端がビオチン標識された、HCP-1（配列表配列番号３）、及び、HCP-2（配列表配列番号４）を用いた。HCP-1、HCP-2のそれぞれの濃度は、最終濃度がそれぞれ、0.35pmol/μL、0.245pmol/μLとなるように添加した。
（３－２）検出用複合体形成反応（自己凝集反応／パルサー反応）
　ハイブリダイゼーション工程後の反応液65μLに、PALSAR反応液を35μL加え、計100μLとし、42℃で1時間反応させ、4℃で保持した。
（４）分離工程（洗浄工程）
　検出用複合体形成反応後に、室温で1000×g、1分間遠心し、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。その後、1xPBS-TP [1x PBS (Nippon Gene)、0.02% Tween 20(CALBIOCHEM)、1.5ppm ProClin 300（SIGMA)]を添加し、室温で1000×g、1分間遠心し、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。
（５）検出工程(蛍光検出）
　複合体形成反応後の反応液を1xPBS-TPで1回洗浄した後、検出試薬[SA-PE (Prozyme社製) 5μg/mL]を50 μL加え、25℃の遮光下で10分間静置した後、1xPBS-TPで2 回洗浄した。その後1xPBS-TPを75μL加え、Luminex System (Luminex社製)でビーズ及びSA-PE複合体からの蛍光を測定し、測定対象物質のシグナルを検出した。
（６）結果
　マウス１００％血漿マトリクスにおけるTarget-3 (3’末端BNA-NC (N-Me))、4(3’末端MOE)、5(3’末端OMe)、6(3’末端DNA)のシグナルについての結果を図１４に示した。各TargetのMn buffer（実施例６）とMg buffer（比較例６）におけるSN比を示したグラフである。いずれのTargetにおいても、Mg buffer（比較例６）よりも、Mn buffer（実施例６）の方が、SN比が大幅に上昇していることが示された。
　以上より、本発明におけるMn bufferを用いることにより、3’末端の修飾核酸がいかなる種類であっても、高い感度で検出可能であることがわかった。また、3’末端の核酸塩基がDNAの場合でも、Mn bufferを用いることで高い感度で検出可能であることがわかった。
〔実施例７-１〕ポリＡポリメラーゼによるポリＡ付加反応時のMnCl2濃度について（マウス２％脳（２０ｍｇ／ｍｌ）マトリクス）
（１）ポリＡ付加反応
（１－１）マウス脳マトリクスの調整
　Direct PCR Lysis Reagent（VIAGEN biotec社、製品番号：102-T）とProteinase K溶液（関東化学社、製品番号：9034）を100：1の割合で混合した溶液を、マウス脳試料（日本チャールスリバー社、製品番号：P00041）に200mg/mL（２０％脳マトリクス）となるように添加した。パワーマッシャーII（ニッピ社、製品番号：891300）を用いて溶液中にてマウス脳を破砕した後、55℃、800rpmで60分間保温した。さらに85℃、800rpmで45分間熱処理した後、25℃、1600×gで15分間遠心し、上清を回収した。回収した上清は、RNase-Free Waterで１０倍希釈した。
（１－２）サンプルの調製
　標的オリゴヌクレオチド（Target-2；配列表配列番号５）は、最終濃度が0、0.１fmolの濃度となるように、マウス２％脳マトリクスで調整した。
（１－３）ポリＡポリメラーゼ反応液の調製
(i)市販キットによるPAP Mixの調製（比較例７-１）
　Poly(A) Tailing Kit（Invitrogen社、製品番号: AM1350）の添付試薬を用いて、5x E-PAPバッファー（キット添付）を4μL、10mM ATP（キット添付）を2μL、E-PAP 0.4μL、Nuclease-Free Waterを3.6μL混合して、合計10μLのPAP Mixを調製した。
(ii)本発明のPAP Mixの調製（実施例７-１）
　Target-2の3’末端にポリＡを付加するため、自家調製した5x PAP Mn bufferを用いて、PAP反応を行った。反応溶液は、PCRプレートを用いて、全量10μL中、終濃度が、1xPAP Mn buffer、1mM ATP、となるように調整した。また、ポリＡポリメラーゼは0.8U添加した。MnCl2濃度は、1xPAP Mn buffer中の濃度が、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20mM となるよう5xPAP Mn buffer を調製し実験に用いた。
（１－４）ポリＡ付加反応
　PCRプレートにPAP Mixを10μL、及び、target-2溶液を10μL添加し、混合した(合計20μL)。サーマルサイクラー（Eppendorf社製　Mastercycler nexus GSX1）を用いて、反応液を37℃で30分間保温した後、65℃で10分間熱処理し、4℃で保持した。
（２）ポリＡ付加オリゴヌクレオチドの捕捉プローブへの捕捉（ハイブリダイゼーション）
（２－１）捕捉プローブの調製
　Luminex社のMicroPlexTM Microspheres(Region No.: 43、製品番号: LC10043-01)に、Target-2に部分相補的な核酸プローブCP-1（配列表配列番号２）を、3’末端のNH2修飾を介して結合させることにより調製した（測定対象物質捕捉ビーズという）。
（２－２）1ｓｔハイブリダイゼーション反応液の組成
　PAP反応溶液と混合した35μL中、終濃度が、1.6x supplement（10x supplement；[500 mM Tris-HCl (pH8.0)、40mM EDTA (pH8.0)、8% N-ラウロイルサルコシンナトリウム]）、1.1M TMAC、上記（２－１）で調製した測定対象物質捕捉ビーズが500個となるように調整した。
（２－３）1stハイブリダイゼーション反応
　poly(A)付加反応後のオリゴヌクレオチド溶液に、15μLの1stハイブリダイゼーション反応液を添加し、混合した(合計35μL)。当該混合液を42℃で1時間保温後、4℃で保持した。
（３）検出用複合体形成反応（自己凝集反応／パルサー反応）
（３－１）PALSAR反応液の調製
　1stハイブリダイゼーション反応液と混合した50μL中、終濃度が1.6x supplement、1.6M TMACとなるよう添加した。自己凝集可能な一対のプローブとして、5’末端がビオチン標識された、HCP-1（配列表配列番号３）、及び、HCP-2（配列表配列番号４）を用いた。HCP-1、HCP-2のそれぞれの濃度は、最終濃度がそれぞれ、0.7pmol/μL、0.49pmol/μLとなるように添加した。
（３－２）検出用複合体形成反応（自己凝集反応／パルサー反応）
　1stハイブリダイゼーション工程後の反応液35μLに、PALSAR反応液を15μL加え、計50μLとし、42℃で1時間反応させ、4℃で保持した。
（４）分離工程（洗浄工程）
　検出用複合体形成反応後に、室温で1000×g、1分間遠心し、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。その後、1xPBS-TP [1x PBS (Nippon Gene)、0.02% Tween 20(CALBIOCHEM)、1.5ppm ProClin 300（SIGMA)]を添加し、室温で1000×g、1分間遠心し、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。
（５）検出工程(蛍光検出）
　複合体形成反応後の反応液を1xPBS-TPで1回洗浄した後、検出試薬[SA-PE (Prozyme社製) 5 μg/mL]を50 μL加え、25℃の遮光下で10分間静置した後、1xPBS-TPで２回洗浄した。その後1xPBS-TPを75 μL加え、Luminex System (Luminex社製)でビーズ及びSA-PE複合体からの蛍光を測定し、測定対象物質のシグナルを検出した。
（６）結果
　図１５は、マウス２％脳マトリクス(20mg/mL)におけるTarget-2（3’末端LNA）の濃度が0.1fmolの時のMFIとSN比の結果を示すグラフである。実施例７-1のSN比のグラフをみると、バッファー中のMnCl2濃度が10～17.5MでSN比が大幅に上昇し、比較例７-１の一般的なポリＡポリメラーゼ反応 (市販キット添付のバッファー：MgCl2を用いた場合)よりもSN比の値が高くなった。
　以上のことより、マウス２％脳マトリクスにおいて、Target-2にポリＡポリメラーゼを反応させる場合に、バッファー中にMnCl2を添加し、濃度を適切な範囲に調製することにより、バックグランドを抑え、かつＳＮ比を大幅に上昇させることが可能であることがわかった。
〔実施例７-２〕ポリＡポリメラーゼによるポリＡ付加反応時のMnCl2濃度について（マウス４％脳(40mg/ml)マトリクス）
（１）ポリＡ付加反応
（１－１）マウス脳マトリクスの調整
　Direct PCR Lysis Reagent（VIAGEN biotec社、製品番号：102-T）とProteinase K溶液（関東化学社、製品番号：9034）を100：1の割合で混合した溶液を、マウス脳試料（日本チャールスリバー社、製品番号：P00041）に200mg/mL(２０％脳マトリクス)となるように添加した。パワーマッシャーII（ニッピ社、製品番号：891300）を用いて溶液中にてマウス脳を破砕した後、55℃、800rpmで60分間保温した。さらに85℃、800rpmで45分間熱処理した後、25℃、1600×gで15分間遠心し、上清を回収した。回収した上清は、RNase-Free Waterで５倍希釈した。
（１－２）サンプルの調製
　標的オリゴヌクレオチド（Target-2；配列表配列番号５）は、最終濃度が0、0.１fmolの濃度となるように、マウス４％脳マトリクスで調整した。
（１－３）ポリＡポリメラーゼ反応液の調製
(i)市販キットによるPAP Mixの調製（比較例７-２）
　Poly(A) Tailing Kit（Invitrogen社、製品番号: AM1350）の添付試薬を用いて、5x E-PAPバッファー（キット添付）を4μL、10mM ATP（キット添付）を2μL、E-PAP 0.4μL、Nuclease-Free Waterを3.6μL混合して、合計10μLのPAP Mixを調製した。
(ii)本発明のPAP Mixの調製（実施例７-２）
　Target-2の3’末端にポリＡを付加するため、自家調製した5x PAP Mn bufferを用いて、PAP反応を行った。反応溶液は、PCRプレートを用いて、全量20μL中、終濃度が、1xPAP Mn buffer、1mM ATP、となるように調整した。また、ポリＡポリメラーゼは0.8U添加した。MnCl2濃度は、1xPAP Mn buffer中の濃度が、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20mM となるよう5xPAP Mn buffer を調製し実験に用いた。
（１－４）ポリＡ付加反応
　PCRプレートにPAP Mixを10μL、及び、target-2溶液を10μL添加し、混合した(合計20μL)。サーマルサイクラー（Eppendorf社製　Mastercycler nexus GSX1）を用いて、反応液を37℃で30分間保温した後、65℃で10分間熱処理し、4℃で保持した。
（２）ポリＡ付加オリゴヌクレオチドの捕捉プローブへの捕捉（ハイブリダイゼーション）
（２－１）捕捉プローブの調製
　Luminex社のMicroPlexTM Microspheres(Region No.: 43、製品番号: LC10043-01)に、Target-2に部分相補的な核酸プローブCP-1（配列表配列番号２）を、3’末端のNH2修飾を介して結合させることにより調製した（測定対象物質捕捉ビーズという）。
（２－２）1ｓｔハイブリダイゼーション反応液の組成
　PAP反応溶液と混合した35μL中、終濃度が、1.6x supplement（10x supplement；[500 mM Tris-HCl (pH8.0)、40mM EDTA (pH8.0)、8% N-ラウロイルサルコシンナトリウム]）、1.1M TMAC、上記（２－１）で調製した測定対象物質捕捉ビーズが500個となるように調整した。
（２－３）1stハイブリダイゼーション反応
　poly(A)付加反応後のオリゴヌクレオチド溶液に、15μLの1stハイブリダイゼーション反応液を添加し、混合した(合計35μL)。当該混合液を42℃で1時間保温後、4℃で保持した。
（３）検出用複合体形成反応（自己凝集反応／パルサー反応）
（３－１）PALSAR反応液の調製
　1stハイブリダイゼーション反応液と混合した50μL中、終濃度が1.6x supplement、1.6M TMACとなるよう添加した。自己凝集可能な一対のプローブとして、5’末端がビオチン標識された、HCP-1（配列表配列番号３）、及び、HCP-2（配列表配列番号４）を用いた。HCP-1、HCP-2のそれぞれの濃度は、最終濃度がそれぞれ、0.7pmol/μL、0.49pmol/μLとなるように添加した。
（３－２）検出用複合体形成反応（自己凝集反応／パルサー反応）
　1stハイブリダイゼーション工程後の反応液35μLに、PALSAR反応液を15μL加え、計50μLとし、42℃で1時間反応させ、4℃で保持した。
（４）分離工程（洗浄工程）
　検出用複合体形成反応後に、室温で1000×g、1分間遠心し、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。その後、1xPBS-TP [1x PBS (Nippon Gene)、0.02% Tween 20(CALBIOCHEM)、1.5ppm ProClin 300（SIGMA)]を添加し、室温で1000×g、1分間遠心し、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。
（５）検出工程(蛍光検出）
　複合体形成反応後の反応液を1xPBS-TPで1回洗浄した後、検出試薬[SA-PE (Prozyme社製) 5 μg/mL]を50 μL加え、25℃の遮光下で10分間静置した後、1xPBS-TPで２回洗浄した。その後1xPBS-TPを75 μL加え、Luminex System (Luminex社製)でビーズ及びSA-PE複合体からの蛍光を測定し、測定対象物質のシグナルを検出した。
（６）結果
　図１６は、マウス４％脳（４０ｍｇ／ｍｌ）マトリクスにおけるTarget-2（3’末端LNA）の濃度が0.1fmolの時のMFIとSN比の結果を示すグラフである。実施例７－２のSN比のグラフをみると、バッファー中のMnCl2濃度が10～20mMでSN比が大幅に上昇し、比較例７-２の一般的なポリＡポリメラーゼ反応 (市販キット添付のバッファー：MgCl2を用いた場合)よりもSN比の値が高くなった。
　以上のことより、マウス４％脳マトリクスにおいて、Target-2にポリＡポリメラーゼを反応させる場合に、バッファー中にMnCl2を添加し、濃度を適切な範囲に調製することにより、バックグランドを抑え、かつＳＮ比を大幅に上昇させることが可能であることがわかった。
　本発明によれば、人工核酸、核酸医薬など、医薬品開発の探索段階における薬物動態・薬力学(PK/PD)スクリーニング試験、非臨床段階における安全性試験、薬理試験及び薬物動態試験、臨床段階において、薬物が投与された動物あるいはヒト生体試料中の薬物濃度を正確に測定することができる。

Claims (15)

  1. 　以下の工程を含む試料中の標的オリゴヌクレオチドの３’末端にポリＡを付加する方法であって、前記標的オリゴヌクレオチドが３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡである前記方法：
    （i）Ｍｎ２＋存在下、試料中の標的オリゴヌクレオチドとポリＡポリメラーゼを接触させる工程。
  2. 　以下の工程を含む試料中の標的オリゴヌクレオチドの回収方法であって、前記標的オリゴヌクレオチドが３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡである前記方法:
    　(i) Ｍｎ２＋存在下、試料中の標的オリゴヌクレオチドとポリＡポリメラーゼを接触させて前記標的オリゴヌクレオチドの３’末端にポリＡを付加する工程
    　(ii)前記試料に前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させてハイブリダイゼーションさせる工程、
    　ここで、前記捕捉プローブは、
    　（Ａ）核酸プローブと、
    　（Ｂ）前記核酸プローブの３’末端又は５’末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含み、
    　前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列を含む
    　(iii)前記試料に含まれるハイブリダイゼーション生成物を回収する工程。
  3. 　以下の工程を含む、試料中の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法であって、前記標的オリゴヌクレオチドが３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡである前記方法:
    　(i) Ｍｎ２＋存在下、試料中の標的オリゴヌクレオチドとポリＡポリメラーゼを接触させて前記標的オリゴヌクレオチドの３’末端にポリＡを付加する工程
    　(ii)前記試料に前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させてハイブリダイゼーションさせる工程、
    　ここで、前記捕捉プローブは、
    　（Ａ）核酸プローブと、
    　（Ｂ）前記核酸プローブの３’末端又は５’末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含み、
    　前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列を含む
    　(iii)前記試料に含まれるハイブリダイゼーション生成物を回収する工程
    　(iv)回収されたハイブリダイゼーション生成物を検出する工程。
  4. 　以下の工程を含む、試料中の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法であって、前記標的オリゴヌクレオチドが３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡである前記方法:
    　(i) Ｍｎ２＋存在下、試料中の標的オリゴヌクレオチドとポリＡポリメラーゼを接触させて前記標的オリゴヌクレオチドの３’末端にポリＡを付加する工程
    　(ii)前記試料に前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させてハイブリダイゼーションさせる工程、
    　ここで、前記捕捉プローブは、
    　（Ａ）核酸プローブと、
    　（Ｂ）前記核酸プローブの３’末端又は５’末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含み、
    　前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列を含む
    　(iii)前記試料中に含まれるハイブリダイゼーション生成物に、第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のシグナル増幅用プローブを接触させて、前記ハイブリダイゼーション生成物と、第１及び第２のオリゴヌクレオチドが自己凝集してなるオリゴヌクレオチドポリマーとの複合体を形成する工程
    　(iv)前記複合体を検出する工程。
  5. 　第１及び第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方が、ポリＴ配列を含む、請求項４に記載の検出方法。
  6. 　前記(iv)の複合体形成工程が、アシストプローブと接触させる工程を含み、
    前記アシストプローブが、
    ポリＴ配列、並びに、前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方の全配列若しくは部分配列に対して相補的な配列、
    を含む、請求項４又は５に記載の検出方法。
  7. 　前記第１のオリゴヌクレオチドが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚ若しくはポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含み、
    　前記第２のオリゴヌクレオチドが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’若しくはポリＡ配列を含む核酸領域Ｚ’を含む請求項４～６のいずれかに記載の検出方法。
  8. 　試料が標的オリゴヌクレオチドを含む、血液由来成分、脳由来成分、バッファー又は水である請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 　３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチドが、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ホスホロチオエート、モルフォリノオリゴ、ボラノホスフェート、２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル化ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）又は２’－Ｆである請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. 　３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチドが、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＭＯＥ、又はＯＭｅである請求項９に記載の方法。
  11. 　ポリＡを付加する工程が、３ｍＭ～３８ｍＭのＭｎ２＋を含む溶液中で行われる工程である請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
  12. 　以下を含むポリＡポリメラーゼ反応液組成物キット。
    （１）ポリＡポリメラーゼ
    （２）Ｍｎ２＋をポリＡポリメラーゼ反応液の最終濃度で３ｍＭ～３８ｍＭとなるように含む反応バッファー溶液
    （３）ＡＴＰ
  13. 　以下を含む、試料中の標的オリゴヌクレオチドを検出するキットであって、前記標的オリゴヌクレオチドが３’末端の核酸塩基が化学修飾されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡである前記キット。
    （１）ポリＡポリメラーゼ
    （２）Ｍｎ２＋をポリＡポリメラーゼ反応液の最終濃度で３ｍＭ～３８ｍＭとなるように含む反応バッファー溶液
    （３）標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブ
    （４）第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブ
  14. 　前記第１のオリゴヌクレオチドが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚ若しくはポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含み、
    　前記第２のオリゴヌクレオチドが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’若しくはポリＡ配列を含む核酸領域Ｚ’を含む請求項１２に記載のキット。
  15. 　請求項４～７の検出方法に用いられる第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブであって、
    　前記第１のオリゴヌクレオチドが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚ若しくはポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含み、
    　前記第２のオリゴヌクレオチドが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’若しくはポリＡ配列を含む核酸領域Ｚ’を含む前記一対のプローブ。
     
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