WO2021095393A1 - 細胞外電位測定装置 - Google Patents

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WO2021095393A1
WO2021095393A1 PCT/JP2020/037452 JP2020037452W WO2021095393A1 WO 2021095393 A1 WO2021095393 A1 WO 2021095393A1 JP 2020037452 W JP2020037452 W JP 2020037452W WO 2021095393 A1 WO2021095393 A1 WO 2021095393A1
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insulating film
recess
opening
electrode
electrode wire
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PCT/JP2020/037452
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隆幸 小森
慶一 宮嶋
秀▲弦▼ 金
藤井　輝夫
慎治 大川
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Nok株式会社
国立大学法人 東京大学
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • C12M41/28—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of redox potential
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
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    • G01N15/01—

Definitions

  • the present invention relates to an extracellular potential measuring device.
  • Patent Documents 1 and 2 In recent years, devices for measuring the extracellular potential of a cell mass or spheroid, which is an aggregate of cells, in vitro (in vitro) have been developed (Patent Documents 1 and 2). Analyzing extracellular potentials is useful in assessing efficacy and / or side effects on cells.
  • the cell mass, organoid or spheroid which is a collection of cells, has a three-dimensional structure, it is preferable to be able to measure the potential at multiple points at different heights. Further, it is preferable that an apparatus for measuring the electric potential can be easily manufactured. Therefore, there is a demand for an extracellular potential measuring device that can measure potentials at multiple points at different heights of a cell assembly and can be easily manufactured.
  • linear axons extend from cell masses, organoids or spheroids, which are a collection of cells related to nerve cells. By measuring not only the cell assembly but also the axon potential, it is considered to contribute to the analysis of the behavior of the (in vivo) nervous system in vivo. Therefore, there is a demand for an extracellular potential measuring device capable of measuring not only a cell assembly but also an axon potential.
  • the extracellular potential measuring device includes a plurality of insulating films formed of an insulating material and laminated and bonded to each other, and a plurality of electrodes formed of a conductive material and arranged at a plurality of heights. Equipped with wires.
  • Each electrode wire is arranged between the upper insulating film and the lower insulating film.
  • each insulating film has a penetrating opening.
  • the opening of the lower insulating film has a size smaller than the size of the opening of the upper insulating film, and the openings of the plurality of insulating films are overlapped so that the cell aggregate is arranged inside.
  • a recess that is smaller in size is formed.
  • Each of the plurality of electrode wires has an end portion that is arranged around the opening of the insulating film immediately below the electrode wire and is exposed in the recess.
  • a three-dimensional cluster of cells is housed in a recess that is provided by overlapping openings of a plurality of insulating films and is smaller in size toward the bottom. Since each end of the electrode wire arranged between the upper and lower insulating films is arranged around the opening of the insulating film directly below and is exposed in the recess, the ends of the plurality of electrode wires are three-dimensional. It is accessible to aggregates of cells. Since the plurality of electrode lines are arranged at a plurality of heights, that is, in a plurality of layers, it is possible to measure the potential at multiple points at different heights of the cell assembly.
  • the extracellular potential measuring device by joining a plurality of insulating films having openings, a plurality of recesses having a smaller size toward the lower side, which are suitable for accommodating a three-dimensional cell aggregate, are provided.
  • the electrode wires By arranging the electrode wires between the insulating films of the above, the electrode wires can be arranged at a plurality of heights. Therefore, it is possible to easily manufacture an extracellular potential measuring device capable of measuring potentials at multiple points at different heights of a three-dimensional cell assembly.
  • By laminating a large number of insulating films it is possible to increase the number of heights at which the electrode wires are provided and the number of electrode wires, and it is possible to enable detailed analysis of cell assembly.
  • the extracellular potential measuring device has a plurality of insulating films formed from an insulating material and laminated and bonded to each other, and has a recess in which an aggregate of cells is arranged.
  • a sheet having a groove connected to a recess and having a linear axon extending from an aggregate of the cells arranged therein, and a plurality of electrode wires arranged between the insulating films of the sheet.
  • the plurality of electrode wires have an exposed end in the recess so that they can be brought into contact with the cell aggregate.
  • the at least one electrode line has an exposed end in the groove so that it can be brought into contact with the axon.
  • the potential of the axon extending from the cell assembly can be measured.
  • FIG. 5 is an enlarged plan view similar to FIG. 8 of a part of the extracellular potential measuring device according to the modified example of the embodiment of the present invention. It is sectional drawing of the extracellular potential measuring apparatus which concerns on other modification of embodiment of this invention.
  • the extracellular potential measuring device 1 has an adhesive 11A, 12A, which joins a plurality of insulating films 11, 12, 13, 14 laminated to each other and the insulating films 11, 12, 13, 14. It has a laminated structure with 13A.
  • the insulating films 11 and 12 are bonded with an adhesive 11A
  • the insulating films 12 and 13 are bonded with an adhesive 12A
  • the insulating films 13 and 14 are bonded with an adhesive 13A.
  • the insulating films 11, 12, 13, 14 and the adhesives 11A, 12A, 13A form one sheet 10.
  • the sheet 10 is formed with a recess 2 described later and a groove 3 connected to the recess 2.
  • the extracellular potential measuring device 1 further has a plurality of heights, that is, a plurality of electrode wires 12B, 12C, 13B, 14B arranged in a plurality of layers of the sheet 10. Each electrode wire is arranged between the upper insulating film and the lower insulating film.
  • each of the insulating films 11, 12, and 13 has openings 11H, 12H, and 13H that penetrate through, except for the insulating film 14 of the lowermost layer.
  • the openings 11H, 12H, 13H have a circular shape.
  • the openings 11H, 12H, and 13H are arranged substantially concentrically with each other.
  • Each of the adhesives 11A, 12A, and 13A has an opening having the same shape and size as the opening of the insulating film directly above.
  • the edge that is, the inner peripheral surface of each of the openings of the adhesives 11A, 12A, and 13A is aligned as much as possible with the edge, that is, the inner peripheral surface of the opening of the insulating film directly above.
  • some deviation between the inner peripheral surface of the opening of the adhesive and the inner peripheral surface of the opening of the insulating film is allowed.
  • the insulating films 11, 12, 13, and 14 are made of an insulating material that does not affect cells as much as possible, for example, polyimide. Adhesives 11A, 12A, 13A are also formed from an insulating material that has as little effect on the cells as possible. Although not essential, preferably, the insulating films 11, 12, 13, 14 and the adhesives 11A, 12A, 13A are made of a transparent or translucent material so that the electrode wires can be visually recognized. ..
  • the electrode wires 12B, 12C, 13B, 14B are formed of a highly conductive material that does not affect cells as much as possible.
  • the electrode wires 12B, 12C, 13B, 14B are formed of gold-plated copper wire.
  • the ends of the plurality of electrode wires are arranged around the opening of the insulating film directly below the electrode wires, and are exposed in the recess 2.
  • the ends of the electrode wires 12B and 12C are arranged around the opening 12H of the insulating film 12 directly below the electrode wires 12B and 12C, and are exposed through the upper opening 11H of the electrode wire 13B.
  • the end portion is arranged around the opening 13H of the insulating film 13 directly below the electrode wire 13B, and is exposed through the upper openings 11H and 12H.
  • the end of the electrode wire 14B arranged between the lowermost insulating film 14 and the second lower insulating film 13 crosses the entire opening 13H of the second lower insulating film 13 in one direction. Specifically, the end of the electrode wire 14B extends along the diameter of the circular opening 13H and traverses the opening 13H. The end of the electrode wire 14B is exposed through the upper openings 11H, 12H, 13H.
  • FIG. 1 corresponds to the I-I line cross section of FIGS. 3 to 6.
  • the uppermost insulating film (cover film) 11 has a linear shape connecting the above-mentioned opening 11H, the opening 21H having the same shape and size as the opening 11H, and the openings 11H and 21H. Slit or groove 3 is formed. The openings 11H and 21H and the groove 3 penetrate the insulating film 11.
  • the insulating film 11 is formed with a plurality of through holes 11P for positioning the insulating films 11, 12, 13, and 14 to be laminated.
  • the insulating film 12 is formed with the above-mentioned opening 12H and an opening 22H having the same shape and size as the opening 12H.
  • the openings 12H and 22H penetrate the insulating film 12.
  • the openings 22H are arranged substantially concentrically with the openings 21H of the insulating film 11.
  • the opening 22H of the insulating film 12 has a diameter or size smaller than the diameter or size of the opening 21H of the insulating film 11 directly above.
  • the openings 21H and 22H of the insulating films 11 and 12 are overlapped to form a recess having a smaller size toward the bottom.
  • the insulating film 12 is formed with a plurality of through holes 12P for positioning the insulating films 11, 12, 13, and 14 to be laminated.
  • the above electrode wires 12B and 12C are formed on the upper surface of the insulating film 12.
  • the end opposite to the end near the opening 12H of these electrode wires 12B and 12C is formed as wide connection terminals 12T and 12CT.
  • a plurality of axon electrode wires 30 described later are formed on the upper surface of the insulating film 12.
  • the ends of the plurality of axon electrode wires 30 are arranged in the vicinity of the straight line connecting the openings 12H and 22H, and are exposed in the groove 3 of the insulating film 11 directly above.
  • the opposite ends of these axon electrode wires 30 are formed as wide connection terminals 30T.
  • the axon electrode wire 30 is formed of a highly conductive material that does not affect cells as much as possible.
  • the axon electrode wire 30 is formed of a gold-plated copper wire.
  • the above-mentioned opening 13H is formed in the insulating film 13.
  • the opening 13H penetrates the insulating film 13.
  • the insulating film 13 is formed with a plurality of through holes 13P for positioning the insulating films 11, 12, 13, and 14 to be laminated.
  • the above electrode wire 13B is formed on the upper surface of the insulating film 13.
  • the end opposite to the end near the opening 13H of the electrode wire 13B is formed as a wide connection terminal 13T.
  • the insulating film 14 is formed with a plurality of through holes 14P for positioning the insulating films 11, 12, 13, and 14 to be laminated.
  • the holes and grooves of the insulating film can be formed by, for example, etching.
  • the electrode wire can be formed on the insulating film by, for example, photolithography.
  • the extracellular potential measuring device 1 can be easily manufactured by joining the insulating film 11 and the insulating films 12, 13 and 14 on which the electrode wires are formed with the adhesives 11A, 12A and 13A.
  • the width of the insulating film 11 is smaller than the width of the insulating film 12 directly underneath, and most of the electrode wires 12B, 12C, 30 formed on the insulating film 12 are covered and protected by the insulating film 11.
  • the connection terminals 12T, 12CT, 30T of the electrode wires 12B, 12C, 30 are at least partially exposed.
  • the width of the insulating film 12 is smaller than the width of the insulating film 13 directly underneath, and most of the electrode wire 13B formed on the insulating film 13 is covered and protected by the insulating film 12, but the connection terminal 13T of the electrode wire 13B is , At least partially exposed.
  • the length of the insulating film 13 is smaller than the length of the insulating film 14 directly underneath, and most of the electrode wire 14B formed on the insulating film 14 is covered and protected by the insulating film 13, but the connection terminal 14T of the electrode wire 14B is protected. Is at least partially exposed.
  • connection terminals 12T, 12CT, 30T, 13T, and 14T can be easily connected to a potential measuring device (not shown).
  • the ends of the electrode wires 12B, 12C, 13B extend radially with respect to the recess 2.
  • the end of the electrode wire 14B formed on the insulating film 12 extends in the groove 3 formed on the insulating film 12.
  • the electrode wire 14B is bent, and the portion other than the end portion is covered with the insulating film 14.
  • FIG. 8 shows the opening 21H formed in the insulating film 11 and the opening 22H formed in the insulating film 12.
  • the openings 21H and 22H are overlapped to form a substantially conical trapezoidal or bowl-shaped recess 4 whose size is smaller toward the bottom.
  • the shapes of the openings 21H and 22H are not limited to circular shapes, and may be other shapes.
  • the groove 3 and the peripheral portion 11X of the openings 11H and 21H in the insulating film 11 are formed. It is formed by photolithography.
  • the insulating film 11 in which the portion 11X does not exist (having a penetrating recess corresponding to the portion 11X) is formed.
  • a recess can be formed in the insulating film 11 by etching.
  • the recess corresponding to the portion 11X is filled with the ultraviolet curable resin, and the portions other than the groove 3 and the recesses 2 and 4 of the ultraviolet curable resin are exposed to ultraviolet rays and cured. Further, the groove 3 and the recesses 2 and 4 are formed by etching. In this way, the groove 3 and the openings 11H and 21H are formed, and at the same time, the end portion of the electrode wire is exposed.
  • the portion 11X formed in this way reaches not only the layer of the insulating film 11 but also the layer of the adhesive 11A. As shown in FIG. 8, the end of the axon electrode wire 30 penetrates the portion 11X.
  • a set of three-dimensional cells is housed in a recess 2 having a smaller size toward the lower side, which is provided by stacking openings 11H, 12H, and 13H of a plurality of insulating films 11, 12, and 13. Since each end of the electrode wires 12B, 12C, and 13B arranged between the upper and lower insulating films is arranged around the opening of the insulating film directly below and is exposed in the recess 2, a plurality of electrode wires 12B , 12C, 13B ends are accessible to a three-dimensional cluster of cells. Since the plurality of electrode lines 12B, 12C, and 13B are arranged at a plurality of heights, that is, in a plurality of layers, the potentials at multiple points at different heights of the cell assembly can be measured.
  • the end of the bottom electrode wire 14B crosses the entire opening of the second lower insulating film 13, that is, the entire bottom of the recess 2 in one direction. Therefore, a large area at the end of the electrode wire 14B is exposed in the recess 2, and the aggregate of cells arranged in the recess 2 easily comes into contact with the end of the electrode wire 14B.
  • This electrode wire 14B which has a high probability of contact with a cell assembly, can be preferably used as a reference electrode, for example.
  • the reference electrode may be any one of the other electrode wires.
  • the extracellular potential measuring device 1 can accommodate a three-dimensional aggregate of cells by joining a plurality of insulating films 11, 12, 13 having openings 11H, 12H, 13H. Suitable recesses 2 that are smaller in size toward the bottom are provided, and by arranging the electrode wires 12B, 12C, 13B, 14B between the plurality of insulating films 11, 12, 13, 14, the heights are increased. Electrode lines 12B, 12C, 13B, 14B can be arranged. Therefore, it is possible to easily manufacture an extracellular potential measuring device 1 capable of measuring potentials at multiple points at different heights of a three-dimensional cell assembly. By laminating a large number of insulating films, it is possible to increase the number of heights at which the electrode wires are provided and the number of electrode wires, and it is possible to enable detailed analysis of cell assembly.
  • FIG. 9 shows a plurality of examples of samples that can be used for extracellular potential measurement using the extracellular potential measuring device 1.
  • Sample 40 is a collection of cells that do not have axons.
  • Sample 41 has a cell assembly 42 for nerve cells and an axon 43 extending from the cell assembly 42.
  • Sample 44 has two cell sets 45,46 for nerve cells and axons 47 attached to the cell sets 45, 46.
  • any of the sample 40, the cell assembly 42, and the cell aggregates 45 and 46 can be arranged inside the recess 2 of the extracellular potential measuring device 1.
  • FIG. 10 shows the measurement of the potential of the sample 44 as an example of the measurement of the potential of the sample.
  • the cell aggregates 45 and 46 are arranged in the recesses 2 and 4, respectively, and the axon 47 is arranged in the groove 3.
  • the bottom of the cell assembly 45 is brought into contact with the end of the electrode wire 14B at the bottom of the recess 2.
  • the ends of the electrode wires 12B, 12C, 13B exposed in the recess 2 are accessible to the cell assembly 45, and as long as they come into contact with the cell assembly 45, the cell assembly 45 is passed through the electrode wires 12B, 12C, 13B. The potential of each point can be measured.
  • the end of the axon electrode wire 30 exposed in the groove 3 can come into contact with the axon 47 arranged in the groove 3, and as long as it comes into contact with the axon 47, the shaft is passed through the axon electrode wire 30.
  • the potential at each point on the cord 47 can be measured.
  • the electrode wire 14B can be used as a reference electrode, but any one of the other electrode wires may be used as a reference electrode.
  • the extracellular potential measuring device 1 in addition to the potential of the cell assembly, the potential of the axon extending from the cell assembly can be measured.
  • in vitro (in vitro) models that are useful for estimating in vivo (in vivo) nerve cell signal transduction, such as efficacy on nerve cells and / Or side effects can be evaluated.
  • the number of axon electrode wires 30 may be one. However, in this embodiment, a plurality of axon electrode wires 30 are provided, and potentials at multiple points in the length direction of the axon can be measured, enabling more detailed analysis.
  • FIG. 11 is an enlarged plan view similar to FIG. 8 of a part of the extracellular potential measuring device according to the modified example of the embodiment.
  • the potentials of both cells 45, 46 of sample 44 can be measured.
  • a second recess 4A in which the electrode is provided is provided instead of the recess 4 in which the electrode is not provided.
  • the second recess 4A is formed of an opening 21H penetrating the insulating film 11, an opening 22H penetrating the insulating film 12, and an opening 23H penetrating the insulating film 13.
  • the cell assembly 46 is arranged to measure the potential of the cell assembly 46.
  • the openings 21H, 22H, and 23H forming the second recess 4A are hereinafter referred to as the second opening.
  • the second openings 21H, 22H, and 23H of the plurality of insulating films 11, 12, and 13 are stacked to form a substantially conical trapezoidal or bowl-shaped second recess 4A whose size is smaller toward the bottom.
  • the shape of the second openings 21H, 22H, and 23H is not limited to a circle, and may be another shape.
  • the second opening 21H of the second recess 4A is connected to the groove 3.
  • the sheet 10 formed of the insulating films 11, 12, 13, 14 and the adhesives 11A, 12A, 13A has a recess 2, a groove 3 connected to the recess 2, and a third groove connected to the groove 3.
  • the recess 4A of 2 is formed.
  • This modification further has a plurality of heights, that is, a plurality of second electrode wires 22B, 22C, 23B arranged in a plurality of layers of the sheet 10.
  • Each electrode wire is arranged between the upper insulating film and the lower insulating film.
  • the second electrode lines 22B, 22C, 23B are used to measure the potentials of the cell assembly 46 at multiple points at different heights.
  • the second electrode line is made of a highly conductive material that has as little effect on the cells as possible.
  • the second electrode wire is made of gold-plated copper wire.
  • the ends of the plurality of second electrode wires are arranged around the second opening of the insulating film directly below the second electrode wire, and are exposed in the second recess 4A.
  • the second electrode wires 22B and 22C are formed on the insulating film 12, and the ends of the second electrode wires 22B and 22C are formed on the insulating film 12 immediately below the second electrode wires 22B and 22C. It is disposed around the opening 22H and is exposed through the upper opening 21H.
  • the second electrode wire 23B is formed on the insulating film 13, and the end portion of the second electrode wire 23B is arranged around the opening 23H of the insulating film 13 directly below the second electrode wire 23B and is located above. It is exposed through the openings 21H and 22H of.
  • the second electrode wire 22B corresponds to the electrode wire 12B related to the recess 2
  • the second electrode wire 22C corresponds to the electrode wire 12C related to the recess 2.
  • the second electrode wire 23B corresponds to the electrode wire 23B associated with the recess 2. The details of the second electrode wires 22B, 22C, 23B can be understood by referring to the description of the electrode wires 12B, 12C, 13B.
  • the electrode wire 14B crosses the entire second opening 23H of the second lower insulating film 13 in one direction. Specifically, the electrode wire 14B extends along the diameter of the circular second opening 23H and crosses the second opening 23H. The electrode wire 14B is exposed through the upper second openings 21H, 22H, 23H. In the measurement of the potential of the cell assembly 46, for example, the electrode wire 14B can be used as the reference electrode, but any one of the other electrode wires may be used as the reference electrode.
  • the bottom of the cell assembly 46 is brought into contact with the end of the electrode wire 14B at the bottom of the second recess 4A.
  • the ends of the second electrode lines 22B, 22C, 23B exposed in the second recess 4A are accessible to the cell assembly 46, and as long as they come into contact with the cell assembly 46, the second electrode lines 22B, 22C, 22C. , 23B, the potential of each point of the cell assembly 46 can be measured.
  • the second openings 21H, 22H, and 23H of the plurality of insulating films 11, 12, and 13 are three-dimensionally formed in the second recess 4A, which is smaller in size toward the lower side and is provided by overlapping the second openings 21H, 22H, and 23H.
  • the cell assembly 46 is housed.
  • the ends of the second electrode wires 22B, 22C, and 23B arranged between the upper and lower insulating films are arranged around the second opening of the insulating film directly underneath, and in the second recess 4A. Since it is exposed, the ends of the plurality of second electrode lines 22B, 22C, 23B can contact the three-dimensional aggregate of the second cells.
  • the plurality of second electrode lines 22B, 22C, 23B are arranged at a plurality of heights, that is, in a plurality of layers, it is necessary to measure the potentials at multiple points at different heights of the second cell assembly. Can be done.
  • this modification has a plurality of second electrode lines 22B, 22C, 23B, the overall plan view of the extracellular potential measuring device, particularly the arrangement of the axon electrode lines 30, is different from that of FIG. 2 (FIG. 2).
  • the second recess 4A is arranged at the position of the recess 4).
  • FIG. 12 is a cross-sectional view of an extracellular potential measuring device according to another modification of the embodiment of the present invention.
  • each end of the electrode wire 12B, 12C, 13B is terminated at the edge, that is, the inner peripheral surface of the openings 12H, 13H of the insulating films 12 and 13 directly below the electrode wire.
  • the exposed portions of the electrode wires 12B, 12C, and 13B in the recess 2 are increased, and the probability of contact with the cell aggregate is improved.
  • the number of insulating films, the ratio of the thickness of multiple insulating films, the ratio of the sizes of multiple openings, the number, thickness and arrangement of electrode lines including the axon electrode line and the second electrode line, and other details is not limited to the above embodiments and modifications.
  • each electrode wire is arranged between the upper insulating film and the lower insulating film.
  • each insulating film has a penetrating opening.
  • the opening of the lower insulating film has a size smaller than the size of the opening of the upper insulating film, and the openings of the plurality of insulating films are overlapped so that the cell aggregate is arranged inside.
  • each of the plurality of electrode wires has an end portion that is arranged around the opening of the insulating film immediately below the electrode wire and is exposed in the recess.
  • the end of this electrode wire crosses the entire opening of the second lower insulating film, that is, the entire bottom of the recess in one direction. Therefore, a large area at the end of the electrode wire is exposed in the recess, and the aggregate of cells arranged in the recess tends to come into contact with the end of the electrode wire.
  • This electrode wire which has a high probability of contact with a cell assembly, can be preferably used as a reference electrode, for example.
  • the top layer of the insulating film is formed with a penetrating groove in which linear axons extending from the cell aggregate are arranged, and the groove is connected to the recess.
  • the extracellular potential according to Clause 1 or 2 further comprising at least one axon electrode wire, the end of the axon electrode wire being exposed in the groove so as to be in contact with the axon. measuring device.
  • the potential of the axon extending from the cell assembly can be measured.
  • each second electrode wire is arranged between the upper insulating film and the lower insulating film.
  • each insulating film has a second opening through which it penetrates.
  • the second opening of the lower insulating film has a size smaller than the size of the second opening of the upper insulating film, and the second openings of the plurality of insulating films are overlapped with each other.
  • a collection of second cells to which axons are attached forms a second recess that is smaller in size toward the bottom, and the second recess is connected to the groove.
  • Each of the plurality of second electrode wires has an end portion that is arranged around the second opening of the insulating film immediately below the second electrode wire and is exposed in the second recess.
  • a three-dimensional collection of second cells is housed in a second recess, which is provided by overlapping the second openings of a plurality of insulating films and is smaller in size toward the bottom.
  • Each end of the second electrode wire arranged between the upper and lower insulating films is arranged around the second opening of the insulating film directly below and is exposed in the second recess, so that a plurality of electrodes are provided.
  • the end of the second electrode line is accessible to a three-dimensional collection of second cells. Since the plurality of second electrode wires are arranged at a plurality of heights, that is, in a plurality of layers, it is possible to measure the potential at multiple points at different heights of the second cell assembly.
  • Clause 6 It has a plurality of insulating films formed from an insulating material and laminated and bonded to each other, and has a recess in which a cell aggregate is arranged inside and a linear shape connected to the recess and extending from the cell aggregate.
  • a sheet with a groove in which the axons are placed and A plurality of electrode wires arranged between the insulating films of the sheet are provided.
  • the plurality of electrode wires have an exposed end in the recess so that they can be brought into contact with the cell aggregate.
  • An extracellular potential measuring device characterized in that at least one electrode wire has an end exposed in the groove so as to be brought into contact with the axon.
  • Clause 7 The extracellular potential measuring device according to Article 6, wherein the plurality of electrode wires whose ends are exposed inside the recess are arranged at a plurality of heights.
  • each insulating film has a penetrating opening.
  • the opening of the lower insulating film has a size smaller than the size of the opening of the upper insulating film, and the openings of the plurality of insulating films are overlapped to form the recess having a smaller size toward the lower side.
  • a collection of three-dimensional cells is housed in a recess that is provided by overlapping openings of a plurality of insulating films and is smaller in size toward the bottom.
  • Each end of the electrode wire arranged between the upper and lower insulating films is arranged around the opening of the insulating film directly below and is exposed in the recess. Therefore, the ends of the plurality of electrode wires can be easily contacted with multiple points at different heights of the three-dimensional cell aggregate.
  • a plurality of second electrode wires arranged between the insulating films of the sheet are provided.
  • the sheet has a second recess in which a collection of second cells to which the axon is attached is arranged, and the second recess is connected to the groove.
  • Clause 10 The extracellular potential measuring device according to Article 9, wherein the plurality of second electrode wires are arranged at a plurality of heights.
  • each insulating film has a second opening through which it penetrates.
  • the second opening of the lower insulating film has a size smaller than the size of the second opening of the upper insulating film, and the second opening of the plurality of insulating films is overlapped and lowered.
  • the second recess which is smaller in size, is formed.
  • Each end of the plurality of second electrode wires is arranged around the second opening of the insulating film immediately below the second electrode wire, and is exposed in the second recess.
  • a three-dimensional collection of second cells is housed in a second recess, which is provided by overlapping the second openings of a plurality of insulating films and is smaller in size toward the bottom.
  • Each end of the second electrode wire arranged between the upper and lower insulating films is arranged around the second opening of the insulating film directly below and is exposed in the second recess. Therefore, the ends of the plurality of second electrode lines can be easily contacted with multiple points at different heights of the three-dimensional second cell assembly.
  • Extracellular potential measuring device 2 Recess 3 Groove 4A Second recess 10 Sheet 11, 12, 13, 14 Insulation film 11A, 12A, 13A Adhesive 12B, 12C, 13B, 14B Electrode line 11H, 12H, 13H Opening 21H , 22H, 23H Second opening 30 Axon electrode wire 40 Sample 41 Sample 42 Cell assembly 43 Axon 44 Sample 45, 46 Cell assembly 47 Axon 22B, 22C, 23B Second electrode wire

Abstract

細胞外電位測定装置は、絶縁材料から形成され、互いに積層されて接合された複数の絶縁フィルムと、導電材料から形成され、複数の高さに配置された複数の電極線を備える。各電極線が上方の絶縁フィルムと下方の絶縁フィルムの間に配置されている。最下層の絶縁フィルムを除き、各絶縁フィルムは貫通する開口部を有する。下方の絶縁フィルムの開口部は、上方の絶縁フィルムの開口部のサイズより小さいサイズを有し、複数の絶縁フィルムの開口部は重ねられて、細胞の集合が内部に配置される下方ほどサイズが小さい凹部を形成する。複数の電極線の各々は、当該電極線の直下の絶縁フィルムの開口部の周囲に配置されて凹部内で露出する端部を有する。

Description

細胞外電位測定装置
　本発明は、細胞外電位測定装置に関する。
　近年、細胞の集合である細胞塊またはスフェロイドの細胞外電位を生体外で（in vitro）測定するための装置が開発されてきている（特許文献１，２）。細胞外電位を解析することは、細胞に対する薬効および／または副作用を評価する上で有用である。
国際公開第２００９／０３８０７９号 国際公開第２０１１／０１０７２１号
　細胞の集合である細胞塊、オルガノイドまたはスフェロイドは、立体構造を有するため、異なる高さの多点での電位を測定することができると好ましい。さらに、電位を測定する装置を容易に製造することができると好ましい。したがって、細胞の集合の異なる高さの多点での電位を測定することができ、容易に製造することができる細胞外電位測定装置の需要がある。
　他方、神経細胞に関する細胞の集合である細胞塊、オルガノイドまたはスフェロイドからは線状の軸索が延びる。細胞の集合だけでなく軸索の電位を測定することによって、生体内での（in vivo）神経系の挙動の解析に貢献すると考えられる。したがって、細胞の集合だけでなく軸索の電位を測定することができる細胞外電位測定装置の需要がある。
　そこで、本開示は、上記の課題のいずれかを解決する
　本開示のある態様に係る細胞外電位測定装置は、絶縁材料から形成され、互いに積層されて接合された複数の絶縁フィルムと、導電材料から形成され、複数の高さに配置された複数の電極線を備える。各電極線が上方の絶縁フィルムと下方の絶縁フィルムの間に配置されている。最下層の絶縁フィルムを除き、各絶縁フィルムは貫通する開口部を有する。下方の絶縁フィルムの前記開口部は、上方の絶縁フィルムの前記開口部のサイズより小さいサイズを有し、複数の絶縁フィルムの前記開口部は重ねられて、細胞の集合が内部に配置される下方ほどサイズが小さい凹部を形成する。複数の電極線の各々は、当該電極線の直下の絶縁フィルムの前記開口部の周囲に配置されて前記凹部内で露出する端部を有する。
　この態様においては、複数の絶縁フィルムの開口部が重ねられて設けられた下方ほどサイズが小さい凹部に立体的な細胞の集合が収容される。上下の絶縁フィルムの間に配置された電極線の各々の端部は、直下の絶縁フィルムの開口部の周囲に配置され、凹部内で露出するので、複数の電極線の端部は立体的な細胞の集合に接触可能である。複数の電極線は、複数の高さ、すなわち複数の層に配置されているので、細胞の集合の異なる高さの多点での電位を測定することができる。
　また、この態様に係る細胞外電位測定装置は、開口部を有する複数の絶縁フィルムを接合することにより、立体的な細胞の集合の収容に適した、下方ほどサイズが小さい凹部が設けられ、複数の絶縁フィルムの間に電極線を配置することによって、複数の高さに電極線を配置することができる。したがって、立体的な細胞の集合の異なる高さの多点での電位を測定することができる細胞外電位測定装置を容易に製造することができる。多数の絶縁フィルムを積層することにより、電極線が設けられる高さの数および電極線の数を増加させることが可能であり、細胞の集合に関する詳細な解析が可能となりうる。
　本開示の他の態様に係る細胞外電位測定装置は、絶縁材料から形成された、互いに積層されて接合された複数の絶縁フィルムを有しており、細胞の集合が内部に配置される凹部と、凹部につながっており前記細胞の集合から延びる線状の軸索が内部に配置される溝を有するシートと、前記シートの前記絶縁フィルムの間に配置された複数の電極線を備える。複数の電極線は、前記細胞の集合と接触させられるように前記凹部内で露出する端部を有する。少なくとも１つの電極線は、前記軸索と接触させられるように前記溝内で露出する端部を有する。
　この態様においては、細胞の集合の電位に加え、細胞の集合から延びる軸索の電位を測定することができる。これらの電位を解析することにより、生体内での神経細胞の信号伝達の推定に役立つ生体外でのモデルを考察することができ、例えば、神経細胞への薬効および／または副作用を評価することができる。
本発明の実施形態に係る細胞外電位測定装置の断面図である。 実施形態に係る細胞外電位測定装置の平面図である。 実施形態に係る細胞外電位測定装置のカバーフィルムの平面図である。 実施形態に係る細胞外電位測定装置の第２層フィルムとその上の電極線の平面図である。 実施形態に係る細胞外電位測定装置の第３層フィルムとその上の電極線の平面図である。 実施形態に係る細胞外電位測定装置の最下層フィルムとその上の電極線の平面図である。 実施形態に係る細胞外電位測定装置の一部の拡大斜視図である。 実施形態に係る細胞外電位測定装置の一部の拡大平面図である。 実施形態に係る細胞外電位測定装置に配置される細胞の集合のサンプルの複数の例を示す斜視図である。 サンプルの一例が配置された細胞外電位測定装置の一部の図８と同様の拡大平面図である。 本発明の実施形態の変形例に係る細胞外電位測定装置の一部の図８と同様の拡大平面図である。 本発明の実施形態の他の変形例に係る細胞外電位測定装置の断面図である。
　以下、添付の図面を参照しながら本発明に係る様々な実施の形態を説明する。図面の縮尺は必ずしも正確ではなく、一部の特徴は誇張または省略されることもある。
　図１に示すように、細胞外電位測定装置１は、互いに積層された複数の絶縁フィルム１１，１２，１３，１４と、絶縁フィルム１１，１２，１３，１４を接合する接着剤１１Ａ，１２Ａ，１３Ａを持つ積層構造を有する。絶縁フィルム１１，１２は接着剤１１Ａで接合され、絶縁フィルム１２，１３は接着剤１２Ａで接合され、絶縁フィルム１３，１４は接着剤１３Ａで接合されている。
　絶縁フィルム１１，１２，１３，１４と、接着剤１１Ａ，１２Ａ，１３Ａは１つのシート１０を形成する。シート１０には、後述する凹部２と、凹部２につながる溝３が形成されている。
　細胞外電位測定装置１は、さらに複数の高さ、すなわちシート１０の複数の層に配置された複数の電極線１２Ｂ，１２Ｃ，１３Ｂ，１４Ｂを有する。各電極線は上方の絶縁フィルムと下方の絶縁フィルムの間に配置されている。
　図１および図２に示すように、最下層の絶縁フィルム１４を除き、絶縁フィルム１１，１２，１３の各々は、貫通する開口部１１Ｈ，１２Ｈ，１３Ｈを有する。開口部１１Ｈ，１２Ｈ，１３Ｈは円形状を有する。開口部１１Ｈ，１２Ｈ，１３Ｈは、互いにほぼ同心に配置されている。
　絶縁フィルム１３の開口部１３Ｈは、直上の絶縁フィルム１２の開口部１２Ｈの直径すなわちサイズより小さい直径すなわちサイズを有し、絶縁フィルム１２の開口部１２Ｈは、直上の絶縁フィルム１１の開口部１１Ｈの直径すなわちサイズより小さい直径すなわちサイズを有する。複数の絶縁フィルム１１，１２，１３の開口部１１Ｈ，１２Ｈ，１３Ｈは重ねられて、下方ほどサイズが小さいほぼ円錐台形またはボウル形の凹部２を形成する。ただし、開口部１１Ｈ，１２Ｈ，１３Ｈの形状は円形に限定されず、他の形状であってもよい。
　接着剤１１Ａ，１２Ａ，１３Ａの各々は、直上の絶縁フィルムの開口部と同形同大の開口部を有する。接着剤１１Ａ，１２Ａ，１３Ａの各開口部の端縁つまり内周面は、直上の絶縁フィルムの開口部の端縁つまり内周面になるべく揃えられている。但し、接着剤の開口部の内周面と絶縁フィルムの開口部の内周面の幾分かのずれは許容されている。
　絶縁フィルム１１，１２，１３，１４は、細胞になるべく影響を及ぼさない絶縁材料、例えばポリイミドから形成されている。接着剤１１Ａ，１２Ａ，１３Ａも細胞になるべく影響を及ぼさない絶縁材料から形成されている。不可欠ではないが、好ましくは、絶縁フィルム１１，１２，１３，１４と接着剤１１Ａ，１２Ａ，１３Ａは、電極線を視認することが可能なように、透明または半透明な材料から形成されている。
　電極線１２Ｂ，１２Ｃ，１３Ｂ，１４Ｂは、細胞になるべく影響を及ぼさない、高い導電率の導電材料から形成されている。例えば、電極線１２Ｂ，１２Ｃ，１３Ｂ，１４Ｂは、金メッキされた銅線から形成されている。
　複数の電極線の端部は、電極線の直下の絶縁フィルムの開口部の周囲に配置され、凹部２内で露出する。具体的には、電極線１２Ｂ，１２Ｃの端部は、電極線１２Ｂ，１２Ｃの直下の絶縁フィルム１２の開口部１２Ｈの周囲に配置されて、上方の開口部１１Ｈを通じて露出し、電極線１３Ｂの端部は、電極線１３Ｂの直下の絶縁フィルム１３の開口部１３Ｈの周囲に配置されて、上方の開口部１１Ｈ，１２Ｈを通じて露出する。
　最下層の絶縁フィルム１４と２番目に下層の絶縁フィルム１３の間に配置された電極線１４Ｂの端部は、２番目に下層の絶縁フィルム１３の開口部１３Ｈの全体を一方向に横断する。具体的には、電極線１４Ｂの端部は、円形の開口部１３Ｈの直径に沿って延びて、開口部１３Ｈを横断する。電極線１４Ｂの端部は、上方の開口部１１Ｈ，１２Ｈ，１３Ｈを通じて露出する。
　図３～図６は、それぞれ絶縁フィルム１１，１２，１３，１４の平面図である。図１は、図３～図６のＩ－Ｉ線断面に対応する。
　図３に示すように、最上層の絶縁フィルム（カバーフィルム）１１には、上記の開口部１１Ｈと、開口部１１Ｈと同形同大の開口部２１Ｈと、開口部１１Ｈ，２１Ｈをつなぐ直線状のスリットまたは溝３が形成されている。開口部１１Ｈ，２１Ｈおよび溝３は、絶縁フィルム１１を貫通する。
　また、絶縁フィルム１１には、積層される絶縁フィルム１１，１２，１３，１４の位置決めのための複数の貫通孔１１Ｐが形成されている。
　図４に示すように、絶縁フィルム１２には、上記の開口部１２Ｈと、開口部１２Ｈと同形同大の開口部２２Ｈが形成されている。開口部１２Ｈ，２２Ｈは、絶縁フィルム１２を貫通する。開口部２２Ｈは絶縁フィルム１１の開口部２１Ｈにほぼ同心に配置される。絶縁フィルム１２の開口部２２Ｈは、直上の絶縁フィルム１１の開口部２１Ｈの直径すなわちサイズより小さい直径すなわちサイズを有する。絶縁フィルム１１，１２の開口部２１Ｈ，２２Ｈは重ねられて、下方ほどサイズが小さい凹部を形成する。
　また、絶縁フィルム１２には、積層される絶縁フィルム１１，１２，１３，１４の位置決めのための複数の貫通孔１２Ｐが形成されている。
　絶縁フィルム１２の上面には、上記の電極線１２Ｂ，１２Ｃが形成されている。これらの電極線１２Ｂ，１２Ｃの開口部１２Ｈの付近の端部と反対の端部は、幅が広い接続端子１２Ｔ，１２ＣＴとして形成されている。
　さらに絶縁フィルム１２の上面には、後述する複数の軸索電極線３０が形成されている。複数の軸索電極線３０の端部は、開口部１２Ｈ，２２Ｈを結ぶ直線の付近に配置されており、直上の絶縁フィルム１１の溝３内で露出する。これらの軸索電極線３０の反対の端部は、幅が広い接続端子３０Ｔとして形成されている。
　軸索電極線３０は、細胞になるべく影響を及ぼさない、高い導電率の導電材料から形成されている。例えば、軸索電極線３０は、金メッキされた銅線から形成されている。
　図５に示すように、絶縁フィルム１３には、上記の開口部１３Ｈが形成されている。開口部１３Ｈは、絶縁フィルム１３を貫通する。
　また、絶縁フィルム１３には、積層される絶縁フィルム１１，１２，１３，１４の位置決めのための複数の貫通孔１３Ｐが形成されている。
　絶縁フィルム１３の上面には、上記の電極線１３Ｂが形成されている。これらの電極線１３Ｂの開口部１３Ｈの付近の端部と反対の端部は、幅が広い接続端子１３Ｔとして形成されている。
　図６に示すように、絶縁フィルム１４には、積層される絶縁フィルム１１，１２，１３，１４の位置決めのための複数の貫通孔１４Ｐが形成されている。
　絶縁フィルム１４の上面には、上記の電極線１４Ｂが形成されている。電極線１４Ｂの開口部１３Ｈに重なる端部と反対の端部は、幅が広い接続端子１４Ｔとして形成されている。
　絶縁フィルムの孔および溝は、例えばエッチングによって形成することができる。電極線は、絶縁フィルム上に例えばフォトリソグラフィによって形成することができる。
　絶縁フィルム１１，１２，１３，１４を接着剤１１Ａ，１２Ａ，１３Ａで接合する際に、貫通孔１１Ｐ，１２Ｐ，１３Ｐ，１４Ｐにピン（図示せず）を挿入することによって、絶縁フィルム１１，１２，１３，１４は位置決めされている。
　絶縁フィルム１１と、電極線が形成された絶縁フィルム１２，１３，１４を接着剤１１Ａ，１２Ａ，１３Ａで接合することにより、細胞外電位測定装置１を容易に製造することができる。
　図２に示すように、絶縁フィルム１１の幅は直下の絶縁フィルム１２の幅より小さく、絶縁フィルム１２に形成された電極線１２Ｂ，１２Ｃ，３０の大部分は絶縁フィルム１１に覆われて保護されるが、電極線１２Ｂ，１２Ｃ，３０の接続端子１２Ｔ，１２ＣＴ，３０Ｔは、少なくとも部分的に露出する。絶縁フィルム１２の幅は直下の絶縁フィルム１３の幅より小さく、絶縁フィルム１３に形成された電極線１３Ｂの大部分は絶縁フィルム１２に覆われて保護されるが、電極線１３Ｂの接続端子１３Ｔは、少なくとも部分的に露出する。絶縁フィルム１３の長さは直下の絶縁フィルム１４の長さより小さく、絶縁フィルム１４に形成された電極線１４Ｂの大部分は絶縁フィルム１３に覆われて保護されるが、電極線１４Ｂの接続端子１４Ｔは、少なくとも部分的に露出する。
　したがって、接続端子１２Ｔ，１２ＣＴ，３０Ｔ，１３Ｔ，１４Ｔは、図示しない電位計測装置に容易に接続することが可能である。
　図７および図８に示すように、電極線１２Ｂ，１２Ｃ，１３Ｂの端部は、凹部２に対して放射状に延びる。絶縁フィルム１２に形成された電極線１４Ｂの端部は、絶縁フィルム１２に形成された溝３内を延びる。電極線１４Ｂは屈曲しており、端部以外の部分は絶縁フィルム１４に覆われている。
　図８は、絶縁フィルム１１に形成された上記の開口部２１Ｈと絶縁フィルム１２に形成された上記の開口部２２Ｈを示す。開口部２１Ｈ，２２Ｈは重ねられて、下方ほどサイズが小さいほぼ円錐台形またはボウル形の凹部４を形成する。ただし、開口部２１Ｈ，２２Ｈの形状は円形に限定されず、他の形状であってもよい。
　開口部１１Ｈ，２１Ｈは、絶縁フィルム１１に形成された直線状のスリットまたは溝３でつながれている。溝３の直下の絶縁フィルム１２に形成された複数の軸索電極線３０の端部は、絶縁フィルム１１の溝３内で露出する。
　溝３が接着剤１１Ａで埋まることを防止するため、および開口部１１Ｈ，２１Ｈの寸法精度を向上させるため、好ましくは、絶縁フィルム１１において溝３と開口部１１Ｈ，２１Ｈの周囲の部分１１Ｘは、フォトリソグラフィによって形成されている。
　具体的には、まず部分１１Ｘが存在しない（部分１１Ｘに相当する貫通する凹部を有する）絶縁フィルム１１を形成する。例えば、絶縁フィルム１１にそのような凹部をエッチングによって形成することができる。
　次に、貫通孔１１Ｐ，１２Ｐ，１３Ｐ，１４Ｐにピン（図示せず）を挿入することによって、絶縁フィルム１１，１２，１３，１４を位置決めしながら、絶縁フィルム１１，１２，１３，１４を接着剤１１Ａ，１２Ａ，１３Ａで接合する。
　この後、部分１１Ｘに相当する凹部に紫外線硬化型樹脂を充填し、紫外線硬化型樹脂の溝３と凹部２，４以外の部分を紫外線で露光して硬化させる。さらに、溝３と凹部２，４をエッチングによって形成する。このようにして、溝３と開口部１１Ｈ，２１Ｈが形成されると同時に、電極線の端部が露出する。
　このように形成された部分１１Ｘは、図１に示すように、絶縁フィルム１１の層だけでなく、接着剤１１Ａの層まで達する。図８に示すように、軸索電極線３０の端部は、部分１１Ｘを貫通する。
　この実施形態においては、複数の絶縁フィルム１１，１２，１３の開口部１１Ｈ，１２Ｈ，１３Ｈが重ねられて設けられた下方ほどサイズが小さい凹部２に立体的な細胞の集合が収容される。上下の絶縁フィルムの間に配置された電極線１２Ｂ，１２Ｃ，１３Ｂの各々の端部は、直下の絶縁フィルムの開口部の周囲に配置され、凹部２内で露出するので、複数の電極線１２Ｂ，１２Ｃ，１３Ｂの端部は立体的な細胞の集合に接触可能である。複数の電極線１２Ｂ，１２Ｃ，１３Ｂは、複数の高さ、すなわち複数の層に配置されているので、細胞の集合の異なる高さの多点での電位を測定することができる。
　最も下の電極線１４Ｂの端部は、２番目に下層の絶縁フィルム１３の開口部全体、すなわち凹部２の底部全体を一方向に横断する。したがって、電極線１４Ｂの端部の広い面積が凹部２で露出し、凹部２内に配置された細胞の集合が電極線１４Ｂの端部に接触しやすい。細胞の集合への接触の蓋然性が高いこの電極線１４Ｂは、例えば基準電極として好ましく使用することができる。但し、基準電極は、他の電極線のいずれか１つであってもよい。
　この実施形態に係る細胞外電位測定装置１は、開口部開口部１１Ｈ，１２Ｈ，１３Ｈを有する複数の絶縁フィルム絶縁フィルム１１，１２，１３を接合することにより、立体的な細胞の集合の収容に適した、下方ほどサイズが小さい凹部２が設けられ、複数の絶縁フィルム絶縁フィルム１１，１２，１３，１４の間に電極線１２Ｂ，１２Ｃ，１３Ｂ，１４Ｂを配置することによって、複数の高さに電極線１２Ｂ，１２Ｃ，１３Ｂ，１４Ｂを配置することができる。したがって、立体的な細胞の集合の異なる高さの多点での電位を測定することができる細胞外電位測定装置１を容易に製造することができる。多数の絶縁フィルムを積層することにより、電極線が設けられる高さの数および電極線の数を増加させることが可能であり、細胞の集合に関する詳細な解析が可能となりうる。
　凹部２内に配置される細胞の集合は、生体内の細胞塊であってもよいし、生体外で培養された細胞塊、オルガノイドまたはスフェロイドのいずれであってもよい。
　図９は、細胞外電位測定装置１を用いた細胞外電位測定に使用されうるサンプルの複数の例を示す。サンプル４０は、軸索を有しない細胞の集合である。サンプル４１は、神経細胞に関する細胞の集合４２と、細胞の集合４２から延びた軸索４３を有する。サンプル４４は、神経細胞に関する２つの細胞の集合４５，４６と、細胞の集合４５，４６に結合した軸索４７を有する。細胞外電位測定装置１の凹部２の内部には、サンプル４０、細胞の集合４２、細胞の集合４５，４６のいずれも配置することができる。
　図１０は、サンプルの電位の測定の一例としてサンプル４４の電位の測定を示す。細胞の集合４５，４６は、それぞれ凹部２，４内に配置され、軸索４７は溝３内に配置される。
　細胞の集合４５の底部は、凹部２の底部にある電極線１４Ｂの端部に接触させられる。凹部２内で露出する電極線１２Ｂ，１２Ｃ，１３Ｂの端部は、細胞の集合４５に接触可能であり、細胞の集合４５に接触する限り、電極線１２Ｂ，１２Ｃ，１３Ｂを通じて、細胞の集合４５の各点の電位を測定することができる。
　また、溝３内で露出する軸索電極線３０の端部は、溝３内に配置された軸索４７に接触可能であり、軸索４７に接触する限り、軸索電極線３０を通じて、軸索４７の各点の電位を測定することができる。軸索の電位の測定においても、例えば電極線１４Ｂを基準電極として使用することができるが、他の電極線のいずれか１つを基準電極として使用してもよい。
　細胞外電位測定装置１によれば、細胞の集合の電位に加え、細胞の集合から延びる軸索の電位を測定することができる。これらの電位を解析することにより、生体内での（in vivo）神経細胞の信号伝達の推定に役立つ生体外での（in vitro）モデルを考察することができ、例えば、神経細胞への薬効および／または副作用を評価することができる。
　軸索電極線３０の数は１つでもよい。但し、この実施形態では複数の軸索電極線３０が設けられ、軸索の長さ方向における多点での電位を測定することができ、より詳細な解析を可能としている。
　図１１は、実施形態の変形例に係る細胞外電位測定装置の一部の図８と同様の拡大平面図である。この変形例では、サンプル４４の細胞の集合４５，４６の両方の電位を測定することができる。
　図１１に示すように、この変形例では、電極が設けられていない凹部４の代わりに、電極が設けられた第２の凹部４Ａを有する。第２の凹部４Ａは、絶縁フィルム１１を貫通する開口部２１Ｈ、絶縁フィルム１２を貫通する開口部２２Ｈ、および絶縁フィルム１３を貫通する開口部２３Ｈから形成されている。第２の凹部４Ａには、細胞の集合４６の電位を測定するために、細胞の集合４６が配置される。第２の凹部４Ａを形成する開口部２１Ｈ，２２Ｈ，２３Ｈを以下、第２の開口部と呼ぶ。
　複数の絶縁フィルム１１，１２，１３の第２の開口部２１Ｈ，２２Ｈ，２３Ｈは重ねられて、下方ほどサイズが小さいほぼ円錐台形またはボウル形の第２の凹部４Ａを形成する。ただし、第２の開口部２１Ｈ，２２Ｈ，２３Ｈの形状は円形に限定されず、他の形状であってもよい。第２の凹部４Ａの第２の開口部２１Ｈは溝３につながっている。
　したがって、この変形例では、絶縁フィルム１１，１２，１３，１４と接着剤１１Ａ，１２Ａ，１３Ａで形成されたシート１０には、凹部２と、凹部２につながる溝３と、溝３につながる第２の凹部４Ａが形成されている。
　この変形例は、さらに複数の高さ、すなわちシート１０の複数の層に配置された複数の第２の電極線２２Ｂ，２２Ｃ，２３Ｂを有する。各電極線は上方の絶縁フィルムと下方の絶縁フィルムの間に配置されている。第２の電極線２２Ｂ，２２Ｃ，２３Ｂは、細胞の集合４６の異なる高さの多点での電位を測定するために使用される。第２の電極線は、細胞になるべく影響を及ぼさない、高い導電率の導電材料から形成されている。例えば、第２の電極線は、金メッキされた銅線から形成されている。
　複数の第２の電極線の端部は、第２の電極線の直下の絶縁フィルムの第２の開口部の周囲に配置され、第２の凹部４Ａ内で露出する。具体的には、第２の電極線２２Ｂ，２２Ｃは、絶縁フィルム１２に形成され、第２の電極線２２Ｂ，２２Ｃの端部は、第２の電極線２２Ｂ，２２Ｃの直下の絶縁フィルム１２の開口部２２Ｈの周囲に配置されて、上方の開口部２１Ｈを通じて露出する。第２の電極線２３Ｂは、絶縁フィルム１３に形成され、第２の電極線２３Ｂの端部は、第２の電極線２３Ｂの直下の絶縁フィルム１３の開口部２３Ｈの周囲に配置されて、上方の開口部２１Ｈ，２２Ｈを通じて露出する。
　第２の電極線２２Ｂは凹部２に関連する電極線１２Ｂに対応し、第２の電極線２２Ｃは凹部２に関連する電極線１２Ｃに対応する。第２の電極線２３Ｂは凹部２に関連する電極線２３Ｂに対応する。第２の電極線２２Ｂ，２２Ｃ，２３Ｂの詳細については、電極線１２Ｂ，１２Ｃ，１３Ｂの説明を参照することにより理解できる。
　電極線１４Ｂは、２番目に下層の絶縁フィルム１３の第２の開口部２３Ｈの全体を一方向に横断する。具体的には、電極線１４Ｂは、円形の第２の開口部２３Ｈの直径に沿って延びて、第２の開口部２３Ｈを横断する。電極線１４Ｂは、上方の第２の開口部２１Ｈ，２２Ｈ，２３Ｈを通じて露出する。　細胞の集合４６の電位の測定においても、例えば電極線１４Ｂを基準電極として使用することができるが、他の電極線のいずれか１つを基準電極として使用してもよい。
　細胞の集合４６の底部は、第２の凹部４Ａの底部にある電極線１４Ｂの端部に接触させられる。第２の凹部４Ａで露出する第２の電極線２２Ｂ，２２Ｃ，２３Ｂの端部は、細胞の集合４６に接触可能であり、細胞の集合４６に接触する限り、第２の電極線２２Ｂ，２２Ｃ，２３Ｂを通じて、細胞の集合４６の各点の電位を測定することができる。
　この変形例においては、複数の絶縁フィルム１１，１２，１３の第２の開口部２１Ｈ，２２Ｈ，２３Ｈが重ねられて設けられた下方ほどサイズが小さい第２の凹部４Ａに立体的な第２の細胞の集合４６が収容される。上下の絶縁フィルムの間に配置された第２の電極線２２Ｂ，２２Ｃ，２３Ｂの各々の端部は、直下の絶縁フィルムの第２の開口部の周囲に配置され、第２の凹部４Ａ内で露出するので、複数の第２の電極線２２Ｂ，２２Ｃ，２３Ｂの端部は立体的な第２の細胞の集合に接触可能である。複数の第２の電極線２２Ｂ，２２Ｃ，２３Ｂは、複数の高さ、すなわち複数の層に配置されているので、第２の細胞の集合の異なる高さの多点での電位を測定することができる。
　したがって、２つの細胞の集合４５，４６の多点の電位とそれらの間の軸索４７の電位を測定することができる。これらの電位を解析することにより、生体内での神経細胞の信号伝達モデルを考察することができ、特に２つの細胞の集合の間の相互作用を考察することができる。
　この変形例は、複数の第２の電極線２２Ｂ，２２Ｃ，２３Ｂを有するので、細胞外電位測定装置の全体の平面図、特に軸索電極線３０の配置は、図２と異なる（図２の凹部４の位置に第２の凹部４Ａが配置される）。但し、軸索電極線および第２の電極線を含む電極線のパターンを工夫することにより、変形例のように第２の電極線を設けることが可能である。
　図１２は、本発明の実施形態の他の変形例に係る細胞外電位測定装置の断面図である。この変形例では、電極線１２Ｂ，１２Ｃ，１３Ｂの各々の端部は、電極線の直下の絶縁フィルム１２，１３の開口部１２Ｈ，１３Ｈの端縁つまり内周面で終端する。図１と比較すると明らかなように、凹部２内での電極線１２Ｂ，１２Ｃ，１３Ｂの露出部分が増えて、細胞の集合と接触する蓋然性が向上する。
　以上、本発明の好ましい実施形態を参照しながら本発明を図示して説明したが、当業者にとって特許請求の範囲に記載された発明の範囲から逸脱することなく、形式および詳細の変更が可能であることが理解されるであろう。このような変更、改変および修正は本発明の範囲に包含されるはずである。
　例えば、絶縁フィルムの数、複数の絶縁フィルムの厚さの比率、複数の開口部のサイズの比率、軸索電極線および第２の電極線を含む電極線の数と太さと配置、その他の詳細は、上記の実施形態および変形例に限定されない。
　図１１に示す凹部２および第２の凹部４Ａに加えて、さらに多くの凹部と凹部をつなぐ溝を細胞外電位測定装置に設けて、これらの凹部に細胞の集合と軸索をそれぞれ配置し、これらの細胞の集合と軸索の電位を測定してもよい。
　本発明の態様は、下記の番号付けされた条項にも記載される。
条項１．　絶縁材料から形成され、互いに積層されて接合された複数の絶縁フィルムと、
　導電材料から形成され、複数の高さに配置された複数の電極線を備え、
　各電極線が上方の絶縁フィルムと下方の絶縁フィルムの間に配置されており、
　最下層の絶縁フィルムを除き、各絶縁フィルムは貫通する開口部を有し、
　下方の絶縁フィルムの前記開口部は、上方の絶縁フィルムの前記開口部のサイズより小さいサイズを有し、複数の絶縁フィルムの前記開口部は重ねられて、細胞の集合が内部に配置される下方ほどサイズが小さい凹部を形成し、
　複数の電極線の各々は、当該電極線の直下の絶縁フィルムの前記開口部の周囲に配置されて前記凹部内で露出する端部を有する
ことを特徴とする細胞外電位測定装置。
条項２．　最下層の絶縁フィルムと２番目に下層の絶縁フィルムの間に配置された電極線の端部は、前記２番目に下層の絶縁フィルムの開口部全体を一方向に横断する
ことを特徴とする条項１に記載の細胞外電位測定装置。
　この条項によれば、この電極線の端部は、２番目に下層の絶縁フィルムの開口部全体、すなわち凹部の底部全体を一方向に横断する。したがって、電極線の端部の広い面積が凹部で露出し、凹部内に配置された細胞の集合が電極線の端部に接触しやすい。細胞の集合への接触の蓋然性が高いこの電極線は、例えば基準電極として好ましく使用することができる。
条項３．　最上層の絶縁フィルムには、前記細胞の集合から延びる線状の軸索が内部に配置される、貫通する溝が形成されており、前記溝は前記凹部につながっており、
　少なくとも１つの軸索電極線をさらに備え、前記軸索電極線の端部が前記軸索と接触させられるように前記溝内で露出する
ことを特徴とする条項１または２に記載の細胞外電位測定装置。
　この条項によれば、細胞の集合の電位に加え、細胞の集合から延びる軸索の電位を測定することができる。これらの電位を解析することにより、生体内での神経細胞の信号伝達の推定に役立つ生体外でのモデルを考察することができ、例えば、神経細胞への薬効および／または副作用を評価することができる。
条項４．　導電材料から形成され、複数の高さに配置された複数の第２の電極線をさらに備え、
　各第２の電極線が上方の絶縁フィルムと下方の絶縁フィルムの間に配置されており、
　最下層の絶縁フィルムを除き、各絶縁フィルムは貫通する第２の開口部を有し、
　下方の絶縁フィルムの前記第２の開口部は、上方の絶縁フィルムの前記第２の開口部のサイズより小さいサイズを有し、複数の絶縁フィルムの前記第２の開口部は重ねられて、前記軸索が結合した第２の細胞の集合が内部に配置される下方ほどサイズが小さい第２の凹部を形成し、前記第２の凹部は前記溝につながっており、
　複数の第２の電極線の各々は、当該第２の電極線の直下の絶縁フィルムの前記第２の開口部の周囲に配置されて前記第２の凹部内で露出する端部を有する
ことを特徴とする条項３に記載の細胞外電位測定装置。
　この条項によれば、複数の絶縁フィルムの第２の開口部が重ねられて設けられた下方ほどサイズが小さい第２の凹部に立体的な第２の細胞の集合が収容される。上下の絶縁フィルムの間に配置された第２の電極線の各々の端部は、直下の絶縁フィルムの第２の開口部の周囲に配置され、第２の凹部内で露出するので、複数の第２の電極線の端部は立体的な第２の細胞の集合に接触可能である。複数の第２の電極線は、複数の高さ、すなわち複数の層に配置されているので、第２の細胞の集合の異なる高さの多点での電位を測定することができる。したがって、２つの細胞の集合の多点の電位とそれらの間の軸索の電位を測定することができる。これらの電位を解析することにより、生体内での神経細胞の信号伝達モデルを考察することができ、特に２つの細胞の集合の間の相互作用を考察することができる。
条項５．　上方の絶縁フィルムと下方の絶縁フィルムは接着剤で接合されている
ことを特徴とする条項１から４のいずれか１項に記載の細胞外電位測定装置。
　この条項によれば、細胞外電位測定装置を容易に製造することができる。
条項６．　絶縁材料から形成された、互いに積層されて接合された複数の絶縁フィルムを有しており、細胞の集合が内部に配置される凹部と、凹部につながっており前記細胞の集合から延びる線状の軸索が内部に配置される溝を有するシートと、
　前記シートの前記絶縁フィルムの間に配置された複数の電極線を備え、
　複数の電極線は、前記細胞の集合と接触させられるように前記凹部内で露出する端部を有し、
　少なくとも１つの電極線は、前記軸索と接触させられるように前記溝内で露出する端部を有する
ことを特徴とする細胞外電位測定装置。
条項７．　前記凹部の内部に端部が露出する複数の電極線は、複数の高さに配置されている
ことを特徴とする条項６に記載の細胞外電位測定装置。
　この条項によれば、立体的な細胞の集合の異なる高さの多点での電位を測定することができる。
条項８．　最下層の絶縁フィルムを除き、各絶縁フィルムは貫通する開口部を有し、
　下方の絶縁フィルムの前記開口部は、上方の絶縁フィルムの前記開口部のサイズより小さいサイズを有し、複数の絶縁フィルムの前記開口部は重ねられて、下方ほどサイズが小さい前記凹部を形成し、
　前記複数の電極線の各々の端部は、当該電極線の直下の絶縁フィルムの前記開口部の周囲に配置され、前記凹部内で露出する
ことを特徴とする条項７に記載の細胞外電位測定装置。
　この条項によれば、複数の絶縁フィルムの開口部が重ねられて設けられた下方ほどサイズが小さい凹部に立体的な細胞の集合が収容される。上下の絶縁フィルムの間に配置された電極線の各々の端部は、直下の絶縁フィルムの開口部の周囲に配置され、凹部内で露出する。したがって、立体的な細胞の集合の異なる高さの多点に複数の電極線の端部が容易に接触可能である。
条項９．　前記シートの前記絶縁フィルムの間に配置された複数の第２の電極線を備え、
　前記シートは、前記軸索が結合した第２の細胞の集合が内部に配置される第２の凹部を有し、前記第２の凹部は前記溝につながっており、
　前記複数の第２の電極線は、前記第２の細胞の集合と接触させられるように前記第２の凹部内で露出する端部を有する
ことを特徴とする条項６から８のいずれか１項に記載の細胞外電位測定装置。
　この条項によれば、２つの細胞の集合の多点の電位とそれらの間の軸索の電位を測定することができる。これらの電位を解析することにより、生体内での神経細胞の信号伝達の推定に役立つ生体外でのモデルを考察することができ、特に２つの細胞の集合の間の相互作用を考察することができる。
条項１０．　前記複数の第２の電極線は、複数の高さに配置されている
ことを特徴とする条項９に記載の細胞外電位測定装置。
　この条項によれば、立体的な第２の細胞の集合の異なる高さの多点での電位を測定することができる。
条項１１．　最下層の絶縁フィルムを除き、各絶縁フィルムは貫通する第２の開口部を有し、
　下方の絶縁フィルムの前記第２の開口部は、上方の絶縁フィルムの前記第２の開口部のサイズより小さいサイズを有し、複数の絶縁フィルムの前記第２の開口部は重ねられて、下方ほどサイズが小さい前記第２の凹部を形成し、
　前記複数の第２の電極線の各々の端部は、当該第２の電極線の直下の絶縁フィルムの前記第２の開口部の周囲に配置され、前記第２の凹部内で露出する
ことを特徴とする条項１０に記載の細胞外電位測定装置。
　この条項によれば、複数の絶縁フィルムの第２の開口部が重ねられて設けられた下方ほどサイズが小さい第２の凹部に立体的な第２の細胞の集合が収容される。上下の絶縁フィルムの間に配置された第２の電極線の各々の端部は、直下の絶縁フィルムの第２の開口部の周囲に配置され、第２の凹部内で露出する。したがって、立体的な第２の細胞の集合の異なる高さの多点に複数の第２の電極線の端部が容易に接触可能である。
１　細胞外電位測定装置
２　凹部
３　溝
４Ａ　第２の凹部
１０　シート
１１，１２，１３，１４　絶縁フィルム
１１Ａ，１２Ａ，１３Ａ　接着剤
１２Ｂ，１２Ｃ，１３Ｂ，１４Ｂ　電極線
１１Ｈ，１２Ｈ，１３Ｈ　開口部
２１Ｈ，２２Ｈ，２３Ｈ　第２の開口部
３０　軸索電極線
４０　サンプル
４１　サンプル
４２　細胞の集合
４３　軸索
４４　サンプル
４５，４６　細胞の集合
４７　軸索
２２Ｂ，２２Ｃ，２３Ｂ　第２の電極線

Claims (11)

  1. 　絶縁材料から形成され、互いに積層されて接合された複数の絶縁フィルムと、
    　導電材料から形成され、複数の高さに配置された複数の電極線を備え、
    　各電極線が上方の絶縁フィルムと下方の絶縁フィルムの間に配置されており、
    　最下層の絶縁フィルムを除き、各絶縁フィルムは貫通する開口部を有し、
    　下方の絶縁フィルムの前記開口部は、上方の絶縁フィルムの前記開口部のサイズより小さいサイズを有し、複数の絶縁フィルムの前記開口部は重ねられて、細胞の集合が内部に配置される下方ほどサイズが小さい凹部を形成し、
    　複数の電極線の各々は、当該電極線の直下の絶縁フィルムの前記開口部の周囲に配置されて前記凹部内で露出する端部を有する
    ことを特徴とする細胞外電位測定装置。
  2. 　最下層の絶縁フィルムと２番目に下層の絶縁フィルムの間に配置された電極線の端部は、前記２番目に下層の絶縁フィルムの開口部全体を一方向に横断する
    ことを特徴とする請求項１に記載の細胞外電位測定装置。
  3. 　最上層の絶縁フィルムには、前記細胞の集合から延びる線状の軸索が内部に配置される、貫通する溝が形成されており、前記溝は前記凹部につながっており、
    　少なくとも１つの軸索電極線をさらに備え、前記軸索電極線の端部が前記軸索と接触させられるように前記溝内で露出する
    ことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞外電位測定装置。
  4. 　導電材料から形成され、複数の高さに配置された複数の第２の電極線をさらに備え、
    　各第２の電極線が上方の絶縁フィルムと下方の絶縁フィルムの間に配置されており、
    　最下層の絶縁フィルムを除き、各絶縁フィルムは貫通する第２の開口部を有し、
    　下方の絶縁フィルムの前記第２の開口部は、上方の絶縁フィルムの前記第２の開口部のサイズより小さいサイズを有し、複数の絶縁フィルムの前記第２の開口部は重ねられて、前記軸索が結合した第２の細胞の集合が内部に配置される下方ほどサイズが小さい第２の凹部を形成し、前記第２の凹部は前記溝につながっており、
    　複数の第２の電極線の各々は、当該第２の電極線の直下の絶縁フィルムの前記第２の開口部の周囲に配置されて前記第２の凹部内で露出する端部を有する
    ことを特徴とする請求項３に記載の細胞外電位測定装置。
  5. 　上方の絶縁フィルムと下方の絶縁フィルムは接着剤で接合されている
    ことを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞外電位測定装置。
  6. 　絶縁材料から形成された、互いに積層されて接合された複数の絶縁フィルムを有しており、細胞の集合が内部に配置される凹部と、凹部につながっており前記細胞の集合から延びる線状の軸索が内部に配置される溝を有するシートと、
    　前記シートの前記絶縁フィルムの間に配置された複数の電極線を備え、
    　複数の電極線は、前記細胞の集合と接触させられるように前記凹部内で露出する端部を有し、
    　少なくとも１つの電極線は、前記軸索と接触させられるように前記溝内で露出する端部を有する
    ことを特徴とする細胞外電位測定装置。
  7. 　前記凹部の内部に端部が露出する複数の電極線は、複数の高さに配置されている
    ことを特徴とする請求項６に記載の細胞外電位測定装置。
  8. 　最下層の絶縁フィルムを除き、各絶縁フィルムは貫通する開口部を有し、
    　下方の絶縁フィルムの前記開口部は、上方の絶縁フィルムの前記開口部のサイズより小さいサイズを有し、複数の絶縁フィルムの前記開口部は重ねられて、下方ほどサイズが小さい前記凹部を形成し、
    　前記複数の電極線の各々の端部は、当該電極線の直下の絶縁フィルムの前記開口部の周囲に配置され、前記凹部内で露出する
    ことを特徴とする請求項７に記載の細胞外電位測定装置。
  9. 　前記シートの前記絶縁フィルムの間に配置された複数の第２の電極線を備え、
    　前記シートは、前記軸索が結合した第２の細胞の集合が内部に配置される第２の凹部を有し、前記第２の凹部は前記溝につながっており、
    　前記複数の第２の電極線は、前記第２の細胞の集合と接触させられるように前記第２の凹部内で露出する端部を有する
    ことを特徴とする請求項６から８のいずれか１項に記載の細胞外電位測定装置。
  10. 　前記複数の第２の電極線は、複数の高さに配置されている
    ことを特徴とする請求項９に記載の細胞外電位測定装置。
  11. 　最下層の絶縁フィルムを除き、各絶縁フィルムは貫通する第２の開口部を有し、
    　下方の絶縁フィルムの前記第２の開口部は、上方の絶縁フィルムの前記第２の開口部のサイズより小さいサイズを有し、複数の絶縁フィルムの前記第２の開口部は重ねられて、下方ほどサイズが小さい前記第２の凹部を形成し、
    　前記複数の第２の電極線の各々の端部は、当該第２の電極線の直下の絶縁フィルムの前記第２の開口部の周囲に配置され、前記第２の凹部内で露出する
    ことを特徴とする請求項１０に記載の細胞外電位測定装置。
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